JPH09110894A - ハイブリッドｄｎａ／ｒｎａオリゴヌクレオチド及び抗ウイルス剤 - Google Patents
ハイブリッドｄｎａ／ｒｎａオリゴヌクレオチド及び抗ウイルス剤Info
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- JPH09110894A JPH09110894A JP7268442A JP26844295A JPH09110894A JP H09110894 A JPH09110894 A JP H09110894A JP 7268442 A JP7268442 A JP 7268442A JP 26844295 A JP26844295 A JP 26844295A JP H09110894 A JPH09110894 A JP H09110894A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオ
チド及び該ヌクレオチドを含有する抗ウイルス剤を提供
する。 【解決手段】 ヘアピンループ部分を少なくとも２つ有
しており、標的ＲＮＡに相補的なアンチセンスＤＮＡと
センスＲＮＡとにより分子内塩基配列が組まれているハ
イブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。
このヌクレオチドは標的部位の RNase H により自己の
センスＲＮＡ領域が分解され、これによって露呈したア
ンチセンスＤＮＡ領域が標的となるＲＮＡと二重鎖を形
成して標的ＲＮＡを分解する。 【効果】 本発明によるオリゴヌクレオチドは自体安定
な塩基対を形成し、生体に存在する各種のヌクレアーゼ
による分解作用に対して耐性を有している。
チド及び該ヌクレオチドを含有する抗ウイルス剤を提供
する。 【解決手段】 ヘアピンループ部分を少なくとも２つ有
しており、標的ＲＮＡに相補的なアンチセンスＤＮＡと
センスＲＮＡとにより分子内塩基配列が組まれているハ
イブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。
このヌクレオチドは標的部位の RNase H により自己の
センスＲＮＡ領域が分解され、これによって露呈したア
ンチセンスＤＮＡ領域が標的となるＲＮＡと二重鎖を形
成して標的ＲＮＡを分解する。 【効果】 本発明によるオリゴヌクレオチドは自体安定
な塩基対を形成し、生体に存在する各種のヌクレアーゼ
による分解作用に対して耐性を有している。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ハイブリッドＤＮ
Ａ／ＲＮＡオリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチ
ドを含有する抗ウィルス剤に係る。
Ａ／ＲＮＡオリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチ
ドを含有する抗ウィルス剤に係る。
【０００２】
【従来の技術】疾患に係る遺伝子を核酸断片により不活
化し、生体に望ましくない遺伝子産物を産生させなくし
たり、寄生生物の増殖を抑制して遺伝子治療を行なう方
法は「アンチセンス技術」として近年医学分野で脚光を
浴びている。アンチセンス法は高い可能性を秘めた魅力
的な遺伝子制御方法であるが、実際に医療の場において
使用する場合には、アンチセンス分子の投与方法、ドラ
ッグデリバリーシステムへの利用、ドラッグターゲッテ
ングシステムへの利用、代謝安全性、低免疫原性、体内
排泄、高活性体であること等の条件を満たすことが最低
限必要であり、未だこのような、機能性に富みしかも安
全性の高いアンチセンス分子は発見されていない ["Bio
chemistry", Vol. 16, page 1988 (1977)「アンチセン
ス技術」及び "Proc, Natl. Acad. Sci. USA,", Vol. 8
4, page 7706 (1987)「エイズウィルス阻害法」等]。
化し、生体に望ましくない遺伝子産物を産生させなくし
たり、寄生生物の増殖を抑制して遺伝子治療を行なう方
法は「アンチセンス技術」として近年医学分野で脚光を
浴びている。アンチセンス法は高い可能性を秘めた魅力
的な遺伝子制御方法であるが、実際に医療の場において
使用する場合には、アンチセンス分子の投与方法、ドラ
ッグデリバリーシステムへの利用、ドラッグターゲッテ
ングシステムへの利用、代謝安全性、低免疫原性、体内
排泄、高活性体であること等の条件を満たすことが最低
限必要であり、未だこのような、機能性に富みしかも安
全性の高いアンチセンス分子は発見されていない ["Bio
chemistry", Vol. 16, page 1988 (1977)「アンチセン
ス技術」及び "Proc, Natl. Acad. Sci. USA,", Vol. 8
4, page 7706 (1987)「エイズウィルス阻害法」等]。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】一本鎖ＲＮＡを遺伝子
とするレトロウィルスは、宿主細胞内で複製し増殖する
寄生体であり、宿主細胞の働きを利用して増殖に必要な
タンパク質を合成する。レトロウィルスが宿主細胞に感
染すると、逆転写酵素 ("ReverseTranscriptase"、以下
「rev タンパク質」と称する) の働きによりＲＮＡから
ＤＮＡが合成される。後天性免疫不全症候群 (AIDS) を
引き起こすＨＩＶ (HumanImmunodeficiency Virus) も
レトロウィルスに属し、Ｔ４リンパ球を宿主細胞とし、
その細胞内で複製し増殖する。
とするレトロウィルスは、宿主細胞内で複製し増殖する
寄生体であり、宿主細胞の働きを利用して増殖に必要な
タンパク質を合成する。レトロウィルスが宿主細胞に感
染すると、逆転写酵素 ("ReverseTranscriptase"、以下
「rev タンパク質」と称する) の働きによりＲＮＡから
ＤＮＡが合成される。後天性免疫不全症候群 (AIDS) を
引き起こすＨＩＶ (HumanImmunodeficiency Virus) も
レトロウィルスに属し、Ｔ４リンパ球を宿主細胞とし、
その細胞内で複製し増殖する。
【０００４】レトロウィルスの代表例として、ＨＩＶラ
イフサイクルを図１に示す。ＨＩＶの親ウィルスが宿主
細胞に吸着するとウィルスＲＮＡが逆転写酵素により一
本鎖ＤＮＡに転写され、二本鎖ＤＮＡになって染色体Ｄ
ＮＡに組み込まれる。このプロウィルスＤＮＡは、潜伏
期間中に宿主の染色体ＤＮＡと共に複製される。このＤ
ＮＡは様々な機能を有し、何らかの刺激が与えられる
と、ＲＮＡへの転写が行われ、ＨＩＶの子ウィルスが発
生する。従って、宿主細胞のタンパク質合成系において
ｍＲＮＡからタンパク質が合成されるステップで、アン
チセンスオリゴヌクレオチドを結合させることができれ
ば、ウィルス増殖を効果的に阻止することができる筈で
ある。
イフサイクルを図１に示す。ＨＩＶの親ウィルスが宿主
細胞に吸着するとウィルスＲＮＡが逆転写酵素により一
本鎖ＤＮＡに転写され、二本鎖ＤＮＡになって染色体Ｄ
ＮＡに組み込まれる。このプロウィルスＤＮＡは、潜伏
期間中に宿主の染色体ＤＮＡと共に複製される。このＤ
ＮＡは様々な機能を有し、何らかの刺激が与えられる
と、ＲＮＡへの転写が行われ、ＨＩＶの子ウィルスが発
生する。従って、宿主細胞のタンパク質合成系において
ｍＲＮＡからタンパク質が合成されるステップで、アン
チセンスオリゴヌクレオチドを結合させることができれ
ば、ウィルス増殖を効果的に阻止することができる筈で
ある。
【０００５】しかしながら、ターゲット遺伝子の特定領
域の塩基配列に相補的な塩基配列を有するだけのアンチ
センスオリゴヌクレオチドを生体内に導入しても、生体
内に存在する種々の核酸分解酵素 [ヌクレアーゼ (Nucl
ease)] により簡単に分解されてしまい、ターゲット遺
伝子と結合する前に消失し、目的とする効果を得ること
は事実上不可能であるか、或いは極めて困難である。こ
れを解決するために、ホスホロチオエート結合を含むア
ンチセンスオリゴヌクレオチドが一般に利用されている
が、ホスホロチオエート結合はＲ体とＳ体の混合重合体
であるために、ターゲットに対する塩基対形成能が低下
する。そこで、ターゲット部位にはホスホロチオエート
結合を使用せず、核酸分解酵素に対する耐性を増加する
ことが必要となる。
域の塩基配列に相補的な塩基配列を有するだけのアンチ
センスオリゴヌクレオチドを生体内に導入しても、生体
内に存在する種々の核酸分解酵素 [ヌクレアーゼ (Nucl
ease)] により簡単に分解されてしまい、ターゲット遺
伝子と結合する前に消失し、目的とする効果を得ること
は事実上不可能であるか、或いは極めて困難である。こ
れを解決するために、ホスホロチオエート結合を含むア
ンチセンスオリゴヌクレオチドが一般に利用されている
が、ホスホロチオエート結合はＲ体とＳ体の混合重合体
であるために、ターゲットに対する塩基対形成能が低下
する。そこで、ターゲット部位にはホスホロチオエート
結合を使用せず、核酸分解酵素に対する耐性を増加する
ことが必要となる。
【０００６】本発明者等は生体内で安定に存在し、しか
もターゲット領域の遺伝子に対する結合能が低下しない
アンチセンスオリゴヌクレオチドを得るべく鋭意検討し
た結果、少なくともヘアピンループ部分を２つ有してお
り、標的ＲＮＡに相補的なアンチセンスＤＮＡと、セン
スＲＮＡとで、分子内塩基配列を組むことを特徴とす
る、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドに
よって上記の課題を解決ることができることを見い出
し、且つこのようなオリゴヌクレオチドが安全性におい
て優れていることを見い出して本発明を完成するに至っ
た。
もターゲット領域の遺伝子に対する結合能が低下しない
アンチセンスオリゴヌクレオチドを得るべく鋭意検討し
た結果、少なくともヘアピンループ部分を２つ有してお
り、標的ＲＮＡに相補的なアンチセンスＤＮＡと、セン
スＲＮＡとで、分子内塩基配列を組むことを特徴とす
る、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドに
よって上記の課題を解決ることができることを見い出
し、且つこのようなオリゴヌクレオチドが安全性におい
て優れていることを見い出して本発明を完成するに至っ
た。
【０００７】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は、少な
くともヘアピンループ部分を２つ有しており、標的ＲＮ
Ａに相補的なアンチセンスＤＮＡと、センスＲＮＡと
で、分子内塩基配列を組むことを特徴とする、ハイブリ
ッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドを提供するもの
である。更に、本発明は該ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ
オリゴヌクレオチド類を有効成分として含有しているこ
とを特徴とする、抗ウィルス剤を提供するものである。
くともヘアピンループ部分を２つ有しており、標的ＲＮ
Ａに相補的なアンチセンスＤＮＡと、センスＲＮＡと
で、分子内塩基配列を組むことを特徴とする、ハイブリ
ッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドを提供するもの
である。更に、本発明は該ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ
オリゴヌクレオチド類を有効成分として含有しているこ
とを特徴とする、抗ウィルス剤を提供するものである。
【０００８】本発明によるハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ
オリゴヌクレオチドの数例を示せば下記の通りである。
オリゴヌクレオチドの数例を示せば下記の通りである。
【０００９】RD5 (配列番号 1) :
【化４】 RD5C (配列番号 2) :
【化５】 RD5S (配列番号 3) :
【化６】 （上記の各式中において、Ａはアデノシン残基、Ｔはチ
ミジン残基、Ｇはグアノシン残基、Ｃはシチジン残基を
意味し、小文字のａ、ｕ、ｇ及びｃは、それぞれ、リボ
ヌクレオチドであり、ｓはホスホロチオエート結合であ
り、他のヌクレオチド間の結合は、ホスホジエステル結
合であり、ｐは燐酸基を意味する）
ミジン残基、Ｇはグアノシン残基、Ｃはシチジン残基を
意味し、小文字のａ、ｕ、ｇ及びｃは、それぞれ、リボ
ヌクレオチドであり、ｓはホスホロチオエート結合であ
り、他のヌクレオチド間の結合は、ホスホジエステル結
合であり、ｐは燐酸基を意味する）
【００１０】尚、上記のオリゴヌクレオチド以外にも、
以下の条件を満たすものであれば同様な活性を有してい
ることが予測され、従って本発明は本明細書に具体的に
開示された化合物に限定されるものではない。
以下の条件を満たすものであれば同様な活性を有してい
ることが予測され、従って本発明は本明細書に具体的に
開示された化合物に限定されるものではない。
【００１１】本発明によるハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ
オリゴヌクレオチドについての特性は以下に記載されて
いる通りに纏めることができる。即ち、本発明のハイブ
リッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡ
に対して相補的な塩基配列からなるアンチセンスＤＮＡ
領域と、センスＲＮＡ領域とを含んでいる。ハイブリッ
ドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドを細胞内に存在さ
せると、例えば、宿主細胞内でハイブリッドＤＮＡ／Ｒ
ＮＡオリゴヌクレオチドのＲＮＡ領域が分解され、アン
チセンスＤＮＡ領域が露呈し、宿主細胞の核からウィル
スのゲノムＲＮＡが放出された場合に、そのゲノムＲＮ
ＡにアンチセンスＤＮＡ領域が結合し、細胞質内の酵素
によってゲノムＲＮＡが分解されるので、子ウィルスの
発生を防止することができる。又、宿主細胞の染色体Ｄ
ＮＡに取り込まれたウィルスＤＮＡから転写されたｍＲ
ＮＡが、宿主細胞の核から細胞質に放出された場合に
も、そのｍＲＮＡに露呈したアンチセンスＤＮＡ領域が
結合し、タンパク質の翻訳をブロックするか、或いは細
胞質内の酵素によってｍＲＮＡが分解されるので、この
場合にも子ウィルスの発生を防止することができる。
オリゴヌクレオチドについての特性は以下に記載されて
いる通りに纏めることができる。即ち、本発明のハイブ
リッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡ
に対して相補的な塩基配列からなるアンチセンスＤＮＡ
領域と、センスＲＮＡ領域とを含んでいる。ハイブリッ
ドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドを細胞内に存在さ
せると、例えば、宿主細胞内でハイブリッドＤＮＡ／Ｒ
ＮＡオリゴヌクレオチドのＲＮＡ領域が分解され、アン
チセンスＤＮＡ領域が露呈し、宿主細胞の核からウィル
スのゲノムＲＮＡが放出された場合に、そのゲノムＲＮ
ＡにアンチセンスＤＮＡ領域が結合し、細胞質内の酵素
によってゲノムＲＮＡが分解されるので、子ウィルスの
発生を防止することができる。又、宿主細胞の染色体Ｄ
ＮＡに取り込まれたウィルスＤＮＡから転写されたｍＲ
ＮＡが、宿主細胞の核から細胞質に放出された場合に
も、そのｍＲＮＡに露呈したアンチセンスＤＮＡ領域が
結合し、タンパク質の翻訳をブロックするか、或いは細
胞質内の酵素によってｍＲＮＡが分解されるので、この
場合にも子ウィルスの発生を防止することができる。
【００１２】標的となるＲＮＡは、ＲＮＡ遺伝子、また
はｍＲＮＡの内、本発明のアンチセンスＤＮＡ領域と結
合させてＲＮＡの複製、ｍＲＮＡへの転写及び／又はｍ
ＲＮＡからタンパク質への翻訳、更にはＲＮＡからＤＮ
Ａへの逆転写を阻害し、それらＲＮＡが有する正常な機
能を発揮させないようにされる対象となるＲＮＡであ
る。
はｍＲＮＡの内、本発明のアンチセンスＤＮＡ領域と結
合させてＲＮＡの複製、ｍＲＮＡへの転写及び／又はｍ
ＲＮＡからタンパク質への翻訳、更にはＲＮＡからＤＮ
Ａへの逆転写を阻害し、それらＲＮＡが有する正常な機
能を発揮させないようにされる対象となるＲＮＡであ
る。
【００１３】標的ＲＮＡとしては、ＲＮＡウィルス、例
えばインフルエンザウィルス、ライノウィルス、ポリオ
ウィルス、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１等のＲＮＡ遺伝子の部
分塩基配列、例えばタンパク質合成開始部位などを選択
することができ、又ＤＮＡ遺伝子からのｍＲＮＡやＲＮ
ＡウィルスのプロウィルスＤＮＡから転写されるｍＲＮ
Ａの全配列又は部分配列、特に rev タンパク質をコー
ドする rev 領域又はその部分配列を挙げることができ
る。
えばインフルエンザウィルス、ライノウィルス、ポリオ
ウィルス、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−１等のＲＮＡ遺伝子の部
分塩基配列、例えばタンパク質合成開始部位などを選択
することができ、又ＤＮＡ遺伝子からのｍＲＮＡやＲＮ
ＡウィルスのプロウィルスＤＮＡから転写されるｍＲＮ
Ａの全配列又は部分配列、特に rev タンパク質をコー
ドする rev 領域又はその部分配列を挙げることができ
る。
【００１４】本発明によるハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ
オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リ
ボヌクレオチド及び／又はそれらの修飾体から形成する
ことができ、塩基数は特に限定されるものではないが、
２つのヘアピンループ構造を形成することができ、相補
的塩基配列を決める最小の単位は、一般的は３８−７６
塩基であり、ヘアピンループ構造が２つ以上の場合はこ
れに限定されるものではない。
オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リ
ボヌクレオチド及び／又はそれらの修飾体から形成する
ことができ、塩基数は特に限定されるものではないが、
２つのヘアピンループ構造を形成することができ、相補
的塩基配列を決める最小の単位は、一般的は３８−７６
塩基であり、ヘアピンループ構造が２つ以上の場合はこ
れに限定されるものではない。
【００１５】ヘアピンループ構造は、環状一本鎖のルー
プ領域と、そのループ領域端部から始まる二本鎖のステ
ム領域とからなり、ヘアピンループ構造を構成する塩基
数は特に限定されるものではないが、一般にはループ領
域は４−８塩基、ステム領域は１５−３０塩基である。
アンチセンス領域は前記のヘアピンループ構造と別個に
形成されていても、或いはアンチセンス領域の全体また
は一部がヘアピンループ構造の全体または一部と一致し
ていても差し支えはない。
プ領域と、そのループ領域端部から始まる二本鎖のステ
ム領域とからなり、ヘアピンループ構造を構成する塩基
数は特に限定されるものではないが、一般にはループ領
域は４−８塩基、ステム領域は１５−３０塩基である。
アンチセンス領域は前記のヘアピンループ構造と別個に
形成されていても、或いはアンチセンス領域の全体また
は一部がヘアピンループ構造の全体または一部と一致し
ていても差し支えはない。
【００１６】アンチセンス領域を構成する塩基数は特に
限定されるものではなく、一般に１５−４６塩基であ
る。本発明によるハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌ
クレオチド内においてアンチセンス領域は連続して存在
する必要はなく、標的ＲＮＡと二重鎖を形成することが
できる限り、非相補的塩基１またはそれ以上が１または
それ以上の箇所で相補的塩基対配列内に介在していても
差し支えない。
限定されるものではなく、一般に１５−４６塩基であ
る。本発明によるハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌ
クレオチド内においてアンチセンス領域は連続して存在
する必要はなく、標的ＲＮＡと二重鎖を形成することが
できる限り、非相補的塩基１またはそれ以上が１または
それ以上の箇所で相補的塩基対配列内に介在していても
差し支えない。
【００１７】本発明によるハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ
オリゴヌクレオチドにおいて、アンチセンス領域以外の
各燐酸エステルの内で少なくとも１箇所以上にホスホロ
チオエート結合を導入することができる。ホスホロチオ
エート結合とは、燐酸ジエステル結合の酸素原子を硫黄
原子で置換したものである。ホスホロチオエート結合を
導入した部位は、ヌクレアーゼに対する分解抵抗性が向
上するので、ホスホロチオエート結合の導入数は多い程
好ましいが、アンチセンスＤＮＡ領域に導入するのは R
Nase H に対する特異性が低下するので好ましくない。
オリゴヌクレオチドにおいて、アンチセンス領域以外の
各燐酸エステルの内で少なくとも１箇所以上にホスホロ
チオエート結合を導入することができる。ホスホロチオ
エート結合とは、燐酸ジエステル結合の酸素原子を硫黄
原子で置換したものである。ホスホロチオエート結合を
導入した部位は、ヌクレアーゼに対する分解抵抗性が向
上するので、ホスホロチオエート結合の導入数は多い程
好ましいが、アンチセンスＤＮＡ領域に導入するのは R
Nase H に対する特異性が低下するので好ましくない。
【００１８】尚、ホスホロチオエート結合を環状ハイブ
リッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドに導入する場
合にはステム領域及びループ領域を構成する塩基数によ
り、その導入数を調整する必要がある。これはループ領
域を全てホスホロチオエート結合になした場合には、ス
テム領域の塩基数によって RNase H に対する安定性も
向上し、RNase H により分解され難い環状ハイブリッド
ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドが形成されることが
あるためである。
リッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドに導入する場
合にはステム領域及びループ領域を構成する塩基数によ
り、その導入数を調整する必要がある。これはループ領
域を全てホスホロチオエート結合になした場合には、ス
テム領域の塩基数によって RNase H に対する安定性も
向上し、RNase H により分解され難い環状ハイブリッド
ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドが形成されることが
あるためである。
【００１９】本発明によるハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ
オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート結合を導入す
る部位を除いては、通常のホスホジエステル法またはホ
スホトリエステル法、例えば H-ホスホネート法、また
はホスホロアミダイト法等によるＤＮＡ／ＲＮＡ自動合
成機を利用して合成することができる。ホスホロチオエ
ート結合を有するハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌ
クレオチドは、通常のポリヌクレオチド合成に用いられ
る酸化剤で水／沃素／ピリジン／テトラヒドロフランの
代わりに、１５％Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′-テトラエチルチ
オラムジスルフィド ／アセトニトリルを用いて合成す
ることができる。
オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート結合を導入す
る部位を除いては、通常のホスホジエステル法またはホ
スホトリエステル法、例えば H-ホスホネート法、また
はホスホロアミダイト法等によるＤＮＡ／ＲＮＡ自動合
成機を利用して合成することができる。ホスホロチオエ
ート結合を有するハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌ
クレオチドは、通常のポリヌクレオチド合成に用いられ
る酸化剤で水／沃素／ピリジン／テトラヒドロフランの
代わりに、１５％Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′-テトラエチルチ
オラムジスルフィド ／アセトニトリルを用いて合成す
ることができる。
【００２０】更に、本発明によるハイブリッドＤＮＡ／
ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＤＮＡ領域
とセンスＤＮＡ領域が安定なハイブリッド塩基対を形成
するので、生体内に存在するヌクレアーゼによる分解に
対しても抵抗性を有している。
ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＤＮＡ領域
とセンスＤＮＡ領域が安定なハイブリッド塩基対を形成
するので、生体内に存在するヌクレアーゼによる分解に
対しても抵抗性を有している。
【００２１】ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレ
オチドの安定性の指標としては、例えば融解温度 (以下
「Tm」と称する) を用いることができる。一般に、オリ
ゴヌクレオチドをホスホロチオエート型にすると Tm 値
は下がり、塩基対の安定性は減少する。しかしながら、
本発明によるハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレ
オチドは、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチ
ドのハイブリッド型であり、分子内で安定した塩基対を
形成することができるので、通常のデオキシリボヌクレ
オチドのみのＤＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドと比較
する場合に、Tm値は上昇し、塩基対は安定化する。又、
ホスホロチオエート結合はアンチセンス領域には導入さ
れないので、標的ＲＮＡとの塩基対形成能は低下しな
い。
オチドの安定性の指標としては、例えば融解温度 (以下
「Tm」と称する) を用いることができる。一般に、オリ
ゴヌクレオチドをホスホロチオエート型にすると Tm 値
は下がり、塩基対の安定性は減少する。しかしながら、
本発明によるハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレ
オチドは、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチ
ドのハイブリッド型であり、分子内で安定した塩基対を
形成することができるので、通常のデオキシリボヌクレ
オチドのみのＤＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドと比較
する場合に、Tm値は上昇し、塩基対は安定化する。又、
ホスホロチオエート結合はアンチセンス領域には導入さ
れないので、標的ＲＮＡとの塩基対形成能は低下しな
い。
【００２２】翻って、生体内には数々のヌクレアーゼが
存在する。例えば、3' 方向から分解する 3'-エキソヌ
クレアーゼ、5' 方向から分解する 5'-エキソヌクレア
ーゼや、中程から切断するエンドヌクレアーゼ、更にＤ
ＮＡ又はＲＮＡの二重鎖を認識してＤＮＡ又はＲＮＡの
みを分解する酵素 (例えば RNase H) が存在する。後述
の実施例において示されているように、本発明によるハ
イブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドは 3'-エ
キソヌクレアーゼ (ヘビ毒ホスホジエステラーゼ) やエ
ンドヌクレアーゼ (SI ヌクレアーゼ) の分解活性に対
して抵抗性を有している。更に、細胞培養等の培地に用
いる牛血清にも種々のヌクレアーゼが含まれているが、
本発明によるハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレ
オチドは牛血清中のヌクレアーゼに対しても抵抗性を有
しているために牛血清含有培地からハイブリッドＤＮＡ
／ＲＮＡオリゴヌクレオチドを細胞に導入することが可
能である。
存在する。例えば、3' 方向から分解する 3'-エキソヌ
クレアーゼ、5' 方向から分解する 5'-エキソヌクレア
ーゼや、中程から切断するエンドヌクレアーゼ、更にＤ
ＮＡ又はＲＮＡの二重鎖を認識してＤＮＡ又はＲＮＡの
みを分解する酵素 (例えば RNase H) が存在する。後述
の実施例において示されているように、本発明によるハ
イブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドは 3'-エ
キソヌクレアーゼ (ヘビ毒ホスホジエステラーゼ) やエ
ンドヌクレアーゼ (SI ヌクレアーゼ) の分解活性に対
して抵抗性を有している。更に、細胞培養等の培地に用
いる牛血清にも種々のヌクレアーゼが含まれているが、
本発明によるハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレ
オチドは牛血清中のヌクレアーゼに対しても抵抗性を有
しているために牛血清含有培地からハイブリッドＤＮＡ
／ＲＮＡオリゴヌクレオチドを細胞に導入することが可
能である。
【００２３】尚、アンチセンス法において重要な作用
に、標的となるｍＲＮＡに結合して形成される細胞内の
ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の内で、ＲＮＡを特異的に切断す
るリボヌクレアーゼ (RNase H) の働きがある。これを
利用すれば、細胞内のタンパク質合成を阻害してウィル
スの増殖を防止することができる。
に、標的となるｍＲＮＡに結合して形成される細胞内の
ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の内で、ＲＮＡを特異的に切断す
るリボヌクレアーゼ (RNase H) の働きがある。これを
利用すれば、細胞内のタンパク質合成を阻害してウィル
スの増殖を防止することができる。
【００２４】本発明によるハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ
オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡとの結合力乃至安定性
が高いために、他のアンチセンスＤＮＡよりも有効な薬
剤となり得る。以下においては実施例により本発明を更
に具体的に且つ詳細に説明するが、本発明は実施例に記
載される化合物、用途に限定されるものではないことに
留意され度い。
オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡとの結合力乃至安定性
が高いために、他のアンチセンスＤＮＡよりも有効な薬
剤となり得る。以下においては実施例により本発明を更
に具体的に且つ詳細に説明するが、本発明は実施例に記
載される化合物、用途に限定されるものではないことに
留意され度い。
【００２５】
【発明の実施の形態】実施例１ ：オリゴヌクレオチドの合成 本実施例では、ＨＩＶの rev タンパク質をコードする
ｍＲＮＡに対する１種類のターゲットＲＮＡと、１種類
のセンスオリゴヌクレオチドと、７種類のアンチセンス
オリゴヌクレオチド (２種類の一本鎖アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドと、５種類のハイブリッドＤＮＡ／ＲＮ
Ａオリゴヌクレオチド) とを合成した。それらの構造は
下記の通りである。
ｍＲＮＡに対する１種類のターゲットＲＮＡと、１種類
のセンスオリゴヌクレオチドと、７種類のアンチセンス
オリゴヌクレオチド (２種類の一本鎖アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドと、５種類のハイブリッドＤＮＡ／ＲＮ
Ａオリゴヌクレオチド) とを合成した。それらの構造は
下記の通りである。
【００２６】 sense-RNA (45mer HIV-1 rev RNA、配列番号 4) :
【化７】 sense-ODN (配列番号 5) :
【化８】 anti-ODN (配列番号 6) :
【化９】 anti-ODNS (配列番号 6 に相当) :
【化１０】 RD5 (配列番号 1) :
【化１１】 RD5C (配列番号 2) :
【化１２】 RD5S (配列番号 3) :
【化１３】 DRL5 (配列番号 7) :
【化１４】 DRL5S (配列番号 7 に相当) :
【化１５】 （これらの式中において、Ａはアデノシン残基、Ｔはチ
ミジン残基、Ｇはグアノシン残基、Ｃはシチジン残基を
意味し、小文字のａ、ｕ、ｇ及びｃは、それぞれ、リボ
ヌクレオチドであり、ｓはホスホロチオエート結合であ
り、ｐは燐酸基を意味する）
ミジン残基、Ｇはグアノシン残基、Ｃはシチジン残基を
意味し、小文字のａ、ｕ、ｇ及びｃは、それぞれ、リボ
ヌクレオチドであり、ｓはホスホロチオエート結合であ
り、ｐは燐酸基を意味する）
【００２７】上記のＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ
オリゴヌクレオチド、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリ
ゴヌクレオチドの合成はホスホロアミダイト法により且
つＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機 (ABI 社製) を用いて合成
した。ホスホロチオエート型のオリゴヌクレオチド (an
ti ODNS、RD5S 及び DRL5S) は通常のポリヌクレオチド
合成に用いられる酸化剤である水／沃素／ピリジン／テ
トラヒドロフランの代わりに、１５％ N,N,N',N'-テト
ラエチルチオラムジスルフィド／アセトニトリルを用い
て合成した。ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレ
オチドの環状化は Chemical phosphorylation reagent
(Glen Research 社製) を用いて、5' 末端を燐酸化させ
たハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドをホ
スホロアミダイト法で合成した後に、T4 DNA リガーゼ
を用いてライゲーションすることにより得た。調製した
オリゴヌクレオチドはポアクリルアミド電気泳動 (PAG
E)により分離し、ゲルから抽出し、エタノール沈殿また
は透析することにより精製した。
オリゴヌクレオチド、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリ
ゴヌクレオチドの合成はホスホロアミダイト法により且
つＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機 (ABI 社製) を用いて合成
した。ホスホロチオエート型のオリゴヌクレオチド (an
ti ODNS、RD5S 及び DRL5S) は通常のポリヌクレオチド
合成に用いられる酸化剤である水／沃素／ピリジン／テ
トラヒドロフランの代わりに、１５％ N,N,N',N'-テト
ラエチルチオラムジスルフィド／アセトニトリルを用い
て合成した。ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレ
オチドの環状化は Chemical phosphorylation reagent
(Glen Research 社製) を用いて、5' 末端を燐酸化させ
たハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドをホ
スホロアミダイト法で合成した後に、T4 DNA リガーゼ
を用いてライゲーションすることにより得た。調製した
オリゴヌクレオチドはポアクリルアミド電気泳動 (PAG
E)により分離し、ゲルから抽出し、エタノール沈殿また
は透析することにより精製した。
【００２８】実施例２：オリゴヌクレオチドの Tm (融
解温度) 測定 本実施例では、オリゴヌクレオチドの塩基対を形成させ
た後に温度を上昇させて吸光度曲線を求め、塩基対が剥
がれる温度 (Tm) を指標として塩基対の安定性を評価し
た。前記の実施例１で調製したそれぞれのオリゴヌクレ
オチド0.15O.D. 260を 10mM Na2HPO4-NaH2PO4 (pH 7.
0)、10mM NaCl 緩衝液により調製し、90℃ で 10 分間
加熱した。その後、室温になるまで徐々に冷却して、塩
基対を形成させた。反応液を UV セルに移し替え、1 分
間に 1℃ づつ上昇させながら、UV 測定器 (島津製作所
製の UV-2200A) で波長 260nm における吸光度を測定し
た。得られた吸光度曲線の一次微分により極大値 を算
出し、これを Tm 値とした。 温度 (℃) と変性度 (%)
との関係を図２−図７に示す。又、図２−図７の吸光度
曲線より算出した Tm 値を下記の表１に示す。
解温度) 測定 本実施例では、オリゴヌクレオチドの塩基対を形成させ
た後に温度を上昇させて吸光度曲線を求め、塩基対が剥
がれる温度 (Tm) を指標として塩基対の安定性を評価し
た。前記の実施例１で調製したそれぞれのオリゴヌクレ
オチド0.15O.D. 260を 10mM Na2HPO4-NaH2PO4 (pH 7.
0)、10mM NaCl 緩衝液により調製し、90℃ で 10 分間
加熱した。その後、室温になるまで徐々に冷却して、塩
基対を形成させた。反応液を UV セルに移し替え、1 分
間に 1℃ づつ上昇させながら、UV 測定器 (島津製作所
製の UV-2200A) で波長 260nm における吸光度を測定し
た。得られた吸光度曲線の一次微分により極大値 を算
出し、これを Tm 値とした。 温度 (℃) と変性度 (%)
との関係を図２−図７に示す。又、図２−図７の吸光度
曲線より算出した Tm 値を下記の表１に示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】sense-ODN + anti-ODN や sense-RNA + an
ti-ODN と比較する場合に、sense-ODN + anti-ODNS と
sense-RNA + anti-ODNS は Tm が下がり、一本鎖オリゴ
ヌクレオチドへのホスホチオエート結合の導入では、塩
基対形成能が低下した。RD5S では RD5 と同様に Tm は
低下せず、ループ部分へのホスホロチオエート結合の導
入は塩基対形成能を低下させることがなく、有効であっ
た。又、RD5C のTm は RD5 より高くなり、環状化する
ことにより塩基対形成能が上昇し、オリゴヌクレオチド
に安定化がもたらされることが判明した。
ti-ODN と比較する場合に、sense-ODN + anti-ODNS と
sense-RNA + anti-ODNS は Tm が下がり、一本鎖オリゴ
ヌクレオチドへのホスホチオエート結合の導入では、塩
基対形成能が低下した。RD5S では RD5 と同様に Tm は
低下せず、ループ部分へのホスホロチオエート結合の導
入は塩基対形成能を低下させることがなく、有効であっ
た。又、RD5C のTm は RD5 より高くなり、環状化する
ことにより塩基対形成能が上昇し、オリゴヌクレオチド
に安定化がもたらされることが判明した。
【００３１】実施例３：ヘビ毒ホスホジエステラーゼを
用いたオリゴヌクレオチドの耐性試験 本実施例では、オリゴヌクレオチドを 3'-エキソヌクレ
アーゼ活性を示すヌクレアーゼであるヘビ毒ホスホジエ
ステラーゼ (以下「SVPD」と称する) を用いて、ヌクレ
アーゼに対するオリゴヌクレオチドの耐性試験を行っ
た。SVPD は、通常の未修飾のオリゴヌクレオチドであ
れば、これを速やかに分解する。前記実施例１で調製し
たそれぞれのオリゴヌクレオチド 0.1 O.D. 260 を 10m
M Tris-HCl (pH 8.5)、10mM MgCl2 及び 100mM NaCl か
ら調製した緩衝液 0.7ml に溶解し、SVPD (ベーリンガ
ーマンハイム社製) 0.1μg を加えて、37℃ で保温しな
がら、UV 測定器 (島津製作所製の UV-2200A) により波
長 260nm での吸光度を1 時間測定した。結果は図８に
示されている通りであった。
用いたオリゴヌクレオチドの耐性試験 本実施例では、オリゴヌクレオチドを 3'-エキソヌクレ
アーゼ活性を示すヌクレアーゼであるヘビ毒ホスホジエ
ステラーゼ (以下「SVPD」と称する) を用いて、ヌクレ
アーゼに対するオリゴヌクレオチドの耐性試験を行っ
た。SVPD は、通常の未修飾のオリゴヌクレオチドであ
れば、これを速やかに分解する。前記実施例１で調製し
たそれぞれのオリゴヌクレオチド 0.1 O.D. 260 を 10m
M Tris-HCl (pH 8.5)、10mM MgCl2 及び 100mM NaCl か
ら調製した緩衝液 0.7ml に溶解し、SVPD (ベーリンガ
ーマンハイム社製) 0.1μg を加えて、37℃ で保温しな
がら、UV 測定器 (島津製作所製の UV-2200A) により波
長 260nm での吸光度を1 時間測定した。結果は図８に
示されている通りであった。
【００３２】未修飾のオリゴヌクレオチドである anti-
ODN は経時的に分解され、10 分後には大部分が分解さ
れてしまった。これに対して RD5、RD5C、RD5S、DRL5
及びDRL5S は殆ど分解されなかった。これにより、ハイ
ブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドはアンチセ
ンス部分にホスホロチオエート結合を導入しなくても3'
-エキソヌクレアーゼ活性を示すヌクレアーゼである SV
PD に対して強い分解抵抗性を示すことが明らかとなっ
た。
ODN は経時的に分解され、10 分後には大部分が分解さ
れてしまった。これに対して RD5、RD5C、RD5S、DRL5
及びDRL5S は殆ど分解されなかった。これにより、ハイ
ブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドはアンチセ
ンス部分にホスホロチオエート結合を導入しなくても3'
-エキソヌクレアーゼ活性を示すヌクレアーゼである SV
PD に対して強い分解抵抗性を示すことが明らかとなっ
た。
【００３３】実施例４： SI ヌクレアーゼを用いたオリ
ゴヌクレオチドの耐性試験 本実施例では、オリゴヌクレオチドをランダムに切断す
るエンドヌクレアーゼ活性を示す SI ヌクレアーゼを用
いて、このヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの
耐性試験を行った。SI ヌクレアーゼは、通常の未修飾
のオリゴヌクレオチドであれば、これを速やかに分解す
る。前記実施例１で調製したそれぞれのオリゴヌクレオ
チド 0.1 O.D. 260 を 30mM CH3COONa (pH 4.6)、280mM
NaCl 及び 1mM ZnSO4 から調製した緩衝液 0.7ml に溶
解し、SI ヌクレアーゼ (Takara社製) 27.5 units を加
えて 37℃ で保温しながら、UV 測定器 (島津製作所製
製の UV-2200A) により波長 260nm での吸光度を 1 時
間測定した。結果は図９に示される通りであった。
ゴヌクレオチドの耐性試験 本実施例では、オリゴヌクレオチドをランダムに切断す
るエンドヌクレアーゼ活性を示す SI ヌクレアーゼを用
いて、このヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの
耐性試験を行った。SI ヌクレアーゼは、通常の未修飾
のオリゴヌクレオチドであれば、これを速やかに分解す
る。前記実施例１で調製したそれぞれのオリゴヌクレオ
チド 0.1 O.D. 260 を 30mM CH3COONa (pH 4.6)、280mM
NaCl 及び 1mM ZnSO4 から調製した緩衝液 0.7ml に溶
解し、SI ヌクレアーゼ (Takara社製) 27.5 units を加
えて 37℃ で保温しながら、UV 測定器 (島津製作所製
製の UV-2200A) により波長 260nm での吸光度を 1 時
間測定した。結果は図９に示される通りであった。
【００３４】未修飾のオリゴヌクレオチドである anti-
ODN は経時的に分解され、10 分後には大部分が分解さ
れてしまった。これに対して RD5、RD5C、RD5S、DRL5
及びDRL5S は殆ど分解されなかった。殊に、RD5C はホ
スホロチオエート結合を導入した一本鎖のオリゴヌクレ
オチドである anti-ODNS よりも分解されなかった。ハ
イブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドはアンチ
センス部分にホスホロチオエート結合を導入しなくても
エンドヌクレアーゼ活性を示す SI ヌクレアーゼに対し
て強い分解抵抗性を示すことが明かになった。
ODN は経時的に分解され、10 分後には大部分が分解さ
れてしまった。これに対して RD5、RD5C、RD5S、DRL5
及びDRL5S は殆ど分解されなかった。殊に、RD5C はホ
スホロチオエート結合を導入した一本鎖のオリゴヌクレ
オチドである anti-ODNS よりも分解されなかった。ハ
イブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドはアンチ
センス部分にホスホロチオエート結合を導入しなくても
エンドヌクレアーゼ活性を示す SI ヌクレアーゼに対し
て強い分解抵抗性を示すことが明かになった。
【００３５】実施例５：ウシ血清を用いたオリゴヌクレ
オチドの耐性試験 本試験例では、１０％ FBSMEM 培地に対するオリゴヌク
レオチドの耐性試験を行なった。前記の実施例１で調製
したそれぞれのオリゴヌクレオチド 0.2 O.D.260 を 10
％ FBS MEM 培地 100μl に添加し、37℃ で保温しなが
ら、3、6、12及び 24 時間反応させた。それぞれの反応
液 20μl に水 20μl 及びフェノール: クロロホルム
(1 : 1) 20μl を添加して攪拌し、15000 rpm で 10 分
間遠心処理し、水層を抽出した。得られた水層 20μl
を遠心エバポレート後、7M 尿素溶液 10μl に溶解さ
せ、10％ PAGE、7M 尿素、TBE で分析した。結果は図１
０に示される通りであった。未修飾のオリゴヌクレオチ
ドである anti-ODM が 24 時間後には完全に分解された
のに対して、RD5、RD5C、RD5S、DRL5 及び DRL5S は 24
時間後においても一部が分解されずに残留した。これ
から、本発明によるハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴ
ヌクレオチドはアンチセンス部分にホスホロチオエート
結合を導入しなくても血清に対して分解抵抗性を示すこ
とが明らかになった。
オチドの耐性試験 本試験例では、１０％ FBSMEM 培地に対するオリゴヌク
レオチドの耐性試験を行なった。前記の実施例１で調製
したそれぞれのオリゴヌクレオチド 0.2 O.D.260 を 10
％ FBS MEM 培地 100μl に添加し、37℃ で保温しなが
ら、3、6、12及び 24 時間反応させた。それぞれの反応
液 20μl に水 20μl 及びフェノール: クロロホルム
(1 : 1) 20μl を添加して攪拌し、15000 rpm で 10 分
間遠心処理し、水層を抽出した。得られた水層 20μl
を遠心エバポレート後、7M 尿素溶液 10μl に溶解さ
せ、10％ PAGE、7M 尿素、TBE で分析した。結果は図１
０に示される通りであった。未修飾のオリゴヌクレオチ
ドである anti-ODM が 24 時間後には完全に分解された
のに対して、RD5、RD5C、RD5S、DRL5 及び DRL5S は 24
時間後においても一部が分解されずに残留した。これ
から、本発明によるハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴ
ヌクレオチドはアンチセンス部分にホスホロチオエート
結合を導入しなくても血清に対して分解抵抗性を示すこ
とが明らかになった。
【００３６】実施例６：オリゴヌクレオチドによる RNa
se H での標的ＲＮＡの分解 本実施例では、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌク
レオチドの RNase Hによる分解と、その分解によって露
呈されたアンチセンス部分と標的ＲＮＡとの塩基対形成
後の RNase H による標的ＲＮＡの分解能力を評価し
た。前記実施例１で調製したそれぞれのオリゴヌクレオ
チド 0.33nmol と標的ＲＮＡ 0.33nmolを 20mM Tris-HC
l 緩衝液 (pH 7.6)、10mM MgCl2、100m KCl、1mM DTT
緩衝液、RNase H 7.5 units、RNasin 12.7 units で 37
℃ 1、２ 又は 4 時間反応させ、70％濃度となるように
EtOH を添加し、-20℃ で 30 分間以上冷却した後、15
000rpm で 15 分間遠心処理することにより沈殿を得
た。得られた沈殿を 9M尿素溶液 5μl に溶解し、10％
PAGE、TBE、50℃ の条件下で分析した。但し、オリゴヌ
クレオチドは反応前に 90℃ で５分間加熱し、室温にな
るまで徐々に冷却したものを使用した。結果は図１１及
び１２に示される通りであった。
se H での標的ＲＮＡの分解 本実施例では、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌク
レオチドの RNase Hによる分解と、その分解によって露
呈されたアンチセンス部分と標的ＲＮＡとの塩基対形成
後の RNase H による標的ＲＮＡの分解能力を評価し
た。前記実施例１で調製したそれぞれのオリゴヌクレオ
チド 0.33nmol と標的ＲＮＡ 0.33nmolを 20mM Tris-HC
l 緩衝液 (pH 7.6)、10mM MgCl2、100m KCl、1mM DTT
緩衝液、RNase H 7.5 units、RNasin 12.7 units で 37
℃ 1、２ 又は 4 時間反応させ、70％濃度となるように
EtOH を添加し、-20℃ で 30 分間以上冷却した後、15
000rpm で 15 分間遠心処理することにより沈殿を得
た。得られた沈殿を 9M尿素溶液 5μl に溶解し、10％
PAGE、TBE、50℃ の条件下で分析した。但し、オリゴヌ
クレオチドは反応前に 90℃ で５分間加熱し、室温にな
るまで徐々に冷却したものを使用した。結果は図１１及
び１２に示される通りであった。
【００３７】未修飾のオリゴヌクレオチドである anti-
ODN は標的ＲＮＡを 4 時間後にほぼ完全に分解した。
ホスホロチオエート結合を導入した anti-ODNS の場合
には4 時間後でも標的ＲＮＡが一部分分解されずに残留
した。一本鎖オリゴヌクレオチドヘホスホチオエート結
合を導入することにより、RNase H による標的ＲＮＡの
分解能は低下した。RD5 と RD5C の場合には RNase H
による標的ＲＮＡの分解はanti-ODN に比べて遅いが、
標的ＲＮＡを分解した。分解が遅い理由は、一端、自体
のセンスＲＮＡ領域が RNase H により分解されない
と、その後のアンチセンス領域と標的ＲＮＡとの二重鎖
の形成、標的ＲＮＡの分解ができないからである。RD5
S、DRL5 及び DRL5S の場合には RNase H による標的Ｒ
ＮＡの分解能はかなり低下したが、これは、自体のセン
スＲＮＡ領域が RNase H により分解され難いことに起
因するものと推定された。これらの結果から、ハイブリ
ッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドはヘアピンルー
プ構造をとっていても、RNase H によって標的ＲＮＡを
分解する活性を有していることが判明した。
ODN は標的ＲＮＡを 4 時間後にほぼ完全に分解した。
ホスホロチオエート結合を導入した anti-ODNS の場合
には4 時間後でも標的ＲＮＡが一部分分解されずに残留
した。一本鎖オリゴヌクレオチドヘホスホチオエート結
合を導入することにより、RNase H による標的ＲＮＡの
分解能は低下した。RD5 と RD5C の場合には RNase H
による標的ＲＮＡの分解はanti-ODN に比べて遅いが、
標的ＲＮＡを分解した。分解が遅い理由は、一端、自体
のセンスＲＮＡ領域が RNase H により分解されない
と、その後のアンチセンス領域と標的ＲＮＡとの二重鎖
の形成、標的ＲＮＡの分解ができないからである。RD5
S、DRL5 及び DRL5S の場合には RNase H による標的Ｒ
ＮＡの分解能はかなり低下したが、これは、自体のセン
スＲＮＡ領域が RNase H により分解され難いことに起
因するものと推定された。これらの結果から、ハイブリ
ッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドはヘアピンルー
プ構造をとっていても、RNase H によって標的ＲＮＡを
分解する活性を有していることが判明した。
【００３８】
【発明の効果】本発明のハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオ
リゴヌクレオチドは、それ自身で安定化した塩基対を形
成し、生体内の各種ヌクレアーゼの分解に対して抵抗性
を有しており、生体内、殊に標的部位の RNase H によ
って自己のセンスＲＮＡ領域が分解され、露呈されたア
ンチセンスＤＮＡ領域が標的となるＲＮＡと二重鎖を形
成し標的ＲＮＡを分解する。更に、このハイブリッドＤ
ＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡを分解す
ることから、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレ
オチドを含有する抗ウィルス剤は、ウィルスの増殖を阻
害することができる。
リゴヌクレオチドは、それ自身で安定化した塩基対を形
成し、生体内の各種ヌクレアーゼの分解に対して抵抗性
を有しており、生体内、殊に標的部位の RNase H によ
って自己のセンスＲＮＡ領域が分解され、露呈されたア
ンチセンスＤＮＡ領域が標的となるＲＮＡと二重鎖を形
成し標的ＲＮＡを分解する。更に、このハイブリッドＤ
ＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡを分解す
ることから、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレ
オチドを含有する抗ウィルス剤は、ウィルスの増殖を阻
害することができる。
配列番号 : 1 配列の長さ : 40 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : ペプチド アンチセンス : Yes 配列 gcaucuccCC CCCGGAGATG CCTAAGGCCC CCCgccuuag 配列番号 : 2 配列の長さ : 40 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 環状 配列の種類 : ペプチド アンチセンス : Yes 配列 gcaucuccCC CCCGGAGATG CCTAAGGCCC CCCgccuuag 配列番号 : 3 配列の長さ : 40 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : ペプチド アンチセンス : Yes 配列 gcaucuccCC CCCGGAGATG CCTAAGGCCC CCCgccuuag 配列番号 : 4 配列の長さ : 45 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : ペプチド アンチセンス : No 配列 uguuucacaa caaaagccuu aggcaucucc uauggcagga agaag 配列番号 : 5 配列の長さ : 15 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : ペプチド アンチセンス : No 配列 GCCTTAGGCA TCTCC 配列番号 : 6 配列の長さ : 15 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : ペプチド アンチセンス : Yes 配列 GGAGATGCCT AAGGC 配列番号 : 7 配列の長さ : 40 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : ペプチド アンチセンス : Yes 配列 CCCGGAGATG CCTAAGGCCC CCCgccuuag gcaucuccCC
【図１】HIV のライフサイクルを示す説明図である。
【図２】sense-ODN + anti-ODN、sense-ODN + anti-ODN
S、sense-RNA + anti-ODN 及びsense-RNA + anti-ODNS
の場合の融解温度曲線である。
S、sense-RNA + anti-ODN 及びsense-RNA + anti-ODNS
の場合の融解温度曲線である。
【図３】図２に示された融解温度の一次微分曲線であ
る。
る。
【図４】RD5、RD5C、RD5S 及び RD5SC の場合の融解温
度曲線である。
度曲線である。
【図５】図４に示された融解温度の一次微分曲線であ
る。
る。
【図６】DR5、DR5S、DRL5 及び DRL5S の場合の融解温
度曲線である。
度曲線である。
【図７】図６に示された融解温度の一次微分曲線であ
る。
る。
【図８】ヘビ毒ホスホジエステラーゼに対するオリゴヌ
クレオチドの耐性試験結果を示すグラフである。
クレオチドの耐性試験結果を示すグラフである。
【図９】SI ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチド
の耐性試験結果を示すグラフである。
の耐性試験結果を示すグラフである。
【図１０】ウシ血清に対するオリゴヌクレオチドの耐性
試験結果を示す電気泳動の撮影像である。
試験結果を示す電気泳動の撮影像である。
【図１１】オリゴヌクレオチドによる RNase H での標
的 RNA に対する分解能を電気泳動により調べた結果を
示す撮影像である。
的 RNA に対する分解能を電気泳動により調べた結果を
示す撮影像である。
【図１２】図１１と同様の、但し他のヌクレオチドの場
合を示す撮影像である。
合を示す撮影像である。
Claims (13)
- 【請求項１】 少なくともヘアピンループ部分を２つ有
しており、標的ＲＮＡに相補的なアンチセンスＤＮＡ
と、センスＲＮＡとにより分子内塩基配列が組まれてい
ることを特徴とする、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリ
ゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 ヘアピンループ部分を２つ有しており、
ハンマーヘッド型であることを特徴とする、請求項１に
記載のハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項３】 ハンマーヘッド型であり且つ環状である
ことを特徴とする、請求項２に記載のハイブリッドＤＮ
Ａ／ＲＮＡオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 ハンマーヘッド型であり且つ一箇所にニ
ックを有していることを特徴とする、請求項２に記載の
ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチド。 - 【請求項５】 ハンマーヘッド型であり且つステム部分
のセンスＲＮＡ側にニックを一箇所有していることを特
徴とする、請求項４に記載のハイブリッドＤＮＡ／ＲＮ
Ａオリゴヌクレオチド。 - 【請求項６】 ループ部分に少なくとも１つのホスホロ
チオエート結合を有していることを特徴とする、請求項
１−５の何れか一つに記載のハイブリッドＤＮＡ／ＲＮ
Ａオリゴヌクレオチド。 - 【請求項７】 ループ部分がすべてホスホロチオエート
結合であることを特徴とする、請求項１、２、４又は５
に記載のハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項８】 ウィルスのＲＮＡ遺伝子に対して相補的
であるアンチセンスＤＮＡを有していることを特徴とす
る、請求項１−７の何れか一つに記載のハイブリットＤ
ＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチド。 - 【請求項９】 ウィルスがＨＩＶ（Human Immunodefici
ency Virus)であることを特徴とする、請求項８に記載
のハイブリットＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１０】RD5 (配列番号 1) : 【化１】 （式中、Ａはアデノシン残基、Ｔはチミジン残基、Ｇは
グアノシン残基、Ｃはシチジン残基を意味し、小文字の
ａ、ｕ、ｇ及びｃは、それぞれ、リボヌクレオチドであ
り、ヌクレオチド間の結合はホスホジエステル結合であ
り、ｐは燐酸基を意味する）にて示される塩基配列を有
していることを特徴とする、請求項１−９の何れか一つ
に記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１１】RD5C (配列番号 2) : 【化２】 （式中、Ａはアデノシン残基、Ｔはチミジン残基、Ｇは
グアノシン残基、Ｃはシチジン残基を意味し、小文字の
ａ、ｕ、ｇ及びｃは、それぞれ、リボヌクレオチドであ
り、ヌクレオチド間の結合はホスホジエステル結合であ
る）にて示される塩基配列を有していることを特徴とす
る、請求項１−９の何れか一つに記載のオリゴヌクレオ
チド。 - 【請求項１２】RD5S (配列番号 2 に相当) : 【化３】 （式中、Ａはアデノシン残基、Ｔはチミジン残基、Ｇは
グアノシン残基、Ｃはシチジン残基であり、小文字の
ａ、ｕ、ｇ及びｃは、それぞれ、リボヌクレオチドであ
り、ｓはホスホロチオエート結合であり、他のヌクレオ
チド間の結合はホスホジエステル結合であり、ｐは燐酸
基を意味する）にて示される塩基配列を有していること
を特徴とする、請求項１−９の何れか一つに記載のオリ
ゴヌクレオチド。 - 【請求項１３】請求項１−１２の何れか一つに記載のハ
イブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドを有効成
分として含有していることを特徴とする、抗ウィルス
剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7268442A JPH09110894A (ja) | 1995-10-17 | 1995-10-17 | ハイブリッドｄｎａ／ｒｎａオリゴヌクレオチド及び抗ウイルス剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7268442A JPH09110894A (ja) | 1995-10-17 | 1995-10-17 | ハイブリッドｄｎａ／ｒｎａオリゴヌクレオチド及び抗ウイルス剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09110894A true JPH09110894A (ja) | 1997-04-28 |
Family
ID=17458566
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7268442A Pending JPH09110894A (ja) | 1995-10-17 | 1995-10-17 | ハイブリッドｄｎａ／ｒｎａオリゴヌクレオチド及び抗ウイルス剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09110894A (ja) |
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