JP6604544B2 - エクソンスキッピング効果を有する二本鎖アンチセンス核酸 - Google Patents

エクソンスキッピング効果を有する二本鎖アンチセンス核酸 Download PDF

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Description

本出願は、コーディングまたは非コーディングRNAの機能を変化させる活性、またさらに特には、アンチセンス効果により標的遺伝子の発現を抑制する効果、およびエクソンスキッピングによってもたらされる効果などを有する二本鎖核酸に関する。この二本鎖核酸は、細胞中のRNAに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドとしての働く1つの鎖を含む。このようなRNAは、コーディングまたは非コーディング領域の一部、あるいはエクソンまたはイントロンの一部であり得る。
近年、核酸薬と呼ばれる医薬品の現在進行中の開発において、オリゴヌクレオチドが関心を集めており、また特に、標的遺伝子の高い選択性および低毒性の点から考えて、アンチセンス法を利用する核酸薬の開発が積極的に進められている。アンチセンス法は、標的遺伝子のmRNA(センス鎖)の部分配列に相補的なオリゴヌクレオチド(アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO))を細胞に導入することにより、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を選択的に変更する方法である。
図1(上部)に示されるとおり、RNAを含むオリゴヌクレオチドがASOとして細胞に導入されると、ASOは標的遺伝子の転写産物(mRNA)に結合し、部分的二本鎖が形成される。この二本鎖は、リボソームによる翻訳を妨げるためのカバーとしての役割を果たし、このため標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現が阻害されることが知られている。
他方、DNAを含むオリゴヌクレオチドがASOとして細胞に導入されると、部分的DNA-RNAヘテロ二本鎖が形成される。この構造がRNaseHによって認識され、その結果標的遺伝子のmRNAが分解されるため、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現が阻害される(図1、下部)。さらに、多くの場合、遺伝子発現抑制効果は、RNAを使用する場合と比較すると、ASOとしてDNAを使用する場合(RNaseH依存性経路)、より高いことも見出された。
核酸薬としてオリゴヌクレオチドを利用する際、標的RNAに対する結合親和性、in vivoでの安定性の増強などを考慮して、例えばLocked Nucleic Acid(LNA)(登録商標)、他の架橋核酸(BNA: bridged nucleic acid)などの様々な核酸アナログが開発されている。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを適用して、プレmRNAのプロセシング中にエクソンスキッピングを誘導することができる。このコンセプトは図2に示される。この図は二本鎖DNAセグメントを示し、DNAの転写により、エクソン(コーディング領域)およびイントロン(非コーディング領域)からなるプレmRNAが生じる。一般的には、mRNAがペプチド(タンパク質)配列に翻訳される前に、細胞がプレmRNAをプロセシングしてイントロン領域を除去する。プレmRNAを標的とし、これに結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞を誘導してエクソンを含まない(読み飛ばす)ようにすることができることが知られている。図2に示されるとおり、プレmRNAは、エクソン1、2、3、および4を含む。正常な作用下では、ASOが存在しない場合、イントロンが除去され、エクソン1、2、3および4が一緒にスプライシングされて完全長mRNAが生じるだろう。
しかし、標的部位(ここではエクソン2として例示される)に結合するASOの存在下では、細胞は、イントロンの除去に加えて、エクソン2を排除し、エクソン1、3、および4の短縮スプライススイッチmRNAを生じる。
当技術分野においてよく知られているとおり、エクソンスキッピングとスプライススイッチングは、遺伝子変異の影響を治療または寛解させるために興味深い。特定の遺伝子疾患は、タンパク質レベルというよりはむしろ、このような機構により遺伝子レベルで治療することが可能であると考えられている。2つの例は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(Duchenne muscular dystrophy)および脊髄性筋ジストロフィー(spinal muscular dystrophy)である(非特許文献1〜4)。
siRNAおよびギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を抑制するように作用するが、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド(SSO)は、プレmRNAスプライシングを改変するように作用する。このようなオリゴヌクレオチドは、修復されなかったとしたら正しくプロセシングされないであろうRNAを「修復する」ことができるか、または、これらのオリゴヌクレオチドは、新たなタンパク質の形成を誘導することができる。スプライス変異タンパク質は、ヒトにおけるタンパク質の大部分を構成するため、スプライススイッチングを誘導および/または調節する能力は、非常に興味深い問題である。
アンチセンス剤として使用されるオリゴヌクレオチドは、通常、標的配列に対する結合親和性を増強するため、修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドアナログを含む。図3に示されるとおり、天然核酸(RNAまたはDNA)の糖部分は4個の炭素原子と1個の酸素原子を有する5員環を有するため、この糖部分はN型とS型の2種類のコンフォメーションを有する。これらのコンフォメーションは一方から他方へと変化し、その結果、核酸のらせん構造も、A型とB型の異なる形態をとることが知られている。上述のASOの標的としての役割を果たすmRNAはA型のらせん構造をとり、その糖部分は主にN型であるため、RNAに対する親和性を高めるという点から考えると、ASOの糖部分がN型をとることが重要である。このコンセプトの下に開発された製品が、LNA(2'-O,4'-C-メチレン-架橋核酸(2',4'-BNA))などの修飾核酸である。例えば、LNAにおいては、2'位の酸素と4'位の炭素がメチレン基で架橋されているため、コンフォメーションはN型に固定され、それ以上コンフォメーション間で変動しない。従って、数個のLNA単位を組み込むことによって合成されるオリゴヌクレオチドは、RNAに対する極めて高い親和性および極めて高い配列特異性を有し、また従来の天然核酸を用いて合成されるオリゴヌクレオチドと比較すると、優れた耐熱性およびヌクレアーゼ耐性も示す(特許文献1参照)。他の人工核酸もこのような特徴を有するため、アンチセンス法などの利用に関連して、人工核酸に大きな注目が払われている(特許文献1〜7を参照)。
さらに、オリゴヌクレオチドが薬に適用される場合、関連オリゴヌクレオチドを標的部位に高特異性および高効率で送達し得ることが重要である。短い正電荷のアルギニン-リッチペプチドP007およびBペプチドなどの細胞浸透性ペプチドは、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされると、オリゴヌクレオチドの細胞への取り込みを高めることができる(非特許文献5)。オリゴヌクレオチドが細胞に入ったとしても、スプライススイッチング効果を有するためには、このオリゴヌクレオチドは核に入る必要がある。スプライススイッチングオリゴヌクレオチドの核膜を越える送達は未だに課題である(非特許文献6)。本発明の目的は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞核内への増強された送達を与える二本鎖核酸剤を提供することである。本発明のさらなる目的は、プレmRNAの増強レベルのエクソンスキッピングおよび/またはプレmRNAの代替的スプライスプロセシングを与えるオリゴヌクレオチドを提供することである。
さらに、オリゴヌクレオチドを特定の身体領域に送達するための方法として、コレステロールおよびビタミンEなどの脂質を利用する方法(非特許文献7および8)、RVG-9Rなどの受容体特異的ペプチドを利用する方法(非特許文献9)、および標的部位に特異的な抗体を利用する方法(非特許文献10)が開発されている。
JP 10-304889 A WO 2005/021570 JP 10-195098 A JP 2002-521310 W WO 2007/143315 WO 2008/043753 WO 2008/029619
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本発明の目的は、コーディングまたは非コーディングRNAの機能を変化させることができる二本鎖核酸剤を提供することである。
特定の実施形態において、二本鎖核酸複合体は、RNAのスプライススイッチ変異体を誘導するアンチセンス核酸を含む。一部の実施形態において、アンチセンス核酸は、コーディングまたは非コーディングRNAの機能を変化させる。一部の実施形態において、アンチセンス核酸は、RNAのプロセシングを調節する。一部の実施形態において、二本鎖核酸複合体は、アンチセンス核酸鎖を標的領域に高特異性および高効率で送達する。一部の実施形態において、アンチセンス核酸は、細胞核内に高効率で送達される。
本発明者らは、オリゴヌクレオチド剤の細胞核への送達について研究し、一本鎖オリゴヌクレオチドではなく二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが、細胞質から核への細胞内移行機構を有し得ることを見出した。二本鎖剤対一本鎖剤の遺伝子サイレンシング効果を比較する実験の結果は、図4に示される。実験は、実施例1として以下に詳細に記載される。手短に言えば、アポBのプレmRNAのイントロンを標的とするLNA/DNAギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製した。相補2'-OMe RNA/RNAギャップマーも作製し、上記のLNA/DNAギャップマーにアニールさせて二本鎖核酸剤を得た。リポフェクタミンRNAiMAXを使用して、ヒト細胞に二本鎖剤(dsASO)または一本鎖LNA/DNAギャップマー(ssASO)のいずれかをトランスフェクトした。GAPDHの発現量に対して正規化したアポBの発現量を測定した。驚くべきことに、dsASO剤はアポBの発現量を抑制したが、一本鎖剤はアポBの発現レベルにほとんど影響を及ぼさなかった(図4)。RNAiMAXはオリゴヌクレオチドを細胞内に輸送することができるが、オリゴヌクレオチドを核内に持ち込むには有効ではない。このように、アポB発現の抑制について二本鎖剤と一本鎖との間で観察された差は、dsASOの、より優れた核膜を越える能力に起因すると考えられる。
結果として、本発明者らは、ASOの(治療的)効力を高めるためには、アンチセンスオリゴヌクレオチドを核に送達するために二本鎖核酸剤を使用することを考えついた。
特定の実施形態は、アンチセンス効果によりRNAプロセシングを調節する活性を有する二本鎖核酸に関する。特定の実施形態において、以下が提供される。
(1)コーディングまたは非コーディングRNAの機能を変化させる方法であって、細胞に、以下：
第2核酸鎖にアニールした第1核酸鎖であって、ここで：
第1核酸鎖は、(i) 天然DNAヌクレオチド、修飾DNAヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログから独立して選択されるヌクレオチドを含み、(ii) 4個以上の連続する天然DNAヌクレオチドを有する領域は含まず、(iii) 第1核酸鎖中の天然DNAヌクレオチド、修飾DNAヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログの総数は8〜100であり、且つ(iv) 第1核酸鎖は、細胞内のRNAにハイブリダイズすることが可能であり；さらに
第2核酸鎖は、天然RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログから独立して選択されるヌクレオチドを含む、
前記第2核酸鎖にアニールした第1核酸鎖を含む二本鎖核酸複合体を接触させるステップを含む、
前記方法。
(2) 第1核酸鎖が、2または3個の連続する天然DNAヌクレオチドからなる少なくとも1つの領域を含む、項目(1)の方法。
(3) 第1核酸鎖が、架橋ヌクレオチド/DNAミックスマーオリゴヌクレオチドを含む、項目(2)の方法。
(4) 架橋ヌクレオチドが、LNA、cEt-BNA、アミドBNA(AmNA)、およびcMOE-BNAから独立して選択される、項目(2)または(3)の方法。
(5) 第1核酸鎖中の天然ヌクレオチドの少なくとも1つまたはヌクレオチドアナログの1つがホスホロチオエート化されている、項目(1)〜(4)のいずれか1つの方法。
(6) コーディングまたは非コーディングRNAの機能を変化させる方法であって、細胞に、以下：
第2核酸鎖にアニールした第1核酸鎖であって、ここで：
第1核酸鎖は、(i) モルホリノオリゴヌクレオチド、2'-O-メチル修飾オリゴヌクレオチド、2'-O-(2-メトキシエチル)修飾オリゴヌクレオチド、または架橋ヌクレオチドオリゴヌクレオチドから選択され、(ii) 第1核酸鎖中のヌクレオチドの総数は8〜100であり、且つ(iv) 第1核酸鎖は、細胞内のRNAにハイブリダイズすることが可能であり；さらに
第2核酸鎖は、天然RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログから独立して選択されるヌクレオチドを含む、
前記第2核酸鎖にアニールした第1核酸鎖を含む二本鎖核酸複合体を接触させるステップを含む、
前記方法。
(7) 第1核酸鎖中のヌクレオチドの少なくとも1つがホスホロチオエート化されている、項目(6)の方法。
(8) 第2核酸鎖が、2'-O-メチル基を有する少なくとも1つの修飾RNAヌクレオチドを含み、且つ治療用オリゴヌクレオチド領域の3'末端および5'末端の少なくとも1つのヌクレオチド間結合が、天然ヌクレオチド間結合よりもヌクレアーゼ耐性である、項目(1)〜(7)のいずれか1つの方法。
(9) 第2核酸鎖が、3'ウイング領域および5'ウイング領域を含む、項目(1)〜(8)のいずれか1つの方法。
(10) 第2核酸鎖が、5'末端および3'末端の両方に位置している1つ以上のホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、項目(8)または(9)の方法。
(11) 第2核酸鎖の3'ウイング領域および5'ウイング領域が、それぞれ、2'-O-メチル基を有する少なくとも1つのヌクレオチドを含む、項目(9)または(10)の方法。
(12) 第1核酸鎖および/または第2核酸鎖が、標識機能、精製機能、および標的送達機能から選択される機能を有する機能性部分をさらに含む、項目(1)〜(11)のいずれかの方法。
(13) 二本鎖核酸複合体が、第1核酸鎖または第2核酸にアニールした第3核酸鎖鎖をさらに含む、項目(1)〜(12)のいずれかの方法。
(14) 第3核酸鎖がPNAヌクレオチドを含む、項目(13)に記載の方法。
(15) 第3核酸鎖が、標識機能、精製機能、および標的送達機能から選択される機能を有する機能性部分をさらに含む、項目(13)または(14)に記載の方法。
(16) 機能性分子が、受容体リガンドおよび抗体から選択されるペプチドまたはタンパク質である、項目(15)に記載の方法。
(17) 機能性分子が、P007およびBペプチドから独立して選択される、項目(16)に記載の方法。
(18) ヒトにおけるRNAのプロセシングを調節する方法であって、項目(1)〜(17)のいずれか1つの二本鎖核酸複合体と製薬上許容可能な担体とを投与するステップを含む、前記方法。
さらなる特定の実施形態において、以下が提供される。
(1) 細胞内のコーディングまたは非コーディングRNAの機能を変化させる医薬組成物であって、以下：
第2核酸鎖にアニールした第1核酸鎖であって、ここで：
第1核酸鎖は、(i) 天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログから独立して選択されるヌクレオチドを含み、(ii) 第1核酸鎖中の天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログの総数は8〜100であり、且つ(iii) 第1核酸鎖は、細胞内のRNAにハイブリダイズすることが可能であり；さらに
第2核酸鎖は、天然RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログから独立して選択されるヌクレオチドを含む、
前記第2核酸鎖にアニールした第1核酸鎖を含む二本鎖核酸複合体
を含む、前記医薬組成物。
(2) 機能が、RNAのプロセシングにおける調節であり、さらに第1核酸鎖が、4個以上の連続する天然DNAヌクレオチドを有する領域を含まない、項目1の医薬組成物。
(3) コーディングまたは非コーディングRNAの機能が、エクソンスキッピングを誘導することによって変化させられる、項目2の医薬組成物。
(4) 第1核酸鎖が、2または3個の連続する天然DNAヌクレオチドからなる少なくとも1つの領域を含む、項目3の医薬組成物。
(5) 第1核酸鎖が、架橋ヌクレオチド/DNAミックスマーオリゴヌクレオチドを含む、項目4の医薬組成物。
(6) 機能が、RNAのプロセシングにおける調節であり、さらに第1核酸鎖が、モルホリノオリゴヌクレオチド、2'-O-メチル修飾オリゴヌクレオチド、2'-O-(2-メトキシエチル)修飾オリゴヌクレオチド、または架橋ヌクレオチドオリゴヌクレオチドから独立して選択されるヌクレオチドを含む、項目1の医薬組成物。
(7) コーディングまたは非コーディングRNAの機能が、エクソンスキッピングを誘導することによって変化させられる、項目6の医薬組成物。
(8) 第1核酸鎖が、4個以上の連続する天然DNAヌクレオチドを含む、項目1の医薬組成物。
(9) 機能が、転写産物のレベルを低下させ、さらに第1核酸鎖が、細胞内の前駆体mRNAの非コーディング領域にハイブリダイズすることができる、項目8の医薬組成物。
(10) 第1核酸鎖が、架橋ヌクレオチド/DNAギャップマーオリゴヌクレオチドを含む、項目9の医薬組成物。
(11) 第1核酸鎖中の天然DNAヌクレオチド、修飾DNAヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログの総数が10〜35である、項目1〜10のいずれか1つの医薬組成物。
(12) 架橋ヌクレオチドが、LNA、cEt-BNA、アミドBNA(AmNA)、およびcMOE-BNAから独立して選択される、項目5または10の医薬組成物。
(13) 第1核酸鎖が、4'-(CH2)p-O-2',4'-(CH2)p-CH2-2',4'-(CH2)p-S-2',4'-(CH2)p-OCO-2',4'-(CH2)n-N(R3)-O-(CH2)m-2'(式中、p、mおよびnは、それぞれ1〜4の整数、0〜2の整数、および1〜3の整数を表し、またR3は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、蛍光もしくは化学発光標識、核酸切断活性を有する機能性基、または細胞内もしくは核内局在化シグナルペプチドを表す)により2'位の炭素原子と4'位の炭素原子が架橋されているヌクレオチドから独立して選択される架橋ヌクレオチドを含む、項目5または10の医薬組成物。
(14) 第1核酸鎖中の修飾ヌクレオチドの少なくとも1つまたはヌクレオチドアナログの1つがホスホロチオエート化されている、項目1〜12のいずれか1つの医薬組成物。
(15) 第1核酸鎖および/または第2核酸鎖が、標識機能、精製機能、および標的送達機能から選択される機能を有する機能性部分をさらに含む、項目1〜14のいずれかの医薬組成物。
(16) 機能性部分が、脂質、糖、ペプチド、およびタンパク質から選択される分子である、項目15に記載の医薬組成物。
(17) 機能性部分が、第1、第2、または第3核酸鎖の3'末端ヌクレオチドおよび/または5'末端ヌクレオチドに連結されている、項目16に記載の医薬組成物。
(18) 機能性分子が、受容体リガンドおよび抗体から選択されるペプチドまたはタンパク質である、項目17に記載の医薬組成物。
(19) 機能性分子が、P007およびBペプチドから独立して選択される、項目18に記載の医薬組成物。
特定の実施形態によれば、アンチセンス核酸は二本鎖複合体で送達することが可能であり、このアンチセンス核酸により、標的遺伝子、RNA、またはタンパク質の発現またはプロセシングを選択的に且つ極めて効果的に抑制し、変化させ、改変しまたは変更することができる。一部の実施形態において、二本鎖複合体は、送達部分を複合体と結合させることによって、標的部位に高特異性および高効率で送達され得る。一部の実施形態において、アンチセンス核酸は、細胞核に高効率で送達され得る。
本発明の実施形態による二本鎖核酸複合体を使用して、一部の実施形態において、アンチセンス核酸を細胞に送達することが可能であり、さらに標的遺伝子の発現またはプレmRNAのプロセシングを高効率で変更することができる。従って、二本鎖核酸は、遺伝子欠損、欠損RNA転写物、遺伝子またはRNAの異常な発現レベル(例えば遺伝子疾患、代謝疾患、腫瘍、および感染症ならびに/または増加レベルの転写産物)に関連する疾患を治療および予防するための医薬組成物等として有用である。
図１は、特定のアンチセンス法の一般的な機構を示す図である。図に示される通り、標的遺伝子のmRNAの部分配列に相補的なオリゴヌクレオチド(アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO))(図中の「DNA」)が細胞に導入されると、標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現が選択的に阻害される。破線のボックスには、RNaseHがASOにハイブリダイズした位置でmRNAを切断する分解機構が示される。RNaseH切断の結果、mRNAは、一般的に、翻訳されて機能的な遺伝子発現産物を産生することはない。 図2は、正常なエクソンスプライシングから得られたRNA産物を、アンチセンスオリゴヌクレオチドプローブによって生じたスプライススイッチRNA産物に対して比較する模式図である。 図3は、RNA、DNA、およびLNAヌクレオチドの構造を示す模式図である。 図4は、実施例1に記載される実験の結果を示す。 図5は、様々な天然ヌクレオチドまたは天然ヌクレオチドアナログおよび修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドアナログの構造式を示す。 図6A〜6Bは、二本鎖核酸複合体の好適な実施形態の例を示す模式図である。「X」は機能性部分を表し、また脂質(例えばコレステロールまたはトコフェロール)、糖など、またはタンパク質、ペプチド(例えば抗体、細胞送達剤)などを独立して表し得る。 図7A〜7Bは、異なる鎖長を有する第1ASOミックスマー核酸鎖および第2相補核酸鎖、ならびに機能性部分「X」が結合している第3核酸鎖の3つの鎖を含む二本鎖核酸複合体の好適な実施形態の例を示す模式図である。 図8A〜8Cは、実施例2において使用されるジストロフィン遺伝子断片発現プラスミド(8A)、2つの二本鎖核酸剤(8B、8C)の構造の模式図である。 図9は、特定の実施形態による二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドのエクソンスキッピング効果を比較する、実施例2に記載される実験の結果を示す。 図10は、特定の実施形態による二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドのエクソンスキッピング効果を比較する、実施例2に記載される実験の結果を示す。 図11は、特定の実施形態による二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドのエクソンスキッピング効果を比較する、実施例2に記載される実験の結果を示す。 図12は、特定の実施形態による二本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドのエクソンスキッピング効果を比較する、実施例2に記載される実験の結果を示す。 図13は、15mer二本鎖SSOのエクソンスキッピング活性およびTm値を示す。
特定の実施形態として、第2核酸にアニールした第1核酸を含む精製または単離された二本鎖核酸複合体が挙げられる。この複合体が細胞に接触すると、複合体は、最終的に標的遺伝子の発現の変化を引き起こす。理論に拘泥するものではないが、一部の例において、この変化は、産生されるmRNAの構造または濃度が未処理の細胞中のmRNAとは異なるようにプレmRNAのプロセシングを変更することによって引き起こされる。
上記の二本鎖核酸は、コーディングまたは非コーディングRNAの機能を変化させることができる。コーディングまたは非コーディングRNAの機能の変化としては、RNAのプロセシングにおけるRNAの調節が挙げられる。RNAの調節としては、エクソンスキッピング、エクソン封入（exon inclusion)およびエクソンリテンション(exon retention)などのRNAプロセシングが挙げられる。さらに、RNAの調節としては、例えば、ブロックRNA発現およびRNA-タンパク質ブロックが挙げられる。
一部の実施形態において、第1核酸鎖は、(i) 天然DNAヌクレオチド、修飾DNAヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログから独立して選択されるヌクレオチドを含み、(ii) 4個以上の連続する天然DNAヌクレオチドを有する領域は含まず、(iii) 第1核酸鎖中の天然DNAヌクレオチド、修飾DNAヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログの総数は8〜100であり、且つ(iv) 第1核酸鎖は、細胞内のRNAにハイブリダイズすることが可能であり；さらに
第2核酸鎖は、天然RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログから独立して選択されるヌクレオチドを含む。
一部の他の実施形態において、第1核酸鎖は、(i) モルホリノオリゴヌクレオチド、2'-O-メチル修飾オリゴヌクレオチド、2'-O-(2-メトキシエチル)修飾オリゴヌクレオチド、または架橋ヌクレオチドオリゴヌクレオチドから選択され、(ii) 第1核酸鎖中のヌクレオチドの総数は8〜100であり、且つ(iv) 第1核酸鎖は、細胞内のRNAにハイブリダイズすることが可能であり；さらに
第2核酸鎖は、天然RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログから独立して選択されるヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、二本鎖核酸複合体は、第3核酸鎖をさらに含み得る。第3核酸鎖は、第1核酸または第2核酸のいずれかとアニールすることができる。
本発明を具体化する一部の方法は、細胞内のmRNAの構造または濃度を変化させる方法であって、細胞に、本発明の実施形態による構造を有する第1核酸鎖および第2核酸鎖を含む二本鎖核酸複合体を接触させるステップを含む、上記方法を提供する。一部の方法は、コーディングまたは非コーディングRNAの機能を変化させるため、プレmRNAプロセシングから得られたスプライスバリアント体を変化させるため、および/または標的遺伝子から最終的に産生されるタンパク質の配列を変化させるために使用することができる。
「アンチセンス効果」は、標的転写産物(RNAセンス鎖)の、例えばDNA鎖、またはより一般的には、アンチセンス効果を引き起こすように設計され、転写産物等の部分配列に相補的な鎖とのハイブリダイゼーションの結果として生じる、標的遺伝子の発現または標的転写産物のレベルを抑制することを意味し、特定の例においては、翻訳の阻害、またはエクソンスキッピングなどのスプライシング機能改変効果(図1および図２中の点線で囲まれている領域の外側の上部の説明を参照)は、アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば第1鎖)の転写産物へのハイブリダイゼーションによって引き起こすことが可能であり、および/または転写産物の分解は、ハイブリダイズされた部分の認識の結果として生じ得る(図1中の点線で囲まれている領域内の説明を参照)。スプライシング機能改変効果を変化させることができるオリゴヌクレオチドは、スプライシングスイッチングオリゴヌクレオチド(SSO)と呼ばれる。さらに、アンチセンス効果は、プレmRNAのイントロンを標的化することによってもたらされる。
アンチセンス効果によってその発現が抑制され、変更され、あるいは改変される「標的遺伝子」または「標的転写産物」は特に限定されず、その例としては、様々な疾患においてその発現が増加する遺伝子が挙げられる。また、「標的遺伝子の転写産物」は、標的遺伝子をコードするゲノムDNAから転写されるmRNAであり、さらにまた、塩基修飾を受けていないmRNA、プロセシングされていないmRNA前駆体などを含む。さらに一般的には、「転写産物」は、DNA依存性RNAポリメラーゼによって合成される任意のRNAであってよい。
本明細書中で使用される用語「精製または単離された二本鎖核酸複合体」は、少なくとも1つの天然には生じない核酸鎖を含むか、または天然の核酸物質を本質的に含まない核酸複合体を意味する。
本明細書中で使用される用語「相補的」は、水素結合を介して、いわゆるワトソン-クリック塩基対(天然型塩基対)または非ワトソン-クリック塩基対(フーグスティーン型塩基対など)が形成され得る関係を意味する。標的転写産物(例えば標的遺伝子の転写産物)の塩基配列と第1核酸鎖の塩基配列とが完全に相補的であることは必ずしも必要ではなく、塩基配列が少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらにより好ましくは90％以上(例えば、95％、96％、97％、98％、または99％以上)の相補性を有していれば許容される。配列の相補性は、BLASTプログラムなどを使用することによって決定することができる。第1鎖は、配列が相補的である場合に、第2鎖に「アニールする」ことができる。当業者であれば、鎖間の相補度を考慮して、2本の鎖がアニールし得る条件(温度、塩濃度等)を容易に決定することができる。またさらに、当業者であれば、例えば標的遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、標的転写産物に相補的なアンチセンス核酸を容易に設計することができる。
特定の実施形態による第1核酸鎖は、転写産物(例えば標的遺伝子の転写産物)に相補的な配列を有するアンチセンス核酸である。
一部の実施形態において、第1鎖は、天然DNAヌクレオチド、修飾DNAヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログから独立して選択されるヌクレオチドを含む。第1鎖は、天然DNAヌクレオチドが存在する場合には1、2、または3個を超える天然DNAヌクレオチドは連続して出現しないという制限の下で、天然もしくは修飾DNAのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの任意の組み合わせを含み得る。すなわち、4個以上の連続する天然DNAヌクレオチドを含む第1鎖の領域またはセグメントは存在しない。
第1核酸鎖のヌクレオチド組成の1つの実施形態は「ミックスマー(mixmer)」である。一部の実施形態において、ミックスマーは、天然DNAヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含む。このヌクレオチドアナログは、例えば、LNAヌクレオチドなどの架橋ヌクレオチドであってよい。ミックスマー配列は、当業者によって理解され、一般的には、周期的または無作為セグメント長の交互型のヌクレオチドが挙げられる。上記のとおり、本明細書中で開示されるように、第1鎖がミックスマーである場合は、1、2、または3個を超える天然DNAヌクレオチドは連続して出現しない。それ以外には、ヌクレオチドの順序または配置に制限はない。ミックスマーは、必ずしも2種のヌクレオチドだけを含むように制限される必要はなく、(天然もしくは修飾のヌクレオチド、またはヌクレオチドアナログであるか否かに関わらず)任意の数の種のヌクレオチドを含み得る。例えば、第1鎖は、天然DNAヌクレオチド、一種の修飾ヌクレオチド、および一種のヌクレオチドアナログを含んでいてもよいし；天然DNAヌクレオチドと2種のヌクレオチドアナログとを含んでいてもよい。
上記の第1核酸鎖は、4個以上の連続する天然DNAヌクレオチドを有する領域を含まず、天然DNAヌクレオチドを有さない第1核酸鎖を包含する。第1核酸鎖は、修飾DNAヌクレオチドを含む。本発明において、4個以上の連続する天然DNAヌクレオチドを有する領域を含まない第1核酸鎖を包含する第1核酸鎖およびミックスマーを「非ギャップマー(non-gapmer)」と呼ぶことができる。すなわち、非ギャップマーは、第1鎖の領域またはセグメントが4個以上の連続する天然DNAヌクレオチドを含まない第1核酸鎖である。
第1核酸鎖のヌクレオチド組成の1つの実施形態は「ギャップマー(gapmer)」である。一部の実施形態において、第1核酸鎖は、「キメラ二本鎖核酸(Chimeric Double-Stranded 核c Acid)」という表題のPCT/JP2012/083180(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)においてアンチセンス鎖について記載されるように、少なくとも4個の連続DNAヌクレオチドからなる中央領域、中央領域の5'末端側に位置する少なくとも2個のヌクレオチドアナログを含む第1の5'ウイング領域、および中央領域の3'末端側に位置する少なくとも2個のヌクレオチドアナログを含む第1の3'ウイング領域を有するように配置されていてもよい。第1核酸鎖のヌクレオチド組成の1つの実施形態はホモヌクレオチドである。このような実施形態において、第1核酸鎖は、単一種の修飾DNAヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む。例としては、モルホリノヌクレオチド、2'-O-メチル修飾ヌクレオチド、2'-O-(2-メトキシエチル)修飾ヌクレオチドから作製されるか、または架橋ヌクレオチド(例えばLNAおよび本明細書中に記載される他のBNA)から作製されるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
第1核酸鎖の鎖長は特に限定されないが、鎖長は、通常、少なくとも8ヌクレオチド塩基、少なくとも10塩基、少なくとも12塩基、または少なくとも13塩基である。鎖長は、20塩基以下、25塩基以下または35塩基以下であってよい。鎖長は、約100塩基もの長さであってもよい。長さの範囲は、10〜35塩基、12〜25塩基、または13〜20塩基であってよい。特定の例において、長さの選択は、一般的に、例えば費用、合成収率などの他の因子の中でも特に、アンチセンス効果の強度と標的に対する核酸鎖の特異性とのバランスによって決まる。
本明細書中で使用される用語「核酸」は、モノマーのヌクレオチドまたはヌクレオシドを指してもよいし、複数のモノマーからなるオリゴヌクレオチドを意味してもよい。用語「核酸鎖」または「鎖」もまた、本明細書中でオリゴヌクレオチドを指すために使用される。核酸鎖は、化学的合成法により(例えば自動合成装置を使用して)、または酵素的工程(例えば、限定するものではないが、ポリメラーゼ、リガーゼ、または制限反応)により、全体的にまたは部分的に作製することができる。
本明細書中で使用される「DNAヌクレオチド」は、「天然DNAヌクレオチド」または「修飾DNAヌクレオチド」を指し得る。天然DNAヌクレオチドは、天然の塩基、糖、およびリン酸構造である。修飾DNAヌクレオチドは、天然の塩基、糖、またはリン酸結合サブユニットが化学的に修飾されているヌクレオチド単位を意味する。修飾塩基、糖、またはリン酸結合サブユニットは、サブユニット内で単一の置換基が付加または置換されており、且つこのサブユニットが全体としては異なる化学基で置換されていない、修飾された塩基、糖、またはリン酸結合サブユニットである。
第1核酸鎖の一部または全体がデオキシリボヌクレアーゼなどのヌクレアーゼ酵素に対して高い抵抗性を有することが望ましい場合、DNAヌクレオチドは修飾DNAヌクレオチドであり得る。修飾DNAヌクレオチドの例としては、シトシンの5-メチル化、5-フッ素化、5-臭素化、5-ヨウ素化およびN4-メチル化；チミジンの5-脱メチル化、5-フッ素化、5-臭素化および5-ヨウ素化；アデニンのN6-メチル化および8-臭素化；グアニンのN2-メチル化および8-臭素化；天然DNAヌクレオチドのホスホロチオエート化、メチルホスホン化、メチルチオホスホン化、キラルメチルホスホン化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、2'-O-メチル化、2'-メトキシエチル(MOE)化、2'-アミノプロピル(AP)化、および2'-フッ素化が挙げられる。優れた薬物動態を有する修飾DNAヌクレオチドの一実施形態は、ホスホロチオエート化DNAヌクレオチドである。第1鎖は、1つの位置、幾つかの位置、または全ての位置においてホスホロチオエート化されていてよい。一部の実施形態において、第1鎖の各末端の1つの位置または幾つかの位置がホスホロチオエート化されている。一般的には、修飾は、同一鎖中のヌクレオチドが独立して異なる修飾を受けることができるように実施することができる。また、以下に考察されるとおり、同様の効果を得るため、RNAヌクレオチドを修飾することもできる。
特定の例において、修飾DNAヌクレオチドの数および修飾の位置は、本発明の二本鎖核酸複合体によって提供されるアンチセンス効果などに影響を及ぼし得る。修飾の選択は、標的遺伝子などの配列によって異なり得るが、当業者であれば、アンチセンス法に関連する文献の説明を参照することによって好適な実施形態を決定することができる。さらに、修飾後の二本鎖核酸複合体が有するアンチセンス効果が測定される場合、このようにして得られた測定値が修飾前の二本鎖核酸複合体の測定値と比較して有意に低くない場合(例えば、修飾後に得られた測定値が修飾前の二本鎖核酸複合体の測定値よりも30％以上低い場合)、関連修飾を評価することができる。アンチセンス効果の測定は、被試験核酸化合物を細胞などに導入し、さらにノーザンブロッティング、定量PCR、およびウェスタンブロッティングなどの公知技術を適切に使用することにより、被試験候補核酸複合体によって提供されるアンチセンス効果により発現が抑制されている細胞内の標的遺伝子の発現量(mRNA量、cDNA量、タンパク質量など)を測定することによって、以下の実施例に示されるとおりに実施することができる。
本明細書中で使用される「ヌクレオチドアナログ」は、塩基、糖、またはリン酸結合サブユニットが、サブユニット内で付加もしくは置換されている2つ以上の置換基を有するか、または前記サブユニットが全体として異なる化学基で置換されている非天然ヌクレオチドを意味する。2つ以上の置換を有するアナログの例は、典型的には2'位および4'位の炭素原子に結合している糖環上の2つの置換によって架橋単位が付加されている架橋核酸である。特定の実施形態による第1核酸鎖に関して、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性および/またはヌクレアーゼに対する標的遺伝子の抵抗性を高めるという観点から、第1核酸鎖はヌクレオチドアナログをさらに含む。「ヌクレオチドアナログ」は、修飾(架橋基、置換基等)によって、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性および/またはヌクレアーゼに対する核酸の抵抗性が増強された任意の核酸であってよく、その例としては、JP 10-304889 A、WO 2005/021570、JP 10-195098 A、JP 2002-521310 W、WO 2007/143315、WO 2008/043753、WO 2008/029619、およびWO 2008/049085(本明細書中以降、これらの文献は「アンチセンス法に関する文献」と呼ばれる)において、アンチセンス法における使用に適していると開示されている核酸が挙げられる。すなわち、その例としては、上記の文献中に開示される核酸：ヘキシトール核酸(HNA)、シクロヘキサン核酸(CeNA)、ペプチド核酸(PNA)、グリコール核酸(GNA)、トレオース核酸(TNA)、モルホリノ核酸、トリシクロ-DNA(tcDNA)、2'-O-メチル化核酸、2'-MOE(2'-O-メトキシエチル)化核酸、2'-AP(2'-O-アミノプロピル)化核酸、2'-フッ素化核酸、2'-F-アラビノ核酸(2'-F-ANA)、およびBNA(架橋核酸)が挙げられる。
特定の実施形態によるBNAは、2'位の炭素原子および4'位の炭素原子が2つ以上の原子によって架橋されている任意のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドであってよい。架橋核酸の例は当業者に公知である。このようなBNAの1つのサブグループは、4'-(CH2)p-O-2',4'-(CH2)p-CH2-2',4'-(CH2)p-S-2',4'-(CH2)p-OCO-2',4'-(CH2)n-N(R3)-O-(CH2)m-2'(ここで、p、mおよびnは、それぞれ1〜4の整数、0〜2の整数、および1〜3の整数を表し；またR3は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、およびユニット置換基(蛍光もしくは化学発光標識分子、核酸切断活性を有する機能性基、細胞内または核内局在化シグナルペプチド等)を表す)により架橋された2'位の炭素原子と4'位の炭素原子を有すると説明することができる。さらに、特定の実施形態によるBNAに関し、3'位の炭素原子上のOR2置換基および5'位の炭素原子上のOR1置換基において、R1およびR2は、典型的には水素原子であるが、互いに同一であっても異なっていてもよく、さらにまた、核酸合成のためのヒドロキシル基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成のための保護基によって保護されているリン酸基、または-P(R4)R5(ここで、R4およびR5は、互いに同一であっても異なっていてもよく、それぞれヒドロキシル基、核酸合成のための保護基によって保護されているヒドロキシル基、メルカプト基、核酸合成のための保護基によって保護されているメルカプト基、アミノ基、1〜5個の炭素原子を有するアルコキシ基、1〜5個の炭素原子を有するアルキルチオ基、1〜6個の炭素原子を有するシアノアルコキシ基、または1〜5個の炭素原子を有するアルキル基で置換されているアミノ基を表す)であってもよい。このようなBNAの非限定的な例としては、α-L-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNAまたはβ-D-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA(LNA(Locked Nucleic Acid(登録商標)、2',4'-BNAとしても知られている)、エチレンオキシ(4'-CH2)2-O-2')BNA(ENAとしても知られている)、β-D-チオ(4'-CH2-S-2')BNA、アミノオキシ(4'-CH2-O-N(R3)-2')BNA、オキシアミノ(4'-CH2-N(R3)-O-2')BNA(2',4'-BNANCとしても知られている)、2',4'-BNAcoc、3'-アミノ-2',4'-BNA、5'-メチルBNA、(4'-CH(CH3)-O-2')BNA(cEt BNAとしても知られている)、(4'-CH(CH2OCH3)-O-2')BNA(cMOE BNAとしても知られている)、アミドBNA(4'-C(O)-N(R)-2')BNA(R=H、Me)(AmNAとしても知られている)、および当業者に公知の他のBNAが挙げられる。
さらに、本発明のヌクレオチドアナログにおいて、特定の実施形態によれば、塩基部分は修飾されていてもよい。塩基部分の修飾の例としては、シトシンの5-メチル化、5-フッ素化、5-臭素化、5-ヨウ素化およびN4-メチル化；チミジンの5-脱メチル化、5-フッ素化、5-臭素化および5-ヨウ素化；アデニンのN6-メチル化および8-臭素化；ならびにグアニンのN2-メチル化および8-臭素化が挙げられる。さらに、特定の実施形態による修飾核酸においては、リン酸ジエステル結合部位が修飾されていてもよい。リン酸ジエステル結合部位の修飾の例としては、ホスホロチオエート化、メチルホスホン化、メチルチオホスホン化、キラルメチルホスホン化、ホスホロジチオエート化、およびホスホロアミデート化が挙げられる。しかし、優れた薬物動態を有するという点から考えると、ホスホロチオエート化を用いることもできる。第1鎖は、1つの位置、幾つかの位置、または全ての位置においてホスホロチオエート化されていてもよい。一部の実施形態においては、第1鎖の各末端の1つの位置または幾つかの位置がホスホロチオエート化されている。一般的には、このような塩基部分の修飾またはリン酸ジエステル結合部位の修飾は、同じ核酸が組み合わされた複数種類の修飾を受けることができるように実施することができる。
一般的に、修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドアナログは、本明細書中に例示される修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドアナログに限定されない。例えば、Tachasらの米国特許第8,299,039号(特に第17〜22段)に開示されている修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドアナログなどの、多数の修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドアナログが当技術分野において公知であり、本出願の実施形態において使用することができる。天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログの例は、図5に示されている。
当業者であれば、アンチセンス効果、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性、ヌクレアーゼに対する抵抗性などを考慮して、このような修飾核酸の中から修飾ヌクレオチドおよび/または修飾ヌクレオチドアナログを適切に選択し且つ使用することができる。一部の実施形態において、ヌクレオチドアナログは、以下の式(1)：
Figure 0006604544
によって表されるLNAである。
式(1)において、「塩基」は、置換されていてもよい芳香族複素環式基または芳香族炭化水素環基、例えば天然ヌクレオシドの塩基部分(プリン塩基もしくはピリミジン塩基)、または非天然(修飾)ヌクレオシドの塩基部分(塩基部分の修飾の例としては、上記の修飾が挙げられる)を表し；さらに
R1およびR2は、互いに同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、水素原子、核酸合成のためのヒドロキシル基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成のための保護基によって保護されているリン酸基、または-P(R4)R5(ここで、R4およびR5は、互いに同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、ヒドロキシル基、核酸合成のための保護基によって保護されているヒドロキシル基、メルカプト基、核酸合成のための保護基によって保護されているメルカプト基、アミノ基、1〜5個の炭素原子を有するアルコキシ基、1〜5個の炭素原子を有するアルキルチオ基、1〜6個の炭素原子を有するシアノアルコキシ基、または1〜5個の炭素原子を有するアルキル基で置換されているアミノ基を表す)を表す。
上記の化学式によって示される化合物は、ヌクレオシドとして表されるが、「LNA」またより一般的には特定の実施形態によるBNAとしては、リン酸誘導基が関連ヌクレオシド(ヌクレオチド)に結合しているヌクレオチド形態が挙げられる。言い換えれば、LNAなどのBNAは、二本鎖核酸複合体を含む核酸鎖に、ヌクレオチドとして組み込まれる。
一部の実施形態による第2核酸鎖は、上記の第1核酸鎖に対して相補的であり、且つ上記の第1核酸鎖とアニーリングすることができる核酸である。第2核酸鎖の塩基配列と第1核酸鎖の塩基配列とが完全に互いに相補的であることは必ずしも必要ではなく、塩基配列は、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらにより好ましくは90％以上(例えば、95％、96％、97％、98％、99％以上)の相補性を有し得る。
第2核酸鎖は、天然RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログから独立して選択されるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態において、第2鎖はPNAヌクレオチドを含み得る。
本明細書中で使用される「RNAヌクレオチド」は、天然RNAヌクレオチド、または修飾塩基、糖、もしくはリン酸結合サブユニットが化学的に修飾されている修飾RNAヌクレオチドを意味し得る。修飾塩基、糖、またはリン酸結合サブユニットは、サブユニット内で単一の置換基が付加または置換されており、且つこのサブユニットが全体としては異なる化学基で置換されていない修飾塩基、糖、またはリン酸結合サブユニットである。
第2核酸鎖の一部または全体がリボヌクレアーゼ(RNase)などのヌクレアーゼに対して高い抵抗性を有することが望ましい場合、RNAヌクレオチドは修飾RNAヌクレオチドであってよい。このような修飾の例としては、シトシンの5-メチル化、5-フッ素化、5-臭素化、5-ヨウ素化およびN4-メチル化；チミジンの5-脱メチル化、5-フッ素化、5-臭素化および5-ヨウ素化；アデニンのN6-メチル化および8-臭素化；グアニンのN2-メチル化および8-臭素化；ホスホロチオエート化、メチルホスホン化、メチルチオホスホン化、キラルメチルホスホン化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、2'-O-メチル化、2'-メトキシエチル(MOE)化、2'-アミノプロピル(AP)化、および2'-フッ素化が挙げられる。また、チミジン塩基がウラシル塩基で置換されているRNAヌクレオチドも想定される。しかし、優れた薬物動態を有するという観点から、ホスホロチオエート化が用いられる。第2鎖は、1つの位置、幾つかの位置、または全ての位置においてホスホロチオエート化されていてよい。一部の実施形態において、第2鎖の各末端の1つの位置または幾つかの位置がホスホロチオエート化されている。一般的には、このような修飾は、同一鎖中のヌクレオチドが独立して異なる修飾を受け得るように実施することができる。例えば、以下の実施例において用いられるとおり、酵素的切断に対する抵抗性を与えるため、同一のRNAがホスホロチオエート化と2'-O-メチル化を受けることができる。しかし、RNAヌクレオチドがRNaseHによって切断されることが期待されるかまたは望まれる場合には、ホスホロチオエート化または2'-O-メチル化のいずれかのみを適用することができる。
第2核酸鎖における使用に適したヌクレオチドアナログは、第1核酸鎖における使用に適した上記のヌクレオチドアナログと同じである。
第2核酸鎖における修飾ヌクレオチドおよび/またはヌクレオチドアナログの数および種類ならびにそれぞれの位置は、二本鎖核酸複合体によって提供されるアンチセンス効果などに影響を及ぼし得る。修飾の選択は、標的遺伝子の配列などによって異なり得るが、当技術分野において通常の技能を有する者であれば、アンチセンス法に関連する文献を参照することにより、および/または日常的な実験によって好適な実施形態を決定することができる。
特定の実施形態によれば、修飾RNAヌクレオチドとしては、例えば、2'-O-メチル化および/またはホスホロチオエート化RNAが挙げられる。一部の実施形態において、このような修飾ヌクレオチドは、第2鎖の3'末端および/または5'末端に、あるいはその近くに位置している。
一部の実施形態において、第2鎖はギャップマーである。すなわち、第2鎖は中央領域を含み、「3'ウイング領域および5'ウイング領域」をさらに含む。
一般的には、中央領域は、天然RNAヌクレオチドまたは修飾RNAヌクレオチドで構成される。中央領域の5'末端に配置されている領域(すなわち5'ウイング領域)および中央領域の3'末端に配置されている領域(すなわち3'ウイング領域)は、それぞれ独立して、少なくとも1種の修飾RNAヌクレオチドおよび/またはヌクレオチドアナログを含み得る。中央領域、3'ウイング領域、および5'ウイング領域のヌクレオチドの典型的な選択および配置は、アンチセンス法についての文献において考察されており、さらに当業者に公知である。5'ウイング領域および3'ウイング領域の長さは、独立して、通常、1〜10塩基、1〜7塩基、または2〜5塩基である。
5'ウイング領域および3'ウイング領域の設計は、特定の実施形態において、二本鎖核酸複合体によって提供されるアンチセンス効果などに影響を及ぼし得る。特定の実施形態のための修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドアナログの数、種類、および位置は、配列によって異なり得るが、当業者であれば、アンチセンス法について記載している文献を参照することによりおよび/または日常的な実験によって、ギャップマー鎖に適した設計を容易に決定することができる。
本発明の二本鎖核酸複合体は高いTm値を有するため、二本鎖は解離しにくい。好ましいTm値は、以下の実施例3の結果から予測することができる。本発明の二本鎖核酸複合体は、65℃を超える、好ましくは70℃を超える、より好ましくは80℃を超える、さらにより好ましくは90℃未満のTm値を有する。
特定の実施形態の二本鎖核酸複合体において、機能性部分は、第2核酸鎖に結合することができる。幾つかの例示的実施形態は、図6および図7に示されている。図6A〜6Bは、第1鎖および第2鎖を含む二本鎖複合体を示す。上記のとおり、第1鎖はミックスマーとして配置されたヌクレオチドを有していてもよいし(図6A)、または第1鎖はホモヌクレオチド型鎖であってもよい(図6B)。場合により、機能性部分「X」は、上記の鎖の1つに連結されていてもよい。図６は、第2鎖の5'末端に結合したX部分を示すが、機能性部分は、別法としてポリヌクレオチドの3'末端に連結されていてもよいし、ポリヌクレオチドの内側の位置に連結されていてもよい。他の実施形態において、相補鎖は、同じであっても異なっていてもよく、複数の位置に連結されていてもよく、および/またはポリヌクレオチドの1つの位置に一群として連結されていてもよい2つ以上の機能性部分を含む。他の実施形態において、機能性部分は、第1鎖に連結されていてもよい。
図7A〜7Bは、第1鎖、第2鎖、および第3鎖を含む二本鎖複合体を示す。第1鎖はミックスマーとして示されるが、ホモヌクレオチド型の鎖であってもよい。図7Aにおいて、第1鎖と第3鎖はいずれも第2鎖にアニールし得る。別法として、第2鎖と第3鎖は第1鎖にアニールしていてもよい(図7B)。この場合も機能性部分「X」は、上記の鎖の1つに連結されていてよい。図７は、第3鎖に結合したX部分を示すが、機能性部分は、別法として上記の任意の位置に連結されていてもよいし、一種以上の部分が独立して選択されて、上記の鎖に別々にまたはクラスターとして連結されていてもよい。
核酸鎖と機能性部分との間の結合は、直接結合であってもよいし、別の物質によって介在される間接結合であってもよい。しかし、特定の実施形態においては、機能性部分が、共有結合、イオン性結合、水素結合などを介して第2核酸鎖に直接結合されていることが好ましく、またより安定した結合を得ることができるという点から考えると、共有結合がより好ましい。
機能性部分が、二本鎖核酸複合体および/または機能性部分が結合している鎖に所望の機能を与えるならば、特定の実施形態による「機能性部分」の構造について特定の限定はない。所望の機能としては、標識機能、精製機能、および送達機能が挙げられる。標識機能を与える部分の例としては、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなどの化合物が挙げられる。精製機能を与える部分の例としては、ビオチン、アビジン、Hisタグペプチド、GSTタグペプチド、FLAGタグペプチドなどの化合物が挙げられる。
一部の実施形態において、機能性部分は、細胞または細胞核への輸送を増強する役割を果たす。例えば、特定のペプチドタグは、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされると、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増強することが示されている。例としては、非特許文献5およびその参考文献中に開示されるアルギニンリッチペプチドP007およびBペプチドが挙げられる。核内輸送は、m3G-CAP(非特許文献6を参照)などの部分をオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることによって増強することができる。
さらに、第1核酸鎖を体内の標的部位または標的領域に高特異性および高効率で送達し、これにより関連核酸による標的遺伝子の発現を極めて効果的に抑制するという観点から、本発明の一部の実施形態の二本鎖核酸複合体を体内の「標的部位」に送達する活性を有する分子が、機能性部分として第2核酸鎖に結合していることが好ましい。
「標的送達機能」を有する部分は、本発明の特定の実施形態の二本鎖核酸複合体を肝臓などに高特異性および高効率で送達し得るという観点から、例えば、脂質であってよい。このような脂質の例としては、コレステロールおよび脂肪酸などの脂質(例えば、ビタミンE(トコフェロール、トコトリエノール)、ビタミンA、およびビタミンD)；ビタミンKなどの脂溶性ビタミン(例えば、アシルカルニチン)；アシル-CoAなどの中間代謝産物；糖脂質、グリセリド、およびそれらの誘導体が挙げられる。しかし、これらの中でも、より高い安全性を有するという点から考えて、特定の実施形態において、コレステロールおよびビタミンE(トコフェロールおよびトコトリエノール)が使用される。
さらに、本発明の特定の実施形態の二本鎖核酸複合体を高特異性および高効率で脳に送達し得るという観点から、特定の実施形態による「機能性部分」の例として、糖(例えば、グルコースおよびスクロース)が挙げられる。
また、様々な臓器の細胞表面上に存在する様々なタンパク質に結合することにより本発明の特定の実施形態の二本鎖核酸複合体を様々な臓器に高特異性および高効率で送達し得るという観点から、特定の実施形態による「機能性部分」の例として、ペプチドまたはタンパク質(例えば、受容体リガンドならびに抗体および/またはそのフラグメント)が挙げられる。
本発明の特定の実施形態の二本鎖核酸複合体に関して、第1核酸鎖の鎖長と第2核酸鎖の鎖長とは、同一であってもよいし、異なっていてもよい。第1核酸鎖と第2核酸鎖とが同じ鎖長を有する本発明の一部の実施形態の二本鎖核酸複合体として、例えば、図6A〜6Bに示される二本鎖核酸は、このような実施形態の例である。これはほんの一例であり、核酸複合体が2つの鎖を含む場合、これらは異なっていてもよい。
さらに、図7A〜7Bに示されるとおり、第1核酸鎖と第2核酸鎖が異なる鎖長を有し得る場合、一部の実施形態において、長さの差は、二本鎖核酸複合体が第1核酸鎖と第2核酸鎖の長い方にアニールした第3核酸鎖をさらに含み得る程度に十分に大きい。第3核酸鎖は、第1核酸鎖と第2核酸鎖のいずれか長い方の領域であって、他方の核酸と比較して突出している領域に相補的である。
本発明の一部の実施形態による第3核酸鎖は、第1核酸鎖のように、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての役割を果たすことができる。第3鎖は、それ自体、第1鎖と同じ配列または異なる配列を標的とすることができる。従って、第1鎖に関して考察された構造およびヌクレオチド組成は、第3鎖の構造および組成に同様に適用することができる。さらに、第2核酸鎖と同様に、第3鎖は、それに直接的または間接的に結合した機能性部分を含み得る。第3鎖は、様々な機能に使用することが可能であり、1つの例は、複合体の送達剤としての役割を果たす。
第3鎖は、天然DNAヌクレオチド、修飾DNAヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログから独立して選択されるヌクレオチド、または天然RNAヌクレオチド、修飾RNAヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログから独立して選択されるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態において、第3鎖は、PNAヌクレオチドを含み得る。
例えば、図7に示されるとおり、PNAが第3核酸鎖として使用される場合、PNAおよびタンパク質(アミノ酸)はペプチド結合を通じて結合することができるため、タンパク質等を含む機能性部分Xを有する一部の実施形態の二本鎖核酸複合体を簡単に作製することができる。さらに、図7Aに示される二本鎖核酸複合体の第3鎖は、第2鎖に相補的であるため、PNAを標的遺伝子の塩基配列にマッチさせる必要性がなく、このため大量生産が達成される。
このように、本発明の一部の実施形態の二本鎖核酸複合体の幾つかの好適な例示的実施形態について説明したが、一部の実施形態の二本鎖核酸が上記の例示的実施形態に限定されることは意図されない。さらに、当業者であれば、公知の方法を適切に選択することによって、本発明の一部の実施形態による第1核酸鎖、第2核酸鎖、および第3核酸鎖を製造することができる。例えば、本発明の一部の実施形態による核酸は、標的転写産物の塩基配列(または、一部の例においては、標的遺伝子の塩基配列)の情報に基づいて核酸のそれぞれの塩基配列を設計し、市販の自動核酸合成装置(アプライドバイオシステムズ株式会社(Applied Biosystems, Inc.)の製品、ベックマン・コールター株式会社(Beckman Coulter, Inc.)の製品など)を使用することによって核酸を合成し、その後、結果として得られたオリゴヌクレオチドを逆相カラムなどを使用して精製することにより製造することができる。この方法で製造した核酸を適切な緩衝溶液中で混合し、約90℃〜98℃で数分間(例えば5分間)変性させ、その後核酸を約30℃〜70℃で約1〜8時間アニールし、このようにして本発明の一部の実施形態の二本鎖核酸複合体を製造することができる。アニールした二本鎖複合体の作製は、このような時間および温度プロトコルに限定されない。2つまたは3つの鎖のアニーリングを促進するのに適した条件は、当技術分野において周知である。さらに、機能性部分が結合している二本鎖核酸複合体は、機能性部分が予め結合された核酸種を使用し、上記の合成、精製およびアニーリングを実施することによって製造することができる。機能性部分を核酸に連結するための多数の方法が、当技術分野において周知である。
本発明の一部の実施形態の二本鎖核酸が、上記の例示的実施形態に限定されることは意図されない。
上記の二本鎖核酸複合体、または下記の核酸複合体を含む組成物を使用する方法は、上記の複合体または組成物を「細胞」に接触させるステップを包含する。細胞は、in vitro回収の細胞であってもよいし、in vivo回収の細胞であってもよい。このため、接触は、in vitroで実施してもよいし、in vivoで実施してもよい。細胞は、細胞の懸濁液、細胞培養物、組織サンプルなどであってもよいし、動物(例えば哺乳動物、またはさらに特にヒト)であってもよい。接触ステップとしては、上記の複合体を細胞に直接接触させるステップ、細胞を含む溶液に入れるステップもあれば、細胞に注入するステップもある。
本発明の一部の実施形態の二本鎖核酸複合体は、標的部位に高特異性および高効率で送達することが可能であり、以下に記載される実施例に開示されるとおり、プレmRNAのプロセシング、標的遺伝子の発現または転写産物のレベルを極めて効果的に抑制することができる。従って、一部の実施形態において、本明細書中に記載される二本鎖核酸複合体を活性成分として含む組成物は、アンチセンス効果により細胞内のRNAの発現または機能を抑制、変更、または改変することができる。特に、本発明の一部の実施形態の二本鎖核酸複合体は、低濃度で投与された場合でも高い効力を与えることが可能であり、また臓器中のアンチセンス核酸の送達標的領域以外への分布を抑制することにより、有害な副作用を低下させることができる。従って、一部の実施形態はまた、例えば、遺伝子変異、標的遺伝子の発現の増加に関連する疾患(代謝疾患、腫瘍、および感染症など)を治療および予防することが意図される医薬組成物を提供することもできる。
本発明の一部の実施形態の二本鎖核酸複合体を含む組成物は、公知の製薬法により製剤化することができる。例えば、本組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、微粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、解膠剤(peptizer)、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、コーティング剤、軟膏、硬膏剤(plaster)、パップ剤(cataplasm)、経皮剤、ローション剤、吸入剤、エアロゾル剤、注射剤および坐剤の形態で経腸的に(経口等で)、または非経腸的に使用することができる。
これらの製剤の製剤化に関して、薬理学的に許容可能な担体または食品および飲料品として許容可能な担体、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物性油、溶媒、基剤、乳化剤、懸濁化剤、界面活性剤、pH調整剤、安定化剤、香味料、香料、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、鎮静剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、増粘剤、矯味剤、溶解助剤、および他の添加剤を適切に組み込むことができる。
製剤化の際、非特許文献7に開示されるとおり、機能性部分として脂質が結合している本発明の一部の実施形態の二本鎖核酸複合体は、リポタンパク質(例えばキロミクロン(chylomicron)またはキロミクロンレムナント(chylomicron remnant))との複合体の形成を引き起こすことができる。さらに、経腸投与の効率性を高めるという点から考えると、リポタンパク質に加えて、結腸粘膜上皮透過性増強作用を有する物質(例えば、中鎖脂肪酸、長鎖不飽和脂肪酸またはそれらの誘導体(塩、エステル形態またはエーテル形態))および界面活性剤(非イオン性界面活性剤およびアニオン性界面活性剤)との複合体(混合ミセルおよび混合エマルション)を使用することもできる。
本発明の一部の実施形態の組成物の好ましい投与形態には特定の限定はなく、その例としては、経腸(経口等)または非経腸投与、より具体的には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気管気管支投与、直腸投与、および筋肉内投与、ならびに輸血による投与が挙げられる。
本発明の一部の実施形態の組成物は、被験体としてヒトを含む動物に使用することができる。しかし、ヒトを除く動物には特定の限定はなく、様々な家畜、家禽、ペット、実験動物などが一部の実施形態の被験体となり得る。
本発明の一部の実施形態の組成物が投与または摂取される場合、投与量または摂取量は、被験体の年齢、体重、症状および健康状態、組成物の種類(医薬品、食品および飲料品等)などに従って適切に選択することができる。しかし、本発明の特定の実施形態による組成物の摂取有効量は、二本鎖核酸複合体0.001mg/kg/日〜50mg/kg/日である。
本発明の一部の実施形態の二本鎖核酸複合体は、以下の実施例に開示されるとおり、標的部位に高特異性および高効率で送達することが可能であり、さらに標的遺伝子の発現または転写産物のレベルを極めて効果的に抑制することができる。従って、一部の実施形態は、本発明の一部の実施形態の二本鎖核酸複合体を被験体に投与し、アンチセンス効果によって標的遺伝子の発現または転写産物レベルを抑制する方法を提供することができる。さらに、本発明の一部の実施形態の組成物を被験体に投与することにより、例えば、標的遺伝子の発現の増加に関連する様々な疾患を治療または予防する方法もまた提供される。
本明細書中以降、一部の実施形態は、実施例および比較実施例によってさらに具体的に説明されるが、実施形態が以下の実施例に限定されることは意図されない。
実施例１
二本鎖アンチセンス核酸複合体の、Huh-7細胞の核への接近可能性(accessibility)について試験し、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの接近可能性と比較した。この実験では、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)が核に到達することが可能である限り、ASOは、標的遺伝子であるアポBの発現を抑制することができなければならず、また従ってアポB mRNAの量は対応する低下を示すだろう。
一本鎖LNA/DNAギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号1)と相補RNAベース鎖(配列番号2)を、以下の配列および組成を用いて作製した：
16merASO (ヒトアポB mRNAのイントロンを標的とした)：
配列番号1：5'-C*T*C*c*c*a*c*c*a*c*a*t*a*G*C*A-3'
16mercRNA (ヒトアポB mRNAのイントロンを標的とした)：
配列番号2：5'-g*c*u*AUGUGGUGGG*a*u*g-3'
小文字イタリック体はDNAを表し、下線付きの大文字タイプはLNAを表し(CはLNAメチルシトシンを意味する)、大文字はRNAを表し、小文字は2'-O-メチル糖修飾を表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。
配列番号1(ASO)と配列番号2(cRNA)から、等モル量の上記の2つの鎖をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、シグマアルドリッチ社(Sigma-Aldrich)、セントルイス、ミズーリ州)溶液に添加し、この溶液を95℃で5分加熱し、溶液をゆっくりと室温に冷却してアニールした二本鎖複合体を形成することにより、二本鎖複合体(dsASO)を作製した。
細胞培養。37℃にて5％CO2中、Huh-7細胞を、10％ウシ胎仔血清(インビトロゲン社(Invitrogen)、カールスバッド、カリフォルニア州)、100U/mlのペニシリン、および100μgのストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地(シグマアルドリッチ社)中で維持した。
In vitro遺伝子サイレンシング。リポフェクタミンRNAiMAX(インビトロゲン社)を使用して、細胞に、10ナノモル/Lまたは25ナノモル/LのASOおよびdsASOを別々にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に細胞を回収した。全RNAを抽出し、標準的な方法により定量RT-PCRを使用して、内在アポB mRNAの量を測定した。
リポフェクタミン陰性対照を、二本鎖ASOおよび一本鎖(従来の)ASOと比較する実験の結果は図4に示される。データにより明らかであるとおり、一本鎖ASOは、陰性対照と比較してmRNAレベルの抑制をほとんど示さなかった。対照的に、二本鎖(ds)ASOは、10nMにおいて標的遺伝子の発現レベルの56％の抑制を、また25nMにおいて72％の抑制を示した。
リポフェクタミンRNAiMAXは、オリゴヌクレオチドを細胞質の範囲までのみ送達し、核膜を越えては送達しないことが予想されるため、二本鎖複合体には細胞質から核への細胞内移行機構があるが、一本鎖オリゴヌクレオチドにはこの機構がないことが示唆される。
実施例２
本発明の1つの実施形態による二本鎖アンチセンス核酸複合体が、ジストロフィン遺伝子の一部のプレmRNAのプロセシング中にエクソンスキッピングを引き起こす能力について試験し、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの能力と比較した。
この実験のため、ヒトジストロフィン遺伝子断片の安定発現プラスミドを構築し、この構築物を含む安定細胞株を確立した。上記のジストロフィン遺伝子断片は、その長さのため便宜上短縮された、イントロン57を除くエクソン57〜エクソン59の完全長配列を有する。
安定細胞株におけるジストロフィン断片の発現は、通常、エクソン57、58、および59を含むmRNAを生じることが予想される。しかし、プレmRNAのプロセシング中にエクソン58のスキッピングを引き起こす能力を有するスプライススイッチングオリゴヌクレオチドの存在下では、発現したmRNAは、エクソン57と59を含むがエクソン58が欠失していると予想し得る。
この実験では、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)が核に到達することが可能である限り、ASOはジストロフィン遺伝子から発現したmRNA産物のスプライシングを変更することができなければならず、またこのためジストロフィンの3つのエクソン断片(エクソン57、58、および59)の量は、対応する低下を示すだろう。
エクソン58のエクソンスキッピングを引き起こすことができる2つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製し、試験した。1つのASOはイントロン57内の配列に結合し、他のASOはエクソン58内の配列に結合し、この両方を通じてエクソン58のスキッピングを引き起こす。それぞれのASOについて、二本鎖アンチセンス核酸複合体を形成するために使用される2つの異なる相補鎖を作製した。いずれの場合も、相補鎖は、下記のとおり2塩基または3塩基のいずれかの3'ウイングおよび5'ウイングを有する2'-OMe RNA/RNAギャップマーである。
ジストロフィン遺伝子発現プラスミドの構築。ジストロフィン遺伝子断片プラスミドの模式図は、図8Aに示される。
構築のための開始プラスミドは、pcDNA5/FRTベクター(インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア州)であった。Flagタグを含む断片を生成するため、2つのオリゴヌクレオチド、5'-AGCTTACCATGGATTACAAGGACGACGACGACAAGGGGGTAC-3'(配列番号3)(HindIII部位およびKpnI部位(下線部)を含む)と、5'-CCCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAATCCATGGTA-3'(配列番号4)を一緒にアニールした。アニーリング後、上記の断片をpcDNA5/FRTベクター(pcDNA5/FRT-FLAG)のHindIII/KpnI部位にクローン化した。このFlagタグは、余分な第1メチオニンの偶発的な発現を回避するため、2つのサイレント変異を含む。
pcDNA3-EGFPベクターを鋳型として使用して、フォワードプライマー：5'-CCCGGGTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3'(配列番号5)(SmaI部位(下線)を含む)およびリバースプライマー：5'-ATAGGGCCCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3'(配列番号6)(ApaI部位(下線)を含む)を用いてEGFP断片を増幅した。サイクル条件は以下のとおりであった：94℃で2分、次いで98℃で0.5分、63℃で0.5分、68℃で0.75分を35サイクル、さらに68℃で3分。PCR反応は、KOD FX NEO(東洋紡株式会社(TOYOBO)、大阪、日本)を製造者の使用説明書に従って使用して実施した。EGFP断片を、SmaI/ApaI消化したpcDNA5/FRT-FLAGベクター(pcDNA5/FRT-FLAG-EGFP)に挿入した。
pDsRed-Express-N1ベクターを鋳型として使用して、フォワードプライマー：5'-ATATGGATCCAACCGGTGTGGCCTCCTCCGAGGACGTCA-3'(配列番号7)(BamHIおよびAgeI部位(下線)を含む)およびリバースプライマー：5'-CGGTCTACAGGAACAGGTGGTGGC-3'(配列番号8)を用いてEGFP断片を増幅した。サイクル条件は以下のとおりであった：94℃で2分、次いで98℃で0.5分、63℃で0.5分、68℃で0.75分を35サイクル、さらに68℃で3分。PCR反応は、KOD FX NEO(東洋紡株式会社社、大阪、日本)を製造者の使用説明書に従って使用して実施した。EGFP断片を、BamHI/SmaI消化したpcDNA5/FRT-FLAG-DsRedベクター(pcDNA5/FRT-FLAG-DsRed-EGFP)に挿入した。
蛍光タンパク質を核に集めるため、NLS配列(核局在化シグナル(Nucleus Localized Signal))を、BamHI消化したpcDNA5/FRT-Flag-DsRed-EGFPに挿入した。このNLS配列は、2つのオリゴヌクレオチド：
5'-ATGCCCCAAAAAAAAAACGCAAAGTGGAGGACCCAAAGGTACCAAAG-3'(配列番号9)と、
5'-GATCCTTTGGTACCTTTGGGTCCTCCACTTTGCGTTTTTTTTTTGGGGCATGTAC-3'(配列番号10)をアニーリングすることによって作製した(pcDNA5/FRT-Flag-NLS-DsRed-EGFP)。
ヒトジストロフィン遺伝子の安定発現プラスミドを作製するため、HepG2ゲノムによるPCRによってヒトジストロフィン遺伝子断片を得た。ジストロフィン遺伝子断片を含むプラスミドは、イントロン57を除くエクソン57〜エクソン59の完全長配列を有する。イントロン57配列(17683塩基対)は、プラスミドに挿入するには長すぎるため、イントロン57の一部である配列+207〜+17486を、フォワードプライマー：5'-AACGGTACCAACGCTGCTGTTCTTTTTCA-3'(配列番号11)(KpnI部位(下線)を含む)、リバースプライマー：5'-GTGTTTGTAATGGACGATTTCTTAAAGGGTATT-3'(配列番号12)およびフォワードプライマー：5'-AAATCGTCCATTACAAACACAGCGCTTTCC-3'(配列番号13)、リバースプライマー：5'-AGACCGGTACTCCTCAGCCTGCTTTCGTA-3'(配列番号14)(AgeI部位(下線)を含む)を使用してPCRにより欠失させた。この断片を、KpnI/AgeI消化したpcDNA5/FRT-Flag-NLS-DsRed-EGFPベクターにクローン化した(pcDNA5/FRT-Flag-NLS-DMD-エクソン57_58_59(短イントロン57)-DsRed-EGFP)。
構築物は全て、ABI PRISM 310アナライザー(アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国)によって確認されたか、または株式会社ファスマック(Fasmac)(神奈川、日本)により配列決定された。
安定な細胞株の確立。Flp-In-293(インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア州)細胞を、10％ウシ胎仔血清(FBS)(バイオウェスト社(Biowest)、ニュアイエ(Nuaille)、フランス)、2％ペニシリン-ストレプトマイシン混合溶液(ペニシリン10,000単位/mL、ストレプトマイシン10,000μg/mL)(ナカライテスク株式会社(Nacalaitesque)、京都、日本)を含有する10％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM)(ナカライテスク株式会社、京都、日本)中で培養し、37℃において100mg/mLのゼオシンで選択した。pcDNA5/FRT-Flag-Dys57>59di-NLS-DsRed-EGFPおよびpOG44(Flpリコンビナーゼ発現プラスミド)(インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア州)を、Flp-In-293細胞に共トランスフェクトした。安定な細胞株を、ハイグロマイシンB 50mg/mL(インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア州)耐性に基づいて選択した。
細胞培養。安定細胞株を、10％ウシ胎仔血清(FBS)(バイオウェスト社、ニュアイエ、フランス)および2％ペニシリン-ストレプトマイシン混合溶液(ペニシリン10,000単位/mL、ストレプトマイシン10,000μg/mL)(ナカライテスク株式会社、京都、日本)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(ナカライテスク株式会社、京都、日本)中で培養した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび相補鎖。上記の実験において使用される核酸鎖の配列および組成は以下に挙げられる。オリゴヌクレオチド(ASOおよびcGapmer)は、株式会社ジーンデザイン(Gene Design)(大阪、日本)によって合成された。ASO2とcGapmer(2)(配列番号18と配列番号19)の間、およびASO2とcGapmer(3)(配列番号18と配列番号20)の間で形成された二本鎖複合体の図は、図8B〜8Cに示される。
ASO1：DMDイントロン57-17683-BNA(15)PS
配列番号15：5'-c*C*c*t*C*t*t*G*a*a*G*g*c*C*t-3'
cGapmer(2)：CSmRNA(2-2_2'OMe_PS)_DMD-イントロン57-17683(15)
配列番号16：5'-a*g*GCCUUCAAGAGg*g-3'
cGapmer(3)：CSmRNA(3-3_2'OMe_PS)_DMD-イントロン57-17683(15)
配列番号17：5'-a*g*g*CCUUCAAGAg*g*g-3'
ASO2：DMD-エクソン58-106-BNA(15)PS
配列番号18：5'-t*C*t*g*G*g*c*T*c*c*T*g*g*T*a-3'
cGapmer(2)：CSmRNA(2-2_2'OMe_PS)_DMD-エクソン58-106(15)
配列番号19：5'-u*a*CCAGGAGCCCAg*a-3'
cGapmer(3)：CSmRNA(3-3_2'OMe_PS)_DMD-エクソン58-106(15)
配列番号20：5'-u*a*c*CAGGAGCCCa*g*a-3'
小文字イタリック体はDNAを表し、下線付きの大文字タイプはLNAを表し(CはLNAメチルシトシンを意味する)、大文字はRNAを表し、小文字は2'-O-メチル糖修飾を表し、また星印はホスホロチオエート結合を表す。
適切なペアのオリゴヌクレオチド(すなわち、配列番号15/16；配列番号15/17；配列番号18/19；および配列番号18/20)をアニーリングすることにより、二本鎖核酸複合体を作製した。ASOと相補RNA cGapmer鎖の等モル溶液を、50mM Tris-HCl、20mM NaCl緩衝液中で合わせた。この溶液を95℃で5分加熱し、37℃に60分超冷却し、さらに37℃で60分間保持した。
一本鎖ASOおよび二本鎖ASOのトランスフェクション。安定細胞株を、トランスフェクションの1日前に、5.0x105細胞/ウェルの密度で24ウェルプレートに播種した。30〜40％のコンフルエンスで、細胞に、一本鎖ASOまたは二本鎖ASO/cGapmer複合体のいずれかを、リポフェクタミンRNAi MAX(インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア州)を製造者の使用説明書に従って使用してトランスフェクトした。それぞれ10nMのASOまたはcGapmerにつき、1.0μLのリポフェクタミンRNAi MAXを使用した。二本鎖複合体を、3nM、10nM、30nM、および100nMのASO鎖の濃度範囲にわたって試験した。(最終濃度：リポフェクタミンRNAi MAXが1〜20μL/mL、ASOおよびcGapmerが6〜200nM)。トランスフェクションの24時間後に細胞を回収し、全RNAを抽出した。
RNA単離および逆転写。QuickGene 800(富士フィルム株式会社(FUJI-FILM)、東京、日本)をRNA培養細胞キットS(東洋紡株式会社、大阪、日本)と共に製造者の使用説明書に従って使用して、全RNAサンプルを細胞から単離した。Rever Tra Ace qPCR Master Mix(東洋紡株式会社、大阪、日本)を製造者の使用説明書に従って使用して、第1鎖cDNAを1.5μgのそれぞれの細胞サンプルの全RNAから合成した。
リアルタイムPCR分析。上記のcDNAを、Primer Expressプログラム(アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国)によって設計された特異的プライマーセットを用いる個々のPCR反応のための鋳型として使用した。プライマーの配列は以下に示される。
エクソン58スキップ分析プライマー：
配列番号21：5'-TCAGCCTGCTTTCGTAGA-3'
配列番号22：5'-GATGTACATAGGAGCTGCCTC-3'
GAPDH分析プライマー：
配列番号23：5'-GGTCACCAGGGCTGCTTTT-3'
配列番号24：5'-GTAAACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAG-3'
プライマーは全て、北海道システム・サイエンス株式会社(Hokkaido System Sciences)(札幌、日本)により合成された。PCR反応は、SYBR Green Real Time PCR Master Mix(東洋紡株式会社、大阪、日本)を、アニーリング時間を除き製造者の使用説明書に従って使用して実施した。アニーリング時間は、特にエクソン58スキッピング検出について、15秒に変更した。PCR分析は、Step one plus(アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国)を使用して実施した。増幅特異性は、PCR産物をエチジウムブロマイド染色した2.0％アガロースゲル上で可視化することによって確認した。グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)を使用して、それぞれの発現データを正規化した。
RT-PCR分析。上記のcDNAを、ホワイトヘッド研究所(Whitehead Institute)で書かれたプライマー3プログラムによって設計された特異的プライマーセットを用いる個々のPCR反応のための鋳型として1.0μL使用した。プライマーは全て、北海道システム・サイエンス株式会社(札幌、日本)により合成された。プライマーの配列は以下に示される。
ジストロフィンプライマー：
配列番号25：5'-AACGGTACCAACGCTGCTGTTCTTTTTCA-3'
配列番号26：5'-CTTGGAGCCGTACTGGAACT-3'
GAPDH分析プライマー：
配列番号27：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
配列番号28：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'
サイクル条件は以下のとおりであった：95℃で1分、次いで98℃で0.5分、55℃で0.5分、68℃で0.25分を25サイクル、さらに68℃で3分。PCR反応は、KOD FX NEO(東洋紡株式会社、大阪、日本)を使用して実施した。反応混合物の調製は、製造者の使用説明書に従った。
実験。要約すると、ジストロフィンを標的とする(エクソンスキッピング)アンチセンスオリゴヌクレオチドと相補ギャップマーRNA鎖を作製し、アニールさせて二本鎖核酸複合体を形成した。この複合体を、RNAiMAXを使用して、ジストロフィン遺伝子断片(エクソン57、58、59)を有するプラスミドを含む安定細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、全RNAを抽出して逆転写に供し、リアルタイムPCRによって分析した。PCRを使用して産物をさらに増幅し、増幅産物をゲル電気泳動によって分析した。このゲルから、それぞれのASOによって誘導されたエクソン58スキッピング量を計算した。この量を、細胞中で観察されたGAPDH発現に対して正規化した。二本鎖複合体についての結果を、一本鎖複合体のみ、および未処理対照(トランスフェクション溶液中にオリゴヌクレオチドが含まれない)に対して比較した。試験は全て、3重で実施した。
様々なASOおよび二本鎖複合体についての結果は、図9〜12においてグラフに示される。グラフから明らかであるとおり、二本鎖複合体によって引き起こされるエクソンスキッピングの程度は、複合体の濃度と共に増加した。最高濃度(100nM)において、細胞が悪影響を受けたことが観察された。死滅した細胞はほとんどなかったが、発現レベルは、恐らく上記の剤によって影響を受けた。
全ての場合において、二本鎖ASO複合体によって誘導されたエクソン58スキッピングの程度は、同じ濃度(10nM)において一本鎖ASOによって誘導されたエクソン58スキッピングの程度よりも著しく大きかった。グラフ中の各棒の上は、ASOのみの対照と比較した、各試験(N=3)のP値に適用したダネット検定(Dunnett's test)の値である。
従って、架橋ヌクレオチド/DNAミックスマーは、RNAベースの相補鎖とアニールして二本鎖核酸複合体が得られると、ASOを核に送達し、一本鎖ASOよりも優れた程度まで、プレmRNAのプロセシングにおいてエクソンスキッピング効果を誘導することができることが示された。
実施例３
材料および方法
スプライススイッチングオリゴヌクレオチド(SSO)の合成
この研究において使用されたSSOは全て、表1に示される。Shimo. T.ら、"Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro"、Nucleic Acids Research, doi：10.1093/nar/gku512(2014年)刷の文献に示されるとおり、SSOの配列は、系統的スクリーニングによって最適化した。2種類の修飾(2',4'-BNAおよび2'-OMe)が、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合によって完全に置換されたSSO配列に組み込まれた。SSOは全て、ヒトジストロフィン遺伝子に対して相補的な配列を有するように設計され、株式会社ジーンデザイン(大阪、日本)によって合成および精製された。
修飾相補RNAの合成
この研究において使用される修飾相補RNA(修飾cRNA)は全て、表2に示される。2'-OMe修飾が、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合により部分的に置換された修飾cRNA配列に組み込まれた。修飾cRNAは、株式会社ジーンデザインによって合成および精製された。
二本鎖SSOの作製
等分子量の一本鎖SSOと相補RNAを、50mM Tris-HClと100mM NaClを含むアニーリング緩衝液に溶解した。サンプルを煮沸し、その後ゆっくりと室温に冷却した。
SSOトランスフェクション
安定細胞株を、トランスフェクションの1日前に、8.0x104細胞/ウェルの密度で24ウェルプレート上に播種した。30〜40％のコンフルエンスで、リポフェクタミンRNAiMAX(インビトロゲン社、カールスバッド、カリフォルニア州)を製造者の使用説明書に従って使用して、SSOを細胞にトランスフェクトした。24時間後、上記の細胞を回収した。
RNA単離およびcDNA合成
QuickGene 800およびQuickGene RNA培養細胞キットS(クラボウ(KURABO)、大阪、日本)を製造者の使用説明書に従って使用して、全RNAサンプルを細胞から単離した。第1鎖cDNAは、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(東洋紡株式会社、大阪、日本)を製造者の使用説明書に従って使用して、150ngのそれぞれの細胞サンプルの全RNAから合成した。
定量リアルタイムRT-PCR分析
上記のcDNAを、Primer Expressプログラム(アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア州)およびプライマー3プログラムを使用して設計されたエクソンスキッピング特異的プライマーセット(表3)を用いる個々のPCR反応のための鋳型として使用した。PCR反応は、SYBR Green Real-time PCR Master Mix(東洋紡株式会社)を、アニーリング時間を15秒間に減少させたことを除き製造者の使用説明書に従って使用して行った。定量PCR分析は、StepOnePlusデバイス(アプライドバイオシステムズ社)を使用して実施した。増幅特異性は、PCR産物をエチジウムブロマイド染色した2％アガロースゲル上で可視化することにより確認した。GAPDHを使用して、発現データを正規化した。
紫外線(UV)融解実験
UV融解実験は、Tm分析アクセサリTMSPC-8を備えたShimadzu UV-1650PC UV-Vis分光光度計を使用して行った(島津製作所(Shimadzu)、京都、日本)。等分子量の2つの一本鎖オリゴヌクレオチドを、10mM NaClを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)に溶解し、2.0μMの最終鎖濃度を得た。サンプルを煮沸し、その後ゆっくりと室温に冷却した。吸収は、5℃から95℃まで、0.5℃/分の走査速度で、260nmでフォワード方向およびリバース方向に記録された。第1導関数を、UV融解プロファイルから計算した。導関数曲線中のピーク温度を融解温度(Tm)と指定した。
この実験に使用したSSOは、以下に示される。ジストロフィンエクソン58スキッピングのための11個のSSOが示される。配列は、5'から3'へ示される。
ASO3：DMDイントロン57-17684-1
配列番号29：5'-T*C*C*C*T*C*T*T*G*A*A*G*G*C*C-3'
ASO4：DMDイントロン57-17684-2
配列番号30：5'-T*c*C*c*T*c*T*t*G*a*A*g*G*c*C-3'
ASO5：DMDイントロン57-17684-3
配列番号31：5'-t*C*c*C*t*C*t*T*g*A*a*G*g*C*c-3'
ASO6：DMDイントロン57-17684-4
配列番号32：5'-t*c*C*c*t*C*t*t*G*a*a*G*g*c*C-3'
ASO7：DMDイントロン57-17684-5
配列番号33：5'-t*c*C*c*t*C*t*t*g*a*a*G*g*c*C-3'
ASO8：DMDイントロン57-17684-6
配列番号34：5'-t*c*C*c*t*c*t*t*G*a*a*g*g*c*C-3'
ASO 9：DMDイントロン57-17684-7
配列番号35：5'-t*c*C*c*t*c*t*t*g*a*a*g*g*c*C-3'
ASO10：DMDイントロン57-17684-8
配列番号36：5'-t*c*c*c*t*c*t*t*G*a*a*g*g*c*c-3'
ASO11：DMDイントロン57-17684-9
配列番号37：5'-u*c*c*c*u*c*u*u*g*a*a*g*g*c*c-3'
ASO12：DMDイントロン57-17684-10
配列番号38：5'-t*c*c*c*t*c*t*t*g*a*a*g*g*c*c-3'
ASO13：DMDイントロン57-17684-11
配列番号39：5'-t*c*c*c*t*c*t*t*g*a*a*g*g*c*c-3'
小文字イタリック体はDNAを表し、下線付きの大文字タイプはLNAを表し(CはLNAメチルシトシンを意味する)、小文字は2'-O-メチル糖修飾を表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。
表1は、結果を示す。
Figure 0006604544
SSOと天然/修飾cRNA間の二本鎖(10mMリン酸緩衝液(pH7.2)、10mM NaCl(n=3-4)中の2μM二本鎖)のTm値は、相補天然RNAおよび修飾cRNAを用いて決定した(+/-SD)。
i) 天然cRNA、rGGCCUUCAAGAGGGA (配列番号40)を含む二本鎖のTm(℃)。
ii) 修飾cRNA、cGapmer CSmRNA(2-2_2'OMe_PS)_DMD-イントロン57-17684(15)を含む二本鎖のTm(℃)。
修飾cRNA、DMD-イントロン57-17684_cRNAの配列を以下に示した。
cGapmer CSmRNA(2-2_2'OMe_PS)_DMD-イントロン57-17684(15)
配列番号41：5'-g*g*CCUUCAAGAGGg*a-3'
大文字はRNAを表し、小文字は2'-O-メチル糖修飾を表し、星印はホスホロチオエート結合を表す。
定量リアルタイムRT-PCR分析に使用されたプライマー。それぞれの標的用のフォワード(For.)プライマーおよびリバース(Rev.)プライマーの配列は、表2に示される。配列は、5'から3'へ示される。小文字イタリック体はDNAを表す。
Figure 0006604544
結果
図13は、15mer二本鎖SSOのエクソンスキッピング活性およびTm値を示す。
エクソン58スキップされたmRNA断片のレベルを、定量リアルタイムRT-PCRにより測定し、未処理セットの値(1とした)と比較して、GAPDH mRNAのシグナルに対して正規化した。値は、3重サンプルの平均+/-標準偏差を表す。図13には、修飾相補RNAを有するそれぞれのSSOのTm値も四角の記号によって示される。「#」は、シグモイド融解曲線が観察されなかったことを示す。データは、平均+/-標準偏差(n=3-4)である。Mock(偽)：リポフェクタミンのみで処理；未処理：未トランスフェクション。
高いTm値を有する二本鎖SSO、DMD-イントロン57-17684-2、DMD-イントロン57-17684-3、DMD-イントロン57-17684-4、DMD-イントロン57-17684-5およびDMD-イントロン57-17684-9は、高いエクソンスキッピング活性を示した。
図13に示されるとおり、二本鎖SSOは、65℃〜88℃のTm値において、高いエクソンスキッピング活性を示した。
1〜4、9、10、15〜20、29〜41 合成
5〜8、11〜14、21〜28、42〜45 プライマー

Claims (18)

  1. 細胞の核内のコーディングまたは非コーディングRNAの機能を変化させ、標的遺伝子の発現の増加に伴う疾患の治療または予防するための医薬組成物であって、以下：
    第2核酸鎖にアニールした第1核酸鎖であって、ここで：
    (i) 第1核酸鎖は、天然DNAヌクレオチドを含み、さらに修飾DNAヌクレオチド、および／または架橋ヌクレオチドを含み、
    (ii) 第1核酸鎖中の天然DNAヌクレオチド、修飾DNAヌクレオチド、および架橋ヌクレオチドの総数は8〜100であり、且つ
    (iii) 第1核酸鎖は、架橋ヌクレオチド/DNAミックスマーオリゴヌクレオチドを含むスプライススイッチングオリゴヌクレオチドであり細胞の核内のコーディングまたは非コーディングRNAにハイブリダイズすることが可能であり；さらに 第2核酸鎖は、天然RNAヌクレオチド、および修飾RNAヌクレオチドから独立して選択されるヌクレオチドを含む、
    前記第2核酸鎖にアニールした第1核酸鎖を含む二本鎖核酸複合体
    を含む、前記医薬組成物。
  2. 前記コーディングまたは非コーディングRNAの機能が、プレmRNAのイントロンを標的とすることによるアンチセンス効果により変化させられる、請求項1に記載の医薬組成物。
  3. 前記コーディングRNAの機能が、エクソンスキッピングを誘導することによって変化させられる、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 二本鎖核酸のTm値が65℃より大きくかつ90℃未満である請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 二本鎖核酸のTm値が70℃より大きくかつ90℃未満である請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  6. 第1核酸鎖が、４個以上の連続する天然DNAヌクレオチドを有する領域を含まない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  7. 第1核酸鎖が、２または３個の連続する天然DNAヌクレオチドからなる少なくとも1つの領域を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  8. 第1核酸鎖が、ホスホロチオエート化された天然DNAヌクレオチド及び修飾DNAヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  9. 第1核酸鎖が、４個以上の連続する天然DNAヌクレオチドを含む、請求項１記載の医薬組成物。
  10. 架橋ヌクレオチドがLNA、cEt-BNA、アミドBNA(AmNA)、およびcMOE-BNAから独立して選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  11. 第1核酸鎖が、4'-(CH2)p-O-2',4'-(CH2)p-CH2-2',4'-(CH2)p-S-2',4'-(CH2)p-OCO-2',4'-(CH2)n-N(R3)-O-(CH2)m-2'(式中、p、mおよびnは、それぞれ1〜4の整数、0〜2の整数、および1〜3の整数を表し、またR3は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、蛍光もしくは化学発光標識、核酸切断活性を有する機能性基、または細胞内もしくは核内局在化シグナルペプチドを表す)により2'位の炭素原子と4'位の炭素原子が架橋されているヌクレオチドから独立して選択される架橋ヌクレオチドを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  12. 第１核酸鎖中の修飾DNAヌクレオチドが、モルホリノヌクレオチド、2'-O-メチル修飾ヌクレオチド、または2'-O-(2-メトキシエチル）修飾ヌクレオチドから独立して選択されるヌクレオチドを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  13. 第1核酸鎖中の天然DNAヌクレオチド、修飾DNAヌクレオチド、および架橋ヌクレオチドの総数が10〜35である、請求項１〜１２のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  14. 修飾RNAヌクレオチドが、2'-O-メチル化および／またはホスホロチオエート化RNAである、請求項１〜１３のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  15. 第1核酸鎖および/または第2核酸鎖が、標識機能、精製機能、および標的送達機能から選択される機能を有する機能性分子をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の医薬組成物。
  16. 前記機能性分子が、脂質、糖、ペプチド、およびタンパク質から選択される分子である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 前記機能性分子が、第1、または第2、核酸鎖の3'末端ヌクレオチドおよび/または5'末端ヌクレオチドに連結されている、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 前記機能性分子が、受容体リガンドおよび抗体から選択されるペプチドまたはタンパク質である、請求項１７に記載の医薬組成物。
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