BR112021012488A2 - Inibidor de sinal de miostatina - Google Patents

Inibidor de sinal de miostatina Download PDF

Info

Publication number
BR112021012488A2
BR112021012488A2 BR112021012488-8A BR112021012488A BR112021012488A2 BR 112021012488 A2 BR112021012488 A2 BR 112021012488A2 BR 112021012488 A BR112021012488 A BR 112021012488A BR 112021012488 A2 BR112021012488 A2 BR 112021012488A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
acvr2b
compound
pharmaceutically acceptable
hydrate
acceptable salt
Prior art date
Application number
BR112021012488-8A
Other languages
English (en)
Inventor
Shinichiro Nakagawa
Original Assignee
Nippon Shinyaku Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nippon Shinyaku Co., Ltd. filed Critical Nippon Shinyaku Co., Ltd.
Publication of BR112021012488A2 publication Critical patent/BR112021012488A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knockout animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/054—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing loss of function
    • A01K2217/058—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing loss of function due to expression of inhibitory nucleic acid, e.g. siRNA, antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3233—Morpholino-type ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/11—Applications; Uses in screening processes for the determination of target sites, i.e. of active nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

inibidor de sinal de miostatina. a presente invenção fornece uma nova abordagem para inibir sinalização de miostatina alvejando-se acvr2b no nível de mrna.

Description

“INIBIDOR DE SINAL DE MIOSTATINA” ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[0001] A miostatina, também conhecida como GDF8, foi descoberta em 1997 como uma citocina inovadora pertencente à superfamília TGF-β. A expressão de tecido de miostatina é específica em músculo esquelético que é o tecido principal responsável por atividades motoras e metabólicas. Os animais que têm mutações de deficiência de miostatina mostram hipertrofia muscular significativa em que a quantidade de músculo esquelético aumenta em duas vezes o tamanho de sua contraparte do tipo selvagem (McPherron et al., Nature. 387(6628):83–90, 1997). Com base nessa observação, a miostatina é considerada por servir como um fator importante no controle de volume muscular esquelético.
[0002] Quando a miostatina transduz seu sinal ao interior de uma célula, essa passa por um processo semelhante a outro TGF-β em que primeiro se liga a um receptor do tipo II, que, então, se associa a um receptor do tipo I para formar um complexo ligante-receptor. Através desse processo, cada um dos receptores é submetido à fosforilação em seu domínio intercelular, que resulta na transdução de sinal através de via de dependente de Smad ou independente de Smad (Chang et al., Endocrine Reviews. 23(6):787–823, 2002). Tanto os receptores do tipo I quanto do tipo II são codificados por múltiplos genes, respectivamente. Cada molécula que pertence à superfamília TGF-β se liga a uma combinação específica de receptores. A miostatina se liga a uma combinação de ALK4 ou ALK5 para receptor do tipo I e ACVR2B para receptor do tipo II. No entanto, a dita combinação não é exclusiva para miostatina, e é usada por algumas outras moléculas de superfamília TGF- β, que incluem GDF11, activina A, e assim por diante (Wakefield e Hill. Nat Rev Cancer.13(5):328–41, 2013, doi:10.1038/nrc3500. Desse modo, a ligação de ligantes além de miostatina ao ACVR2B/ALK4 ou ACVR2B/ALK5 pode acionar a transdução de sinais supressores para volume muscular assim como a ligação de miostatina. De fato, relatou-se que a administração de um anticorpo neutro contra ACVR2B ou ACVR2B solúvel em que o domínio transmembranar e regiões a jusantes da mesma são substituídas com um domínio de anticorpo-Fc, para um camundongo deficiente do gene miostatina aumenta adicionalmente o volume muscular além do aumento causado por deficiência de miostatina (consulte Lach-Trifilieff et al., Mol Cell Biol. 34(4):606–18, 2014. doi: 10.1128/MCB.01307–13; Lee et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 102(50):18117–22, 2005). Esse aumento adicional sugere que existe fatores adicionais para miostatina que suprimem o volume muscular por ligação ao ACVR2B.
[0003] Meios para reduzir a sinalização de miostatina podem ser úteis no tratamento ou na prevenção de fadiga muscular particular e outras doenças relacionadas a músculo. A presente invenção fornece uma nova abordagem para inibir sinalização de miostatina alvejando-se ACVR2B no nível de mRNA.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0004] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecido um composto que é capaz de permitir que uma célula-alvo produza um mRNA de receptor de activina tipo 2B (ACVR2B) mutante em que uma parte da sequência de mRNA que codifica parte ou toda a região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem está ausente.
[0005] De acordo com uma variação do primeiro aspecto da invenção, é fornecido um composto que é capaz de fazer com que a proteína de receptor de activina tipo 2B (ACVR2B) seja produzida como uma versão truncada que carece de parte da região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
[0006] Em modalidades particulares, o composto é um oligonucleotídeo que é capaz de efetuar o salto de éxon de um ou mais dos éxons, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 de ACVR2B.
[0007] De acordo com um segundo aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende o composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo do primeiro aspecto da invenção.
[0008] De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é fornecido o composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo do primeiro aspecto da invenção ou a composição farmacêutica do segundo aspecto da invenção para uso em terapia. Em uma modalidade particular, a terapia é a prevenção ou o tratamento de uma doença de fadiga muscular, uma doença sarcopênica ou uma doença amiotrófica, como distrofia muscular de Duchenne.
[0009] De acordo com um quarto aspecto da invenção, é fornecido um animal geneticamente manipulado que expressa um mRNA de ACVR2B mutante que carece de parte da região intracelular de ACVR2B.
[0010] Aspectos e modalidades particulares da invenção incluem:
[1] Um composto que é capaz de permitir que uma célula- alvo produza um mRNA de receptor de activina tipo 2B (ACVR2B) mutante em que uma parte da sequência que codifica parte ou toda a região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem está ausente, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
[2] O composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com [1], em que a dita região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem é codificada por éxons 5 a 11 de ACVR2B do tipo selvagem.
[3] O composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com [1] ou [2], que é capaz de fazer com que a célula-alvo produza uma proteína de ACVR2B truncada que carece de parte da região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem.
[4] O composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com [3], em que a proteína de ACVR2B truncada carece de toda ou parte da região intracelular codificada por pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9 e 10 de ACVR2B.
[5] O composto, de acordo com qualquer um de [1] a [3], que é um oligômero antissenso com a capacidade para induzir o salto de uma éxon que codifica uma parte da região intracelular de ACVR2B, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
[6] O composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com [5], em que o dito éxon a ser saltado é selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9 e 10 de ACVR2B.
[7] O composto, de acordo com [5] ou [6], que compreende 10–50 nucleobases, ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
[8] O composto, de acordo com qualquer um de [5] a [7], que compreende uma sequência complementar a 10 a 50 nucleotídeos consecutivos de um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9 e 10 de ACVR2B, ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
[9] O composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com qualquer um de [5] a [8], em que o éxon compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 6.
[10] O composto, de acordo com qualquer um de [5] a [9], que compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 12 a 36 e 43 a 111, ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
[11] O composto, de acordo com qualquer um de [5] a [10], que consiste em uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 12 a 36 e 43 a 111, ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
[12] O composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com qualquer um de [5] a [11], em que o oligômero antissenso é um oligonucleotídeo.
[13] O composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com [12], em que pelo menos uma fração de açúcar e/ou pelo menos uma fração de ligação de fosfato no oligonucleotídeo é modificada.
[14] O composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com [13], em que a fração de açúcar modificada é uma ribose na qual o grupo -OH na posição 2′ é substituído com qualquer grupo selecionado a partir do grupo que consiste em OR, R, R′OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br e I (em que R representa alquila ou arila, e R′ representa alquileno).
[15] O composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com [13] ou [14], em que a fração de ligação de fosfato modificada é uma selecionada a partir do grupo que consiste em uma ligação de fosforotioato, uma ligação de fosforoditioato, uma ligação de alquilfosfonato, uma ligação de fosforoamidato e uma ligação de boranofosfato.
[16] O composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com qualquer um de [5] a [11], em que o oligômero antissenso compreende pelo menos um anel de morfolino.
[17] O composto, de acordo com [16], que é um oligômero de morfolino ou oligômero de morfolino de fosforodiamidato, ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
[18] O composto, de acordo com [16] ou [17], que tem qualquer um dos grupos representados pelas fórmulas químicas (1) a (3) mostradas abaixo em suas extremidades 5′-terminal, ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
[19] Um composto que é um conjugado em que um peptídeo de penetração de célula é ligado ao composto, de acordo com qualquer um de [1] a [18], ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
[20] Uma composição farmacêutica que compreende o composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com qualquer um de [1] a [19].
[21] A composição farmacêutica, de acordo com [20], que compreende adicionalmente pelo menos um carreador ou aditivo farmaceuticamente aceitável.
[22] A composição farmacêutica, de acordo com [20] ou [21], que é liofilizada.
[23] O composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com qualquer um de [1] a [19], ou a composição farmacêutica, de acordo com qualquer um de
[20] a [22], para uso em terapia em um indivíduo.
[24] O composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo para uso ou composição farmacêutica para uso, de acordo com [23], em que a terapia é a prevenção ou o tratamento de uma doença amiotrófica, uma doença de fadiga muscular ou uma doença sarcopênica em um indivíduo.
[25] O composto ou sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável para uso ou composição farmacêutica para uso, de acordo com [24], em que a doença amiotrófica é distrofia muscular de Duchenne.
[26] O composto ou sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável para uso ou composição farmacêutica para uso, de acordo com qualquer um de [23] a [25], em que o indivíduo é um ser humano.
[27] Um método para tratar uma doença amiotrófica, uma doença de fadiga muscular ou uma doença sarcopênica em um indivíduo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com qualquer um de [1] a [19], ou a composição farmacêutica, de acordo com qualquer um de [20] a [22].
[28] O método, de acordo com [27], em que a doença amiotrófica é distrofia muscular de Duchenne.
[29] O método, de acordo com [27] ou [28], em que o indivíduo é um ser humano.
[30] Uso do composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com qualquer um de [1] a [19], na fabricação de um medicamento para prevenir ou tratar uma doença amiotrófica, uma doença de fadiga muscular ou uma doença sarcopênica em um indivíduo.
[31] O uso, de acordo com [30], em que a doença amiotrófica é distrofia muscular de Duchenne.
[32] O uso, de acordo com [30] ou [31], em que o indivíduo é um ser humano.
[33] Um animal geneticamente manipulado que expressa um mRNA de receptor de activina tipo 2B (ACVR2B) mutante em que uma parte da sequência que codifica parte ou toda a região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem está ausente.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0011] A Figura 1 mostra a eficácia de salto (%) de cada éxon pelos oligômeros de morfolino de fosforodiamidato (PMOs) indicados (a e b), oligonucleotídeos (c)de fosforotioato (PS) ou um conjugado de PMO-peptídeo (d). A Figura 2 mostra a supressão de sinalização de miostatina pela expressão de ACVR2B truncado em que o ACVR2B truncado é expresso de modo dominante sobre o ACVR2B endógeno do tipo selvagem. A Figura 3 mostra a supressão de expressão de mRNA de SMAD7 que serve como um índice de intensidade de sinal de miostatina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0012] A presente invenção será descrita em maiores detalhes abaixo. As seguintes modalidades se destinam a descrever a presente invenção a título de exemplo apenas e não se destinam a limitar a presente invenção apenas a essas modalidades. A presente invenção pode ser implantada em vários modos sem se afastar do espírito da presente invenção. As sequências de nucleotídeo são apresentadas de maneira que a extremidade 5′ seja colocada na extremidade esquerda e a extremidade 3′ seja colocada na extremidade direita. As sequências de aminoácido são apresentadas de maneira que terminal N seja colocado na extremidade esquerda e terminal C seja colocado na extremidade direita. Composto
[0013] A presente invenção fornece um composto que é capaz de permitir que uma célula-alvo produza um mRNA de receptor de activina tipo 2B (ACVR2B) mutante em que uma parte da sequência de mRNA que codifica parte ou toda a região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem está ausente, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
[0014] A proteína de ACVR2B também é conhecida como ActRIIB e consiste em 512 aminoácidos. A localização de mapa citogênico de ACVR2B é 3p22–p21.3. ACVR2B consiste em três domínios principais, um domínio de ligação de ligante extracelular, um domínio transmembranar e um domínio de serina/treonina quinase intracelular. Ishikawa et al. (Journal of Human Genetics volume 43, páginas 132– 134 (1998)) relatou que o gene ACVR2B contém 11 éxons e abrange aproximadamente 30 kb. A sequência de mRNA do ACVR2B humano do tipo selvagem (doravante no presente documento denominado “ACVR2B do tipo selvagem”) é revelada na Sequência de Referência NCBI: NM_001106.4 e no presente documento em SEQ ID NO: 8.
[0015] Uma sequência de codificação representativa (CDS) de ACVR2B humano é mostrada em SEQ ID NO: 10. Uma sequência de nucleotídeo de CDS de ACVR2B não é limitada a uma mostrada como SEQ ID NO: 10, e inclui sequências variantes que têm 90 % ou mais, 91 % ou mais, 92 % ou mais, 93 % ou mais, 94 % ou mais, 95 % ou mais, 96 % ou mais, 97 % ou mais, 98 % ou mais, 99 % ou mais ou 100 % do comprimento de SEQ ID NO: 10 e uma identidade de sequência de 90 % ou mais, 91 % ou mais, 92 % ou mais, 93 % ou mais, 94 % ou mais, 95 % ou mais, 96 % ou mais, 97 % ou mais, 98 % ou mais, 99 % ou mais ou 100 % para SEQ ID NO: 10.
[0016] Uma sequência de aminoácido representativa de proteína de ACVR2B humana é mostrada em SEQ ID NO: 11. Uma sequência de aminoácido de proteína de ACVR2B não é limitada a uma como SEQ ID NO: 11, e inclui sequências variantes que têm 90 % ou mais, 91 % ou mais, 92 % ou mais, 93 % ou mais, 94 % ou mais, 95 % ou mais, 96 % ou mais, 97 % ou mais, 98 % ou mais, 99 % ou mais ou 100 % do comprimento de SEQ ID NO: 11 e uma identidade de sequência de 90 % ou mais, 91 % ou mais, 92 % ou mais, 93 % ou mais, 94 % ou mais, 95 % ou mais, 96 % ou mais, 97 % ou mais, 98 % ou mais, 99 % ou mais ou 100 % para SEQ ID NO: 11.
[0017] Quando o composto da presente invenção for fornecido a uma célula que expressa ACVR2B, isso faz com que a célula produza um mRNA de ACVR2B mutante em que uma parte da sequência de mRNA que codifica parte ou toda a região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem está ausente. Um “mRNA de ACVR2B mutante em que uma parte da sequência de mRNA que codifica parte ou toda a região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem está ausente” (doravante no presente documento denominado “o mRNA de ACVR2B mutante da presente invenção” significa um mRNA de ACVR2B mutante/variante que carece de uma parte da sequência encontrada em mRNA de ACVR2B do tipo selvagem, e em que a dita sequência que está ausente com relação ao ACVR2B do tipo selvagem codifica parte ou toda a região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem, ou um mRNA de ACVR2B mutante que carece de parte da sequência encontrado em um mRNA de ACVR2B do tipo selvagem que codifica parte ou toda a região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem.
[0018] A região intracelular de ACVR2B humano consiste em 159o a 512o aminoácidos, inclusive, do lado terminal N. Uma sequência de mRNA que codifica parte ou toda a região intracelular de um ACVR2B do tipo selvagem representativo é mostrado em SEQ ID NO: 9.
[0019] O mRNA de ACVR2B mutante da presente invenção pode carecer de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354,
355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714,
715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814, 815, 816, 817, 818, 819, 820, 821, 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 829, 830, 831, 832, 833, 834, 835, 836, 837, 838, 839, 840, 841, 842, 843, 844, 845, 846, 847, 848, 849, 850, 851, 852, 853, 854, 855, 856, 857, 858, 859, 860, 861, 862, 863, 864, 865, 866, 867, 868, 869, 870, 871, 872, 873, 874, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881, 882, 883, 884, 885, 886, 887, 888, 889, 890, 891, 892, 893, 894, 895, 896, 897, 898, 899, 900, 901, 902, 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 911, 912, 913, 914, 915, 916, 917, 918, 919, 920, 921, 922, 923, 924, 925, 926, 927, 928, 929, 930, 931, 932, 933, 934, 935, 936, 937, 938, 939, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 946, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 953, 954, 955, 956, 957, 958, 959, 960, 961, 962, 963, 964, 965, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 972, 973, 974, 975, 976, 977, 978, 979, 980, 981, 982, 983, 984, 985, 986, 987, 988, 989, 990, 991, 992, 993, 994, 995, 996, 997, 998, 999, 1000, 1001, 1002, 1003, 1004, 1005, 1006, 1007, 1008, 1009, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018, 1019, 1020, 1021, 1022, 1023, 1024, 1025, 1026, 1027, 1028, 1029, 1030, 1031, 1032, 1033, 1034, 1035, 1036, 1037, 1038, 1039, 1040, 1041, 1042, 1043, 1044, 1045, 1046, 1047, 1048, 1049, 1050, 1051, 1052, 1053, 1054, 1055, 1056, 1057, 1058, 1059, 1060, 1061,
1062, 1063, 1064 ou 1065 nucleotídeos de SEQ ID NO:9.
[0020] Como demonstrado na seção Exemplos no presente documento, a interrupção da região intracelular de ACVR2B humano no nível de mRNA reduz eficazmente a sinalização de miostatina. Desse modo, a região intracelular de ACVR2B é um bom alvo para interromper o sinal de miostatina.
[0021] Em uma modalidade, o composto da presente invenção tem a capacidade para fazer com que a célula-alvo produza uma proteína de ACVR2B truncada que carece de parte da região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem proteína, por exemplo, como uma com a sequência em SEQ ID NO: 11.
[0022] Como usado no presente documento, “proteína de ACVR2B truncada que carece de parte da região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem” (doravante no presente documento intercambiavelmente denominado “versão truncada de proteína de ACVR2B” ou “proteína de ACVR2B truncada”) se refere a qualquer versão truncada de proteína de ACVR2B que carece de pelo menos um aminoácido na dita região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem. A parte da região intracelular de ACVR2B que está ausente com relação ao ACVR2B do tipo selvagem se refere a um ou mais aminoácidos presentes em ACVR2B do tipo selvagem, mas não no ACVR2B truncado. Por exemplo, a versão truncada de proteína de ACVR2B pode carecer de 1 aminoácido ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,
99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353 ou 354 aminoácidos da região intracelular constatados na proteína de ACVR2B do tipo selvagem, por exemplo, como aquele mostrado como SEQ ID NO: 11. Como será evidente, uma versão/variante truncada não abrange meramente versões que têm um ou mais aminoácidos removidos da terminação carbóxi ou amino da proteína, mas também abrange variantes que carecem de um ou mais aminoácidos de dentro da proteína de ACVR2B.
[0023] A parte da região intracelular de ACVR2B que está ausente ou escassa na versão truncada é codificada por todos ou por parte de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 de ACVR2B do tipo selvagem.
[0024] Como usado no presente documento “que é capaz de fazer com que a proteína de ACVR2B seja produzida como uma versão truncada” significa que o composto da presente invenção permite que uma célula a qual o composto é adicionado para sintetizar ou produzir um ACVR2B truncado como mais totalmente explicado no presente documento.
[0025] Devido ao fato de as regiões extracelular e transmembrana de ACVR2B ainda estarem presentes, a versão truncada de ACVR2B da invenção ainda pode ter a capacidade para se ligar a seus ligantes nativos, mas com relação a ligação do ligante de miostatina, a eficiência de transdução do sinal de miostatina pode ser reduzida em comparação aquela de ACVR2B do tipo selvagem. Exemplos dos ligantes nativos que podem se ligar a ACVR2B incluem activina-A, activina-B, GDF1, GDF3, NODAL, GDF11, miostatina (que também é conhecido como GDF8), BMP2, BMP5, GDF5 (que também é conhecido como BMP14), GDF6, GDF7, BMP5, BMP6, BMP7 e BMP8. Um exemplo preferido do ligante é miostatina que também é conhecida como GDF8.
[0026] Como usado no presente documento “transdução” de um sinal se destina a significar transferir o sinal ativando-se fatores a jusantes relevantes ao sinal, ou inativando-se fatores a jusantes relevantes ao sinal.
[0027] Em uma modalidade particular, a versão truncada de proteína de ACVR2B da invenção tem a capacidade para se ligar à miostatina.
[0028] A proteína de ACVR2B truncada da invenção transduz sinais mediante a ligação de um ligante ao ACVR2B, mas com menos intensidade que ACVR2B do tipo selvagem.
Em uma modalidade, a proteína de ACVR2B truncada transduz o sinal de miostatina com menos intensidade que ACVR2B do tipo selvagem mediante a ligação de miostatina ao mesmo.
Como usado no presente documento, o termo “menos intensidade que ACVR2B do tipo selvagem” se refere a uma redução em intensidade de sinal (habilidade para sinalizar) em 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % em comparação à intensidade de sinal transduzido por ligação do mesmo ligante ao ACVR2B do tipo selvagem.
A intensidade de sinal pode ser determinada indiretamente quantificando- se o nível de expressão de mRNA de um ou mais genes cuja expressão é acionada pelo sinal transduzido.
Por exemplo, a intensidade de sinal de sinalização acionada por miostatina pode ser aferida medindo-se o nível de expressão de mRNA de SMAD7. Nesse caso, o composto da presente invenção tem a capacidade para reduzir a intensidade de sinal de miostatina a um nível, correlacionado a uma redução de nível de expressão de mRNA de SMAD7 por 1 %, 2 %, 3 %, 4 %,
5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % em comparação àquela causada por sinalização de miostatina de ACVR2B do tipo selvagem.
[0029] Em outra modalidade, o mRNA de ACVR2B mutante da presente invenção pode carecer de uma parte da sequência que codifica parte ou toda a região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem devido a uma mutação de quadro de leitura. Tal mutação de quadro de leitura pode gerar uma leitura diferente de quadro a jusante a essa do mRNA de tipo selvagem. Desse modo, nesse caso, o mRNA de ACVR2B mutante da presente invenção carece de uma parte da sequência que codifica parte ou toda a região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem.
[0030] Tal quadro de leitura também pode fazer com que o mRNA de ACVR2B mutante da presente invenção passa através de decaimento de mRNA mediado por não senso (NMD) de ACVR2B. NMD é um mecanismo para controlar a qualidade de mRNAs que todos os organismos eucarióticos têm, e destrói mRNAs anormais que têm um códon de parada em uma posição a montante (para extremidade 5′) para o códon de parada original, tipicamente causada por meio de mutações. Quando alguns éxons, em particular éxons que têm sequências no comprimento de não múltiplos de três nucleotídeos (isto é, não 3N em que N é um determinado número inteiro), são saltados, o quadro de tradução de tripletos é alterado, e isso pode gerar um códon de parada a montante novo para o códon de parada original. Por exemplo, quando o éxon 8 de ACVR2B é saltado, éxons 7 e 9 se tornam diretamente ligados. O quadro de leitura na união de éxons 7 e 9, “AG/GTAG” é composto por 2 nucleotídeos na maior extremidade 3′ do éxon 7, isto é, “AG”, e 4 nucleotídeos na maior extremidade 5′ do éxon 9, isto é, “GTAG”. O AGG TAG codifica arginina (Arg) e um códon de parada, que gera um mRNA semelhante a mutante não senso. Tal mRNA mutante pode, então, ser destruído por NMD. Por outro lado, em ACVR2B do tipo selvagem, o quadro de leitura posicionado na união de éxons 7 e 8, “AG/GGAU” é composto por 2 nucleotídeos na maior extremidade 3′ do éxon 7, isto é, “AG”, e 4 nucleotídeos na maior extremidade 5′ do éxon 8, isto é, “GGAU”. O AGG GAU codifica arginina (Arg) e ácido aspártico (Asp).
[0031] Na situação em que um novo códon de parada é gerado devido a uma alteração de quadro, o mRNA de ACVR2B mutante da presente invenção é produzido, mas é, então, tipicamente degradado/decaído através de NMD.
[0032] Como usado no presente documento uma “célula- alvo” é uma célula na qual o composto da presente invenção é introduzido e pode ser quaisquer células que expressam ACVR2B (por exemplo, ACVR2B do tipo selvagem). Exemplo da célula-alvo inclui célula miócito, mioblasto ou miotubo. Em uma modalidade, a célula-alvo é uma célula animal. Em outra modalidade, a célula-alvo é uma célula de mamífero. Em outra modalidade, a célula-alvo é uma célula humana.
[0033] O composto da presente invenção é qualquer composto que é capaz de fazer com que o mRNA de ACVR2B e/ou proteína seja produzido como uma versão truncada que carece de parte da região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem. Exemplos de compostos adequados da presente invenção incluem: uma sequência de RNA guia CRISPR-CAS9 com a qual a endonuclease adequada tem a capacidade para impor/remover uma parte de gene ACVR2B que codifica uma parte da região intracelular da mesma, um oligômero antissenso para saltar pelo menos um éxon que codifica uma parte da região intracelular ACVR2B, e compostos de sistema de loxP para realizar inativação de uma parte de gene ACVR2B que codifica uma parte da região intracelular do mesmo.
[0034] Como seria observado por um elemento versado na técnica, outras técnicas de edição de gene como TALENs ou dedos de Zinco (ZFN) também podem ser empregadas para gerar uma versão truncada de ACVR2B da invenção.
[0035] Quando CRISPR-CAS9 é usado para inibir o sinal de miostatina, um RNA guia que tem uma sequência complementar a uma sequência alvo de DNA genômico que codifica ACVR2B ou uma parte de ACVR2B (por exemplo, a região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem) é introduzido em uma célula-alvo, enquanto identifica-se uma sequência-alvo a ser clivada. A proteína Cas9 introduzida à célula-alvo cliva a parte de fita dupla composta do DNA genômico e RNA guia. Por meio de um processo de reparação o sítio de clivagem, uma mutação (ou mutações) é causada por deleção e/ou inserção de nucleotídeos, portanto, causando a inativação de todo ou parte de ACVR2B.
Exemplos da sequência de DNA genômico alvo inclui qualquer sequência de éxons, por exemplo, éxons 1 a 11 de ACVR2B.
Adequadamente, a sequência de DNA genômico alvo inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 ou grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9 e 10 de ACVR2B.
Em uma modalidade, a sequência de DNA genômico alvo inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 9 e 10 de ACVR2B.
Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 9 e 10 de ACVR2B.
Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6 e 10 de ACVR2B.
Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5 e 6 de ACVR2B.
Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 7, 8 e 9 de ACVR2B.
Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 7 e 8 de ACVR2B.
Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo é éxon 5 de ACVR2B.
Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo é éxon 6 de ACVR2B.
Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo é éxon 7 de ACVR2B.
Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo é éxon 8 de ACVR2B.
Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo é éxon 9 de ACVR2B. Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo é éxon 10 de ACVR2B. Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo é éxon 11 de ACVR2B. Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 7, 8, 9 e 10 ou grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9 e 10 de ACVR2B. Alternativamente, íntrons podem ser alvejados por CRISPR-CAS9. Por exemplo, íntrons 7 e 8 que ensanduicham éxon 8 podem ser clivados. Quando os sítios clivados são reparados, o éxon 8 pode se tornar ausente para gerar mRNA mutante deletado por éxon 8. De modo similar, íntrons 4 e 5 ou íntrons 5 e 6 ou íntrons 6 e 7 ou íntrons 8 e 9 ou íntrons 9 e 10 ou íntrons 10 e 11 podem ser alvejados para clivagem. Desse modo, o composto da presente invenção pode ser um RNA guia para CRISPR-CAS9, como descrito acima, ou um DNA (como um plasmídeo de expressão) que fornece um RNA guia como sua transcrição ou proteína CAS9 (ou similar a Cas9) ou um DNA (como um plasmídeo de expressão) que codifica e fornece proteína CAS9 (ou similar a Cas9) ou uma combinação dos mesmos.
[0036] Quando siRNA é usado para inibir o sinal de miostatina, um siRNA projetado para alvejar uma sequência de mRNA de ACVR2B é introduzido a uma célula-alvo. Quando a fita guia do siRNA assim introduzido se hibridiza à sequência alvejada, então uma proteína RISC endógena na célula-alvo identifica a parte de fita dupla composta da fita guia e a fita de mRNA alvejada, e cliva a sequência alvejada do mRNA. Fazendo-se isso, o nível de proteína de ACVR2B é reduzido. Desse modo, em outra modalidade, o composto da presente invenção pode ser um siRNA ou um DNA (como um plasmídeo de expressão) que fornece um siRNA como sua transcrição. Oligômero antissenso
[0037] Um mRNA de ACVR2B mutante também pode ser produzido de modo intracelular colocando-se a célula em contato com um oligonucleotídeo antissenso (AON) com a capacidade para induzir o salto de éxon de um ou mais do ACVR2B éxons que codifica a região intracelular da proteína para a célula.
[0038] Em uma modalidade, o composto da presente invenção é um oligômero antissenso com a capacidade para induzir o salto de uma éxon que codifica uma parte da região intracelular de ACVR2B (doravante no presente documento denominado “o oligômero antissenso da presente invenção” ou “o oligômero antissenso”). Adequadamente, o éxon a ser saltado é um selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 ou grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9 e 10 de ACVR2B. Em uma modalidade, o éxon a ser saltado é um selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 9 e 10. Em outra modalidade, o éxon a ser saltado é éxon 5. Em ainda outra modalidade, o éxon a ser saltado é éxon 6. Em ainda outra modalidade, o éxon a ser saltado é éxon 7. Em ainda outra modalidade, o éxon a ser saltado é éxon 8. Em ainda outra modalidade, o éxon a ser saltado é éxon 9. Em ainda outra modalidade, o éxon a ser saltado é éxon 10. Em ainda outra modalidade, o éxon a ser saltado é éxon 11. Em ainda outra modalidade, o éxon a ser saltado é um selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 7, 8, 9 e 10 ou grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9 e 10 de ACVR2B.
[0039] As sequências de nucleotídeo representativas de éxons 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 são aquelas mostradas como SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, respectivamente. As sequências de nucleotídeo de éxons 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 não devem ser limitadas àquelas mostradas como SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, e incluem sequências variantes que têm 90 % ou mais, 91 % ou mais, 92 % ou mais, 93 % ou mais, 94 % ou mais, 95 % ou mais, 96 % ou mais, 97 % ou mais, 98 % ou mais, 99 % ou mais ou 100 % do comprimento de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 respectivamente e uma identidade de sequência de 90 % ou mais, 91 % ou mais, 92 % ou mais, 93 % ou mais, 94 % ou mais, 95 % ou mais, 96 % ou mais, 97 % ou mais, 98 % ou mais, 99 % ou mais ou 100 % para SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, respectivamente.
[0040] O termo “com a capacidade para induzir o salto de uma éxon que codifica uma parte da região intracelular de ACVR2B” significa que após a ligação do oligômero antissenso da presente invenção a seu sítio-alvo de uma éxon que codifica uma parte da região intracelular da transcrição (por exemplo, pré-mRNA) do gene ACVR2B (por exemplo, gene ACVR2B humano), o dito éxon é separado-out. Por exemplo, se o oligômero antissenso da presente invenção se liga a uma parte de éxon 6 de pré-mRNA de ACVR2B, a sequência de nucleotídeo correspondente à extremidade 5′ do éxon a jusante a éxon 6, isto é, éxon 7, é unido no lado 3′ da sequência de nucleotídeo correspondente à extremidade 3′ do éxon a montante a éxon 6, isto é, éxon 5. Isso é causado por uma interrupção do mecanismo de união normal após a ligação do oligômero antissenso da presente invenção. O polipeptídeo de ACVR2B codificado pelo mRNA, então, incluiria aminoácidos codificados pelo éxon 5 unido ao éxon 7, com aqueles codificados pelo éxon 6 que é omitido (está ausente) da variante de ACVR2B truncado.
[0041] No presente documento, o termo “ligação” significa que quando o oligômero antissenso da presente invenção é colocado em contato com (por exemplo, misturado com) cópias de transcrição de gene ACVR2B (por exemplo, gene ACVR2B humano), as sequências complementares se hibridizam sob condições fisiológicas para formar um ácido nucleico de fita dupla. O termo “sob condições fisiológicas” se refere a condições que imitam o ambiente in vivo em termos de pH, composição de sal e temperatura. As condições adequadas podem ser qualquer combinação de temperatura, pH e concentração de sal a seguir: Temperatura: 25 C a 40 C, 35 C a 38 C, 36 C a 38 C ou 37 C; pH: pH 5 a 8, pH 6 a 8, pH 7 a 8 ou pH 7,4; e Concentração de sal: 100 a 200 mM, 130 a 170 mM, 140 a 160 mM ou 150 mM de concentração de cloreto de sódio.
[0042] Como usado no presente documento, “identidade de sequência” e “homologia” com relação a uma sequência de nucleotídeo se refere à porcentagem de resíduos de nucleotídeo em uma sequência-alvo candidata que são idênticos aos resíduos de nucleotídeo em uma sequência de nucleotídeo de indivíduo, após alinhar as sequências e permitir lacunas, se for necessário, para obter a porcentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação de percentual de identidade de sequência de nucleotídeo pode ser obtido de várias formas que estão na habilidade de um elemento versado na técnica, por exemplo, usando software de computador publicamente disponibilizado como o software BLAST, BLAST-2, ClustalW2, ALIGN ou MEGALIGNTM (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para medir alinhamento, que inclui quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo por toda uma extensão das sequências que são comparadas. Por exemplo, a identidade de sequência de duas ou mais sequências de nucleotídeo pode ser determinado com o uso do algoritmo de Karlin e Altschul, BLAST (Ferramenta de Busca de Alinhamento Local Básica) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264–2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993). Com base no algoritmo de BLAST, os programas chamados BLASTN e BLASTX foram desenvolvidos (Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990). Se BLASTN é usado para análise de sequência de nucleotídeo, os parâmetros podem ser estabelecidos, por exemplo, em pontuação = 100 e comprimento de palavra = 12. Se os programas BLAST e Gapped BLAST são usados, os parâmetros padrão em cada programa podem ser usados.
[0043] O oligômero antissenso da presente invenção é um oligonucleotídeo ou oligonucleotídeo modificado. Como usado no presente documento, um “oligonucleotídeo” é uma sequência de nucleotídeos ligados de um comprimento, como definido abaixo, que pode ou não incluir modificações. Um oligonucleotídeo modificado é descrito em detalhes em outro lugar.
[0044] O oligômero antissenso da presente invenção pode ter um comprimento de 10 a 70 nucleotídeos, como: 11 a 70, 12 a 70, 13 a 70, 14 a 70, 15 a 70, 16 a 70, 17 a 70, 18 a 70, 19 a 70, 20 a 70, 21 a 70, 22 a 70, 23 a 70, 24 a 70, 25 a 70, 10 a 65, 11 a 65, 12 a 65, 13 a 65, 14 a 65, 15 a 65, 16 a 65, 17 a 65, 18 a 65, 19 a 65, 20 a 65, 21 a 65, 22 a 65, 23 a 65, 24 a 65, 25 a 65, 10 a 60, 11 a 60, 12 a 60, 13 a 60, 14 a 60, 15 a 60, 16 a 60, 17 a 60, 18 a 60, 19 a 60, 20 a 60, 21 a 60, 22 a 60, 23 a 60, 24 a 60, 25 a 60, 10 a 55, 11 a 55, 12 a 55, 13 a 55, 14 a 55, 15 a 55, 16 a 55, 17 a 55, 18 a 55, 19 a 55, 20 a 55, 21 a 55, 22 a 55, 23 a 55, 24 a 55, 25 a 55,10 a 50, 11 a 50, 12 a 50, 13 a 50, 14 a 50, 15 a 50, 16 a 50, 17 a 50, 18 a 50, 19 a 50, 20 a 50, 21 a 50, 22 a 50, 23 a 50, 24 a 50, 25 a 50,10 a 45, 11 a 45, 12 a 45, 13 a 45, 14 a 45, 15 a 45, 16 a 45, 17 a 45, 18 a 45, 19 a 45, 20 a 45, 21 a 45, 22 a 45, 23 a 45, 24 a 45, 25 a 45, 10 a 40, 11 a 40, 12 a 40, 13 a 40, 14 a 40, 15 a 40, 16 a 40, 17 a 40, 18 a 40, 19 a 40, 20 a 40, 21 a 40, 22 a 40, 23 a 40, 24 a 40, 25 a 40,10 a 38, 11 a 38, 12 a 38, 13 a 38, 14 a 38, 15 a 38, 16 a 38, 17 a 38, 18 a 38, 19 a 38, 20 a 38, 21 a 38, 22 a 38, 23 a 38, 24 a 38, 25 a 38, 10 a 36, 11 a 36, 12 a 36, 13 a 36, 14 a 36, 15 a 36, 16 a 36, 17 a 36, 18 a 36, 19 a 36, 20 a 36, 21 a 36, 22 a 36, 23 a 36, 24 a 36, 25 a 36, 10 a 35, 11 a 35, 12 a 35, 13 a 35, 14 a 35, 15 a 35, 16 a 35, 17 a 35, 18 a 35, 19 a 35, 20 a 35, 21 a 35, 22 a 35, 23 a 35, 24 a 35, 25 a 35, 10 a 34, 11 a 34, 12 a 34, 13 a 34, 14 a 34, 15 a 34, 16 a 34, 17 a 34, 18 a 34, 19 a 34, 20 a 34, 21 a 34, 22 a 34, 23 a 34, 24 a 34, 25 a 34, 10 a 33, 11 a 33, 12 a 33, 13 a 33, 14 a 33, 15 a 33, 16 a 33, 17 a 33, 18 a 33, 19 a 33, 20 a 33, 21 a 33, 22 a 33, 23 a 33, 24 a 33, 25 a
33, 10 a 32, 11 a 32, 12 a 32, 13 a 32, 14 a 32, 15 a 32, 16 a 32, 17 a 32, 18 a 32, 19 a 32, 20 a 32, 21 a 32, 22 a 32, 23 a 32, 24 a 32, 25 a 32, 10 a 30, 11 a 30, 12 a 30, 13 a 30, 14 a 30, 15 a 30, 16 a 30, 17 a 30, 18 a 30, 19 a 30, 20 a 30, 21 a 30, 22 a 30, 23 a 30, 24 a 30, 25 a 30, 10 a 29, 11 a 29, 12 a 29, 13 a 29, 14 a 29, 15 a 29, 16 a 29, 17 a 29, 18 a 29, 19 a 29, 20 a 29, 21 a 29, 22 a 29, 23 a 29, 24 a 29, 25 a 29, 10 a 28, 11 a 28, 12 a 28, 13 a 28, 14 a 28, 15 a 28, 16 a 28, 17 a 28, 18 a 28, 19 a 28, 20 a 28, 21 a 28, 22 a 28, 23 a 28, 24 a 28, 25 a 28, 10 a 27, 11 a 27, 12 a 27, 13 a 27, 14 a 27, 15 a 27, 16 a 27, 17 a 27, 18 a 27, 19 a 27, 20 a 27, 21 a 27, 22 a 27, 23 a 27, 24 a 27, 25 a 27, 10 a 26, 11 a 26, 12 a 26, 13 a 26, 14 a 26, 15 a 26, 16 a 26, 17 a 26, 18 a 26, 19 a 26, 20 a 26, 21 a 26, 22 a 26, 23 a 26, 24 a 26, 25 a 26, 10 a 25, 11 a 25, 12 a 25, 13 a 25, 14 a 25, 15 a 25, 16 a 25, 17 a 25, 18 a 25, 19 a 25, 20 a 25, 21 a 25, 22 a 25, 23 a 25, 24 a 25, 10 a 24, 11 a 24, 12 a 24, 13 a 24, 14 a 24, 15 a 24, 16 a 24, 17 a 24, 18 a 24, 19 a 24, 20 a 24, 21 a 24, 22 a 24, 23 a 24, 10 a 23, 11 a 23, 12 a 23, 13 a 23, 14 a 23, 15 a 23, 16 a 23, 17 a 23, 18 a 23, 19 a 23, 20 a 23, 21 a 23, 22 a 23, 10 a 22, 11 a 22, 12 a 22, 13 a 22, 14 a 22, 15 a 22, 16 a 22, 17 a 22, 18 a 22, 19 a 22, 20 a 22, 21 a 22, 10 a 21, 11 a 21, 12 a 21, 13 a 21, 14 a 21, 15 a 21, 16 a 21, 17 a 21, 18 a 21, 19 a 21, 20 a 21, 10 a 20, 11 a 20, 12 a 20, 13 a 20, 14 a 20, 15 a 20, 16 a 20, 17 a 20, 18 a 20, 19 a 20, 10 a 19, 11 a 19, 12 a 19, 13 a 19, 14 a 19, 15 a 19, 16 a 19, 17 a 19, 18 a 19, 10 a 18, 11 a 18, 12 a 18, 13 a 18, 14 a 18, 15 a 18, 16 a 18, 17 a 18, 10 a 17, 11 a 17, 12 a 17, 13 a 17, 14 a 17, 15 a 17, 16 a
17, 10 a 16, 11 a 16, 12 a 16, 13 a 16, 14 a 16, 15 a 16, 10 a 15, 11 a 15, 12 a 15, 13 a 15 e 14 a 15 nucleotídeos de sua extremidade 5′ para a extremidade 3′ (doravante no presente documento denominado “faixa de comprimento exemplificativa do oligômero antissenso da presente invenção”). O oligômero antissenso da presente invenção pode ter um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 44, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 66, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70 nucleotídeos de sua extremidade 5′ para a extremidade 3′ (doravante no presente documento denominado “comprimento exemplificativo do oligômero antissenso da presente invenção”). As faixas particularmente adequadas para o comprimento do oligômero da invenção incluem: 15 a 45, 17 a 35, 15 a 24, 15 a 26, e 20 a 40 nucleotídeos de sua extremidade 5′ para a extremidade 3′.
[0045] O oligômero antissenso da presente invenção compreende uma sequência de nucleotídeo complementar a uma parte da sequência de nucleotídeo de um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 de ACVR2B ou o grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9 e 10 de ACVR2B. A parte da sequência de nucleotídeo de um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 de ACVR2B ou o grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9 e 10 de ACVR2B é no presente documento também é denominada “a sequência-alvo”. As sequências de nucleotídeo representativas de éxons 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 são aquelas mostradas como SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7,
respectivamente. As sequências de nucleotídeo de éxons 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 não devem ser limitadas àquelas mostradas como SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, e incluem sequências variantes que têm 90 % ou mais, 91 % ou mais, 92 % ou mais, 93 % ou mais, 94 % ou mais, 95 % ou mais, 96 % ou mais, 97 % ou mais, 98 % ou mais, 99 % ou mais ou 100 % de identidade de sequência para uma sequência revelada em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, respectivamente. Desse modo, de acordo com modalidades particulares da invenção, o oligômero da invenção compreende uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência com 90 % ou mais, 91 % ou mais, 92 % ou mais, 93 % ou mais, 94 % ou mais, 95 % ou mais, 96 % ou mais, 97 % ou mais, 98 % ou mais, 99 % ou mais ou 100 % de identidade de sequência para uma sequência revelada em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, respectivamente.
[0046] A sequência-alvo pode ser de qualquer comprimento com a condição de que seja do mesmo comprimento ou mais curta que o comprimento do oligômero antissenso da presente invenção. Por exemplo, a sequência-alvo pode estar no comprimento de 10 a 70 nucleotídeos, como: 11 a 70, 12 a 70, 13 a 70, 14 a 70, 15 a 70, 16 a 70, 17 a 70, 18 a 70, 19 a 70, 20 a 70, 21 a 70, 22 a 70, 23 a 70, 24 a 70, 25 a 70, 10 a 65, 11 a 65, 12 a 65, 13 a 65, 14 a 65, 15 a 65, 16 a 65, 17 a 65, 18 a 65, 19 a 65, 20 a 65, 21 a 65, 22 a 65, 23 a 65, 24 a 65, 25 a 65, 10 a 60, 11 a 60, 12 a 60, 13 a 60, 14 a 60, 15 a 60, 16 a 60, 17 a 60, 18 a 60, 19 a 60, 20 a 60, 21 a 60, 22 a 60, 23 a 60, 24 a 60, 25 a 60, 10 a 55, 11 a 55, 12 a 55, 13 a 55, 14 a 55, 15 a 55, 16 a 55,
17 a 55, 18 a 55, 19 a 55, 20 a 55, 21 a 55, 22 a 55, 23 a 55, 24 a 55, 25 a 55,10 a 50, 11 a 50, 12 a 50, 13 a 50, 14 a 50, 15 a 50, 16 a 50, 17 a 50, 18 a 50, 19 a 50, 20 a 50, 21 a 50, 22 a 50, 23 a 50, 24 a 50, 25 a 50, 10 a 45, 11 a 45, 12 a 45, 13 a 45, 14 a 45, 15 a 45, 16 a 45, 17 a 45, 18 a 45, 19 a 45, 20 a 45, 21 a 45, 22 a 45, 23 a 45, 24 a 45, 25 a 45,10 a 40, 11 a 40, 12 a 40, 13 a 40, 14 a 40, 15 a 40, 16 a 40, 17 a 40, 18 a 40, 19 a 40, 20 a 40, 21 a 40, 22 a 40, 23 a 40, 24 a 40, 25 a 40,10 a 38, 11 a 38, 12 a 38, 13 a 38, 14 a 38, 15 a 38, 16 a 38, 17 a 38, 18 a 38, 19 a 38, 20 a 38, 21 a 38, 22 a 38, 23 a 38, 24 a 38, 25 a 38, 10 a 36, 11 a 36, 12 a 36, 13 a 36, 14 a 36, 15 a 36, 16 a 36, 17 a 36, 18 a 36, 19 a 36, 20 a 36, 21 a 36, 22 a 36, 23 a 36, 24 a 36, 25 a 36, 10 a 35, 11 a 35, 12 a 35, 13 a 35, 14 a 35, 15 a 35, 16 a 35, 17 a 35, 18 a 35, 19 a 35, 20 a 35, 21 a 35, 22 a 35, 23 a 35, 24 a 35, 25 a 35, 10 a 34, 11 a 34, 12 a 34, 13 a 34, 14 a 34, 15 a 34, 16 a 34, 17 a 34, 18 a 34, 19 a 34, 20 a 34, 21 a 34, 22 a 34, 23 a 34, 24 a 34, 25 a 34, 10 a 33, 11 a 33, 12 a 33, 13 a 33, 14 a 33, 15 a 33, 16 a 33, 17 a 33, 18 a 33, 19 a 33, 20 a 33, 21 a 33, 22 a 33, 23 a 33, 24 a 33, 25 a 33, 10 a 32, 11 a 32, 12 a 32, 13 a 32, 14 a 32, 15 a 32, 16 a 32, 17 a 32, 18 a 32, 19 a 32, 20 a 32, 21 a 32, 22 a 32, 23 a 32, 24 a 32, 25 a 32, 10 a 30, 11 a 30, 12 a 30, 13 a 30, 14 a 30, 15 a 30, 16 a 30, 17 a 30, 18 a 30, 19 a 30, 20 a 30, 21 a 30, 22 a 30, 23 a 30, 24 a 30, 25 a 30, 10 a 29, 11 a 29, 12 a 29, 13 a 29, 14 a 29, 15 a 29, 16 a 29, 17 a 29, 18 a 29, 19 a 29, 20 a 29, 21 a 29, 22 a 29, 23 a 29, 24 a 29, 25 a 29,10 a 28, 11 a 28, 12 a 28, 13 a 28, 14 a 28, 15 a 28, 16 a 28, 17 a 28, 18 a 28, 19 a 28, 20 a 28,
21 a 28, 22 a 28, 23 a 28, 24 a 28, 25 a 28, 10 a 27, 11 a 27, 12 a 27, 13 a 27, 14 a 27, 15 a 27, 16 a 27, 17 a 27, 18 a 27, 19 a 27, 20 a 27, 21 a 27, 22 a 27, 23 a 27, 24 a 27, 25 a 27, 10 a 26, 11 a 26, 12 a 26, 13 a 26, 14 a 26, 15 a 26, 16 a 26, 17 a 26, 18 a 26, 19 a 26, 20 a 26, 21 a 26, 22 a 26, 23 a 26, 24 a 26, 25 a 26, 10 a 25, 11 a 25, 12 a 25, 13 a 25, 14 a 25, 15 a 25, 16 a 25, 17 a 25, 18 a 25, 19 a 25, 20 a 25, 21 a 25, 22 a 25, 23 a 25, 24 a 25, 10 a 24, 11 a 24, 12 a 24, 13 a 24, 14 a 24, 15 a 24, 16 a 24, 17 a 24, 18 a 24, 19 a 24, 20 a 24, 21 a 24, 22 a 24, 23 a 24, 10 a 23, 11 a 23, 12 a 23, 13 a 23, 14 a 23, 15 a 23, 16 a 23, 17 a 23, 18 a 23, 19 a 23, 20 a 23, 21 a 23, 22 a 23, 10 a 22, 11 a 22, 12 a 22, 13 a 22, 14 a 22, 15 a 22, 16 a 22, 17 a 22, 18 a 22, 19 a 22, 20 a 22, 21 a 22, 10 a 21, 11 a 21, 12 a 21, 13 a 21, 14 a 21, 15 a 21, 16 a 21, 17 a 21, 18 a 21, 19 a 21, 20 a 21, 10 a 20, 11 a 20, 12 a 20, 13 a 20, 14 a 20, 15 a 20, 16 a 20, 17 a 20, 18 a 20, 19 a 20, 10 a 19, 11 a 19, 12 a 19, 13 a 19, 14 a 19, 15 a 19, 16 a 19, 17 a 19, 18 a 19, 10 a 18, 11 a 18, 12 a 18, 13 a 18, 14 a 18, 15 a 18, 16 a 18, 17 a 18, 10 a 17, 11 a 17, 12 a 17, 13 a 17, 14 a 17, 15 a 17, 16 a 17, 10 a 16, 11 a 16, 12 a 16, 13 a 16, 14 a 16, 15 a 16, 10 a 15, 11 a 15, 12 a 15, 13 a 15 e 14 a 15 nucleotídeos da extremidade 5′ para a extremidade 3′. A sequência-alvo pode ter um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 44, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 66, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70 nucleotídeos de sua extremidade 5′ para a extremidade 3′.
[0047] A sequência de nucleotídeo complementar à sequência-alvo (doravante no presente documento denominado “sequência hibridizante”) deve ser do mesmo comprimento que a sequência-alvo.
Desse modo, o comprimento exemplificativo da sequência hibridizante inclui: 10 a 70 nucleotídeos, como 11 a 70, 12 a 70, 13 a 70, 14 a 70, 15 a 70, 16 a 70, 17 a 70, 18 a 70, 19 a 70, 20 a 70, 21 a 70, 22 a 70, 23 a 70, 24 a 70, 25 a 70, 10 a 65, 11 a 65, 12 a 65, 13 a 65, 14 a 65, 15 a 65, 16 a 65, 17 a 65, 18 a 65, 19 a 65, 20 a 65, 21 a 65, 22 a 65, 23 a 65, 24 a 65, 25 a 65, 10 a 60, 11 a 60, 12 a 60, 13 a 60, 14 a 60, 15 a 60, 16 a 60, 17 a 60, 18 a 60, 19 a 60, 20 a 60, 21 a 60, 22 a 60, 23 a 60, 24 a 60, 25 a 60, 10 a 55, 11 a 55, 12 a 55, 13 a 55, 14 a 55, 15 a 55, 16 a 55, 17 a 55, 18 a 55, 19 a 55, 20 a 55, 21 a 55, 22 a 55, 23 a 55, 24 a 55, 25 a 55,10 a 50, 11 a 50, 12 a 50, 13 a 50, 14 a 50, 15 a 50, 16 a 50, 17 a 50, 18 a 50, 19 a 50, 20 a 50, 21 a 50, 22 a 50, 23 a 50, 24 a 50, 25 a 50,10 a 45, 11 a 45, 12 a 45, 13 a 45, 14 a 45, 15 a 45, 16 a 45, 17 a 45, 18 a 45, 19 a 45, 20 a 45, 21 a 45, 22 a 45, 23 a 45, 24 a 45, 25 a 45,10 a 40, 11 a 40, 12 a 40, 13 a 40, 14 a 40, 15 a 40, 16 a 40, 17 a 40, 18 a 40, 19 a 40, 20 a 40, 21 a 40, 22 a 40, 23 a 40, 24 a 40, 25 a 40,10 a 38, 11 a 38, 12 a 38, 13 a 38, 14 a 38, 15 a 38, 16 a 38, 17 a 38, 18 a 38, 19 a 38, 20 a 38, 21 a 38, 22 a 38, 23 a 38, 24 a 38, 25 a 38,10 a 36, 11 a 36, 12 a 36, 13 a 36, 14 a 36, 15 a 36, 16 a 36, 17 a 36, 18 a 36, 19 a 36, 20 a 36, 21 a 36, 22 a 36, 23 a 36, 24 a 36, 25 a 36,10 a 35, 11 a 35, 12 a 35, 13 a 35, 14 a 35, 15 a 35, 16 a 35, 17 a 35, 18 a 35, 19 a 35, 20 a 35, 21 a 35, 22 a 35, 23 a 35, 24 a 35, 25 a 35,10 a 34, 11 a
34, 12 a 34, 13 a 34, 14 a 34, 15 a 34, 16 a 34, 17 a 34, 18 a 34, 19 a 34, 20 a 34, 21 a 34, 22 a 34, 23 a 34, 24 a 34, 25 a 34,10 a 33, 11 a 33, 12 a 33, 13 a 33, 14 a 33, 15 a 33, 16 a 33, 17 a 33, 18 a 33, 19 a 33, 20 a 33, 21 a 33, 22 a 33, 23 a 33, 24 a 33, 25 a 33,10 a 32, 11 a 32, 12 a 32, 13 a 32, 14 a 32, 15 a 32, 16 a 32, 17 a 32, 18 a 32, 19 a 32, 20 a 32, 21 a 32, 22 a 32, 23 a 32, 24 a 32, 25 a 32,10 a 30, 11 a 30, 12 a 30, 13 a 30, 14 a 30, 15 a 30, 16 a 30, 17 a 30, 18 a 30, 19 a 30, 20 a 30, 21 a 30, 22 a 30, 23 a 30, 24 a 30, 25 a 30,10 a 29, 11 a 29, 12 a 29, 13 a 29, 14 a 29, 15 a 29, 16 a 29, 17 a 29, 18 a 29, 19 a 29, 20 a 29, 21 a 29, 22 a 29, 23 a 29, 24 a 29, 25 a 29,10 a 28, 11 a 28, 12 a 28, 13 a 28, 14 a 28, 15 a 28, 16 a 28, 17 a 28, 18 a 28, 19 a 28, 20 a 28, 21 a 28, 22 a 28, 23 a 28, 24 a 28, 25 a 28,10 a 27, 11 a 27, 12 a 27, 13 a 27, 14 a 27, 15 a 27, 16 a 27, 17 a 27, 18 a 27, 19 a 27, 20 a 27, 21 a 27, 22 a 27, 23 a 27, 24 a 27, 25 a 27,10 a 26, 11 a 26, 12 a 26, 13 a 26, 14 a 26, 15 a 26, 16 a 26, 17 a 26, 18 a 26, 19 a 26, 20 a 26, 21 a 26, 22 a 26, 23 a 26, 24 a 26, 25 a 26,10 a 25, 11 a 25, 12 a 25, 13 a 25, 14 a 25, 15 a 25, 16 a 25, 17 a 25, 18 a 25, 19 a 25, 20 a 25, 21 a 25, 22 a 25, 23 a 25, 24 a 25, 10 a 24, 11 a 24, 12 a 24, 13 a 24, 14 a 24, 15 a 24, 16 a 24, 17 a 24, 18 a 24, 19 a 24, 20 a 24, 21 a 24, 22 a 24, 23 a 24, 10 a 23, 11 a 23, 12 a 23, 13 a 23, 14 a 23, 15 a 23, 16 a 23, 17 a 23, 18 a 23, 19 a 23, 20 a 23, 21 a 23, 22 a 23, 10 a 22, 11 a 22, 12 a 22, 13 a 22, 14 a 22, 15 a 22, 16 a 22, 17 a 22, 18 a 22, 19 a 22, 20 a 22, 21 a 22, 10 a 21, 11 a 21, 12 a 21, 13 a 21, 14 a 21, 15 a 21, 16 a 21, 17 a 21, 18 a 21, 19 a 21, 20 a 21, 10 a 20, 11 a 20, 12 a 20, 13 a 20, 14 a 20, 15 a
20, 16 a 20, 17 a 20, 18 a 20, 19 a 20, 10 a 19, 11 a 19, 12 a 19, 13 a 19, 14 a 19, 15 a 19, 16 a 19, 17 a 19, 18 a 19, 10 a 18, 11 a 18, 12 a 18, 13 a 18, 14 a 18, 15 a 18, 16 a 18, 17 a 18, 10 a 17, 11 a 17, 12 a 17, 13 a 17, 14 a 17, 15 a 17, 16 a 17, 10 a 16, 11 a 16, 12 a 16, 13 a 16, 14 a 16, 15 a 16, 10 a 15, 11 a 15, 12 a 15, 13 a 15 e 14 a 15 nucleotídeos da extremidade 5′ para a extremidade 3′. A sequência hibridizante pode ter um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 44, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 66, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70 nucleotídeos de sua extremidade 5′ para a extremidade 3′.
[0048] Exemplos de sequência hibridizante adequada incluem qualquer um de SEQ ID NOs: 12 a 36 e 43 a 111. O oligômero antissenso da presente invenção pode compreender uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em qualquer um de SEQ ID NOs: 12 a 36 e 43 a 111 (doravante no presente documento denominado “uma sequência hibridizante adequada” ou “sequências hibridizantes adequadas”).
[0049] O oligômero antissenso da presente invenção pode não compreender necessariamente apenas a sequência hibridizante. Com a condição de que o oligômero antissenso da presente invenção retenha atividade de salto for pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 de ACVR2B ou grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9, e 10 de ACVR2B, o oligômero antissenso da presente invenção pode compreender uma sequência parcial das sequências hibridizantes adequadas acima. Em alguma modalidade, o oligômero antissenso da presente invenção pode compreender 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 nucleotídeos consecutivos de qualquer uma das sequências reveladas em SEQ ID NOs: 12 a 36 e 43 a 111. Em outra modalidade, o oligômero antissenso da presente invenção pode compreender pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 nucleotídeos consecutivos de qualquer uma das sequências reveladas em SEQ ID NOs: 12 a 36 e 43 a 111.
[0050] O oligômero antissenso da presente invenção pode não compreender necessariamente apenas a sequência hibridizante. Com a condição de que o oligômero antissenso da presente invenção retenha atividade de salto para pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 de ACVR2B ou grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9, e 10 de ACVR2B, o oligômero antissenso da presente invenção pode compreender sequência adicional (bases) que não complementa a região- alvo.
[0051] Exemplos da sequência alvejada por um oligômero antissenso da presente invenção inclui qualquer sequência de éxons, por exemplo, éxons 1 a 11 de pré-mRNA de ACVR2B. Adequadamente, a sequência-alvo inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 ou grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9 e 10 de pré-mRNA de ACVR2B. Em uma modalidade, a sequência-alvo de pré-mRNA de ACVR2B inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 9 e 10. Em outra modalidade, a sequência-alvo de pré-mRNA de ACVR2B inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 9 e 10. Em outra modalidade, a sequência-alvo de pré-mRNA de ACVR2B inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6 e 10. Em outra modalidade, a sequência-alvo de pré-mRNA de ACVR2B inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5 e 6. Em outra modalidade, a sequência-alvo de pré-mRNA de ACVR2B inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 7, 8 e 9. Em outra modalidade, a sequência-alvo de pré-mRNA de ACVR2B inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 7 e 8. Em outra modalidade, a sequência-alvo de pré-mRNA de ACVR2B é éxon
5. Em outra modalidade, a sequência-alvo de pré-mRNA de ACVR2B é éxon 6. Em outra modalidade, a sequência-alvo de pré-mRNA de ACVR2B é éxon 7. Em outra modalidade, a sequência-alvo de pré-mRNA de ACVR2B é éxon 8. Em outra modalidade, a sequência-alvo de pré-mRNA de ACVR2B é éxon
9. Em outra modalidade, a sequência-alvo de pré-mRNA de ACVR2B é éxon 10. Em outra modalidade, a sequência-alvo de pré-mRNA de ACVR2B é éxon 11. Em outra modalidade, a sequência-alvo de pré-mRNA de ACVR2B inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 7, 8, 9 e 10 ou grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9 e 10.
[0052] Em uma modalidade particular o oligômero da invenção tem uma sequência hibridizante que é do mesmo comprimento que o oligômero ou mais curto que o oligômero em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos. Por exemplo, o oligômero pode ter 24 nucleotídeos de comprimento e ter uma sequência hibridizante que é do mesmo comprimento, isto é, todos os 24 nucleotídeos no oligômero complementam a região-alvo ou pode ter uma sequência hibridizante que é de 20 nucleotídeos de comprimento (4 mais curto que o oligômero comprimento) e o oligômero, desse modo, também possui 4 nucleotídeos que não complementam a região-alvo (e não são, desse modo, parte da sequência hibridizante). Tal oligômero pode, por exemplo, ter dois nucleotídeos em cada lado da sequência hibridizante que não complementam a região-alvo ou 3 em um lado e um no outro ou 4 em uma extremidade.
[0053] Além da sequência hibridizante ou sequência hibridizante parcial, o oligômero antissenso da presente invenção pode compreender sequências adicionais que podem ou não contribuir com a hibridização para a sequência-alvo. Tais sequências adicionais podem ser fixadas à extremidade 5′, extremidade 3′ ou ambas as extremidades da sequência hibridizante ou sequência hibridizante parcial. Nesse caso o comprimento total do oligômero antissenso da presente invenção está na faixa de comprimento exemplificativa do oligômero antissenso da presente invenção ou do comprimento exemplificativo do oligômero antissenso da presente invenção.
[0054] Em outra modalidade, o oligômero antissenso da presente invenção pode consistir em uma sequência de nucleotídeo, como mostrado em qualquer um de SEQ ID NOs: 12 a 36 e 43 a 111. Em alguma modalidade, o oligômero antissenso da presente invenção pode consistir em 5, 6, 7,
8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 nucleotídeos consecutivos de uma sequência mostrada em qualquer um de SEQ ID NOs: 12 a 36 e 43 a 111. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um conjugado em que um peptídeo funcional, por exemplo, peptídeo de penetração de célula (CPP), é ligada ao oligômero antissenso da presente invenção.
O peptídeo funcional publicamente conhecido ou peptídeo funcional comercialmente disponibilizado pode ser usado na presente invenção.
O peptídeo funcional que pode ser usado na presente invenção inclui, por exemplo, os peptídeos ricos em arginina revelados no documento WO2008/036127; ou os peptídeos que alvejam órgãos revelados no documento WO2009/005793, como RXR, RBR e similares; ou os peptídeos que compreendem uma subunidade de aminoácido revelada no documento WO2012/150960. Os peptídeos de penetração em célula (CPPs) representam sequências de peptídeos curtas de 10 a cerca de 30 aminoácidos que podem cruzar a membrana plasmática de células de mamífero e podem, desse modo, aprimorar entrega de fármaco celular (consulte, por exemplo, Hum Mol Genet. 15 de agosto de 2011; 20(16): 3151-3160; Pharmacology & Therapeutics 154 (2015) 78–86). CPPs publicamente conhecidos ou CPPs comercialmente disponibilizados podem ser usados na presente invenção.
Os CPPs que podem ser usados na presente invenção incluem, por exemplo; os CPPs listados na Tabela 1 na página 80 de Pharmacology & Therapeutics 154 (2015) 78–86, como TAT (48– 60), penetratina, poliarginina, Oct4, WT1-pTj, DPV3, Transportano, MAP, VP22, Rep1, KW, KFGF, FGF12, peptídeo de Intefrina β3, C105Y, TP2; os CPPs listados no parágrafo
[0085], Tabela 1 de JP-A-2017-500856 (WO2015/089487), como DPV10/6, DPV15b, YM-3, Tat, LR11, C45D18, Lyp-1, Lyp-2, BMV GAG, hLF1-22, C45D18, LR20; e similares.
Os CPPs são comercialmente disponibilizados a partir, por exemplo, de Funakoshi, Co., Ltd.
Os CPPs comercialmente disponibilizados como TAT (Funakoshi, Co., Ltd.), penetratina (Funakoshi, Co., Ltd.) e similares ou os CPPs publicamente conhecidos como R8 e similares podem ser usados na presente invenção.
Os CPPs preferidos que podem ser usados na presente invenção incluem, por exemplo, hLIMK, TAT, penetratina, R8 e similares (consulte os documentos WO2016/187425, WO2018/118662, WO2018/118599, WO2018/118627, EBioMedicine 45 (2019) 630–645, etc.). O CPP pode ser diretamente ligado ao oligômero antissenso da presente invenção ou pode ser ligado através de um ligante que pode ligar um CPP a um oligômero antissenso.
Os ligantes publicamente conhecidos podem ser usados na presente invenção.
Tais ligantes incluem, por exemplo, aqueles descritos nos documentos JP-A-2017-500856 (WO2015/089487), WO2015/089487, WO2009/073809, WO2013/075035, WO2015/105083, WO2014/179620, WO2015/006740, WO2017/010575 e similares.
Os ligantes preferidos que podem ser usados na presente invenção incluem, por exemplo, ácido 4-maleimidobutírico, um ligante que pode se fixar ao peptídeo funcional ou ao oligômero antissenso da presente invenção por meio de ligação de dissulfeto, e similares.
Os conjugados da presente invenção podem ser preparados por um método publicamente conhecido por um elemento de habilidade comum na técnica.
Eficiência de salto:
[0055] Independentemente ou não de um oligômero particular poder efetuar o salto de um éxon ou éxons no gene ACVR2B pode ser avaliado ou confirmado introduzindo-se o oligômero antissenso da presente invenção em uma célula que expressa ACVR2B (por exemplo, uma célula de rabdomiossarcoma humano), amplificando-se a região de mRNA de ACVR2B que codifica a região intracelular de ACVR2B a partir do RNA total da célula de expressão de ACVR2B por RT-PCR ou análise de sequência no produto amplificado por PCR.
[0056] A eficiência de salto pode ser determinada como a seguir: A solução de reação de RT-PCR é medida para o nível de polinucleotídeo “A” no produto amplificado por PCR com salto de éxon (por exemplo, a quantidade de mRNA de ACVR2B truncado) e o nível de polinucleotídeo “B” no produto amplificado por PCR sem salto de éxon (por exemplo, a quantidade de mRNA de comprimento total de ACVR2B), seguido pelo cálculo com base nesses valores medidos de “A” e “B”, de acordo com a seguinte equação. Eficiência de salto (%) = {A/(A + B)}  100
[0057] Em uma modalidade preferida, o oligômero antissenso da presente invenção causa o salto de éxon com uma eficiência de 10 % ou mais, 15 % ou mais, 20 % ou mais, 25 % ou mais, 30 % ou mais, 35 % ou mais, 40 % ou mais, 45 % ou mais, 50 % ou mais, 55 % ou mais, 60 % ou mais, 62,5 % ou mais, 65 % ou mais, 67,5 % ou mais, 70 % ou mais, 72,5 % ou mais, 75 % ou mais, 77,5 % ou mais, 80 % ou mais, 82,5 % ou mais, 85 % ou mais, 87,5 % ou mais, 90 % ou mais, 92,5 % ou mais, 95 % ou mais, 97,5 % ou mais, 98 % ou mais ou 99 % ou mais.
Uma vez que um oligômero antissenso eficiente seja identificada, um elemento versado na técnica pode buscar identificar um more ideal sequência projetando-se uma variedade de oligômeros antissenso que têm sequências que se sobrepõem com a sequência do oligômero antissenso eficiente, e testando-se os mesmos com o uso de procedimentos, como descrito no presente documento. Oligonucleotídeo, oligômero de morfolino ou oligômero de ácido nucleico de peptídeo:
[0058] O oligômero antissenso da presente invenção pode ser um oligonucleotídeo, um oligômero de morfolino ou um oligômero de ácido nucleico de peptídeo (PNA), em que cada um na faixa de comprimento exemplificativa do oligômero antissenso da presente invenção ou o comprimento exemplificativo do oligômero antissenso da presente invenção.
[0059] O oligonucleotídeo acima (doravante no presente documento denominado “o oligonucleotídeo da presente invenção”) é um oligômero antissenso da presente invenção, cuja unidade constituinte é um nucleotídeo, e tal nucleotídeo pode ser qualquer de um ribonucleotídeo, um desoxirribonucleotídeo ou um nucleotídeo modificado. O oligonucleotídeo antissenso é tipicamente de fita simples.
[0060] Um nucleotídeo modificado se refere a um ribonucleotídeo ou desoxirribonucleotídeo cuja nucleobase, fração de açúcar e fração de ligação de fosfato são todas ou parcialmente modificadas.
[0061] Na presente invenção, exemplos de uma nucleobase incluem adenina, guanina, hipoxantina, citosina, timina, uracila ou bases modificadas das mesmas. Tais bases modificadas podem ser exemplificadas por pseudouracila, 3- metiluracila, di-hidrouracila, 5-alquilcitosinas (por exemplo, 5-metilcitosina), 5-alquiluracilas (por exemplo, 5-etiluracila), 5-halouracilas (por exemplo, 5- bromouracila), 6-azapirimidina, 6-alquilpirimidinas (por exemplo, 6-metiluracila), 2-tiouracila, 4-tiouracila, 4- acetilcitosina, 5-(carboxi-hidroximetil)uracila, 5- carboximetilaminometil-2-tiouracila, 5- carboximetilaminometiluracila, 1-metiladenina, 1-metil- hipoxantina, 2,2-dimetilguanina, 3-metilcitosina, 2- metiladenina, 2-metilguanina, N6-metiladenina, 7- metilguanina, 5-metoxiaminometil-2-tiouracila, 5- metilaminometiluracila, 5-metilcarbonilmetiluracila, 5- metiloxiuracila, 5-metil-2-tiouracila, 2-metiltio-N6- isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, 2- tiocitosina, purina, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, isoguanina, indol, imidazol, xantina e assim por diante, mas não são limitados ao mesmo.
[0062] As modificações para a fração de açúcar podem ser exemplificadas por modificações na posição 2′ de ribose e modificações nas outras posições de açúcar. Exemplos de modificações na posição 2′ de ribose incluem modificações destinadas a substituir o grupo -OH na posição 2′ de ribose com OR, R, R′OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br ou I, em que R representa alquila ou arila, e R′ representa alquileno.
[0063] Exemplos de modificações nas outras posições de açúcar incluem a substituição de O com S na posição 4' de ribose ou desoxirribose, e ligação entre posições 2' e 4′ de açúcar, como exemplificado por LNAs (ácidos nucleicos travados) ou ENAs (ácidos nucleicos ligados a 2′-O,4′-C- etileno), mas não são limitados ao mesmo.
[0064] As modificações para a fração de ligação de fosfato podem ser exemplificadas por modificações destinadas a substituir a ligação de fosfodiéster com uma ligação de fosforotioato, uma ligação de fosforoditioato, uma ligação de alquilfosfonato, uma ligação de fosforoamidato ou uma ligação de boranofosfato (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 18, 9154–9160) (consulte, por exemplo, os documentos JP WO2006/129594 e JP WO2006/038608).
[0065] Na presente invenção, alquila é preferencialmente uma alquila linear ou ramificada que contém 1 a 6 átomos de carbono. Mais especificamente, exemplos incluem metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec- butila, terc-butila, n-pentila, isopentila, neopentila, terc-pentila, n-hexila e iso-hexila. Tal alquila pode ser substituída com 1 a 3 substituintes que incluem halogênio, alcóxi, ciano, nitro, etc.
[0066] Na presente invenção, cicloalquila é preferencialmente um cicloalquila que contém 5 a 12 átomos de carbono. Mais especificamente, exemplos incluem ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-heptila, ciclo-octila, ciclodecila e ciclododecila.
[0067] Na presente invenção, halogênios incluem flúor, cloro, bromo e iodo.
[0068] O alcóxi pode ser um alcóxi linear ou ramificado que contém 1 a 6 átomos de carbono, como exemplificado por metóxi, etóxi, n-propóxi, isopropóxi, n-butóxi, isobutóxi, sec-butóxi, terc-butóxi, n-pentilóxi, isopentilóxi, n-
hexilóxi, iso-hexilóxi e assim por diante. É particularmente preferido um alcóxi que contém 1 a 3 átomos de carbono.
[0069] Na presente invenção, arila é preferencialmente uma arila que contém 6 a 10 átomos de carbono. Mais especificamente, exemplos incluem fenila, -naftila e - naftila. É particularmente preferido fenila. Tal arila pode ser substituída com 1 a 3 substituintes que inclui alquila, halogênio, alcóxi, ciano, nitro, etc.
[0070] Na presente invenção, alquileno é preferencialmente um alquileno linear ou ramificado que contém 1 a 6 átomos de carbono. Mais especificamente, exemplos incluem metileno, etileno, trimetileno, tetrametileno, pentametileno, hexametileno, 2- (etil)trimetileno e 1-(metil)tetrametileno.
[0071] Na presente invenção, acila pode ser uma alcanoíla ou uma aroíla linear ou ramificada. Exemplos de tal alcanoíla incluem formila, acetila, 2-metilacetila, 2,2-dimetilacetila, propionila, butirila, isobutirila, pentanoíla, 2,2-dimetilpropionila, hexanoíla e assim por diante. Exemplos de uma aroíla incluem benzoíla, toluoíla e naftoíla. Tal aroíla pode ser substituída em qualquer posição substituível e pode ser substituída com alquila (ou alquilas).
[0072] O oligonucleotídeo da presente invenção é preferencialmente um oligômero antissenso, de acordo com a presente invenção, cuja unidade constituinte é um grupo representado pela seguinte fórmula geral, em que o grupo - OH na posição 2′ de ribose é substituído com metóxi e a fração de ligação de fosfato é uma ligação de fosforotioato: (em que Base representa uma nucleobase).
[0073] O oligonucleotídeo da presente invenção pode ser prontamente sintetizado com vários sintetizadores automáticos (por exemplo, FOCUS (Aapptec), AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare)), ou, alternativamente, sua síntese pode ser passada para um terceiro (por exemplo, Promega, Takara ou Japan Bio Services), etc.
[0074] O oligômero de morfolino da presente invenção é um oligômero antissenso, de acordo com a presente invenção, cuja unidade constituinte é um grupo representado pela seguinte fórmula geral:
(em que Base é a mesma como definido acima; e W representa um grupo representado por qualquer uma das seguintes fórmulas:
em que X representa -CH2R1, -O-CH2R1, -S-CH2R1, -NR2R3 ou F; R1 representa H ou alquila; R2 e R3, que pode ser o mesmo ou diferentes, representam cada um H, alquila, cicloalquila ou arila; Y1 representa 0, S, CH2 ou NR1;
Y2 representa 0, S ou NR1; e Z representa 0 ou S)). O oligômero de morfolino é preferencialmente um oligômero cuja unidade constituinte é um grupo representado pela seguinte fórmula (isto é, um oligômero de morfolino de fosforodiamidato (doravante no presente documento denominado “PMO”)): (em que Base, R2 e R3 são iguais como definido acima).
[0075] Por exemplo, o oligômero de morfolino pode ser preparado de acordo com o documento WO1991/009033 ou WO2009/064471. Em particular, PMO pode ser preparado de acordo com os procedimentos descritos no documento WO2009/064471 ou pode ser preparado de acordo com os procedimentos mostrados abaixo. [Processo para preparação de PMO]
[0076] Como uma modalidade de um PMO, um composto representado pela seguinte fórmula geral (I) (doravante no presente documento denominado PMO (I)) pode ser fornecido a título de exemplo:
[em que cada Base, R2 e R3 são iguais como definido acima; e n é qualquer número inteiro na faixa de 1 a 99, adequadamente, qualquer número inteiro na faixa de 13 a 29, 14 a 28 ou 15 a 27, 16 a 26, 17 a 25].
[0077] PMO (I) pode ser preparado de acordo com procedimentos conhecidos, por exemplo, conduzindo-se as operações mostradas nas seguintes etapas. Os compostos e reagentes usados nas seguintes etapas não são limitados de qualquer forma com a condição de que os mesmos sejam comumente usados para a preparação de PMO. Além disso, todas dentre as seguintes etapas podem ser obtidas pelo método de fase líquida ou o método de fase sólida (de acordo com manuais de instrução ou com o uso de um sintetizador automático de fase sólida comercialmente disponível). Quando PMO é preparado pelo método de fase sólida, é desejável usar um sintetizador automático em termos de operação simples e síntese precisa.
(1) Etapa A:
[0078] Essa é uma etapa em que um composto representado pela seguinte fórmula geral (II) (doravante no presente documento denominado composto (II)) é tratado com um ácido para preparar um composto representado pela seguinte fórmula geral (III) (doravante no presente documento denominado composto (III)): [em que n, R2 e R3 são iguais como definido acima; cada BP representa independentemente uma nucleobase que pode ser protegida; T representa um grupo tritila, um grupo monometoxitritila ou um grupo dimetoxitritila; e L representa hidrogênio, acila ou um grupo representado pela seguinte fórmula geral (IV) (doravante no presente documento denominado grupo (IV))]:
[0079] “Nucleobases” possíveis para BP podem ser exemplificadas pelas mesmas “nucleobases” listadas para Base, com a condição de que grupos amino ou grupos hidroxila nessas nucleobases para BP possam ser protegidos.
[0080] Os grupos protetores para esses grupos amino não são limitados de qualquer forma com a condição de que os mesmos sejam usados como grupos protetores para ácidos nucleicos. Mais especificamente, exemplos incluem benzoíla, 4-metoxibenzoila, acetila, propionila, butirila, isobutirila, fenilacetila, fenoxiacetila, 4-terc- butilfenoxiacetila, 4-isopropilfenoxiacetila e (dimetilamino)metileno. Os grupos protetores para grupos hidroxila incluem, por exemplo, 2-cianoetila, 4- nitrofenetila, fenilsulfoniletila, metilsulfoniletila, trimetilsililetila, fenila que pode ser substituída com 1 a 5 grupos removedores de elétrons em qualquer posição (ou posições) substituível, difenilcarbamoíla, dimetilcarbamoíla, dietilcarbamoíla, metilfenilcarbamoíla, 1-pirrolidinilcarbamoíla, morfolinocarbamoíla, 4-(terc- butilcarboxi)benzila, 4-[(dimetilamino)carboxi]benzila e 4- (fenilcarboxi)benzila (consulte, por exemplo, o documento WO2009/064471).
[0081] O “carreador sólido” não é limitado de qualquer forma com a condição de que seja um carreador disponível para o uso na reação de fase sólida de ácidos nucleicos, mas é desejável usar, por exemplo, um carreador que (i) seja moderadamente solúvel em reagentes disponíveis para uso na síntese de derivados de ácido nucleico de morfolino (por exemplo, diclorometano, acetonitrila, tetrazol, N- metilimidazol, piridina, anidrido acético, lutidina, ácido trifluoroacético), (ii) é quimicamente estável contra os reagentes disponíveis para uso na síntese de derivados de ácido nucleico de morfolino, (iii) pode ser quimicamente modificado, (iv) pode ser carregado com derivados de ácido nucleico de morfolino desejados, (v) tem força suficiente para suportar alta pressão durante o processamento, e (vi) tem uma determinada faixa de tamanho de partícula e distribuição.
Mais especificamente, exemplos incluem poliestirenos inchados (por exemplo, resina de poliestireno de aminometila reticulada com divinilbenzeno a 1 % (200 a 400 mesh) (2,4 a 3,0 mmol/g) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Japão), HCl de Resina de Poliestireno Aminometilado [divinilbenzeno a 1 %, 100 a 200 mesh] (Peptide Institute, Inc., Japão)), poliestirenos não inchados (por exemplo, Suporte de Iniciador (GE Healthcare)), poliestirenos ligados a cadeia de PEG (por exemplo, resina de NH2-PEG (Watanabe Chemical Industries, Ltd., Japão), TentaGel resina), vidro de poro controlado (CPG) (por exemplo, um produto de CPG Inc.), vidro de poro controlado oxalilado (consulte, por exemplo, Alul et al., Nucleic Acids Research, Volume 19, 1527 (1991)), suporte derivado de aminopolietileno glicol de suporte TentaGel (consulte, por exemplo, Wright et al., Tetrahedron Letters, Volume 34, 3373 (1993)), e um copolímero de poliestireno/divinilbenzeno poroso.
[0082] Como um “ligante,” é possível usar um ligante conhecido que é comumente usado para ligar um ácido nucleico ou um derivado de ácido nucleico de morfolino. Exemplos adequados incluem 3-aminopropila, succinila, 2,2′- dietanol sulfonila e um alquilamino de cadeia longa (LCAA).
[0083] Exemplos de um “ácido” disponível para uso nessa etapa incluem ácido trifluoroacético, ácido dicloroacético ou ácido tricloroacético. A quantidade de um ácido a ser usada está, por exemplo, na faixa de 0,1 equivalente molar a 1000 equivalentes molares, como na faixa de 1 equivalente molar a 100 equivalentes molares, com relação a 1 mol de composto (II).
[0084] Além disso, é possível usar uma amina orgânica juntamente com o ácido acima. Qualquer amina orgânica pode ser usada para esse fim, e os exemplos incluem trietilamina. A quantidade de uma amina orgânica a ser usada está, por exemplo, razoavelmente na faixa de 0,01 equivalente molar a 10 equivalentes molares, como na faixa de 0,1 equivalente molar a 2 equivalentes molares, com relação a 1 mol do ácido.
[0085] Em um caso em que um ácido e uma amina orgânica são usados como um sal ou mistura nessa etapa, os exemplos incluem um sal ou mistura de ácido trifluoroacético e trietilamina, mais especificamente uma mistura que contém 2 equivalentes de ácido trifluoroacético e 1 equivalente de trietilamina.
[0086] Um ácido disponível para uso nessa etapa pode ser usado ser diluído com um solvente adequado para gerar uma concentração na faixa de 0,1 % a 30 %. Qualquer solvente pode ser usado para esse propósito com a condição de que seja inerte para a reação, e os exemplos incluem diclorometano, acetonitrila, álcoois (por exemplo, etanol, isopropanol, trifluoroetanol), água ou misturas dos mesmos.
[0087] A temperatura de reação na reação acima está, por exemplo, na faixa de 10 C a 50 C, como na faixa de 20 C a 40 C ou na faixa de 25 C a 35 C.
[0088] O tempo de reação variará dependendo do tipo de ácido a ser usado e/ou da temperatura de reação, mas está, de modo geral, na faixa de 0,1 minuto a 24 horas, e adequadamente na faixa de 1 minuto a 5 horas.
[0089] Além disso, após a conclusão dessa etapa, uma base pode ser opcionalmente adicionada para neutralizar o ácido restante no sistema. Qualquer “base” pode ser usada para esse fim e os exemplos incluem di-isopropiletilamina. Tal base pode ser usada sendo diluída com um solvente adequado para gerar uma concentração na faixa de 0,1 % (v/v) a 30 % (v/v).
[0090] Qualquer solvente pode ser usado nessa etapa com a condição de que esse seja inerte para a reação, e os exemplos incluem diclorometano, acetonitrila, álcoois (por exemplo, etanol, isopropanol, trifluoroetanol), água ou misturas dos mesmos. A temperatura de reação está, por exemplo, na faixa de 10 C a 50 C, como na faixa de 20 C a 40 C, e adequadamente na faixa de 25 C a 35 C.
[0091] O tempo de reação variará dependendo do tipo de base a ser usado e/ou da temperatura de reação, mas está,
de modo geral, na faixa de 0,1 minuto a 24 horas, e adequadamente na faixa de 1 minuto a 5 horas.
[0092] Deve-se observar que o composto (II) em que n = 1 e L é o grupo (IV), isto é, um composto representado pela seguinte fórmula geral (IIa) (doravante no presente documento denominado composto (IIa)) pode ser preparado de acordo com os seguintes procedimentos: [em que BP, T, Ligante e Carreador sólido são iguais como definido acima]. Etapa 1:
[0093] Essa é uma etapa em que um composto representado pela seguinte fórmula geral (V) é tratado com um agente de acilação para preparar um composto representado pela seguinte fórmula geral (VI) (doravante no presente documento denominado composto (VI)):
[em que BP, T e Ligante são iguais como definido acima; e R4 representa um grupo hidroxila, halogênio, um grupo carboxila ou amino].
[0094] Essa etapa pode ser obtida começando a partir do composto (V) por qualquer reação conhecida para introdução de ligante.
[0095] Em particular, um composto representado pela seguinte fórmula geral (VIa) pode ser preparado por qualquer processo conhecido como reação de esterificação com o uso de composto (V) e anidrido succínico: [em que BP e T são iguais como definido acima]. Etapa 2:
[0096] Essa é uma etapa em que o composto (VI) é reagido com um carreador sólido ao ser tratada com um agente condensante ou similares para preparar o composto (IIa): [em que BP, R4, T, Ligante e Carreador sólido são iguais como definido acima].
[0097] Essa etapa pode ser obtida por qualquer processo conhecido como reação de condensação com o uso de composto (VI) e um carreador sólido.
[0098] O composto (II) em que n = 2 a 99 (adequadamente qualquer número inteiro na faixa de 13 a 29, 14 a 28, 15 a 27, 16 a 26 ou 17 a 25) e L é grupo (IV), isto é, um composto representado pela seguinte fórmula geral (IIa2) pode ser preparado começando a partir do composto (IIa) repetindo-se as Etapas A e B por vezes desejadas do processo para a preparação de PMO revelada no presente documento:
[em que BP, R2, R3, T, Ligante e Carreador sólido são iguais como definido acima; e n′ representa 1 a 98 (em modalidades particulares, n′ representa 1 a 28, 1 a 27, 1 a 26, 1 a 25 ou 1 a 24)].
[0099] (2) Etapa B: Essa é uma etapa em que o composto (III) é tratada com um composto de monômero de morfolino na presença de uma base para preparar um composto representado pela seguinte fórmula geral (VII) (doravante no presente documento denominado composto (VII)): [em que cada BP, L, n, R2, R3 e T são iguais como definido acima].
[0100] Essa etapa pode ser obtida tratando-se o composto (III) com um composto de monômero de morfolino na presença de uma base.
[0101] Tal composto de monômero de morfolino pode ser exemplificado por um composto representado pela seguinte fórmula geral (VIII): [em que BP, R2, R3 e T são iguais como definido acima].
[0102] Exemplos de uma “base” disponível para uso nessa etapa incluem di-isopropiletilamina, trietilamina ou N- etilmorfolino. A quantidade de uma base a ser usada está, por exemplo, na faixa de 1 equivalente molar a 1000 equivalentes molares, adequadamente na faixa de 10 equivalentes molares a 100 equivalentes molares, com relação a 1 mol de composto (III).
[0103] Tal composto de monômero de morfolino e uma base disponível para uso nessa etapa pode ser usado sendo diluído com um solvente adequado para gerar uma concentração de 0,1 % a 30 %. Qualquer solvente pode ser usado para esse propósito com a condição de que esse seja inerte para a reação, e os exemplos incluem N,N- dimetilimidazolidinona, N-metilpiperidona, DMF, diclorometano, acetonitrila, tetra-hidrofurano ou misturas dos mesmos.
[0104] A temperatura de reação está, por exemplo, na faixa de 0 C a 100 C, e adequadamente na faixa de 10 C a 50 C.
[0105] O tempo de reação variará dependendo do tipo de base a ser usado e/ou da temperatura de reação, mas está, de modo geral, na faixa de 1 minuto a 48 horas, e adequadamente na faixa de 30 minuto a 24 horas.
[0106] Além disso, após a conclusão dessa etapa, um agente de acilação pode ser opcionalmente adicionado. Exemplos de um “agente de acilação” incluem anidrido acético, cloreto de ácido acético e anidrido fenoxiacético. Tal agente de acilação pode ser usado sendo diluído com um solvente adequado para gerar uma concentração na faixa de 0,1 % a 30 %, a título de exemplo. Qualquer solvente pode ser usado para esse propósito com a condição de que o mesmo seja inerte para a reação, e os exemplos incluem diclorometano, acetonitrila, tetra-hidrofurano, álcoois (por exemplo, etanol, isopropanol, trifluoroetanol), água ou misturas dos mesmos.
[0107] Se necessário, é possível usar uma base (por exemplo, piridina, lutidina, colidina, trietilamina, di- isopropiletilamina, N-etilmorfolino) juntamente com um agente de acilação. A quantidade de um agente de acilação a ser usado está adequadamente na faixa de 0,1 equivalente molar a 10000 equivalentes molares, e mais adequadamente na faixa de 1 equivalente molar a 1000 equivalentes molares. A quantidade de uma base a ser usada está, por exemplo, na faixa de 0,1 equivalente molar a 100 equivalentes molares, adequadamente na faixa de 1 equivalente molar a 10 equivalentes molares, com relação a 1 mol de um agente de acilação.
[0108] A temperatura de reação nessa reação está adequadamente na faixa de 10 C a 50 C, como na faixa de 20 C a 40 C, e adequadamente na faixa de 25 C a 35 C. O tempo de reação variará, por exemplo, dependendo do tipo de agente de acilação a ser usado e/ou a temperatura de reação, mas está geralmente na faixa de 0,1 minuto a 24 horas, e adequadamente na faixa de 1 minuto a 5 horas. (3) Etapa C:
[0109] Essa é uma etapa em que um agente de desproteção é usado para remover os grupos protetores do composto (VII) preparado na Etapa B, portanto, preparando um composto representado pela fórmula geral (IX): [em que Base, BP, L, n, R2, R3 e T são iguais como definido acima].
[0110] Essa etapa pode ser obtida tratando-se o composto (VII) com um agente de desproteção.
[0111] Exemplos de um “agente de desproteção” incluem amônia e metilamina aquosas concentradas. Tal “agente de desproteção” disponível para o uso nessa etapa pode ser usado sendo diluído com água, metanol, etanol, álcool isopropílico, acetonitrila, tetra-hidrofurano, DMF, N,N- dimetilimidazolidinona, N-metilpiperidona ou um solvente misto dos mesmos. Dentre esses, prefere-se etanol. A quantidade de um agente de desproteção a ser usada está, por exemplo, na faixa de 1 equivalente molar a 100000 equivalentes molares, adequadamente na faixa de 10 equivalentes molares a 1000 equivalentes molares, com relação a 1 mol de composto (VII), a título de exemplo.
[0112] A temperatura de reação está, por exemplo, na faixa de 15 C a 75 C, adequadamente na faixa de 40 C a 60 C ou na faixa de 50 C a 60 C. O tempo de reação para desproteção variará dependendo do tipo de composto (VII) e/ou da temperatura de reação, etc., mas está razoavelmente na faixa de 10 minutos a 30 horas, adequadamente na faixa de 30 minutos a 24 horas, e mais adequadamente na faixa de 5 horas a 20 horas. (4) Etapa D:
[0113] Essa é uma etapa em que o composto (IX) preparado na Etapa C é tratado com um ácido para preparar PMO (I): [em que Base, n, R2, R3 e T são iguais como definido acima].
[0114] Essa etapa pode ser obtida adicionando-se um ácido ao composto (IX).
[0115] Exemplos de um “ácido” disponível para uso nessa etapa incluem ácido tricloroacético, ácido dicloroacético, ácido acético, ácido fosfórico e ácido clorídrico, etc. Quanto à quantidade de um ácido a ser usada, é razoável usar o ácido em uma quantidade para gerar um pH de solução, por exemplo, na faixa de 0,1 a 4,0, adequadamente na faixa de 1,0 a 3,0. Qualquer solvente pode ser usado nessa etapa com a condição de que o mesmo seja inerte para a reação, e exemplos incluem acetonitrila, água ou solventes mistos dos mesmos.
[0116] A temperatura de reação está adequadamente na faixa de 10 C a 50 C, como na faixa de 20 C a 40 C ou na faixa de 25 C a 35 C. O tempo de reação para desproteção variará dependendo do tipo de composto (IX) e/ou da temperatura de reação, etc., mas esse está adequadamente na faixa de 0,1 minutos a 5 horas, como na faixa de 1 minuto a 1 hora, e mais adequadamente na faixa de 1 minuto a 30 minutos.
[0117] PMO (I) pode ser obtido a partir da mistura de reação obtida nessa etapa por meios de separação e purificação comumente usados que incluem extração, concentração, neutralização, filtração, centrifugação, recristalização, cromatografia em coluna de fase reversa de C8 a C18, cromatografia em coluna de troca de cátion, cromatografia em coluna de troca de ânions, cromatografia em coluna de filtração de gel, cromatografia líquida de alta eficácia, diálise, ultrafiltração e outros meios, que podem ser usados sozinhos ou em combinação, em que o PMO
(I) desejado pode ser isolado e purificado (consulte, por exemplo, o documento WO1991/09033).
[0118] No caso do uso de cromatografia em fase reversa para purificação de PMO (I), uma solução mista de 20 mM de tampão de trietilamina/ acetato e acetonitrila pode ser usado como um solvente de eluição, a título de exemplo.
[0119] De modo semelhante, no caso do uso de cromatografia de troca de íon para purificação de PMO (I), uma solução mista de 1 M de cloreto de sódio aquoso e 10 mM de hidróxido de sódio aquoso podem ser usados, a título de exemplo.
[0120] O oligômero de ácido nucleico de peptídeo é um oligômero antissenso, de acordo com a presente invenção, cuja unidade constituinte é um grupo representado pela seguinte fórmula geral: (em que Base é a mesma como definido acima).
[0121] Os ácidos nucleicos de peptídeo podem ser preparados, por exemplo, de acordo com os documentos listados abaixo.
1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991) 2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, Jacs., 114, 1895 (1992) 3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994) 4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995) 5) T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)
[0122] O oligômero antissenso da presente invenção pode ser configurado de modo que sua extremidade 5′-terminal é qualquer um dos grupos representados pelas fórmulas químicas (1) a (3) mostradas abaixo, em que (3) -OH é preferido.
Como mencionado acima, um peptídeo funcional (por exemplo, CPP (peptídeo de penetração de célula)) pode ser ligado ao oligômero antissenso sem ou através de um ligante. Quando o peptídeo funcional é ligado ao oligômero antissenso através de um ligante, um aminoácido adicional pode ser fixado ao peptídeo funcional. Em uma modalidade preferida, o peptídeo funcional pode ser ligado a um oligômero de morfolino de fosforodiamidato (“PMO”) na extremidade 5′-terminal ou extremidade 3′-terminal em que a ligação à extremidade 3′- terminal é preferida. Adicionalmente, em uma modalidade preferida, o terminal C do peptídeo funcional pode ser ligado ao PMO. Sais farmaceuticamente aceitáveis e hidratos
[0123] Exemplos de um sal farmaceuticamente aceitável do composto (por exemplo, oligômero antissenso) da presente invenção incluem sais de metal alcalino (por exemplo, sal de sódio, sal de potássio, sal de lítio); sais de metal alcalinoterroso (por exemplo, sal de cálcio, sal de magnésio); sais metálicos (por exemplo, sal de alumínio, sal de ferro, sal de zinco, sal de cobre, sal de níquel, sal de cobalto); sal de amônio; sais de amina orgânicos (por exemplo, como sal de t-octilamina, sal de dibenzilamina, sal de morfolina, sal de glicosamina, sal de fenilglicina alquil éster, sal de etilenodiamina, sal de N- metilglicamina, sal de guanidina, sal de dietilamina, sal de trietilamina, sal de diciclo-hexilamina, sal de N,N'- dibenziletilenodiamina, sal de cloroprocaína, sal de procaína, sal de dietanolamina, sal de N-benzil- fenetilamina, sal de piperazina, sal de tetrametilamônio, sal de tris(hidroximetil)aminometano); sais de hidrácido halogenados (por exemplo, sal de fluoridrato, sal de cloridrato, sal de bromidrato, sal iodidrato); sais de ácido orgânico (isto é, sal de nitrato, sal de perclorato, sal de sulfato, sal de fosfato); sais de ácido alcanossulfônico de baixo peso molecular (por exemplo, sal de metanossulfonato, sal de trifluorometanossulfonato, sal de etanossulfonato); sais de ácido arilsulfônico (por exemplo, sal de benzenossulfonato, sal de p- toluenossulfonato); sais de ácido orgânico (por exemplo, sal de acetato, sal de malato, sal de fumarato, sal de succinato, sal de citrato, sal de tartarato, sal de oxalato, sal de maleato); sais de aminoácido (por exemplo, sal de glicina, sal de lisina, sal de arginina, sal de ornitina, sal de glutamato, sal de aspartato), etc. Esses sais podem ser preparados de qualquer maneira conhecida.
[0124] Um hidrato do composto (por exemplo, oligômero antissenso) da presente invenção pode ser preparado de qualquer maneira conhecida. Modalidades particulares
[0125] O oligômero antissenso da presente invenção inclui, por exemplo, um oligonucleotídeo, oligômero de morfolino ou PNA que tem um comprimento da faixa de comprimento exemplificativa do oligômero antissenso da presente invenção ou o comprimento exemplificativo do oligômero antissenso da presente invenção. Em uma modalidade particular o oligonucleotídeo é um oligômero antissenso em que pelo menos uma fração de açúcar e/ou pelo menos uma fração de ligação de fosfato no oligonucleotídeo é modificada.
[0126] Em uma modalidade particular, o oligonucleotídeo antissenso da presente invenção inclui pelo menos uma fração de açúcar modificada que é uma ribose na qual o grupo -OH na posição 2′ é substituído com qualquer grupo selecionado a partir do grupo que consiste em OR, R, R′OR,
SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br e I (em que R representa alquila ou arila, e R′ representa alquileno). Em uma modalidade particular, o oligonucleotídeo inclui pelo menos uma fração de ligação de fosfato modificada selecionada a partir do grupo que consiste em uma ligação de fosforotioato, uma ligação de fosforoditioato, uma ligação de alquilfosfonato, uma ligação de fosforoamidato e uma ligação de boranofosfato.
[0127] Em uma modalidade particular, o oligonucleotídeo é um oligômero antissenso que compreende pelo menos um anel de morfolino. Em uma modalidade particular, o antissenso é um oligômero de morfolino ou oligômero de morfolino de fosforodiamidato. Em uma modalidade adicional, o oligômero antissenso tem qualquer um dos grupos representados pelas fórmulas químicas (1) a (3) mostradas abaixo em suas extremidades 5′-terminal.
Todos os oligômeros antissenso testados na seção exemplificativa podem empregar qualquer modificação química como descrito acima. Como mencionado acima, um peptídeo funcional (por exemplo, CPP (peptídeo de penetração de célula)) pode ser ligado ao oligômero antissenso sem ou através de um ligante. Quando o peptídeo funcional é ligado ao oligômero antissenso através de um ligante, um aminoácido adicional pode ser fixado ao peptídeo funcional. Em uma modalidade preferida, o peptídeo funcional pode ser ligado a um oligômero de morfolino de fosforodiamidato (“PMO”) na extremidade 5′-terminal ou extremidade 3′-terminal. Composições farmacêuticas
[0128] De acordo com o segundo aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende o composto da presente invenção (por exemplo, o oligômero antissenso da presente invenção) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo como um ingrediente ativo (doravante no presente documento denominado “a composição farmacêutica da presente invenção”). Em modalidades particulares, a composição farmacêutica compreende qualquer um dos oligômeros ou oligonucleotídeos anteriormente mencionados ou sais farmacêuticos ou hidratos dos mesmos, e pelo menos um aditivo e/ou carreador farmaceuticamente aceitável. As formulações adequadas para o uso na presente invenção são constatadas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17ª edição,
1985. Para uma breve revisão dos métodos para entrega de fármaco, consulte, por exemplo, Langer (Science 249:1527– 1533, 1990).
[0129] O carreador pode servir para promover a entrega do oligômero para o tecido muscular. Tal carreador não é limitado de qualquer forma com a condição de que seja farmaceuticamente aceitável. Exemplos adequados incluem carreadores catiônicos (por exemplo, lipossomos catiônicos, polímeros catiônicos) ou carreadores à base de envelope viral. Exemplos de lipossomos catiônicos incluem lipossomos formados a partir de glicerol de 2-O-(2- dietilaminoetil)carbamoil-1,3-O-dioleoila e um fosfolipídio como membros constituintes essenciais (doravante no presente documento denominado “lipossomo A”), Oligofectamina (Invitrogen), Lipofectina (Invitrogen), Lipofectamina (Invitrogen), Lipofectamina 2000 (Invitrogen), DMRIE-C (Invitrogen), GeneSilencer (Gene Therapy Systems), TransMessenger (QIAGEN), TransIT TKO (Mirus) e Nucleofector II (Lonza). Dentre esses, prefere-se lipossomo A. Exemplos de polímeros catiônicos incluem JetSI (Qbiogene) e Jet-PEI (polietilenoimina, Qbiogene). Exemplos de carreadores à base de envelope viral incluem GenomeOne (HVJ-E lipossomos, Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd., Japão). Alternativamente, também é possível usar o dispositivo farmacêutico mostrado na Patente japonesa nº 2924179 ou os carreadores catiônicos mostrados nos documentos JP WO2006/129594 e JP WO2008/096690.
[0130] Para maiores detalhes, pode ser feita referência às Patentes nº US 4.235.871 e US 4.737.323, WO96/14057, “New RRC, Liposomes: practical approach, IRL Press, Oxford (1990) páginas 33–104”, etc.
[0131] A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender opcionalmente um aditivo farmaceuticamente aceitável, além do oligômero antissenso da presente invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo e/ou um carreador como descrito acima. Exemplos de tal aditivo incluem um auxílio de emulsificador (por exemplo, um ácido graxo que contém 6 a 22 átomos de carbono ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, albumina, dextrano), um agente estabilizante (por exemplo, colesterol, ácido fosfatídico), um agente isotonizante (por exemplo, cloreto de sódio, glicose, maltose, lactose, sacarose, trealose), e um ajustador de pH (por exemplo, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, trietanolamina). Esses aditivos podem ser usados sozinhos ou em combinação. O teor do aditivo (ou aditivos) na composição farmacêutica da presente invenção é razoavelmente de 90 % em peso ou menos, como 60 % em peso ou menos, e adequadamente 50 % em peso ou menos.
[0132] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser preparada adicionando-se o composto (por exemplo, oligômero antissenso) da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo a uma dispersão de um carreador, seguido pela agitação adequada. O aditivo (ou aditivos) pode ser adicionado em qualquer estágio adequado, antes ou após a adição do composto da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo. Qualquer solvente aquoso pode ser usado para a adição do composto da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo com a condição de que seja farmaceuticamente aceitável, e exemplos incluem água injetável, água destilada injetável, soluções eletrolíticas (por exemplo, solução salina fisiológica), e soluções de açúcar (por exemplo, solução de glicose, solução de maltose). Além disso, nesse caso, as condições que incluem pH e temperatura podem ser selecionadas conforme adequado pelos elementos versados na técnica.
[0133] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser formulada em uma solução ou uma formulação liofilizada da mesma. Tal formulação liofilizada pode ser preparada de maneira padrão por secagem por congelamento da composição farmacêutica da presente invenção em uma forma de solução. Por exemplo, a composição farmacêutica da presente invenção em uma forma de solução pode ser esterilizada conforme adequado e, então, dispensada em determinadas quantidades em recipientes, seguido por congelamento preliminar sob condições de cerca de -40 C a -20 C por cerca de 2 horas, secagem primária a cerca de 0 C a 10 C sob pressão reduzida e, então, secagem secundária a cerca de 15 C a 25 C sob pressão reduzida. Além disso, na maioria dos casos, os frascos podem ser purgados com um gás nitrogênio e, então, tapados, portanto, fornecendo uma formulação liofilizada da composição farmacêutica da presente invenção.
[0134] Tal formulação liofilizada da composição farmacêutica da presente invenção pode, de modo geral, ser usada após ser reconstituída por adição de qualquer solução adequada (isto é, uma solução reconstituinte). Exemplos de tal solução reconstituinte incluem água injetável, solução salina fisiológica, e outras soluções de infusão comumente usadas. O volume de tal solução reconstituinte variará, por exemplo, dependendo do uso destinado e não é limitado de qualquer forma, mas é razoavelmente 0,5 a 2 vezes maior que o volume de solução antes da secagem por congelamento ou 500 ml ou menos.
[0135] O composto (por exemplo, oligômero antissenso) da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo contido na composição farmacêutica da presente invenção pode estar na forma de um hidrato do mesmo. Tal hidrato pode ser preparado de qualquer maneira conhecida.
[0136] Composições e métodos para a formulação de composições farmacêuticas são dependentes de uma variedade de critérios, que inclui, porém sem limitação, a via de administração, extensão da doença ou dose a ser administrada.
[0137] Essas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais ou podem ser filtradas de modo estéril. As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para uso como são ou liofilizadas, em que a preparação liofilizada é combinada com um carreador aquoso estéril antes da administração. O pH das preparações tipicamente será entre 3 e 11, adequadamente entre 5 e 9 ou entre 6 e 8, e mais adequadamente entre 7 e 8, como 7 a 7,5. As composições resultantes na forma sólida podem ser embaladas em múltiplas unidades de dose simples, cada que contém uma quantidade fixada do agente ou agentes acima mencionados, como em uma embalagem vedada de comprimidos ou cápsulas. A composição na forma sólida também pode ser embalada em um recipiente para uma quantidade flexível, como em um tubo compressível projetado para um creme ou pomada topicamente aplicável.
[0138] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada em qualquer modo farmaceuticamente aceitável, que pode ser selecionado como adequado para o método terapêutico destinado. No entanto, em termos de facilidade de entrega para o tecido muscular, são preferidas administração intravenosa, administração intra- arterial, administração intramuscular, administração subcutânea, administração oral, administração intersticial, administração percutânea e assim por diante. Além disso, a composição da presente invenção pode estar em qualquer forma de dosagem, e exemplos incluem vários tipos de injeções, formulações orais, gotas, inalantes, pomadas, loções, etc.
[0139] A concentração do composto (por exemplo, oligômero antissenso) da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo contida na composição farmacêutica da presente invenção variará, por exemplo, dependendo do tipo de carreador, mas está razoavelmente na faixa de 0,1 nM a 100 M, e adequadamente na faixa de 100 nM a 10 M. De modo semelhante, a razão de peso do carreador para o oligômero antissenso da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo continha na composição farmacêutica da presente invenção (isto é, o carreador/oligômero antissenso ou sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável da mesma razão) variará, por exemplo, dependendo das propriedades do oligômero e o tipo do carreador, mas está razoavelmente na faixa de 0,1 a 100, e adequadamente na faixa de 0,1 a 10.
[0140] O composto da invenção, um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo pode ser incluído em uma unidade formulação como em um farmaceuticamente aceitável carreador ou diluente em uma quantidade suficiente para entregar a um indivíduo uma quantidade terapeuticamente aceitável sem causar efeitos colaterais graves no indivíduo.
[0141] A dose para administração da composição farmacêutica da presente invenção é desejavelmente ajustada considerando-se o tipo do oligômero antissenso da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo contido nessa, a forma de dosagem desejada, a condição de um indivíduo como idade e massa corporal, a via de administração, e a natureza e gravidade de uma doença. Se o indivíduo é um ser indivíduo humano, a dose diária para adultos está, de modo geral, na faixa de 0,1 mg a 10 g/kg de massa corporal, como na faixa de 1 mg a 1 g/kg de massa corporal, 20 mg a 120 mg/kg de massa corporal, 30 mg a 100 mg/kg de massa corporal ou 40 mg a 80 mg/kg de massa corporal, calculada como a quantidade do oligômero antissenso da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo. Essa faixa numérica pode variar dependendo do tipo de doença a ser alvejada, do modo de administração, e/ou do tipo de molécula-alvo. Desse modo, uma dose inferior a essa faixa pode ser suficiente em alguns casos ou, por outro lado, uma dose superior a essa faixa deve ser exigida em alguns casos. Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada uma vez a diversas vezes por dia ou em intervalos de um a diversos dias.
[0142] Em outra modalidade, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser uma composição farmacêutica que compreende um vetor com a capacidade para expressar o composto da presente invenção (por exemplo, o oligonucleotídeo antissenso da presente invenção) e um carreador como descrito acima. Tal vetor de expressão pode ter a capacidade para expressar uma pluralidade de oligonucleotídeos antissensos, de acordo com a presente invenção. Tal composição farmacêutica pode compreender opcionalmente um aditivo farmaceuticamente aceitável, como descrito acima. A concentração do vetor de expressão contida nessa composição farmacêutica variará, por exemplo, dependendo do tipo de carreador, mas está razoavelmente na faixa de 0,1 nM a 100 M, e adequadamente na faixa de 100 nM a 10 M. A razão de peso do carreador para o vetor de expressão contida nessa composição farmacêutica (isto é, o carreador/vetor de expressão razão) variará, por exemplo, dependendo das propriedades do vetor de expressão e o tipo do carreador, mas está razoavelmente na faixa de 0,1 a 100, e adequadamente na faixa de 0,1 a 10. Além disso, o teor do carreador contido nessa composição farmacêutica é igual ao descrito acima, e os procedimentos para preparação também são iguais ao descrito acima. Usos terapêuticos
[0143] O composto da invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo ou a composição farmacêutica da invenção que compreende esses (doravante no presente documento denominado “Agente terapêutico da presente invenção”) pode ser usado em terapia, como no tratamento de um ser humano.
[0144] O Agente terapêutico da presente invenção pode ser fornecido para o uso na prevenção ou no tratamento de um distúrbio metabólico (por exemplo, obesidade, síndrome metabólica, diabetes), uma doença amiotrófica ou uma doença de fadiga muscular ou uma doença sarcopênica. Exemplos de uma doença amiotrófica ou uma doença de fadiga muscular incluem amiotrofia miogênica (por exemplo, distrofia muscular (por exemplo, distrofia muscular de Duchenne, Fukuyama distrofia muscular, distrofia miotônica), miopatia congênita, miosite por corpúsculos de inclusão), amiotrofia neurogênica (por exemplo, esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinhal, atrofia muscular espinhal e bulbar), amiotrofia por desuso (por exemplo, síndrome de desuso induzido por apoplexia), doença de fadiga muscular (por exemplo, caquexia de câncer, amiotrofia relacionada à sepse) e vários tipos de doenças sarcopênicas que incluem perda de músculo esquelético relacionado a idade (sarcopenia relacionada à idade), em que a distrofia muscular é particularmente adequada.
[0145] Em algumas modalidades da presente invenção, é fornecido um método para prevenção ou tratamento de uma doença amiotrófica, uma doença de fadiga muscular ou uma doença sarcopênica, que compreende administrar a um indivíduo que precisa de prevenção ou tratamento de uma doença amiotrófica ou uma doença de fadiga muscular com uma quantidade terapeuticamente eficaz do Agente terapêutico da presente invenção. Em uma modalidade particular, o composto (por exemplo, oligômero antissenso) da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo pode ser administrado ao sujeito na forma da composição farmacêutica da presente invenção.
[0146] No contexto da presente invenção, o termo “indivíduo” se destina a significar um indivíduo humano ou um animal de sangue quente não humano, como exemplificado por pássaros e mamíferos não humanos (por exemplo, vaca, macaco, gato, camundongo, rato, porquinho-da-índia, hamster, porco, cachorro, coelho, ovelha, cavalo). O “indivíduo” é preferencialmente um indivíduo humano.
[0147] Em modalidades particulares da presente invenção, é fornecido o uso do Agente terapêutico da presente invenção na fabricação de uma composição farmacêutica para a prevenção ou o tratamento de uma doença amiotrófica ou uma doença de fadiga muscular. Em modalidades particulares da presente invenção, é fornecido o uso do composto (por exemplo, oligômero antissenso) da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo na fabricação de uma composição farmacêutica para a prevenção ou o tratamento de uma doença amiotrófica ou uma doença de fadiga muscular.
[0148] Em outras modalidades da presente invenção, é fornecido o Agente terapêutico da presente invenção para uso no tratamento de uma doença amiotrófica ou uma doença de fadiga muscular.
[0149] Como descrito acima, o composto da presente invenção permite a inibição de transdução de sinal de miostatina no nível de mRNA através de, por exemplo, indução de salto de éxon ou degradação de mRNA. Em uma modalidade, o composto da presente invenção pode ser o oligômero antissenso da presente invenção.
[0150] A inibição de sinal de miostatina em tecidos musculares pode ser aplicada para a prevenção ou o tratamento de uma doença amiotrófica, uma doença de fadiga muscular ou uma doença sarcopênica. A atrofia de músculo esquelético não apenas diminui a qualidade de vida de indivíduos, mas também acompanha complicação sistêmica grave que inclui desnutrição e insuficiência respiratória e assim os agentes e tratamentos com a capacidade para abordar essa necessidade médica são exigidos.
[0151] Desse modo, uma doença amiotrófica, uma doença de fadiga muscular ou uma doença sarcopênica pode ser prevenida ou tratada quando o Agente terapêutico da presente invenção é administrado a um indivíduo que precisa de prevenção ou tratamento de uma doença amiotrófica, uma doença de fadiga muscular ou uma doença sarcopênica.
[0152] A presente invenção também fornece o Agente terapêutico da presente invenção para uso em terapia em um indivíduo. A dita terapia pode ser a prevenção ou o tratamento da doença listada acima. Em uma modalidade, a terapia pode ser a prevenção ou o tratamento de uma doença amiotrófica, uma doença de fadiga muscular ou uma doença sarcopênica em um indivíduo. Em uma modalidade, a doença amiotrófica pode ser distrofia muscular de Duchenne. O indivíduo pode ser um indivíduo humano.
[0153] A presente invenção também fornece uso do composto da presente invenção ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo na fabricação de um medicamento (como uma composição farmacêutica) para prevenção ou tratamento de uma doença amiotrófica, uma doença de fadiga muscular ou uma doença sarcopênica em um indivíduo. Em uma modalidade, a doença amiotrófica é distrofia muscular de Duchenne. Em uma modalidade, o indivíduo é um ser humano.
[0154] A dose e a via de administração podem ser iguais àquelas listadas para a composição farmacêutica da presente invenção.
[0155] A presente invenção também fornece um método para tratar uma doença em um indivíduo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do Agente terapêutico da presente invenção. A doença pode ser um distúrbio metabólico (por exemplo, obesidade, síndrome metabólica, diabetes), uma doença amiotrófica, uma doença de fadiga muscular ou uma doença sarcopênica. Exemplos de uma doença amiotrófica ou uma doença de fadiga muscular incluem amiotrofia miogênica (por exemplo, distrofia muscular (por exemplo, distrofia muscular de Duchenne, Fukuyama distrofia muscular, distrofia miotônica), miopatia congênita, miosite por corpúsculos de inclusão), amiotrofia neurogênica (por exemplo, esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinhal, atrofia muscular espinhal e bulbar), amiotrofia por desuso (por exemplo, síndrome de desuso induzido por apoplexia), doença de fadiga muscular (por exemplo, caquexia de câncer, amiotrofia relacionada à sepse) e vários tipos de doenças sarcopênicas que incluem perda de músculo esquelético relacionado a idade (sarcopenia relacionada à idade), em que a distrofia muscular é particularmente adequada. Em uma modalidade, a terapia pode ser a prevenção ou o tratamento de uma doença amiotrófica, uma doença de fadiga muscular ou uma doença sarcopênica em um indivíduo. Em uma modalidade, a doença amiotrófica pode ser distrofia muscular de Duchenne. O indivíduo pode ser um indivíduo humano. A dose e a via de administração podem ser iguais àquelas listadas para a composição farmacêutica da presente invenção. Animais
[0156] A presente invenção também fornece um animal geneticamente manipulado que produz uma versão truncada de proteína de ACVR2B que carece de parte da região intracelular de ACVR2B (doravante no presente documento denominado “o animal GM da presente invenção”). Como usado no presente documento, os animais podem ser de qualquer espécie exceto ser humano. Os animais particularmente adequados são animais domésticos como peixe (por exemplo, atum), bovinos, ovelha, cabras ou porcos. O elemento versado na técnica tem a capacidade para gerar tal animal geneticamente manipulado com o uso de técnicas padrão. Por exemplo, o animal GM da presente invenção pode ser produzido por administração do composto da presente invenção ou uma composição farmacêutica da presente invenção. Por exemplo, o animal GM da presente invenção pode ser produzido por CRISPR-CAS9, siRNA, sistema de knockout loxP, TALENs, dedos de Zinco (ZFN) ou oligômero antissenso.
[0157] Quando CRISPR-CAS9 é usado, um RNA guia que tem uma sequência complementar a uma sequência de DNA genômico alvo que codifica ACVR2B ou uma parte de ACVR2B (por exemplo, a região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem) é introduzido em uma célula-alvo ou um animal hospedeiro, enquanto identifica-se uma sequência-alvo a ser clivada. A proteína Cas9 (ou similar a Cas9) introduzida na célula-
alvo cliva a parte de fita dupla composta do DNA genômico e RNA guia.
Por meio de um processo de reparação o sítio de clivagem, uma mutação (ou mutações) é causada por deficiência e/ou inserção de nucleotídeos, portanto, causando a inativação de ACVR2B.
Exemplos da sequência de DNA genômico alvo inclui qualquer sequência de éxons, por exemplo, éxons 1 a 11 de ACVR2B.
Adequadamente, a sequência de DNA genômico alvo inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11 ou grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9 e 10 de ACVR2B.
Em uma modalidade, a sequência de DNA genômico alvo inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 9 e 10 de ACVR2B.
Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 9 e 10 de ACVR2B.
Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6 e 10 de ACVR2B.
Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5 e 6 de ACVR2B.
Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 7, 8 e 9 de ACVR2B.
Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 7 e 8 de ACVR2B.
Em outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo é éxon 5 de ACVR2B. Em ainda outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo é éxon 6 de ACVR2B. Em ainda outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo é éxon 7 de ACVR2B. Em ainda outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo é éxon 8 de ACVR2B. Em ainda outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo é éxon 9 de ACVR2B. Em ainda outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo é éxon 10 de ACVR2B. Em ainda outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo é éxon 11 de ACVR2B. Em ainda outra modalidade, a sequência de DNA genômico alvo inclui qualquer sequência de pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 7, 8, 9 e 10 ou grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9 e 10 de ACVR2B. Alternativamente, íntrons podem ser alvejados por CRISPR- CAS9. Por exemplo, íntrons 7 e 8 que ensanduicham éxon 8 podem ser clivados. Quando os sítios clivados são reparados, o éxon 8 pode se tornar ausente para gerar mRNA mutante deficiente de éxon 8. De modo similar, íntrons 4 e 5 ou íntrons 5 e 6 ou íntrons 6 e 7 ou íntrons 8 e 9 ou íntrons 9 e 10 ou íntrons 10 e 11 podem ser alvejados para clivagem.
[0158] Quando siRNA é usado para inibir o sinal de miostatina, um siRNA projetado para alvejar uma sequência de mRNA de ACVR2B é introduzido a uma célula-alvo. Quando a fita guia do siRNA assim introduzido se hibridiza à sequência alvejada, então uma proteína RISC endógena na célula-alvo identifica a parte de fita dupla composta da fita guia e a fita de mRNA alvejada, e cliva a sequência alvejada do mRNA. Ao fazer isso, o nível de proteína de ACVR2B no animal GM da presente invenção é reduzido.
[0159] Deve-se observar que todas as publicações citadas no presente documento, que inclui documentos da técnica anterior, jornais de patente e outros documentos de patente, são incorporados ao presente documento a título de referência. A presente invenção será adicionalmente descrita em maiores detalhes abaixo a título dos seguintes exemplos ilustrativos, embora a presente invenção não seja limitada a isso.
EXEMPLO [Exemplo de Referência 1] Ácido 4-{[(2S,6R)-6-(5-metil-2,4-dioxopirimidin-1-il)-4- tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico carregado em resina de aminopoliestireno Etapa 1: Preparação de ácido 4-{[(2S,6R)-6-(5-metil-2,4- dioxopirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4- oxobutanoico
[0160] Sob uma atmosfera de argônio, 1-[(2R,6S)-6- (hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-5-metilpirimidina- 2,4-diona (41,11 g) e 4-dimetilaminopiridina (4-DMAP) (15,58 g) foram suspensas em diclorometano (850 ml), e anidrido succínico (12,76 g) foi, então, adicionado ao mesmo, seguido pela agitação à temperatura ambiente por 3,5 horas. A solução de reação foi extraída com diclorometano e 1 M de fosfato de di-hidrogênio de sódio aquoso. A camada orgânica resultante foi lavada sequencialmente com 1 M de fosfato de di-hidrogênio de sódio aquoso e cloreto de sódio aquoso saturado. A camada orgânica resultante foi seca com sulfato de sódio e concentrada sob pressão reduzida. Ao sólido resultante, diclorometano (600 ml) foi adicionado para efetuar a cristalização, seguido por filtração. Após o diclorometano adicional (300 ml) ter sido adicionado, os cristais foram agitados por 5 minutos, e, então, filtrados e secos durante a noite sob pressão reduzida para obter o produto desejado (50,2 g). Etapa 2: Preparação de ácido 4-{[(2S,6R)-6-(5-metil-2,4- dioxopirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4- oxobutanoico carregado em resina de aminopoliestireno
[0161] Ácido 4-{[(2S,6R)-6-(5-metil-2,4-dioxopirimidin- 1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico (50,2 g) foi dissolvido em piridina (desidratado) (600 ml), seguido pela adição de 4-DMAP (12,4 g) e cloridrato de 1-(3- dimetilaminopropil)-3-etilcarbodi-imida (77,6 g). A resina de aminopoliestireno e resina de Aminometila (um produto de Watanabe Chemical Industries, Ltd., Japão, A00673, 200 a 400 mesh, 1 mmol/g, 1 % de DVB) (40,5 g) e trietilamina (69,6 ml) foram, então, adicionados a essa mistura, seguido pela agitação à temperatura ambiente por 4 dias. Após a reação, a resina foi coletada por filtração. A resina resultante foi lavada sequencialmente com piridina, metanol e diclorometano, e, então, seca sob pressão reduzida. À resina resultante, tetra-hidrofurano (desidratada) (500 ml), anidrido acético (104 ml) e 2,6-lutidina (128 ml) foram adicionados, seguido pela agitação à temperatura ambiente por 4 horas. A resina foi coletada por filtração, lavada sequencialmente com piridina, metanol e diclorometano, e, então, seca sob pressão reduzida para obter 59,0 g do produto desejado.
[0162] Para determinar a quantidade de carga do produto desejado, a quantidade molar de tritila por grama da resina foi medida de uma maneira conhecida, como absorbância de UV a 409 nm. A quantidade de carga na resina constada foi de 467,83 mol/g. Condições para medição de UV Instrumento: U-2910 (Hitachi, Ltd., Japão) Solvente: ácido metanossulfônico Comprimento de onda: 409 nm Valor : 45000 [Exemplo de Referência 2] Ácido 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oxopirimidin-1-il)-4- tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico carregado em resina de aminopoliestireno
[0163] Os mesmos procedimentos como mostrado no Exemplo de Referência 1 foram repetidos para preparar o composto do título, exceto pelo fato de que 1-[(2R,6S)-6- (hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-5-metilpirimidina- 2,4-diona usado na Etapa 1 do Exemplo de Referência 1 foi substituído nessa etapa com N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroximetil)- 4-tritilmorfolin-2-il]-2-oxo-1,2-di-hidropirimidin-4- il}benzamida.
[0164] Para determinar a quantidade de carga do produto desejado, a quantidade molar de tritila por grama da resina foi medida de uma maneira conhecida, como absorbância de UV a 409 nm. A quantidade de carga na resina constada foi de 460,28 mol/g. [Exemplo de Referência 3] Ácido 4-{[(2S,6R)-6-(6-benzamidopurin-9-il)-4- tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico carregado em resina de aminopoliestireno
[0165] Os mesmos procedimentos como mostrado no Exemplo de Referência 1 foram repetidos para preparar o composto do título, exceto pelo fato de que 1-[(2R,6S)-6- (hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-5-metilpirimidina- 2,4-diona usado na Etapa 1 do Exemplo de Referência 1 foi substituído nessa etapa com N-{9-[(2R,6S)-6-(hidroximetil)- 4-tritilmorfolin-2-il]purin-6-il}benzamida.
[0166] Para determinar a quantidade de carga do produto desejado, a quantidade molar de tritila por grama da resina foi medida de uma maneira conhecida, como absorbância de UV a 409 nm. A quantidade de carga na resina constada foi de 425,13 mol/g. [Exemplo de Referência 4] Ácido 4-{{(2S,6R)-6-{6-(2-cianoetoxi)-2-[(2- fenoxiacetil)amino]purin-9-il}-4-tritilmorfolin-2- il}metoxi}-4-oxobutanoico carregado em resina de aminopoliestireno
[0167] Os mesmos procedimentos como mostrado no Exemplo de Referência 1 foram repetidos para preparar o composto do título, exceto pelo fato de que 1-[(2R,6S)-6- (hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-5-metilpirimidina- 2,4-diona usado na Etapa 1 do Exemplo de Referência 1 foi substituído nessa etapa com N-{6-(2-cianoetoxi)-9-[(2R,6S)- 6-(hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]purin-2-il}-2- fenoxiacetamida.
[0168] Para determinar a quantidade de carga do produto desejado, a quantidade molar de tritila por grama da resina foi medida de uma maneira conhecida, como absorbância de UV a 409 nm. A quantidade de carga na resina constada foi de 341,09 mol/g.
[0169] De acordo com as descrições no Exemplo 1 mostrado abaixo ou de acordo com os procedimentos descritos no documento PCT/JP2015/57180 com o uso de um ácido nucleico sintetizador (AKTA Oligopilot 10 plus), PMOs foram sintetizados (a extremidade 5′-terminal é grupo (3)). Dentre os PMOs sintetizados, aqueles que mostram atividade de salto foram listados na Tabela 1.
[0170] [Tabela 1] Peso Peso PMO Nome de Sequência de nucleotídeo (5′ SEQ ID molecular molecular nº Sequência a 3′) NO: (calculado) (medido) ACVR2B_H5_48- 1 CGAGCCTTGATCTCCAGCAGCTGC 7884,72 7884,73 12 71 ACVR2B_H5_51- 2 CCCCGAGCCTTGATCTCCAGCAGC 7829,72 7829,16 13 74 ACVR2B_H5_86- 3 TCATGAGCTGGGCCTTCCAGACAC 7908,75 7908,84 14 109 ACVR2B_H5_119- 4 GGAGTGGGAAGATCTTGACAGCTA 8076,80 8077,00 15 142 ACVR2B_H5_121- 5 CTGGAGTGGGAAGATCTTGACAGC 8052,79 8052,66 16 144 ACVR2B_H5_123- 6 ACCTGGAGTGGGAAGATCTTGACA 8036,79 8036,89 17 146 ACVR2B_H6_126- 7 CTCACCTTGTCATGGAAGGCCGTG 7939,74 7940,09 18 149 ACVR2B_H7_10- 8 GATGTTCCCCTTGAGGTAATCCGT 7929,74 7929,60 19 33
Peso Peso PMO Nome de Sequência de nucleotídeo (5′ SEQ ID molecular molecular nº Sequência a 3′) NO: (calculado) (medido) ACVR2B_H7_28- 9 CAGTTCGTTCCATGTGATGATGTT 7959,74 7959,31 20 51 ACVR2B_H7_38- 10 CTACATGACACAGTTCGTTCCATG 7882,73 7882,07 21 61 ACVR2B_H7_66- 11 TATGAGAGGCCTCGTGACATCGTC 7963,76 7964,32 22 89 ACVR2B_H7_76- 12 CTCATGCAGGTATGAGAGGCCTCG 7988,77 7988,06 23 99 ACVR2B_H7_86- 13 AGGGCACATCCTCATGCAGGTATG 7972,77 7972,02 24 109 ACVR2B_H8_19- 14 GTGAGGTCGCTCTTCAGCAATACA 7947,75 7947,21 25 42 ACVR2B_H8_21- 15 CTGTGAGGTCGCTCTTCAGCAATA 7938,74 7938,21 26 44 ACVR2B_H8_26- 16 CACGGCTGTGAGGTCGCTCTTCAG 7955,74 7955,23 27 49 17 ACVR2B_H8_45- CCAAGCCAAAGTCAGCCAGCACGG 7920,77 7920,76 28
Peso Peso PMO Nome de Sequência de nucleotídeo (5′ SEQ ID molecular molecular nº Sequência a 3′) NO: (calculado) (medido) 68 ACVR2B_H8_73- 18 GGAGGTTTCCCTGGCTCAAATCGA 7963,76 7963,38 29 96 ACVR2B_H8_78- 19 CCCCTGGAGGTTTCCCTGGCTCAA 7875,73 7875,76 30 101 ACVR2B_H8_87- 20 CGTGGGTGTCCCCTGGAGGTTTCC 7962,74 7962,81 31 110 ACVR2B_H8_93- 21 CCTGTCCGTGGGTGTCCCCTGGAG 7947,73 7947,60 32 116 ACVR2B_H9_56- 22 CAATGCGCAGGAAGGCATCTCTCT 7932,76 7933,08 33 79 ACVR2B_H9_66- 23 GCATACATGTCAATGCGCAGGAAG 8005,79 8005,48 34 89 ACVR2B_H10_-1- 24 CAGCATGTACTCATCCACGGGTCC 7868,74 7868,93 35 23 ACVR2B_H10_49- 25 CCTGCAGCTCCTCCAACGAAGGGT 7893,75 7893,29 36 72
Peso Peso PMO Nome de Sequência de nucleotídeo (5′ SEQ ID molecular molecular nº Sequência a 3′) NO: (calculado) (medido) ACVR2B_H6_16- 26 GCTGAAGATCTCCCGTTCACTCTG 7874,73 7874,32 43 39 ACVR2B_H6_46- 27 TAGCAGGTTCTCGTGCTTCATGCC 7905,72 7906,34 44 69 ACVR2B_H7_96- 28 CCACGGCACCAGGGCACATCCTCA 7847,75 7848,04 45 119 ACVR2B_H8_34- 29 TCAGCCAGCACGGCTGTGAGGTCG 7989,76 7989,50 46 57 ACVR2B_H8_38- 30 AAAGTCAGCCAGCACGGCTGTGAG 8006,78 8007,05 47 61 ACVR2B_H8_30- 31 CCAGCACGGCTGTGAGGTCGCTCT 7940,74 7940,81 48 53 ACVR2B_H8_69- 32 GTTTCCCTGGCTCAAATCGAACAG 7907,74 7907,61 49 92 ACVR2B_H8_12- 33 CGCTCTTCAGCAATACATTCTTAC 7817,71 7817,90 50 35 34 ACVR2B_H8_16- AGGTCGCTCTTCAGCAATACATTC 7882,73 7882,72 51
Peso Peso PMO Nome de Sequência de nucleotídeo (5′ SEQ ID molecular molecular nº Sequência a 3′) NO: (calculado) (medido) 39 ACVR2B_H8_42- 35 AGCCAAAGTCAGCCAGCACGGCTG 7951,77 7951,66 52 65 ACVR2B_H8_24- 36 CGGCTGTGAGGTCGCTCTTCAGCA 7955,74 7955,10 53 47 ACVR2B_H8_46- 37 GCCAAGCCAAAGTCAGCCAGCACG 7920,77 7920,54 54 69 ACVR2B_H8_53- 38 TCGAACAGCCAAGCCAAAGTCAGC 7919,77 7919,50 55 76 ACVR2B_H8_82- 39 GTGTCCCCTGGAGGTTTCCCTGGC 7922,72 7922,98 56 105 ACVR2B_H8_45- 40 CAAGCCAAAGTCAGCCAGCACGG 7605,66 7605,47 57 67 ACVR2B_H8_97- 41 GTTACCTGTCCGTGGGTGTCCCCT 7897,71 7897,41 58 120 ACVR2B_H8_61- 42 GGCTCAAATCGAACAGCCAAGCCA 7919,77 7919,58 59 84
Peso Peso PMO Nome de Sequência de nucleotídeo (5′ SEQ ID molecular molecular nº Sequência a 3′) NO: (calculado) (medido) ACVR2B_H8_89- 43 TCCGTGGGTGTCCCCTGGAGGTTT 7977,73 7977,47 60 112 ACVR2B_H8_15- 44 GGTCGCTCTTCAGCAATACATTCT 7873,72 7873,52 61 38 ACVR2B_H8_-5- 45 ATTCTTACTTTTAAAGTCCCTGTG 7878,72 7878,48 62 19 ACVR2B_H8_-2- 46 TACATTCTTACTTTTAAAGTCCCT 7822,70 7822,60 63 22 ACVR2B_H8_18- 47 TGAGGTCGCTCTTCAGCAATACAT 7922,74 7922,70 64 41 ACVR2B_H8_14- 48 GTCGCTCTTCAGCAATACATTCTT 7848,71 7848,54 65 37 ACVR2B_H8_22- 49 GCTGTGAGGTCGCTCTTCAGCAAT 7954,74 7954,19 66 45 ACVR2B_H8_23- 50 GGCTGTGAGGTCGCTCTTCAGCAA 7979,75 7979,16 67 46 51 ACVR2B_H8_13- TCGCTCTTCAGCAATACATTCTTA 7832,71 7832,30 68
Peso Peso PMO Nome de Sequência de nucleotídeo (5′ SEQ ID molecular molecular nº Sequência a 3′) NO: (calculado) (medido) 36 ACVR2B_H8_20- 52 TGTGAGGTCGCTCTTCAGCAATAC 7938,74 7938,70 69 43 ACVR2B_H8_17- 53 GAGGTCGCTCTTCAGCAATACATT 7922,74 7922,78 70 40
[Exemplo 1]
[0171] Ácido 4-{[(2S,6R)-6-(5-metil-2,4-dioxopirimidin- 1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico carregado em resina de aminopoliestireno (Exemplo de Referência 1) ou 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oxopirimidin- 1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico ácido carregado em resina de aminopoliestireno (Exemplo de Referência 2) ou ácido 4-{[(2S,6R)-6-(6-benzamidopurin-9- il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico carregado em resina de aminopoliestireno (Exemplo de Referência 3) ou ácido 4-{{(2S,6R)-6-{6-(2-cianoetoxi)-2-[(2- fenoxiacetil)amino]purin-9-il}-4-tritilmorfolin-2- il}metoxi}-4-oxobutanoico carregado em resina de aminopoliestireno (Exemplo de Referência 4), cada um correspondendo à base 5′-terminal, foi preenchido em uma quantidade de 0,1 g em um vaso de reação equipado com um filtro para iniciar os seguintes ciclos de síntese com o uso de um sintetizador de peptídeo (FOCUS). Para gerar a sequência de nucleotídeo de cada composto indicado na Tabela 1, um composto de monômero de morfolino desejado foi adicionado em cada ciclo de acoplamento (consulte a Tabela 2 abaixo).
[0172] [Tabela 2] Volume Tempo Número de Etapa Reagente (ml/execução) (min/execução) execuções Solução de 1 1,8 a 3 0,1 a 2 3 a 8 desbloqueio Solução de 3 2 2 a 10 1 neutralização 3 Diclorometano 2 a 10 - 5
Volume Tempo Número de Etapa Reagente (ml/execução) (min/execução) execuções Solução de 1 4 1,8 a 3 - Ativador Solução de 5 1 a 1,5 - 1 monômero Solução de 6 0,9 a 1,4 - 1 Ativador Reação de acoplamento com 7 os reagentes 120 a 180 carregados nas Etapas 5 e 6 8 Diclorometano 2 a 10 - 5 Solução de 9 2 a 3 2 2 capeamento 10 Diclorometano 2 a 10 - 5
[0173] Deve-se observar que a solução de desbloqueio usada foi preparada dissolvendo-se uma mistura de ácido trifluoroacético (2 equivalentes) e trietilamina (1 equivalente) a uma concentração de 3 % (p/v) em uma solução de diclorometano que contém 1 % (v/v) de etanol e 10 % (v/v) de 2,2,2-trifluoroetanol. A solução neutralizante usada foi preparada dissolvendo-se N,N-di- isopropiletilamina a uma concentração de 5 % (v/v) em uma solução de diclorometano que contém 25 % (v/v) de 2- propanol. A solução de ativador usada foi uma solução de 1,3-dimetil-2-imidazolidinona que contém 20 % (v/v) de N,N- di-isopropiletilamina. A solução de monômero usada foi preparada dissolvendo-se um composto de monômero de morfolino a uma concentração de 0,20 M em tetra-hidrofurano. A solução de capeamento usada foi preparada dissolvendo-se anidrido acético a 10 % (v/v) e 2,6-lutidina a 15 % (v/v) em diclorometano.
[0174] A resina de aminopoliestireno carregada com PMO sintetizado como acima foi coletada a partir do vaso de reação e seca a 30 C por 2 horas ou mais sob pressão reduzida. O PMO carregado seco na resina de aminopoliestireno foi carregado em um vaso de reação e 5 ml de 28 % de amônia-etanol aquoso (1/3) foram adicionados a esse, seguido por repouso a 55 C por 16 horas. A resina de aminopoliestireno foi separada por filtração e lavada com 3 ml de água-acetonitrila (1/1). Após o filtrado resultante ter sido misturado com etanol (3 ml) e éter dietílico (35 ml), a mistura foi centrifugada e, então, decantada para remover o tensoativo, e o resíduo foi seco sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi dissolvido em 10 ml de um solvente misto que contém 20 mM de acetato de amônio aquoso e acetonitrila (4/1), e, então, purificado por HPLC de fase reversa. As condições usadas são como indicado na Tabela 3 abaixo.
[0175] [Tabela 3] Coluna XBridge 5 m C18 (Waters, 19 50 mm, 1 CV = 14 ml) Taxa de fluxo 10 ml/minuto Temperatura de temperatura ambiente coluna Solução A 20 mM de acetato de amônio aquoso Solução B CH3CN
Gradiente (B) concentração de 20 %  50 %/10 de CV CV: volume de coluna
[0176] As frações foram, cada uma, analisadas para coletar o produto desejado. A solução resultante foi misturada com 0,1 M de ácido clorídrico aquoso (4 ml) e permitido ficar em repouso por 2 horas. Após a reação, 1 M de hidróxido de sódio aquoso (0,4 ml) foi adicionado para neutralizar a mistura, que foi, então, filtrada através de um filtro de membrana (0,22 m).
[0177] A solução aquosa resultante que contém o produto desejado foi tornada alcalina com 1 M de hidróxido de sódio aquoso (0,4 ml) e purificada através de uma coluna de resina de troca de ânions. As condições usadas são como indicado na Tabela 4 abaixo.
[0178] [Tabela 4] Coluna Fonte 15Q (GE Healthcare, 16  97 mm, 1 CV = 19,5 ml) Taxa de fluxo 10 ml/minuto Temperatura de temperatura ambiente coluna Solução A 10 mM de hidróxido de sódio aquoso Solução B 10 mM de hidróxido de sódio aquoso, 1 M de cloreto de sódio aquoso Gradiente (B) concentração de 5 % 50 %/20 CV
[0179] As frações foram, cada uma, analisadas (por HPLC) para obter o produto desejado como uma solução aquosa. A solução aquosa resultante foi neutralizada com 0,1 M de tampão de fosfato (pH 6,0) e, então, dessalinizada por HPLC de fase reversa sob as condições mostradas na Tabela 5 abaixo.
[0180] [Tabela 5] Coluna YMC GEL C4 HG 10 m (YMC, 10  35 mm, 1 CV = 2,7 ml) Taxa de fluxo 10 ml/minuto Temperatura temperatura ambiente de coluna Solução A água Solução B CH3CN Gradiente (B) concentração de 0 % 50 %/10 CV
[0181] O produto desejado foi coletado e concentrado sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi dissolvido em água e seco por congelamento para obter o composto desejado como um sólido floculento branco. Os valores calculados e medidos de ESI-TOF-MS são mostrados na Tabela 1. [Exemplo 2] Síntese de conjugado de peptídeo-oligômero antissenso (conjugado de PMO-peptídeo)
[0182] O PMO (PMO nº 15, 18,1 mg, 1,0 eq.) foi dissolvido em DMSO (284,0 µl) e DMF (17,5 µl). À solução foi adicionada uma mistura de ácido 4-maleimidobutírico (1,7 mg, 4,0 eq.) e WSCI·HCl (2,2 mg, 5,0 eq.) em DMSO
(23,2 µl) e DMF (22,2 µl). A mistura de reação foi agitada a 45 °C por 6 h. Após a reação quase ter sido concluída, CH2Cl2 (13,2 ml) foi adicionado à mistura para gerar um precipitado. O precipitado foi coletado por centrifugação, seguido por secagem a vácuo. O precipitado seco foi dissolvido novamente em DMSO (175,0 µl) e H2O (52,7 µl). À solução resultante foi adicionado hLIMK (Ac-KKRTLRKNDRKKRC- CONH2, 5,1 mg, 1,2 eq.) (SEQ ID NO: 112) e a mistura foi agitada a 45 °C por 30 min. Após a confirmação da conclusão da reação por análise de HPLC, a reação foi terminada pela adição de solução de acetonitrila (10 % em H2O; 400 µl). A solução foi diluída com água (aproximadamente 40 ml) e o produto desejado foi purificado por cromatografia de troca de cátion. As condições usadas são mostradas na Tabela 6 abaixo.
[0183] Tabela 6 Coluna Fonte 15S (GE Healthcare, 16  50 mm, 1 CV = 10 ml) Taxa de fluxo 10 ml/min Temperatura temperatura ambiente de coluna Solução A 25 mM de KH2PO4 com 25 % de MeCN (pH 3,5) Solução B 25 mM de KH2PO4 com 25 % de MeCN (pH 3,5) e 1,5 M de KCl Gradiente (B) concentração de 0 %  90 %/30 de CV CV: volume de coluna
[0184] As frações foram analisadas por HPLC e as frações adequadas foram coletadas. A solução aquosa foi diluída sete vezes com água e, então, dessalinizada por HPLC de fase reversa sob as condições mostradas na Tabela 7 abaixo.
[0185] Tabela 7 Coluna AMBERCHROM_CG300m_10 mm  30 mm (1 CV = 2,4 ml) Taxa de fluxo 5 ml/min Temperatura temperatura ambiente de coluna Solução A água Solução B MeOH Gradiente (B) concentração de 0 %  90 %/30 de CV
[0186] O produto desejado foi coletado e concentrado sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi dissolvido em água e seco por congelamento para gerar o composto desejado (denominado PPMO nº 1) como um sólido floculento branco (7,7 mg, 34,0 % de rendimentos).
[0187] O peso molecular do composto obtido (PPMO nº 1) foi determinando usando ESI-TOF-MS (calculado: 9973,92, observado: 9973,54). [Exemplo 3] Avaliação da atividade de salto de oligômeros antissenso Transfecção de PMO nas células
[0188] Em 3 × 105 células RD (linhagem celular de rabdomiossarcoma humano), os oligômeros antissenso mostrados na Tabela 1 foram, cada um, transfectados a 10 ou 30 µM usando Nucleofector II (Lonza) e um Kit Nucleofector de Linhagem Celular Amaxa. O programa de pulso usado foi T-
030. Após a transfecção, as células foram cultivadas nos poços de placas de 6 poços sob 5 % de CO2 em Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich) que contém
10 % de soro bovino fetal (FBS) (Sigma-Aldrich). Três dias após a transfecção, o meio de cultura foi substituído com DMEM livre de soro que contém 0,4 ng/ml de miostatina recombinante (R&D Systems) e as células foram cultivadas por mais 2 horas a 37 C sob CO2 a 5 %. Transfecção de oligonucleotídeos de fosforotioato (PS) nas células
[0189] No dia antes da transfecção, as células de RD foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 3 × 104 células/poço e cultivadas sob CO2 a 5 % em DMEM (Sigma- Aldrich) que contém FBS a 10 % (Sigma-Aldrich). No dia seguinte, os oligômeros antissenso de oligonucleotídeos de fosforotioato (PS) de 2′-O-metila (JbioS) mostrados na Tabela 8 foram, cada um, transfectados a 10 ou 30 nM usando Reagente de Transfecção de Lipofectamina 3000 (Thermo Scientific). As células foram cultivadas por três dias após a transfecção.
[Tabela 8] Peso Peso PS Nome de Sequência de nucleotídeo (5′ SEQ ID molecular molecular nº Sequência a 3′) NO: (calculado) (medido) 1 ACVR2B_054 CAGCUGCAGUGGCUUCAGGCCCAC 8347 8352,5791 71 2 ACVR2B_055 UGAUCUCCAGCAGCUGCAGUGGCU 8349 8355,2591 72 3 ACVR2B_056 CCCCGAGCCUUGAUCUCCAGCAGC 8267 8270,6786 73 4 ACVR2B_060 GUCAUUCAUGAGCUGGGCCUUCCA 8310 8314,0250 74 5 ACVR2B_061 CAGCUACAAAGUCAUUCAUGAGCU 8325 8327,7387 75 6 ACVR2B_062 AAGAUCUUGACAGCUACAAAGUCA 8372 8376,2644 76 7 ACVR2B_063 CUGGAGUGGGAAGAUCUUGACAGC 8476 8480,5301 77 8 ACVR2B_006 AACUGUAGCAGGUUCUCGUGCUUC 8311 8313,9651 78 9 ACVR2B_014 CUUGAGGUAAUCCGUGAGGGAGCC 8452 8455,6050 79 10 ACVR2B_015 GAUGUUCCCCUUGAGGUAAUCCGU 8311 8317,1643 80 11 ACVR2B_016 CCAUGUGAUGAUGUUCCCCUUGAG 8311 8313,8275 81 12 ACVR2B_017 CAGUUCGUUCCAUGUGAUGAUGUU 8313 8315,9555 82 13 ACVR2B_018 UACAUGACACAGUUCGUUCCAUGU 8279 8281,5703 83 14 ACVR2B_019 CGUCUCUGCUACAUGACACAGUUC 8254 8258,0108 84 15 ACVR2B_020 CUCGUGACAUCGUCUCUGCUACAU 8231 8235,1182 85 16 ACVR2B_021 UAUGAGAGGCCUCGUGACAUCGUC 8373 8375,2037 86
Peso Peso PS Nome de Sequência de nucleotídeo (5′ SEQ ID molecular molecular nº Sequência a 3′) NO: (calculado) (medido) 17 ACVR2B_022 CUCAUGCAGGUAUGAGAGGCCUCG 8412 8416,8200 87 18 ACVR2B_023 AGGGCACAUCCUCAUGCAGGUAUG 8396 8399,2399 88 19 ACVR2B_024 CCACGGCACCAGGGCACAUCCUCA 8313 8318,7891 89 20 ACVR2B_030 GUGAGGUCGCUCUUCAGCAAUACA 8357 8361,8757 90 21 ACVR2B_031 AGCACGGCUGUGAGGUCGCUCUUC 8365 8369,4975 91 22 ACVR2B_032 AAGUCAGCCAGCACGGCUGUGAGG 8474 8475,5442 92 23 ACVR2B_033 GCCAAGCCAAAGUCAGCCAGCACG 8400 8402,1792 93 24 ACVR2B_034 AAUCGAACAGCCAAGCCAAAGUCA 8393 8397,0875 94 25 ACVR2B_035 CCUGGCUCAAAUCGAACAGCCAAG 8362 8366,7717 95 26 ACVR2B_036 GGAGGUUUCCCUGGCUCAAAUCGA 8373 8375,6335 96 27 ACVR2B_037 GUGUCCCCUGGAGGUUUCCCUGGC 8318 8322,6302 97 28 ACVR2B_038 CUGUCCGUGGGUGUCCCCUGGAGG 8397 8399,1436 98 29 ACVR2B_064 AGCCAUGUACCGUCUCGUGCCUAC 8269 8273,6442 99 30 ACVR2B_065 CACCUCAGGAGCCAUGUACCGUCU 8292 8297,9971 100 31 ACVR2B_068 UCUCUGGAAGUUGAUGGCUCCCUC 8287 8287,8070 101 32 ACVR2B_069 GAAGGCAUCUCUCUGGAAGUUGAU 8398 8400,5961 102 33 ACVR2B_070 CAAUGCGCAGGAAGGCAUCUCUCU 8356 8360,2476 103
Peso Peso PS Nome de Sequência de nucleotídeo (5′ SEQ ID molecular molecular nº Sequência a 3′) NO: (calculado) (medido) 34 ACVR2B_071 GCAUACAUGUCAAUGCGCAGGAAG 8443 8447,4672 104 35 ACVR2B_073 CCCACAGCACCAACCCCAUGGCAU 8257 8262,1851 105 36 ACVR2B_074 GACACAAGCUCCCACAGCACCAAC 8304 8308,9227 106 37 ACVR2B_075 CUUGCAGCGAGACACAAGCUCCCA 8338 8342,7494 107 38 ACVR2B_076 CGUCUGCAGCCUUGCAGCGAGACA 8371 8376,4996 108 39 ACVR2B_039 GCAGCAUGUACUCAUCCACGGGUC 8332 8336,2184 109 40 ACVR2B_043 UCCAACGAAGGGUGCUGGCCAAUC 8395 8401,4766 110 41 ACVR2B_044 CUGCAGCUCCUCCAACGAAGGGUG 8371 8377,0700 111
Entrega Gimnótica de um conjugado de PMO-peptídeo nas células
[0190] No dia antes da transfecção, as células de RD foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 4 × 104 células/poço e cultivadas sob CO2 a 5 % em DMEM (Sigma- Aldrich) que contém FBS a 10 % (Sigma-Aldrich). No dia seguinte, o conjugado de peptídeo-oligômero antissenso (conjugado de PMO-peptídeo) sintetizado no Exemplo 2 foi adicionado ao meio. As células foram cultivadas por três dias após a adição do conjugado de PMO-peptídeo. Extração de RNA
[0191] As células foram lavadas uma vez com PBS (Nissui Pharmaceutical), então, 350 µl de Tampão RLT (Qiagen) que contém 1 % de 2-mercaptoetanol (Nacalai Tesque) foram adicionados às células, e as células foram lisadas permitindo-se que permaneçam à temperatura ambiente por alguns minutos. O lisado celular foi coletado em um homogeneizador QIAshredder (Qiagen) e centrifugado a 20.400 × g por 2 minutos para preparar um homogenato. O RNA total foi extraído de acordo com as instruções de fabricação de um Mini-Kit RNeasy (Qiagen). A concentração do RNA total extraído foi medida com um espectrofotômetro NanoDrop ND- 1000 (Thermo Fisher Scientific). Medição de eficácia de salto
[0192] O RNA total extraído (150 ng) foi usado como um modelo para realizar RT-PCR de uma etapa com um Kit de RT- PCR de Uma Etapa QIAGEN (Qiagen). Uma solução de reação foi preparada de acordo com o protocolo que acompanha o kit. O ciclador térmico usado foi ciclador térmico de PCR TaKaRa Dice Touch (Takara Bio). O programa de RT-PCR usado é como mostrado abaixo. 50 C por 30 min: reação de transcrição reversa 95 C por 15 min: ativação de polimerase, inativação de transcriptase reversa [94 C por 30 segundos; 62 C por 30 segundos; 72 C por 50 segundos] × 32 ciclos: PCR 72 C por 7 min: reação de alongamento final
[0193] As sequências de nucleotídeo dos iniciadores diretos e reversos usados para RT-PCR são como mostrado abaixo. Para detecção de salto de éxon 5: Iniciador Direto: 5′-TGCTACGATAGGCAGGAGTG-3′ (SEQ ID NO:37) Iniciador Reverso: 5′-AGCAGGTTCTCGTGCTTCAT-3′ (SEQ ID NO:38) Para detecção de salto de éxon 6, 7 ou 8: Iniciador Direto: 5′-CATGTGGACATCCATGAGGA-3′ (SEQ ID NO:39) Iniciador Reverso: 5′-GAGACACAAGCTCCCACAGC-3′ (SEQ ID NO:40) Para detecção de salto de éxon 9 ou 10: Iniciador Direto: 5′-TCTATTGCCCACAGGGACTT-3′ (SEQ ID NO:41) Iniciador Reverso: 5′-GAGCCTCTGCATCATGGTC-3′ (SEQ ID NO:42)
[0194] A solução de reação de PCR acima (1 µl) foi analisada usando um Bioanalisador (Agilent). A molaridade de polinucleotídeo “A” do PCR amplicon com salto de éxon, isto é, ACVR2B truncado cDNA, e a molaridade e polinucleotídeo “B” do amplicon de PCR do tipo selvagem, isto é, cDNA de ACVR2B do tipo selvagem, foram medidos. Com base nesses valores medidos de “A” e “B”, a eficácia de salto foi determinada de acordo com a seguinte equação.
Eficiência de salto (%) = A/(A + B) × 100 Os resultados obtidos são mostrados nas Figuras 1a–d. As Figuras 1a–d indicaram que o oligômero antissenso e o conjugado de peptídeo-oligômero antissenso da presente invenção causam o salto de éxon. [Exemplo 4] Medição de atividade negativa de dominante
[0195] 8 × 103 células de HEK-293 (linhagem celular renal embrionária humano) foram semeadas em placas brancas com 96 poços (Thermo Fisher Scientific) e cultivadas a 37 C sob CO2 a 5 % em Meio Mínimo Essencial de Eagle (Sigma- Aldrich) que contém FBS a 10 %. No dia seguinte, 10 ng de pBApo-CMV (Takara Bio) portando DNA que codifica cada produto de salto de éxon (éxon 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) (Eurofins Genomics) e 14 ng de DNA repórter de luciferase (Kit de Ensaio Repórter de SMAD Cignal, Qiagen) foram cotransfectados nas células usando Lipofectamina LTX (Thermo Fisher Scientific). Dois dias após a transfecção, a miostatina recombinante (R&D Systems) diluída em Meio Mínimo Essencial de Eagle livre de soro foi adicionada ao meio a uma concentração final de 10 ng/ml. Após 24 horas adicionais de cultura, o DNA repórter de luciferase foi realizado usando Sistema de Ensaio de Luciferase Dual-Glo (Promega), de acordo com as instruções de fabricação. A atividade de luciferase foi medida usando um luminômetro, Tecan infinite F200 PRO (Tecan).
[0196] Os resultados obtidos são mostrados na Figura 2. Como mostrado na Figura 2, a atividade de luciferase induzida pela adição de miostatina foi quase completamente suprimida nas células transfectadas com DNA que codifica cada produto de salto de éxon. A Figura 2 indicou que qualquer salto de éxon (éxon 5, 6, 7, 8, 9 e 10) pode eficazmente suprimir o sinal de miostatina. [Exemplo 5] Medição de sinal de miostatina
[0197] O RNA total extraído (360 ng) foi usado como um modelo para realizar reação de RT com um Kit de Transcrição Reversa de cDNA de Alta Capacidade (Thermo Fisher Scientific). A preparação da solução de reação e as condições térmicas seguiram as instruções de fabricação do kit. O ciclador térmico usado foi ciclador térmico de PCR TaKaRa Dice Touch (Takara Bio). A solução da reação de RT (0,6 µl) foi usada como um modelo para realizar qPCR com Master Mix de Expressão de Gene TaqMan (Thermo Fisher Scientific) e Ensaios de Expressão de Gene TaqMan para SMAD7 e PPIB (Thermo Fisher Scientific). O instrumento usado para qPCR foi QuantStudio 6 Flex Systems (Thermo Fisher Scientific).
[0198] Os resultados obtidos são mostrados na Figura 3. Como mostrado na Figura 3, a expressão de gene SMAD7 aumentou em 6 vezes pelo estímulo com miostatina. Os oligômeros antissenso da presente invenção suprimiram a expressão aumentada de gene SMAD7. Esses oligômeros antissenso não têm homologia para o gene SMAD7 na análise de BLAST. Portanto, essas atividades inibitórias de expressão de gene SMAD7 são específicas para atividade inibitória de sinal de miostatina. IDENTIFICADORES DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1
GACCCUGGGCCUCCACCACCAUCCCCUCUGGUGGGCCUGAAGCCACUGCAGCUGCUGGA GAUCAAGGCUCGGGGGCGCUUUGGCUGUGUCUGGAAGGCCCAGCUCAUGAAUGACUUUG
UAGCUGUCAAGAUCUUCCCACUCCAG SEQ ID NO: 2
GACAAGCAGUCGUGGCAGAGUGAACGGGAGAUCUUCAGCACACCUGGCAUGAAGCACGA GAACCUGCUACAGUUCAUUGCUGCCGAGAAGCGAGGCUCCAACCUCGAAGUAGAGCUGU
GGCUCAUCACGGCCUUCCAUGACAAG SEQ ID NO: 3
GGCUCCCUCACGGAUUACCUCAAGGGGAACAUCAUCACAUGGAACGAACUGUGUCAUGU AGCAGAGACGAUGUCACGAGGCCUCUCAUACCUGCAUGAGGAUGUGCCCUGGUGCCGUG
GCGAGGGCCACAAGCCGUCUAUUGCCCACAG SEQ ID NO: 4
GGACUUUAAAAGUAAGAAUGUAUUGCUGAAGAGCGACCUCACAGCCGUGCUGGCUGACU
UUGGCUUGGCUGUUCGAUUUGAGCCAGGGAAACCUCCAGGGGACACCCACGGACAG SEQ ID NO: 5
GUAGGCACGAGACGGUACAUGGCUCCUGAGGUGCUCGAGGGAGCCAUCAACUUCCAGAG AGAUGCCUUCCUGCGCAUUGACAUGUAUGCCAUGGGGUUGGUGCUGUGGGAGCUUGUGU
CUCGCUGCAAGGCUGCAGACG SEQ ID NO: 6
GACCCGUGGAUGAGUACAUGCUGCCCUUUGAGGAAGAGAUUGGCCAGCACCCUUCGUUG GAGGAGCUGCAGGAGGUGGUGGUGCACAAGAAGAUGAGGCCCACCAUUAAAGAUCACUG
GUUGAAACACCCG SEQ ID NO: 7 (éxon 11 que inclui códon de parada de UAA terminal)
GGCCUGGCCCAGCUUUGUGUGACCAUCGAGGAGUGCUGGGACCAUGAUGCAGAGGCUCG CUUGUCCGCGGGCUGUGUGGAGGAGCGGGUGUCCCUGAUUCGGAGGUCGGUCAACGGCA CUACCUCGGACUGUCUCGUUUCCCUGGUGACCUCUGUCACCAAUGUGGACCUGCCCCCU
AAAGAGUCAAGCAUCUAA SEQ ID NO: 8:
GGCUCGGCUCCGUGGCCGCCGCUCAGGAGCCAUUUUGGACUCGGUUCAGCUCCCCUCCC CCCCACCCCUCCCCCCGUUCAUGGCCCCUCCGGACUCGGCCCCUGCGCCCGGGGCCCGG GCCCAGCCCCGCCGCGCUAUGCCUGAGUCGGGCGCGCCCCGGCCCGUGCCCCGCCGCCG CCCCCCGGCCCCCGCGUCGCCCCGGAGCCCGGGCCGCAGCCUGCGCCGCCCGCAGCGGC CCUGAGCCCGGCCCCGCCGACCGGCCCUUGGAGCCCGAACGCUGCUCGGGGACGAAGGC GCAGGAAGCGCGCAGGGAACGAGACCGAAGGAAGGAGCGGGAAGGAGAGCGCAGCCGCC GCCUGGCCCUGCGCGCCCCGGGAGCGCCGUGCGGCCCUGCCCGCGGGCUCCGGGUGUGC GCGGGGCGGCGCCGCGGAACAUGACGGCGCCCUGGGUGGCCCUCGCCCUCCUCUGGGGA UCGCUGUGCGCCGGCUCUGGGCGUGGGGAGGCUGAGACACGGGAGUGCAUCUACUACAA CGCCAACUGGGAGCUGGAGCGCACCAACCAGAGCGGCCUGGAGCGCUGCGAAGGCGAGC AGGACAAGCGGCUGCACUGCUACGCCUCCUGGCGCAACAGCUCUGGCACCAUCGAGCUC GUGAAGAAGGGCUGCUGGCUAGAUGACUUCAACUGCUACGAUAGGCAGGAGUGUGUGGC CACUGAGGAGAACCCCCAGGUGUACUUCUGCUGCUGUGAAGGCAACUUCUGCAACGAAC GCUUCACUCAUUUGCCAGAGGCUGGGGGCCCGGAAGUCACGUACGAGCCACCCCCGACA GCCCCCACCCUGCUCACGGUGCUGGCCUACUCACUGCUGCCCAUCGGGGGCCUUUCCCU CAUCGUCCUGCUGGCCUUUUGGAUGUACCGGCAUCGCAAGCCCCCCUACGGUCAUGUGG ACAUCCAUGAGGACCCUGGGCCUCCACCACCAUCCCCUCUGGUGGGCCUGAAGCCACUG CAGCUGCUGGAGAUCAAGGCUCGGGGGCGCUUUGGCUGUGUCUGGAAGGCCCAGCUCAU GAAUGACUUUGUAGCUGUCAAGAUCUUCCCACUCCAGGACAAGCAGUCGUGGCAGAGUG AACGGGAGAUCUUCAGCACACCUGGCAUGAAGCACGAGAACCUGCUACAGUUCAUUGCU GCCGAGAAGCGAGGCUCCAACCUCGAAGUAGAGCUGUGGCUCAUCACGGCCUUCCAUGA CAAGGGCUCCCUCACGGAUUACCUCAAGGGGAACAUCAUCACAUGGAACGAACUGUGUC AUGUAGCAGAGACGAUGUCACGAGGCCUCUCAUACCUGCAUGAGGAUGUGCCCUGGUGC CGUGGCGAGGGCCACAAGCCGUCUAUUGCCCACAGGGACUUUAAAAGUAAGAAUGUAUU GCUGAAGAGCGACCUCACAGCCGUGCUGGCUGACUUUGGCUUGGCUGUUCGAUUUGAGC CAGGGAAACCUCCAGGGGACACCCACGGACAGGUAGGCACGAGACGGUACAUGGCUCCU GAGGUGCUCGAGGGAGCCAUCAACUUCCAGAGAGAUGCCUUCCUGCGCAUUGACAUGUA UGCCAUGGGGUUGGUGCUGUGGGAGCUUGUGUCUCGCUGCAAGGCUGCAGACGGACCCG UGGAUGAGUACAUGCUGCCCUUUGAGGAAGAGAUUGGCCAGCACCCUUCGUUGGAGGAG CUGCAGGAGGUGGUGGUGCACAAGAAGAUGAGGCCCACCAUUAAAGAUCACUGGUUGAA ACACCCGGGCCUGGCCCAGCUUUGUGUGACCAUCGAGGAGUGCUGGGACCAUGAUGCAG AGGCUCGCUUGUCCGCGGGCUGUGUGGAGGAGCGGGUGUCCCUGAUUCGGAGGUCGGUC AACGGCACUACCUCGGACUGUCUCGUUUCCCUGGUGACCUCUGUCACCAAUGUGGACCU GCCCCCUAAAGAGUCAAGCAUCUAAGCCCAGGACAUGAGUGUCUGUCCAGACUCAGUGG AUCUGAAGAAAAAAGGAAAAAAAGUUGUGUUUUGUUUUGGAAAUCCCAUAAAACCAACA AACACAUAAAAUGCAGCUGCUAUUUUACCUUGACUUUUUAUUAUUAUUAUUAUAAUUAU UAUAAUUAUUAUUAUUAAUAUUAUUUUUUGGAUUGGAUCAGUUUUUACCAGCAUAUUGC UCUACUGUAUCACAAACAGCGGACACGUCAGCAGGCGUUGAGGUGCUGAGCUGUGGAUG CAGAACCAGCGCCAUGCUGAAGAGCCUCAGCCACCUCCUGUCCUUUGGGAUUCGUUUUU CCCGCUUUCUCUUUGUUUGUCGUCUCAGAAUCUGUGACACAAAGAAACCCAUCUCCUGU CUUAGGAAACCUAAUGCUGCAAACUCUACCUAGAGGAACCUUUGAAGACUGUUACAUAA GAACAUACCUUCCUCAGAAGAGGAGUUUCCUCUGCCCUCUGCCCUUCUCCCCUGCCUCC CUCCCUCCCCUCCUUUUAUUUUGUUUUAGUGAGCUUAAGAAACAGCAGAUGUGUCUUUC ACGGAUCUAACGGGUGUUGUCCUGAUCGAGAAAAAAACUGGGAUGAGAAUGGUUUGGAC UGGAGUUGGAAGGGGAGGACGGUACUGGGGGUAGGGUUUGGAACAGAGCUACACUGGAC UCGGGCACAUUCGGAGCAGCAUCCUUUAGUAUGGAGGCUACUUCUCAGGUAACCAGGAA UUGAGGGGAAGGACCUUGUGGAGGCCGAGCAUUAACAGCAAGAGCGGGGUUUGGAGAAA GUCUGAGAUUGGGUGCAGCCCUGACUUACCUGCUGGCCCUGACCAGUUUCUUUUCACUA ACUUGGCCUUGGGCAUAGGAUGAAACAUUUUUUCUGCCCUAAUUUUAAAACUAGGUGAG GGUAGAAUCAUCACAGGUUAGGAAUACAUUCUUCAUAAGACACGAUGCUGUAAAUACCC UUAAUGGACGAAAAGUUGAAAUACUUUUGUUUCCUCUUGGAGCAGUUCAGGGAAAUGCC CACAGGGGAUUGUCCUGCACAGAUAGGGCAAGAGGAUUUCCUGGGUGGAGUCUGCCAAG GCCUGCCUCGCUGGGGACCCCAGAGUCCUGCACCUCUGGUUCCGCCCCAGGUGGUGACA UUACUGUCCCCGUUCUGUGGCUCGUGGACAAGACUUUCUCCAGACCCCUUAAAGUGGUA CAUAUUCUAAAAAACUGUUUUUCUAUUAUGCCAUAACCUUGCUCUAGUCAGUGAAUGUU CCUAAUGCUGCUGUUUCAACAUUUGAAUUCUUUUUAAUUUAUGAAACAUGCUAAAUUUU UUUUUUCAAACAAAACACACACAUCCACAUAUACACAUGCUUCGCUAUGUGGCUUCCAA GGUUUAAAUUUUGAAAAGUAAAAGAAUUAAAACUUCACGACCACAGAUCACCUCAAACC AGAAAUACCUCAGAAUUUUCUACUUAUGUAAGGUUUAUUAUAUAUUUUGUUAGUUGUGU UGUCUUGUAGUAAGUAUAUUUUAAUGUAAGUUGGCUUUUGUGACAAGGAAGUUUAAAAG AAAUAGAGAAAAAGAAAAAAGUUUGCAUCUUCUAGGGAGUGCUACCAUUUUUGUUUGAU AACGCCCCCUUGUAAAUAAUUGUCAUCAACUGUAGGUUGGCUGUCUGGGCCAAGUCUGG GCAUUUAUCAGUCUUGUUUGUGAAGGCUUUUCCUUCUGGUUUCUUUAGAUCAUUUUAUU UAAAAACAGUGCAUCUCUUCAUCGUGAGGGUAGGCAAGGCGGGGGCCGUGGGGAGAGGU UGACCUGGGUGAGAACUGAAGAGGCCGCCUCCUCUUGGGUUGUUUGGAGCUUCACAUGU AAUUCACAUGUAACAUGUAACUUGAUCGGUCAGUGUUCAGAAUGACAAGUAACCCCGCU UAAACUUGGUAGAAGGAUGGCCCUUAGACCUGAAUGGGGUGAUUUUACUUGGGAUUUAA CUUCUUCAGCAAAUUAACAGCAACGUUGGAAGAGAUCUGUGGCGCCUCUGUGAAGCACA CCGUGACUCAGGCCAGUCUUUUAGUGCAGCGUGUCUGGGAGUGAAGGGUUUUGCCCUUG CUGGUCUUGGAGUCCACAGUGUGAGGGGCACUGCACAUGCCUGGGCAUCUACCUAGUGU GCUAUGUUCAGUGUCUGGGGCUUACUGCCCCGGGGUCCUUUCCUCUGGGUGUUGGGGCA CAGGGUGCUAUGGGAGGCCCAUUUGCUUCCCUCUCGGAGCUCAGUUUUUGCUUCAUGGG UCAAAAUGUGGGCUGGCCAAGUGGUUACAGGAACAGGGUUUCGGUAAGCUAUGUUGUCU UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAAUGGUUUGAUUUUGUGCUGUGGUAUUUUUUUU CCCUUAGAAUAAUUUUUAAUGGCAAAACAGGCCUUACAGCAGUUGCUUUUCUUUACCAU UUAUUUCUUUAAGAAGCUUUAAAAUAUUUAUUGAAAAGUGCCAUAUCUAAUUUCUUUAG CUUUCGCCUCAGGCAGUGCAGGCAUCUUUACUUUUCAUCCUCAGAAGAAACAAACGACU AACAAAUGUAGCAAAUUUACUGCAGGAAUAGUUAGGUCAUGAUACUACCUGAACACUAA ACCCCAGCCUCUUUGUUUGGUUUUAGUUCCUCUGGGUGGUUUUUCUUUUGUGUGCUGGC UUGAUUCUUGUGAGAAGUUUUGACCUGGCCAAGGGAGGGUUGAGCCAUGGUUCUGGUGU GGGACUUUGCGGUCAAGACACAGUACAGACAGGUCAGGCCUGCGUGCCUUUUCUCUGGG UGGCCUCCCCGUUAGGCCCACCGUACGCUCAGCCACUAUAGUGUCCCUGUGGGGCCUUG CCAUCAGAUUGUGUGUCAGGAGAUGGUACCUUUUUGGUGUGGCUGGGGAGGAGUGUGGU CCAUGCCAGUUCUUUGGGCUUCAGGCCACUCUUCCCCUCAUGCUGUGGUGUAAAGUGCA CCCAUCAGGUGGUAUAUCUGGUUCUGAUGGCAAGAAGAAGGUGGGGGAUCUCCUUAUAG GGCAUGGGUCUAGGAGCACAGAUGGGCCUUUUGCCCCGGGUAAAUGCUUGUCUGUUUGC UGUCAUGUGUUCUUUGAGGAGUGAGCCAUCUCGAGCCCUGCUUUGAAUUUACUGGGUCA UAGAGCCUCUGCCUGUGCUCUUUUCCAUAAUGACUUCAUGUGACAUGCACUUUUGGUGG GCUCAGAUAAUUGGUUUCUUUUUGUUUUUGACCUCAGGCUCUGUGGCAGACUGGGGAAA AUGGGGCCUGGCAUCAUUUUCCCUGUCAAUGGGAGGGGCUGUUCCAUGCAGGGUGGGAG GGGACCAAGUUAGCAGAGAGUAGCCAAGGAUCCUUGCUUCUUCCUUUCUAGUGUGCUGU CAUCCAAGCAGGCUCCUGGCUGUAGGGAUGGGCCUUGGGGAAGAAUCUUCUUUGAAAGC AUCUAUGAUAACUGAGAAGUCAUCCCUAGUUGGAGAAAUCCAGUAAUGAGCAGAAGGAG GAAGCAAGUGAGGACAGAGGCCAUUGUAUUACAGUGUCACGCAGAGGGCCCUCAAUGAU GGGGCAUUGGGGAAGGCUGUAGACAUAGUCAUCAGAACAUCCUGGCCUGGCAUAAGCUG GGUUUUCUCCUGGGACCAUUGGUCCUCAGCAGGAGUUCUUUGCAUGAGUUGCUCAGGGG CAAGGGCUGCAAGUGGGCUGUGCUUAGGAGAAAGUGACACCUGGCAGUGAGGGAAGAUG GUGAGCAUUAUUAGCCUUUGUUGUCCAGCAUGGCCUUCUUGUCCUGUCUGCUCUGGAGA GGAGCCUGUGGGACCAGUCCUGCCUGGGGAGGGCAUACCCACACGUGCCAGCUGAUUCU GACUCUGAAUACAUCAUGUCCGGACUUGGGGGUGUUUCUGCAGAAAAAGGAGGUUGUUU UUCAGCCUUGAACAUCUUCAGGAGGAUAGAGACUCUUGCUCACAUAUUCUUAGCAAAGG GAAGGGUCUCUCAUCUCCAGGCCACAGAGAUAGUUCUUCCAUUGCCCUAAGAGGCUAGG CUAACCCUCUUGACAUAACUUAGACAGCAAAGCACUUCAUCCUGUAGUUGGGCUCUGUC ACCUUUCUCUUCAGUUGGCCACAUUCUCGUUUCCUCCAUCCUGCUAUGCUUUGUGUGCU CGGGCUGUGUGUGGGGUUUUUCCCUGGUGGAAGGAAGCCCAGCUGUGUAUUGAAUGUCC UUCAUGUGUUGUGUGUGGCUCAGAAAGCCUGUCACUUGGCCCCUGUGCUCUGAGCCGUG AGGGUGGGGAGGUGGCUGUUCCAUUAAAGUGGGAGUAUUGGAUGGCCCUCUUGAAACUA GAAUUUUGCCUUUUUUAGUAUGCAGUAUAAAGUUUCCAGCAUCUAUUGGUAACACAAAG AUUUGCUGGUUUUUAAAAUAAUACAGUAAGCAUAAGUAUGUAAGUUUUUAGAAUUGGUA CUAGAAGUUGGACAGCUAGUUAUUCUCGAGAACUUUAUUUCACUAGAAAAAUAUACUAA UUGGAAAGCAGUUUCCAGGAGUUAACUCAGUUUAAUUUUCAGUCUCAGUUAUUUUAGCC UGUUGAGUUUUUGAUGGCACACCUUUGGAGAGAUGGCCACGCCUGAUUCCCAUUUCAGG GGCAUCAGACCAUACCUUUUUAAGAAGCUCCGUGAAUCUAGUCAUCUACCCUUCAUCCU GGGCGAACAGCCAAAAAGAGAAGGGGACAAGGUGUCUUUUUCUCCUUCUCACUGGGGUG ACAUGAAUUCUUUUAGUUAAUGGCUGUUUGCAAAUUCUAAACUAAUGAAAUACUUAGCA GCUAACAUGUUCAAUCUAGUAAUGAUGAGUUUAAAUCUCAAUUGACAGUAAUGUUUUAG AUAAACAGGCCCAGUAAUUCAGUUGAUGAACUGUAUAUCUUCUCAGUCUAGAUUUGUAA AUGUUUAAUGAAUUCAGGGUUAUAAGCAUAGUUCUUUAAGUAAGAUUCCAGAUAGUUGA UUUGCAACCAGCAGUCUACCUAUGAAUGUAUCCCAAACCUUUAGAAGAUUGGAAAAGAU UUUUGAAAUAAUGAUUUAGUUUUGUAGGAAAAACACCCCCUUGAAAAUUAAUUCGGUUG ACCCAGUAACAUUUUUUAAAACAAUUGGUGGCUCCAAAAGGCCUGCCAACAAAGAAAAG UCCAAAUUAUCUAGUGGGACAUUUUGAAUGUUUUAUGUUUAUUUUGGGUCCACUGUAAA CUUUGGUUCAAAAAAGAAUUUGAAUUUAAAGAAUUUACCAUUAUUUAAAUUAUUACCAA GUUUUUACAUUUUCAUGAUGGUAUUUUCCAGGUAUGAAUGAAACAUGACUUUUUGAUUG UGGUACUUCCUGUAUCCCCUGUAGUGCCAAAACCAGUGAUACUUUAUUUGCUCCUAUGG CAGCUCAUAGAGGUAACCGAAGUGAUUUUUCCUCAGUAAUUGAAACACAUAUUCUCUAA AUGCCAAUGUGUGGUGAUGGGCCCUGCACUGCCUUCAUUUCUCUAGGGCAGUGUCUUUG GAUUGUCUAGGGCCUAGGUAAUUCUGAGAACUACUGUAAACCAACCACAGGGCACUAAA GCAAUGUACACACCACUCUUUGUGUGUAUGGAAGGGGUUAUAUAAACCUGGGCUAUGCU GGACAUCUACAGAAGAGUAUUACAUUCACUUGCAAAGUUUACAUUUUUGAGCUCACAGU UAUGAAAAAUAUGACCCACAAGUUUUUCAGGCAGGUGAGGAUGGGUCUUCUUGCAAAUG CAUGAGUUCUGUCUUGAGUCCUGGGAACUUCUCUGUUGGUUGAGUGUGGGCUCAUUCCC UGACUCUCCUAAUCAUGUUUGCGUCAGAAUGUUAGCAUUGUAAAUAAAAGAAUAGGUUG UAUAAUAGAUACACAACACUUGAAACUUUACUUUAAAAAAAUCGAUAGUUCUACAUAUA UAUUUAGUUAUAUCACUUGACAGAUUUCUUCUACACAGUGUGGAGAUUGUUUUAUACCA CAGAUUAUUUUUAUAAAGUUAGUGAAUUUGAAUGAUUUUGUAAUCAGAGCUAAUGAGCU UUACCUUUCAAGAGAAACGUACACUGGAGCAUGAGUGGUGUGGAACUUUUACUUAGUGU UUAUAUGGAUUCUUGUGAUACACUGGCAGACUGGAGUCAAUUUGCGGGUCUUUUUUGGC CAAAACUCCACUUGUGGUUGUGUAGGACAGUGAUAUUCAGCUCAGCUUCUUGUGGAUUG GGAGGAGAGAGGGCCUGCAAUGUGUUUUACAUUGGUGCUUCCUCCUGAGAUUUCUGUUG AACAAAGGGUUCUGAGGUCAAAAAUUAGUUUGUAAGCCUUUGCCAUAGGACAUAGUCAU GUGAGAGUGUUUGGGGGAACAGAAAUUGUAUAGGGGUGCCUAUUGGGGUGGGAUGGGAC UCGAAUAAGAUUCAGGUACAAAAACUUUGAAAUGAGAAUCUGGUGGUUUGAGUAAUCCA CCAGACUGAAUUAUCUAAGAUCACAUUAUCCAGGUUGGGGGGCAGAAUUACCCAGUUAA GUAAUUGUUCAGAAAAGUGGGGAGGGUGGCAUGUGGAUGCAGUGAUCCAAUUAAAUGGA GAGCUGCCAGGCACAUUUUGUCCUCUCUGGUCAGUGAGAAUGGUUGGGUUGGCUCGCUG CUUCAAUCUGUGGAAUCAGCCAGGAGCCCAGUGAGGAAGCUCAGAACCCCAGUAACAGC AGAGCAUCUUUCAGAUAGCUCCAGAGUUUUCCUGCUUUUCUGAGGAAGCUCAGCAUCAC UGCCACAAUACGGAAAGUGGUCUUCAUUUUAGCCUAUUUAUUUUUAGGCAGAGAGUGGA UGGUUAUUUGUGUGGGACUUUUGGUGGCGAUAUAUAAUGAAUAAUUAAGUUAAUUUCUG GUAUGCAUAAUGGCCAGUCCUGAGGCCCAGCUGAAGACCUGUCCCCCAGACCCUGCCCG CUGGCUUCAGGCUGCUGCUUCUAGACAGAGGUGCACUGGACGGGAUAGUUUUAUCAAGA GAAUCCCUAAUGUGUCAUUUUAAACCAGCUGUGCUUUUUAUUCAUUCUGGUUGAGCGUA UAGGUUUACACUUUACCCUUUUUAUACUUGGAAUAAAUUUAGUUCCAGCAGAUCUAGUA GCACUCCAGAAACCAACCCCAUCUGUUCCCCAUAAAAAGAACAUUUUCUCUGCUCUCCA GCCACGUGUCUUGGAAUGUAAUUCUGUUGUGCCUUUGUUUUUAUCACUCUCUUCGCCCC AAAAGCAACUGCUGUAAGCUUUUUUCUACUUGUCUUUUCUAGUCCCCAACCUCUACCUU UUUCCUUUUUCCCAGCCCUAAUUUCUGGAUGCACUUCUGUGAUCCAGGUAUUUUAAGAA CCAGUUACCUCAGACCUCAUGUUGAACAGUGUCGCCAUCUGGGUCCUCUUGAUACUGCA GACUUUUAACGUACACAUGCAGGAACCCUGCUGAGCGUGGGCACUUGUUUUAAAGCAAA ACUCUUCCCAAGGACUGAAGAAAGGGCUUCUGGCAAGCUCGUCAUGGCAUUGUGGUGGG AUGGGUCUAGAGUGUCAUCUGAAUGGUGCUUCCUGUGUUCCUCUUUGAAUUCUGCCAUU UUCAGUAUUCUUGUGUGUCUGAAUAGGCAAAGCGAUUUAAUUGGCUGGUCUUGCACGCA AAUUAGUUCCAAAGAUAAGCUCUUUGUAACACAUUUCCAGUCGCUAAUGCUCAAAUGUA GAACAUUCCUUUAAAUGGCAGGAUAAAAAACCCACUAUCCACCAUAGUGCAUUUUGGGA AGAUGUCUGUAGCAUAUGUUGCUGUGAAAUUAGGCCUUGUGGGAUAUGGCUGUUUGUCA UUUUGAUGUAUUUUAAAUAAAUAUAUAUAUUUUUUAAAGAGCCUUUUUUACCAGUUCAA AAAGUUUAAUUAACCAGCAGUCACCGCAUCUGAAUUUUUGUCUCUGGGGCAUAGAUGGC AGACCAAGAUUAAAAGUGGUAACUCAGCUAUACGAGCAUGGGCUACCUUCCUGGGCUCU CCUGCAGUCCUGUAGACCUGCUGUUCCGCAGACCAUGGGACACAAGGUCAGUGUGUUCC CAGUGAGGGUCCCAAGUCAGUCAUCUUAAGUGUUUGUUCUCUGCCCCAUUCAGUGGACU GUUGACUUCAGUCCCUGCAAGUGCUUUAGCCCGAGUGGGGUUUUCUCAGAGCACUGCCA CGAGUUAAGUGUGUGUUUAGCCAAAUAAUUUCUCCGUAAGGGAAAAAUGCAGUCACCCA AAUUUUACCAACAAUGACAGAGAUGAGAGUAGAAAAGAUUAGGCAACAUCUGAGUUUUA ACUUGAAAAGUGUCCAAGUCAUCAUGAAAGGCCGACUGGGAGCAAGUGAUUAUUAGAGA UUCUUCAGGAGACCUCAUCUGAAAAUGUUAAGACUGCCAGUGAGGGAAGGAAUUGUUAA AAUGCCAGCGGCUUUUUUUUCCUCUUUUUUUCUGUAAUUCUGUAAAAAUGCAGAGAAAG UUGAGUGGUACUUCAGAAUUGAGGGAGAGGGUUACCGCAGAGUAGAAAUAUAUUUCUAG AUUUCAGUUCCACACCACAAAUCCACAACAAUGCCAUUUUUCAACUGUACAAAAAUCUG CUUAUGAACUGGACAUGAUCUUAAUGGUAGUGUCAAAGGCCAAGUUUUUCACCUGUUAA UAUUUUUCCACAUUUGUCCUUGAAUCUGAAUAACUUUAUACAGUACUGUAAAUUUAACU UACAUCGAGUUUGUUGUCAAUUCUUAUGAAAAGAGCUUUCUGCAUGUAACACAUACGGU UAAAGAACACAGCAAAGGACAAAAUUUGCAGGAACAGUUUUGGAACCAACAGAAAAUGU CACCUUUUAUUUGCCAUCUUAUAUAUAUCUAUCAGUUUUACCAGCUACUUCUAAAUUUG UACAUUAUUUGUAAGGGAAAGAAGGAAAACCCUAAGACUUGUCUAACUUAGUGGAGAAU GUGUGUGUUGGGCUUAGGAUGGAUAGCUAAGUCUUAUUGAGCUGUGUUACCUAACUUGU AUAUAAAAAUUGUAAUUAAAAGUUUGGGUUCACCUGUUUCUCACAGUUUAAAAUGAUGA GUAAUUGCAAACUCUGGAAAUGUGACUAGUAUAUGAUUUAAGGCUGUAGAAGCAAGGAA GCUCUUUCAAGUGCUAAAACUAAAGACUUCUAGUUUUUGGCUCAAAUAAGUACUGUUUG UAUACCAGGAUAUGUGAGAUGUAAAUGUAGUAGGUCACUUUUCACCCUUGUAGCUAUAA AAUAAAAAUUUUGUAGAACAGAAAUAGCUUGUACUACUGAAUUAACAAAAGUUAUACUA AAGUAUCAUGUUUAAAAAAAAUAUAUAUAUAUAUACAGAGUUAAGCUUGUUGCUGUUAC CCUGUCUGGAUUUGAAAAGUGUGCUGAUUUAUAUAUAUAUAUUACACACACACACACAC ACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAUA CACCUAAAAUGGCCUAAAGCAGACAUCCAUGUAAUUACAGUUGCAAAAUGAAAACAUUU UGGAAAGAACAUUGUAUCAUAGUUCAUUCAUUUGCAGUGGAUCUUUGUUCCUUUUUACU GUGGUAAUUUUAGAAAUGAGUGUCAAGUUUGAAAUUAGAUCUGCUAAGUUGGGGUUUUG CUGCUUGAACUCUGCACUGGGUCCUCAAAUAAACCGAUGUGAAUGUAGUUUUUUCCCCC UGUGUGAAGAAGCAGUUACACCCCAACAAUAGGAGGAAAAAUCUAGAACUAUUUCAAGU
UUUAUCUUUUUGUAUAUGAAAAUAAAAUAAUAAUAAAACAA SEQ ID NO: 9:
AUGUACCGGCAUCGCAAGCCCCCCUACGGUCAUGUGGACAUCCAUGAGGACCCUGGGCC UCCACCACCAUCCCCUCUGGUGGGCCUGAAGCCACUGCAGCUGCUGGAGAUCAAGGCUC GGGGGCGCUUUGGCUGUGUCUGGAAGGCCCAGCUCAUGAAUGACUUUGUAGCUGUCAAG AUCUUCCCACUCCAGGACAAGCAGUCGUGGCAGAGUGAACGGGAGAUCUUCAGCACACC UGGCAUGAAGCACGAGAACCUGCUACAGUUCAUUGCUGCCGAGAAGCGAGGCUCCAACC UCGAAGUAGAGCUGUGGCUCAUCACGGCCUUCCAUGACAAGGGCUCCCUCACGGAUUAC CUCAAGGGGAACAUCAUCACAUGGAACGAACUGUGUCAUGUAGCAGAGACGAUGUCACG AGGCCUCUCAUACCUGCAUGAGGAUGUGCCCUGGUGCCGUGGCGAGGGCCACAAGCCGU CUAUUGCCCACAGGGACUUUAAAAGUAAGAAUGUAUUGCUGAAGAGCGACCUCACAGCC GUGCUGGCUGACUUUGGCUUGGCUGUUCGAUUUGAGCCAGGGAAACCUCCAGGGGACAC CCACGGACAGGUAGGCACGAGACGGUACAUGGCUCCUGAGGUGCUCGAGGGAGCCAUCA ACUUCCAGAGAGAUGCCUUCCUGCGCAUUGACAUGUAUGCCAUGGGGUUGGUGCUGUGG GAGCUUGUGUCUCGCUGCAAGGCUGCAGACGGACCCGUGGAUGAGUACAUGCUGCCCUU UGAGGAAGAGAUUGGCCAGCACCCUUCGUUGGAGGAGCUGCAGGAGGUGGUGGUGCACA AGAAGAUGAGGCCCACCAUUAAAGAUCACUGGUUGAAACACCCGGGCCUGGCCCAGCUU UGUGUGACCAUCGAGGAGUGCUGGGACCAUGAUGCAGAGGCUCGCUUGUCCGCGGGCUG UGUGGAGGAGCGGGUGUCCCUGAUUCGGAGGUCGGUCAACGGCACUACCUCGGACUGUC UCGUUUCCCUGGUGACCUCUGUCACCAAUGUGGACCUGCCCCCUAAAGAGUCAAGCAUC
UAA SEQ ID NO: 10.
ATGACGGCGCCCTGGGTGGCCCTCGCCCTCCTCTGGGGATCGCTGTGCGCCGGCTCTGG GCGTGGGGAGGCTGAGACACGGGAGTGCATCTACTACAACGCCAACTGGGAGCTGGAGC GCACCAACCAGAGCGGCCTGGAGCGCTGCGAAGGCGAGCAGGACAAGCGGCTGCACTGC TACGCCTCCTGGCGCAACAGCTCTGGCACCATCGAGCTCGTGAAGAAGGGCTGCTGGCT AGATGACTTCAACTGCTACGATAGGCAGGAGTGTGTGGCCACTGAGGAGAACCCCCAGG TGTACTTCTGCTGCTGTGAAGGCAACTTCTGCAACGAACGCTTCACTCATTTGCCAGAG GCTGGGGGCCCGGAAGTCACGTACGAGCCACCCCCGACAGCCCCCACCCTGCTCACGGT GCTGGCCTACTCACTGCTGCCCATCGGGGGCCTTTCCCTCATCGTCCTGCTGGCCTTTT GGATGTACCGGCATCGCAAGCCCCCCTACGGTCATGTGGACATCCATGAGGACCCTGGG CCTCCACCACCATCCCCTCTGGTGGGCCTGAAGCCACTGCAGCTGCTGGAGATCAAGGC TCGGGGGCGCTTTGGCTGTGTCTGGAAGGCCCAGCTCATGAATGACTTTGTAGCTGTCA AGATCTTCCCACTCCAGGACAAGCAGTCGTGGCAGAGTGAACGGGAGATCTTCAGCACA CCTGGCATGAAGCACGAGAACCTGCTACAGTTCATTGCTGCCGAGAAGCGAGGCTCCAA CCTCGAAGTAGAGCTGTGGCTCATCACGGCCTTCCATGACAAGGGCTCCCTCACGGATT ACCTCAAGGGGAACATCATCACATGGAACGAACTGTGTCATGTAGCAGAGACGATGTCA CGAGGCCTCTCATACCTGCATGAGGATGTGCCCTGGTGCCGTGGCGAGGGCCACAAGCC GTCTATTGCCCACAGGGACTTTAAAAGTAAGAATGTATTGCTGAAGAGCGACCTCACAG CCGTGCTGGCTGACTTTGGCTTGGCTGTTCGATTTGAGCCAGGGAAACCTCCAGGGGAC ACCCACGGACAGGTAGGCACGAGACGGTACATGGCTCCTGAGGTGCTCGAGGGAGCCAT CAACTTCCAGAGAGATGCCTTCCTGCGCATTGACATGTATGCCATGGGGTTGGTGCTGT GGGAGCTTGTGTCTCGCTGCAAGGCTGCAGACGGACCCGTGGATGAGTACATGCTGCCC TTTGAGGAAGAGATTGGCCAGCACCCTTCGTTGGAGGAGCTGCAGGAGGTGGTGGTGCA CAAGAAGATGAGGCCCACCATTAAAGATCACTGGTTGAAACACCCGGGCCTGGCCCAGC TTTGTGTGACCATCGAGGAGTGCTGGGACCATGATGCAGAGGCTCGCTTGTCCGCGGGC TGTGTGGAGGAGCGGGTGTCCCTGATTCGGAGGTCGGTCAACGGCACTACCTCGGACTG TCTCGTTTCCCTGGTGACCTCTGTCACCAATGTGGACCTGCCCCCTAAAGAGTCAAGCA
TCTAA SEQ ID NO: 11. Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu Pro Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ile Val Leu Leu Ala Phe Trp Met Tyr Arg His Arg Lys Pro Pro Tyr Gly His Val Asp Ile His Glu Asp Pro Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Gln Leu Leu Glu Ile Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln Leu Met Asn Asp Phe Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg Asp Phe Lys Ser Lys
Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val His Lys Lys Met Arg Pro Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro Gly Leu Ala Gln Leu Cys Val Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu Ile Arg Arg Ser Val Asn Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu Val Thr Ser Val Thr Asn Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile

Claims (33)

REIVINDICAÇÕES
1. Composto caracterizado por ser capaz de permitir que uma célula-alvo produza um mRNA de receptor de activina tipo 2B (ACVR2B) mutante em que uma parte da sequência que codifica parte ou toda a região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem está ausente, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
2. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem é codificada por éxons 5 a 11 de ACVR2B do tipo selvagem.
3. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por ser capaz de fazer com que a célula-alvo produza uma proteína de ACVR2B truncada que carece de parte da região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem.
4. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a proteína de ACVR2B truncada carece de toda ou parte da região intracelular codificada por pelo menos um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9 e 10 de ACVR2B.
5. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser um oligômero antissenso capaz de induzir o salto de uma éxon que codifica uma parte da região intracelular de ACVR2B, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
6. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o dito éxon a ser saltado é selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9 e 10 de ACVR2B.
7. Composto, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado por compreender 10-50 nucleobases, ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
8. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado por compreender uma sequência complementar a 10 a 50 nucleotídeos consecutivos de um éxon selecionado a partir do grupo que consiste em éxons 5, 6, 7, 8, 9 e 10 de ACVR2B, ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
9. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo fato de que o éxon compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 6.
10. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9, caracterizado por compreender uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 12 a 36 e 43 a 111, ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
11. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, caracterizado por consistir em uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 12 a 36 e 43 a 111, ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
12. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 11, caracterizado pelo fato de que o oligômero antissenso é um oligonucleotídeo.
13. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma fração de açúcar e/ou pelo menos uma fração de ligação de fosfato no oligonucleotídeo é modificada.
14. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a fração de açúcar modificada é uma ribose na qual o grupo -OH na posição 2′ é substituído com qualquer grupo selecionado a partir do grupo que consiste em OR, R, R′OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br e I (em que R representa alquila ou arila e R′ representa alquileno).
15. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a fração de ligação de fosfato modificada é uma selecionada a partir do grupo que consiste em uma ligação de fosforotioato, uma ligação de fosforoditioato, uma ligação de alquilfosfonato, uma ligação de fosforoamidato e uma ligação de boranofosfato.
16. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 11, caracterizado pelo fato de que o oligômero antissenso compreende pelo menos um anel de morfolino.
17. Composto, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por ser um oligômero de morfolino ou oligômero de morfolino de fosforodiamidato, ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
18. Composto, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado por ter qualquer um dos grupos representados pelas fórmulas químicas (1) a (3) mostradas abaixo em suas extremidades 5′-terminal, ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo .
19. Composto caracterizado por ser um conjugado em que um peptídeo de penetração de célula é ligado ao composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo.
20. Composição farmacêutica caracterizada por compreender o composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.
21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por compreender adicionalmente pelo menos um carreador ou aditivo farmaceuticamente aceitável.
22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizada por ser liofilizada.
23. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, ou a composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizados por serem para o uso em terapia em um indivíduo.
24. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo para uso ou composição farmacêutica para uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizados pelo fato de que a terapia é a prevenção ou o tratamento de uma doença amiotrófica, uma doença de fadiga muscular ou uma doença sarcopênica em um indivíduo.
25. Composto ou sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável para uso ou composição farmacêutica para uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizados pelo fato de que a doença amiotrófica é distrofia muscular de Duchenne.
26. Composto ou sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável para uso ou composição farmacêutica para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizados pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
27. Método para tratar uma doença amiotrófica, uma doença de fadiga muscular ou uma doença sarcopênica em um indivíduo caracterizado por compreender administrar ao dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 ou a composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 22.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a doença amiotrófica é distrofia muscular de Duchenne.
29. Método, de acordo com a reivindicação 27 ou 28,
caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
30. Uso caracterizado por ser do composto ou sal farmaceuticamente aceitável ou hidrato do mesmo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 na fabricação de um medicamento para prevenir ou tratar uma doença amiotrófica, uma doença de fadiga muscular ou uma doença sarcopênica em um indivíduo.
31. Uso, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a doença amiotrófica é distrofia muscular de Duchenne.
32. Uso, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
33. Animal geneticamente manipulado caracterizado por expressar um mRNA de receptor de activina tipo 2B (ACVR2B) mutante onde uma parte da sequência que codifica parte ou toda a região intracelular de ACVR2B do tipo selvagem está ausente.
BR112021012488-8A 2018-12-28 2019-12-26 Inibidor de sinal de miostatina BR112021012488A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1821269.6A GB201821269D0 (en) 2018-12-28 2018-12-28 Myostatin signal inhibitor
GB1821269.6 2018-12-28
PCT/JP2019/051651 WO2020138509A1 (en) 2018-12-28 2019-12-26 Myostatin signal inhibitor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112021012488A2 true BR112021012488A2 (pt) 2021-09-08

Family

ID=65364695

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112021012488-8A BR112021012488A2 (pt) 2018-12-28 2019-12-26 Inibidor de sinal de miostatina

Country Status (19)

Country Link
US (1) US20220119818A1 (pt)
EP (1) EP3902916A1 (pt)
JP (1) JP2022516207A (pt)
KR (1) KR20210110593A (pt)
CN (1) CN113272429A (pt)
AU (1) AU2019415399A1 (pt)
BR (1) BR112021012488A2 (pt)
CA (1) CA3122475A1 (pt)
CL (3) CL2021001712A1 (pt)
CO (1) CO2021008091A2 (pt)
EC (1) ECSP21046159A (pt)
GB (1) GB201821269D0 (pt)
IL (1) IL284342A (pt)
MX (1) MX2021007740A (pt)
PE (1) PE20211732A1 (pt)
PH (1) PH12021551187A1 (pt)
SG (1) SG11202106511UA (pt)
TW (1) TW202039848A (pt)
WO (1) WO2020138509A1 (pt)

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
JP3398378B2 (ja) 1989-12-20 2003-04-21 アンチビラルス・インコーポレイテツド リン含有キラルインターサブユニットリンケージを有する非電荷モルホリノ―基体ポリマー
JP2924179B2 (ja) 1993-02-19 1999-07-26 日本新薬株式会社 グリセロール誘導体，デバイス及び医薬組成物
IL115849A0 (en) 1994-11-03 1996-01-31 Merz & Co Gmbh & Co Tangential filtration preparation of liposomal drugs and liposome product thereof
EP1811024A1 (en) 2004-10-05 2007-07-25 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Oligo double-stranded rna and medicinal composition
EP1886688A4 (en) 2005-05-30 2013-01-09 Nippon Shinyaku Co Ltd METHOD FOR PRODUCING PREPARATION OF A NUCLEIC ACID-CONTAINING COMPLEX
DK2024499T3 (da) 2006-05-10 2018-01-29 Sarepta Therapeutics Inc Oligonukleotidanaloger med kationiske intersubunit-koblinger
CN101121933A (zh) * 2006-08-11 2008-02-13 中国科学院上海生命科学研究院 用于激酶基因过表达相关疾病的siRNA
JP5347510B2 (ja) 2007-02-05 2013-11-20 日本新薬株式会社 ポリエチレングリコール誘導体
ES2694726T3 (es) 2007-06-29 2018-12-26 Sarepta Therapeutics, Inc. Conjugados peptídicos específicos de tejido y métodos
CA2884340C (en) 2007-11-15 2017-07-25 Sarepta Therapeutics, Inc. Method of synthesis of morpholino oligomers
WO2009082607A2 (en) 2007-12-04 2009-07-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Targeting lipids
US8906877B2 (en) * 2009-02-20 2014-12-09 GenRemedy, LLC Method for identifying agents that inhibit cell migration, promote cell adhesion and prevent metastasis
US8293881B2 (en) * 2009-06-12 2012-10-23 Acceleron Pharma Inc. Isolated nucleic acid encoding a truncated ActRIIB fusion protein
TWI541024B (zh) * 2010-09-01 2016-07-11 日本新藥股份有限公司 反義核酸
US20140088174A1 (en) * 2011-04-05 2014-03-27 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Compounds and methods for altering activin receptor-like kinase signaling
KR102183273B1 (ko) 2011-05-05 2020-11-27 사렙타 쎄러퓨틱스, 인코퍼레이티드 펩타이드 올리고뉴클레오타이드 접합체
KR20220045091A (ko) 2011-11-18 2022-04-12 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스티레틴（ＴＴＲ） 관련 질병을 치료하기 위한 ＲＮＡｉ 제제, 조성 및 그의 사용방법
IL284593B2 (en) 2013-05-01 2023-02-01 Ionis Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for modulation of hbv and ttr expression
US10808246B2 (en) 2013-07-11 2020-10-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide-ligand conjugates and process for their preparation
CN113105559A (zh) 2013-12-12 2021-07-13 生命技术公司 增强转染的膜穿透性肽和组合物以及其使用方法
WO2015105083A1 (ja) 2014-01-07 2015-07-16 塩野義製薬株式会社 アンチセンスオリゴヌクレオチド及び糖誘導体を含む二本鎖オリゴヌクレオチド
GB201421379D0 (en) * 2014-12-02 2015-01-14 Isis Innovation Ltd And Medical Res Council Molecule
KR20240035901A (ko) 2015-05-19 2024-03-18 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 펩티드 올리고뉴클레오티드 콘주게이트
EP3323893A4 (en) 2015-07-16 2019-03-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. BETA2GPI GENE EXPRESSION-INHIBITING NUCLEIC ACID COMPLEX
UA123359C2 (uk) * 2015-09-15 2021-03-24 Ніппон Шин'Яку Ко., Лтд. Антисенсова нуклеїнова кислота
EP3351634A4 (en) * 2015-09-16 2019-05-08 Nippon Shinyaku Co., Ltd. ANTISENSE NUCLEIC ACID FOR THE TREATMENT OF AMYOTROPHY
BR112018007066A2 (pt) * 2015-10-09 2018-10-23 Sarepta Therapeutics Inc composições e métodos para tratamento da distrofia muscular de duchene e distúrbios relacionados
CN110636866A (zh) 2016-12-19 2019-12-31 萨勒普塔医疗公司 用于肌肉萎缩症的外显子跳跃寡聚体缀合物
SG10202100491QA (en) 2016-12-19 2021-02-25 Sarepta Therapeutics Inc Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
HUE059843T2 (hu) 2016-12-19 2023-01-28 Sarepta Therapeutics Inc Exonátugró oligomerkonjugátumok izomdisztrófiára
US11603532B2 (en) * 2017-06-02 2023-03-14 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2019415399A1 (en) 2021-06-03
EP3902916A1 (en) 2021-11-03
CO2021008091A2 (es) 2021-06-30
MX2021007740A (es) 2021-08-05
CL2023001901A1 (es) 2023-12-15
US20220119818A1 (en) 2022-04-21
PH12021551187A1 (en) 2022-01-03
KR20210110593A (ko) 2021-09-08
CL2021001712A1 (es) 2022-01-07
CN113272429A (zh) 2021-08-17
WO2020138509A1 (en) 2020-07-02
PE20211732A1 (es) 2021-09-06
JP2022516207A (ja) 2022-02-24
CA3122475A1 (en) 2020-07-02
CL2023001902A1 (es) 2023-12-15
ECSP21046159A (es) 2021-07-30
GB201821269D0 (en) 2019-02-13
IL284342A (en) 2021-08-31
SG11202106511UA (en) 2021-07-29
TW202039848A (zh) 2020-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11053497B2 (en) Antisense nucleic acids
EP3297649B1 (en) Peptide oligonucleotide conjugates
ES2765463T3 (es) Acido nucleico antisentido para usar en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne
JP6977998B2 (ja) アンチセンス核酸
JPWO2012029986A1 (ja) アンチセンス核酸
US11655472B2 (en) Antisense nucleic acid that induces skipping of exon 50
US11781140B2 (en) Antisense nucleic acid inducing skipping of exon 51
US10563199B2 (en) Antisense nucleic acid for treating amyotrophy
BR112021012488A2 (pt) Inibidor de sinal de miostatina
EA045808B1 (ru) Антисмысловая нуклеиновая кислота, которая индуцирует пропуск экзона 50