JP2018203779A - キメラ2重鎖核酸 - Google Patents
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Abstract
Description
(1) 標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって抑制する活性を有する、下記(a)及び(b)の核酸を含む二重鎖核酸
(a)標的遺伝子の転写産物に相補的なアンチセンス核酸であって、4塩基以上の連続したDNAからなる領域を含む核酸
(b)(a)の核酸に相補的な核酸。
(2) (a)の核酸が、前記4塩基以上の連続したDNAからなる領域の5'末側及び3'末側の少なくともいずれか一方に配置された修飾核酸を含む領域をさらに含む核酸である(1)に記載の二重鎖核酸。
(3) (a)の核酸の修飾核酸を含む領域が、4塩基以上の連続したDNAからなる領域の5'末側及び3'末側に配置された修飾核酸を含む領域であり、該修飾核酸がLNAである、(2)に記載の二重鎖核酸。
(4) (b)の核酸がRNA又はPNAである、(1)〜(3)のいずれか一に記載の二重鎖核酸。
(5) (b)の核酸がRNAであって、(a)の核酸の修飾核酸を含む領域に対して相補的な領域が修飾されており、前記修飾がRNA分解酵素による分解を抑制する効果を有するものである、(1)〜(3)のいずれか一に記載の二重鎖核酸。
(6) 前記修飾が、2’−O−メチル化及び/又はホスホロチオエート化である、(5)に記載の二重鎖核酸。
(7) (b)の核酸に機能性分子が結合している、(1)〜(6)のいずれか一に記載の二重鎖核酸。
(8) (a)又は(b)の核酸の鎖長が同一である、(1)〜(7)のいずれか一に記載の二重鎖核酸。
(9) (a)又は(b)の核酸の鎖長が異なる、(1)〜(7)のいずれか一に記載の二重鎖核酸。
(10) さらに、下記(c)の核酸を含む、(9)に記載の二重鎖核酸
(c)(a)又は(b)の核酸のうち鎖長が長い核酸における他の一方の核酸に対して突出した領域に対して相補的な核酸。
(11) (c)の核酸がPNAである、(10)に記載の二重鎖核酸。
(12) (c)の核酸に機能性分子が結合している、(10)又は(11)に記載の二重鎖核酸。
(13) 機能性分子が、二重鎖核酸を標的部位に送達させる活性を有する分子である、(7)又は(12)に記載の二重鎖核酸。
(14) (1)〜(13)のいずれか一に記載の二重鎖核酸を有効成分として含有する、標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって抑制するための組成物。
(15) 細胞内の転写産物レベルを低減する方法であって、
該細胞と組成物とを接触させる工程を含み、
該組成物は、(a)第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖を含む二重鎖核酸複合体を含み、
第1の核酸鎖は、
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は8〜100であり、
(ii)前記転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含み、
(iii)前記転写産物にハイブリダイズする
核酸鎖であり、かつ、
第2の核酸鎖は、ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含む核酸鎖である、方法。
(16) 哺乳動物における遺伝子の発現レベルを低減する方法であって、
該哺乳動物に、医薬組成物を有効量投与する工程を含み、
該医薬組成物は、(a)第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖を含む二重鎖核酸複合体と、(b)薬理学上許容される担体とを含み、
第1の核酸鎖は、
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は8〜100であり、
(ii)前記遺伝子の転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含み、
(iii)前記転写産物にハイブリダイズする
核酸鎖であり、かつ、
第2の核酸鎖は、ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含む核酸鎖である、方法。
(17) 精製又は単離された二重鎖核酸複合体であって、
第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖を含み、
第1の核酸鎖は、
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は8〜100であり、
(ii)転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含み、
(iii)少なくとも1つの非天然ヌクレオチドを含み、かつ、
(iv)前記転写産物にハイブリダイズする
核酸鎖であり、かつ、
第2の核酸鎖は、ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
(18) 哺乳動物を治療するための医薬組成物であって、前記転写産物が哺乳動物の転写産物であり、(17)に記載の二重鎖核酸複合体と、薬理学上許容される担体とを含む、医薬組成物。
<1> 精製又は単離された二重鎖核酸複合体であって、
第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖を含み、
第1の核酸鎖は、DNAヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、
また、第1の核酸鎖は、5’末側に配置された1又は複数のヌクレアーゼ耐性のヌクレオチドを含む5’ウィング領域、及び/又は、3’末側に配置された1又は複数のヌクレアーゼ耐性のヌクレオチドを含む3’ウィング領域を含み、
また、第1の核酸鎖は、少なくとも4つの連続したDNAヌクレオチドを含み、
また、第1の核酸鎖におけるDNAヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの総数は、10〜100ヌクレオチドであり、
第1の核酸鎖は、転写産物の配列の一部と相補的な少なくとも10個の連続したヌクレオチド配列を更に有し、かつ、
第2の核酸鎖は、
(i)RNAヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にDNAヌクレオチドとを含み、
(ii)DNAヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログを含み、又は、
(iii)PNAヌクレオチドを含み、
また、第2の核酸鎖は、5’末側に配置された1又は複数のヌクレアーゼ耐性のヌクレオチドを含む5’ウィング領域、及び/又は、3’末側に配置された1又は複数のヌクレアーゼ耐性のヌクレオチドを含む3’ウィング領域を含み、
また、第2の核酸鎖におけるRNAヌクレオチド、DNAヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ及びPNAヌクレオチドの総数は、10〜100ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
<2> 前記転写産物は、タンパク質をコードするmRNA転写産物である、<1>に記載の二重鎖核酸複合体。
<3> 前記転写産物は、タンパク質をコードしない転写産物である、<1>に記載の二重鎖核酸複合体。
<4> <1>〜<3>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖におけるヌクレオチドの数と、第2の核酸鎖におけるそれとが同じである、二重鎖核酸複合体。
<5> <1>〜<3>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖におけるヌクレオチドの数と、第2の核酸鎖におけるそれとが異なる、二重鎖核酸複合体。
<6> <5>に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖におけるヌクレオチドの数が、第1の核酸鎖におけるヌクレオチドの数よりも大きい、二重鎖核酸複合体。
<7> <1>〜<6>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖に含まれるヌクレオチドの総数が10〜35ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
<8> <1>〜<7>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖に含まれるヌクレオチドは、全てヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
<9> <1>〜<8>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、
1又は複数のヌクレオチドアナログを含む前記5’ウィング領域、及び/又は、
3’末側に配置された1又は複数のヌクレオチドアナログを含む前記3’ウィング領域を含む、二重鎖核酸複合体。
<10> <1>〜<9>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、
5’末側に少なくとも2つの連続したヌクレオチドアナログからなる前記5’ウィング領域と、3’末側に少なくとも2つの連続したヌクレオチドアナログからなる前記3’ウィング領域とを含む、二重鎖核酸複合体。
<11> <10>に記載の二重鎖核酸複合体であって、
前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域が、独立して2〜10個のヌクレオチドアナログからなる、二重鎖核酸複合体。
<12> 請求項11に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域が、独立して2〜3個のヌクレオチドアナログを含む、方法。
<13> <1>〜<12>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖が、少なくとも1つのヌクレオチドアナログを含み、該ヌクレオチドアナログが架橋化ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
<14> <1>〜<13>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖に含まれるヌクレオチドアナログは、架橋化ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
<15> <14>に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖における前記架橋化ヌクレオチドが、LNA、cEt−BNA、アミドBNA(AmNA)及びcMOE−BNAから独立して選択される架橋化ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
<16> <14>に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖における前記架橋化ヌクレオチドが、4’−(CH2)p−O−2’、4’−(CH2)p−S−2’、4’−(CH2)p−OCO−2’、4’−(CH2)n−N(R3)−O−(CH2)m−2’によって、2’位の炭素と4’位の炭素とが架橋されているリボヌクレオチドから選択される架橋化ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体(p、m及びnは、各々1〜4、0〜2及び1〜3の整数である。R3は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は、細胞内若しくは核内移行シグナルペプチドを示す)。
<17> <1>〜<16>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖における前記DNAヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、二重鎖核酸複合体。
<18> <1>〜<17>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖における前記ヌクレオチドアナログがホスホロチオエート化されている、二重鎖核酸複合体。
<19> <1>〜<18>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖は、4〜20個の連続したDNAヌクレオチドからなる部分を含む、二重鎖核酸複合体。
<20> <1>〜<19>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖が、
(i)5’末側に少なくとも2つの連続したヌクレオチドアナログからなる5’ウィング領域、
(ii)3’末側に少なくとも2つの連続したヌクレオチドアナログからなる3’ウィング領域、及び、
(iii)少なくとも4個の連続したDNAヌクレオチド
を含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
<21> <1>〜<19>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖は、
(i)5’末側に少なくとも2つの連続したヌクレオチドアナログからなる5’ウィング領域、
(ii)3’末側に少なくとも2つの連続したヌクレオチドアナログからなる3’ウィング領域、及び、
(iii)少なくとも4個の連続したDNAヌクレオチド
を含み、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域における前記ヌクレオチドアナログは架橋化ヌクレオチドであり、前記架橋化ヌクレオチド及び前記DNAヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、二重鎖核酸複合体。
<22> <1>〜<21>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第1の核酸鎖の鎖長が12〜25ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
<23> <1>〜<22>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖が、RNAヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログと、任意にDNAとを含む、二重鎖核酸複合体。
<24> <23>に記載の二重鎖核酸複合体であって、
第2の核酸鎖における前記5’ウィング領域は少なくとも1のヌクレオチドアナログを含み、第2の核酸鎖における前記3’ウィング領域は少なくとも1のヌクレオチドアナログを含み、かつ、第2の核酸鎖は、少なくとも4個の連続したRNAヌクレオチドを含む、二重鎖核酸複合体。
<25> <23>に記載の二重鎖核酸複合体であって、
第2の核酸鎖における前記5’ウィング領域は少なくとも1のホスホロチオエート化されているヌクレオチドを含み、第2の核酸鎖における前記3’ウィング領域は少なくとも1のホスホロチオエート化されているヌクレオチドを含み、かつ、第2の核酸鎖は、少なくとも4個の連続したRNAヌクレオチドを含む、二重鎖核酸複合体。
<26> <24>又は<25>に記載の二重鎖核酸複合体であって、
第2の核酸鎖における前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域の全てのヌクレオチドが、ホスホロチオエート化されている、二重鎖核酸複合体。
<27> <24>〜<26>のいずれか一に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖における前記ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドは、架橋化ヌクレオチド及び2’−O−メチル化RNAから独立して選択されるヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
<28> <27>に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖における前記架橋化ヌクレオチドは、LNA、cEt−BNA、アミドBNA(AmNA)及びcMOE−BNAから独立して選択される架橋化ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体。
<29> <27>に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖における前記架橋化ヌクレオチドが、4’−(CH2)p−O−2’、4’−(CH2)p−S−2’、4’−(CH2)p−OCO−2’、4’−(CH2)n−N(R3)−O−(CH2)m−2’によって、2’位の炭素と4’位の炭素とが架橋されているリボヌクレオチドから選択される架橋化ヌクレオチドである、二重鎖核酸複合体(p、m及びnは、各々1〜4、0〜2及び1〜3の整数である。R3は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は、細胞内若しくは核内移行シグナルペプチドを示す)。
<30> <24>に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖は、
(i)前記5’末側に少なくとも2つの、ホスホロチオエート化されている2’−O−メチル化RNAヌクレオチドからなる5’ウィング領域、
(ii)前記3’末側に少なくとも2つの、ホスホロチオエート化されている2’−O−メチル化RNAヌクレオチドからなる3’ウィング領域、及び、
(iii)少なくとも4個の連続した天然RNAヌクレオチドであって、独立して、任意にホスホロチオエート化されている天然RNAヌクレオチド
を含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
<31> <24>に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖は、
(i)前記5’末側に少なくとも2つの、ホスホロチオエート化されている架橋化ヌクレオチドからなる5’ウィング領域、
(ii)前記3’末側に少なくとも2つの、ホスホロチオエート化されている架橋化ヌクレオチドからなる3’ウィング領域、及び、
(iii)少なくとも4個の連続した天然RNAヌクレオチドであって、独立して、任意にホスホロチオエート化されている天然RNAヌクレオチド
を含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
<32> <1>〜<22>のいずれか1に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖はPNAヌクレオチドを含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
<33> <23>〜<32>のいずれか1に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分を更に含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
<34> <1>〜<3>及び<5>〜<33>のいずれか1に記載の二重鎖核酸複合体であって、第2の核酸鎖にアニーリングする第3の核酸鎖を更に含む二重鎖核酸複合体。<35> <34>に記載の二重鎖核酸複合体であって、
第3の核酸鎖は、DNAヌクレオチド及び任意にヌクレオチドアナログを含み、
また、第3の核酸鎖は、4個の連続したDNAヌクレオチドを含み、
ヌクレオチドの総数が10〜100ヌクレオチドであり、
該第3の核酸鎖は、転写産物の配列の一部と相補的な少なくとも10個の連続したヌクレオチド配列を更に有する、二重鎖核酸複合体。
<36> <35>に記載の二重鎖核酸複合体であって、第3の核酸鎖は、
(i)前記5’末側に少なくとも2つの連続したヌクレオチドアナログからなる5’ウィング領域、
(ii)前記3’末側に少なくとも2つの連続したヌクレオチドアナログからなる3’ウィング領域、及び、
(iii)少なくとも4個の連続したDNAヌクレオチド
を含み、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域における前記ヌクレオチドアナログは架橋化ヌクレオチドであり、前記架橋化ヌクレオチド及び前記DNAヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、二重鎖核酸複合体。
<37> <34>に記載の二重鎖核酸複合体であって、第3の核酸鎖はPNAヌクレオチドを含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
<38> <34>〜<37>のいずれか1に記載の二重鎖核酸複合体であって、第3の核酸鎖が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分を更に含む核酸鎖である、二重鎖核酸複合体。
<39> <33>〜<38>のいずれか1に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記機能性部分が、脂質、ペプチド及びタンパク質から選択される分子である、二重鎖核酸複合体。
<40> <39>に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記機能性部分が、前記3’末端のヌクレオチド又は前記5’末端のヌクレオチドに結合している、二重鎖核酸複合体。<41> <39>又は<40>に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記機能性部分が脂質である、二重鎖核酸複合体。
<42> <41>に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記機能性部分が、コレステロール、脂肪酸、脂溶性ビタミン、糖脂質及びグリセリドから選択される脂質である、二重鎖核酸複合体。
<43> <41>に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記機能性部分が、コレステロール、トコフェロール及びトコトリエノールから選択される脂質である、二重鎖核酸複合体。
<44> <39>又は<40>に記載の二重鎖核酸複合体であって、前記機能性部分が、受容体のリガンド及び抗体から選択されるペプチド又はタンパク質である、二重鎖核酸複合体。
<45> 薬理学上許容される担体と、<1>〜<44>のうちのいずれかに記載の二重鎖核酸複合体とを含む、医薬組成物。
<46> 哺乳動物において遺伝子の発現を低減するための薬剤を製造するための、<1>〜<44>のうちのいずれかに記載の二重鎖核酸複合体の使用。
<47> 哺乳動物において遺伝子の発現を低減するための、<1>〜<44>のうちのいずれかに記載の二重鎖核酸複合体の使用。
<48> 哺乳動物における遺伝子の発現レベルを低減する方法であって、
該哺乳動物に、医薬組成物を有効量投与する工程を含み、
第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖と、薬理学上許容される担体とを含む、単離又は精製された二重鎖核酸複合体を、前記医薬組成物は含み、
第1の核酸鎖は、DNAヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、少なくとも4個の連続したDNAヌクレオチドとを含み、第1の核酸鎖におけるDNAヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの総数は10〜100ヌクレオチドであり、
第1の核酸鎖は、哺乳動物の転写産物の配列の一部と相補的な少なくとも10個の連続したヌクレオチド配列を更に有し、かつ、
第2の核酸鎖は、
(i)RNAヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にDNAヌクレオチドとを含み、
(ii)DNAヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログを含み、又は、
(iii)PNAヌクレオチドを含み、
第2の核酸鎖におけるRNAヌクレオチド、DNAヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ及びPNAヌクレオチドの総数は、10〜100ヌクレオチドである、方法。
<49> <48>に記載の方法であって、投与経路が経腸管的である、方法。
<50> <48>に記載の方法であって、投与経路が非経腸管的である、方法。
<51> <48>〜<50>のいずれか一に記載の方法であって、前記二重鎖核酸複合体の投与量が、0.001mg/kg/日〜50mg/kg/日である、方法。
<52> <48>〜<51>の方法であって、前記哺乳動物がヒトある、方法。
ある実施形態において、精製又は単離された二重鎖核酸複合体は、第2の核酸鎖にアニーリングしている第1の核酸鎖を含み、標的遺伝子の発現、又は通常転写産物レベルをアンチセンス効果によって抑制する活性を有する。
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は8〜100であり、
(ii)転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含み、
(iii)少なくとも1つの非天然ヌクレオチドを含み、
(iv)前記転写産物にハイブリダイズする。
(i)RNAヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にDNAヌクレオチドとを含み、
(ii)DNAヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログを含み、又は、
(iii)PNAヌクレオチドを含む。
R1、R2は、同一又は異なっていてもよく、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、又は、−P(R4)R5[ここで、R4及びR5は、同一又は異なっていてもよく、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数1〜5のアルコキシ基、炭素数1〜5のアルキルチオ基、炭素数1〜6のシアノアルコキシ基、又は、炭素数1〜5のアルキル基で置換されたアミノ基を示す。]を示す。
(ii)DNAヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログを含み、又は、(iii)PNAヌクレオチドを含む。
アンチセンス法におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)の安定性、生体内における標的遺伝子の発現に対する抑制活性(アンチセンス効果)及び送達性を向上させるべく、コレステロールを直接結合させた、LNAヌクレオチド及びDNAヌクレオチドを含むASO(LNA/DNAギャップマー)の生体内における送達性及びアンチセンス効果を評価した。
GCattggtatTC(大文字:LNA、小文字:DNA、核酸間:ホスホロチオエート結合)(配列番号:1)。
コレステロール等の機能性部分をLNA/DNAギャップマー(アンチセンス鎖)に直接結合すると、そのアンチセンス効果が損なわれてしまうことが明らかになった。そこで、ASOの相補鎖が、ASOを直接送達するための機能性部分のキャリアーとして機能する、二重鎖核酸複合体を利用することを本発明者らは着想した。図9に、かかる複合体の1の実施態様の概略を示す。
cRNA(o):5’−GAAUACCAAUGC−3’(配列番号:2)
cRNA(G):5’−gsasAUACCAAUsgsc−3’(配列番号:3)
cRNA(m/s):5’−gsasasusascscsasasusgsc−3’(配列番号:4)
(大文字:RNA,小文字:2’−OMe−RNA,s:核酸間の結合がホスホロチエート結合)。
実施例1と同様に、通常のRNAのみからなる相補鎖(cRNA(o))(配列番号:2)、全てのRNAにおいて2’−OMe(2’−O−メチル化)修飾及び核酸間がホスホロチオエート結合(S化)してある相補鎖(cRNA(m/S))(配列番号:4)、末端の2塩基のRNAのみに2’−OMe修飾及び核酸間がS化してあり、中央の8塩基を通常のRNAとしている相補鎖(cRNA(G))(配列番号:3)を用意し、いずれもLNA/DNAギャップマーとアニーリングさせ、二重鎖核酸を調製した。LNA/DNAギャップマーの標的遺伝子はラット由来のアポリポ蛋白B(rApoB)遺伝子である。ASOは、株式会社ジーンデザインにおいて合成にて製造された。
次に、図15に示す通り、前記cRNA(G)の5’末端にトコフェロール(Toc)を結合させた相補的RNA鎖(Toc−cRNA(G))を作製した。さらにLNA/DNAギャップマー(アンチセンス鎖)をアニーリングさせることにより、間接的にトコフェロールをアンチセンス鎖に結合することに成功した。なお、実施例において用いたLNA/DNAギャップマー及び相補鎖(cRNA)の配列、構成及び鎖長は下記の通りである。
1.ASO 12mer:5’−GCattggtatTC−3’(配列番号:1)
2.ASO 13mer:5’−GCattggtatTCA−3’(配列番号:5) 3.ASO 14mer:5’−AGCattggtatTCA−3’(配列番号:6)
(大文字:LNA、小文字:DNA、核酸間は全てホスホロチオエート結合である)
相補鎖
1.cRNA 12mer:5’−gsasAUACCAAUsgsc−3’(配列番号:2)
2.cRNA 13mer:5’−usgsasAUACCAAUsgsc−3’(配列番号:7)
3.cRNA 14mer:5’−usgsasAUACCAAUsgscsu−3’(配列番号:6)
(大文字:RNA、小文字:2’−OMe−RNA、下線付:PNA、s:核酸間がホスホロチオエート結合である)。
実施例3に記載の方法と同様の方法にて、ASO/Toc−cRNAの標的遺伝子に対する特異性を評価した。すなわち、13塩基の鎖長を有するLNA/DNAギャップマー及びToc−cRNA(G)を含む二重鎖核酸(ASO/Toc−cRNA(G))を調製した。そして、それをマウスに静脈注射し、当該マウスから得られた肝臓由来のcDNAを用いて、肝臓内の標的遺伝子(mApoB遺伝子)及び内在性コントロール遺伝子(mTTR遺伝子、mSOD1遺伝子及びmGAPDH遺伝子)の発現を定量的PCRにて評価した。なお、定量的RT−PCRに用いたプライマーは、各遺伝子番号を元にライフテクノロジー社が設計、調製したものを使用した。得られた結果を図17に示す。
実施例3に記載の方法と同様の方法にて、13塩基の核酸鎖を用い、ASO/Toc−cRNA(G)によるアンチセンス効果の用量依存性を評価した。すなわち、ASO/Toc−cRNA(G) 13mer二重鎖核酸複合体を0、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.09mg/kg又は0.75mg/kgずつマウスに静脈注射し、当該マウスから得られた肝臓由来のcDNAを用いて、mApoB遺伝子の発現を定量的PCRにて評価した。得られた結果を図18に示す。
実施例3に記載の方法と同様の方法にて、ASO/cRNA及びASO/Toc−cRNAによるアンチセンス効果の持続性を評価した。すなわち、LNA/DNAギャップマー(ss−ASO)、LNA/DNAギャップマー及びcRNA−Gを含む二重鎖核酸(ASO/cRNA(G))又はLNA/DNAギャップマー及びToc−cRNAを含む二重鎖核酸(ASO/Toc−cRNA(G))をマウスに静脈注射した。静脈注射した全ての核酸の鎖長は13塩基である。コントロールとして、核酸を含まないPBS溶液のみを注射したマウスも用意した。第1の実験においては、静脈注射してから1日後、3日後、7日後、14日後、28日後に肝臓を摘出し、当該肝臓由来のcDNAを用いて、mApoB遺伝子の発現を定量的PCRにて評価した。得られた結果を図19Aに示す。PBS溶液コントロール、一本鎖LNAのみ、及び二重鎖複合体ASO/Toc−cRNA(G)を用いて実験を繰り返し、同様の方法にて、静脈注射してから1日後、3日後、7日後、14日後、28日後及び42日後のmApoB遺伝子の発現レベルを評価した。得られた結果を図19Bに示す。
他の実施形態における二重鎖核酸複合体のアンチセンス効果を評価した。その比較する核酸鎖の構成の概要を図20Aに示す。先の実験においては、天然型のRNA塩基からなる中央領域と、2’−OMe修飾及びホスホロチオエート化してある5’及び3’ウィング領域とを有する、cRNA(G)(配列番号:3)を用いた。ここで用いる相補鎖は、同じ5’及び3’ウィング領域(末端の2塩基のRNA塩基に2’−OMe修飾及びホスホロチオエート結合)を有する。しかし、中央の8塩基のRNAに2’−OMe修飾が施されており、核酸間は天然型のリン酸ジエステル結合である(cRNA(G)−OM)(配列番号:9)。
ASO 12mer:5’−GCattggtatTC−3’(配列番号:1)
(大文字:LNA、小文字:DNA、核酸間は全てホスホロチオエート結合である)
相補鎖
1.cRNA(G):5’−gsasAUACCAAUsgsc−3’(配列番号:3)
2.cRNA(G)−OM:5’−gsasauaccaausgsc−3’(配列番号:9)
(大文字:RNA、小文字:2’−OMe−RNA、s:核酸間がホスホロチオエート結合である)。
LNA/DNAギャップマー及びToc−cRNAを含む二重鎖核酸複合体については前述の通り、高いアンチセンス効果を有しつつ、肝臓等へ特異的に効率良く送達できることが明らかになった。
ASO 12mer:5’−GCattggtatTC−3’(配列番号:1)
(大文字:LNA、小文字:DNA、核酸間は全てホスホロチオエート結合である)
相補鎖
cRNA 21mer:5’−ususcGCACCAGAAUACCAAusgsc−3’(配列番号:10)
(大文字:RNA、小文字:2’−OMe−RNA、s:核酸間がホスホロチオエート結合である)
第3の核酸(ペプチド)鎖
PNA 9mer:N‘−TGGTGCGAA−C’(配列番号:11)
(下線付:PNA)。
PNA鎖が二重鎖核酸の相補鎖として利用できることを以下に示す実施例にて実証した。
ASO 12mer:5’−GCattggtatTC−3’(配列番号:1)
(大文字:LNA、小文字:DNA、核酸間は全てホスホロチオエート結合である)
相補鎖
1.cPNA 12mer:N‘−GAAUACCAAUGC−C’(配列番号:12)
2.cPNA 10mer:N‘−GAAUACCAAU−C’(配列番号:13)
3.cPNA 8mer:N‘−GAAUACCA−C’(配列番号:14)
(下線付:PNA)。
この実施例においては、「RNAヌクレオチド及び任意にヌクレオチドアナログ」を含む、様々な構造の相補鎖を用いても、二重鎖核酸複合体がアンチセンス効果を発揮できることを実証する。4種類の相補鎖構造を設計し、調製した。それら構造の概要を図24に示す。図24に示す通り、2種類の中央の領域と、2種類の5‘及び3‘ウィング領域とを結合させた。ウィング領域は、ホスホロチエート結合を伴う2‘−Oメチル化修飾されたRNAと、ホスホロチエート結合を伴うヌクレオチドアナログとの、いずれかを含むものである。中央領域は、天然型リン酸ジエステル結合のRNAと、ホスホロチエート結合のRNAとのいずれかを含むものである。
ASO13−mer:5’−GCattggtatTCA−3’(配列番号:5)
(大文字:LNA、小文字:DNA、核酸間の全ての結合はホスホロチエート結合である)
相補鎖
1.Toc−cRNA(G):5’−usgsasAUACCAAUsgsc−3’(配列番号:7)
2.Toc−cLNA(G):5’−usgsasAUACCAAUsgsc−3’(配列番号:15)
3.Toc−cLNA(s):5’−usgsasAsUsAsCsCsAsAsUsgsc−3’(配列番号:16)
4.Toc−cRNA(s):5’−usgsasAsUsAsCsCsAsAsUsgsc−3’(配列番号:17)
(大文字:RNA、小文字:2’−OMe−RNA、下線付小文字:LNA、s:核酸間の結合がホスホロチエート結合である)
LNA/DNAギャップマーと各相補鎖とを等モル量混合し、実施例7に記載の通り、アニーリングした。次に、二重鎖核酸複合体をマウスの尾静脈から0.75mg/kgずつ静脈注射した。また、コントロールマウスとしてPBS溶液を尾静脈から投与したマウスも用意した。そして、注射してから3日後に、当該マウスをPBSにて灌流した後、肝臓を摘出した。次いで、比較例1に記載の通り、mRNAの抽出、cDNAの合成、及び定量的RT−PCRを行った。mApoBの相対的発現レベルを、mGAPDH(内部標準遺伝子)と比較して算出した。得られた結果を図25A〜Bに示す。
図25Aに示す通り、Toc−cRNA(G)とToc−cLNA(G)との結果を比較したところ、RNA同様に、相補鎖の5‘及び3’ウィング領域を架橋化核酸にて調製しても、同等の高いアンチセンス効果を得ることができた。
さらに、このデータから、ウィング領域のいずれかの種類に対しても、核酸鎖の中央のRNA部分をホスホロチエート化することができ、核酸鎖の中央部分が天然型のRNAとした場合に得られたアンチセンス効果と同程度のそれが維持されていることが示された。Toc−cLNA(s)及びToc−cRNA(s)において、得られた効果に関し、Toc−cRNA(G)と比較した結果を、図25A及び図25Bに各々示す。
この実施例においては、たとえ第1の核酸鎖と第2の核酸鎖(アンチセンスと相補鎖)との鎖長が異なっていたとしても、アンチセンス効果は発揮されるということを実証する。ここで、13塩基のLNA/DNAギャップマーと、31塩基の相補的RNAを基礎とする核酸鎖とをアニーリングさせ、マウスにおけるApoB遺伝子の発現抑制試験に供した。また、該31塩基の核酸鎖は、3つの2’−Oメチル修飾及びホスホロチエート化されたRNAヌクレオチドを含む5’ウィング領域と、20個の2’−Oメチル修飾及びホスホロチエート化されたRNAヌクレオチドと、ホスホロチオエート結合している8個のRNAヌクレオチドを含む中央領域とを結合させることにより、調製した。13−mer/31−mer複合体の活性と、13−mer/13−mer複合体の活性とを比較した。
LNA 13−mer:5’−GCattggtatTCA−3’(配列番号:5)
(大文字:LNA,小文字:DNA,核酸間の全ての結合は、ホスホロチエート結合)
相補鎖
1.13−mer Toc−cRNA(G):5’−usgsasAUACCAAUsgsc−3’(配列番号:7)
2.31−mer Toc−cRNA(s):5’−usgsasAUACCAAUgcuacgcauacgcaccascscsa−3’(配列番号:18)
(大文字:RNA,小文字:2’−OMe−RNA,s:核酸間の結合がホスホロチエート結合)。
ここで開示した二重鎖核酸複合体は、配列特異性及び普遍的な適用性を有していることを実証するため、異なる遺伝子、ヒトのトランスチレチン(hTTR)の転写産物を標的とするアンチセンスプローブを調製した。実験は、hTTRを有するよう改変されたトランスジェニックマウスを用いて行った(該マウスは、hTTR及びmTTRを有する)。アンチセンスと相補鎖とは、2つの鎖長のもの、13塩基の核酸鎖及び20塩基の核酸鎖を用意した。そして、13−mer/13−mer二重鎖複合体と20−mer/20−mer二重鎖複合体とを試験に供した。また、該複合体が肝臓に送達されるよう、5’−トコフェロール機能性部分を備えた相補鎖を調製した。また、hTTRは、最終的には血中で検出されるタンパク質として産生されるので、その発現タンパク質の血清濃度を分析した。そして、二重鎖複合体注入後に生じる発現の減少を検出した。以下に示す様々な核酸鎖の配列及び複合体を設計して作製し、試験に供した。
1.ASO 13−mer:5’−TGtctctgccTGG−3’(配列番号:19)
2.ASO 20−mer:5’−TTATTgtctctgcctGGACT−3’(配列番号:21)
(大文字:LNA,小文字:DNA,核酸間の全ての結合は、ホスホロチエート結合である)
相補鎖
1.13−mer Toc−cRNA(G):5’−cscsasGGCAGAGAscsa−3’(配列番号:20)
2.20−mer Toc−cRNA(G):5’−asgsuscscsAGGCAGAGACsasasusasa−3’(配列番号:22)
(大文字:RNA,小文字:2’−OMe−RNA,s:核酸間の結合がホスホロチエート結合である)
13塩基のアンチセンス及び相補鎖を、20塩基のアンチセンス及び相補鎖を、各々等モル量にて混合し、実施例7に記載の通り、アニーリングさせた。次に、13塩基のアンチセンス単一鎖と、アニーリングした13塩基の二重鎖複合体とを、各々トランスジェニックマウスの尾静脈から0.75mg/kgずつ静脈注射した。同様に、20塩基のアンチセンス単一鎖と、アニーリングした20塩基の二重鎖複合体とを、6mg/kgずつ注射した。また、コントロールマウスとしてPBS溶液を尾静脈から投与したマウスも用意した。そして、注射してから3日後に、当該マウスをPBSにて灌流した後、肝臓を摘出した。次いで、比較例1に記載の通り、mRNAの抽出、cDNAの合成、及び定量的RT−PCRを行った。hTTRの相対的発現レベルを、mGAPDH(内部標準遺伝子)と比較して算出した。13塩基の核酸鎖に関する結果を図27Aに、20塩基の核酸鎖に関する結果を図27Bに示す。
この実施例においては、送達機能性部分としてペプチドを用い、神経系の細胞に二重鎖核酸複合体が送達されることを実証した。図28に一般的な構造を示した、アンチセンス鎖、相補鎖及びPNA鎖の3つの核酸鎖を含む二重鎖複合体を用いた。後神経節(DRG)細胞に該複合体を局在させるための薬剤として機能させるため、ドデカペプチド DRG1を、9塩基のPNA鎖のN末端に結合させた。この9塩基のPNAを、以下に示す、13塩基のアンチセンス鎖及び22塩基の相補鎖にアニーリングさせることにより、二重鎖複合体を形成させ、本実験に用いた。該アンチセンス鎖が標的とする遺伝子は、TRPV1である。
ASO 13−mer:5’−TAgtccagttCAC−3’(配列番号:23)(大文字:LNA;小文字:DNA;核酸間の全ての結合は、ホスホロチエート結合である)
相補鎖
cRNA(G) 22−mer:5’−gsusgsAACUGGACuauacgcacscsa−3’(配列番号:24)
(大文字:RNA;小文字:2’−OMe−RNA;s:核酸間の結合がホスホロチエート結合)
第3の核酸(ペプチド)鎖
pep−PNA 9−mer:N’−SPGARAFGGGGS−tggtgcgta−C’(配列番号:25及び31)
(大文字:アミノ酸;下線付,小文字:PNA)
LNA/DNAギャップマー、相補鎖及びペプチド−PNA鎖を、等モル量にて混合し、この混合物を95℃で5分間加熱した。その後、3本の核酸鎖をアニーリングさせるべく、該混合物を37℃にて1時間、定温にて放置した(「ts−TRPV1」)。また、すぐに使用しない場合は4℃にて保存した。また、同様に、アンチセンス鎖及び相補鎖のみを含有する二重鎖複合体を調製した(「ds−TRPV1」)。マウスは、三協ラボサービス株式会社(東京、日本)より入手し、病原体フリ―の施設内にて維持し、自由に餌及び水を摂取させた。8週齢、平均体重27gの雌ICRマウスに、髄腔内注射にて、PBS、ds−TRPV1又はts−TRPV1を2.66μgずつ投与した。動物の処置は、東京医科歯科大学の動物実験委員会の承認を得た倫理性及び安全性に関わる実験計画書に従って、動物実験の許可を得た処置者によって行われた。抱水クロラ―ル(0.5mg/g体重)及び塩酸ケタミン(0.05mg/g体重)の腹腔内注射により、麻酔導入した後に髄腔内注射を行った。全てのマウスをうつ伏せにし、第2腰椎及び第3腰椎(L2−L3)において部分椎弓切除を施した。一旦露出させたこれら脊椎骨をs 27ゲージ針にて穿刺し、次いで、10μLハミルトンシリンジが接続されているPE−10カテーテルを、くも膜下腔内の後方、大体L5付近に挿入した。そして、1分間にわたって10μL量を着実に投与した。カテーテルを除去した後に、筋膜及び皮膚を4-0-ナイロンにて縫合し、抗生物質溶液にて処理した。そして、当該動物の頭部を挙上させ、加温パッド上で回復させた。
この実施例においては、非タンパク質コーディングRNA転写産物、すなわちmiRNAに対する、二重鎖核酸複合体によるアンチセンス効果について実証する。マウスの肝臓においては、miR−122というmiRNAが発現していることが知られている。15塩基のアンチmiR鎖を設計し、3つのヌクレオチドアナログ(架橋化核酸、LNA)を含む5’ウィング及び3’ウィングと、DNAを含む9塩基の中央領域とを調製した。なお、これら核酸間の全ての結合は、ホスホロチエート結合である。2’−OMe及びホスホロチエート化されたRNAを含む5’及び3’ウィングと、天然型のRNAを含む中央領域とを備えた相補鎖を調製した。
ASO 15−mer:5’−CCAttgtcacacTCC−3’(配列番号:26)
(大文字:LNA;小文字:DNA;核酸間の全ての結合は、ホスホロチエート結合である)
相補鎖
Toc−cRNA(G) 15−mer:5’−Toc−gsgsasGUGUGACCAsusgsg−3’(配列番号:27)
(大文字:RNA;小文字:2’−OMe−RNA;s:核酸間の結合が、ホスホロチエート結合である)
この実施例においては、アンチセンス効果を奏するために、アミド架橋化核酸である「アミドBNA」を含むアンチセンス鎖を用いた。アミド架橋化核酸(「AmNAs」とも称する)は、LNAアナログであり、糖環における2’位の炭素と4’位の炭素とが結合している、環状アミド架橋構造(4’−C(O)−N(R)−2’;R=H,Me)を有する。
AmNAsの合成、それらオリゴヌクレオチドへの導入や、結合強度及びヌクレアーゼ耐性等の物性については、A.Yaharaら、ChemBioChem 2012年、13巻、2513〜2516ページにて最近報告されている。この文献に開示されている内容は、この参照により、本願明細書において援用される。Yaharaらが開示している通り、AmNAsは相補鎖に対して優れた結合活性を示し、また高いヌクレアーゼ耐性を示す。このように、AmNAsは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの利用に適している。13塩基のアンチセンス鎖を設計し、ヌクレオチドアナログ(アミドBNA、AmNA)を2個及び3個各々含む、5’ウィング及び3’ウィングと、8塩基のDNAを含む中央領域とを調製した。なお、これら核酸間の全ての結合は、ホスホロチエート結合である。2’−OMe及びホスホロチエート化されたRNAを含む5’及び3’ウィングと、天然型のRNAを含む中央領域とを備えた相補鎖を調製した。
ASO 13−mer:5’−GCattggtatTCA−3’(配列番号:28) (大文字:N−メチルアミドBNA(AmNA),小文字:DNA,核酸間の全ての結合はホスホロチエート結合である)
相補鎖
1.13−mer Toc−cRNA(G):5’−usgsasAUACCAAUsgsc−3’(配列番号:7)
(大文字:RNA,小文字:2’−OMe−RNA,s:核酸間の結合は、ホスホロチエート結合である)
Claims (8)
- 細胞内の転写産物レベルを低減するための医薬組成物であって、該医薬組成物は、第1の核酸鎖と、第1の核酸鎖と相補的な配列を有する第2の核酸鎖と、第1の核酸鎖と第2の核酸鎖を結合するヘアピンリンカーとを含む二本鎖核酸複合体を含み、
(i)第1の核酸鎖は、
前記転写産物にハイブリダイズし、そして
(a)前記転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したDNAヌクレオチドもしくは修飾DNAヌクレオチドを含む核酸鎖であり、かつ、
(ii)第2の核酸鎖は、
(a)少なくとも4つの連続したRNAヌクレオチドと、さらに
(b)前記少なくとも4つの連続したRNAヌクレオチドの5’末側に配置された1又は複数の修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよび/もしくは修飾ヌクレオチドアナログ、ならびに/または
(c)前記少なくとも4つの連続したRNAヌクレオチドの3’末側に配置された1又は複数の修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよび/もしくは修飾ヌクレオチドアナログとを含む核酸鎖である、医薬組成物。 - 請求項1に記載の医薬組成物であって、ヘアピンリンカーは第1の核酸と第2の核酸を結合させるヘアピンループ核酸である、医薬組成物。
- 請求項1に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖は、さらに(b)前記RNaseHにより認識される少なくとも4つの連続したDNAヌクレオチドもしくは修飾DNAヌクレオチドの5’末側に配置された1又は複数のヌクレオチドアナログもしくは修飾ヌクレオチドアナログを含む5’ウイング領域、ならびに/または
(c)前記RNaseHにより認識される少なくとも4つの連続したDNAヌクレオチドもしくは修飾DNAヌクレオチドの3’末側に配置された1又は複数のヌクレオチドアナログもしくは修飾ヌクレオチドアナログを含む3’ウイング領域を含む核酸鎖である、医薬組成物。 - 請求項1に記載の医薬組成物であって、前記二本鎖核酸複合体が、第2の核酸鎖にアニーリングしている第3の核酸鎖を更に含む複合体である、医薬組成物。
- 請求項4に記載の医薬組成物であって、第3の核酸鎖は、
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は8〜100であり、
(ii)第2の転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含み、
かつ
(iii)第2の転写産物にハイブリダイズする
核酸である、医薬組成物。 - 請求項4に記載の医薬組成物であって、第3の核酸鎖は、第1の核酸鎖と同一の転写産物にハイブリダイズする核酸である、医薬組成物。
- 請求項4に記載の医薬組成物であって、第3の核酸鎖は、第1の核酸鎖と異なる転写産物にハイブリダイズする核酸である、医薬組成物。
- 請求項1に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分を更に含む核酸鎖である、医薬組成物。
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