TW202039848A - 肌肉生長抑制素訊號傳導抑制劑 - Google Patents

Abstract

本發明提供了一種藉由在mRNA層次上靶向ACVR2B而抑制肌肉生長抑制素訊號傳導之新穎方法。

Description

肌肉生長抑制素訊號傳導抑制劑

本發明係關於一種藉由在mRNA層次上靶向ACVR2B而抑制肌肉生長抑制素訊號傳導的新方法。

也稱為GDF8之肌肉生長抑制素係於1997年被發現之屬於TGF-β超家族的新型細胞介素。肌肉生長抑制素的組織表現係特異性於骨骼肌中，骨骼肌是負責運動及代謝活動的主要組織。患有肌肉生長抑制素缺乏症突變的動物表現出明顯的肌肉肥大，其中，骨骼肌的數量增加至其野生型對應物物的兩倍(McPherron等人，Nature.387(6628)：83-90,1997)。根據該觀察，肌肉生長抑制素被認為是控制骨骼肌體積的重要因素。

當肌肉生長抑制素將其訊號轉導至細胞內部時，其如其他TGF-β般經歷一個過程，首先與II型受體結合，然後與I型受體結合以形成配體-受體複合物。通過這個過程，各受體在其細胞間結構域上都進行磷酸化，從而通過Smad依賴性或Smad非依賴性途徑進行訊號轉導(Chang等人,Endocrine Reviews.23(6)：787-823,2002)。I型及II型受體兩者分別由多個基因編碼。屬於TGF-β超家族的各分子都與受體的特定組合結合。肌肉生長抑制素與I型受體的ALK4或ALK5及II型受體的ACVR2B結合。然而，該組合並非肌肉生長抑制 素所特有，亦被包括GDF11、活化素A等一些其他TGF-β超家族分子使用(Wakefield及Hill.Nat Rev Cancer.13(5)：328-41,2013,doi：10.1038/nrc3500。因此，肌肉生長抑制素以外的其他配體與ACVR2B/ALK4或ACVR2B/ALK5的結合可能會像肌肉生長抑制素的結合一樣觸發向肌肉傳導抑制性訊號。實際上，已報導對於缺乏肌肉生長抑制素基因的小鼠投予針對ACVR2B或可溶性ACVR2B之中和抗體，係除了肌肉生長抑制素缺乏引起的肌肉體積增加以外，進一步增加肌肉體積，其中，該中和抗體係跨膜結構域及其下游區域經抗體-Fc結構域替換者(參見Lach-Trifilieff等人，Mol Cell Biol.34(4)：606-18,2014.doi：10.1128/MCB.01307-13；Lee等人，Proc Natl Acad Sci USA.102(50)：18117-22、2005)。此進一步增加表示肌肉生長抑制素還存在其他因子，其係藉由與ACVR2B結合而抑制肌肉體積。

用於減少肌肉生長抑制素訊號傳導的手段可用於治療或預防特定的肌肉消瘦及其他肌肉相關疾病。本發明提供了一種藉由在mRNA層次上靶向ACVR2B而抑制肌肉生長抑制素訊號傳導的新方法。

根據本發明的第一態樣，提供一種化合物，該化合物係能夠使目標細胞產生突變之活化素受體2B型(ACVR2B)mRNA，其中，該突變之活化素受體2B型(ACVR2B)mRNA中不存在編碼ACVR2B之野生型的一些或全部細胞內區域之一部份mRNA序列。

根據本發明的第一態樣的變體，提供一種化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，該化合物係能夠使活化素受體2B型(ACVR2B)蛋白產生成截 斷形式，該截斷形式缺少野生型ACVR2B的部分細胞內區域。

在特定具體例中，該化合物是寡核苷酸，其能夠實現ACVR2B的5、6、7、8、9及10個外顯子中的一個或多個外顯子跳躍(skipping)。

根據本發明的第二態樣，提供一種醫藥組成物，其包括本發明的第一態樣的化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物。

根據本發明的第三態樣，提供用於治療的本發明的第一態樣的化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物或本發明的第二態樣的醫藥組成物。在一個特定具體例中，該療法係預防或治療肌肉萎縮症、肌少症或肌萎縮性疾病，例如杜興氏肌肉失養症(Duchenne muscular dystrophy)。

根據本發明的第四態樣，提供一種基因操作動物，該基因操作動物表現缺少ACVR2B的部分細胞內區域的突變ACVR2B mRNA。

本發明的特定態樣及具體例包括：

[1]一種化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，該化合物係能夠使目標細胞產生突變之活化素受體2B型(ACVR2B)mRNA，該突變的活化素受體2B型(ACVR2B)mRNA中不存在編碼野生型ACVR2B的一些或全部細胞內區域的部分序列。

[2]如[1]所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其中，該野生型ACVR2B的細胞內區域係由野生型ACVR2B的外顯子5至11編碼。

[3]如[1]或[2]所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，該化合物係能夠使目標細胞產生截斷ACVR2B蛋白(truncated ACVR2B protein)，該截斷ACVR2B蛋白缺少野生型ACVR2B的部分細胞內區域。

[4]如[3]所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其中，該截斷ACVR2B蛋白係缺少由至少一個選自由ACVR2B的外顯子5、6、7、8、9及10所組成群組的外顯子所編碼的全部或部分細胞內區域。

[5]如[1]至[3]中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，該化合物為能夠誘發用於編碼ACVR2B的部分細胞內區域的外顯子跳躍(skipping)的反義寡聚物。

[6]如[5]所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其中，該被跳躍的外顯子係選自由ACVR2B的外顯子5、6、7、8、9及10所組成群組。

[7]如[5]或[6]所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其係包括10至50個核鹼基。

[8]如[5]至[7]中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其係包括與選自由ACVR2B的外顯子5、6、7、8、9及10所組成群組之外顯子的10至50個連續核苷酸互補的序列。

[9]如[5]至[8]中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其中，該外顯子包括選自由SEQ ID NO：1至6所組成群組的序列。

[10]如[5]至[9]中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，該化合物包括選自由SEQ ID NO：12至36及43至111所組成群組的核苷酸序列。

[11]如[5]至[10]中任一項所述之化合物或其選自醫藥上可接受之鹽或水合物，該化合物係由選自由SEQ ID NO：12至36及43至111所組成群組之核苷酸序列所組成。

[12]如[5]至[11]中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其中，該反義寡聚物是寡核苷酸。

[13]如[12]所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其中，該寡核苷酸中的至少一個糖部分及/或至少一個磷酸酯鍵部分經修飾。

[14]如[13]所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其中，該修飾之糖部分為核糖，在該核糖中，2’-位置的-OH基經選自由OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br及I所組成群組中的任意基團取代(其中，R表示烷基或芳基，R’表示伸烷基)。

[15]如[13]或[14]所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其中，該修飾之磷酸酯鍵部分係選自由硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基磷酸酯鍵、胺基磷酸酯鍵及硼烷磷酸酯鍵(boranophosphate bond)所組成群組中之一者。

[16]如[5]至[11]中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其中，該反義寡聚物包括至少一個嗎啉環。

[17]如[16]所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，該化合物為嗎啉代寡聚物(morpholino oligomer)或磷醯二胺(phosphorodiamidate)嗎啉代寡聚物。

[18]如[16]或[17]所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，該化合物在其5’-末端具有由化學式(1)至(3)表示的任何一個基團。

[19]一種化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，該化合物係細胞穿透肽與[1]至[18]中任一項所述之化合物鍵結成之接合物。

[20]一種醫藥組成物，其係包括[1]至[19]中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物。

[21]如[20]所述之醫藥組成物，其更包含至少一種醫藥上可接受之載體或添加劑。

[22]如[20]或[21]的醫藥組成物，其係經冷凍乾燥。

[23]如[1]至[19]中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，或[20]至[22]中任一項的醫藥組成物，係用於對象主體(subject)的療法。

[24]如[23]所述之用於對象主體的化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物、或用於對象主體的醫藥組成物，其中，該療法係預防或治療對象主體的肌萎縮性疾病、肌肉萎縮症(muscle wasting disease)或肌少症(sarcopenic disease)。

[25]如[24]所述之用於對象主體的化合物或醫藥上可接受之鹽或水合物、或用於對象主體的醫藥組成物，其中，該肌萎縮性疾病係杜興氏肌肉失養症。

[26]如[23]至[25]中任一項所述之用於對象主體的化合物或醫藥上可接受之鹽或水合物、或用於對象主體的醫藥組成物，其中該對象主體係人類。

[27]一種用於治療對象主體之肌萎縮性疾病、肌肉萎縮症或肌少症之方法，其包括向該對象主體投予治療有效量的[1]至[19]中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，或[20]至[22]中任一項所述之醫藥組成物。

[28]如[27]所述之方法，其中，該肌萎縮性疾病係杜興氏肌肉失養症。

[29]如[27]或[28]所述之方法，其中，該對象主體係人類。

[30]一種[1]至[19]中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物之用途，係製備用於預防或治療肌萎縮性疾病、肌肉萎縮症或肌少症之藥物。

[31]如[30]所述之用途，其中，該肌萎縮性疾病係杜興氏肌肉失養症。

[32]如[30]或[31]所述之用途，其中，該對象主體係人類。

[33]一種基因操作之動物，其係表現突變活化素受體2B型(ACVR2B)mRNA，該突變活化素受體2B型(ACVR2B)mRNA中不存在編碼野生型ACVR2B的一些或全部細胞內區域的部分序列。

第1圖顯示藉由被所示的磷醯二胺嗎啉代寡聚物(PMO)(a及b)、硫代磷酸酯(PS)寡核苷酸(c)或PMO-肽接合物(d)各外顯子的跳躍效率(%)。

第2圖顯示藉由截斷之ACVR2B的表現而抑制肌肉生長抑制素訊號傳導，其中，該截斷之ACVR2B主要表現在內源性野生型ACVR2B上。

第3圖顯示作為肌肉生長抑制素訊號強度的指標之SMAD7 mRNA表現之抑制。

後文更詳細地描述本發明。下述具體例僅旨在通過實施例的方式描述本發明，而不旨在將本發明限制於該等具體例。在不悖離本發明的精神的情況下，可以以各種方式實現本發明。以5’端位於左端且3’端位於右端的方式呈現核苷酸序列。胺基酸序列以N端位於左端且C端位於右端的方式呈現。

化合物

本發明提供一種化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其係能夠使目標細胞產生突變之活化素受體2B型(ACVR2B)mRNA，該突變之活化素受體2B型(ACVR2B)mRNA中不存在編碼野生型ACVR2B的一些或全部細胞內區域的部分mRNA序列。

ACVR2B蛋白也稱為ActRIIB並且由512個胺基酸組成。ACVR2B的細胞學圖譜定位為3p22-p21.3。ACVR2B係由三個主要結構域：胞外配體結合結構域、跨膜結構域及胞內絲胺酸/蘇胺酸激酶結構域所組成。Ishikawa等人(Journl of Human Genetics,volume 43，第132-134頁(1998年))報導了ACVR2B基因包括11個外顯子，跨度約為30kb。NCBI揭露野生型人類ACVR2B的mRNA序列(後文稱為“野生型ACVR2B”)的參考序列：NM_001106.4及本文的SEQ ID NO：8。

SEQ ID NO：10顯示人類ACVR2B的代表性編碼序列(CDS)。ACVR2B CDS的核苷酸序列不限於SEQ ID NO：10所示者，並且包括具有SEQ ID NO：10長度之90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上或100%之變異序列，以及與SEQ ID NO：10具有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上或100%之序列一致性(sequence identity)。

SEQ ID NO：11顯示人類ACVR2B蛋白的代表性胺基酸序列。ACVR2B蛋白的胺基酸序列不限於示於SEQ ID NO：11所示者，並且包括具有SEQ ID NO：11長度之90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、 95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上或100%之變異序列，以及與SEQ ID NO：11具有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上或100%之序列一致性。

當將本發明的化合物提供給表現ACVR2B的細胞時，其造成細胞產生突變之ACVR2B mRNA，該ACVR2B mRNA中不存在野生型ACVR2B的一些或全部細胞內區域的部分mRNA序列。“不存在編碼野生型ACVR2B的一些或全部細胞內區域的部分mRNA序列的突變之ACVR2B mRNA”(後文稱為“本發明之突變之ACVR2B mRNA”)是指突變/變異之ACVR2B缺少在野生型ACVR2B mRNA中發現的部分mRNA序列，並且，其中該相對於野生型ACVR2B不存在的序列編碼野生型ACVR2B的一些或全部細胞內區域；或者是，突變之ACVR2B mRNA缺少在野生型ACVR2B mRNA中發現的編碼野生型ACVR2B的一些或全部胞內區域之部分序列。

人類ACVR2B的細胞內區域係由從N端側算起第159至512個胺基酸所組成。SEQ ID NO：9顯示編碼代表性野生型ACVR2B的一些或全部細胞內區域的mRNA序列。

本發明之突變之ACVR2B mRNA可能缺少SEQ ID NO：9的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、 109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、 416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、 724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、1004、1005、1006、1007、1008、1009、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022、1023、1024、1025、 1026、1027、1028、1029、1030、1031、1032、1033、1034、1035、1036、1037、1038、1039、1040、1041、1042、1043、1044、1045、1046、1047、1048、1049、1050、1051、1052、1053、1054、1055、1056、1057、1058、1059、1060、1061、1062、1063、1064或1065個核苷酸。

如本文的實施例部分所證明，在mRNA層次上破壞人類ACVR2B的細胞內區域有效地減少肌肉生長抑制素的訊號傳導。因此，ACVR2B的細胞內區域是破壞肌肉生長抑制素訊號的良好目標。

在一具體例中，本發明的化合物能夠造成目標細胞產生截斷ACVR2B蛋白，該蛋白缺少野生型ACVR2B蛋白的部分細胞內區域，例如，諸如具有SEQ ID NO：11的序列者。

如本文所用，“缺少野生型ACVR2B的部分細胞內區域的截斷ACVR2B蛋白”(以下可互換地稱為“ACVR2B蛋白的截斷形式”或“截斷ACVR2B蛋白質”)是指缺少所述野生型ACVR2B的細胞內區域中至少一個胺基酸之ACVR2B蛋白的任何截斷形式。相對於野生型ACVR2B不存在的ACVR2B的部分細胞內區域是指存在於野生型ACVR2B中但不存在於截斷之ACVR2B中的一個或多個胺基酸。例如，ACVR2B蛋白的截斷形式可能缺少野生型ACVR2B蛋白中發現的細胞內區域之1個胺基酸，或缺少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、 101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353或354個胺基酸，例如，諸如，SEQ ID NO：11所示者。截斷形式/變體不僅涵蓋具有從蛋白質的羧基或胺基末端去除一個或多個胺基酸的變體，而且還涵蓋缺乏ACVR2B蛋白中的一個或多個胺基酸之變體。

截斷形式中缺少或不存在的部分ACVR2B細胞內區域係由選自 由野生型ACVR2B外顯子5、6、7、8、9、10及11所組成群組中之至少一個外顯子的全部或部分編碼。

如本文所用，“能夠造成產生截斷形式之ACVR2B蛋白”是指如本文更充分地說明的，本發明的化合物允許添加了該化合物的細胞合成或產生截斷之ACVR2B。

由於ACVR2B的細胞外及跨膜區域仍然存在，本發明的ACVR2B的截斷形式仍然可與其天然配體結合，但就肌肉生長抑制素配體的結合而言，肌肉生長抑制素訊號的轉導效率可能低於野生型ACVR2B所具者。可以結合ACVR2B的天然配體的例子包括：活化素A、活化素B、GDF1、GDF3、NODAL、GDF11、肌肉生長抑制素(也稱為GDF8)、BMP2、BMP5、GDF5(也稱為BMP14)、GDF6、GDF7、BMP5、BMP6、BMP7及BMP8。配體的較佳實例是也稱為GDF8之肌肉生長抑制素。

如本文所用，訊號的“轉導”旨在表示藉由活化與訊號有關的下游因素或藉由使與訊號有關的下游因素失活而中繼訊號。

在一特定具體例中，本發明的ACVR2B蛋白的截斷形式能夠結合肌肉生長抑制素。

本發明的截斷ACVR2B蛋白在配體與ACVR2B結合後轉導訊號，但強度低於野生型ACVR2B。在一具體例中，截斷ACVR2B蛋白在與肌肉生長抑制素結合後，以比野生型ACVR2B小的強度轉導肌肉生長抑制素訊號。如本文所用，術語“強度小於野生型ACVR2B”是指與藉由將相同配體與野生型ACVR2B結合而轉導的訊號強度相比，訊號強度(訊號傳遞能力)降低1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、 17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。可藉由定量一種或多種基因的mRNA表現層次而間接確定訊號強度，該等基因的表現係被轉導的訊號觸發。例如，可以藉由測量SMAD7的mRNA表現層次而測定肌肉生長抑制素觸發的訊號傳導的訊號強度。在這種情況下，本發明的化合物能夠將肌肉生長抑制素訊號的強度降低至一定層次，該層次與野生型ACVR2B的肌肉生長抑制素訊號轉導所致者相比，SMAD7的mRNA表現層次降低1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。

在另一具體例中，由於框移突變，本發明的突變型ACVR2B mRNA可能缺少編碼野生型ACVR2B的一些或全部細胞內區域的部分序列。如 此之框移突變可以在其下游產生與野生型mRNA不同的閱讀框。因此，在這種情況下，本發明的突變之ACVR2B mRNA缺少編碼野生型ACVR2B的一些或全部細胞內區域的部分序列。

如此之框移也可能導致本發明的突變之ACVR2B mRNA經歷ACVR2B的無意義介導(nonsense-mediated)的mRNA衰變(NMD)。NMD是一種所有真核生物均具有的用於控制mRNA的質量之機制，並破壞異常mRNA，該異常mRNA係具有通常由突變所致之在原始終止密碼子上游(朝5’端)具有終止密碼子。當某些外顯子跳躍，特別是具有序列長度為非三個核苷酸的倍數(亦即，非3N，在此，N為給定整數(given integer))的外顯子時，三聯體的轉譯框發生位移，此可能在原始終止密碼子的上游產生新的終止密碼子。例如，當ACVR2B的外顯子8被跳躍時，外顯子7及第9直接相連。外顯子7及9的接合處的閱讀框“AG/GTAG”係由外顯子7的最3’端的2個核苷酸(亦即，“AG”)及外顯子9的最5’端的4個核苷酸所組成(亦即，“GTAG”)。AGG TAG編碼精胺酸(Arg)及終止密碼子，進而產生類無義突變之mRNA。如此之突變mRNA可被NMD破壞。另一方面，在野生型ACVR2B中，位於外顯子7及8的連接子處的閱讀框“AG/GGAU”係由外顯子7的最3’端的2個核苷酸(亦即，“AG”)，以及外顯子8的最5’端的4個核苷酸(亦即，“GGAU”)所組成。AGG GAU編碼精胺酸(Arg)及天冬胺酸(Asp)。

在由於移框而產生新的終止密碼子的情況下，產生了本發明的突變之ACVR2B mRNA，但是通常隨後經由NMD降解/衰減。

如本文所用，“目標細胞”是本發明的化合物被導入的細胞，並且可以是表現ACVR2B的任何細胞(例如，野生型ACVR2B)。目標細胞的實例包 括肌細胞、肌母細胞或肌管細胞。在一具體例中，目標細胞是動物細胞。在另一具體例中，目標細胞是哺乳動物細胞。在另一具體例中，目標細胞是人類細胞。

本發明的化合物是能夠造成ACVR2B之mRNA及/或蛋白質被製成為缺少野生型ACVR2B的部分細胞內區域的截斷形式的任何化合物。本發明合適的化合物例子包括：具有合適的核酸內切酶CRISPR-CAS9引導之RNA序列，係能夠切除/去除編碼其部分細胞內區域的部分ACVR2B基因；反義寡聚物，係用於跳躍至少一個編碼部分細胞內區域ACVR2B之外顯子；以及loxP系統化合物，係用於剔除(knocking out)編碼其部分細胞內區域之部分ACVR2B基因。

如發明所屬技術領域中的技術人員所理解的，也可以採用例如TALEN或鋅指(ZFN)之其他眾所周知的基因編輯技術來產生本發明的ACVR2B的截斷形式。

當使用CRISPR-CAS9抑制肌肉生長抑制素訊號時，將具有與編碼ACVR2B或部分ACVR2B的基因組DNA目標序列互補的序列的引導RNA(例如，野生型ACVR2B的細胞內區域)導入至目標細胞，從而辨識待切割的目標序列。導入至目標細胞的Cas9蛋白切割由基因組DNA及引導RNA所組成的雙鏈部分。通過修復切割位點的過程，由核苷酸的缺失及/或插入引起突變，從而導致全部或部分ACVR2B的剔除。基因組DNA的目標序列的實例包括外顯子的任何序列，例如，ACVR2B之外顯子1至11。合適地，基因組DNA的目標序列包括選自由ACVR2B之外顯子5、6、7、8、9、10及11所組成群組或由ACVR2B之外顯子5、6、7、8、9及10所組成群組之至少一個外顯子的任何序列。在一具體例中，基因組DNA的目標序列包括選自由ACVR2B的外顯子5、6、7、9及10所組成群組之至少一個外顯子的任何序列。在另一具體例中，基因組DNA 的目標序列包括選自由ACVR2B之外顯子5、6、9及10所組成群組之至少一個外顯子的任何序列。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列包括選自由ACVR2B之外顯子5、6及10所組成群組之至少一個外顯子的任何序列。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列包括選自由ACVR2B之外顯子5及6所組成群組之至少一個外顯子的任何序列。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列包括選自由ACVR2B之外顯子7、8及9所組成群組之至少一個外顯子的任何序列。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列包括選自由ACVR2B之外顯子7及8所組成群組之至少一個外顯子的任何序列。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列是ACVR2B的外顯子5。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列是ACVR2B的外顯子6。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列是ACVR2B的外顯子7。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列是ACVR2B的外顯子8。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列是ACVR2B的外顯子9。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列是ACVR2B的外顯子10。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列是ACVR2B的外顯子11。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列包括選自由ACVR2B之外顯子7、8、9及10所組成群組及選自由ACVR2B之外顯子5、6、7、8、9及10所組成群組之至少一個外顯子的任何序列。或者是，可藉由CRISPR-CAS9靶向內含子。例如，包夾外顯子8的內含子7及8可經切割。當切割位點被修復時，外顯子8可能不存在而產生外顯子8經刪除之突變mRNA。類似地，內含子4及5、內含子5及6、內含子6及7、內含子8及9、內含子9及10、或內含子10及11可經切割。因此，本發明的化合物可以是如上所述之用於CRISPR-CAS9之引導RNA、提供引導RNA作為其轉錄物的DNA(例如，表現質體)、CAS9(或類Cas9)蛋白、編碼並提 供CAS9(或類Cas9)蛋白質的DNA(例如，表現質體)或該等之組合。

當使用siRNA抑制肌肉生長抑制素訊號時，將旨在靶向ACVR2B mRNA序列的siRNA導入至目標細胞。當如此導入的siRNA的引導股與目標序列雜交時，目標細胞中的內源性RISC蛋白識別由引導股及目標mRNA鏈所組成的雙鏈部分，並切割mRNA的目標序列。如此一來，ACVR2B蛋白層次降低。因此，在另一具體例中，本發明的化合物可以是siRNA或提供siRNA作為其轉錄物的DNA(例如，表現質體)。

反義寡聚物

突變之ACVR2B mRNA亦可以藉由使細胞與反義寡核苷酸(AON)接觸而在細胞內產生，該反義寡核苷酸(AON)能夠誘發編碼蛋白質的細胞內區域的一個以上ACVR2B外顯子的外顯子跳躍。

在一具體例中，本發明的化合物是能夠誘發用於編碼ACVR2B的部分細胞內區域的外顯子跳躍的反義寡聚物(後文稱為“本發明的反義寡聚物”或“反義寡聚物”)。合適地，欲跳躍的外顯子係選自由ACVR2B的外顯子5、6、7、8、9、10及11所組成群組或由ACVR2B的外顯子5、6、7、8、9及10所組成群組之一者。在一具體例中，欲跳躍的外顯子係選自由外顯子5、6、7、9及10所組成群組之一個。在另一具體例中，欲跳躍的外顯子是外顯子5。在另一具體例中，欲跳躍的外顯子是外顯子6。在又一實施例中，欲跳躍的外顯子是外顯子7。在又一實施例中，欲跳躍的外顯子是外顯子8。在又一實施例中，欲跳躍的外顯子是外顯子9。在又一實施例中，欲跳躍的外顯子是外顯子10。在又一實施例中，欲跳躍的外顯子是外顯子11。在另一實施例中，欲跳躍的外顯子係選自由ACVR2B的外顯子7、8、9及10所組成群組、或由ACVR2B的外顯子5、 6、7、8、9及10所組成群組之一者。

外顯子5、6、7、8、9、10及11的代表性核苷酸序列分別顯示為SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6及7。外顯子5、6、7、8、9、10及11的核苷酸序列不限於SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6及7所示的序列，並且包含分別具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6及7之長度的90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上或100%之變異序列，以及與SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6及7分別具有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上或100%之序列一致性。

術語“能夠誘發用於編碼ACVR2B的部分細胞內區域的外顯子跳躍”是指在本發明的反義寡聚物與其外顯子的目標位點結合之後，剪接該外顯子，該外顯子係編碼ACVR2B基因(例如，人類ACVR2B基因)轉錄物(例如，前驅mRNA(pre-mRNA))的細胞內區域之一部分。例如，若本發明的反義寡聚物與ACVR2B前驅mRNA的部分外顯子6結合，則對應於外顯子6下游外顯子的5’端核苷酸序列(亦即，外顯子7)，係在對應於外顯子6上游外顯子的3’端的核苷酸序列的3’側(亦即，外顯子5)被剪接。這是本發明的反義寡聚物結合後由正常剪接機制的破壞所導致者。然後，由mRNA編碼的ACVR2B多肽包括與外顯子7接合的外顯子5編碼的胺基酸，並且截短的ACVR2B變體中省略(不存在)由外顯子6編碼的胺基酸。

在本文中，術語“結合”是指當本發明的反義寡聚物與ACVR2B基因(例如，人類ACVR2B基因)的轉錄物的套數接觸(例如，與之混合)時，互補序列在生理條件下雜交以形成雙股核酸。術語“在生理條件下”是指在pH、鹽組成 及溫度方面模仿生體內環境(in vivo)的條件。合適的條件可以是如下溫度、pH及鹽濃度的任何組合：溫度：25℃至40℃、35℃至38℃、36℃至38℃或37℃；pH：pH 5至8、pH 6至8、pH 7至8或pH 7.4；以及鹽濃度：氯化鈉濃度為100至200mM、130至170mM、140至160mM或150mM。

如本文所用，相對於核苷酸序列的“序列一致性”及“同源性”是指在比對序列，必要時，允許缺口後，候選目標序列中與對象主體之核苷酸序列中的核苷酸殘基相同的核苷酸殘基的百分比，以達成最大的序列一致性百分比，並且不考慮將任何保守性取代作為序列一致性的一部分。為了確定核苷酸序列一致性百分比的目的，比對係可以用發明所屬領域中具有通常知識者所知的各種方式而達成，例如，使用公開可用的電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ClustalW2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)軟體。發明所屬技術領域中的技術人員可以確定用於測量比對的合適參數，包括在所比較的序列的全長上達成最大比對所需的任何算法。例如，可以使用Karlin及Altschul之BLAST(基本局部比對搜索工具)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268,1990；Proc Natl Acad Sci USA 90：5873、1993)的演算法測定兩個或多個核苷酸序列的序列一致性。根據BLAST的演算法，已開發出稱為BLASTN及BLASTX的程式(Altschul SF等人，J Mol Biol 215：403,1990)。若將BLASTN用於核苷酸序列分析，則可以將參數設置為例如分數=100及字長=12。如果使用BLAST及Gapped BLAST程序，則可以使用各程式中的默認參數。

本發明的反義寡聚物是寡核苷酸或經修飾之寡核苷酸。如本文所用，“寡核苷酸”是具有如下述定義的連接之核苷酸的序列之長度，並且，可包括或不包括修飾。經修飾之寡核苷酸詳述於他處。

本發明的反義寡聚物可以具有10至70個核苷酸的長度，諸如：從其5’端至3’端之11至70、12至70、13至70、14至70、15至70、16至70、17至70、18至70、19至70、20至70、21至70、22至70、23至70、24至70、25至70、10至65、11至65、12至65、13至65、14至65、15至65、16至65、17至65、18至65、19至65、20至65、21至65、22至65、23至65、24至65、25至65、10至60、11至60、12至60、13至60、14至60、15至60、16至60、17至60、18至60、19至60、20至60、21至60、22至60、23至60，24至60、25至60、10至55、11至55、12至55、13至55、14至55、15至55、16至55、17至55、18至55、19至55、20至55、21至55、22至55、23至55、24至55、25至55、10至50、11至50、12至50、13至50、14至50、15至50、16至50，17至50、18至50、19至50、20至50、21至50、22至50、23至50、24至50、25至50、10至45、11至45、12至45、13至45、14至45、15至45、16至45、17至45、18至45、19至45、20至45、21至45、22至45、23至45、24至45、25至45、10至40、11至40、12至40、13至40、14至40、15至40、16至40、17至40、18至40、19至40、20至40、21至40、22至40、23至40、24至40、25至40、10至38、11至38、12至38、13至38、14至38、15至38、16至38、17至38、18至38、19至38、20至38、21至38、22至38、23至38、24至38、25至38、10至36、11至36、12至36、13至36、14至36、15至36、16至36、17至36、18至36、19至36、20至36、21至36、22至36、23至36、24至36、25至36、10至35、11至35、12至35、13至35、14至35、15至35、16至35、17至35、18至35、19至35、20至35、21至35、22至35、23至35、24至35、25至35、10至34、11至34、12至34、13 至34、14至34、15至34、16至34、17至34、18至34、19至34、20至34、21至34、22至34、23至34、24至34、25至34、10至33、11至33、12至33、13至33、14至33、15至33、16至33、17至33、18至33、19至33、20至33、21至33、22至33、23至33、24至33、25至33、10至32、11至32、12至32、13至32、14至32、15至32、16至32、17至32、18至32、19至32、20至32、21至32、22至32、23至32、24至32、25至32、10至30、11至30、12至30、13至30、14至30、15至30、16至30、17至30、18至30、19至30、20至30、21至30、22至30、23至30、24至30、25至30、10至29、11至29、12至29、13至29、14至29、15至29、16至29、17至29、18至29、19至29、20至29、21至29、22至29、23至29、24至29、25至29、10至28、11至28、12至28、13至28、14至28、15至28、16至28、17至28、18至28、19至28、20至28、21至28、22至28、23至28、24至28、25至28、10至27、11至27、12至27、13至27、14至27、15至27、16至27、17至27、18至27、19至27、20至27、21至27、22至27、23至27、24至27、25至27、10至26、11至26、12至26、13至26、14至26、15至26、16至26、17至26、18至26、19至26、20至26、21至26、22至26、23至26、24至26、25至26、10至25、11至25、12至25、13至25、14至25、15至25、16至25、17至25、18至25、19至25、20至25、21至25、22至25、23至25、24至25、10至24、11至24、12至24、13至24、14至24、15至24、16至24、17至24、18至24、19至24、20至24、21至24、22至24、23至24、10至23、11至23、12至23、13至23、14至23、15至23、16至23、17至23、18至23、19至23、20至23、21至23、22至23、10至22、11至22、12至22、13至22、14至22、15至22、16至22、 17至22、18至22、19至22、20至22、21至22、10至21、11至21、12至21、13至21、14至21、15至21、16至21、17至21、18至21、19至21、20至21、10至20、11至20、12至20、13至20、14至20、15至20、16至20、17至20、18至20、19至20、10至19、11至19、12至19、13至19、14至19、15至19、16至19、17至19、18至19、10至18、11至18、12至18、13至18、14至18、15至18，16至18、17至18、10至17、11至17、12至17、13至17、14至17、15至17、16至17、10至16、11至16、12至16、13至16、14至16、15至16、10至15、11至15、12至15、13至15及14至15個核苷酸(後文稱為“本發明的反義寡聚物的例示性長度範圍”)。本發明的反義寡聚物可具有從其5’端至3’端之10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70個核苷酸(後文稱為“本發明反義寡聚物的例示性長度”)。本發明的寡聚物的長度特別合適的範圍包括：從其5’端至3’端的15至45、17至35、15至24、15至26及20至40個核苷酸。

本發明的反義寡聚物包括與選自由ACVR2B之外顯子5、6、7、8、9、10所組成群組或由ACVR2B之外顯子5、6、7、8、9及10所組成群組之外顯子的部分核苷酸序列互補的核苷酸序列。本文中之選自由ACVR2B之外顯子5、6、7、8、9、10所組成群組或由ACVR2B之外顯子5、6、7、8、9及10所組成群組之外顯子的部分核苷酸序列也稱為“目標序列”。外顯子5、6、7、8、9、10及11的代表性核苷酸序列分別顯示為彼等SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6及7所示者。外顯子5、6、7、8、9、10及11的核苷酸序列不限於SEQ ID NO： 1、2、3、4、5、6及7所示的序列，包含與SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6及7中任一者揭露的序列具有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上或100%之序列一致性之變異序列。因此，根據本發明的特定具體例，本發明的寡聚物包括與SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6及7中任一者揭露的序列具有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上或100%之序列一致性之序列互補之核苷酸序列。

目標序列可以具有任何長度，只要其與本發明的反義寡聚物的長度相同或比其更短即可。例如，目標序列的長度可以是10至70個核苷酸，諸如：從5’端至3’端之11至70、12至70、13至70、14至70、15至70、16至70、17至70、18至70、19至70、20至70、21至70、22至70、23至70、24至70、25至70、10至65、11至65、12至65、13至65、14至65、15至65、16至65、17至65、18至65、19至65、20至65、21至65、22至65、23至65、24至65、25至65、10至60、11至60、12至60、13至60、14至60、15至60、16至60、17至60、18至60、19至60、20至60、21至60、22至60、23至60、24至60、25至60、10至55、11至55、12至55、13至55、14至55、15至55、16至55、17至55、18至55、19至55、20至55、21至55、22至55、23至55、24至55、25至55、10至50、11至50、12至50、13至50、14至50、15至50、16至50、17至50、18至50、19至50、20至50、21至50、22至50、23至50、24至50、25至50、10至45、11至45、12至45、13至45、14至45、15至45、16至45、17至45、18至45、19至45、20至45、21至45、22至45、23至45、24至45、25至45、10至40、11至40、12至40、13至40、14至40、15至40、 16至40、17至40、18至40、19至40、20至40、21至40、22至40、23至40、24至40、25至40、10至38、11至38、12至38、13至38、14至38、15至38、16至38、17至38、18至38、19至38、20至38、21至38、22至38、23至38、24至38、25至38、10至36、11至36、12至36、13至36、14至36、15至36、16至36、17至36、18至36、19至36、20至36、21至36、22至36、23至36、24至36、25至36、10至35、11至35、12至35、13至35、14至35、15至35、16至35、17至35、18至35、19至35、20至35、21至35、22至35、23至35、24至35、25至35、10至34、11至34、12至34、13至34、14至34、15至34、16至34、17至34、18至34、19至34、20至34、21至34、22至34、23至34、24至34、25至34、10至33、11至33、12至33、13至33、14至33、15至33、16至33、17至33、18至33、19至33、20至33、21至33、22至33、23至33、24至33、25至33、10至32、11至32、12至32、13至32、14至32、15至32、16至32、17至32、18至32、19至32、20至32、21至32、22至32、23至32、24至32、25至32、10至30、11至30、12至30、13至30、14至30、15至30、16至30、17至30、18至30、19至30、20至30、21至30、22至30、23至30、24至30、25至30、10至29、11至29、12至29、13至29、14至29、15至29、16至29、17至29、18至29、19至29、20至29、21至29、22至29、23至29、24至29、25至29、10至28、11至28、12至28、13至28、14至28、15至28、16至28、17至28、18至28、19至28、20至28、21至28、22至28、23至28、24至28、25至28、10至27、11至27、12至27、13至27、14至27、15至27、16至27、17至27、18至27、19至27、20至27、21至27、22至27、23至27、24至27、25至27、10至26、11至26、12至26、13至26、 14至26、15至26、16至26、17至26、18至26、19至26、20至26、21至26、22至26、23至26、24至26、25至26、10至25、11至25、12至25、13至25、14至25、15至25、16至25、17至25、18至25、19至25、20至25、21至25、22至25、23至25、24至25、10至24、11至24，12至24、13至24、14至24、15至24、16至24、17至24、18至24、19至24、20至24、21至24、22至24、23至24、10至23、11至23、12至23、13至23、14至23、15至23、16至23、17至23、18至23、19至23、20至23、21至23、22至23、10至22、11至22、12至22、13至22、14至22、15至22、16至22、17至22、18至22、19至22、20至22、21至22、10至21、11至21、12至21、13至21、14至21、15至21、16至21、17至21、18至21、19至21、20至21、10至20、11至20、12至20、13至20、14至20、15至20、16至20、17至20、18至20、19至20、10至19、11至19、12至19、13至19、14至19、15至19、16至19、17至19、18至19、10至18、11至18、12至18、13至18、14至18、15至18、16至18、17至18、10至17、11至17、12至17、13至17、14至17、15至17、16至17、10至16、11至16、12至16、13至16、14至16、10至15、11至15、12至15、13至15及14至15個核苷酸。目標序列的長度可以為從其5’端至3’端的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70個核苷酸。

與目標序列互補的核苷酸序列(後文稱為“雜交序列”)應與目標序列的長度相同。因此，雜交序列的例示性長度包含：從5’端至3’端之10至 70個核苷酸，諸如：11至70、12至70、13至70、14至70、15至70、16至70、17至70、18至70、19至70、20至70、21至70、22至70、23至70、24至70、25至70、10至65、11至65、12至65、13至65、14至65、15至65、16至65、17至65、18至65、19至65、20至65、21至65、22至65、23至65、24至65、25至65、10至60、11至60、12至60、13至60、14至60、15至60、16至60、17至60、18至60、19至60、20至60、21至60、22至60、23至60、24至60、25至60、10至55、11至55、12至55、13至55、14至55、15至55、16至55、17至55、18至55、19至55、20至55、21至55、22至55、23至55、24至55、25至55、10至50、11至50、12至50、13至50、14至50、15至50、16至50、17至50、18至50、19至50、20至50、21至50、22至50、23至50、24至50、25至50、10至45、11至45、12至45、13至45、14至45、15至45、16至45、17至45、18至45、19至45、20至45、21至45、22至45、23至45、24至45、25至45、10至40、11至40、12至40、13至40、14至40、15至40、16至40、17至40、18至40、19至40、20至40、21至40、22至40、23至40、24至40、25至40、10至38、11至38、12至38、13至38、14至38、15至38、16至38、17至38、18至38、19至38、20至38、21至38、22至38、23至38、24至38、25至38、10至36、11至36、12至36、13至36、14至36、15至36、16至36、17至36、18至36、19至36、20至36、21至36、22至36、23至36、24至36、25至36、10至35、11至35、12至35、13至35、14至35、15至35、16至35、17至35、18至35、19至35、20至35、21至35、22至35、23至35、24至35、25至35、10至34、11至34、12至34、13至34、14至34、15至34、16至34、17至34、18至34、19至34、20至34、21至34、22至34、23至34、 24至34、25至34、10至33、11至33、12至33、13至33、14至33、15至33、16至33、17至33、18至33、19至33、20至33、21至33、22至33、23至33、24至33、25至33、10至32、11至32、12至32、13至32、14至32、15至32、16至32、17至32、18至32、19至32、20至32、21至32、22至32、23至32、24至32、25至32、10至30、11至30、12至30、13至30、14至30、15至30、16至30、17至30、18至30、19至30、20至30、21至30、22至30、23至30、24至30、25至30、10至29、11至29、12至29、13至29、14至29、15至29、16至29、17至29、18至29、19至29、20至29、21至29、22至29、23至29、24至29、25至29、10至28、11至28、12至28、13至28、14至28、15至28、16至28、17至28、18至28、19至28、20至28、21至28、22至28、23至28、24至28、25至28、10至27、11至27、12至27、13至27、14至27、15至27、16至27、17至27、18至27、19至27、20至27、21至27、22至27、23至27、24至27、25至27、10至26、11至26、12至26、13至26、14至26、15至26、16至26、17至26、18至26、19至26、20至26、21至26、22至26、23至26、24至26、25至26、10至25、11至25、12至25、13至25、14至25、15至25、16至25、17至25、18至25、19至25、20至25、21至25、22至25、23至25、24至25、10至24、11至24、12至24、13至24、14至24、15至24、16至24、17至24、18至24、19至24、20至24、21至24、22至24、23至24、10至23、11至23、12至23、13至23、14至23、15至23、16至23、17至23、18至23、19至23、20至23、21至23、22至23、10至22、11至22、12至22、13至22、14至22、15至22、16至22、17至22、18至22、19至22、20至22、21至22、10至21、11至21、12至21、13至21、14至21、15至21、16 至21、17至21、18至21、19至21、20至21、10至20、11至20、12至20、13至20、14至20、15至20、16至20、17至20、18至20、19至20、10至19、11至19、12至19、13至19、14至19、15至19、16至19、17至19、18至19、10至18、11至18、12至18、13至18、14至18、15至18、16至18、17至18、10至17、11至17、12至17、13至17、14至17、15至17、16至17、10至16、11至16、12至16、13至16、14至16、15至16、10至15、11至15、12至15、13至15及14至15個核苷酸。雜交序列的長度可以為從其5’端至3’端之10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70個核苷酸。

合適的雜交序列的實例包括SEQ ID NO：12至36及43至111中的任一者。本發明的反義寡聚物可包含選自SEQ ID NO：12至36及43至111中的任何一個核苷酸序列(後文稱為“合適的雜交序列”或“多個合適的雜交序列”)。

本發明的反義寡聚物可不必僅包括雜交序列。只要本發明的反義寡聚物對選自由ACVR2B的外顯子5、6、7、8、9、10及11所組成群組或由ACVR2B的外顯子5、6、7、8、9及10所組成群組中的至少一個外顯子保持跳躍活性，本發明的反義寡聚物可包括上述合適的雜交序列的部分序列。在一些具體例中，本發明的反義寡聚物可以包括SEQ ID NO：12至36及43至111所揭露之序列中之任一者的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24個連續核苷酸。在另一具體例中，本發明的反義寡聚物可包括SEQ ID NO：12至36及43至111所揭露之序列中之任一者的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、21、22、23、24個連續核苷酸。

本發明的反義寡聚物可不必僅包括雜交序列。只要本發明的反義寡聚物對選自由ACVR2B的外顯子5、6、7、8、9、10及11所組成群組或由ACVR2B的外顯子5、6、7、8、9及10所組成群組中的至少一個外顯子保持跳躍活性，本發明的反義寡聚物可包括不與目標區域互補的其他序列(鹼基)。

本發明的反義寡聚體靶向的序列的實例包含任何外顯子序列，例如，ACVR2B前驅mRNA的外顯子1至11。合適地，目標序列包含選自由ACVR2B前驅mRNA之外顯子5、6、7、8、9、10及11所組成群組或由ACVR2B前驅mRNA之外顯子5、6、7、8、9及10所組成群組之至少一個外顯子之任何序列。在另一具體例中，ACVR2B前驅mRNA的目標序列包含選自外顯子5、6、7、9及10的至少一個外顯子的任何序列。在另一具體例中，ACVR2B前驅mRNA的目標序列包含選自由外顯子5、6、9及10所組成群組之至少一個外顯子之任何序列。在另一具體例中，ACVR2B前驅mRNA的目標序列包含選自由外顯子5、6及10所組成群組之至少一個外顯子之任何序列。在另一具體例中，ACVR2B前驅mRNA的目標序列包含選自由外顯子5及6所組成群組之至少一個外顯子之任何序列。在另一具體例中，ACVR2B前驅mRNA的目標序列包含選自由外顯子7、8及9所組成群組之至少一個外顯子之任何序列。在另一具體例中，ACVR2B前驅mRNA的目標序列包含選自由外顯子7及8所組成群組之至少一個外顯子之任何序列。在另一實施例中，ACVR2B前驅mRNA的目標序列是外顯子5。在另一具體例中，ACVR2B前驅mRNA的目標序列是外顯子6。在另一具體例中，ACVR2B前驅mRNA的目標序列是外顯子7。在另一具體例 中，ACVR2B前驅mRNA的目標序列是外顯子8。在另一具體例中，ACVR2B前驅mRNA的目標序列是外顯子9。在另一具體例中，ACVR2B前驅mRNA的目標序列是外顯子10。在另一具體例中，前驅mRNA是外顯子11。在另一具體例中，ACVR2B前驅mRNA的目標序列包括選自由外顯子7、8、9及10所組成群組或由外顯子5、6、7、8、9及10所組成群組之至少一個外顯子之任何序列。

在一特定的實施態樣中，本發明的寡聚物具有與該寡聚物相同的長度或比該寡聚物短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸的雜交序列。例如，寡聚物的長度可能為24個核苷酸，並且具有相同長度的雜交序列，亦即，寡聚物中的所有24個核苷酸都與目標區域互補；或者其雜交序列的長度可能為20個核苷酸(比寡聚物長度短4個核苷酸)，並且，該寡聚物還具有不與目標區域互補的4個核苷酸(因此，不屬於雜交序列的一部分)。此寡聚物可以例如在雜交序列的任一側皆具有兩個不與目標區域互補的核苷酸、在一側具有3個核苷酸而在另一側具有一個核苷酸、或在一端具有4個核苷酸。

除了雜交序列或部分雜交序列外，本發明的反義寡聚物可包括可能助於或可能有助於與目標序列雜交的額外序列。此額外序列可與雜交序列的5’端、3’端或兩端、或部分雜交序列連接。在這種情況下，本發明的反義寡聚物的總長度落在本發明的反義寡聚物的例示性長度範圍內或反義寡核苷酸的例示性長度內。

在另一具體例中，本發明的反義寡聚物可以由SEQ ID NO：12至36及43至111中任一者所示的核苷酸序列組成。在一些具體例中，本發明的反義寡聚物可以由SEQ ID NO：12至36及43至111中任一者之序列之5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24個連續核苷酸組成。

在另一具體例中，本發明提供一種接合物，其中功能性肽，例如，細胞穿透肽(CPP)與本發明的反義寡聚物結合。在本發明中可以使用公知的功能性肽或可商購的功能性肽。可用於本發明的功能性肽包括，例如，WO2008/036127中揭露的富含精胺酸的肽；WO2009/005793中揭露的靶向器官的肽，例如RXR、RBR等；或者是，WO2012/150960中揭露的包含胺基酸次單元的肽。細胞穿透肽(CPP)表示10至30個胺基酸左右的短肽序列，可以穿過哺乳動物細胞的質膜，因此可改善細胞藥物的遞送(例如，參見Hum Mol Genet.2011 Aug 15；20(16)：3151-3160；Pharmacology & Therapeutics 154(2015)78-86)。在本發明中可以使用公知的CPP或可商購的CPP。可以在本發明中使用的CPP例如包括；Pharmacology & Therapeutics 154(2015)78-86第80頁表1中列出的CPP，例如TAT(48-60)、滲透肽(penetratin)、聚精胺酸、Oct4、WT1-pTj、DPV3、Transportan、MAP、VP22、Rep1、KW、KFGF、FGF12、整聯蛋白(Intefrin)β3肽、C105Y、TP2；JP-A-2017-500856(WO2015/089487)第[0085]段表1中列出的CPP，例如DPV10/6、DPV15b、YM-3、Tat、LR11、C45D18、Lyp-1、Lyp-2、BMV GAG、hLF1-22、C45D18、LR20等。CPP可從例如Funakoshi股份有限公司商購獲得。在本發明中可以使用可商購獲得的CPP，諸如TAT(Funakoshi股份有限公司)、穿透素(Funakoshi股份有限公司)等，或公知的CPP，諸如R8等。可用於本發明的較佳CPP例如包含：hLIMK、TAT、穿透素、R8等(請參閱WO2016/187425、WO2018/118662、WO2018/118599、WO2018/118627、EBioMedicine 45(2019)630-645等)。CPP可直接與本發明的反義寡聚物鍵結，或可通過可將CPP結合至反義寡聚物的連接 子鍵結。本發明中可以使用公知的連接子。此連接子包括例如彼等JP-A-2017-500856(WO2015/089487)、WO2015/089487、WO2009/073809、WO2013/075035、WO2015/105083、WO2014/179620、WO2015/006740、WO2017/010575中描述的連接子等。可用於本發明的較佳連接子包含例如4-馬來醯亞胺基丁酸、可經由二硫鍵附接本發明的功能性肽或反義寡聚物的連接子等。本發明的接合物可以通過發明所屬領域之技術人員公知的方法製備。

跳躍效率：

特定的寡聚物是否可以導致ACVR2B基因中的一個或多個外顯子跳躍，係可以藉由將本發明的反義寡聚物導入表現ACVR2B基因的細胞(例如，人類橫紋肌肉瘤細胞)中，利用RT-PCR擴增來自ACVR2B表現細胞的總RNA中之編碼ACVR2B細胞內區域的ACVR2B mRNA區域或對PCR擴增產物進行序列分析，而評估或確認。

可如下述般確定跳躍效率：測量RT-PCR反應溶液中PCR擴增產物中具有外顯子跳躍的多核苷酸層次“A”(例如，截斷之ACVR2B的mRNA量)及PCR擴增產物中不具有外顯子跳躍的多核苷酸層次“B”(例如，全長ACVR2B的mRNA量)，然後根據下述等式並且基於改等“A”及“B”的實測值進行計算。

跳躍效率(%)={A/(A+B)}×100

在一較佳的具體例中，本發明的反義寡聚物造成具有10%以上、15%以上、20%以上、25%以上，30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、62.5%以上，65%以上、67.5%以上、70%以上、72.5%以上、75%以上、77.5%以上、80%以上、82.5%以上、85%以上、87.5%以上、90%以上、92.5%以上、95%以上、97.5%以上、98%以上或99%以上效率之跳躍。

一旦辨識到有效的反義寡聚物，技術人員可以通過設計具有與有效的反義寡聚物的序列重疊的序列的各種反義寡聚物，並使用本文所述之方法對其進行測試，以尋求鑑定更佳的序列。

寡核苷酸、嗎啉代寡聚物或肽核酸寡聚物(peptide nucleic acid oligomer)：

本發明的反義寡聚物可以是寡核苷酸、嗎啉代寡聚物或肽核酸(PNA)寡聚物，該等各自在本發明的反義寡聚物的例示性長度範圍內或為本發明的反義寡聚物的例示性長度範圍。

上述寡核苷酸(後文稱為“本發明的寡核苷酸”)是本發明的反義寡聚物，其組成單元是核苷酸，並且如此之核苷酸可以是核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸或經修飾之核苷酸中的任一者。反義寡核苷酸通常是單股。

經修飾之核苷酸是指其核鹼基、糖部分及磷酸酯鍵部分全部或部分經修飾之核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸。

在本發明中，核鹼基的實例包括：腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、脲嘧啶或該等經修飾之鹼基。如此之經修飾之鹼基的實例為：假脲嘧啶、3-甲基脲嘧啶、二氫脲嘧啶、5-烷基胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶)、5-烷基脲嘧啶(例如，5-乙基脲嘧啶)、5-鹵素脲嘧啶(例如，5-溴脲嘧啶)、6-氮雜嘧啶、6-烷基嘧啶(例如，6-甲基脲嘧啶)、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、4-乙醯基胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)脲嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫脲嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基脲嘧啶、1-甲基腺嘌呤、1-甲基次黃嘌呤、2,2-二甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲氧基胺 基甲基-2-硫脲嘧啶、5-甲基胺基甲基脲嘧啶、5-甲基羰基甲基脲嘧啶、5-甲基氧基脲嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-甲基硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、脲嘧啶-5-氧基乙酸、2-硫胞嘧啶、嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、異鳥嘌呤、吲哚、咪唑、黃嘌呤等，但不限於此。

糖部分的修飾可以藉由在核糖的2’-位置修飾及在糖的其他位置修飾而舉說明。核糖2’-位置修飾之實例包括旨在用OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br或I取代核糖2’-位置的-OH基之修飾，其中R表示烷基或芳基，R表示伸烷基。

在糖的其他位置修飾之實例包括在核糖或去氧核糖的4'-位置用S取代O、以及在糖的2’-及4'-位置之間橋接，如LNA(鎖定核酸(locked nucleic acid))或ENA(2’-O,4'-C-伸乙基橋接的核酸)，但不限於此。

磷酸酯鍵部分的修飾可以舉例為旨在用硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基磷酸酯鍵、胺基磷酸酯鍵或硼磷酸酯鍵取代磷酸二酯鍵的修飾(Enya等人：Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008,18,9154-9160)(參見，例如，JP WO2006/129594及JP WO2006/038608)。

在本發明中，烷基較佳為含有1至6個碳原子的直鏈或支鏈烷基。更具體地，實例包括：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、第三戊基、正己基及異己基。此烷基可以經包含鹵素、烷氧基、氰基、硝基等1至3個取代基取代。

在本發明中，環烷基較佳為含有5至12個碳原子的環烷基。更具體地，實例包括：環戊基、環己基、環庚基、環辛基、環癸基及環十二烷基。

在本發明中，鹵素包含氟、氯、溴及碘。

烷氧基可以是含有1至6個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基，例如：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基、正戊氧基、異戊氧基、正戊氧基、己氧基、異己氧基等。特佳的是含有1至3個碳原子的烷氧基。

在本發明中，芳基較佳為含有6至10個碳原子的芳基。更具體地，實例包含苯基、α-萘基及β-萘基。特佳的是苯基。此芳基可以經包含烷基、鹵素、烷氧基、氰基、硝基等1至3個取代基取代。

在本發明中，伸烷基較佳為含有1至6個碳原子的直鏈或支鏈伸烷基。更具體地，實例包括：亞甲基、伸乙基、三亞甲基、四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、2-(乙基)三亞甲基及1-(甲基)四亞甲基。

在本發明中，醯基可以是直鏈或支鏈的烷醯基或芳醯基。此烷醯基的實例包括：甲醯基、乙醯基、2-甲基乙醯基、2,2-二甲基乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、2,2-二甲基丙醯基、己醯基等。芳醯基的實例包含苯甲醯基、甲苯醯基及萘甲醯基。此芳醯基在任何可取代的位置可以經取代，並且可以經烷基取代。

本發明的寡核苷酸較佳為根據本發明的反義寡聚物，其組成單元係由如下通式表示的基團，其中核糖的2’-位置的-OH基團經甲氧基取代，並且磷酸酯鍵部分係硫代磷酸酯鍵：

(其中，鹼基表示核鹼基)。

本發明的寡核苷酸可以容易地用各種自動合成器(例如，FOCUS(Aapptec)、AKTA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare))合成，或者可以將其合成委託給第三方(例如，Promega、Takara或Japan Bio Services)等。

本發明的嗎啉代寡聚物係根據本發明的反義寡聚物，其組成單元是由如下通式表示的基團所示：

(其中，鹼基與上述定義相同，W表示由下列任一式表示的基團：

(其中，X表示-CH₂R¹，-O-CH₂R¹，-S-CH₂R¹，-NR²R³或F；

R¹表示H或烷基；

R²及R³可以相同或不同，分別表示H、烷基、環烷基或芳基；

Y₁表示O、S、CH₂或NR¹；

Y₂表示O、S或NR¹；以及

Z表示O或S))。

嗎啉代寡聚物較佳是其組成單元係由下式表示的基團的寡聚物(亦即，磷醯二胺嗎啉代寡聚物(後文稱為“PMO”))：

(其中，鹼基、R²及R³與上述定義相同)。

例如，嗎啉代寡聚物可以根據WO1991/009033或WO2009/064471製備。特別地，PMO可以根據WO2009/064471中描述的程序來製備，或者可以根據如下所示的程序來製備。

[PMO製備之程序]

作為PMO的一個具體例，可以藉由實例之方式給出由如下通式(I)表示的化合物(後文稱為PMO(I))：

[其中，各鹼基、R²及R³與上述定義相同；n為1至99範圍內的任何整數，較佳為13至29、14至28或15至27、16至26、17至25的範圍內的任何整數]。

PMO(I)可以根據已知的方法製備，例如，藉由進行如下述步驟所示的操作。

下述步驟中使用的化合物及試劑沒有任何限制，只要它們通常用於PMO製備即可。此外，下述所有步驟可以藉由液相法或固相法(根據使用說明書或使用市售的固相自動合成器)來完成。當藉由固相方法製備PMO時，就操作簡單及精確合成而言，期望使用自動合成器。

(1)步驟A：

該步驟是用酸處理下述通式(II)表示的化合物(後文稱為化合物(II))以製備如下通式(III)表示的化合物(後文稱為化合物(III))的步驟：

[其中，n、R²及R³與上述定義相同；

各B^P獨立地表示可經保護的核鹼基；

T表示三苯甲基、單甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基；以及

L表示氫、醯基或下述通式(IV)表示的基團(後文稱為基團(IV))]：

B^P可能的“核鹼基”可以用與針對鹼基所列出的相同“核鹼基”來舉例說明，前提是可以保護這些BP核鹼基中的胺基或羥基。

胺基的保護基沒有任何限制，只要它們用作核酸的保護基即可。更具體地，實例包括：苯甲醯基、4-甲氧基苯甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、苯乙醯基、苯氧基乙醯基、4-第三丁基苯氧基乙醯基、4-異丙基苯氧基乙醯基及(二甲基胺基)亞甲基。羥基的保護基例如包括：2-氰基乙基、4-硝基苯乙基、苯基磺醯基乙基、甲基磺醯基乙基、三甲基甲矽基乙基、可在任何可取代位置經1至5個吸電子基團取代之苯基、二苯基胺甲醯基、二甲基胺甲醯基、二乙基胺甲醯基、甲基苯基胺甲醯基、1-吡咯啶基胺甲醯基、嗎啉基胺甲醯基、4-(第三丁基羧基)苄基、4-[(二甲基胺基)羧基]苄基及4-(苯基羧基)苄基(參見，例如，WO2009/064471)。

“固體載體”沒有任何限制，只要它是可用於核酸的固相反應的載體即可，但是期望使用例如(i)微溶於水可用於合成嗎啉基核酸衍生物的試劑(例如，二氯甲烷、乙腈、四唑、N-甲基咪唑、吡啶、乙酸酐、二甲基吡啶、三氟乙酸)，(ii)對可用於合成嗎啉基核酸衍生物之試劑呈化學安定，(iii)可以進行化學修飾，(iv)可以裝載所需的嗎啉基核酸衍生物，(v)具有足以承受加工過程中高壓的強度，以及(vi)具有一定範圍的粒徑及分布。更具體地，實例包含溶脹聚苯乙烯(例如，與1%二乙烯基苯交聯的胺基甲基聚苯乙烯樹脂(200至400目)(2.4至3.0 mmol/g)(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.,Japan)、胺基甲基化聚苯乙烯樹脂HCl[二乙烯苯1%，100至200目](Peptide Institute,Inc.,Japan)、非溶脹性聚苯乙烯(例如，Primer Support(GE Healthcare))、PEG鏈狀聚苯乙烯(例如，NH₂-PEG樹脂(Watanabe Chemical Industries Ltd.,Japan)、TentaGel樹脂)、可控孔玻璃(CPG)(例如，CPG Inc.的產品)、草醯化可控孔玻璃(例如參見Alul等人，Nucleic Acids Research,Vol.19,1527(1991))、TentaGel撐體-胺基聚乙二醇衍生的撐體(參見，例如，Wright等人，Tetrahedron Letters,Vol.34,3373(1993))以及Poros-聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物。

就“連接子”而言，可以使用通常用於連接核酸或嗎啉基核酸衍生物的已知的連接子。合適的實例包括3-胺基丙基、琥珀醯基、2,2’-二乙醇磺醯基及長鏈烷基胺基(LCAA)。

可用於該步驟的“酸”的實例包括三氟乙酸、二氯乙酸或三氯乙酸。相對於1莫耳之化合物(II)，酸的使用量例如在0.1莫耳當量至1000莫耳當量的範圍內，諸如在1莫耳當量至100莫耳當量的範圍內。

再者，可以將有機胺與上述酸一起使用。任何有機胺均可用於該目的，實例包括三乙胺。相對於1莫耳酸，有機胺的用量例如在0.01莫耳當量至10莫耳當量合理的範圍內，諸如在0.1莫耳當量至2莫耳當量的範圍內。

在該步驟中使用酸及有機胺作為鹽或混合物的情況下，實例包含三氟乙酸及三乙胺的鹽或混合物，更具體地，含有2當量的三氟乙酸及1當量的三乙胺的混合物。

可用於該步驟的酸可藉由用適當的溶劑被稀釋在0.1%至30%範圍內的濃度而使用。只要對反應是惰性，任何溶劑均可用於此目的，實例包括二 氯甲烷、乙腈、醇(例如，乙醇、異丙醇、三氟乙醇)、水或其混合物。

上述反應中的反應溫度例如在10℃至50℃的範圍內，例如在20℃至40℃的範圍內或在25℃至35℃的範圍內。

反應時間依據所使用的酸的類型及/或反應溫度而變化，但是通常在0.1分鐘至24小時的範圍內，並且合適為在1分鐘至5小時的範圍內。

再者，在完成該步驟後，可以視需要地添加鹼以中和系統中剩餘的酸。任何“鹼”均可用於此目的，實例包括二異丙基乙胺。此鹼可藉由用適當的溶劑稀釋為0.1%(體積/體積)至30%(體積/體積)的濃度來使用。

只要對反應呈惰性，任何溶劑均可用於該步驟，其實例包括：二氯甲烷、乙腈、醇(例如，乙醇、異丙醇、三氟乙醇)、水或其混合物。反應溫度例如在10℃至50℃的範圍內，諸如在20℃至40℃的範圍內，並且合適為在25℃至35℃的範圍內。

反應時間依據所使用的鹼的類型及/或反應溫度而變化，但是通常在0.1分鐘至24小時的範圍內，並且合適為在1分鐘至5小時的範圍內。

應當注意，可以根據下述方法製備其中n=1並且L是基團(IV)的化合物(II)，亦即，由如下通式(IIa)表示的化合物(後文稱為化合物(IIa))：

[其中，B^P、T、連接子及固體載體與上述定義相同]。

步驟1：

該步驟是用醯化劑處理由下述通式(V)表示的化合物，以製備由下述通式(VI)表示的化合物(後文稱為化合物(VI))的步驟：

[其中，B^P、T及連接子與上述定義相同；以及

R⁴表示羥基、鹵素、羧基或胺基]。

該步驟可以藉由任何已知的用於導入連接子的反應，從化合物(V)起始而完成。

特別地，下述通式(VIa)表示的化合物可藉由已知為酯化反應的任何方法，而使用化合物(V)及琥珀酸酐製備：

[其中，B^P及T與上述定義相同]。

步驟2：

此是藉由縮合劑等處理而使化合物(VI)與固體載體反應以製備化合物(IIa)的步驟：

[其中，B^P、R⁴、T、連接子及固體載體與上述定義相同]。

該步驟可以藉由使用化合物(VI)及固體載體的任何稱為縮合反應的方法而完成。

化合物(II)係其中n=2至99(合適地為13至29、14至28、15至27、16至26或17至25範圍內的任何整數)且L為基團(IV)，亦即，可藉由將本文揭露的PMO製備程序的步驟A及B重複所需次數，而從化合物(IIa)起始而製備由下述通式(IIa2)表示的化合物：

[其中，B^P、R²、R³、T、連接子及固體載體與上述定義相同；以及

n'表示1至98(在特定具體例中，n'表示1至28、1至27、1至26、1至25或1至24)]。

(2)步驟B：

這是在鹼的存在下用嗎啉基單體化合物處理化合物(III)以製備由下述通式(VII)表示的化合物(後文稱為化合物(VII))的步驟：

[其中，各B^P、L、n、R²、R₃及T與上述定義相同]。

該步驟可以藉由在鹼存在下，用嗎啉基單體化合物處理化合物(III)而完成。

此嗎啉基單體化合物可以由下述通式(VIII)表示的化合物例示：

[其中，B^P、R²、R³及T與上述定義相同]。

可用於該步驟的“鹼”的實例包括二異丙基乙胺、三乙胺或N-乙基嗎啉。相對於1莫耳化合物(III)，鹼的使用量例如在1莫耳當量至1000莫耳當 量的範圍內，合適為在10莫耳當量至100莫耳當量的範圍內。

此嗎啉基單體化合物及可用於該步驟的鹼可藉由適當的溶劑稀釋為0.1%至30%的濃度來使用。只要對反應呈惰性，任何溶劑均可用於此目的，其實例包括N,N-二甲基咪唑啉酮、N-甲基啶啶酮、DMF、二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃或其混合物。

反應溫度例如在0℃至100℃的範圍內，並且合適為在10℃至50℃的範圍內。

反應時間依據所使用的鹼的類型及/或反應溫度而變化，但是通常在1分鐘至48小時的範圍內，並且合適為在30分鐘至24小時的範圍內。

再者，在該步驟完成之後，可以視需要地添加醯化劑。“醯化劑”的實例包括乙酸酐、乙醯氯及苯氧基乙酸酐。例如，這種醯化劑可藉由適當的溶劑稀釋為0.1%至30%的範圍內之濃度使用。任何溶劑只要對反應呈惰性均可用於此目的，其實例包括二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃、醇(例如，乙醇、異丙醇、三氟乙醇)、水或其混合物。

因應所需，可以將鹼(例如，吡啶、二甲基吡啶、柯林鹼、三乙胺、二異丙基乙胺、N-乙基嗎啉)與醯化劑一起使用。醯化劑的使用量合適為在0.1莫耳當量至10000莫耳當量的範圍內，更合適為在1莫耳當量至1000莫耳當量的範圍內。相對於1莫耳醯化劑，鹼的使用量為例如在0.1莫耳當量至100莫耳當量的範圍內，合適為在1莫耳當量至10莫耳當量的範圍內。

該反應中的反應溫度合適為在10℃至50℃的範圍內，例如在20℃至40℃的範圍內，並且合適為在25℃至35℃的範圍內。反應時間例如依據所使用的醯化劑的類型及/或反應溫度而變化，但是通常在0.1分鐘至24小時的 範圍內，並且合適為在1分鐘至5小時的範圍內。

(3)步驟C：

這是一個使用脫保護劑去除從步驟B中製備的化合物(VII)之保護基，從而製備由通式(IX)所示的化合物之步驟：

[其中，B^P、L、n、R²、R³及T與上述定義相同]。

該步驟可以用脫保護劑處理化合物(VII)而完成。

“脫保護劑”的實例包括濃氨水及甲胺。可用於該步驟的此“脫保護劑”係可藉由水、甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃、DMF、N,N-二甲基咪唑啉酮、N-甲基哌啶酮或其混合溶劑稀釋而使用。其中，較佳為乙醇。相對於1莫耳化合物(VII)，脫保護劑的使用量例如在1莫耳當量至100000莫耳當量的範圍內，合適為在10莫耳當量至1000莫耳當量的範圍內。

反應溫度例如在15℃至75℃的範圍內，合適為在40℃至60℃的範圍內或在50℃至60℃的範圍內。脫保護的反應時間依據化合物(VII)的種類及/或反應溫度等而不同，但較佳為10分鐘至30小時的範圍內，較佳為30分鐘至24小時的範圍內，更合適為5至20小時。

(4)步驟D：

這是將步驟C中製備的化合物(IX)用酸處理以製備PMO(I)之步驟：

[其中，鹼基、n，R²、R³及T與上述定義相同]。

該步驟可藉由向化合物(IX)添加酸而完成。

可用於該步驟的‘‘酸”的實例包括三氯乙酸、二氯乙酸、乙酸、磷酸及鹽酸等。關於酸的使用量，可合理的使用可使溶液的pH值為例如在0.1至4.0的範圍內，合適為在1.0至3.0的範圍內之酸的量。只要對反應呈惰性，在該步驟中可以使用任何溶劑，並且實例包括乙腈、水或其混合溶劑。

反應溫度合適為在10℃至50℃的範圍內，例如在20℃至40℃的範圍內或在25℃至35℃的範圍內。用於脫保護的反應時間將根據化合物(IX)的類型及/或反應溫度等而變化，但是合適為在0.1分鐘至5小時的範圍內，諸如，在1分鐘至1小時的範圍內，更合適為在1分鐘至30分鐘的範圍內。

可以藉由常用的分離及純化手段而從該步驟中獲得的反應混合物獲得PMO(I)，該分離及純化手段包含可以單獨使用或結合使用之萃取、濃縮、中和、過濾、離心、再結晶、C₈至C₁₈逆相管柱層析術、陽離子交換管柱層析術、陰離子交換管柱層析術、凝膠過濾管柱層析術、高效液相層析術、透析、超濾及其他手段，從而可以單離及純化所需的PMO(I)(參見，例如，WO1991/09033)。

在使用逆相層析術純化PMO(I)的情況下，例如，可以使用20mM三乙胺/乙酸鹽緩衝液及乙腈的混合溶液作為洗脫溶劑。

同樣地，在使用離子交換層析術純化PMO(I)的情況下，例如，可以使用1M氯化鈉水溶液及10mM氫氧化鈉水溶液的混合溶液。

肽核酸寡聚物是根據本發明的反義寡聚物，其組成單元是由下述通式表示的基團：

(其中，鹼基與上述定義相同)。

肽核酸可以例如根據如下列出的文件製備。

1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991)

2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, Jacs., 114, 1895 (1992)

3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)

4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)

5) T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)

本發明的反義寡聚物可以被配置為使得其5’端為如下所示的化學式(1)至(3)所示的基團中的任一者，較佳為(3)-OH。

如上所述，功能性肽(例如，CPP(細胞穿透肽))可以在沒有或通過連接子的情況下與反義寡聚物鍵結。當功能性肽通過連接子與反義寡聚物鍵結時，額外的胺基酸可以與功能性肽鍵結。在一個較佳的具體例中，功能性肽可以在5’端或3’端與磷醯二胺嗎啉代寡聚物(“PMO”)鍵結，較佳為與3’端鍵結。同樣地，在一個較佳的具體例中，功能性肽的C端可以與PMO鍵結。

醫藥上可接受之鹽及水合物

本發明化合物(例如，反義寡聚物)的醫藥上可接受之鹽的實例包括鹼金屬鹽(例如，鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽)；鹼土金屬鹽(例如，鈣鹽、鎂鹽)；金屬鹽(例如，鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽)；銨鹽；有機胺鹽(例如，第三辛胺鹽、二苄胺鹽、嗎啉鹽、葡糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基葡糖胺鹽、胍鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、二環己基胺鹽、N,N'-二苄基乙二胺鹽、氯普魯卡因鹽(chloroprocaine salt)、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-苯乙胺鹽、哌嗪鹽、四甲基銨鹽、參(羥甲基)胺基甲烷鹽)；鹵化氫酸鹽(例如，氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽)；無機酸鹽(例如，硝酸鹽、高氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽)；低級鏈烷磺酸鹽(例如，甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽)；芳基磺酸鹽(例如，苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽)；有機酸鹽(例如，乙酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、琥 珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽)；胺基酸鹽(例如，甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽)等。這些鹽可以任何已知的方式製備。

本發明的化合物(例如，反義寡聚物)的水合物可以任何已知的方式製備。

特定具體例

本發明的反義寡聚物例如包含：具有本發明的反義寡聚物的例示性長度範圍的長度或本發明的反義寡聚物的例示性長度的寡核苷酸、嗎啉代寡聚物或PNA。在一特定的具體例中，寡核苷酸是反義寡聚物，其中該寡核苷酸中的至少一個糖部分及/或至少一個磷酸酯鍵部分經修飾。

在一特定的具體例中，本發明的反義寡核苷酸包含至少一個經修飾之糖部分，其係核糖之2’-位置的-OH基團經選自由OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR2、N₃、CN、F、Cl、Br及I(其中，R表示烷基或芳基，R’表示伸烷基)所組成群組之任意基團所取代。

在一特定的具體例中，寡核苷酸包含至少一個選自硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基磷酸酯鍵、胺基磷酸酯鍵及硼烷磷酸酯鍵的修飾之磷酸酯鍵部分。

在一特定的具體例中，寡核苷酸是包括至少一個嗎啉環的反義寡聚物。在一特定的實施態樣中，反義寡聚物是嗎啉代寡聚物或磷醯二胺嗎啉代寡聚物。

在另一具體例中，反義寡聚物在其5’端具有由下示化學式(1)至(3)表示的任何一個基團。

在實施例部分中測試的所有反義寡聚物可以採用如上所述之任何化學修改。

如上述，功能性肽(例如，CPP(細胞穿透肽))可以在沒有或通過連接子的情況下與反義寡聚物鍵結。當功能性肽通過連接子與反義寡聚物結合時，額外的胺基酸可以附接至功能性肽。在一較佳的具體例中，功能性肽可以在5’端或3’端與磷醯二胺嗎啉代寡聚物(“PMO”)鍵結。

醫藥組成物

根據本發明的第二態樣，提供了一種醫藥組成物，其包括本發明的化合物(例如，本發明的反義寡聚物)或其醫藥上可接受之鹽或水合物作為活性成分(後文稱為“本發明的醫藥組成物”)。

在特定的實施態樣中，醫藥組成物包含任何上述寡聚物或寡核苷酸、或其醫藥上的鹽或水合物、以及至少一種醫藥上可接受之添加劑及/或載體。

適用於本發明的製劑可見於Remingtn’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,費城，賓夕法尼亞州，第17版，1985。關於藥物遞送方法的簡要綜述，參見，例如，Langer(Science 249：1527-1533,1990)。

載體可用於促進寡聚物向肌肉組織的遞送。此載體沒有任何限 制，只要它是醫藥上可接受之即可。合適的例子包括陽離子載體(例如，陽離子性脂質體、陽離子性聚合物)或基於病毒包膜的載體。陽離子性脂質體的實例包括：由2-O-(2-二乙基胺基乙基)胺甲醯基-1,3-O-二油醯基甘油及磷脂作為必需組成成分形成的脂質體(後文稱為“脂質體A”)、Oligofectamine®(Invitrogen)、Lipofectin®(Invitrogen)、Lipofectamine®(Invitrogen)、Lipofectamine 2000®(Invitrogen)、DMRIE-C®(Invitrogen)、GeneSilencer®(Gene Therapy System)、TransMessenger®(QIAGEN)，TransIT TKO®(Mirus)及Nucleofector II(Lonza)。其中，較佳為脂質體A。陽離子性聚合物的實例包括JetSI®(Qbiogene)及Jet-PEI®(聚乙烯亞胺，Qbiogene)。病毒包膜系載體的實例包括GenomeOne®(HVJ-E脂質體，Ishihara Sangyo Kaisha,Ltd.,Japan)。或者是，也可以使用日本專利第2924179號中所示的醫藥裝置或JP WO2006/129594及JP WO2008/096690中所示的陽離子性載體。

有關更多詳細訊息，請參見美國專利第4,235,871及4,737,323號、WO96/14057、“New RRC,Liposomes：A practical approach,IRL Press,Oxford(1990)pages 33-104”等。

除了本發明的反義寡聚物或其醫藥上可接受之鹽或水合物及/或如上所述之載體之外，本發明的醫藥組成物還可視需要地包含醫藥上可接受之添加劑。此添加劑的實例包括：乳化助劑(例如，含6至22個碳原子的脂肪酸或其醫藥上可接受之鹽、白蛋白、右旋糖酐)、安定劑(例如，膽固醇、磷脂酸)、等滲劑(例如，氯化鈉、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖)及pH調節劑(例如，鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、三乙醇胺)。此等添加劑可以單獨使用或組合使用。在本發明的醫藥組成物中，添加劑的含量合理地為90重 量%以下，諸如，60重量%以下，並且合適地為50重量%以下。

本發明的醫藥組成物可以藉由將本發明的化合物(例如，反義寡聚物)或其醫藥上可接受之鹽或水合物加入載體的分散體中，然後充分地攪拌而製備。可以在添加本發明的化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物之前或之後的任何適當階段添加添加劑。只要是醫藥上可接受的，任何水性溶劑都可以用於添加本發明的化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，並且實例包括注射用水、注射蒸餾水、電解液(例如，生理鹽水)及糖溶液(例如，葡萄糖溶液、麥芽糖溶液)。再者，在這種情況下，發明所屬技術領域中的技術人員可以適當地選擇包含pH及溫度條件。

本發明的醫藥組成物可以調配成溶液或其冷凍乾燥製劑。如此冷凍乾燥調配物係可以藉由將溶液形式的本發明的醫藥組成物冷凍乾燥來以標準方式製備。例如，可以將溶液形式的本發明的醫藥組成物適當地滅菌，然後以分配定量至小瓶中，然後在約-40℃至-20℃的條件下初步冷凍約2小時，在約0℃至10℃的減壓下進行一次乾燥，然後在約15℃至25℃的減壓下進行二次乾燥。再者，在多數情況下，可以用氮氣吹掃小瓶，然後加蓋，從而得至本發明醫藥組成物的冷凍乾燥調配物。

如此之本發明的醫藥組成物的冷凍乾燥調配物通常可以在藉由添加任何合適的溶液(亦即，復水溶液)而復水之後使用。此復水溶液的實例包括注射用水、生理鹽水及其他常用的輸注溶液。例如，此復水溶液的體積取決於預期用途而變化，並且不以任何方式進行限制，但是其合理地比冷凍乾燥之前的溶液體積大0.5至2倍，或者500mL以下。

本發明的醫藥組成物中包含的本發明的化合物(例如，反義寡聚 物)或其醫藥上可接受之鹽或水合物可以其水合物的形式存在。如此之水合物可以任何已知的方式製備。

醫藥組成物的組成及調配方法依據許多標準，包括但不限於投予途徑、疾病程度或投予劑量。

這些組成物可以通過傳統的滅菌技術進行滅菌，或可以進行無菌過濾。可以將所得的水溶液直接包裝使用或冷凍乾燥，在投予前將冷凍乾燥的製劑與無菌水性載體合併。製劑的pH通常將在3至11之間，合適為在5至9之間或在6至8之間，並且最合適為在7至8之間，例如7至7.5。可以將所得的固體形式之組成物包裝在多個單劑量單位中，各單位包含固定量的一種或多種上述試劑，例如在密封的片劑或膠囊包裝中。固體形式的組成物也可以彈性量包裝在容器中，例如，在設計用於局部投予的乳膏或軟膏的可擠壓管中。

本發明的醫藥組成物可以任何醫藥上可接受之方式投予，該方式可以根據預期的治療方法適當地選擇。然而，就易於遞送至肌肉組織而言，較佳為靜脈內投予、動脈內投予、肌內投予、皮下投予、口服、間質投予、經皮投予等。再者，本發明的組成物可以是任何劑型，並且實例包括各種類型的注射劑、口服製劑、滴劑、吸入劑、軟膏劑、洗劑等。

本發明的醫藥組成物中所含的本發明的化合物(例如，反義寡聚物)或其醫藥上可接受之鹽或水合物的濃度將例如根據載體的種類而不同，但在0.1nM至100μM的範圍內，且合適為在100nM至10μM的範圍內。同樣地，本發明的醫藥組成物中包含的載體與本發明的反義寡聚物或其醫藥上可接受之鹽或水合物的重量比(亦即，載體/反義寡聚物或其醫藥上可接受之鹽或水合物的比率)係根據於寡聚物的性質及載體的類型而變化，但是其合理地在0.1至100 的範圍內，並且合適為在0.1至10的範圍內。

本發明的化合物、其醫藥上可接受之鹽或水合物可以包含在單位調配物中，例如醫藥上可接受之載體或稀釋劑，其含量足以將治療上可接受的量遞送給對象主體，而不會引起對象主體的嚴重副作用。

本發明的醫藥組成物的投予劑量係期望考量到本發明的反義寡聚物或其所含的醫藥上可接受之鹽或水合物的類型、所欲劑型、對象主體的狀況(諸如，年齡及體重)、投予途徑以及疾病的性質及嚴重程度而進行調整。若對象主體是人類對象主體，則成年人的每日劑量通常在0.1mg至10g/公斤體重的範圍內，例如以本發明的反義寡聚物或其醫藥上可接受之鹽或水合物的量計算，在1mg至1g/公斤體重、20mg至120mg/公斤體重、30mg至100mg/公斤體重或40mg至80mg/公斤體重的範圍內。該數值範圍可以根據要靶向的疾病類型、投予方式及/或目標分子的類型而變化。因此，在某些情況下，低於此範圍的劑量可能已足夠，或者相反，在某些情況下，應要求高於該範圍的劑量。再者，本發明的醫藥組成物可以一天一次至數次或間隔一至幾天投予。

在另一具體例中，本發明的醫藥組成物可以是醫藥組成物，其包括能夠表現本發明的化合物的載體(例如，本發明的反義寡核苷酸)及如上所述之載體。此表現載體能夠表現根據本發明的多個反義寡核苷酸。如上述，此醫藥組成物可以視需要地包括醫藥上可接受之添加劑。該醫藥組成物中包含的表現載體的濃度例如根據載體的種類而變化，但較佳為0.1nM至100μM的範圍，且合適為100nM至10μM的範圍。例如，該醫藥組成物中包含的載體與表現載體的重量比(亦即，載體/表現載體之比率)，係根據表現載體的性質及載體的類型而變化，但其範圍合理為0.1至100，並且合適為在0.1至10。再者，在該醫藥 組成物中所含的載體的含量與上述相同，並且其製備步驟也與上述相同。

治療用途

本發明的化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物或包含該等之本發明的醫藥組成物(後文稱為“本發明的治療劑”)可用於治療，例如用於治療人類。

可以提供本發明的治療劑以用於預防或治療代謝紊亂(例如，肥胖、代謝綜合症、糖尿病)、肌萎縮性疾病或肌肉萎縮症或肌少症。肌萎縮性疾病或肌肉萎縮症的例子包括：肌源性肌萎縮症(例如，肌營養不良症(例如，杜興氏肌肉失養症(Duchenne muscular dystrophy)、福山肌營養不良症(Fukuyama muscular dystrophy)、肌強直性營養不良症)、先天性肌病、包涵體肌炎)、神經源性肌萎縮症(例如，肌萎縮性側索硬化症、脊髓性肌萎縮症、脊髓及延髓性肌萎縮症、廢用肌萎縮症(例如，中風引起的廢用症候群(disuse syndrome))、肌肉萎縮症(例如，癌症惡病質、敗血症相關的肌萎縮症)以及各種類型的肌少症，包括與年齡相關的骨骼肌流失(與年齡有關的肌少症)，尤其是肌肉營養不良。

在本發明的一些具體例中，提供了用於預防或治療肌萎縮性疾病、肌肉萎縮症或肌少症的方法，其包括向需要預防或治療肌萎縮性疾病或肌肉萎縮症的對象主體投予治療有效量的本發明的治療劑。在一特定的實施態樣中，本發明的化合物(例如，反義寡聚物)或其醫藥上可接受之鹽或水合物可以本發明的醫藥組成物的形式對對象主體投予。

在本發明的上下文中，術語“對象主體”意指人類對象主體或非人類的溫血動物，例如鳥類及非人類哺乳動物(例如，牛、猴子、貓、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、豬、狗、兔子、綿羊、馬)。“對象主體”較佳為人類對象主體。

在本發明的特定具體例中，提供一種本發明的治療劑在製備用於 預防或治療肌萎縮性疾病或肌肉萎縮症的醫藥組成物之用途。

在本發明的特定具體例中，提供一種本發明的化合物(例如，反義寡聚物)或其醫藥上可接受之鹽或水合物在製備用於預防或治療肌萎縮性疾病或肌肉萎縮症的醫藥組成物之用途。

在本發明的其他具體例中，提供一種本發明的治療劑，其用於治療肌萎縮性疾病或肌肉萎縮症。

如上所述，本發明的化合物允許通過例如誘發外顯子跳躍或mRNA降解而在mRNA層次上抑制肌肉生長抑制素訊號轉導。在一具體例中，本發明的化合物可以是本發明的反義寡聚物。

肌肉組織中肌肉生長抑制素訊號之抑制可用於預防或治療肌萎縮性疾病、肌肉萎縮症或肌少症。骨骼肌的萎縮不僅降低了對象主體的生活品質，而且伴隨著嚴重的全身併發症，包括營養不良及呼吸衰竭，因此需要能夠解決這一醫學需求的藥物及治療方法。

因此，當將本發明的治療劑施用於需要預防或治療肌萎縮性疾病、肌肉萎縮症或肌少症的對象主體時，可以預防或治療肌萎縮性疾病、肌肉萎縮症或肌肉萎縮性疾病。

本發明還提供一種用於對象主體的療法中的本發明的治療劑。

所述療法可以是以上所列疾病的預防或治療。

在一具體例中，該療法可以是預防或治療對象主體的肌萎縮性疾病、肌肉萎縮症或肌少症。在一個具體例中，肌萎縮性疾病可以是杜興氏肌肉失養症。該對象主體可以是人類對象主體。

本發明亦提供本發明的化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物 在製備用於預防或治療肌萎縮性疾病、肌肉萎縮症或肌少症的藥物(例如，醫藥組成物)之用途。在一具體例中，肌萎縮性疾病是杜興氏肌肉失養症。在一具體例中，對象主體是人類。

劑量及投予途徑可以與本發明醫藥組成物中列出的劑量及投予途徑相同。

本發明亦提供一種用於治療對象主體之疾病的方法，該方法包括向對象主體投予治療有效量的本發明的治療劑。該疾病可以是代謝紊亂(例如，肥胖、代謝綜合症、糖尿病)、肌萎縮性疾病、肌肉萎縮症或肌少症。肌萎縮性疾病或肌肉萎縮症的實例包括肌源性肌萎縮症(例如，肌營養不良症(例如，杜興氏肌肉失養症、福山肌營養不良症、肌強直性營養不良症)、先天性肌病，包涵體肌炎)、神經源性肌萎縮症(例如，肌萎縮性側索硬化症、脊髓性肌萎縮症、脊髓及延髓性肌萎縮症、廢用肌萎縮症(例如，中風引起的廢用症候群)、肌肉萎縮症(例如，癌症惡病質、敗血症相關的肌萎縮症)以及各種類型的肌少症，包括與年齡相關的骨骼肌流失(與年齡有關的肌少症)，尤其是肌肉營養不良。在一個具體例中，該療法可以是預防或治療對象主體的肌萎縮性疾病、肌肉萎縮症或肌少症。

在一具體例中，肌萎縮性疾病可以是杜興氏肌肉失養症。該對象主體可以是人類對象主體。劑量及投予途徑可以與本發明醫藥組成物中列出的劑量及投予途徑相同。

動物

本發明還提供一種遺傳操作之動物，其產生缺少ACVR2B的部分細胞內區域之截斷形式的ACVR2B蛋白(後文稱為“本發明的GM動物”)。如本文所用， 動物可以是人類以外的任何物種。特別合適的動物是家養動物，例如魚(例如，金槍魚)、牛、綿羊、山羊或豬。

發明所屬技術領域中的技術人員能夠使用標準技術來產生這種經遺傳操作的動物。例如，可以藉由投予本發明的化合物或本發明的醫藥組成物而產生本發明的GM動物。例如，本發明的GM動物可以藉由CRISPR-CAS9、siRNA、loxP剔除系統、TALEN、鋅指(ZFN)或反義寡聚物而產生。

當使用CRISPR-CAS9時，將具有與編碼ACVR2B或部分ACVR2B的基因組DNA的目標序列互補的序列的引導RNA(例如，野生型ACVR2B的細胞內區域)導入至目標細胞或宿主動物，從而辨識待切割的目標序列。導入至目標細胞的Cas9(或類Cas9)蛋白切割由基因組DNA及引導RNA組成的雙股部分。通過修復切割位點的過程，核苷酸的缺乏及/或插入引起突變，從而導致ACVR2B的剔除。基因組DNA的目標序列的實例包括外顯子的任何序列，例如，ACVR2B的外顯子1至11。合適地，基因組DNA的目標序列包含選自由ACVR2B之外顯子5、6、7、8、9、10及11所組成群組或由ACVR2B之外顯子5、6、7、8、9及10所組成群組的至少一個外顯子的任何序列。在一具體例中，基因組DNA的目標序列包含選自由ACVR2B的外顯子5、6、7、9及10所組成群組的至少一個外顯子的任何序列。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列包含選自由ACVR2B的外顯子5、6、9及10所組成群組的至少一個外顯子的任何序列。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列包含選自由ACVR2B的外顯子5、6及10所組成群組的至少一個外顯子的任何序列。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列包含選自由ACVR2B的外顯子5及6所組成群組的至少一個外顯子的任何序列。在另一具體例中，基因組DNA的目標 序列包含選自由ACVR2B的外顯子7、8及9所組成群組的至少一個外顯子的任何序列。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列包含選自由ACVR2B的外顯子7及8所組成群組的至少一個外顯子的任何序列。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列是ACVR2B的外顯子5。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列是ACVR2B的外顯子6。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列是ACVR2B的外顯子7。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列是ACVR2B的外顯子8。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列是ACVR2B的外顯子9。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列是ACVR2B的外顯子10。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列是ACVR2B的外顯子11。在另一具體例中，基因組DNA的目標序列包含選自由ACVR2B的外顯子7、8、9及10所組成群組或由ACVR2B的外顯子5、6、7、8、9及10所組成群組的至少一個外顯子的任何序列。

或者是，CRISPR-CAS9可靶向內含子。例如，夾有外顯子8的內含子7及8可以被切割。當切割的位點被修復時，外顯子8可能不存在而產生外顯子8缺陷型突變mRNA。類似地，內含子4及5、或內含子5及6、或內含子6及7、或內含子8及9、或內含子9及10、或內含子10及11可以被切割。

當使用siRNA抑制肌肉生長抑制素訊號時，將旨在靶向ACVR2B mRNA序列的siRNA導入至目標細胞。當如此被導入的siRNA的引導股與目標序列雜交時，目標細胞中的內源性RISC蛋白識別由引導股及目標mRNA股組成的雙股部分，並切割mRNA的目標序列。藉此，降低本發明的GM動物中的ACVR2B蛋白層次。

應當注意的是，本文引用的所有刊物、包括現有技術文件、專利 公報及其他專利文件，均藉由併入方式本文。後文將藉由下述闡釋性實施例更詳細地描述本發明，惟，本發明不限於此。

實施例

[參考例1]

承載於胺基聚苯乙烯樹脂上之4-{[(2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸

步驟1：4-{[(2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸之製備

在氬環境下，將1-[(2R,6S)-6-(羥甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-5-甲基嘧啶-2,4-二酮(41.11g)及4-二甲基胺基吡啶(4-DMAP)(15.58g)懸浮於二氯甲烷(850mL)中，然後向其中加入琥珀酸酐(12.76g)，然後在室溫攪拌3.5小時。反應溶液以二氯甲烷及1M磷酸二氫鈉水溶液萃取。依次用1M磷酸二氫鈉水溶液及飽和氯化鈉水溶液洗滌所得的有機層。所得有機層經硫酸鈉乾燥並減壓濃縮。向所得固體中，加入二氯甲烷(600mL)以進行結晶，然後過濾。加入另外的二氯甲烷(300mL)後，將晶體攪拌5分鐘，然後過濾並在減壓下乾燥過夜，以獲得所需產物(50.2g)。

步驟2：承載於胺基聚苯乙烯樹脂上之4-{[(2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸之製備

將4-{[(2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸(50.2g)溶於吡啶(脫水)(600mL)，然後加入4-DMAP(12.4g)及1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(77.6g)。然後將胺基聚苯乙烯樹脂胺基甲基樹脂(Watanabe Chemical Industries之產品，A00673，200至400目， 1mmol/g，1%DVB)(40.5g)及三乙胺(69.6mL)加入至該混合物中，然後在室溫震盪4天。反應後，藉由過濾而採集樹脂。依次用吡啶、甲醇及二氯甲烷洗滌所得樹脂，然後在減壓下乾燥。向所得樹脂，添加四氫呋喃(脫水)(500mL)、乙酸酐(104mL)及2,6-二甲基吡啶(128mL)，然後在室溫震盪4小時。藉由過濾而採集樹脂，依次用吡啶、甲醇及二氯甲烷洗滌，然後於減壓下乾燥以得所需產物59.0g。

為了測定所需產物的承載量，以公知的方式(在409nm的UV吸收)測量每公克樹脂中三苯甲基的莫耳量。樹脂上的承載量實測為467.83μmol/g。

紫外線測量條件

儀器：U-2910(Hitachi,Ltd.,Japan)

溶劑：甲磺酸

波長：409nm

ε值：45000

[參考例2]

承載在胺基聚苯乙烯樹脂上的4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺基-2-側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸

除了在參考例1的步驟1中使用N-{1-[(2R,6S)-6-(羥甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-2-側氧基-1,2-二氫嘧啶-4-基}苯甲醯胺取代在該步驟的1-[(2R,6S)-6-(羥甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-5-甲基嘧啶-2,4-二酮以外，重複參考例1中所示的相同步驟以製備標題化合物。

為了測定所需產物的承載量，以公知的方式(在409nm的UV吸收)測量每公克樹脂中三苯甲基的莫耳量。樹脂上的承載量實測為460.28μmol/g。

[參考例3]

承載在胺基聚苯乙烯樹脂上的4-{[(2S,6R)-6-(6-苯甲醯胺基嘌呤-9-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸

除了於參考例1的步驟1中使用N-{9-[(2R,6S)-6-(羥甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]嘌呤-6-基}苯甲醯胺取代在該步驟中的1-[(2R,6S)-6-(羥甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-5-甲基嘧啶-2,4-二酮以外，重複參考例1中所示的相同步驟以製備標題化合物。

為了測定所需產物的承載量，以公知的方式(在409nm的UV吸收)測量每公克樹脂中三苯甲基的莫耳量。在樹脂上的承載量實測為425.13μmol/g。

[參考例4]

承載在胺基聚苯乙烯樹脂上的4-{{(2S,6R)-6-{6-(2-氰基乙氧基)-2-[(2-苯氧基乙醯基)胺基]嘌呤-9-基}-4-三苯甲基嗎啉-2-基}甲氧基}-4-側氧基丁酸

除了在參考例1的步驟1中使用N-{6-(2-氰基乙氧基)-9-[(2R,6S)-6-(羥甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]嘌呤-2-基}-2-苯氧基乙醯胺取代在該步驟中的1-[(2R,6S)-6-(羥甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-5-甲基嘧啶-2,4-二酮以外，重複參考例1中所示的相同步驟以製備標題化合物。

為了測定所需產物的承載量，以公知的方式(在409nm的UV吸收)測量每公克樹脂中三苯甲基的莫耳量。樹脂上的承載量實測為341.09μmol/g。

根據如下顯示的實施例1中的描述，或者根據PCT/JP2015/57180中描述的程序，使用核酸合成器(AKTA Oligopilot 10 plus)合成出PMO(5’端是基團(3))。表1列出在合成的PMO中，表現出跳躍活性的PMO。

[表1]

[實施例1]

承載在胺基聚苯乙烯樹脂上的4-{[((2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸(參考例1)、承載在胺基聚苯乙烯樹脂上的4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺基-2-氧嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸(參考例2)、承載在胺基聚苯乙烯樹脂上的4-{[((2S,6R)-6-(6-苯甲醯胺嘌呤-9-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸(參考例3)、或承載在胺基聚苯乙烯樹脂上的4-{{(2S,6R)-6-{6-(2-氰基乙氧基)-2-[(2-苯氧基乙醯基)胺基]嘌呤-9-基}-4-三苯甲基嗎啉-2-基}甲氧基}-4-側氧基丁酸(參考例4)各自對應於5’端鹼基，以0.1g的量填充至配備有過濾器的反應容器中，以使用肽合成器引發如下合成循環(FOCUS)。為了提供表1中所示的各化合物的核苷酸序列，在各偶聯循環中加入所需的嗎啉基單體化合物(參見下述表2)。

[表2]

應當注意的是，所用的解塊溶液係藉由將濃度為3%(重量/體積)的三氟乙酸(2當量)及三乙胺(1當量)的混合物溶解在含有1%(體積/體積)乙醇及10%(體積/體積)2,2,2-三氟乙醇的二氯甲烷溶液中而製備。所使用的中和溶液係藉由將濃度為5%(體積/體積)的N,N-二異丙基乙胺溶解在含有25%(體積/體積)的2-丙醇的二氯甲烷溶液中而製備。所用的活化劑溶液係含有20%(體積/體積)的N,N-二異丙基乙胺的1,3-二甲基-2-咪唑啉酮溶液。所用的單體溶液係藉由將濃度為0.20M的嗎啉基單體化合物溶解在四氫呋喃中而製備。所用的封端溶液 係藉由將10%(體積/體積)的乙酸酐及15%(體積/體積)的2,6-二甲基吡啶溶解在二氯甲烷中而製備。

從反應容器中採集承載有如上所述合成的PMO的胺基聚苯乙烯樹脂，並在30℃於減壓下乾燥2小時或更長。將承載在胺基聚苯乙烯樹脂上的乾燥的PMO填入反應容器中，並向其中加入5mL 28%的氨水-乙醇(1/3)，然後在55℃靜置16小時。藉由過濾而分離胺基聚苯乙烯樹脂，並用3mL水-乙腈(1/1)洗滌。將所得濾液與乙醇(3mL)及二乙醚(35mL)混合後，將混合物離心，然後傾析以除去上清液，並將殘餘物於減壓下乾燥。將所得的殘餘物溶於10mL的含有20mM乙酸銨水溶液及乙腈(4/1)的混合溶劑中，然後藉由逆相HPLC純化。下述表3中顯示使用的條件。

[表3]

分別分析區分物(fraction)以採集所需產物。將所得溶液與0.1M鹽酸水溶液(4mL)混合並靜置2小時。反應後，加入1M氫氧化鈉水溶液(0.4mL)以中和混合物，然後通過膜濾器(0.22μm)過濾。

含有所需產物的水溶液以1M氫氧化鈉水溶液(0.4mL)鹼化，並通 過陰離子交換樹脂柱純化。下述表4顯示使用的條件。

[表4]

分別分析區分物(通過HPLC)以獲得所需產物的水溶液。所得水溶液以0.1M磷酸鹽緩衝液(pH 6.0)中和，然後在下述表5所示的條件下通過逆相HPLC脫鹽。

[表5]

採集所需產物並減壓濃縮。將所得殘餘物溶解在水中，並冷凍乾燥，以獲得呈白色絮狀固體之期望的化合物。表1顯示ESI-TOF-MS的計算值及 實測值。

[實施例2]

反義寡聚物-肽接合物(PMO-肽接合物)的合成

將PMO(PMO No.15，18.1mg，1.0當量)溶解在DMSO(284.0μL)及DMF(17.5μL)中。向該溶液加4-馬來醯亞胺基丁酸(1.7mg，4.0當量)及WSCI．HCl(2.2mg，5.0當量)於DMSO(23.2μL)及DMF(22.2μL)中的混合物。將反應混合物在45℃攪拌6小時。反應幾乎完成後，向混合物加入CH₂Cl₂(13.2mL)，以得到沉澱。藉由離心而採集沉澱物，然後真空乾燥。將乾燥的沉澱物再溶解在DMSO(175.0μL)及H2O(52.7μL)中。向所得溶液中加入hLIMK(Ac-KKRTLRKNDRKKRC-CONH₂，5.1mg，1.2當量)(SEQ ID NO：112)，並將混合物在45℃攪拌30分鐘。藉由HPLC分析確認反應完成後，藉由添加乙腈溶液(10%的H₂O溶液；400μL)而終止反應。用水(約40mL)稀釋溶液，並藉由陽離子交換層析術純化期望的產物。下述表6顯示所用條件。

[表6]

藉由HPLC分析區分物，並採集適當的級分。將水溶液用水稀釋七倍，然後在下述表7所示的條件下藉由逆相HPLC脫鹽。

[表7]

採集所需產物並減壓濃縮。將所得殘餘物溶解在水中並冷凍乾燥，以得到呈白色絮狀固體(7.7mg，34.0%產率)之期望的化合物(指定為PPMO No.1)。

藉由使用ESI-TOF-MS(計算值：9973.92，觀察值：9973.54)，而確定所獲得的化合物(PPMO No.1)的分子量。

[實施例3]

反義寡聚物的跳躍活性評估

將PMO轉染至細胞中

將表1中所示的反義寡聚物用Nucleofector II(Lonza)及Amaxa細胞系Nucleofector套組分別轉染至3×10⁵個RD細胞(人類橫紋肌肉瘤細胞系)中。使用的脈衝程序是T-030。

轉染後，將細胞在含10%胎牛血清(FBS)(Sigma-Aldrich)的Dulbecco's Modified Eagle培養基(DMEM)(Sigma-Aldrich)中，於5%CO₂下於6孔板的孔中培養。轉染三天後，將培養基換成不含血清的含0.4ng/mL重組肌肉生長抑制素的DMEM(R & D Systems)，並將細胞在5%CO₂下於37℃培養2小時。

硫代磷酸酯(PS)寡核苷酸轉染至細胞中

轉染前一天，將RD細胞以3×10⁴個細胞/孔的密度接種至24孔盤中，並在5%CO₂的條件下於含有10%FBS(Sigma-Aldrich)的DMEM(Sigma-Aldrich)中培養。第二天，使用Lipofectamine 3000 Transfection Reagent(Thermo Scientific)將表8所示的2’-O-甲基硫代磷酸酯(PS)寡核苷酸(JbioS)的反義寡聚體分別以10或30nM轉染。轉染後將細胞培養三天。

[表8]

將PMO-肽接合物以裸露(gymnotic)遞輸至細胞中

轉染前一天，將RD細胞以4×10⁴個細胞/孔的密度接種在24孔盤中，並在5%CO₂的條件下於含有10%FBS(Sigma-Aldrich)的DMEM(Sigma-Aldrich)中培養。第二天，將實施例2中合成的反義寡聚物-肽接合物(PMO-肽接合物)添加至培養基中。加入PMO-肽接合物後，將細胞培養三天。

RNA萃取

將細胞用PBS(Nissui Pharmaceutical)洗滌一次，然後將350μL的含有1%之2-巰基乙醇(Nacalai Tesque)的Buffer RLT(Qiagen)加入至細胞中，並藉由使其在室溫靜置幾分鐘而裂解細胞。將細胞裂解液採集至QIAshredder均質器(Qiagen)中，並以20,400×g離心2分鐘以製備勻質物。依照RNeasy Mini Kit(Qiagen)的製造商的說明書萃取總RNA。用NanoDrop ND-1000分光光度計(Thermo Fisher Scientific)測量萃取的總RNA的濃度。

跳躍效率的測量

將萃取的總RNA(150ng)作為模板，用QIAGEN OneStep RT-PCR套組(Qiagen)進行一步式RT-PCR。根據套組附帶的方案製備反應溶液。使用的熱循環儀是TaKaRa PCRThermal Cycler Dice Touch(Takara Bio)。所用的RT-PCR程式如下所示。

50℃持續30分鐘：逆轉錄反應

95℃持續15分鐘：聚合酶活化，逆轉錄酶失活

[94℃持續30秒鐘；62℃持續30秒；72℃，持續50秒]×32個循環：PCR

72℃持續7分鐘：最終延伸反應

用於RT-PCR的正向及反向引子的核苷酸序列如下所示。

為了偵測外顯子5之跳躍：

正向引子：5’-TGCTACGATAGGCAGGAGTG-3’(SEQ ID NO：37)

反向引子：5’-AGCAGGTTCTCGTGCTTCAT-3’(SEQ ID NO：38)

為了偵測外顯子6、7或8之跳躍：

正向引子：5’-CATGTGGACATCCATGAGGA-3’(SEQ ID NO：39)

反向引子：5’-GAGACACAAGCTCCCACAGC-3’(SEQ ID NO：40)

為了偵測外顯子9或10之跳躍：

前置引子：5’-TCTATTGCCCACAGGGACTT-3’(SEQ ID NO：41)

反置引子：5’-GAGCCTCTGCATCATGGTC-3’(SEQ ID NO：42)

上述PCR反應溶液(1μL)係使用生物分析儀(Agilent)分析。測量具有外顯子跳躍的PCR擴增子(亦即，截斷之ACVR2B cDNA)的多核苷酸莫耳濃度“A”，以及野生型PCR擴增子(亦即，野生型ACVR2B cDNA)的多核苷酸莫耳濃度“B”。依據該等“A”及“B”的實測值，根據下式確定跳躍效率。

跳躍效率(%)=A/(A+B)×100

第1a至d圖顯示所獲得的結果。

第1a至d圖表示本發明的反義寡聚物及反義寡聚物-肽接合物造成外顯子跳躍。

[實施例4]

顯性負活性之測量

將8×10³個HEK-293細胞(人類胚胎腎細胞系)接種至96孔白盤(Thermo Fisher Scientific)中，並在37℃及5%CO₂下於含有10%FBS的最低必需培養基Eagle(Sigma-Aldrich)中培養。第二天，使用Lipofectamine LTX(Thermo Fisher Scientific)將10ng之帶有編碼各外顯子(外顯子5、6、7、8、9或10)跳躍產物(Eurofins Genomics)的DNA的pBApo-CMV(Takara Bio)及14ng之螢光素酶報告基因DNA(Cignal SMAD Reporter Aassay Kit，Qiagen)共轉染至細胞中。轉染後兩天，將在不含血清的最低必需培養基Eagle中稀釋的重組肌肉生長抑制素(R & D Systems)以10ng/mL的最終濃度添加至培養基。再培養24小時後，根據製造商的說明書，使用Dual-Glo螢光素酶測定係統(Promega)進行螢光素酶報告基因測定。將發光計Tecan infinite F200 PRO(Tecan)用於測量螢光素酶活性。

第2圖顯示所獲得的結果。

如第2圖所示，在例用編碼各外顯子跳躍產物的DNA轉染的細胞中，藉由添加肌肉生長抑制素誘發的螢光素酶活性幾乎完全被抑制。第2圖表示任何外顯子跳躍(外顯子5、6、7、8、9及10)均可有效地抑制肌肉生長抑制素訊號。

[實施例5]

肌肉生長抑制素訊號的測量

萃取的總RNA(360ng)被作為模板，藉由高容量cDNA逆轉錄套組(Thermo Fisher Scientific)進行RT反應。反應溶液的製備及熱條件係遵循套組製造商的說明書。所用的熱循環儀是TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch(Takara Bio)。

將RT反應溶液(0.6μL)用作模板，以使用TaqMan基因表現預混液(Thermo Fisher Scientific)及針對SMAD7及PPIB的TaqMan基因表現測定法(Thermo Fisher Scientific)進行qPCR。用於qPCR的儀器是QuantStudio 6 Flex Systems(Thermo Fisher Scientific)。

第3圖顯示所獲得的結果。

如第3圖所示，藉由肌肉生長抑制素的刺激，SMAD7基因的表現增加6倍。本發明的反義寡聚物抑制SMAD7基因表現的增加。

該等反義寡聚物在BLAST分析中與SMAD7基因沒有同源性。因此，該等SMAD7基因表現抑制活性係對肌肉生長抑制素訊號抑制活性具有特異性。

序列標識：

SEQ ID NO：1

SEQ ID NO：2

SEQ ID NO：3

SEQ ID NO：4

SEQ ID NO：5

SEQ ID NO：6

SEQ ID NO：7(包括末端UAA終止密碼子之外顯子11)

SEO ID NO：8：

SEQ ID NO：9：

SEQ ID NO：10.

SEQ ID NO：11.

<110> 日本新藥股份有限公司

<120> 肌肉生長抑制素訊號傳導抑制劑

<130> G2319WO

<150> GB 1821269.6

<151> 2018-12-28

<160> 112

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 144

<212> RNA

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 144

<212> RNA

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 149

<212> RNA

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 115

<212> RNA

<213> 智人

<400> 4

<210> 5

<211> 139

<212> RNA

<213> 智人

<400> 5

<210> 6

<211> 131

<212> RNA

<213> 智人

<400> 6

<210> 7

<211> 195

<212> RNA

<213> 智人

<400> 7

<210> 8

<211> 11782

<212> RNA

<213> 智人

<400> 8

<210> 9

<211> 1065

<212> RNA

<213> 智人

<400> 9

<210> 10

<211> 1539

<212> DNA

<213> 智人

<400> 10

<210> 11

<211> 512

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 12

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 13

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 14

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 15

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 16

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成核酸

<400> 17

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 18

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成核酸

<400> 19

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成核酸

<400> 20

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<212> DNA

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<223> 合成核酸

<400> 21

<210> 22

<211> 24

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<213> 人工

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<223> 合成核酸

<400> 22

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<212> DNA

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<223> 合成核酸

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<223> 合成核酸

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<210> 25

<211> 24

<212> DNA

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<223> 合成核酸

<400> 25

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<212> DNA

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<223> 合成核酸

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<210> 27

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<223> 合成核酸

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<223> 合成核酸

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<223> 合成核酸

<400> 30

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<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成核酸

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<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成核酸

<400> 32

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 33

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 34

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 35

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 36

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 37

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 38

<210> 39

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<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成核酸

<400> 39

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成核酸

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<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成核酸

<400> 41

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成核酸

<400> 42

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成核酸

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

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<223> 合成核酸

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<212> DNA

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<223> 合成核酸

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<223> 合成核酸

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<212> DNA

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<223> 合成核酸

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<223> 合成核酸

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<212> DNA

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<223> 合成核酸

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<212> DNA

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<223> 合成核酸

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<212> DNA

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<223> 合成核酸

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<223> 合成核酸

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<212> DNA

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<223> 合成核酸

<400> 55

<210> 56

<211> 24

<212> DNA

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<223> 合成核酸

<400> 56

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<212> DNA

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<223> 合成核酸

<400> 57

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<223> 合成核酸

<400> 58

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<212> DNA

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<223> 合成核酸

<400> 59

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<212> DNA

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<223> 合成核酸

<400> 60

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<223> 合成核酸

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<223> 合成核酸

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<223> 合成核酸

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<210> 64

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<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 64

<210> 65

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 65

<210> 66

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 66

<210> 67

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 67

<210> 68

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 68

<210> 69

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 69

<210> 70

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 70

<210> 71

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 71

<210> 72

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 72

<210> 73

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 73

<210> 74

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 74

<210> 75

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 75

<210> 76

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 76

<210> 77

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 77

<210> 78

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 78

<210> 79

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 79

<210> 80

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 80

<210> 81

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 81

<210> 82

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 82

<210> 83

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 83

<210> 84

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 84

<210> 85

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 85

<210> 86

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 86

<210> 87

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 87

<210> 88

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 88

<210> 89

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 89

<210> 90

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 90

<210> 91

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 91

<210> 92

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 92

<210> 93

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 93

<210> 94

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 94

<210> 95

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 95

<210> 96

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 96

<210> 97

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 97

<210> 98

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 98

<210> 99

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 99

<210> 100

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 100

<210> 101

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 101

<210> 102

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 102

<210> 103

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 103

<210> 104

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 104

<210> 105

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 105

<210> 106

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 106

<210> 107

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 107

<210> 108

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 108

<210> 109

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 109

<210> 110

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 110

<210> 111

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 111

<210> 112

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 112

Claims (33)

1. 一種化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，係能夠使目標細胞產生突變的活化素受體2B型(ACVR2B)mRNA，該突變的活化素受體2B型(ACVR2B)mRNA中不存在編碼野生型ACVR2B之一些或全部細胞內區域的部分序列。
2. 如申請專利範圍第1項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其中，該野生型ACVR2B之細胞內區域係由野生型ACVR2B之外顯子5至11編碼。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其係能夠使該目標細胞產生截斷ACVR2B蛋白，該截斷ACVR2B蛋白缺少該野生型ACVR2B之部分細胞內區域。
4. 如申請專利範圍第3項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其中，該截斷ACVR2B蛋白缺少由至少一個選自由ACVR2B之外顯子5、6、7、8、9及10所組成群組之外顯子所編碼之全部或部分細胞內區域。
5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其為能夠誘發用於編碼ACVR2B之部分細胞內區域之外顯子跳躍(skipping)之反義寡聚物。
6. 如申請專利範圍第5項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其中，該被跳躍的外顯子係選自由ACVR2B之外顯子5、6、7、8、9及10所組成群組。
7. 如申請專利範圍第5或6項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其係包括10至50個核鹼基。
8. 如申請專利範圍第5至7項中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其係包括與選自由ACVR2B之外顯子5、6、7、8、9及10所組成群組之外顯子的10至50個連續核苷酸互補之序列。
9. 如申請專利範圍第5至8項中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其中，該外顯子包含選自由SEQ ID NO：1至6所組成群組之序列。
10. 如申請專利範圍第5至9項中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其係包括選自由SEQ ID NO：12至36及43至111所組成群組之核苷酸序列。
11. 如申請專利範圍第5至10項中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其係由選自由SEQ ID NO：12至36及43至111所組成群組之核苷酸序列組成。
12. 如申請專利範圍第5至11項中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其中，該反義寡聚物係寡核苷酸。
13. 如申請專利範圍第12項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其中，該寡核苷酸中之至少一個糖部分及/或至少一個磷酸酯鍵部分係經修飾。
14. 如申請專利範圍第13項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其中，該經修飾之糖部分為核糖，在該核糖中，2’-位置的-OH基經選自由OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br及I所組成群組中之任意基團取代，其中，R表示烷基或芳基，R’表示伸烷基。
15. 如申請專利範圍第13或14項所述之化合物或其醫藥上可接受之 鹽或水合物，其中，該經修飾之磷酸酯鍵部分係選自由硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基磷酸酯鍵、胺基磷酸酯鍵及硼烷磷酸酯所組成群組之一者。
16. 如申請專利範圍第5至11項中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其中，該反義寡聚物係包括至少一個嗎啉環。
17. 如申請專利範圍第16項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其係嗎啉代寡聚物或磷酸二胺基二酯嗎啉代寡聚物。
18. 如申請專利範圍第16或17項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，該化合物係在其5’端具有由如下所示的化學式(1)至(3)表示的任何一個基團，

    
19. 一種化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，其係細胞穿透肽與申請專利範圍第1至18項中任一項所述之化合物鍵結成之接合物。
20. 一種醫藥組成物，其係包括申請專利範圍第1至19項中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物。
21. 如申請專利範圍第20項所述之醫藥組成物，其更包含至少一種醫藥上可接受之載體或添加劑。
22. 如申請專利範圍第20或21項所述之醫藥組成物，其係經冷凍乾 燥。
23. 如申請專利範圍第1至19項中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，或如申請專利範圍第項20至22中任一項所述之醫藥組成物，其係用於對象主體之療法。
24. 如申請專利範圍第23項所述之用於對象主體之療法的化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物、或用於對象主體之療法的醫藥組成物，其中，該療法係預防或治療對象主體之肌萎縮性疾病、肌肉萎縮症或肌少症。
25. 如申請專利範圍第24項所述之用於對象主體之療法的化合物或醫藥上可接受之鹽或水合物、或用於對象主體之療法的醫藥組成物，其中，該肌萎縮性疾病係杜興氏肌肉失養症。
26. 如申請專利範圍第23至25項中任一項所述之用於對象主體之療法的化合物或醫藥上可接受之鹽或水合物、或用於對象主體之療法的醫藥組成物，其中，該對象主體係人類。
27. 一種用於治療對象主體之肌萎縮性疾病、肌肉萎縮症或肌少症之方法，其包括向該對象主體投予治療有效量之申請專利範圍第1至19項中任一項所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽或水合物，或申請專利範圍第20至22項中任一項所述之醫藥組成物。
28. 如申請專利範圍第27項所述之方法，其中，該肌萎縮性疾病係杜興氏肌肉失養症。
29. 如申請專利範圍第27或28項所述之方法，其中，該對象主體係人類。
30. 一種申請專利範圍第1至19項中任一項所述之化合物或其醫藥 上可接受之鹽或水合物之用途，係用以製備預防或治療對象主體之肌萎縮性疾病、肌肉萎縮症或肌少症的藥劑。
31. 如申請專利範圍第30項所述之用途，其中，該肌萎縮性疾病係杜興氏肌肉失養症。
32. 如申請專利範圍第30或31項所述之用途，其中，該對象主體係人類。
33. 一種基因操作動物，其係表現突變型活化素受體2B型(ACVR2B)mRNA，該突變型活化素受體2B型(ACVR2B)mRNA中不存在編碼野生型ACVR2B的一些或全部細胞內區域的部分序列。

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