JP2022516207A - マイオスタチンシグナル阻害剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、ｍＲＮＡレベルでＡＣＶＲ２Ｂを標的とすることによってマイオスタチンシグナル伝達を阻害するための新しいアプローチを提供する。【選択図】なし

Description

ＧＤＦ８としても知られるマイオスタチンは、ＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する新規サイトカインとして１９９７年に発見された。マイオスタチンの組織発現は、運動および代謝活性を担う主要組織である骨格筋に特異的である。マイオスタチン欠損変異を有する動物は有意な筋肥大を示し、骨格筋の量が野生型対応動物の大きさの２倍に増加する（McPherron et al., Nature. 387(6628):83-90, 1997）。この観察に基づいて、マイオスタチンは骨格筋体積を制御する重要な因子として作用すると考えられる。

マイオスタチンがそのシグナルを細胞の内部に伝達した場合、他のＴＧＦ－βと同様のプロセスを経て、最初にＩＩ型受容体に結合し、次にＩ型受容体と結合してリガンド－受容体複合体を形成する。このプロセスを通じて、各受容体はその細胞内ドメイン（intercellular domain）上でリン酸化を受け、Ｓｍａｄ依存性またはＳｍａｄ非依存性経路を介してシグナル伝達を生じる（Chang et al., Endocrine Reviews. 23(6):787-823, 2002）。Ｉ型受容体とＩＩ型受容体の両方は、それぞれ複数の遺伝子にコードされる。ＴＧＦ－βスーパーファミリーに属する各分子は、特異的な受容体の組み合わせに結合する。マイオスタチンは、Ｉ型受容体としてはＡＬＫ４またはＡＬＫ５と、ＩＩ型受容体としてはＡＣＶＲ２Ｂとの組み合わせに結合する。しかしながら、前記の組み合わせはマイオスタチンに限定されず、ＧＤＦ１１、アクチビンＡなどを含むいくつかの他のＴＧＦ－βスーパーファミリー分子によって使用される（Wakefield and Hill. Nat Rev Cancer.13(5):328-41, 2013, doi:10.1038/nrc3500）。したがって、ＡＣＶＲ２Ｂ／ＡＬＫ４またはＡＣＶＲ２Ｂ／ＡＬＫ５へのマイオスタチン以外のリガンドの結合は、マイオスタチン結合と同様に筋体積への抑制シグナルの伝達を引き起こす可能性がある。実際に、マイオスタチン遺伝子を欠損したマウスに、膜貫通ドメインおよびその下流領域が抗体－Ｆｃドメインで置換されているＡＣＶＲ２Ｂまたは可溶性ＡＣＶＲ２Ｂに対する中和抗体を投与すると、マイオスタチン欠損によって引き起こされる増加に加えて筋体積がさらに増加することが報告されている（Lach-Trifilieff et al., Mol Cell Biol. 34(4):606-18, 2014. doi: 10.1128/MCB.01307-13; Lee et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 102(50):18117-22, 2005を参照されたい）。このさらなる増加は、ＡＣＶＲ２Ｂに結合することによって筋体積を抑制するマイオスタチンに対する追加の因子が存在することを示唆する。

マイオスタチンシグナル伝達を低下させる手段は、特定の筋肉消耗および他の筋肉関連疾患の治療または予防に有用である可能性がある。本発明は、ｍＲＮＡレベルでＡＣＶＲ２Ｂを標的とすることによってマイオスタチンシグナル伝達を阻害するための新しいアプローチを提供する。

本発明の第１の態様によれば、野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部または全部をコードするｍＲＮＡ配列の一部が存在しない変異型アクチビン受容体２Ｂ型（ＡＣＶＲ２Ｂ）ｍＲＮＡを標的細胞が産生することを可能にすることができる化合物が提供される。

本発明の第１の態様のバリエーションによれば、野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部を欠く切断型バージョンとしてアクチビン受容体２Ｂ型（ＡＣＶＲ２Ｂ）タンパク質の産生を引き起こすことができる化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物が提供される。

特定の実施形態では、化合物は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９および１０のうちの１つ以上のエクソンスキッピングをもたらすことができるオリゴヌクレオチドである。

本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を含む医薬組成物が提供される。

本発明の第３の態様によれば、療法に使用するための、本発明の第１の態様の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、あるいは本発明の第２の態様の医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、療法は、筋消耗性疾患、サルコペニア性疾患または筋萎縮性疾患、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィーの予防または治療である。

本発明の第４の態様によれば、ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部を欠く変異型ＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡを発現する遺伝子操作された動物が提供される。

本発明の特定の態様および実施形態は、以下を含む：
［１］野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部もしくは全部をコードする配列の一部が存在しない変異型アクチビン受容体２Ｂ型（ＡＣＶＲ２Ｂ）ｍＲＮＡを標的細胞が産生することを可能にすることができる化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［２］野生型ＡＣＶＲ２Ｂの前記細胞内領域が野生型ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５～１１によってコードされる、［１］に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［３］野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部を欠く切断型ＡＣＶＲ２Ｂタンパク質を標的細胞に産生させることができる、［１］または［２］に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［４］切断型ＡＣＶＲ２Ｂタンパク質が、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンによってコードされる細胞内領域の全部または一部を欠いている、［３］に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［５］ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部をコードするエクソンのスキップを誘導することができるアンチセンスオリゴマーである、［１］～［３］のいずれか一つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［６］スキップされる前記エクソンが、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される、［５］に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［７］１０～５０個の核酸塩基を含む、［５］または［６］に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［８］ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９および１０からなる群から選択されるエクソンの１０～５０個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含む、［５］～［７］のいずれか一つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［９］エクソンが、配列番号１～６からなる群から選択される配列を含む、［５］～［８］のいずれか一つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［１０］配列番号１２～３６および４３～１１１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、［５］～［９］のいずれか一つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［１１］配列番号１２～３６および４３～１１１からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、［５］～［１０］のいずれか一つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［１２］アンチセンスオリゴマーがオリゴヌクレオチドである、［５］～［１１］のいずれか一つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［１３］オリゴヌクレオチドにおける少なくとも１つの糖部分および／または少なくとも１つのリン酸結合部分が修飾されている、［１２］に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［１４］修飾された糖部分が、２’位の－ＯＨ基が、ＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、Ｎ_３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ（Ｒはアルキルまたはアリールを表し、Ｒ’はアルキレンを表す）からなる群から選択されるいずれかの基で置換されているリボースである、［１３］に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［１５］修飾されたリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合およびボラノホスフェート結合からなる群から選択される、［１３］または［１４］に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［１６］アンチセンスオリゴマーが少なくとも１つのモルホリノ環を含む、［５］～［１１］のいずれか一つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［１７］モルホリノオリゴマーまたはホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、［１６］に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［１８］下記の化学式（１）～（３）

で表される基のいずれか１つをその５’末端に有する、［１６］または［１７］に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［１９］［１］～［１８］のいずれか一つに記載の化合物に細胞浸透性ペプチドが結合されたコンジュゲートである化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
［２０］［１］～［１９］のいずれか一つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を含む医薬組成物。
［２１］少なくとも１つの薬学的に許容される担体または添加剤をさらに含む、［２０］に記載の医薬組成物。
［２２］凍結乾燥されている、［２０］または［２１］に記載の医薬組成物。
［２３］対象における療法に使用するための、［１］～［１９］のいずれか一つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、あるいは［２０］～［２２］のいずれか一つに記載の医薬組成物。
［２４］療法は、対象における筋萎縮性疾患、筋肉消耗性疾患もしくはサルコペニア性疾患の予防または治療である、［２３］に記載の使用のための化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、あるいは［２３］に記載の使用のための医薬組成物。
［２５］筋萎縮性疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、［２４］に記載の使用のための化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、あるいは［２４］に記載の使用のための医薬組成物。
［２６］対象がヒトである、［２３］～［２５］のいずれか一つに記載の使用のための化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、あるいは［２３］～［２５］のいずれか一つに記載の使用のための医薬組成物。
［２７］対象における筋萎縮性疾患、筋消耗性疾患またはサルコペニア性疾患を治療する方法であって、［１］～［１９］のいずれか一つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物の治療有効量、あるいは［２０］～［２２］のいずれか一つに記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
［２８］筋萎縮性疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、［２７］に記載の方法。
［２９］対象がヒトである、［２７］または［２８］に記載の方法。
［３０］対象における筋萎縮性疾患、筋消耗性疾患、またはサルコペニア性疾患を予防または治療するための医薬の製造における、［１］～［１９］のいずれか一つに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物の使用。
［３１］筋萎縮性疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、［３０］に記載の使用。
［３２］対象がヒトである、［３０］または［３１］に記載の使用。
［３３］野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部または全部をコードする配列の一部が存在しない、変異型アクチビン受容体２Ｂ型（ＡＣＶＲ２Ｂ）ｍＲＮＡを発現する遺伝子操作された動物。

示されたホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）（ａおよびｂ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴヌクレオチド（ｃ）またはＰＭＯ－ペプチドコンジュゲート（ｄ）による各エクソンのスキッピング効率（％）を示す図である。 切断型ＡＣＶＲ２Ｂの発現によるマイオスタチンシグナル伝達の抑制を示し、切断型ＡＣＶＲ２Ｂは、内因性の野生型ＡＣＶＲ２Ｂよりも優位に発現されることを示す図である。 マイオスタチンシグナル強度の指標として作用するＳＭＡＤ７ ｍＲＮＡ発現の抑制を示す図である。

本発明は、以下により詳細に説明される。以下の実施形態は、例示としてのみ本発明を説明することを意図したものであり、本発明をこれらの実施形態のみに限定することを意図したものではない。本発明は、本発明の精神から逸脱することなく、種々のモードで実施することができる。ヌクレオチド配列は、５’末端が左端に、３’末端が右端に配置されるように提示される。アミノ酸配列は、Ｎ末端が左端に、Ｃ末端が右端に配置されるように提示される。

化合物
本発明は、野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部もしくは全部をコードするｍＲＮＡ配列の一部が存在しない変異型アクチビン受容体型２Ｂ（ＡＣＶＲ２Ｂ）ｍＲＮＡを標的細胞が産生することを可能にすることができる化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を提供する。

ＡＣＶＲ２Ｂタンパク質は、ＡｃｔＲＩＩＢとしても公知であり、５１２個のアミノ酸からなる。ＡＣＶＲ２Ｂの細胞遺伝学的地図の位置は、３ｐ２２－ｐ２１．３である。ＡＣＶＲ２Ｂは、３つの主要ドメインである細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内セリン／トレオニンキナーゼドメインからなる。Ishikawa et al. (Journal of Human Genetics volume 43, pages 132-134 (1998))は、ＡＣＶＲ２Ｂ遺伝子は１１個のエクソンを含み、約３０ｋｂに及ぶことを報告した。野生型ヒトＡＣＶＲ２Ｂ（以下「野生型ＡＣＶＲ２Ｂ」と称する）のｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００１１０６．４および本明細書中の配列番号８に開示される。

ヒトＡＣＶＲ２Ｂの代表的なコード配列（ＣＤＳ）を配列番号１０に示す。ＡＣＶＲ２Ｂ ＣＤＳのヌクレオチド配列は、配列番号１０として示されるものに限定されず、配列番号１０の長さの９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％を有するバリアント配列を含み、配列番号１０に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性を有する。

ヒトＡＣＶＲ２Ｂタンパク質の代表的なアミノ酸配列を配列番号１１に示す。ＡＣＶＲ２Ｂタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１として示されるものに限定されず、配列番号１１の長さの９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％を有し、配列番号１１に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性を有するバリアント配列を含む。

本発明の化合物がＡＣＶＲ２Ｂを発現する細胞に提供される場合、それは、野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部または全部をコードするｍＲＮＡ配列の一部が存在しない変異型ＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡの、細胞による産生を引き起こす。「野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部または全部をコードするｍＲＮＡ配列の一部が存在しない変異型ＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡ」（以下、「本発明の変異型ＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡ」と称する）とは、野生型ＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡにおいて見出される配列の一部を欠く変異型／バリアントＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡであって、野生型ＡＣＶＲ２Ｂとの比較において存在しない前記配列が野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部または全部をコードする変異型／バリアントＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡを意味するか、または野生型ＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡに見出される、野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部または全部をコードする配列の一部を欠く変異型ＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡを意味する。

ヒトＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域は、Ｎ末端側から１５９～５１２番目のアミノ酸からなる。代表的な野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部または全部をコードするｍＲＮＡ配列を配列番号９に示す。

本発明の変異型ＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡは、配列番号９の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、８００、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、８２６、８２７、８２８、８２９、８３０、８３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８４５、８４６、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６０、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８６９、８７０、８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８３、８８４、８８５、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８９２、８９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、９００、９０１、９０２、９０３、９０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９１６、９１７、９１８、９１９、９２０、９２１、９２２、９２３、９２４、９２５、９２６、９２７、９２８、９２９、９３０、９３１、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１、９７２、９７３、９７４、９７５、９７６、９７７、９７８、９７９、９８０、９８１、９８２、９８３、９８４、９８５、９８６、９８７、９８８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、９９４、９９５、９９６、９９７、９９８、９９９、１０００、１００１、１００２、１００３、１００４、１００５、１００６、１００７、１００８、１００９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０、１０２１、１０２２、１０２３、１０２４、１０２５、１０２６、１０２７、１０２８、１０２９、１０３０、１０３１、１０３２、１０３３、１０３４、１０３５、１０３６、１０３７、１０３８、１０３９、１０４０、１０４１、１０４２、１０４３、１０４４、１０４５、１０４６、１０４７、１０４８、１０４９、１０５０、１０５１、１０５２、１０５３、１０５４、１０５５、１０５６、１０５７、１０５８、１０５９、１０６０、１０６１、１０６２、１０６３、１０６４または１０６５ヌクレオチドを欠く場合がある。

本明細書の実施例のセクションで実証されるように、ｍＲＮＡレベルでのヒトＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の破壊は、マイオスタチンシグナル伝達を効率的に減少させる。したがって、ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域は、マイオスタチンシグナルを破壊する良好な標的である。

一実施形態では、本発明の化合物は、野生型ＡＣＶＲ２Ｂタンパク質の細胞内領域の一部、例えば、配列番号１１の中の配列を有するものを欠く切断型ＡＣＶＲ２Ｂタンパク質の、標的細胞による産生を引き起こすことができる。

本明細書で使用される場合、「野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部を欠く切断型ＡＣＶＲ２Ｂタンパク質」（以下、「ＡＣＶＲ２Ｂタンパク質の切断型バージョン」または「切断型ＡＣＶＲ２Ｂタンパク質」と称する）とは、野生型ＡＣＶＲ２Ｂの前記細胞内領域の中の少なくとも１つのアミノ酸を欠く任意の切断型バージョンのＡＣＶＲ２Ｂタンパク質を指す。野生型ＡＣＶＲ２Ｂに比べて存在しないＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の部分は、野生型ＡＣＶＲ２Ｂに存在するが、切断型ＡＣＶＲ２Ｂには存在しない１つ以上のアミノ酸を指す。例えば、ＡＣＶＲ２Ｂタンパク質の切断型バージョンは、野生型ＡＣＶＲ２Ｂタンパク質、例えば、配列番号１１として示されるものに見出される細胞内領域の１個のアミノ酸、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、または３５４個のアミノ酸を欠く場合がある。明らかであるとおり、切断型バージョン／バリアントは、単に、タンパク質のカルボキシ末端またはアミノ末端から除去された１つ以上のアミノ酸を有するバージョンをカバーするだけでなく、ＡＣＶＲ２Ｂタンパク質内から１つ以上のアミノ酸を欠くバリアントもまたカバーする。

切断型バージョンにおいて存在しないまたは欠いているＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の部分は、野生型ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９、１０および１１からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの全部または一部によってコードされる。

本明細書で使用される場合、「切断型バージョンとしてのＡＣＶＲ２Ｂタンパク質の産生を引き起こすことができる」とは、本発明の化合物が、本明細書でより十分に説明されるように、化合物が添加された細胞が切断型ＡＣＶＲ２Ｂを合成または産生することを可能にすることを意味する。

ＡＣＶＲ２Ｂの細胞外領域および膜貫通領域が依然として存在するため、本発明のＡＣＶＲ２Ｂの切断型バージョンは、その天然リガンドに結合し得るが、マイオスタチンリガンドの結合に関しては、マイオスタチンシグナルの伝達効率は、野生型ＡＣＶＲ２Ｂのものと比較して減少し得る。ＡＣＶＲ２Ｂに結合し得る天然リガンドの例としては、アクチビン－Ａ、アクチビン－Ｂ、ＧＤＦ１、ＧＤＦ３、ＮＯＤＡＬ、ＧＤＦ１１、マイオスタチン（ＧＤＦ８としても公知である）、ＢＭＰ２、ＢＭＰ５、ＧＤＦ５（ＢＭＰ１４としても知られる）、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７およびＢＭＰ８が挙げられる。リガンドの好ましい例は、ＧＤＦ８としても知られるマイオスタチンである。

本明細書で使用される場合、シグナルの「伝達」は、シグナルに関連する下流因子を活性化することによって、またはシグナルに関連する下流因子を不活性化することによって、シグナルを中継することを意味することが意図される。

特定の実施形態では、本発明のＡＣＶＲ２Ｂタンパク質の切断型バージョンは、マイオスタチンに結合することができる。

本発明の切断型ＡＣＶＲ２Ｂタンパク質は、リガンドのＡＣＶＲ２Ｂへの結合時にシグナルを伝達するが、野生型ＡＣＶＲ２Ｂよりも強度は低い。一実施形態では、切断型ＡＣＶＲ２Ｂタンパク質は、マイオスタチンのそれへの結合時に、野生型ＡＣＶＲ２Ｂよりも低い強度でマイオスタチンシグナルを伝達する。本明細書で使用される場合、用語「野生型ＡＣＶＲ２Ｂよりも低い強度」とは、シグナル強度（シグナル能力）が、同リガンドの野生型ＡＣＶＲ２Ｂへの結合によって伝達されたシグナル強度と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％減少することを指す。シグナル強度は、伝達されたシグナルによってその発現が誘発される１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを定量することによって間接的に決定することができる。例えば、マイオスタチン誘発性シグナル伝達のシグナル強度は、ＳＭＡＤ７のｍＲＮＡ発現レベルを測定することによって評価することができる。この場合、本発明の化合物は、マイオスタチンシグナルの強度を、野生型ＡＣＶＲ２Ｂのマイオスタチンシグナル伝達に起因するものと比較して、ＳＭＡＤ７のｍＲＮＡ発現レベルの１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の減少と相関するレベルまで減少させることができる。

別の実施形態では、本発明の変異型ＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡは、フレームシフト変異のために、野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部または全部をコードする配列の一部を欠いてもよい。このようなフレームシフト変異は、野生型ｍＲＮＡとは異なるリーディングフレームをその下流に生成することができる。したがって、この場合、本発明の変異型ＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡは、野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部または全部をコードする配列の一部を欠く。

このようなフレームシフトにより、本発明の変異型ＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡは、ＡＣＶＲ２Ｂのナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊（ＮＭＤ）を経ることもできる。ＮＭＤは、全ての真核生物が有するｍＲＮＡの品質を制御する機構であり、典型的には変異によって引き起こされる、元の終止コドンの上流（５’末端に向かって）の位置に終止コドンを有する異常なｍＲＮＡを破壊する。一部のエクソン、特に３ヌクレオチドの非倍数の長さの配列を有するエクソン（すなわち、Ｎが所与の整数である３Ｎではない）がスキップされた場合、トリプレットの翻訳フレームがシフトされ、これは、元の終止コドンの上流に新規の終止コドンを生成し得る。例えば、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン８がスキップされた場合、エクソン７と９は直接接続される。エクソン７および９の接続におけるリーディングフレーム、「ＡＧ／ＧＴＡＧ」は、エクソン７の最も３’末端の２ヌクレオチド、すなわち「ＡＧ」と、エクソン９の最も５’末端の４ヌクレオチド、すなわち「ＧＴＡＧ」で構成される。ＡＧＧ ＴＡＧはアルギニン（Ａｒｇ）および終止コドンをコードし、ナンセンス変異様ｍＲＮＡを生成する。このような変異ｍＲＮＡは、次に、ＮＭＤによって破壊され得る。一方、野生型ＡＣＶＲ２Ｂでは、エクソン７および８の接続部に位置するリーディングフレーム「ＡＧ／ＧＧＡＵ」は、エクソン７の最も３’末端の２ヌクレオチド、すなわち「ＡＧ」、およびエクソン８の最も５’末端の４ヌクレオチド、すなわち「ＧＧＡＵ」で構成される。ＡＧＧ ＧＡＵはアルギニン（Ａｒｇ）およびアスパラギン酸（Ａｓｐ）をコードする。

フレームシフトのために新たな終止コドンが生成される状況では、本発明の変異型ＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡが生成されるが、次に、典型的には、ＮＭＤを介して分解／減衰される。

本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、本発明の化合物が導入され、ＡＣＶＲ２Ｂ（例えば、野生型ＡＣＶＲ２Ｂ）を発現する任意の細胞であり得る。標的細胞の例としては、筋細胞、筋芽細胞、または筋管細胞が挙げられる。一実施形態では、標的細胞は動物細胞である。別の実施形態では、標的細胞は哺乳動物細胞である。別の実施形態では、標的細胞はヒト細胞である。

本発明の化合物は、野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部を欠く切断型バージョンとしてＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の産生を引き起こすことができる任意の化合物である。本発明の適切な化合物の例としては、適切なエンドヌクレアーゼにより、その細胞内領域の一部をコードするＡＣＶＲ２Ｂ遺伝子の一部を切り出し／除去することができるＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９ガイドＲＮＡ配列、細胞内領域ＡＣＶＲ２Ｂの一部をコードする少なくとも１つのエクソンをスキップするためのアンチセンスオリゴマー、およびその細胞内領域の一部をコードするＡＣＶＲ２Ｂ遺伝子の一部をノックアウトするためのｌｏｘＰ系化合物が挙げられる。

当業者には理解されるように、ＴＡＬＥＮまたは亜鉛フィンガー（ＺＦＮ）などの他の周知の遺伝子編集技術を用いて、本発明のＡＣＶＲ２Ｂの切断型バージョンを生成することもできる。

ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９を用いてマイオスタチンシグナルを阻害する場合、ＡＣＶＲ２ＢまたはＡＣＶＲ２Ｂの一部（例えば、野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域）をコードするゲノムＤＮＡの標的配列に相補的な配列を有するガイドＲＮＡを標的細胞に導入し、それによって切断される標的配列を同定する。標的細胞に導入されたＣａｓ９タンパク質は、ゲノムＤＮＡおよびガイドＲＮＡで構成される二本鎖部分を切断する。切断部位を修復するプロセスを通じて、変異（複数可）は、ヌクレオチドの欠失および／または挿入によって引き起こされ、それによってＡＣＶＲ２Ｂの全部または一部のノックアウトを引き起こす。ゲノムＤＮＡの標的配列の例としては、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソンの任意の配列、例えばＡＣＶＲ２Ｂのエクソン１～１１が挙げられる。適切には、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９、１０および１１からなる群、またはＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。一実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、９および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、９および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５および６からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン７、８および９からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン７および８からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５である。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン６である。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン７である。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン８である。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン９である。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン１０である。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン１１である。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン７、８、９および１０からなる群、またはＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンのいずれかの配列を含む。あるいは、イントロンは、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９によって標的化され得る。例えば、エクソン８をサンドイッチするイントロン７および８を切断することができる。切断された部位が修復される場合、エクソン８が不存在になり、エクソン８が欠失した変異型ｍＲＮＡを生じることができる。同様に、イントロン４および５、またはイントロン５および６、またはイントロン６および７、またはイントロン８および９、またはイントロン９および１０、またはイントロン１０および１１を標的化して、切断することができる。したがって、本発明の化合物は、上記されるＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９のためのガイドＲＮＡ、またはその転写物としてガイドＲＮＡを提供するＤＮＡ（例えば、発現プラスミド）、またはＣＡＳ９（もしくはＣａｓ９様）タンパク質、またはＣＡＳ９（もしくはＣａｓ９様）タンパク質をコードし、提供するＤＮＡ（例えば、発現プラスミド）、またはそれらの組み合わせであり得る。

ｓｉＲＮＡを用いてマイオスタチンシグナルを阻害した場合、ＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡの配列を標的とするように設計されたｓｉＲＮＡが標的細胞に導入される。このように導入されたｓｉＲＮＡのガイド鎖が標的配列にハイブリダイズした場合、標的細胞中の内因性ＲＩＳＣタンパク質は、ガイド鎖および標的ｍＲＮＡ鎖で構成される二本鎖部分を同定し、ｍＲＮＡの標的配列を切断する。そうすることにより、ＡＣＶＲ２Ｂタンパク質レベルが減少する。したがって、別の実施形態では、本発明の化合物は、ｓｉＲＮＡまたはその転写物としてｓｉＲＮＡを提供するＤＮＡ（発現プラスミドなど）であり得る。

アンチセンスオリゴマー
変異型ＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡはまた、細胞を、タンパク質の細胞内領域をコードする１つ以上のＡＣＶＲ２Ｂエクソンのエクソンスキップを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）に接触させることによって細胞内で産生され得る。

一実施形態では、本発明の化合物は、ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部をコードするエクソンのスキッピングを誘導することができるアンチセンスオリゴマー（以下、「本発明のアンチセンスオリゴマー」または「アンチセンスオリゴマー」と称する）である。適切には、スキップされるエクソンは、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９、１０および１１からなる群、またはＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９および１０からなる群から選択されるものである。一実施形態では、スキップされるエクソンは、エクソン５、６、７、９および１０からなる群から選択されるものである。別の実施形態では、スキップされるエクソンはエクソン５である。さらに別の実施形態では、スキップされるエクソンはエクソン６である。さらに別の実施形態では、スキップされるエクソンはエクソン７である。さらに別の実施形態では、スキップされるエクソンはエクソン８である。さらに別の実施形態では、スキップされるエクソンはエクソン９である。さらに別の実施形態では、スキップされるエクソンはエクソン１０である。さらに別の実施形態では、スキップされるエクソンはエクソン１１である。さらに別の実施形態では、スキップされるエクソンは、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン７、８、９および１０からなる群、またはＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９および１０からなる群から選択されるものである。

エクソン５、６、７、８、９、１０および１１の代表的なヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１、２、３、４、５、６および７として示されるものである。エクソン５、６、７、８、９、１０および１１のヌクレオチド配列は、配列番号１、２、３、４、５、６および７として示されるものに限定されず、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、６および７の長さの９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の長さを有し、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、６および７に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性を有するバリアント配列を含む。

用語「ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部をコードするエクソンのスキッピングを誘導することができる」とは、本発明のアンチセンスオリゴマーが、ＡＣＶＲ２Ｂ遺伝子（例えば、ヒトＡＣＶＲ２Ｂ遺伝子）の転写物（例えば、プレｍＲＮＡ）の細胞内領域の一部をコードするエクソンのその標的部位に結合した後、前記エクソンがスプライシングされることを意味する。例えば、本発明のアンチセンスオリゴマーがＡＣＶＲ２ＢプレｍＲＮＡのエクソン６の一部に結合する場合、エクソン６の下流のエクソン、すなわちエクソン７の５’末端に対応するヌクレオチド配列は、エクソン６の上流のエクソン、すなわちエクソン５の３’末端に対応するヌクレオチド配列でスプライシングされる。これは、本発明のアンチセンスオリゴマーの結合に続く正常なスプライシング機構の破壊によって引き起こされる。次に、ｍＲＮＡによりコードされるＡＣＶＲ２Ｂポリペプチドは、エクソン７に接続されたエクソン５によりコードされるアミノ酸を含み、エクソン６によりコードされるものは、切断型ＡＣＶＲ２Ｂバリアントから省略される（存在しない）。

ここで、用語「結合」とは、本発明のアンチセンスオリゴマーが、ＡＣＶＲ２Ｂ遺伝子（例えば、ヒトＡＣＶＲ２Ｂ遺伝子）の転写物のコピーと接触（例えば、混合）された場合、相補配列が生理学的条件下でハイブリダイズし、二本鎖核酸を形成することを意味する。用語「生理学的条件下」とは、ｐＨ、塩組成および温度に関してインビボ環境を模倣する条件を指す。適切な条件は、以下の温度、ｐＨおよび塩濃度の任意の組み合わせであり得る。
温度：２５℃～４０℃、３５℃～３８℃、３６℃～３８℃、または３７℃；
ｐＨ：ｐＨ５～８、ｐＨ６～８、ｐＨ７～８、またはｐＨ７．４；および
塩濃度：１００～２００ｍＭ、１３０～１７０ｍＭ、１４０～１６０ｍＭ、または１５０ｍＭの塩化ナトリウム濃度。

本明細書で使用される場合、ヌクレオチド配列に関する「配列同一性」および「相同性」とは、配列をアライメントし、必要であれば最大の配列同一性パーセントを達成するためにギャップを許容し、配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮しないようにした後、対象ヌクレオチド配列中のヌクレオチド残基と同一である候補標的配列中のヌクレオチド残基のパーセンテージを指す。ヌクレオチド配列同一性パーセントを決定する目的でのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、ＡＬＩＧＮまたはＭＥＧＡＬＩＧＮＴＭ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当業者の技術の範囲内の種々の方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。例えば、２つ以上のヌクレオチド配列の配列同一性は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定することができる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮがヌクレオチド配列分析に使用される場合、パラメータは、例えば、スコア＝１００およびワード長＝１２に設定され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムが使用される場合、各プログラムのデフォルトパラメータを使用することができる。

本発明のアンチセンスオリゴマーは、オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、修飾を含み得るかまたは含み得ない、以下で定義される長さの連結ヌクレオチドの配列である。修飾オリゴヌクレオチドは、他の箇所に詳細に記載される。

本発明のアンチセンスオリゴマーは、その５’末端から３’末端に１０～７０ヌクレオチドの長さ、例えば１１～７０、１２～７０、１３～７０、１４～７０、１５～７０、１６～７０、１７～７０、１８～７０、１９～７０、２０～７０、２１～７０、２２～７０、２３～７０、２４～７０、２５～７０、１０～６５、１１～６５、１２～６５、１３～６５、１４～６５、１５～６５、１６～６５、１７～６５、１８～６５、１９～６５、２０～６５、２１～６５、２２～６５、２３～６５、２４～６５、２５～６５、１０～６０、１１～６０、１２～６０、１３～６０、１４～６０、１５～６０、１６～６０、１７～６０、１８～６０、１９～６０、２０～６０、２１～６０、２２～６０、２３～６０、２４～６０、２５～６０、１０～５５、１１～５５、１２～５５、１３～５５、１４～５５、１５～５５、１６～５５、１７～５５、１８～５５、１９～５５、２０～５５、２１～５５、２２～５５、２３～５５、２４～５５、２５～５５、１０～５０、１１～５０、１２～５０、１３～５０、１４～５０、１５～５０、１６～５０、１７～５０、１８～５０、１９～５０、２０～５０、２１～５０、２２～５０、２３～５０、２４～５０、２５～５０、１０～４５、１１～４５、１２～４５、１３～４５、１４～４５、１５～４５、１６～４５、１７～４５、１８～４５、１９～４５、２０～４５、２１～４５、２２～４５、２３～４５、２４～４５、２５～４５、１０～４０、１１～４０、１２～４０、１３～４０、１４～４０、１５～４０、１６～４０、１７～４０、１８～４０、１９～４０、２０～４０、２１～４０、２２～４０、２３～４０、２４～４０、２５～４０、１０～３８、１１～３８、１２～３８、１３～３８、１４～３８、１５～３８、１６～３８、１７～３８、１８～３８、１９～３８、２０～３８、２１～３８、２２～３８、２３～３８、２４～３８、２５～３８、１０～３６、１１～３６、１２～３６、１３～３６、１４～３６、１５～３６、１６～３６、１７～３６、１８～３６、１９～３６、２０～３６、２１～３６、２２～３６、２３～３６、２４～３６、２５～３６、１０～３５、１１～３５、１２～３５、１３～３５、１４～３５、１５～３５、１６～３５、１７～３５、１８～３５、１９～３５、２０～３５、２１～３５、２２～３５、２３～３５、２４～３５、２５～３５、１０～３４、１１～３４、１２～３４、１３～３４、１４～３４、１５～３４、１６～３４、１７～３４、１８～３４、１９～３４、２０～３４、２１～３４、２２～３４、２３～３４、２４～３４、２５～３４、１０～３３、１１～３３、１２～３３、１３～３３、１４～３３、１５～３３、１６～３３、１７～３３、１８～３３、１９～３３、２０～３３、２１～３３、２２～３３、２３～３３、２４～３３、２５～３３、１０～３２、１１～３２、１２～３２、１３～３２、１４～３２、１５～３２、１６～３２、１７～３２、１８～３２、１９～３２、２０～３２、２１～３２、２２～３２、２３～３２、２４～３２、２５～３２、１０～３０、１１～３０、１２～３０、１３～３０、１４～３０、１５～３０、１６～３０、１７～３０、１８～３０、１９～３０、２０～３０、２１～３０、２２～３０、２３～３０、２４～３０、２５～３０、１０～２９、１１～２９、１２～２９、１３～２９、１４～２９、１５～２９、１６～２９、１７～２９、１８～２９、１９～２９、２０～２９、２１～２９、２２～２９、２３～２９、２４～２９、２５～２９、１０～２８、１１～２８、１２～２８、１３～２８、１４～２８、１５～２８、１６～２８、１７～２８、１８～２８、１９～２８、２０～２８、２１～２８、２２～２８、２３～２８、２４～２８、２５～２８、１０～２７、１１～２７、１２～２７、１３～２７、１４～２７、１５～２７、１６～２７、１７～２７、１８～２７、１９～２７、２０～２７、２１～２７、２２～２７、２３～２７、２４～２７、２５～２７、１０～２６、１１～２６、１２～２６、１３～２６、１４～２６、１５～２６、１６～２６、１７～２６、１８～２６、１９～２６、２０～２６、２１～２６、２２～２６、２３～２６、２４～２６、２５～２６、１０～２５、１１～２５、１２～２５、１３～２５、１４～２５、１５～２５、１６～２５、１７～２５、１８～２５、１９～２５、２０～２５、２１～２５、２２～２５、２３～２５、２４～２５、１０～２４、１１～２４、１２～２４、１３～２４、１４～２４、１５～２４、１６～２４、１７～２４、１８～２４、１９～２４、２０～２４、２１～２４、２２～２４、２３～２４、１０～２３、１１～２３、１２～２３、１３～２３、１４～２３、１５～２３、１６～２３、１７～２３、１８～２３、１９～２３、２０～２３、２１～２３、２２～２３、１０～２２、１１～２２、１２～２２、１３～２２、１４～２２、１５～２２、１６～２２、１７～２２、１８～２２、１９～２２、２０～２２、２１～２２、１０～２１、１１～２１、１２～２１、１３～２１、１４～２１、１５～２１、１６～２１、１７～２１、１８～２１、１９～２１、２０～２１、１０～２０、１１～２０、１２～２０、１３～２０、１４～２０、１５～２０、１６～２０、１７～２０、１８～２０、１９～２０、１０～１９、１１～１９、１２～１９、１３～１９、１４～１９、１５～１９、１６～１９、１７～１９、１８～１９、１０～１８、１１～１８、１２～１８、１３～１８、１４～１８、１５～１８、１６～１８、１７～１８、１０～１７、１１～１７、１２～１７、１３～１７、１４～１７、１５～１７、１６～１７、１０～１６、１１～１６、１２～１６、１３～１６、１４～１６、１５～１６、１０～１５、１１～１５、１２～１５、１３～１５および１４～１５ヌクレオチドを有することができる（以下、「本発明のアンチセンスオリゴマーの例示的な長さ範囲」と称する）。本発明のアンチセンスオリゴマーは、その５’末端から３’末端に１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３３、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４４、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６６、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０ヌクレオチドの長さを有することができる（以下、「本発明のアンチセンスオリゴマーの例示的な長さ」と称する）。本発明のオリゴマーの長さに特に適した範囲は、その５’末端から３’末端に１５～４５、１７～３５、１５～２４、１５～２６、および２０～４０ヌクレオチドを含む。

本発明のアンチセンスオリゴマーは、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９、１０および１１からなる群、またはＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９および１０からなる群から選択されるエクソンのヌクレオチド配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９、１０および１１からなる群、またはＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９および１０からなる群から選択されるエクソンのヌクレオチド配列の一部は、本明細書では「標的配列」とも称する。エクソン５、６、７、８、９、１０および１１の代表的なヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１、２、３、４、５、６および７として示されるものである。エクソン５、６、７、８、９、１０および１１のヌクレオチド配列は、配列番号１、２、３、４、５、６および７として示されるものに限定されず、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、６および７のいずれかに開示される配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性を有するバリアント配列を含む。したがって、本発明の特定の実施形態によれば、本発明のオリゴマーは、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、６および７のいずれかに開示される配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性を有する配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。

標的配列は、それが本発明のアンチセンスオリゴマーの長さと同じであるかまたはそれよりも短い限り、任意の長さであり得る。例えば、標的配列は、５’末端から３’末端に１０～７０ヌクレオチドの長さ、例えば１１～７０、１２～７０、１３～７０、１４～７０、１５～７０、１６～７０、１７～７０、１８～７０、１９～７０、２０～７０、２１～７０、２２～７０、２３～７０、２４～７０、２５～７０、１０～６５、１１～６５、１２～６５、１３～６５、１４～６５、１５～６５、１６～６５、１７～６５、１８～６５、１９～６５、２０～６５、２１～６５、２２～６５、２３～６５、２４～６５、２５～６５、１０～６０、１１～６０、１２～６０、１３～６０、１４～６０、１５～６０、１６～６０、１７～６０、１８～６０、１９～６０、２０～６０、２１～６０、２２～６０、２３～６０、２４～６０、２５～６０、１０～５５、１１～５５、１２～５５、１３～５５、１４～５５、１５～５５、１６～５５、１７～５５、１８～５５、１９～５５、２０～５５、２１～５５、２２～５５、２３～５５、２４～５５、２５～５５、１０～５０、１１～５０、１２～５０、１３～５０、１４～５０、１５～５０、１６～５０、１７～５０、１８～５０、１９～５０、２０～５０、２１～５０、２２～５０、２３～５０、２４～５０、２５～５０、１０～４５、１１～４５、１２～４５、１３～４５、１４～４５、１５～４５、１６～４５、１７～４５、１８～４５、１９～４５、２０～４５、２１～４５、２２～４５、２３～４５、２４～４５、２５～４５、１０～４０、１１～４０、１２～４０、１３～４０、１４～４０、１５～４０、１６～４０、１７～４０、１８～４０、１９～４０、２０～４０、２１～４０、２２～４０、２３～４０、２４～４０、２５～４０、１０～３８、１１～３８、１２～３８、１３～３８、１４～３８、１５～３８、１６～３８、１７～３８、１８～３８、１９～３８、２０～３８、２１～３８、２２～３８、２３～３８、２４～３８、２５～３８、１０～３６、１１～３６、１２～３６、１３～３６、１４～３６、１５～３６、１６～３６、１７～３６、１８～３６、１９～３６、２０～３６、２１～３６、２２～３６、２３～３６、２４～３６、２５～３６、１０～３５、１１～３５、１２～３５、１３～３５、１４～３５、１５～３５、１６～３５、１７～３５、１８～３５、１９～３５、２０～３５、２１～３５、２２～３５、２３～３５、２４～３５、２５～３５、１０～３４、１１～３４、１２～３４、１３～３４、１４～３４、１５～３４、１６～３４、１７～３４、１８～３４、１９～３４、２０～３４、２１～３４、２２～３４、２３～３４、２４～３４、２５～３４、１０～３３、１１～３３、１２～３３、１３～３３、１４～３３、１５～３３、１６～３３、１７～３３、１８～３３、１９～３３、２０～３３、２１～３３、２２～３３、２３～３３、２４～３３、２５～３３、１０～３２、１１～３２、１２～３２、１３～３２、１４～３２、１５～３２、１６～３２、１７～３２、１８～３２、１９～３２、２０～３２、２１～３２、２２～３２、２３～３２、２４～３２、２５～３２、１０～３０、１１～３０、１２～３０、１３～３０、１４～３０、１５～３０、１６～３０、１７～３０、１８～３０、１９～３０、２０～３０、２１～３０、２２～３０、２３～３０、２４～３０、２５～３０、１０～２９、１１～２９、１２～２９、１３～２９、１４～２９、１５～２９、１６～２９、１７～２９、１８～２９、１９～２９、２０～２９、２１～２９、２２～２９、２３～２９、２４～２９、２５～２９、１０～２８、１１～２８、１２～２８、１３～２８、１４～２８、１５～２８、１６～２８、１７～２８、１８～２８、１９～２８、２０～２８、２１～２８、２２～２８、２３～２８、２４～２８、２５～２８、１０～２７、１１～２７、１２～２７、１３～２７、１４～２７、１５～２７、１６～２７、１７～２７、１８～２７、１９～２７、２０～２７、２１～２７、２２～２７、２３～２７、２４～２７、２５～２７、１０～２６、１１～２６、１２～２６、１３～２６、１４～２６、１５～２６、１６～２６、１７～２６、１８～２６、１９～２６、２０～２６、２１～２６、２２～２６、２３～２６、２４～２６、２５～２６、１０～２５、１１～２５、１２～２５、１３～２５、１４～２５、１５～２５、１６～２５、１７～２５、１８～２５、１９～２５、２０～２５、２１～２５、２２～２５、２３～２５、２４～２５、１０～２４、１１～２４、１２～２４、１３～２４、１４～２４、１５～２４、１６～２４、１７～２４、１８～２４、１９～２４、２０～２４、２１～２４、２２～２４、２３～２４、１０～２３、１１～２３、１２～２３、１３～２３、１４～２３、１５～２３、１６～２３、１７～２３、１８～２３、１９～２３、２０～２３、２１～２３、２２～２３、１０～２２、１１～２２、１２～２２、１３～２２、１４～２２、１５～２２、１６～２２、１７～２２、１８～２２、１９～２２、２０～２２、２１～２２、１０～２１、１１～２１、１２～２１、１３～２１、１４～２１、１５～２１、１６～２１、１７～２１、１８～２１、１９～２１、２０～２１、１０～２０、１１～２０、１２～２０、１３～２０、１４～２０、１５～２０、１６～２０、１７～２０、１８～２０、１９～２０、１０～１９、１１～１９、１２～１９、１３～１９、１４～１９、１５～１９、１６～１９、１７～１９、１８～１９、１０～１８、１１～１８、１２～１８、１３～１８、１４～１８、１５～１８、１６～１８、１７～１８、１０～１７、１１～１７、１２～１７、１３～１７、１４～１７、１５～１７、１６～１７、１０～１６、１１～１６、１２～１６、１３～１６、１４～１６、１５～１６、１０～１５、１１～１５、１２～１５、１３～１５および１４～１５ヌクレオチドの長さであり得る。標的配列は、その５’末端から３’末端に１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３３、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４４、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６６、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０ヌクレオチドの長さを有することができる。

標的配列に相補的なヌクレオチド配列（以下、「ハイブリダイズ配列」と称する）は、標的配列と同じ長さであるべきである。したがって、ハイブリダイズ配列の例示的な長さは、５’末端から３’末端に１０～７０ヌクレオチド、例えば１１～７０、１２～７０、１３～７０、１４～７０、１５～７０、１６～７０、１７～７０、１８～７０、１９～７０、２０～７０、２１～７０、２２～７０、２３～７０、２４～７０、２５～７０、１０～６５、１１～６５、１２～６５、１３～６５、１４～６５、１５～６５、１６～６５、１７～６５、１８～６５、１９～６５、２０～６５、２１～６５、２２～６５、２３～６５、２４～６５、２５～６５、１０～６０、１１～６０、１２～６０、１３～６０、１４～６０、１５～６０、１６～６０、１７～６０、１８～６０、１９～６０、２０～６０、２１～６０、２２～６０、２３～６０、２４～６０、２５～６０、１０～５５、１１～５５、１２～５５、１３～５５、１４～５５、１５～５５、１６～５５、１７～５５、１８～５５、１９～５５、２０～５５、２１～５５、２２～５５、２３～５５、２４～５５、２５～５５、１０～５０、１１～５０、１２～５０、１３～５０、１４～５０、１５～５０、１６～５０、１７～５０、１８～５０、１９～５０、２０～５０、２１～５０、２２～５０、２３～５０、２４～５０、２５～５０、１０～４５、１１～４５、１２～４５、１３～４５、１４～４５、１５～４５、１６～４５、１７～４５、１８～４５、１９～４５、２０～４５、２１～４５、２２～４５、２３～４５、２４～４５、２５～４５、１０～４０、１１～４０、１２～４０、１３～４０、１４～４０、１５～４０、１６～４０、１７～４０、１８～４０、１９～４０、２０～４０、２１～４０、２２～４０、２３～４０、２４～４０、２５～４０、１０～３８、１１～３８、１２～３８、１３～３８、１４～３８、１５～３８、１６～３８、１７～３８、１８～３８、１９～３８、２０～３８、２１～３８、２２～３８、２３～３８、２４～３８、２５～３８、１０～３６、１１～３６、１２～３６、１３～３６、１４～３６、１５～３６、１６～３６、１７～３６、１８～３６、１９～３６、２０～３６、２１～３６、２２～３６、２３～３６、２４～３６、２５～３６、１０～３５、１１～３５、１２～３５、１３～３５、１４～３５、１５～３５、１６～３５、１７～３５、１８～３５、１９～３５、２０～３５、２１～３５、２２～３５、２３～３５、２４～３５、２５～３５、１０～３４、１１～３４、１２～３４、１３～３４、１４～３４、１５～３４、１６～３４、１７～３４、１８～３４、１９～３４、２０～３４、２１～３４、２２～３４、２３～３４、２４～３４、２５～３４、１０～３３、１１～３３、１２～３３、１３～３３、１４～３３、１５～３３、１６～３３、１７～３３、１８～３３、１９～３３、２０～３３、２１～３３、２２～３３、２３～３３、２４～３３、２５～３３、１０～３２、１１～３２、１２～３２、１３～３２、１４～３２、１５～３２、１６～３２、１７～３２、１８～３２、１９～３２、２０～３２、２１～３２、２２～３２、２３～３２、２４～３２、２５～３２、１０～３０、１１～３０、１２～３０、１３～３０、１４～３０、１５～３０、１６～３０、１７～３０、１８～３０、１９～３０、２０～３０、２１～３０、２２～３０、２３～３０、２４～３０、２５～３０、１０～２９、１１～２９、１２～２９、１３～２９、１４～２９、１５～２９、１６～２９、１７～２９、１８～２９、１９～２９、２０～２９、２１～２９、２２～２９、２３～２９、２４～２９、２５～２９、１０～２８、１１～２８、１２～２８、１３～２８、１４～２８、１５～２８、１６～２８、１７～２８、１８～２８、１９～２８、２０～２８、２１～２８、２２～２８、２３～２８、２４～２８、２５～２８、１０～２７、１１～２７、１２～２７、１３～２７、１４～２７、１５～２７、１６～２７、１７～２７、１８～２７、１９～２７、２０～２７、２１～２７、２２～２７、２３～２７、２４～２７、２５～２７、１０～２６、１１～２６、１２～２６、１３～２６、１４～２６、１５～２６、１６～２６、１７～２６、１８～２６、１９～２６、２０～２６、２１～２６、２２～２６、２３～２６、２４～２６、２５～２６、１０～２５、１１～２５、１２～２５、１３～２５、１４～２５、１５～２５、１６～２５、１７～２５、１８～２５、１９～２５、２０～２５、２１～２５、２２～２５、２３～２５、２４～２５、１０～２４、１１～２４、１２～２４、１３～２４、１４～２４、１５～２４、１６～２４、１７～２４、１８～２４、１９～２４、２０～２４、２１～２４、２２～２４、２３～２４、１０～２３、１１～２３、１２～２３、１３～２３、１４～２３、１５～２３、１６～２３、１７～２３、１８～２３、１９～２３、２０～２３、２１～２３、２２～２３、１０～２２、１１～２２、１２～２２、１３～２２、１４～２２、１５～２２、１６～２２、１７～２２、１８～２２、１９～２２、２０～２２、２１～２２、１０～２１、１１～２１、１２～２１、１３～２１、１４～２１、１５～２１、１６～２１、１７～２１、１８～２１、１９～２１、２０～２１、１０～２０、１１～２０、１２～２０、１３～２０、１４～２０、１５～２０、１６～２０、１７～２０、１８～２０、１９～２０、１０～１９、１１～１９、１２～１９、１３～１９、１４～１９、１５～１９、１６～１９、１７～１９、１８～１９、１０～１８、１１～１８、１２～１８、１３～１８、１４～１８、１５～１８、１６～１８、１７～１８、１０～１７、１１～１７、１２～１７、１３～１７、１４～１７、１５～１７、１６～１７、１０～１６、１１～１６、１２～１６、１３～１６、１４～１６、１５～１６、１０～１５、１１～１５、１２～１５、１３～１５および１４～１５ヌクレオチドを含み得る。ハイブリダイズ配列は、その５’末端から３’末端に１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３３、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４４、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６６、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０ヌクレオチドの長さを有することができる。

適切なハイブリダイズ配列の例としては、配列番号１２～３６および４３～１１１のいずれかが挙げられる。本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号１２～３６および４３～１１１のいずれかからなる群から選択されるヌクレオチド配列（以下、「適切なハイブリダイズ配列」または「適切な複数のハイブリダイズ配列」と称する）を含み得る。

本発明のアンチセンスオリゴマーは、必ずしもハイブリダイズ配列のみを含むとは限らない場合がある。本発明のアンチセンスオリゴマーが、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９、１０および１１からなる群、またはＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンに対するスキッピング活性を保持する限り、本発明のアンチセンスオリゴマーは、上記の適切なハイブリダイズ配列の部分配列を含み得る。一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号１２～３６および４３～１１１に開示される配列のいずれか１つの、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個の連続するヌクレオチドを含むことができる。別の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号１２～３６および４３～１１１に開示される配列のいずれか１つの、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個の連続するヌクレオチドを含むことができる。

本発明のアンチセンスオリゴマーは、必ずしもハイブリダイズ配列のみを含むとは限らない場合がある。本発明のアンチセンスオリゴマーが、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９、１０および１１からなる群、またはＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンに対するスキッピング活性を保持する限り、本発明のアンチセンスオリゴマーは、標的領域に相補的でない追加の配列（塩基）を含み得る。

本発明のアンチセンスオリゴマーにより標的化される配列の例としては、ＡＣＶＲ２ＢプレｍＲＮＡのエクソンの任意の配列、例えばエクソン１～１１が挙げられる。適切には、標的配列は、ＡＣＶＲ２ＢプレｍＲＮＡのエクソン５、６、７、８、９、１０および１１からなる群、またはＡＣＶＲ２ＢプレｍＲＮＡのエクソン５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。一実施形態では、ＡＣＶＲ２ＢプレｍＲＮＡの標的配列は、エクソン５、６、７、９および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。別の実施形態では、ＡＣＶＲ２ＢプレｍＲＮＡの標的配列は、エクソン５、６、９および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。別の実施形態では、ＡＣＶＲ２ＢプレｍＲＮＡの標的配列は、エクソン５、６および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。別の実施形態では、ＡＣＶＲ２ＢプレｍＲＮＡの標的配列は、エクソン５および６からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。別の実施形態では、ＡＣＶＲ２ＢプレｍＲＮＡの標的配列は、エクソン７、８および９からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。別の実施形態では、ＡＣＶＲ２ＢプレｍＲＮＡの標的配列は、エクソン７および８からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。別の実施形態では、ＡＣＶＲ２ＢプレｍＲＮＡの標的配列はエクソン５である。別の実施形態では、ＡＣＶＲ２ＢプレｍＲＮＡの標的配列はエクソン６である。別の実施形態では、ＡＣＶＲ２ＢプレｍＲＮＡの標的配列はエクソン７である。別の実施形態では、ＡＣＶＲ２ＢプレｍＲＮＡの標的配列はエクソン８である。別の実施形態では、ＡＣＶＲ２ＢプレｍＲＮＡの標的配列はエクソン９である。別の実施形態では、ＡＣＶＲ２ＢプレｍＲＮＡの標的配列はエクソン１０である。別の実施形態では、ＡＣＶＲ２ＢプレｍＲＮＡの標的配列はエクソン１１である。別の実施形態では、ＡＣＶＲ２ＢプレｍＲＮＡの標的配列は、エクソン７、８、９および１０からなる群、またはエクソン５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。

特定の実施形態では、本発明のオリゴマーは、オリゴマーと同じ長さであるか、またはオリゴマーよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０ヌクレオチド短いハイブリダイズ配列を有する。例えば、オリゴマーは、長さが２４ヌクレオチドであり、同じ長さであるハイブリダイズ配列を有し得、すなわち、オリゴマー中の全ての２４ヌクレオチドが標的領域に相補的であるか、またはオリゴマーは、長さが２０ヌクレオチド（オリゴマー長よりも４ヌクレオチド短い）であるハイブリダイズ配列を有し得、したがって、オリゴマーは、標的領域に相補的でない（したがって、ハイブリダイズ配列の一部ではない）４ヌクレオチドも有することができる。このようなオリゴマーは、例えば、標的領域に相補的でないハイブリダイズ配列のいずれかの側に２つのヌクレオチド、または一方の側に３つ、他方に１つ、または一方の末端に４つのヌクレオチドを有することができる。

ハイブリダイズ配列または部分ハイブリダイズ配列に加えて、本発明のアンチセンスオリゴマーは、標的配列へのハイブリダイズに寄与してもよく寄与しなくてもよい追加配列を含み得る。このような追加の配列は、ハイブリダイズ配列の５’末端、３’末端、もしくは両末端、または部分的ハイブリダイズ配列に結合され得る。この場合、本発明のアンチセンスオリゴマーの全長は、本発明のアンチセンスオリゴマーの例示的な長さの範囲、または本発明のアンチセンスオリゴマーの例示的な長さ内に入る。

別の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号１２～３６および４３～１１１のいずれかに示されるヌクレオチド配列からなり得る。一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号１２～３６および４３～１１１のいずれかに示される配列の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個の連続したヌクレオチドからなり得る。
別の実施形態では、本発明は、機能性ペプチド、例えば細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）が本発明のアンチセンスオリゴマーに結合しているコンジュゲートを提供する。公知の機能性ペプチドまたは市販の機能性ペプチドを本発明において使用することができる。本発明で使用することができる機能性ペプチドには、例えば、国際公開第２００８／０３６１２７号パンフレットに開示されているアルギニンリッチペプチド；または国際公開第２００９／００５７９３号パンフレットに開示されている臓器を標的とするペプチド、例えば、ＲＸＲ、ＲＢＲなど；または国際公開第２０１２／１５０９６０号パンフレットに開示されているアミノ酸サブユニットを含むペプチドが含まれる。細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）は、哺乳動物細胞の細胞膜を通過することができ、したがって、細胞ドラッグデリバリーを改善することができる１０～約３０アミノ酸の短いペプチド配列を表す（例えば、Hum Mol Genet. 2011 Aug 15; 20(16): 3151-3160; Pharmacology & Therapeutics 154 (2015) 78-86を参照されたい）。公知のＣＰＰまたは市販のＣＰＰを本発明において使用することができる。本発明において使用することができるＣＰＰは、例えば、Pharmacology & Therapeutics 154 (2015) 78-86の８０頁の表１に列挙されたＣＰＰが含まれ、例えば、ＴＡＴ（４８－６０）、ペネトラチン、ポリアルギニン、Ｏｃｔ４、ＷＴ１－ｐＴｊ、ＤＰＶ３、トランスポータン、ＭＡＰ、ＶＰ２２、Ｒｅｐ１、ＫＷ、ＫＦＧＦ、ＦＧＦ１２、インテフリンβ３ペプチド、Ｃ１０５Ｙ、ＴＰ２；特表２０１７－５００８５６明細書（国際公開第２０１５／０８９４８７号パンフレット）の段落［００８５］、表１に列挙されるＣＰＰ、例えばＤＰＶ１０／６、ＤＰＶ１５ｂ、ＹＭ－３、Ｔａｔ、ＬＲ１１、Ｃ４５Ｄ１８、Ｌｙｐ－１、Ｌｙｐ－２、ＢＭＶ ＧＡＧ、ｈＬＦ１－２２、Ｃ４５Ｄ１８、ＬＲ２０などが挙げられる。ＣＰＰは、例えば、Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から市販されている。ＴＡＴ（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、ペネトラチン（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）などの市販のＣＰＰ、または公知のＣＰＰ、例えばＲ８などを本発明において使用することができる。本発明において用いることができる好ましいＣＰＰは、例えば、ｈＬＩＭＫ、ＴＡＴ、ペネトラチン、Ｒ８などを含む（国際公開第２０１６／１８７４２５号パンフレット、国際公開第２０１８／１１８６６２号パンフレット、国際公開第２０１８／１１８５９９号パンフレット、国際公開第２０１８／１１８６２７号パンフレット、EBioMedicine 45 (2019) 630-645などを参照されたい）。ＣＰＰは、本発明のアンチセンスオリゴマーに直接結合することができ、またはＣＰＰをアンチセンスオリゴマーに結合することができるリンカーを介して結合することができる。公知のリンカーを本発明において使用することができる。このようなリンカーには、例えば、特表２０１７－５００８５６明細書（国際公開第２０１５／０８９４８７号パンフレット）、国際公開第２０１５／０８９４８７号パンフレット、国際公開第２００９／０７３８０９号パンフレット、国際公開第２０１３／０７５０３５号パンフレット、国際公開第２０１５／１０５０８３号パンフレット、国際公開第２０１４／１７９６２０号パンフレット、国際公開第２０１５／００６７４０号パンフレット、国際公開第２０１７／０１０５７５号パンフレットなどに記載されるものが含まれる。本発明において使用することができる好ましいリンカーは、例えば、４－マレイミド酪酸、ジスルフィド結合を介して本発明の機能性ペプチドまたはアンチセンスオリゴマーに結合することができるリンカーなどを含む。本発明のコンジュゲートは、当業者に公知の方法によって調製することができる。

スキッピング効率：
特定のオリゴマーが、ＡＣＶＲ２Ｂ遺伝子中のエクソンまたは複数のエクソンのスキッピングをもたらし得るか否かは、ＡＣＶＲ２Ｂを発現する細胞（例えば、ヒト横紋筋肉腫細胞）に本発明のアンチセンスオリゴマーを導入し、ＲＴ－ＰＣＲまたはＰＣＲ増幅産物に関する配列分析により、ＡＣＶＲ２Ｂ発現細胞の総ＲＮＡからＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域をコードするＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡの領域を増幅することによって評価または確認することができる。

スキッピングの効率は、以下のように決定することができる：ＲＴ－ＰＣＲ反応溶液は、エクソンスキッピングを伴うＰＣＲ増幅産物のポリヌクレオチドレベル「Ａ」（例えば、切断型ＡＣＶＲ２ＢのｍＲＮＡ量）、およびエクソンスキッピングを伴わないＰＣＲ増幅産物のポリヌクレオチドレベル「Ｂ」（例えば、全長ＡＣＶＲ２ＢのｍＲＮＡ量）について測定され、続いて、「Ａ」および「Ｂ」のこれらの測定値に基づいて、次の式に従って計算される。
スキッピング効率（％）＝｛Ａ／（Ａ＋Ｂ）｝×１００

好ましい実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴマーは、エクソンスキッピングを１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６２．５％以上、６５％以上、６７．５％以上、７０％以上、７２．５％以上、７５％以上、７７．５％以上、８０％以上、８２．５％以上、８５％以上、８７．５％以上、９０％以上、９２．５％以上、９５％以上、９７．５％以上、９８以上または９９％以上の効率で引き起こす。有効なアンチセンスオリゴマーが同定されると、当業者は、有効なアンチセンスオリゴマーの配列とオーバーラップする配列を有する種々のアンチセンスオリゴマーを設計し、本明細書に記載される手順を用いてそれらを試験することによって、より最適な配列を同定することを試みることができる。

オリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴマーまたはペプチド核酸オリゴマー：
本発明のアンチセンスオリゴマーは、オリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴマーまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーであり得、各々は、本発明のアンチセンスオリゴマーの例示的な長さの範囲、または本発明のアンチセンスオリゴマーの例示的な長さである。

上記オリゴヌクレオチド（以下、「本発明のオリゴヌクレオチド」と称する）は、本発明のアンチセンスオリゴマーであり、その構成単位はヌクレオチドであり、このようなヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのいずれかであり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には一本鎖である。

「修飾ヌクレオチド」とは、核酸塩基、糖部分およびリン酸結合部分が全てまたは部分的に修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを指す。

本発明では、核酸塩基の例としては、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、チミン、ウラシル、またはそれらの修飾塩基が挙げられる。このような修飾塩基は、シュードウラシル、３－メチルウラシル、ジヒドロウラシル、５－アルキルシトシン（例えば、５－メチルシトシン）、５－アルキルウラシル（例えば、５－エチルウラシル）、５－ハロウラシル（例えば、５－ブロモウラシル）、６－アザピリミジン、６－アルキルピリミジン（例えば、６－メチルウラシル）、２－チオウラシル、４－チオウラシル、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、１－メチルアデニン、１－メチルヒポキサンチン、２，２－ジメチルグアニン、３－メチルシトシン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メチルカルボニルメチルウラシル、５－メチルオキシウラシル、５－メチル－２－チオウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸、２－チオシトシン、プリン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノプリン、イソグアニン、インドール、イミダゾール、キサンチンなどによって例示され得るが、こられに限定されない。

糖部分への修飾は、リボースの２’位での修飾および糖の他の位置での修飾によって例示され得る。リボースの２’位における修飾の例としては、リボースの２’位での－ＯＨ基をＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、Ｎ_３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩで置換することを意図した修飾が挙げられ、Ｒはアルキルまたはアリールを表し、Ｒ’はアルキレンを表す。

糖の他の位置での修飾の例としては、リボースまたはデオキシリボースの４’位でのＯのＳへの置換、およびＬＮＡ（ロックド核酸）またはＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸）によって例示されるように、糖の２’位と４’位の間の架橋が挙げられるが、これらに限定されない。

リン酸結合部分への修飾は、ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合またはボラノホスフェート結合で置換することを意図した修飾（Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 18, 9154-9160）によって例示され得る（例えば、国際公開第２００６／１２９５９４号パンフレットおよび国際公開第２００６／０３８６０８号パンフレットを参照されたい）。

本発明では、アルキルは、好ましくは１～６個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖アルキルである。より具体的には、例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ｎ－ヘキシルおよびイソヘキシルが挙げられる。このようなアルキルは、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロなどの１～３個の置換基で置換され得る。

本発明では、シクロアルキルは、好ましくは５～１２個の炭素原子を含むシクロアルキルである。より具体的には、例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシルおよびシクロドデシルが挙げられる。

本発明では、ハロゲンにはフッ素、塩素、臭素およびヨウ素が含まれる。

アルコキシは、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ｎ－ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ－ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシなどによって例示される１～６個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖アルコキシであり得る。特に好ましいものは、１～３個の炭素原子を含むアルコキシである。

本発明では、アリールは、好ましくは６～１０個の炭素原子を含むアリールである。より具体的には、例として、フェニル、α－ナフチルおよびβ－ナフチルが挙げられる。特に好ましいものはフェニルである。このようなアリールは、アルキル、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロなどを含む１～３個の置換基で置換され得る。

本発明では、アルキレンは、好ましくは１～６個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖アルキレンである。より具体的には、例には、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、２－（エチル）トリメチレンおよび１－（メチル）テトラメチレンが挙げられる。

本発明では、アシルは、直鎖もしくは分枝鎖アルカノイルまたはアロイルであり得る。このようなアルカノイルの例としては、ホルミル、アセチル、２－メチルアセチル、２，２－ジメチルアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、２，２－ジメチルプロピオニル、ヘキサノイルなどが挙げられる。アロイルの例としては、ベンゾイル、トルオイルおよびナフトイルが挙げられる。このようなアロイルは、任意の置換可能な位置で置換され得、アルキル（複数可）で置換され得る。

本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、その構成単位が、以下の一般式によって表される基であり、リボースの２’位の－ＯＨ基がメトキシで置換され、リン酸結合部分がホスホロチオネート結合である本発明によるアンチセンスオリゴマーである。

（式中、Ｂａｓｅは核酸塩基を表す）。

本発明のオリゴヌクレオチドは、種々の自動シンセサイザー（例えば、ＦＯＣＵＳ（Ａａｐｐｔｅｃ）、ＡＫＴＡオリゴパイロットプラス１０／１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で容易に合成することができ、あるいはその合成を第三者（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｔａｋａｒａ、またはＪａｐａｎ Ｂｉｏ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）などに委託することができる。

本発明のモルホリノオリゴマーは、その構成単位が、以下の一般式：

（式中、Ｂａｓｅは上記で定義されるものと同じであり、Ｗは、以下の式：

（式中、Ｘは、－ＣＨ_２Ｒ^１、－Ｏ－ＣＨ_２Ｒ^１、－Ｓ－ＣＨ_２Ｒ^１、－ＮＲ_２Ｒ^３またはＦを表し；
Ｒ^１は、Ｈまたはアルキルを表し；
Ｒ^２およびＲ^３は、同一であるかまたは異なることができ、各々が、Ｈ、アルキル、シクロアルキルまたはアリールを表し；
Ｙ_１は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ_２またはＮＲ^１を表し；
Ｙ_２は、Ｏ、ＳまたはＮＲ^１を表し；および
Ｚは、ＯまたはＳを表す）
のいずれかで表される基を表す）
で表される基である、本発明によるアンチセンスオリゴマーである。
モルホリノオリゴマーは、好ましくは、構成単位が以下の式：

（式中、Ｂａｓｅ、Ｒ^２およびＲ^３は、上記で定義されるものと同じである）
で表される基であるオリゴマー（すなわち、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（以下、「ＰＭＯ」と称する））である。

例えば、モルホリノオリゴマーは、国際公開第１９９１／００９０３３号パンフレットまたは国際公開第２００９／０６４４７１号パンフレットに従って調製することができる。特に、ＰＭＯは、国際公開第２００９／０６４４７１号に記載される手順に従って調製することができ、または以下に示される手順に従って調製することができる。

［ＰＭＯ調製のためのプロセス］
ＰＭＯの一実施形態として、以下の一般式（Ｉ）：

［式中、各Ｂａｓｅ、Ｒ^２およびＲ^３は、上記で定義されるものと同じであり；ｎは、１～９９の範囲の任意の整数であり、適切には１３～２９、１４～２８または１５～２７、１６～２６、１７～２５の範囲の任意の整数である］
で表される化合物（以下、ＰＭＯ（Ｉ）と称する）が、例として与えられ得る。

ＰＭＯ（Ｉ）は、例えば、以下のステップに示される操作を行うことによって、公知の手順に従って調製することができる。以下のステップで使用される化合物および試薬は、それらが一般的にＰＭＯ調製に使用される限り、いずれの方法においても限定されない。さらに、以下の全てのステップは、液相法または固相法によって（取扱説明書に従って、または市販の固相自動シンセサイザーを使用して）達成することができる。ＰＭＯを固相法で調製する場合、簡単な操作および正確な合成の観点から、自動シンセサイザーを使用することが望ましい。

（１）ステップＡ：
これは、以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物（以下、化合物（ＩＩ）と称する）を酸で処理して、以下の一般式（ＩＩＩ）：

［式中、ｎ、Ｒ^２およびＲ^３は、上記で定義されるものと同じであり；
各Ｂ^Ｐは、独立して、保護され得る核酸塩基を表し；
Ｔは、トリチル基、モノメトキシトリチル基またはジメトキシトリチル基を表し；
Ｌは、水素、アシルまたは以下の一般式（ＩＶ）で表される基（以下、基（ＩＶ）と称する）：

を表す］
で表される化合物（以下、化合物（ＩＩＩ）と称する）を調製するステップである。

Ｂ^Ｐの可能性のある「核酸塩基」は、Ｂａｓｅについて列挙されるのと同じ「核酸塩基」によって例示され得るが、ただし、Ｂ^Ｐに関するこれらの核酸塩基中のアミノ基またはヒドロキシル基が保護され得ることを条件とする。

これらのアミノ基の保護基は、それらが核酸の保護基として使用される限り、いずれの方法においても限定されない。より具体的には、例としては、ベンゾイル、４－メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル、４－イソプロピルフェノキシアセチル、および（ジメチルアミノ）メチレンが挙げられる。ヒドロキシル基の保護基としては、例えば、２－シアノエチル、４－ニトロフェネチチル、フェニルスルホニルエチル、メチルスルホニルエチル、トリメチルシリルエチル、任意の置換可能な位置（複数可）において１～５個の電子求引基で置換され得るフェニル、ジフェニルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、メチルフェニルカルバモイル、１－ピロリジニルカルバモイル、モルホリノカルバモイル、４－（ｔｅｒｔ－ブチルカルボキシ）ベンジル、４－［（ジメチルアミノ）カルボキシ］ベンジル、および４－（フェニルカルボキシ）ベンジルが挙げられる（例えば、国際公開第２００９／０６４４７１号パンフレットを参照されたい）。

「固体担体」は、それが核酸の固相反応における使用に利用可能な担体である限り、いずれの方法においても限定されないが、例えば、（ｉ）モルホリノ核酸誘導体の合成における使用に利用可能な試薬（例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラゾール、Ｎ－メチルイミダゾール、ピリジン、無水酢酸、ルチジン、トリフルオロ酢酸）にはわずかに可溶であり、（ｉｉ）モルホリノ核酸誘導体の合成における使用に利用可能な試薬に対して化学的に安定であり、（ｉｉｉ）化学的に修飾することができ、（ｉｖ）所望のモルホリノ核酸誘導体をローディングすることができ、（ｖ）処理中の高圧に耐えるのに十分な強度を有し、および（ｖｉ）特定の範囲の粒子サイズと分布を有する担体を用いるのが望ましい。より具体的には、例として、膨潤ポリスチレン（例えば、１％ジビニルベンゼンで架橋されたアミノメチルポリスチレンレジン（２００～４００メッシュ）（２．４～３．０ｍｍｏｌ／ｇ）（Ｔｏｋｙｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）、アミノメチル化ポリスチレンレジンＨＣｌ［ジビニルベンゼン１％、１００～２００メッシュ］（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｊａｐａｎ）、非膨潤ポリスチレン（例えば、プライマーサポート（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））、ＰＥＧ鎖様ポリスチレン（例えば、ＮＨ_２－ＰＥＧレジン（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）、ＴｅｎｔａＧｅｌレジン）、制御された孔質ガラス（ＣＰＧ）（ＣＰＧ Ｉｎｃ．の製品）、オキサリル化された制御された孔質ガラス（例えば、Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19, 1527 (1991)を参照されたい）、ＴｅｎｔａＧｅｌ支持体－アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体（例えば、Wright et al., Tetrahedron Letters, Vol. 34, 3373 (1993)を参照されたい）、および多孔質ポリスチレン／ジビニルベンゼンコポリマーが挙げられる。

「リンカー」として、核酸またはモルホリノ核酸誘導体を連結するために一般的に使用される公知のリンカーを使用することが可能である。適切な例としては、３－アミノプロピル、スクシニル、２，２’－ジエタノールスルホニル、および長鎖アルキルアミノ（ＬＣＡＡ）が挙げられる。

このステップにおける使用に利用可能な「酸」の例としては、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸またはトリクロロ酢酸が挙げられる。使用される酸の量は、例えば、１モルの化合物（ＩＩ）に対して、０．１モル当量～１０００モル当量の範囲、例えば、１モル当量～１００モル当量の範囲である。

さらに、有機アミンを上記酸とともに使用することが可能である。この目的のために任意の有機アミンを使用することができ、例としては、トリエチルアミンが挙げられる。使用される有機アミンの量は、例えば、１モルの酸に対して、合理的には０．０１モル当量～１０モル当量の範囲、例えば、０．１モル当量～２モル当量の範囲である。

このステップにおいて酸および有機アミンが塩または混合物として使用される場合、例としては、トリフルオロ酢酸およびトリエチルアミンの塩または混合物、より具体的には、２当量のトリフルオロ酢酸および１当量のトリエチルアミンを含む混合物が挙げられる。

このステップにおける使用に利用可能な酸は、０．１％～３０％の範囲の濃度を得るために適切な溶媒で希釈することによって使用することができる。反応に対して不活性である限り、任意の溶媒をこの目的のために使用することができ、例としては、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール（例えば、エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノール）、水、またはそれらの混合物が挙げられる。

上記反応における反応温度は、例えば、１０℃～５０℃の範囲であり、例えば２０℃～４０℃の範囲または２５℃～３５℃の範囲である。

反応時間は、使用される酸のタイプおよび／または反応温度に依存して変化するが、一般的に０．１分～２４時間の範囲であり、適切には１分～５時間の範囲である。

さらに、このステップの完了後、塩基を場合により添加して、システム内に残存する酸を中和することができる。この目的のために、任意の「塩基」を使用することができ、例として、ジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。このような塩基は、０．１％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度を与えるように適切な溶媒で希釈することによって使用することができる。

反応に対して不活性である限り、任意の溶媒をこのステップに使用することができ、例としては、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール（例えば、エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノール）、水、またはそれらの混合物が挙げられる。反応温度は、例えば、１０℃～５０℃の範囲であり、例えば２０℃～４０℃の範囲、適切には２５℃～３５℃の範囲である。

反応時間は、使用される塩基のタイプおよび／または反応温度に依存して変化するが、一般的に０．１分～２４時間の範囲であり、適切には１分～５時間の範囲である。

ｎ＝１であり、Ｌが基（ＩＶ）である化合物（ＩＩ）、すなわち、以下の一般式（ＩＩａ）：

［式中、Ｂ^Ｐ、Ｔ、リンカーおよび固体キャリアは、上記で定義されるものと同じである］
で表される化合物（以下、化合物（ＩＩａ）と称する）は、以下の手順に従って調製することができることに留意されたい。

ステップ１：
これは、以下の一般式（Ｖ）で表される化合物をアシル化剤で処理して、以下の一般式（ＶＩ）：

［式中、Ｂ^Ｐ、Ｔおよびリンカーは、上記で定義されるものと同じであり；ならびに
Ｒ^４は、ヒドロキシル基、ハロゲン、カルボキシル基またはアミノを表す］
で表される化合物（以下、化合物（ＶＩ）と称する）を調製するステップである。

このステップは、リンカー導入のための任意の既知の反応によって化合物（Ｖ）から出発して達成することができる。

特に、以下の一般式（ＶＩａ）：

［式中、Ｂ^ＰおよびＴは、上記で定義されるものと同じである］
で表される化合物は、化合物（Ｖ）および無水コハク酸の使用によるエステル化反応として既知である任意のプロセスによって調製することができる。

ステップ２：
これは、化合物（ＶＩ）を、縮合剤などで処理して固体担体と反応させ、化合物（ＩＩａ）を調製するステップである。

［式中、Ｂ^Ｐ、Ｒ^４、Ｔ、リンカーおよび固体担体は、上記で定義されるものと同じである］。

このステップは、化合物（ＶＩ）および固体担体を使用する縮合反応として既知である任意のステップによって達成することができる。

ｎ＝２～９９（適切には１３～２９、１４～２８、１５～２７、１６～２６、または１７～２５の範囲の任意の整数）であり、Ｌが基（ＩＶ）である化合物（ＩＩ）、すなわち、以下の一般式（ＩＩａ２）：

［式中、Ｂ^Ｐ、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｔ、リンカーおよび固体担体は、上記で定義されるものと同じであり；
ｎ’は、１～９８を表す（特定の実施形態では、ｎ’は、１～２８、１～２７、１～２６、１～２５、または１～２４を表す）］
によって表される化合物は、本明細書に開示されるＰＭＯを調製するためのプロセスのステップＡおよびＢを所望の回数繰り返すことにより化合物（ＩＩａ）から開始して調製することができる。

（２）ステップＢ：
これは、化合物（ＩＩＩ）を塩基の存在下でモルホリノモノマー化合物で処理して、以下の一般式（ＶＩＩ）：

［式中、各Ｂ^Ｐ、Ｌ、ｎ、Ｒ^２、Ｒ^３およびＴは、上記で定義されるものと同じである］
で表される化合物（以下、化合物（ＶＩＩ）と称する）を調製するステップである。

このステップは、塩基の存在下でモルホリノモノマー化合物で化合物（ＩＩＩ）を処理することによって達成することができる。

このようなモルホリノモノマー化合物は、以下の一般式（ＶＩＩＩ）：

［式中、Ｂ^Ｐ、Ｒ^２、Ｒ^３およびＴは、上記で定義されるものと同じである］
で表される化合物によって例示することができる。

このステップにおける使用に利用可能な「塩基」の例としては、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミンまたはＮ－エチルモルホリンが挙げられる。使用される塩基の量は、例えば、１モルの化合物（ＩＩＩ）に対して、１モル当量～１０００モル当量の範囲であり、適切には１０モル当量～１００モル当量の範囲である。

このようなモルホリノモノマー化合物およびこのステップにおける使用に利用可能な塩基は、０．１％～３０％の濃度を得るために適切な溶媒で希釈することによって使用することができる。反応に対して不活性である限り、任意の溶媒をこの目的のために使用することができ、例としては、Ｎ，Ｎ－ジメチルイミダゾリジノン、Ｎ－メチルピペリドン、ＤＭＦ、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、またはそれらの混合物が挙げられる。

反応温度は、例えば、０℃～１００℃の範囲であり、適切には１０℃～５０℃の範囲である。

反応時間は、使用される塩基のタイプおよび／または反応温度に依存して変化するが、一般的に１分～４８時間の範囲であり、適切には３０分～２４時間の範囲である。

さらに、このステップの完了後、アシル化剤を場合により添加することができる。「アシル化剤」の例としては、無水酢酸、塩化酢酸および無水フェノキシ酢酸が挙げられる。このようなアシル化剤は、適切な溶媒で希釈して、例えば０．１％～３０％の範囲の濃度を与えることによって使用することができる。反応に対して不活性である限り、任意の溶媒をこの目的のために使用することができ、例としては、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、アルコール（例えば、エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノール）、水、またはそれらの混合物が挙げられる。

必要に応じて、塩基（例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－エチルモルホリン）をアシル化剤とともに使用することが可能である。使用されるアシル化剤の量は、０．１モル当量～１００００モル当量の範囲であり、より適切には１モル当量～１０００モル当量の範囲である。使用される塩基の量は、例えば、１モルのアシル化剤に対して、０．１モル当量～１００モル当量の範囲であり、適切には１モル当量～１０モル当量の範囲である。

この反応における反応温度は、適切には１０℃～５０℃の範囲であり、例えば、２０℃～４０℃の範囲であり、適切には２５℃～３５℃の範囲である。反応時間は、例えば、使用されるアシル化剤のタイプおよび／または反応温度に依存して変化するが、一般的に０．１分～２４時間の範囲であり、適切には１分～５時間の範囲である。

（３）ステップＣ：
これは、ステップＢで調製された化合物（ＶＩＩ）から保護基を除去するために脱保護剤を使用し、それによって一般式（ＩＸ）：

［式中、Ｂａｓｅ、Ｂ^Ｐ、Ｌ、ｎ、Ｒ^２、Ｒ^３およびＴは、上記で定義されるものと同じである］
で表される化合物を調製するステップである。

このステップは、化合物（ＶＩＩ）を脱保護剤で処理することによって達成することができる。

「脱保護剤」の例としては、濃縮水性アンモニア（concentrated aqueous ammonia）およびメチルアミンが挙げられる。このステップにおける使用に利用可能なこのような「脱保護剤」は、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ－ジメチルイミダゾリジノン、Ｎ－メチルピペリドン、またはそれらの混合溶媒で希釈することによって使用することができる。その中で、好ましいものはエタノールである。使用される脱保護剤の量は、例えば、例として１モルの化合物（ＶＩＩ）に対して、１モル当量～１０００００モル当量の範囲であり、適切には１０モル当量～１０００モル当量の範囲である。

反応温度は、例えば、１５℃～７５℃の範囲であり、適切には４０℃～６０℃の範囲であるかまたは５０℃～６０℃の範囲である。脱保護のための反応時間は、化合物（ＶＩＩ）のタイプおよび／または反応温度などに依存して変化するが、合理的には１０分～３０時間の範囲であり、適切には３０分～２４時間の範囲であり、より適切には５時間～２０時間の範囲である。

（４）ステップＤ：
これは、ステップＣで調製された化合物（ＩＸ）を酸で処理してＰＭＯ（Ｉ）を調製するステップである：

［式中、Ｂａｓｅ、ｎ、Ｒ^２、Ｒ^３およびＴは、上記で定義されるものと同じである］。

このステップは、化合物（ＩＸ）に酸を添加することによって達成することができる。

このステップにおける使用に利用可能な「酸」の例としては、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、酢酸、リン酸および塩酸などが挙げられる。使用される酸の量に関しては、例えば０．１～４．０の範囲で、適切には１．０～３．０の範囲で溶液ｐＨを与える量で酸を使用することが合理的である。反応に対して不活性である限り、任意の溶媒をこのステップに使用することができ、例としてアセトニトリル、水、またはそれらの混合溶媒が挙げられる。

反応温度は、１０℃～５０℃の範囲、例えば２０℃～４０℃の範囲または２５℃～３５℃の範囲が適切である。脱保護のための反応時間は、化合物（ＩＸ）のタイプおよび／または反応温度などに依存して変化するが、適切には０．１分～５時間の範囲、例えば１分～１時間の範囲、より適切には１分～３０分の範囲である。

ＰＭＯ（Ｉ）は、単独でまたは組み合わせて使用することができる、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、Ｃ_８～Ｃ_１８逆相カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析、限外濾過および他の手段を含む、一般的に使用される分離および精製手段によってこのステップで得られる反応混合物から得ることができ、それにより所望のＰＭＯ（Ｉ）を単離および精製することができる（例えば、国際公開第１９９１／０９０３３号パンフレットを参照されたい）。

ＰＭＯ（Ｉ）の精製に逆相クロマトグラフィーを使用する場合、例として２０ｍＭトリエチルアミン／酢酸緩衝液とアセトニトリルとの混合溶液を、溶出溶媒として使用することができる。

同様に、ＰＭＯ（Ｉ）の精製のためにイオン交換クロマトグラフィーを使用する場合、例として１Ｍ塩化ナトリウム水溶液と１０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液との混合溶液を使用することができる。

ペプチド核酸オリゴマーは、本発明によるアンチセンスオリゴマーであり、その構成単位は、以下の一般式：

（式中、Ｂａｓｅは上記で定義されるものと同じである）
で表される基である。

ペプチド核酸は、例えば、以下に列挙する文献に従って調製することができる。
１）P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991)
２）M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, Jacs., 114, 1895 (1992)
３）K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)
４）L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)
５）T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)

本発明のアンチセンスオリゴマーは、その５’末端が、以下に示される化学式（１）～（３）で表される基のいずれか１つであるように構成することができ、（３）－ＯＨが好ましい。

上述されるように、機能性ペプチド（例えば、ＣＰＰ（細胞浸透性ペプチド））は、リンカーなしでまたはリンカーを介してアンチセンスオリゴマーに結合され得る。機能性ペプチドがリンカーを介してアンチセンスオリゴマーに結合される場合、さらなるアミノ酸が機能性ペプチドに結合され得る。好ましい実施形態では、機能性ペプチドは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（「ＰＭＯ」）に５’末端または３’末端で結合され得、３’末端への結合が好ましい。また、好ましい実施形態では、機能性ペプチドのＣ末端をＰＭＯに結合させることができる。

薬学的に許容される塩および水和物
本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴマー）の薬学的に許容される塩の例としては、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩）；アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩）；金属塩（例えば、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩）；アンモニウム塩；有機アミン塩（例えば、ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩）；ハロゲン化水素酸塩（例えば、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩）；無機酸性塩（すなわち、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩）；低級アルカンスルホン酸塩（例えば、メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩）；アリールスルホン酸塩（例えば、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩）；有機酸塩（例えば、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩）；アミノ酸塩（例えば、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩）などが挙げられる。これらの塩は、任意の既知の方法で調製することができる。

本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴマー）の水和物は、任意の既知の方法で調製することができる。

特定の実施形態
本発明のアンチセンスオリゴマーは、例えば、本発明のアンチセンスオリゴマーの例示的な長さ範囲の長さまたは本発明のアンチセンスオリゴマーの例示的な長さを有するオリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴマーまたはＰＮＡを含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つの糖部分および／または少なくとも１つのリン酸結合部分が修飾されているアンチセンスオリゴマーである。

特定の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’位の－ＯＨ基が、ＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、Ｎ_３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ（Ｒはアルキルまたはアリールを表し、Ｒ’はアルキレンを表す）からなる群から選択されるいずれかの基で置換されているリボースである少なくとも１つの修飾された糖部分を含む。
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合およびボラノホスフェート結合からなる群から選択される少なくとも１つの修飾されたリン酸結合部分を含む。

特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのモルホリノ環を含むアンチセンスオリゴマーである。特定の実施形態では、アンチセンスは、モルホリノオリゴマーまたはホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである。
さらなる実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、下記に示される化学式（１）～（３）で表される基のいずれか１つをその５’末端に有する。

実施例のセクションで試験された全てのアンチセンスオリゴマーは、上記される任意の化学的修飾を用いることができる。
上述されるように、機能性ペプチド（例えば、ＣＰＰ（細胞浸透性ペプチド））は、リンカーなしでまたはリンカーを介してアンチセンスオリゴマーに結合され得る。機能性ペプチドがリンカーを介してアンチセンスオリゴマーに結合される場合、さらなるアミノ酸が機能性ペプチドに結合され得る。好ましい実施形態では、機能性ペプチドは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（「ＰＭＯ」）に５’末端または３’末端で結合され得る。

医薬組成物
本発明の第２の態様によれば、本発明の化合物（例えば、本発明のアンチセンスオリゴマー）またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を活性成分として含む医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」と称する）が提供される。
特定の実施形態では、医薬組成物は、前述のオリゴマーまたはオリゴヌクレオチドのいずれか、またはその薬学的な塩もしくは水和物、ならびに少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤および／または担体を含む。
本発明において使用するのに適した製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985に見出される。ドラッグデリバリーのための方法の簡単な概説については、例えば、Langer (Science 249:1527-1533, 1990)を参照されたい。

担体は、オリゴマーの筋肉組織への送達を促進するのに役立つことができる。このような担体は、それが薬学的に許容される限り、いずれの方法においても限定されない。適切な例としては、カチオン性担体（例えば、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー）またはウイルスエンベロープベースの担体が挙げられる。カチオン性リポソームの例としては、必須成分としての２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロールおよびリン脂質から形成されるリポソーム（以下「リポソームＡ」と称する）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ）、ＴｒａｎｓＩＴ ＴＫＯ（登録商標）（Ｍｉｒｕｓ）およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ（Ｌｏｎｚａ）が挙げられる。それらの中で好ましいものはリポソームＡである。カチオン性ポリマーの例としては、ＪｅｔＳＩ（登録商標）（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）およびＪｅｔ－ＰＥＩ（登録商標）（ポリエチレンイミン、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）が挙げられる。ウイルスエンベロープベースの担体の例としては、ＧｅｎｏｍｅＯｎｅ（登録商標）（ＨＶＪ－Ｅリポソーム、Ｉｓｈｉｈａｒａ Ｓａｎｇｙｏ Ｋａｉｓｈａ，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）が挙げられる。あるいは、日本特許第２９２４１７９号に示される医薬デバイス、または国際公開第２００６／１２９５９４号パンフレットおよび国際公開第２００８／０９６６９０号パンフレットに示されるカチオン性担体もまた使用することができる。

より詳細については、米国特許第４，２３５，８７１号明細書および同第４，７３７，３２３号明細書、国際公開第９６／１４０５７号パンフレット、「New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990) pages 33-104」などを参照することができる。

本発明の医薬組成物は、場合により、本発明のアンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、および／または上記される担体に加えて、薬学的に許容される添加剤を含み得る。このような添加剤の例としては、乳化助剤（例えば、炭素原子６～２２個を含む脂肪酸またはその薬学的に許容される塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、および等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、およびｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）が挙げられる。これらの添加剤は、単独でまたは組み合わせて使用することができる。本発明の医薬組成物中の添加剤（複数可）の含有量は、合理的には９０重量％以下、例えば６０重量％以下、および適切には５０重量％以下である。

本発明の医薬組成物は、本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴマー）またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を担体の分散物に添加し、続いて適切に撹拌することによって調製することができる。添加剤は、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を添加する前または後のいずれかの任意の適切な段階で添加することができる。任意の水性溶媒は、薬学的に許容される限り、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を添加するために使用することができ、例としては、注射用水、注射用蒸留水、電解液（例えば、生理食塩水）、および糖溶液（例えば、グルコース溶液、マルトース溶液）が挙げられる。さらに、この場合、ｐＨおよび温度を含む条件は、当業者によって必要に応じて選択することができる。

本発明の医薬組成物は、溶液またはその凍結乾燥製剤に製剤化することができる。このような凍結乾燥製剤は、本発明の医薬組成物を溶液形態で凍結乾燥することによって標準的な方法で調製することができる。例えば、溶液形態の本発明の医薬組成物は、必要に応じて滅菌し、次にバイアルボトルに所定量で分注され、続いて約－４０℃～－２０℃の条件下で約２時間、予備凍結され、約０℃～１０℃にて減圧下で一次乾燥され、次に約１５℃～２５℃にて減圧下で二次乾燥され得る。さらに、ほとんどの場合、バイアルを窒素ガスでパージし、次にキャップし、それにより本発明の医薬組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。

本発明の医薬組成物のこのような凍結乾燥製剤は、一般的に任意の適切な溶液（すなわち、復元溶液）の添加によって復元させた後に使用することができる。このような復元溶液の例としては、注射用水、生理食塩水、および他の一般的に使用される輸液が挙げられる。このような復元溶液の体積は、例えば、意図された用途に応じて変化し、いかなる方法によっても限定されないが、合理的には、凍結乾燥前の溶液体積よりも０．５倍～２倍大きいか、または５００ｍＬ以下である。

本発明の医薬組成物に含まれる、本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴマー）またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物は、その水和物の形態であり得る。このような水和物は、任意の既知の方法で調製することができる。

医薬組成物の製剤化のための組成物および方法は、限定されないが、投与経路、疾患の範囲、または投与される用量を含む多数の基準に依存する。

これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。得られた水溶液は、そのまま使用するためにパッケージされ得るか、または凍結乾燥され得、凍結乾燥調製物を投与前に無菌水性担体と組み合わせることができる。調製物のｐＨは、典型的には３～１１、適切には５～９または６～８、最も適切には７～８、例えば７～７．５である。得られた固体形態の組成物は、複数の単回投薬単位でパッケージすることができ、各々は、固定量の上記薬剤または複数の薬剤を含み、例えば、錠剤またはカプセルの密封されたパッケージに含む。固体形態の組成物はまた、局所的に適用可能なクリームまたは軟膏のために設計された、絞ることができるチューブなどの柔軟な量のための容器にパッケージすることができる。

本発明の医薬組成物は、任意の薬学的に許容される様式で投与することができ、意図された治療方法に適しているように選択することができる。しかしながら、筋肉組織への容易な送達の観点から、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、間質投与、経皮投与などが好ましい。さらに、本発明の組成物は、任意の投薬形態であり得、例としては、種々のタイプの注射、経口製剤、点滴、吸入剤、軟膏、ローションなどが挙げられる。

本発明の医薬組成物に含まれる、本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴマー）またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物の濃度は、例えば、担体のタイプに依存して変化するが、合理的には０．１ｎＭ～１００μＭの範囲であり、適切には１００ｎＭ～１０μＭの範囲である。同様に、本発明の医薬組成物に含まれる、担体対本発明のアンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物の重量比（すなわち、担体／アンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物比）は、例えば、オリゴマーの特性および担体のタイプに依存して変化するが、合理的には０．１～１００の範囲であり、適切には０．１～１０の範囲である。

本発明の化合物、その薬学的に許容される塩または水和物は、対象に重篤な副作用を引き起こすことなく、治療的に許容される量を対象に送達するのに十分な量で、薬学的に許容される担体または希釈剤などの単位製剤中に含まれ得る。

本発明の医薬組成物の投与量は、望ましくは、その中に含まれる、本発明のアンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物のタイプ、意図される投与形態、年齢および体重などの対象の状態、投与経路、ならびに疾患の性質および重症度を考慮して調整される。対象がヒト対象である場合、本発明のアンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩もしくは水和物の量として計算される、成人の１日用量は、一般的に、体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ～１０ｇの範囲、例えば、体重１ｋｇあたり１ｍｇ～１ｇ、体重１ｋｇあたり２０ｍｇ～１２０ｍｇ、体重１ｋｇあたり３０ｍｇ～１００ｍｇ、または体重１ｋｇあたり４０ｍｇ～８０ｍｇの範囲である。この数値範囲は、標的とする疾患のタイプ、投与様式、および／または標的分子のタイプに依存して変化し得る。したがって、この範囲を下回る用量は、ある場合は十分であり得、または逆に、この範囲を上回る用量は、ある場合は必要とされるべきである。さらに、本発明の医薬組成物は、１日に１～数回、または１～数日の間隔で投与することができる。

別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明の化合物（例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド）を発現させることができるベクターと、上記される担体とを含む医薬組成物であり得る。このような発現ベクターは、本発明による複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるものであってよい。このような医薬組成物は、上記されるように、場合により薬学的に許容される添加剤を含み得る。この医薬組成物に含まれる発現ベクターの濃度は、例えば、担体のタイプに依存して変化するが、合理的には０．１ｎＭ～１００μＭの範囲であり、適切には１００ｎＭ～１０μＭの範囲である。この医薬組成物に含まれる担体対発現ベクターの重量比（すなわち、担体／発現ベクター比）は、例えば、発現ベクターの特性および担体のタイプに依存して変化するが、合理的には０．１～１００の範囲であり、適切には０．１～１０の範囲である。さらに、この医薬組成物に含まれる担体の含有量は、上記されるものと同じであり、調製手順もまた上記されるものと同じである。

治療用途
本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、またはこれらを含む本発明の医薬組成物（以下、「本発明の治療薬」と称する）は、療法、例えばヒトの治療に使用することができる。

本発明の治療薬は、代謝障害（例えば、肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病）、筋萎縮性疾患、または筋消耗性疾患、またはサルコペニア性疾患の予防または治療に使用するために提供され得る。筋萎縮性疾患または筋消耗性疾患の例としては、筋原性筋萎縮症（例えば、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、福山型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー）、先天性ミオパシー、封入体筋炎）、神経原性筋萎縮症（例えば、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症）、廃用筋萎縮症（例えば、卒中誘導型廃用症候群）、筋消耗性疾患（例えば、癌性悪液質、敗血症関連筋萎縮症）、および加齢に伴う骨格筋の喪失（加齢に関連したサルコペニア）を含む様々な種類のサルコペニア性疾患が挙げられ、筋ジストロフィーが特に適切である。

本発明の一部の実施形態では、筋萎縮性疾患、筋消耗性疾患またはサルコペニア性疾患の予防または治療のための方法が提供され、筋萎縮性疾患または筋消耗性疾患の予防または治療を必要とする対象に、本発明の治療薬の治療有効量を投与するステップを含む。特定の実施形態では、本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴマー）またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物は、本発明の医薬組成物の形態で対象に投与され得る。

本発明との関連では、用語「対象」は、ヒト対象、またはトリおよび非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ウマ）によって例示される非ヒト温血動物を意味することが意図される。「対象」は、好ましくはヒト対象である。

本発明の特定の実施形態では、筋萎縮性疾患または筋消耗性疾患の予防または治療のための医薬組成物の製造における本発明の治療薬の使用が提供される。
本発明の特定の実施形態では、筋萎縮性疾患または筋消耗性疾患の予防または治療のための医薬組成物の製造における本発明の化合物（例えば、アンチセンスオリゴマー）またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物の使用が提供される。

本発明の他の実施形態では、筋萎縮性疾患または筋消耗性疾患の治療に使用するための本発明の治療薬が提供される。

上記されるように、本発明の化合物は、例えば、エクソンスキッピングまたはｍＲＮＡ分解の誘導を介して、ｍＲＮＡレベルでのマイオスタチンシグナル伝達の阻害を可能にする。一実施形態では、本発明の化合物は、本発明のアンチセンスオリゴマーであり得る。

筋肉組織におけるマイオスタチンシグナルの阻害は、筋萎縮性疾患、筋消耗性疾患またはサルコペニア性疾患の予防または治療に適用され得る。骨格筋の萎縮は、対象の生活の質を低下させるだけでなく、栄養不良および呼吸不全などの重篤な全身性合併症を伴うため、この医療ニーズに対応することができる薬剤および治療が必要である。

したがって、本発明の治療薬を筋萎縮性疾患、筋消耗性疾患またはサルコペニア性疾患の予防または治療を必要とする対象に投与した場合、筋萎縮性疾患、筋消耗性疾患またはサルコペニア性疾患を予防または治療することができる。

本発明はまた、対象における療法に使用するための本発明の治療薬を提供する。
前記療法は、上記に列挙された疾患の予防または治療であり得る。
一実施形態では、療法は、対象における筋萎縮性疾患、筋消耗性疾患またはサルコペニア性疾患の予防または治療であり得る。一実施形態では、筋萎縮性疾患はデュシェンヌ型筋ジストロフィーであり得る。対象はヒト対象であり得る。

本発明はまた、対象における筋萎縮性疾患、筋消耗性疾患またはサルコペニア性疾患を予防または治療するための医薬（例えば、医薬組成物）の製造における、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物の使用を提供する。一実施形態では、筋萎縮性疾患はデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。一実施形態では、対象はヒトである。

用量および投与経路は、本発明の医薬組成物について列挙されたものと同じであり得る。

本発明はまた、対象における疾患を治療するための方法を提供し、前記対象に本発明の治療薬の治療有効量を投与するステップを含む。この疾患は、代謝性障害（例えば、肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病）、筋萎縮性疾患、筋消耗性疾患またはサルコペニア性疾患であり得る。筋萎縮性疾患または筋消耗性疾患の例としては、筋原性筋萎縮症（例えば、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、福山型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー）、先天性ミオパシー、封入体筋炎）、神経原性筋萎縮症（例えば、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症）、廃用筋萎縮症（例えば、卒中誘導型廃用症候群）、筋消耗性疾患（例えば、癌性悪液質、敗血症関連筋萎縮症）、および加齢に伴う骨格筋の喪失（加齢に関連したサルコペニア）を含む様々な種類のサルコペニア性疾患が挙げられ、筋ジストロフィーが特に適切である。一実施形態では、療法は、対象における筋萎縮性疾患、筋消耗性疾患またはサルコペニア性疾患の予防または治療であり得る。一実施形態では、筋萎縮性疾患はデュシェンヌ型筋ジストロフィーであり得る。対象はヒト対象であり得る。用量および投与経路は、本発明の医薬組成物について列挙されたものと同じであり得る。

動物
本発明はまた、ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部を欠くＡＣＶＲ２Ｂタンパク質の切断型バージョンを産生する遺伝子操作された動物（以下、「本発明のＧＭ動物」と称する）を提供する。本明細書で使用される場合、動物は、ヒトを除く任意の種であり得る。特に適した動物は、魚（例えば、マグロ）、ウシ、ヒツジ、ヤギまたはブタなどの家畜である。
当業者は、標準的な技術を用いて、このような遺伝子操作された動物を作製することができる。例えば、本発明のＧＭ動物は、本発明の化合物または本発明の医薬組成物を投与することによって生成することができる。例えば、本発明のＧＭ動物は、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９、ｓｉＲＮＡ、ｌｏｘＰノックアウトシステム、ＴＡＬＥＮ、亜鉛フィンガー（ＺＦＮ）またはアンチセンスオリゴマーによって生成することができる。

ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９を使用する場合、ＡＣＶＲ２ＢまたはＡＣＶＲ２Ｂの一部（例えば、野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域）をコードするゲノムＤＮＡの標的配列に相補的な配列を有するガイドＲＮＡを標的細胞または宿主動物に導入し、それによって切断される標的配列を同定する。標的細胞に導入されたＣａｓ９（またはＣａｓ９様）タンパク質は、ゲノムＤＮＡおよびガイドＲＮＡで構成される二本鎖部分を切断する。切断部位を修復するプロセスを通じて、変異（複数可）はヌクレオチドの欠損および／または挿入によって引き起こされ、それによってＡＣＶＲ２Ｂのノックアウトを引き起こす。ゲノムＤＮＡの標的配列の例としては、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソンの任意の配列、例えばＡＣＶＲ２Ｂのエクソン１～１１が挙げられる。好ましくは、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９、１０および１１からなる群、またはＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。一実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、９および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、９および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５および６からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン７、８および９からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン７および８からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンの任意の配列を含む。別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５である。さらに別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン６である。さらに別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン７である。さらに別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン８である。さらに別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン９である。さらに別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン１０である。さらに別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン１１である。さらに別の実施形態では、ゲノムＤＮＡの標的配列は、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン７、８、９および１０からなる群、またはＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンのいずれかの配列を含む。
あるいは、イントロンは、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９によって標的化され得る。例えば、エクソン８をサンドイッチするイントロン７および８を切断することができる。切断された部位が修復される場合、エクソン８が欠損し、エクソン８欠損変異型ｍＲＮＡが生成され得る。同様に、イントロン４および５、またはイントロン５および６、またはイントロン６および７、またはイントロン８および９、またはイントロン９および１０、またはイントロン１０および１１を切断するために標的化することができる。

ｓｉＲＮＡを用いてマイオスタチンシグナルを阻害した場合、ＡＣＶＲ２Ｂ ｍＲＮＡの配列を標的とするように設計されたｓｉＲＮＡが標的細胞に導入される。このように導入されたｓｉＲＮＡのガイド鎖が標的配列にハイブリダイズした場合、標的細胞の内因性ＲＩＳＣタンパク質は、ガイド鎖および標的ｍＲＮＡ鎖で構成される二本鎖部分を認識し、ｍＲＮＡの標的配列を切断する。これにより、本発明のＧＭ動物におけるＡＣＶＲ２Ｂタンパク質レベルが減少する。

先行技術文献、特許公報および他の特許文献を含めて、本明細書中で引用される全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれることに留意されたい。本発明を以下の例示的な実施例により、以下により詳細にさらに記載するが、本発明はそれに限定されない。

[参考実施例１]
アミノポリスチレンレジンにローディングした４－｛［（２Ｓ，６Ｒ）－６－（５－メチル－２，４－ジオキソピリミジン－１－イル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］メトキシ｝－４－オキソブタン酸
ステップ１：４－｛［（２Ｓ，６Ｒ）－６－（５－メチル－２，４－ジオキソピリミジン－１－イル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］メトキシ｝－４－オキソブタン酸の調製
アルゴン雰囲気下で、１－［（２Ｒ，６Ｓ）－６－（ヒドロキシメチル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］－５－メチルピリミジン－２，４－ジオン（４１．１１ｇ）および４－ジメチルアミノピリジン（４－ＤＭＡＰ）（１５．５８ｇ）をジクロロメタン（８５０ｍＬ）に懸濁し、次に、無水コハク酸（１２．７６ｇ）をそこに添加し、続いて室温で３．５時間撹拌した。反応溶液をジクロロメタンおよび１Ｍリン酸二水素ナトリウム水溶液で抽出した。得られた有機層を１Ｍリン酸二水素ナトリウム水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液で連続して洗浄した。得られた有機層を硫酸ナトリウム上で脱水し、減圧下で濃縮した。得られた固体にジクロロメタン（６００ｍＬ）を添加して結晶化させ、続いて濾過した。追加のジクロロメタン（３００ｍＬ）を添加した後、結晶を５分間撹拌し、次に濾過し、減圧下で一晩乾燥させて所望の製造物（５０．２ｇ）を得た。

ステップ２：アミノポリスチレンレジンにローディングした４－｛［（２Ｓ，６Ｒ）－６－（５－メチル－２，４－ジオキソピリミジン－１－イル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］メトキシ｝－４－オキソブタン酸の調製
４－｛［（２Ｓ，６Ｒ）－６－（５－メチル－２，４－ジオキソピリミジン－１－イル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］メトキシ｝－４－オキソブタン酸（５０．２ｇ）をピリジン（脱水）（６００ｍＬ）に溶解し、続いて４－ＤＭＡＰ（１２．４ｇ）および１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（７７．６ｇ）を添加した。アミノポリスチレンレジンであるアミノメチルレジン（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎの製品、Ａ００６７３、２００～４００メッシュ、１ｍｍｏｌ／ｇ、１％ＤＶＢ）（４０．５ｇ）およびトリエチルアミン（６９．６ｍＬ）をこの混合物に添加し、次に室温で４日間振とうした。反応後、レジンを濾過により回収した。得られたレジンをピリジン、メタノールおよびジクロロメタンで連続して洗浄し、次に減圧下で乾燥させた。得られたレジンに、テトラヒドロフラン（無水）（５００ｍＬ）、無水酢酸（１０４ｍＬ）および２，６－ルチジン（１２８ｍＬ）を添加し、次に室温で４時間振とうした。レジンを濾過により回収し、ピリジン、メタノールおよびジクロロメタンで連続して洗浄し、次に減圧下で乾燥させて、５９．０ｇの所望の製造物を得た。

所望の製造物のローディング量を決定するために、レジンの１グラムあたりのトリチルのモル量を、４０９ｎｍでのＵＶ吸光度として既知の方法で測定した。レジンへのローディング量は４６７．８３μｍｏｌ／ｇであることが分かった。
ＵＶ測定条件
機器：Ｕ－２９１０（Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）
溶媒：メタンスルホン酸
波長：４０９ｎｍ
ε値：４５０００

[参考実施例２]
アミノポリスチレンレジンにローディングした４－｛［（２Ｓ，６Ｒ）－６－（４－ベンズアミド－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］メトキシ｝－４－オキソブタン酸
参考実施例１に示されるのと同じ手順を繰り返して、参考実施例１のステップ１で使用した１－［（２Ｒ，６Ｓ）－６－（ヒドロキシメチル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］－５－メチルピリミジン－２，４－ジオンを、このステップではＮ－｛１－［（２Ｒ，６Ｓ）－６－（ヒドロキシメチル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－４－イル｝ベンズアミドで置き換えたことを除いて、表題化合物を調製した。

所望の製造物のローディング量を決定するために、レジンの１グラムあたりのトリチルのモル量を、４０９ｎｍでのＵＶ吸光度として既知の方法で測定した。レジンへのローディング量は４６０．２８μｍｏｌ／ｇであることが分かった。

[参考実施例３]
アミノポリスチレンレジンにローディングした４－｛［（２Ｓ，６Ｒ）－６－（６－ベンズアミドプリン－９－イル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］メトキシ｝－４－オキソブタン酸
参考実施例１に示されたのと同じ手順を繰り返して、参考実施例１のステップ１で使用した１－［（２Ｒ，６Ｓ）－６－（ヒドロキシメチル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］－５－メチルピリミジン－２，４－ジオンを、このステップではＮ－｛９－［（２Ｒ，６Ｓ）－６－（ヒドロキシメチル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］プリン－６－イル｝ベンズアミドで置き換えたことを除いて、表題化合物を調製した。

所望の製造物のローディング量を決定するために、レジンの１グラムあたりのトリチルのモル量を、４０９ｎｍでのＵＶ吸光度として既知の方法で測定した。レジンへのローディング量は４２５．１３μｍｏｌ／ｇであることが分かった。

[参考実施例４]
アミノポリスチレンレジンにローディングした４－｛（２Ｓ，６Ｒ）－６－｛６－（２－シアノエトキシ）－２－［（２－フェノキシアセチル）アミノ］プリン－９－イル｝－４－トリチルモルホリン－２－イル｝メトキシ｝－４－オキソブタン酸
参考実施例１に示されたのと同じ手順を繰り返して、参考実施例１のステップ１で使用した１－［（２Ｒ，６Ｓ）－６－（ヒドロキシメチル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］－５－メチルピリミジン－２，４－ジオンを、このステップではＮ－｛６－（２－シアノエトキシ）－９－［（２Ｒ，６Ｓ）－６－（ヒドロキシメチル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］プリン－２－イル｝－２－フェノキシアセトアミドで置き換えたことを除いて、表題化合物を調製した。

所望の製造物のローディング量を決定するために、レジンの１グラムあたりのトリチルのモル量を、４０９ｎｍにおけるＵＶ吸光度として既知の方法で測定した。レジンへのローディング量は３４１．０９μｍｏｌ／ｇであることが分かった。

以下に示される実施例１の記載に従って、または核酸シンセサイザー（ＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ １０ｐｌｕｓ）を用いる国際出願第ＰＣＴ／ＪＰ２０１５／５７１８０号明細書に記載された手順に従って、ＰＭＯを合成した（５’末端は基（３）である）。合成されたＰＭＯの中で、スキッピング活性を示すものを表１に列挙した。

[実施例１]
アミノポリスチレンレジンにローディングした４－｛［（２Ｓ，６Ｒ）－６－（５－メチル－２，４－ジオキソピリミジン－１－イル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］メトキシ｝－４－オキソブタン酸（参考実施例１）、またはアミノポリスチレンレジンにローディングした４－｛［（２Ｓ，６Ｒ）－６－（４－ベンズアミド－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］メトキシ｝－４－オキソブタン酸（参考実施例２）、またはアミノポリスチレンレジンにローディングした４－｛［（２Ｓ，６Ｒ）－６－（６－ベンズアミドプリン－９－イル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］メトキシ｝－４－オキソブタン酸（参考実施例３）、またはアミノポリスチレンレジンにローディングした４－｛｛（２Ｓ、６Ｒ）－６－｛６－（２－シアノエトキシ）－２－［（２－フェノキシアセチル）アミノ］プリン－９－イル｝－４－トリチルモルホリン－２－イル｝メトキシ｝－４－オキソブタン酸（参考実施例４）は、各々５’末端塩基に対応し、ペプチドシンセサイザー（ＦＯＣＵＳ）を使用して次の合成サイクルを開始するために、フィルターを備えた反応容器に０．１ｇの量で充填させた。表１に指示される各化合物のヌクレオチド配列を与えるために、所望のモルホリノモノマー化合物を各カップリングサイクルに添加した（下記の表２を参照されたい）。

使用したデブロッキング溶液は、トリフルオロ酢酸（２当量）とトリエチルアミン（１当量）の混合物を、１％（ｖ／ｖ）エタノールおよび１０％（ｖ／ｖ）２，２，２－トリフルオロエタノールを含むジクロロメタン溶液中に３％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解することによって調製されたことに留意されたい。使用した中和溶液は、２５％（ｖ／ｖ）の２－プロパノールを含むジクロロメタン溶液中に５％（ｖ／ｖ）の濃度でＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを溶解することによって調製された。使用した活性剤溶液は、２０％（ｖ／ｖ）のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを含む１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン溶液であった。使用したモノマー溶液は、テトラヒドロフラン中に０．２０Ｍの濃度でモルホリノモノマー化合物を溶解することによって調製された。使用したキャッピング溶液は、ジクロロメタン中に１０％（ｖ／ｖ）で無水酢酸および１５％（ｖ／ｖ）で２，６－ルチジンを溶解することによって調製された。

上記で合成したＰＭＯをローディングしたアミノポリスチレンレジンを反応容器から回収し、減圧下で３０℃にて２時間以上乾燥させた。アミノポリスチレンレジンにローディングした乾燥ＰＭＯを反応容器に投入し、それに５ｍＬの２８％アンモニア－エタノール水溶液（１／３）を添加し、続いて５５℃で１６時間放置した。アミノポリスチレンレジンを濾過により分離し、３ｍＬの水－アセトニトリル（１／１）で洗浄した。得られた濾液をエタノール（３ｍＬ）およびジエチルエーテル（３５ｍＬ）と混合した後、混合物を遠心分離し、上清を除去するためにデカントし、残渣を減圧下で乾燥させた。得られた残渣を２０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液およびアセトニトリル（４／１）を含む１０ｍＬの混合溶媒に溶解し、次に逆相ＨＰＬＣにより精製した。使用条件は、下記の表３に指示される通りである。

画分をそれぞれ分析し、所望の製造物を回収した。得られた溶液を０．１Ｍ塩酸水溶液（４ｍＬ）と混合し、２時間放置した。反応後、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．４ｍＬ）を添加して、混合物を中和し、次に、メンブランフィルター（０．２２ｍ）を通して濾過した。

所望の製造物を含む得られた水溶液を１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．４ｍＬ）でアルカリ性にし、陰イオン交換レジンカラムを通して精製した。使用条件は、下記の表４に指示される通りである。

画分を各々（ＨＰＬＣにより）分析して、所望の製造物を水溶液として得た。得られた水溶液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で中和し、次、下記の表５に示される条件下で逆相ＨＰＬＣにより脱塩した。

所望の製造物を回収し、減圧下で濃縮した。得られた残渣を水に溶解し、凍結乾燥して、所望の化合物を白色綿状固体として得た。ＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＳの計算値と測定値を表１に示す。

[実施例２]
アンチセンスオリゴマー－ペプチドコンジュゲート（ＰＭＯ－ペプチドコンジュゲート）の合成

ＰＭＯ（ＰＭＯ Ｎｏ．１５、１８．１ｍｇ、１．０当量）をＤＭＳＯ（２８４．０μＬ）およびＤＭＦ（１７．５μＬ）に溶解した。この溶液にＤＭＳＯ（２３．２μＬ）およびＤＭＦ（２２．２μＬ）中の４－マレイミド酪酸（１．７ｍｇ、４．０当量）とＷＳＣＩ・ＨＣｌ（２．２ｍｇ、５．０当量）の混合物を添加した。反応混合物を４５℃で６時間撹拌した。反応がほぼ完了に達した後、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１３．２ｍＬ）を混合物に添加して沈殿物を得た。沈殿物を遠心分離により回収し、続いて真空中で乾燥させた。乾燥させた沈殿物をＤＭＳＯ（１７５．０μＬ）およびＨ_２Ｏ（５２．７μＬ）に再溶解した。得られた溶液にｈＬＩＭＫ（Ａｃ－ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＣ－ＣＯＮＨ_２、５．１ｍｇ、１．２当量）（配列番号１１２）を添加し、混合物を４５℃で３０分間撹拌した。ＨＰＬＣ分析による反応の完了を確認した後、アセトニトリル溶液（Ｈ_２Ｏ中１０％；４００μＬ）の添加により反応を停止させた。溶液を水（約４０ｍＬ）で希釈し、所望の製造物を陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。使用条件を下記の表６に示す。

画分をＨＰＬＣで分析し、適切な画分を回収した。水溶液を水で７回希釈し、次に、下記の表７に示される条件下で逆相ＨＰＬＣにより脱塩した。

所望の製造物を回収し、減圧下で濃縮した。得られた残渣を水に溶解し、凍結乾燥して所望の化合物（ＰＰＭＯ Ｎｏ．１と称する）を白色綿状固体（７．７ｍｇ、収率３４．０％）として得た。

得られた化合物（ＰＰＭＯ Ｎｏ．１）の分子量は、ＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＳを用いて決定した（計算値：９９７３．９２、観測値：９９７３．５４）。

[実施例３]
アンチセンスオリゴマーのスキッピング活性の評価
細胞内へのＰＭＯのトランスフェクション
３×１０^５個のＲＤ細胞（ヒト横紋筋肉腫細胞株）に、表１に示されるアンチセンスオリゴマーを各々、１０または３０μＭで、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ（Ｌｏｎｚａ）およびＡｍａｘａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔを用いてトランスフェクトした。使用したパルスプログラムはＴ－０３０であった。
トランスフェクション後、細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で５％ＣＯ_２下、６ウェルプレートのウェルで培養した。トランスフェクションの３日後、培地を０．４ｎｇ／ｍＬの組換えマイオスタチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む無血清ＤＭＥＭに置換し、細胞をさらに２時間、３７℃にて５％ＣＯ_２下で培養した。

ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴヌクレオチドの細胞へのトランスフェクション
トランスフェクションの前日に、ＲＤ細胞を３×１０^４細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中、５％ＣＯ_２下で培養した。翌日、表８に示される２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴヌクレオチド（ＪｂｉｏＳ）のアンチセンスオリゴマーを各々、１０または３０ｎＭで、リポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後の３日間、細胞を培養した。

細胞内へのＰＭＯ－ペプチドコンジュゲートのジムノティック（gymnotic）送達
トランスフェクションの前日に、ＲＤ細胞を４×１０^４細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中、５％ＣＯ_２下で培養した。翌日、実施例２で合成されたアンチセンスオリゴマー－ペプチドコンジュゲート（ＰＭＯ－ペプチドコンジュゲート）を培地に添加した。細胞をＰＭＯ－ペプチドコンジュゲートの添加後の３日間培養した。

ＲＮＡ抽出
細胞をＰＢＳ（Ｎｉｓｓｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）で１回洗浄し、次に、１％の２－メルカプトエタノール（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）を含む３５０μＬの緩衝液ＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ）を細胞に添加し、細胞を室温で数分間放置することにより溶解させた。細胞溶解物をＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒホモジナイザー（Ｑｉａｇｅｎ）に回収し、２０，４００×ｇで２分間、遠心分離してホモジネートを調製した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）の製造者の指示に従って全ＲＮＡを抽出した。抽出された全ＲＮＡの濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。

スキッピング効率の測定
抽出された全ＲＮＡ（１５０ｎｇ）を鋳型として用い、ＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたワンステップＲＴ－ＰＣＲを行った。キットに添付されたプロトコルに従って反応溶液を調製した。使用したサーマルサイクラーは、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｔｏｕｃｈ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）であった。使用したＲＴ－ＰＣＲプログラムは、以下に示される通りである。
５０℃で３０分間：逆転写反応
９５℃で１５分間：ポリメラーゼ活性化、逆転写酵素不活性化
［９４℃で３０秒間；６２℃で３０秒間；７２℃で５０秒間］×３２サイクル：ＰＣＲ
７２℃で７分間：最終伸長反応

ＲＴ－ＰＣＲに用いるフォワードプライマーおよびリバースプライマーのヌクレオチド配列は、以下に示される通りである。
エクソン５のスキッピングの検出用：
フォワードプライマー：５’－ＴＧＣＴＡＣＧＡＴＡＧＧＣＡＧＧＡＧＴＧ－３’（配列番号３７）
リバースプライマー：５’－ＡＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＧＴＧＣＴＴＣＡＴ－３’（配列番号３８）
エクソン６、７、または８のスキッピングの検出用：
フォワードプライマー：５’－ＣＡＴＧＴＧＧＡＣＡＴＣＣＡＴＧＡＧＧＡ－３’（配列番号３９）
リバースプライマー：５’－ＧＡＧＡＣＡＣＡＡＧＣＴＣＣＣＡＣＡＧＣ－３’（配列番号４０）
エクソン９または１０のスキッピングの検出用：
フォワードプライマー：５’－ＴＣＴＡＴＴＧＣＣＣＡＣＡＧＧＧＡＣＴＴ－３’（配列番号４１）
リバースプライマー：５’－ＧＡＧＣＣＴＣＴＧＣＡＴＣＡＴＧＧＴＣ－３’（配列番号４２）

上記ＰＣＲ反応液（１μＬ）をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて分析した。エクソンスキッピングを伴うＰＣＲアンプリコン、すなわち切断型ＡＣＶＲ２Ｂ ｃＤＮＡのポリヌクレオチドモル濃度「Ａ」、および野生型ＰＣＲアンプリコン、すなわち野生型ＡＣＶＲ２Ｂ ｃＤＮＡのポリヌクレオチドモル濃度「Ｂ」を測定した。これらの「Ａ」および「Ｂ」の測定値に基づき、下記式に従ってスキッピング効率を決定し
た。
スキッピング効率（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）×１００
得られた結果を図１ａ～ｄに示す。図１ａ～ｄは、本発明のアンチセンスオリゴマーおよびアンチセンスオリゴマー－ペプチドコンジュゲートがエクソンスキッピングを引き起こすことを示した。

[実施例４]
ドミナントネガティブ活性の測定
８×１０^３個のＨＥＫ－２９３細胞（ヒト胚性腎細胞株）を９６ウェル白色プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に播種し、１０％ＦＢＳを含む最小必須培地イーグル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３７℃にて５％ＣＯ_２下で培養した。翌日、各エクソン（エクソン５、６、７、８、９または１０）スキッピング生成物（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＧｅｎｏｍｉｃｓをコードするＤＮＡを有する１０ｎｇのｐＢＡｐｏ－ＣＭＶ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）、および１４ｎｇのルシフェラーゼレポーターＤＮＡ（Ｃｉｇｎａｌ ＳＭＡＤ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）をリポフェクタミンＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、無血清最小必須培地イーグルで希釈された組換えマイオスタチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で培地に添加した。さらに２４時間の培養後、ルシフェラーゼレポーターアッセイを、製造者の指示に従ってＤｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。ルシフェラーゼ活性をルミノメーター、Ｔｅｃａｎ ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００ ＰＲＯ（Ｔｅｃａｎ）を用いて測定した。

得られた結果を図２に示す。図２に示されるように、マイオスタチンの添加によって誘導されたルシフェラーゼ活性は、各エクソンスキッピング生成物をコードするＤＮＡでトランスフェクトされた細胞においてほぼ完全に抑制された。図２は、エクソンスキッピング（エクソン５、６、７、８、９および１０）のいずれもマイオスタチンシグナルを効果的に抑制し得ることを示した。

[実施例５]
マイオスタチンシグナルの測定
抽出された全ＲＮＡ（３６０ｎｇ）を鋳型として使用し、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＲＴ反応を行った。反応溶液の調製および熱条件は、キットの製造者の指示に従った。使用したサーマルサイクラーは、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｔｏｕｃｈ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）であった。
ＲＴ反応溶液（０．６μＬ）を鋳型として使用し、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ならびにＳＭＡＤ７およびＰＰＩＢのＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲに使用した機器は、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。

得られた結果を図３に示す。
図３に示されるように、ＳＭＡＤ７遺伝子の発現は、マイオスタチンによる刺激により６倍増加した。本発明のアンチセンスオリゴマーは、ＳＭＡＤ７遺伝子の発現増加を抑制した。
これらのアンチセンスオリゴマーは、ＢＬＡＳＴ分析においてＳＭＡＤ７遺伝子に相同性を示さない。したがって、これらのＳＭＡＤ７遺伝子発現阻害活性は、マイオスタチンシグナル阻害活性に特異的である。

Claims (33)

1. 野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部もしくは全部をコードする配列の一部が存在しない変異型アクチビン受容体２Ｂ型（ＡＣＶＲ２Ｂ）ｍＲＮＡを標的細胞が産生することを可能にすることができる化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
2. 野生型ＡＣＶＲ２Ｂの前記細胞内領域が野生型ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５～１１によってコードされる、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
3. 野生型ＡＣＶＲ２Ｂの前記細胞内領域の一部を欠く切断型ＡＣＶＲ２Ｂタンパク質を前記標的細胞に産生させることができる、請求項１または２に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
4. 前記切断型ＡＣＶＲ２Ｂタンパク質が、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される少なくとも１つのエクソンによってコードされる前記細胞内領域の全部または一部を欠いている、請求項３に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
5. ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部をコードするエクソンのスキップを誘導することができるアンチセンスオリゴマーである、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
6. スキップされる前記エクソンが、ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される、請求項５に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
7. １０～５０個の核酸塩基を含む、請求項５または６に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
8. ＡＣＶＲ２Ｂのエクソン５、６、７、８、９および１０からなる群から選択されるエクソンの１０～５０個の連続するヌクレオチドに相補的な配列を含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
9. 前記エクソンが、配列番号１～６からなる群から選択される配列を含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
10. 配列番号１２～３６および４３～１１１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項５～９のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
11. 配列番号１２～３６および４３～１１１からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、請求項５～１０のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
12. 前記アンチセンスオリゴマーがオリゴヌクレオチドである、請求項５～１１のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
13. 前記オリゴヌクレオチドにおける少なくとも１つの糖部分および／または少なくとも１つのリン酸結合部分が修飾されている、請求項１２に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
14. 前記修飾された糖部分が、２’位の－ＯＨ基が、ＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、Ｎ_３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ（Ｒはアルキルまたはアリールを表し、Ｒ’はアルキレンを表す）からなる群から選択されるいずれかの基で置換されているリボースである、請求項１３に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
15. 前記修飾されたリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合およびボラノホスフェート結合からなる群から選択される、請求項１３または１４に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
16. 前記アンチセンスオリゴマーが少なくとも１つのモルホリノ環を含む、請求項５～１１のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
17. モルホリノオリゴマーまたはホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、請求項１６に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
18. 下記の化学式（１）～（３）
    

    

    で表される基のいずれか１つをその５’末端に有する、請求項１６または１７に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
19. 請求項１～１８のいずれか一項に記載の化合物に細胞浸透性ペプチドが結合されたコンジュゲートである化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物。
20. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物を含む医薬組成物。
21. 少なくとも１つの薬学的に許容される担体または添加剤をさらに含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
22. 凍結乾燥されている、請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
23. 対象における療法に使用するための、請求項１～１９のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、あるいは請求項２０～２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
24. 前記療法が、対象における筋萎縮性疾患、筋肉消耗性疾患もしくはサルコペニア性疾患の予防または治療である、請求項２３に記載の使用のための化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、あるいは請求項２３に記載の使用のための医薬組成物。
25. 前記筋萎縮性疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項２４に記載の使用のための化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、あるいは請求項２４に記載の使用のための医薬組成物。
26. 前記対象がヒトである、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の使用のための化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物、あるいは請求項２３～２５のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
27. 対象における筋萎縮性疾患、筋消耗性疾患またはサルコペニア性疾患を治療する方法であって、請求項１～１９のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物の治療有効量、あるいは請求項２０～２２のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
28. 前記筋萎縮性疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項２７に記載の方法。
29. 前記対象がヒトである、請求項２７または２８に記載の方法。
30. 対象における筋萎縮性疾患、筋消耗性疾患、またはサルコペニア性疾患を予防または治療するための医薬の製造における、請求項１～１９のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物の使用。
31. 前記筋萎縮性疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項３０に記載の使用。
32. 前記対象がヒトである、請求項３０または３１に記載の使用。
33. 野生型ＡＣＶＲ２Ｂの細胞内領域の一部または全部をコードする配列の一部が存在しない、変異型アクチビン受容体２Ｂ型（ＡＣＶＲ２Ｂ）ｍＲＮＡを発現する遺伝子操作された動物。
    

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