UA123359C2

UA123359C2 - Антисенсова нуклеїнова кислота

Info

Publication number: UA123359C2
Application number: UAA201802093A
Authority: UA
Inventors: Юкіко Енья; Юкико Энья; Юічіро Тоне; Юичиро Тоне; Сін'іті Такеда; Синьити Такеда; Йосітсугу Аокі; Йоситсугу Аоки
Original assignee: Ніппон Шин'Яку Ко., Лтд.; Ниппон Шиньяку Ко., Лтд.; Нешенел Сентер Оф Ньюроледжі Енд Сайкаіетрі; Нешенел Сентер Оф Ньюроледжи Энд Сайкаиетри
Priority date: 2015-09-15
Filing date: 2016-09-15
Publication date: 2021-03-24
Also published as: EP3351633B1; LT3351633T; ES2808049T3; MY185390A; CN108026531B; KR20220053048A; SI3351633T1; CN113930426A; RU2018113276A; KR20190040098A; JP2024038104A; KR20180043244A; CN108026531A; US11981894B2; CA2996280C; PL3351633T3; US10144931B2; BR112018004970A2; HUE050061T2; RS60493B1

Description

(54) АНТИСЕНСОВА НУКЛЕЇНОВА КИСЛОТА (57) Реферат:

Винахід стосується олігомеру, який дозволяє пропуск екзона 45 в гені дистрофіну людини.

ТЕХНІЧНА ГАЛУЗЬ

І0О001) Представлений винахід стосується антисенсового олігомера, який дозволяє пропуск екзона 45 в гені дистрофіну людини, та фармацевтичної композиції, яка містить такий олігомер.

ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ

І0002| М'язова дистрофія Дюшенна (ОМО) представляє собою спадкову прогресуючу міопатію з найвищим рівнем захворюваності, яка виникає з частотою приблизно один на З 500 живих новонароджених хлопчиків. В їх періоді раннього дитинства, пацієнти з ОМО демонструють майже такі самі рухові функції, що і у нормальних людей, але вони мають ознаки м'язової слабкості у віці від 4 до 5 років. Потім, їх м'язова слабкість прогресує до втрати здатності пересуватися до віку приблизно 12 років та в кінцевому підсумку призводить до смерті в віці двадцяти років через серцеву недостатність або дихальну недостатність. ЮМО представляє собою таке серйозне захворювання. В даний час не існує ефективної терапії ОМО, та тому сильно потребує розробки нового терапевтичного агента.

І0003| ОМО, як відомо, викликається мутаціями гена дистрофіну. Ген дистрофіну є розташованим на Х-хромосомі та представляє собою величезний ген, який складається з 2,2 мільйонів пар нуклеотидів ДНК. Дана ДНК транскрибується в мРНК-попередник та додатково сплайсується для того, щоб видалити інтрони, таким чином, в результаті утворюється мРНК, яка складається з 79 екзонів, з'єднаних разом, що становить 13 993 основ в довжину. Дана мРНК транслюється в З 685 амінокислоти для одержання протеїну дистрофіну. Протеїн дистрофіну бере участь у збереженні мембранної стабільності м'язових клітин та є необхідним для того, щоб зробити м'язові клітини менш схильними до поломки. Пацієнти з ОМО мають мутації у своєму гені дистрофіну та, таким чином, не демонструють практично ніякої експресії функціонального протеїну дистрофіну в своїх м'язових клітинах. З цієї причини в організмі пацієнтів з ОМО, м'язові клітини більше не можуть зберігати свою структуру та велика кількість іонів кальцію вливається в м'язові клітини. В результаті, відбудеться реакція схожа на запалення, що сприятиме фіброзу, тому м'язові клітини важко відновити. (0004) М'язова дистрофія Беккера (ВМО) також викликається мутаціями гена дистрофіну. Як його симптом, спостерігається м'язова слабкість, але, як правило, є м'яюшою та прогресує повільніше, ніж у ОМО, таким чином, що в більшості випадків ВМО розвивається у дорослому віці. Відмінність клінічних симптомів між ОМО та ВМО, як видається, виникає внаслідок того, що мутації порушують або зберігають амінокислотну рамку зчитування під час трансляції є МРНК дистрофіну в протеїн дистрофіну (Непатентний документ 1). Зокрема, пацієнти з ОМО не демонструють практично ніякої експресії функціонального протеїну дистрофіну через наявність мутацій, що відповідають за зсув амінокислотної рамки зчитування, тоді як у пацієнтів з ВМО, мутації викликають видалення деяких екзонів, але амінокислотна рамка зчитування зберігається, таким чином, що функціональний протеїн дистрофіну хоча і виробляється, але є неповним.

І0005| Як терапія для ЮМО, перспективною є терапія пропуском екзону. Дана терапія включає модифікацію сплайсингу, щоб відновити амінокислотну рамку зчитування в мРНК дистрофіні, тим самим індукуючи експресію протеїну дистрофіну з частково відновленою функцією (Непатентний документ 2). Ділянки амінокислотної послідовності, орієнтовані на пропуск екзона, видаляються в даній терапії. З цієї причини, протеїн дистрофіну, експресований в даній терапії, є більш коротким, ніж нормальний протеїн, але частково зберігає функцію стабілізації м'язових клітин, оскільки амінокислота рамка зчитування зберігається. Тому очікується, що пропуск екзона дозволяє ОМО представляти такі самі симптоми, як видно в ВМО, які є більш м'якими. Терапія пропуску екзона на даний момент знаходиться на стадії клінічного випробування на пацієнтах-людях з ОМО після експериментів на тваринах - мишах та собаках.

ІЇО006| Пропуск екзона може бути індукованим шляхом зв'язування антисенсових нуклеїнових кислот, спрямованих проти одного або обох сайтів 5" та 3" сплайсингу або проти внутрішніх послідовностей екзону. Екзон є включеним в мРНК тільки тоді, коли його обидва сайти сплайсинга розпізнаються сплайсингосомним комплексом. Таким чином, пропуск екзона може бути індукованим, коли сайти сплайсинга є орієнтованими антисенсовими нуклеїновими кислотами. Більш того, для індукування розпізнавання екзону машиною сплайсингу, ЗК протеїни, багаті на серин та аргінін, повинні бути приєднані до енхансерів сплайсингу екзону (ЕЗЕ); та, отже, пропуск екзона також може бути викликаний при націленні на Е5Е.

ІЇ0007| Пацієнти з ЮОМО мають різні мутації у своєму гені дистрофіну, та, тому різні антисенсові нуклеїнові кислоти є потрібними в залежності від положення та типу мутації гена.

Існують деякі повідомлення про антисенсову нуклеїнову кислоту, призначену для індукування пропуску екзона одного екзону в гені дистрофіну шляхом націлювання на одну неперервну бо послідовність (Патентні документи 1-6, а також непатентні документи 1 та 2). Крім того, існує доповідь, яка показує, що коли двом різним антисенсовим нуклеїновим кислотам, спрямовані проти одного і того ж екзону в гені дистрофіну, дозволяється діяти в суміші (подвійне призначення), активність пропуску може бути посиленою в порівнянні з тим, коли кожна антисенсова нуклеїнова кислота використовується самостійно (Патентний документ 7).

ІЇО008| Однак, не існує ніяких повідомлень, які показують, що сполучені одноланцюгові антисенсові нуклеїнові кислоти, спрямовані проти двох або більше сайтів в одному й тому ж екзоні (тобто, антисенсова нуклеїнова кислота зв'язного типу) показують активність пропуску.

Документи попереднього рівня техніки

Патентні документи

І0009| Патентний документ 1: УУО2004/048570

Патентний документ 2: ММО2009/139630

Патентний документ 3: ММО2010/048586

Патентний документ 4: 052010/0168212

Патентний документ 5: ММО2011/057350

Патентний документ 6: УМО2006/000057

Патентний документ 7: ММО2007/135105

Непатентні документи

ІЇ0010| Непатентний документ 1: АппетіеКе Аагізта-Нив еї аї., (2002) Меиготивсшаг

Різогаєгв 12: 571-577.

Непатентний документ 2: УМійоп 5. О., еї аІ., Моїесшіаг Тпегару 2007: 15: р. 1288-96.

СУТЬ ВИНАХОДУ

Проблеми, які вирішуються за допомогою винаходу

ЇОО11| За таких обставин, як описано вище, представлений винахід в основному є спрямованим на створення нового антисенсового олігомера зв'язного типу, який є призначеним для того, щоб індукувати пропуск екзона шляхом націлювання на окремі дві нуклеотидні послідовності в одному й тому ж екзоні гена дистрофіну, та терапевтичного агента для м'язової дистрофії, що включає такий олігомер.

СПОСОБИ ВИРІШЕННЯ ПРОБЛЕМИ

0012) В результаті детальних досліджень технічного змісту, описаного в зазначених вище

Зо документах, та структури гена дистрофіну, тощо, автори представленого винаходу виявили, що олігомери, спрямовані проти двох окремих сайтів в екзоні 45 гена дистрофіну людини, є з'єднаними разом, та одержаний в результаті антисенсовий олігомер може індукувати пропуск даного екзона. Автори представленого винаходу виявили здійснили представлений винахід на основі даного виявлення. 0013) Зокрема, представлений винахід полягає в наступному.

ГП Антисенсового олігомер від 14 до 32 основ в довжину, який містить зв'язані два одиничні олігомери, вибрані з групи, яка складається з (а) - (е), показаних нижче, або його фармацевтично прийнятної солі або гідрату, причому два одиничні олігомери не є суміжними один до одного або не перекриваються один з одним: (а) одиничний олігомер, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності, яка складається з суміжних від 7 до 16 основ, вибраних з нуклеотидної послідовності, розташованої в положеннях від -5 до 15 від 5-термінального кінця екзона 45 в гені дистрофіну людини; (Б) одиничний олігомер, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності, яка складається з суміжних від 7 до 16 основ, вибраних з нуклеотидної послідовності, розташованої в положеннях від 48 до 70 від 5'-т"ермінального кінця екзона 45 в гені дистрофіну людини; (с) одиничний олігомер, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності, яка складається з суміжних від 7 до 16 основ, вибраних з нуклеотидної послідовності, розташованої в положеннях від 128 до 150 від 5'-термінального кінця екзона 45 в гені дистрофіну людини; (4) одиничний олігомер, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності, яка складається з суміжних від 7 до 16 основ, вибраних з нуклеотидної послідовності, розташованої в положеннях від 15 до 40 від 5'-т-ермінального кінця екзона 45 в гені дистрофіну людини; та (є) одиничний олігомер, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності, яка складається з суміжних від 7 до 16 основ, вибраних з нуклеотидної послідовності, розташованої в положеннях від 110 до 125 від 5'-термінального кінця екзона 45 в гені дистрофіну людини.

І2Ї Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрату відповідно до зазначеного вище |1|, причому один з двох одиничних олігомерів є (а).

ІЗ) Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат відповідно до зазначеного вище (1) або (21), який складається з будь-якої однієї нуклеотидної послідовності, вибраної з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 7-12, 14-33, 40-52, 57, 64, 65 та 79-86. 4) Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат відповідно до будь-якого одного із зазначених вище |11 - ІЗ), який складається з будь-якої однієї нуклеотидної послідовності, вибраної з групи, яка складається з 5ЕО ІО МО: 8, 10, 25, 30, 33, 79 та 80.

ІБ) Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат відповідно до будь-якого одного із зазначених вище |11 - (4), який представляє собою олігонуклеотид.

І6| Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат відповідно до зазначеного вище |5Ї, причому щонайменше один нуклеотид, який утворює олігонуклеотид, модифікується в цукровому фрагменті та/або в фрагменті фосфатного зв'язку.

І/|Ї Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат відповідно до зазначеного вище |5| або (б), в якому цукровий фрагмент щонайменше одного нуклеотида, який утворює олігонуклеотид, представляє собою рибозу, в якій -ОН група в 2-положенні є заміщеною на будь-яку групу, вибрану з групи, яка складається з ОК, К, КОР, 5Н, 5, МН»,

МНА, МА», Ма, СМ, Е, СІ, Вг та І (причому К представляє собою алкіл або арил, та К" представляє собою алкілен).

ІВ) Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат відповідно до зазначеного вище |бЇ або І/), в якому фрагмент фосфатного зв'язку щонайменше одного нуклеотида, який утворює олігонуклеотид, представляє собою будь-який один, вибраний з групи, яка складається з фосфоротіоатного зв'язку, фосфородитіоатного зв'язку, алкілфосфонатного зв'язку, фосфороамідатного зв'язку та боранофосфатного зв'язку.

ІЗ) Антисенсовий олігомер відповідно до будь-якого одного із зазначених вище |11| - (4), який представляє собою морфоліноолігомер, або його фармацевтично прийнятну сіль або гідрат. 19) Антисенсовий олігомер відповідно до зазначеного вище (|9|, який представляє собою фосфородіамідатморфоліноолігомер, або його фармацевтично прийнятну сіль або гідрат.

П11 Антисенсовий олігомер відповідно до зазначеного вище (|4|, який представляє собою

Зо фосфородіамідатморфоліноолігомер, або його фармацевтично прийнятну сіль або гідрат. 112) Антисенсовий олігомер відповідно до будь-якого одного із зазначених вище (9) - 111, чий 5'-термінальний кінець є будь-якою однією з груп, представлених хімічними формулами (1) - (3), показаними нижче, або їх фармацевтично прийнятної солі або гідрату.

ІФормула 11 0.0 о щ иа ит ОоН

М о МН

С Те

М сн М І , З Н «СНуі

ОхР-М Ос:Р-М

І х і СНуз

Б (1) (2) (3) (13) Фармацевтична композиція для лікування м'язової дистрофії, яка включає антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат відповідно до будь-якого одного із зазначених вище |11 - (121 як активний інгредієнт.

І14)Ї Фармацевтична композиція відповідно до зазначеного вище (13), яка додатково включає фармацевтично прийнятний носій. 151 Спосіб лікування м'язової дистрофії, який включає стадію введення пацієнту з м'язовою дистрофією антисенсового олігомера або його фармацевтично прийнятної солі або гідрату відповідно до будь-якого одного із зазначених вище (1) - (12| або фармацевтичної композиції відповідно до зазначеного вище (13) або (141.

П16Ї Спосіб лікування відповідно до зазначеного вище (15), в якому пацієнт з м'язовою дистрофією представляє собою пацієнта, який має мутацію, яка має бути націленою на пропуск екзона 45 в гені дистрофіну.

І17| Спосіб лікування відповідно до зазначеного вище І15| або |(16)Ї, в якому пацієнт є пацієнтом-людиною. 181 Застосування антисенсового олігомера або його фармацевтично прийнятної солі або гідрату відповідно до будь-якого одного із зазначених вище |1| - (12| у виробництві фармацевтичної композиції для лікування м'язової дистрофії.

І19|) Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат відповідно до будь-якого одного із зазначених вище (1| - (12)| для застосування в лікування м'язової дистрофії. (20) Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат відповідно до зазначеного вище |191І, де в процесі лікування, пацієнт з м'язовою дистрофією має мутацію, на яку повинен бути націлений пропуск екзона 45 в гені дистрофіну. (21) Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат відповідно до зазначеного вище (191 або (201, в якому пацієнт є пацієнтом-людиною.

ЕФЕКТ ВИНАХОДУ

І0014| Антисенсовий олігомер представленого винаходу дозволяє ефективно індукувати пропуск екзона 45 в гені дистрофіну людини. Крім того, фармацевтична композиція за представленим винаходом, коли вводиться, дозволяє ефективно полегшувати симптоми м'язової дистрофії Дюшенна. Вилучені екзони у пацієнтів, на який іде націлювання, включають екзони 18-44, 44, 46, 46-47, 46-48, 46-49, 46-51, 46-53, тощо.

КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ

0015) Фігура 1 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 2 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура З представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Зо Фігура 4 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 5 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 6 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 7 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 8 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 9 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 10 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 11 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 12 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 13 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 14 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 15 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 16 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 17 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 18 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 19 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 20 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 21 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 22 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 23 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 24 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

Фігура 25 представляє собою графік, який показує ефективність пропуску екзона 45 в гені дистрофіну людини в людських рабдоміосаркомних клітинах (КО клітини).

ОПИС ВАРІАНТІВ ЗДІЙСНЕННЯ

І0016| Представлений винахід буде описаний більш детально нижче. Наступні варіанти здійснення ілюструються для того, щоб описати представлений винахід, та не є призначеними для того, щоб обмежити представлений винахід тільки даними варіантами здійснення.

Представлений винахід може бути реалізований в різних режимах без відхилення від духу представленого винаходу.

Слід зазначити, що всі публікації, які цитуються в даному документі, включаючи документи попереднього рівня техніки, патентні бюлетені та інші патентні документи, є включеними в даний документ у вигляді посилання. Більш того, даний опис включає зміст, розкритий в описі та кресленнях японської патентної заявки Мо 2015-182145 (поданої 15 вересня 2015 року), на підставі якої представлена заявка заявляє пріоритет. 0017) 1. Антисенсовий олігомер

Представлений винахід передбачає антисенсовий олігомер, який дозволяє пропуск екзона 45 в гені дистрофіну людини, або його фармацевтично прийнятну сіль або гідрат (далі в даному документі узагальнено називається, як "олігомер за представленим винаходом").

Зо 0018) (Екзон 45 в гені дистрофіну людини)

В контексті представленого винаходу, термін "ген" є призначеним для включення не тільки геномного гена, але також КДНК, попередника мРНК та мРНК. Переважно, ген представляє собою попередник мРНК, тобто пре-мРНК.

В геномі людини ген дистрофіна людини знаходиться в локусі Хр21.2. Ген дистрофіна людини має розмір 3,0 мільйона пар нуклеотидів та є найбільшим геном серед відомих генів людини. Однак, кодуючі ділянки в гені дистрофіна людини становлять лише 14 тисяч пар основ, розподілених як 79 екзонів в межах гену дистрофіна людини (Кобегів5, КО, еї аї., Зепотісв, 16: 536-538 (1993)). Пре-мРНК, яка є транскриптом з гена дистрофіна людини, піддається сплайсингу для формування зрілої МРНК з 14 тисяч пар основ. Нуклеотидна послідовність немутантного гена дистрофіна людини є відомою (бСепеВапкК Номер доступу Мо ММ 004006).

Нуклеотидна послідовність екзона 45 в людському немутантному гені дистрофіну є показаною в ЗЕО ІЮ МО: 13. Більш того, в нуклеотидній послідовності (ЗЕО ІЮ МО: 13) екзона 45 в людському немутантному гені дистрофіну, послідовність, яка складається з основ в положеннях від -5 до 15, які відраховуються від 5'--ермінального кінця, є показаною в 5ЕО ІЮ

МО: 3. Аналогічним чином, послідовність, яка складається з основ в положеннях 48-70, послідовність, яка складається з основ в положеннях 128-150, послідовність, яка складається з основ в положеннях від 15 до 40 та послідовність яка складається з основ в положеннях від 110 до 125 є показаними в 5ЕО ІЮ МО: 4-6 та 143, відповідно.

І0019| Олігомер за представленим винаходом на даний момент є отриманим для того, щоб викликати пропуск екзона 45 в гені дистрофіну людини з метою модифікування протеїну, кодованого геном дистрофіну ОМО в протеїн дистрофіну ВМО. Таким чином, екзон 45 в гені дистрофіну, який пропускається олігомером за представленим винаходом, включає не тільки форми немутантного типу, але також мутовані форми.

Більш конкретно, мутований екзон 45 в гені дистрофіну людини або його частина представляє собою полінуклеотид, показаний в (І) або (ІЇ) нижче: (І) полінуклеотид, здатний гібридизуватися в жорстких умовах з полінуклеотидом, яка складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до будь-якої нуклеотидної послідовності, вибраної з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 13, 5ЕО ІО МО: 3, 5ЕО ІЮО МО: 4,

ЗЕО ІЮ МО: 5, ЗЕО ІЮ МО: 6 та ЗЕО ІЮ МО: 143; або

(ІЇ) полінуклеотид, який складається з нуклеотидної послідовності, яка має ідентичність 90 95 або більше з будь-якою нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з ЗЕО

ІО МО: 13, 5ЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІО МО: 5, 5ЕО ІО МО: б та 5ЕО ІО МО: 143.

І0020| Як використовується в даному документі, термін "полінуклеотид" є призначеним означати ДНК або РНК.

Як використовується в даному документі, вираз "полінуклеотид здатний гібридизуватися в жорстких умовах" є призначеним означати, наприклад, полінуклеотид який може бути отриманий за методикою гібридизації колоній, гібридизації бляшок, саузерн-гібридизації або іншої гібридизації з використанням як зонда всього або частини полінуклеотиду, що складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до будь-якої нуклеотидної послідовності, вибраної з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 13, 5ЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 5,

ЗЕО ІО МО: 6 та 5ЕО ІО МО: 143. Для гібридизації можливим є використовувати способи як ті, які описані в, наприклад, "Затогоок 4 КиззеїЇ, МоІесціаг СіІопіпд: А Гарогаїогу Мапиаї Мої. 3, Соїа зргіпд Нагброг, І арогайїогу Рге55 2001" та "Аизибреї, Сигепі РгоїосоЇ5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, допп

УМіеу в Зоп5 1987-1997"

І0021| Як використовується в даному документі, термін "комплементарна нуклеотидна послідовність" не обмежується тільки нуклеотидними послідовностями, які формують пари

Уотсона-Кріка з цільовими нуклеотидними послідовностями, але, крім того, є призначеною включати нуклеотидні послідовності, які утворюють неоднозначні пари основ. В цьому відношенні, пара Уотсона-Кріка є призначеною означати пару основ, яка утворює водневі зв'язки між аденіном та тиміном, між аденіном та урацилом або між гуаніном та цитозином, тоді як термін неоднозначна пара основ є призначеним означати пару основ, яка утворює водневі зв'язки між гуаніном та урацилом, між інозином та урацилом, між інозином та аденіном або між інозином та цитозином. Більш того, така "комплементарна нуклеотидна послідовність" необов'язково має 100 95 комплементарність до цільової нуклеотидної послідовності та може містити некомплементарні основи (наприклад, від Її до З основ, 1 або 2 основи, або одну основу) до цільової нуклеотидної послідовності.

І0022| Як використовується в даному документі, термін "жорсткі умови" можуть представляти собою будь-які з менш жорстких умов, помірних жорстких умов або надзвичайно

Зо жорстких умов. Термін "менш жорсткі умови" стосується, наприклад, умов 5 х 55, 5 х розчин

Денхардта, 0,5 95 505, 50 95 формамід при 32 "С. Аналогічним чином, термін "помірні жорсткі умови" стосується, наприклад, умов 5 х 55С, 5 х розчин Денхардта, 0,5 95 505, 50 96 формамід при 42 "С, або 5 х 55С, 195 505, 50 мМ Ттгі5-НОЇ (рН 7,5), 50 95 формамід при 42 "С. Термін "надзвичайно жорсткі умови" стосується, наприклад, умов 5 х 55С, 5 х розчин Денхардта, 0,5 95 505, 50 956 формамід при 50 "С або умов 0,2 х 550, 0,195 505 при 650. В даних умовах, очікуваним може бути, що полінуклеотиди, які мають більш високу гомологічність, більш ефективно отримуються при більш високих температурах. Однак, декілька чинників приймають участь в жорсткості гібридизації, включаючи температуру, концентрацію зонда, довжину зонда, іонну силу, час реакції, концентрацію солі та інші. Кваліфікований фахівець в даній галузі може відповідним чином вибрати дані чинники, щоб досягти аналогічну жорсткість.

Ї0023| Слід зазначити, що, коли комерційно доступні набори використовують для гібридизації, то, наприклад, то для даної цілі можуть використовувати системи АЇКрпо5 бОігесі

І абеїїпд та Оєїесійоп Зубіет (СЕ Неаксаге). У цьому випадку, гібридизацію можуть здійснювати відповідно до протоколу, включеного в набір, тобто, після того як мембрану інкубують з міченим зондом протягом ночі та потім промивають з первинним промивним буфером, який містить 0,195 (мас./об.) ЗОЗ при 55"С, гібридизований полінуклеотид може бути виявленим.

Альтернативно, якщо комерційно доступний реагент (наприклад, РСК Іареїйпуд Міх (Коспе

Оіадповіійс5)) використовують для маркування зонду дигоксигеніном (010) під час отримання зонду на основі цілої або частини нуклеотидної послідовності, комплементарної до будь-якої

БО нуклеотидної послідовності, вибраної з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 13, 5ЕО ІЮО МО: 3,

ЗЕБЕО ІЮ МО: 4, 5ЕБЕО ІЮО МО: 5, 5ЕО ІЮО МО: 6 та 5ЕО ІО МО: 143 або вибраної з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: 3, ЗЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІО МО: 5, ЗЕО ІО МО: 6 та 5ЕО ІЮ МО: 143, СІС набір для детектування нуклеїнової кислоти (Коспе Оіадповіїс5) може використовуватись для виявлення гібридизації. (0024) На додаток до тих, які перелічені вище, інші здатні гібридизуватися полінуклеотиди включають полінуклеотиди, які мають ідентичність 90 95 або більше, 91 95 або більше, 92 95 або більше, 93 95 або більше, 94 95 або більше, 95 95 або більше, 96 95 або більше, 97 95 або більше, 98 95 або більше, 99 95 або більше, 99,1 95 або більше, 99,2 95 або більше, 99,3 95 або більше, 99,4 95 або більше, 99,5 95 або більше, 99,6 95 або більше, 99,7 95 або більше, 99,8 95 або 60 більше, або 99,9 95 або більше з послідовністю, яка складається з будь-якого полінуклеотиду,

вибрані з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 13, 5ЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО ІЮО МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 5,

ЗЕО ІО МО: 6 та 5ЕО ІЮО МО: 143, як розраховується гомологічним пошуковим програмним забезпеченням ВГ А5Т, використовуючи параметри за замовчуванням.

Слід зазначити, що ідентичність нуклеотидних послідовностей може бути визначена шляхом використання алгоритму Кагпіп та Айї5спиї, ВГА5Т (Вавіс ГІ оса! АІїдпітепі зеагсп Тоої) (Ргос. Май.

Асад. 5сі. ОБА 872264-2268, 1990; Ргос Маї! Асай Зсі ОА 90: 5873, 1993). На основі алгоритму

ВГА5Т були розроблені програми ВІ АЗТМ та ВІ АЗТХ (Айбспиї 5Е, еї аї: 9) Мої Віо! 215: 403, 1990). Якщо ВГАЗТМ використовують для аналізу нуклеотидної послідовності, параметри можуть бути встановлені, наприклад, з балом - 100 та довжиною слова - 12. Якщо використовуються програми ВГА5Т та Сарреа ВГА5Т, параметри за замовчуванням можуть використовуватись в кожній програмі. 0025) В певному варіанті здійснення, олігомер за представленим винаходом представляє собою антисенсовий олігомер від 14 до 32 основ в довжину, який містить зв'язані два одиничні олігомери, вибрані з групи, яка складається з (а) - (є), показаної нижче, або її фармацевтично прийнятної солі або гідрату: (а) одиничний олігомер, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності, яка складається з суміжних від 7 до 16 основ, вибраних з нуклеотидної послідовності, розташованої в положеннях від -5 до 15 від 5-термінального кінця екзона 45 в гені дистрофіну людини; (Б) одиничний олігомер, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності, яка складається з суміжних від 7 до 16 основ, вибраних з нуклеотидної послідовності, розташованої в положеннях від 48 до 70 від 5'--ермінального кінця екзона 45 в гені дистрофіну людини; (с) одиничний олігомер, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності, яка складається з суміжних від 7 до 16 основ, вибраних з нуклеотидної послідовності, розташованої в положеннях від 128 до 150 від 5'-термінального кінця екзона 45 в гені дистрофіну людини; (4) одиничний олігомер, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності, яка складається з суміжних від 7 до 16 основ, вибраних з нуклеотидної послідовності, розташованої в положеннях від 15 до 40 від 5'-т-ермінального кінця екзона 45 в гені дистрофіну людини; та (є) одиничний олігомер, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності, яка складається з суміжних від 7 до 16 основ, вибраних з нуклеотидної послідовності, розташованої в положеннях від 110 до 125 від 5'-т-ермінального кінця екзона 45 в гені дистрофіну людини. (0026) Зазначені вище одиничні олігомери від (а) - (є) (далі в даному документі також просто називаються як "одиничні") кожен має розмір від 7 до 16 основ в довжину, переважно від 8 до 16 основ в довжину, більше переважно від 9 до 16 основ в довжину. Відповідні одиниці можуть мати однаковий або відмінний розмір.

І0027| Більш того, коли два одиничні олігомери є вибраними з групи, яка складається з (а) - (є), дані два одиничні олігомери можуть представляти собою комбінацію однакових одиниць (тобто, (а) та (а), (Б) та (Б), (с) та (с), (4) та (а), або (є) та (є)) або можуть представляти собою комбінацію різних одиниць, але переважно - комбінацію різних одиниць. Наприклад, якщо (а) вибирають, як одну одиницю, то інша одиниця переважно є будь-якої однієї з (Б) - (є).

Аналогічним чином, якщо (Б) вибирають, як одну одиницю, то інша одиниця переважно є (а), (с), (а) або (е), тоді як якщо (с) вибирають, як одну одиницю, то інша одиниця переважно є да), (р), (а) або (є). 0028) Коли дві одиниці є вибраними з (а) - (є), будь-яка з двох вибраних одиниць може бути розташованою на 5'-термінальній стороні. Якщо вибраними є (а) та (Б), то одиниця (а) є переважно зв'язаною з 3'-т-ермінальною стороною. Якщо вибраними є (Б) та (с), то одиниця (Б) є переважно зв'язаною з 3'-т-ермінальною стороною. Якщо вибраними є (а) та (с), то одиниця (а) є переважно зв'язаною з 3'-термінальною стороною. Якщо вибраними є (а) та (4), то одиниця (а) є переважно зв'язаною з 3'-термінальною стороною. Якщо вибраними є (а) та (є), то одиниця (а) є переважно зв'язаною з 3-термінальною стороною. (0029) Як використовується в даному документі, термін "зв'язаний" є призначеним означати, що дві одиниці, вибрані з (а) - (є) є безпосередньо зв'язаними одна до одною. Зокрема, коли дві одиниці є зв'язаними, це означає, що 3'-термінальний кінець одиниці, розташованої на 5'- термінальній стороні, та 5'--ермінальний кінець одиниці, розташованої на 3'-термінальній стороні, утворюють фосфатний зв'язок або будь-яку з наступних груп: бо ІФормула 21 дути тм агллг

ЛА шк | гли

І х | ушу шк х | Ї Фо ла пли плялаг лллг (причому Х представляє собою -ОН, -СНеВ", -0-СНеВ", -5-СНеВ", -МА2ВЗ або Е;

В" представляє собою Н або алкіл;

В? та РУ, які можуть бути однаковими або різними, кожен представляє собою Н, алкіл, циклоалкіл або арил;

У: представляє собою 0, 5, СНг або МЕ";

Уг представляє собою 0, 5 або МЕ"; та 2 представляє собою О або 5).

І0ОЗ0| Вираз "який дозволяє пропуск екзона 45 в гені дистрофіну людини" є призначеним означати, що при зв'язуванні олігомера за представленим винаходом з сайтом, що відповідає екзону 45 в транскрипті (наприклад, пре-мРНК) гена дистрофіну людини, транскрипт сплайсується для встановлення зв'язку між основою, що відповідає 3'--ермінальному кінцю екзона 43, та основою, що відповідає 5'--ермінальному кінцю екзона 46 у випадку пацієнтів з

ОМО з делецією екзона 44, у вигляді прикладу, тим самим утворюючи зрілу мРНК, вільну від зсуву рамки зчитування кодону.

І00О31)| Термін "зв'язування", як використовується в даному документі, означає, що коли олігомер за представленим винаходом змішують з транскриптом гена дистрофіна людини, обидва гібридизуються один з одним в фізіологічних умовах з утворенням подвійного ланцюга нуклеїнової кислоти. Термін "в фізіологічних умовах", як використовується в даному документі, означає умови, встановлені для імітації іп мімо рН, сольового складу та температури, як ілюструється умовами від 25 "С до 40 "С, переважно 37 "С, рН від 5 до 8, переважно рн 7,4, та концентрація хлориду натрію 150 мМ. 0032) Для того, щоб підтвердити чи був, чи не був пропуск екзона 45 викликаний в гені дистрофіну людини, олігомер за представленим винаходом може бути трансфікований в дистрофін-експресуючі клітини (наприклад, людські рабдоміосаркомні клітини) та ділянка навколо екзона 45 в мРНК гена дистрофіну людини може бути ампліфікованою з використанням

РЧ-ПЛР із загальної РНК зазначеної вище дистрофін-експресуючої клітини, з наступною вкладеною ПЛР або аналізом секвенування на продукт ПЛР-ампліфікації. Ефективність пропуску може бути визначена наступним чином: мРНК гена дистрофіну людини збирається з

Зо досліджуваних клітин, та мРНК вимірюється щодо полінуклеотидного рівня "А" в смузі з пропуском екзона 45 та полінуклеотидного рівня "В" в смузі без пропуску екзона 45, з наступним розрахунком на основі даних виміряних значень "А" та "В" відповідно до наступного рівняння.

Ефективність пропуску (95) - АЛАжЖВ)х100

І0033| Олігомер за представленим винаходом переважно викликає пропуск екзона 45 з ефективністю 10 95 або більше, 20 95 або більше, 30 95 або більше, 40 95 або більше, 50 95 або більше, 60 95 або більше, 70 95 або більше, 80 95 або більше, або 90 95 або більше.

Стосовно розрахунку ефективності пропуску, посилання може бути зроблене на

МО2012/029986.

Ї0034| Олігомер за представленим винаходом може бути проілюстрованим олігонуклеотидом, морфоліно-олігомером або олігомером пептидної нуклеїнової кислоти (РМА), кожен з яких має від 14 до 32 основ в довжину. Олігомер за представленим винаходом переважно містить від 16 до 30 основ, від 17 до 30 основ, від 18 до 30 основ, від 19 до 30 основ, від 20 до 30 основ, від 20 до 29 основ, від 20 до 28 основ, від 20 до 27 основ, від 20 до 26 основ або від 21 до 26 основ в довжину, та переважно представляє собою морфоліно-олігомер.

Ї0035| Зазначений вище олігонуклеотид (далі в даному документі називається як "олігонуклеотид за представленим винаходом") представляє собою олігомер відповідно до представлений винахід, складова частина якого представляє собою нуклеотид, та такий нуклеотид може представляти собою будь-який з рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду або модифікованого нуклеотиду.

І0036| Модифікований нуклеотид стосується рибонуклеотиду або дезоксирибонуклеотиду, чия нуклеооснова, цукровий фрагмент та фрагмент фосфатного зв'язку є повністю або частково модифікованими.

І0037| Приклади нуклеїнової основи включають аденін, гуанін, гіпоксантин, цитозин, тимін, урацил, або їх модифіковані основи. Такі модифіковані основи можуть бути проілюстрованими псевдоурацилом, З-метилурацилом, дигідроурацилом, 5-алкілцитозинами (наприклад, 5- метилцитозином), 5-алкілурацилами (наприклад, 5-етилурацил), 5-галогенурацилами (наприклад, 5-бромурацилом), б-азапіримідином, б-алкілпіримідинами (наприклад, 6- метилурацилом), 2-тіоурацилом, 4-тіоурацилом, 4-ацетилцитозином, 5- (карбоксигідроксиметил)урацилом, 5'і-карбоксиметиламінометил-2-тіоурацилом, 5- карбоксиметиламінометилурацил, 1-метиладеніном, 1-метилгіпоксантином, 2,2- диметилгуаніном, З-метилцитозином, 2-метиладеніном, 2-метилгуаніном, Мб-метиладеніном, 7- метилгуаніном, 5-метоксіамінометил-2-тіоурацилом, БбБ-метиламінометилурацилом, 5- метилкарбонілметилурацилом, 5-метилоксіурацилом, 5-метил-2-тіоурацилом, 2-метилтіо-Мб- ізопентеніладеніном, урацил-5-оксіоцтовою кислотою, 2-тіоцитозином, пурином, 2,6- діамінопурином, 2-амінопурином, ізогуаніном, індолом, імідазолом, ксантином і так далі, але не обмежуючись цим. 0038) Модифікації в цукровому фрагменті можуть бути проілюстрованими модифікаціями в 2-положенні рибози та модифікації в інших положеннях цукру. Приклади модифікацій в 2'- положенні рибози включають модифікації, призначені для заміщення -ОН групи в 2'-положенні рибози з ОК, К, Е'ОК, ЗН, 5К, МН», МНА, МР», Мз, СМ, Е, СІ, Вг або І, причому К представляє собою алкіл або арил, та К" представляє собою алкілен.

Приклади модифікацій в інших положеннях цукру включають заміщення О на 5 в 4- положенні рибози або дезоксирибози, та утворення місточкового зв'язку між 2- та 4- положеннями цукру, як проілюстровано І МА (заблокованими нуклеїновими кислотами) або ЕМА (2'-О, 4-С-етилен-місточковими нуклеїновими кислотами), але не обмежуються ними.

ІЇ0039| Модифікації фрагменту фосфатного зв'язку може бути проілюстрованою

Зо модифікаціями призначеними для заміни фосфодискладноефірного зв'язку на фосфоротіоатний зв'язок, фосфородитіоатний зв'язок, алкілфосфонатний зв'язок, фосфороамідатний зв'язок або боранофосфатний зв'язок (Епуа єї а!: Віоогдапіс 85 Меаісіпа!

Спетівігу, 2008, 18, 9154-9160) (дивіться, наприклад, УР УУО2006/129594 та Р

МО2006/038608).

І0040| Алкіл переважно представляє собою лінійний або розгалужений алкіл, який містить від 1 до б атомів вуглецю. Більш конкретно, приклади включають метил, етил, н-пропіл, ізопропіл, н-бутил, ізобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, ізопентил, неопентил, трет- пентил, н-гексил та ізогексил. Такий алкіл може бути заміщеним від 1 до 3 замісниками, включаючи галоген, алкокси, ціано, нітро, тощо. (0041) Циклоалкіл переважно представляє собою циклоалкіл, який містить від 5 до 12 атомів вуглецю. Більш конкретно, приклади включають циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, циклодецил та циклододецил.

Галогени включають фтор, хлор, бром та йод.

Алкокси може представляти собою лінійний або розгалужений алкокси, який містить від 1 до б атомів вуглецю, як проілюстровано метокси, етокси, н-пропокси, ізопропокси, н-бутокси, ізобутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, н-пентилокси, ізопентилокси, н-гексилокси, ізогексилокси, тощо. Особливо переважним є алкокси, який містить від 1 до З атомів вуглецю. (0042) Арил переважно представляє собою арил, який містить від б до 10 атомів вуглецю.

Більш конкретно, приклади включають феніл, а-нафтил та ВД-нафтил. Особливо переважним є феніл. Такий арил може бути заміщеним від 1 до З замісниками, включаючи алкіл, галоген, алкокси, ціано, нітро, тощо.

Алкілен переважно представляє собою лінійний або розгалужений алкілен, який містить від 1 до 6 атомів вуглецю. Більш конкретно, приклади включають метилен, етилен, триметилен, тетраметилен, пентаметилен, гексаметилен, 2-(етил)триметилен та 1-(метил)тетраметилен.

І0043| Ацил може представляти собою лінійний або розгалужений алканоїл або ароїл.

Приклади такого алканоїла включають форміл, ацетил, 2-метилацетил, 2,2-диметилацетил, пропіоніл, бутирил, ізобутирил, пентаноїл, 2,2-диметилпропіоніл, гексаноїл, тощо. Приклади ароїлу включають бензоїл, толуоїл та нафтоїл. Такий ароїл може бути заміщеним в будь-яких положеннях, які є здатними для заміщення та може бути заміщеним алкілом(ами).

І0044| Олігонуклеотид за представленим винаходом переважно представляє собою п олігомер відповідно до представленого винаходу, складовою частиною якого є одиницею, яка представляє собою групу, представлену наступною загальною формулою, в якій -ОН група в 2- положенні рибози є заміщеною метокси, та фрагмент фосфатного зв'язку представляє собою фосфоротіоатний зв'язок:

ІФормула ЗІ в ЩІ ого щей че ВсНнОоВа їі х шт

Од 00 осн. «муку й а (причому основа представляє собою нуклеїнову основу).

І0045| Олігонуклеотид за представленим винаходом може бути легко синтезований з використанням різних автоматизованих синтезаторів (наприклад, АКТА оїїдоріої ріиз 10/100 (СЕ

Неансаге)), або альтернативно, його синтез може бути також покладено на організацію третьої сторони (наприклад, Рготеда або ТакКага), тощо.

І0046| Зазначений вище морфоліноолігомер представляє собою олігомер відповідно до представленого винаходу, складова частина якого являє собою групу, представлену наступною загальною формулою:

ІФормула 41 ш

Му 5 о Основа с 1" 3 у

Ї ле в даному документі основа є такою самою, як визначено вище; та

МУ представляє собою групу, показану будь-якою з наступних формул:

ІФормула 5) дл

ШІ "-тУТХ | йшшр---Х

ЗІ | | й (причому Х представляє собою -СНеВ", -0-СНеВ", -5-СНеВ", -МВ2ВЗ або Е;

В' представляє собою Н або алкіл;

В2 та З, які можуть бути однаковими або різними, кожен представляє собою Н, алкіл, циклоалкіл або арил;

У: представляє собою 0, 5, СНг або МЕ";

Уг представляє собою 0, 5 або МЕ"; та 2 представляє собою О або 5)). (0047| Морфоліноолігомер переважно представляє собою олігомер складова частина якого являє собою групу, представлену наступною формулою (тобто, фосфородіамідатний морфоліноолігомер (далі в даному документі називається як ""МО")):

ІФормула 6)

ВР о М ж- о ' в? у Вазе

М

І пиши (причому основа, Р: та ЕЗ є такими самими як визначено вище). (0048) Наприклад, морфоліноолігомер може бути отриманий відповідно до ММО1991/009033 або М/О2009/064471. Зокрема, РМО може бути отриманий відповідно до процедур, описаних в

УО2009/064471 або може бути отриманий відповідно до процедур, описаних в УМО2013/100190. 0049) |Спосіб отримання РМО)Ї

Як один варіант здійснення РМО, сполука, представлена наступною загальною формулою (І) (далі в даному документі називається як РМО (І)) може бути надана як приклад:

ІФормула 7сю У «Основа

Во в М. М. «Основа "м я

ІЗ н

Іпричому кожна основа, КЗ: та КЗ є такими самими як визначено вище; та п представляє собою будь-яке ціле число в діапазоні від 1 до 99, переважно будь-яке ціле число в діапазоні від 13 до 311. 0050) РМО (І) може бути отриманий відповідно до відомого способу, наприклад, можуть отримувати шляхом виконання операцій, показаних в наступних стадіях.

Сполуки та реагенти, використовувані в описаних нижче стадіях, не мають особливих обмежень, оскільки вони загальноприйнято використовуються для отримання РМО. 00511 Крім того, всі наступні стадії можуть бути виконані, застосовуючи рідинофазний спосіб або твердофазний спосіб (повторюючи серії реакцій або з використанням комерційно доступних твердофазних автоматичних синтезаторів). При отриманні РМО застосовуючи твердофазний

Зо спосіб, бажаним є використовувати автоматизовані синтезатори, приймаючи до уваги прості процедури роботи та точність синтезу. 00521 (1) Стадія А:

Це є стадія, на якій сполуку, представлену наступною загальною формулою (ІІ) (далі в даному документі зазначається, як сполука (ІІ)) піддають взаємодії з кислотою з отриманням сполуки, представленої наступною загальною формулою (Ії) (далі в даному документі зазначається, як сполука (ПІ):

ІФормула 81)

І о І ІВ,

Бе но ЕР

ФІ ) рг М киспота М ля-в о 8-8-Я ЗО ее йем-й ЩВ вв зу меш зу й лю (1 ! (т) й

Іпричому п, Р: та ЕЗ є такими самими як визначено вище; кожен В" незалежно представляє собою нуклеїнову основу, яка може бути захищеною; 5 Т представляє собою тритильну групу, монометокситритильну групу або диметокситритильну групу; та

Ї представляє собою водень, ацил або групу, представлену наступною загальною формулою (ІМ) (далі в даному документі зазначається як група (ІМ):

ІФормула 9) що "Нуклеїнові основи" можливі для ВР можуть бути проілюстрованими такими самими "нуклеїновими основами" як перелічено для основ, за умови, що аміно групи або гідроксильні групи в даних нуклеїнових основах для В" можуть бути захищеними.

Захисні групи для даних аміногруп не обмежуються будь-яким чином, якщо вони використовуються як захисні групи для нуклеїнових кислот. Більш конкретно, приклади включають бензоїл, 4-метоксибензоїл, ацетил, пропіоніл, бутирил, ізобутирил, фенілацетил, феноксіацетил, 4-трет-бутилфеноксіацетил, 4-ізопропілфеноксіацетил, та (диметиламіно)метилен. Захисні групи для гідроксильних груп включають, наприклад, 2- ціаноетил, 4-нітрофенетил, фенілсульфонілетил, метилсульфонілетил, триметилсилілетил, феніл, які можуть бути заміщеними від 1 до 5 електроноакцепторними групами в будь-якому прийнятному(их) положенні(ях), дифенілкарбамоїлом, диметилкарбамоїлом, діетилкарбамоїлом, метилфенілкарбамоїлом, 1-піролідинілкарбамоїлом, морфолінокарбамоїлом, 4-(трет-бутилкарбокси)бензилом, 4-((диметиламіно)карбокси|бензилом, та 4-(фенілкарбокси)бензилом (дивіться, наприклад, УМО2009/064471).

Ї0О53| "Твердий носій" не обмежується будь-якими конкретними представниками, оскільки він представляє собою носій доступний для застосування в реакції в твердій фазі нуклеїнових кислот, але бажаним для застосування, наприклад, є носій, який (ї) є помірно розчинним в реагентах, прийнятних для застосування в синтезі морфолінових похідних нуклеїнових кислот (наприклад, дихлорметан, ацетонітрил, тетразол, М-метилімідазол, піридин, оцтовий ангідрид,

Зо лютидин, трифтороцтова кислота); (ії) є хімічно стабільними до реагентів, прийнятних для застосування в синтезі морфолінових похідних нуклеїнової кислоти; (ії) можуть бути хімічно модифікованими; (ім) можуть бути наповненим бажаними морфоліновими похідними нуклеїнової кислоти; (м) має міцність, достатню, щоб витримувати високий тиск під час обробки; та (мі) має певний діапазон розміру та розподілення частинок. Більш конкретно, приклади включають здатний до розбухання полістирол (наприклад, амінометилполістирольну смолу перехресно сшиті з 1 95 дивінілбензолом (200-400 меш) (від 2,4 до 3,0 ммоль/г) (Токуо Спетісаї! Іпдивігу Со.,

Ца., дарап); амінометильовану полістирольну смолу: НСІ |дивінілбензол 1 95, від 100 до 200 меші (Рерііде Іпзійшціеє, Іпс., Уарап)), не здатний до розбухання полістирол (наприклад, Ргітег зиррогі (СЕ НеайвВсаге)), полістирол з приєднаним ПЕГ ланцюгом (наприклад, МНо-ПЕТ смола (Уагапаре Спетісаї! Іпдивілевз, (4., дарап), ТепіаСсе! смола), скло з контрольованим розміром пор (СРО) (наприклад, СРО Іпс.), скло з оксаліл-контрольованим розміром пор (дивіться, наприклад, АїЇш! еї аїЇ., МисіІеіс Асід5 Кезеагсп, Мої. 19, 1527 (1991)), Тепіасе! підложка- амінополіетиленгліколь-деріватізірована підложка (дивіться, наприклад, Умпідні еї аї., с.

Тетрапеайгоп І ецегв5, Мої. 34, 3373 (1993)), та співполімер Рогов - полістирол/дивінілбензол.

ІЇ0054| Як "лінкер, " можливим є використовувати відомий лінкер, який широко використовується для з'єднання нуклеїнової кислоти або морфолінових похідних нуклеїнової кислоти, та приклади включають З-амінопропіл, сукциніл, 2,2- діетанолсульфоніл, та довголанцюговий алкіламіно (І САА). 0055) Дана стадія може виконуватись шляхом взаємодії сполуки (Ії) з кислотою.

ІЇ0056| Приклади "кислоти" прийнятної для застосування на даній стадії включають трифтороцтову кислоту, дихлороцтову кислоту або трихлороцтову кислоту. Кількість кислоти, яка використовується, знаходиться, наприклад, обгрунтовано в діапазоні від 0,1 молярних еквівалентів до 1000 молярних еквівалентів, переважно в діапазоні від 1 молярного еквівалента до 100 молярних еквівалентів, в розрахунку на 1 моль сполуки (І).

Більш того, можливим є використовувати органічний амін разом із зазначеною вище кислотою. Будь-який органічний амін може використовуватись для даної цілі, та приклади включають триетиламін. Кількість органічного аміна, який використовується, знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від, наприклад, 0,01 молярних еквівалентів до 10 молярних еквівалентів, переважно в діапазоні від 0,1 молярних еквівалентів до 2 молярних еквівалентів, в розрахунку на 1 моль кислоти.

І0057| У випадку, коли на даній стадії кислота та органічний амін використовуються у вигляді солі або суміші, приклади включають сіль або суміш трифтороцтової кислоти та триєтиламіну, більш конкретно суміш, яка містить 2 еквіваленти трифтороцтової кислоти та 1 еквівалент триєтиламіну.

Кислота прийнятна для застосування на даній стадії може використовуватись будучи розбавленою відповідним розчинником для отримання концентрації в діапазоні від 0,1 95 до

З0 95. Для даної мети може використовуватись будь-який розчинник, якщо він є інертним до реакції та приклади включають дихлорметан, ацетонітрил, спирти (наприклад, етанол, ізопропанол, трифторетанол), воду або їх суміші. 0058) Температура реакції, зазначеної вище реакції знаходиться, наприклад, переважно в діапазоні від 10 "С до 50 "С, більше переважно в діапазоні від 20 "С до 40 "С, та ще більше переважно в діапазоні від 25 "С до 35 760.

Час реакції може варіювати в залежності від виду кислоти, яку використовують, та температури реакції, але, як правило, знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 0,1 хвилини до 24 годин, та переважно в діапазоні від 1 хвилини до 5 годин. 0059) Більш того, після завершення даної стадії, за необхідністю можуть додавати основу, щоб нейтралізувати залишкову кислоту в системі. Будь-яка "основа" може використовуватись для даної цілі та приклади включають діїззопропілетиламін. Така основа може використовуватись будучи розбавленою відповідним розчинником, отримуючи концентрацію в діапазоні від 0,1 95 (06./06.) то 30 95 (06./06.).

Будь-який розчинник може використовуватись на даній стадії, якщо він є інертним до реакції, та приклади включають дихлорметан, ацетонітрил, спирти (наприклад, етанол, ізопропанол, трифторетанол), воду або їх суміші. Температура реакції знаходиться, наприклад, переважно в діапазоні від 10 "С до 50 "С, більш переважно в діапазоні від 20 "С до 40 "С, та ще більше переважно в діапазоні від 25 "С до 35 760.

Час реакції буде варіювати в залежності від виду основи, яку використовують та/або температури реакції, але, як правило, знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 0,1 хвилини до 24 годин, та переважно в діапазоні від 1 хвилини до 5 годин.

І0О60| Слід зазначити, що сполука (Ії), в якій п-1 та Ї представляє собою групу (ІМ), тобто, сполука, представлена наступною загальною формулою (Па) (далі в даному документі називається як сполука (Іа)), може бути отримана відповідно до наступних процедур:

ІФормула 10) нене ф-т ро

І

(на) т

Іпричому ВЕ, Т, Лінкер та Твердий носій є такими самими як визначено вище|.

І0О61) Стадія 1:

Це стадія, на якій сполуку, представлена наступною загальною формулою (М), піддають взаємодії з ацилюючим агентом, отримуючи сполуку, представлену наступною загальною формулою (МІ) (далі в даному документі називається як сполука (М1І)):

ІФормула 11) он ве--(лінкев|--о

Р Р щ г о. .в

С --- С т ї

Т Т

(м (МІ)

Іпричому ВЕР, Т та Лінкер є такими самими як визначено вище; та

В" представляє собою гідроксильну групу, галоген або аміно).

І0062| Дана стадія може бути здійснена виходячи зі сполуки (М) за будь-якою відомою реакцією щодо введення лінкера.

Зокрема, сполуку, представлену наступною загальною формулою (Міа), можуть отримувати за будь-яким способом, відомим як реакція етерифікації з використанням сполуки (М) та бурштинового ангідриду:

ІФормула 12)

І

(УІа)

Іпричому ВЕ та Т є такими самими як визначено вище).

І0О63) Стадія 2:

Це стадія, на якій сполука (МІ) взаємодіє з твердим носієм за рахунок обробки конденсуючим агентом або подібним, отримуючи сполуку (Па):

ІФормула 13) ке-(лінкер|--о о чу" С й вай - «6 565 53 2 А - 52-- й ЩІ т . т «МІ Іа

Іпричому В", ВУ, Т, Лінкер та Твердий носій є такими самими як визначено вищеї.

Дана стадія може виконуватись за будь-яким способом відомим як реакція конденсації з використанням сполуки (МІ) та твердого носія.

І0064| Сполука (І), в якій п - від 2 до 99, та Ї являє собою групу (ІМ), тобто, сполука, представлена наступною загальною формулою (ІПаг), може бути отримана, виходячи зі сполуки (Па) за рахунок повторення бажаних стадій А та В способу отримання РМО, розкритого в даному документі:

Зо ІФормула 14)

о щу паї а що о

Е Е

0 "Є ту й «ІїЇаг) 7

Іпричому В", НВ, ВУ, Т, Лінкер та Твердий носій є такими самими як визначено вище; та п" дорівнює від 1 до 981. 0065) Аналогічним чином, сполука (ІІ), в якій п-1, та Ї представляє собою водень, тобто, сполука представлена наступною загальною формулою (ІІБ) може бути отримана, наприклад, за процедурами, описаними в М/01991/009033:

ІФормула 15) он у і т (1)

Іпричому ВЕ та Т є такими самими як визначено вище). 0066) Сполука (ІІ), в якій п - від 2 до 99, та Ї представляє собою водень, тобто, сполука, представлена наступною загальною формулою (162) може бути отримана, виходячи зі сполуки (ІБ) за рахунок повторення бажаних стадій А та В способу отримання РМО, розкритого в даному документі:

ІФормула 16)

Н о у

М

Вл 7М-Р о о п Ви їй 5 (11Ь2)

Іпричому ВЕ", п", В2, ВЗ та Т є такими самими як визначено вище).

І0067| Аналогічним чином, сполука (І), в якій п-1, та Ї представляє собою ацил, тобто, сполука, представлена наступною загальною формулою (Іс), може бути отримана зі сполуки (ПІБ) за будь-яким способом, відомим як реакція ацилювання: 20 ІФормула 17)

о

БУ о у ве

М і т (Т1Іс)

Іпричому ВЕ та Т є такими самими як визначено вище; та

В? представляє собою ацилі. 0068) Сполука (ІІ), в якій п - від 2 до 99, та Ї представляє собою ацил, тобто, сполука, представлена наступною загальною формулою (ІІс2), може бути отримана виходячи зі сполуки (Пс) за рахунок повторення бажаних стадій А та В способу отримання РМО, розкритого в даному документі:

ІФормула 18)

Во. о; у

М

В І

-2М-р о т о Со. ве . п у і що ; Т (ТІ с2)

Іпричому ВЕ, п", Н2г, ВУ, В? та Т є такими самими як визначено вищеї|. 0069) (2) Стадія В:

Це стадія, на якій сполуку (ІІІ) піддають взаємодії з морфоліновою мономерною сполукою в присутності основи, отримуючи сполуку, представлену наступною загальною формулою (МІЇ) (далі в даному документі називається як сполука (МІЇ)):

ІФормула 19)

І о І (8) о. ОВ О.В

Т морфопінова мономарна спопука Т

М я лоріОСМ й ен-я о ден о т о М о. ве о «о. в "У ЩІ й. ве (1111 Н 7М-5-о

І т о ни

ІІІ М і

Іпричому кожен ВЕ, І, п, В-, ВЗ та Т є такими самими як визначено вище).

І0070| Дана стадія може виконуватись шляхом взаємодії сполуки (ІІ) з морфоліновою мономерною сполукою в присутності основи.

ІЇ0071| Така морфолінова мономерна сполука може бути проілюстрованим сполукою, представленою наступною загальною формулою (МІП):

ІФормула 20) ват

М-во в г у в'

М

І т (МІІ1)

Іпричому В", В, ВЗ та Т є такими самими як визначено вище).

Приклади "основи", прийнятної для застосування на даній стадії включають діізопропілетиламін, триетиламін або М-етилморфолін. Кількість основи, яку використовують, знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 1 молярного еквівалента до 1000 молярних еквівалентів, переважно в діапазоні від 10 молярних еквівалентів до 100 молярних еквівалентів, в розрахунку на 1 моль сполуки (1).

І0072| Така морфолінова мономерна сполука та основа, прийнятна для застосування на даній стадії може використовуватись, будучи розбавленою відповідним розчинником, отримуючи концентрацію від 0,1 9о до 30 95. Будь-який розчинник може використовуватись для даної цілі, якщо він є інертним до реакції, та приклади включають М, М-диметилімідазолідон, М- метилпіперидон, ДМФ, дихлорметан, ацетонітрил, тетрагідрофуран, або їх суміші.

І0073| Температура реакції знаходиться, наприклад, переважно в діапазоні від 0 "С до 100 "С, та більше переважно в діапазоні від 10 "С до 50 "С.

Час реакції буде варіюватися в залежності від типу основи, яку використовують, та/або температури реакції, але, як правило, знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 1 хвилини до 48 годин, та переважно в діапазоні від 30 хвилин до 24 годин. 00741 Крім того, після завершення даної стадії, можуть додавати ацилюючий агент, якщо це необхідно. Приклади "ацилюючого агента" включають оцтовий ангідрид, ацетилхлорид та феноксіоцтовий ангідрид. Такий ацилюючий агент може використовуватись будучи розбавленим відповідним розчинником, отримуючи концентрацію в діапазоні від 0,1 95 до 30 Об, як приклад. Будь-який розчинник може використовуватись для даної цілі якщо він є інертним до реакції, та приклади включають дихлорметан, ацетонітрил, спирти (наприклад, етанол, ізопропанол, трифторетанол), воду або їх суміші.

За необхідності можливим є використовувати основу (наприклад, піридин, лютидин, колідин, триетиламін, діїзопропілетиламін, М-етилморфолін) разом із адилюючим агентом.

Кількість адилюючого агента, яка використовується, знаходиться переважно в діапазоні від 0,1 молярних еквівалентів до 10000 молярних еквівалентів, та більше переважно в діапазоні від 1 молярного еквівалента до 1000 молярних еквівалентів. Кількість основи, яку використовують, знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 0,1 молярних еквівалентів до 100 молярних еквівалентів, переважно в діапазоні від 1 молярного еквівалента до 10 молярних еквівалентів, в розрахунку на 1 моль ацилюючого агента.

Температура реакції в даній реакції переважно знаходиться в діапазоні від 10 "С до 50 С, більш переважно в діапазоні від 10 "С до 50 "С, ще більш переважно в діапазоні від 20 "С до 40 "С, та все ще більше переважно в діапазоні від 25 "С до 35 "С. Час реакції буде варіювати, наприклад, в залежності типу адцилюючого агента, який використовується та/або температури реакції, але, як правило, знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 0,1 хвилин до 24 годин, та переважно в діапазоні від 1 хвилини до 5 годин. 0075) (3) Стадія С:

Це стадія, на якій агент для зняття захисних груп використовують для видалення захисних груп зі сполуки (МІ), отриманої на Стадії В, таким чином, одержуючи сполуку, представлену загальною формулою (ІХ):

ІФормула 21) рено Ї н-З52 і

С сло Ве | | М «Основа : М-в--й Ї Мер пенні і ве 0 і С ке ва З й й С о бсвнова це Й ій т о -в че з ц м ж М. м ко

Іпричому Основа, ВР, І, п, Ве, ВЗ та Т є такими самими як визначено вище).

ІЇ0076| Дана стадія може виконуватись шляхом взаємодії сполуки (МІЇ) з агентом зняття захисту.

І0077| Приклади "агента для зняття захисних груп" включають концентрований водний аміак та метиламін. Такий "агент для зняття захисних груп", прийнятний для застосування на даній стадії може використовуватись, будучи розбавленим водою, метанолом, етанолом, ізопропіловим спиртом, ацетонітрилом, тетрагідрофураном, ДМФ, М, М-диметилімідазолідоном,

М-метилпіперидоном, або його змішаним розчинником. Серед них, переважним є етанол.

Кількість агента для зняття захисних груп, яку використовують, знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 1 молярного еквівалента до 100000 молярних еквівалентів, переважно в діапазоні від 10 молярних еквівалентів до 1000 молярних еквівалентів, в розрахунку на 1 моль сполуки (МІЇ), як приклад. 0078) Температура реакції знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 15 "С до 75 "С, переважно в діапазоні від 40 "С до 70 "С, та більше переважно в діапазоні від 50 "С до 60 "с.

Час реакції зняття захисту буде варіювати в залежності від типу сполуки (МІ) та/або температури реакції, тощо, але знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 10 хвилин до 30 годин, переважно в діапазоні від 30 хвилин до 24 годин, та більше переважно в діапазоні від 5 годин до 20 годин. 00791 (4) Стадія 0:

Це стадія, на якій сполуку (ІХ), одержану на стадії С, обробляють кислотою для одержання

РМО (І):

ІФормула 22) т в о : й щі З. «Основа : н о й й її Е си ибеснова бод-в нш ва М що ко пе ви Основа І й ваш що ! шт а ів зи у Основа -к т й І

ТЕЗ М

Іпричому Основа, п, Р, ВЗ та Т є такими самими як визначено вище). 0080) Дана стадія може виконуватись шляхом додавання кислоти до сполуки (ІХ).

І0081| Приклади "кислоти", прийнятної для застосування на даній стадії включають трихлороцтову кислоту, дихлороцтову кислоту, оцтову кислоту, фосфорну кислоту та

Зо гідрохлоридну кислоту, тощо. Стосовно кількості кислоти, яка використовується, прийнятним є використовувати кислоту в кількості, щоб отримати рН розчину, наприклад, в діапазоні від 0,1 до 4,0, більш переважно в діапазоні від 1,0 до 3,0. Будь-який розчинник може використовуватись на даній стадії, якщо він є інертним до реакції, та приклади включають ацетонітрил, воду, або суміш даних розчинників.

І0082| Температура реакції переважно знаходиться в діапазоні від 10 "С до 50 "С, більше переважно в діапазоні від 20 "С до 40 "С, та ще більше переважно в діапазоні від 25 "С до 35 "С. Час реакції зняття захисту буде варіювати в залежності від типу сполуки (ІХ) та/або температури реакції, тощо, але прийнятно знаходиться в діапазоні від 0,1 хвилини до 5 годин, переважно в діапазоні від 1 хвилини до 1 години, та більше переважно в діапазоні від 1 хвилини до 30 хвилин.

Ї0ОО83| РМО (І) може бути отриманим з реакційної суміші, отриманої на даній стадії шляхом звичайно використовуваних засобів розділення та очищення, включаючи екстракцію, концентрування, нейтралізацію, фільтрування, центрифужне розділення, перекристалізацію, хроматографію з оберненою фазою на колонці від Св до Сів, катіонообмінну колоночночну хроматографію, аніонообмінну колоночночну хроматографію, гель-фільтраційну колоночночну хроматографію, високо-ефективну рідинну хроматографію, діаліз, ультрафільтрацію та інші засоби, які можуть використовуватись або самостійно або в комбінації, при цьому бажаний РМО (І) може бути виділений та очищений (дивіться, наприклад, М/О1991/09033).

У випадку застосування хроматографії зі зворотною фазою для очистки РМО (І), як приклад, може використовуватись змішаний розчин 20 мМ триєетиламін/ацетатний буфер та ацетонітрил як розчинник для елюювання.

Аналогічним чином, у випадку застосування іонообмінної хроматографії для очистки РМО (І), як приклад, може використовуватись змішаний розчин 1 М водного розчину хлориду натрію та 10 мМ водного розчину натрію гідроксиду.

ІЇ0084| Зазначений вище олігомер пептидної нуклеїнової кислоти представляє собою олігомер відповідно до представленого винаходу, складова частина якого являє собою групу, представлену наступною загальною формулою:

ІФормула 23)

Основа пе о у- о (причому Основа є такою самою, як визначено вище).

Пептидні нуклеїнові кислоти можуть бути отримані, наприклад, відповідно до документів, наведених нижче. 1) Р. Е. Мівівзеп, М. Едпо!т, В. Н. Вего, О. Виснагаї, бсіепсе, 254, 1497 (1991) 2) М. Еапо!т, 0. Виспагаї, Р. Е. Мів!Ізеп, В. Н. Вега, дасв., 114, 1895 (1992) 3) К. . Юепоїт, М. Едпоїт, С. Вейгепв, Ї. СНгібвіепзеп, Н. ЕР. Напзеп, Т. Миїріив5, К. Н.

Реїегзеп, В. Н. Вего, Р. Е. Мівівеп, О. ВисНагаї, 9. Огу. Снпет., 59, 5767 (1994) 4) У. Спгівіепзеп, В. Ейграїгіск, В. сіїаєа, К. Н. Реїегзеп, Н. РЕ. Напзеп, Т. Косі, М. Едпо!т, 0.

Виснагаї, Р. Е. Мієївзеп, У). Соції, В. Н. Вего, . Рері. 5сі., 1, 175 (1995) 5) Т. Кос, Н. Е. Напзеп, Р. Апаегзеп, Т. І агзеп, Н. а. Ваїг, К. ОНезоп, Н. Огит, у. Рері. Вев., 49, 80 (1997) 0085) Крім того, олігомер за представленим винаходом може бути сконфігурований таким чином, що його 5'--ермінальний кінець являє собою будь-яку одну з груп, представлених хімічними формулами (1) - (3), показаними нижче, причому переважною є (3) -ОН.

ІФормула 24) 0. (о)

М Ой

Сі сн

М сн. М З

І З і «СНУ

Охр-М ОБР ен

Фо Ян

Б (1) (2) (3)

Групи, представлені зазначеними вище формулами (1), (2) та (3) далі в даному документі називається як "група (1)," "група (2) та " група (3)," відповідно. (0086) 2. Фармацевтична композиція

Олігомер за представленим винаходом дозволяє пропуск екзона 45 в гені дистрофіну.

Таким чином, очікується, що симптоми м'язової дистрофії можуть бути полегшені шляхом введення фармацевтичної композиції, яка містить олігомер за представленим винаходом, пацієнтам з ЮОМО, які мають мутацію, націлену через пропуск екзона 45 (тобто, мутація трансформується в рамку зчитування шляхом пропуску екзона 45) в їх гені дистрофіну. Крім того, через його коротку довжину ланцюга, олігомер за представленим винаходом є переважним, оскільки стадії його отримання є простими, та, до того ж, оскільки вартість його отримання може бути знижена.

Таким чином, в іншому варіанті здійснення, представлений винахід передбачає фармацевтичну композицію для м'язової дистрофії, яка містить олігомер за представленим винаходом, його фармацевтично прийнятну сіль або гідрат, як активний інгредієнт (далі в даному документі називається як "композиція за представленим винаходом").

І0087| Приклади фармацевтично прийнятної солі олігомера за представленим винаходом, яка міститься в композиції за представленим винаходом, включають солі лужних металів (наприклад, сіль натрію, сіль калію, сіль літію); солі лужноземельних металів (наприклад, сіль кальцію, сіль магнію); солі металів (наприклад, сіль алюмінію, сіль заліза, сіль цинку, сіль міді, сіль нікелю, сіль кобальту); солі амонію; солі органічних амінів (наприклад, сіль трет-октиламіну, сіль дибензиламіну, сіль морфоліну, сіль глюкозаміну, сіль алкілового складного ефіру фенілгліцину, сіль етилендіаміну, сіль М-метилтлюкаміну, сіль гуанідину, діетиламінову сіль, триетиламінову сіль, дициклогексиламінову сіль, М, М'-дибензилметилендіамінову сіль, хлорпрокаїнову сіль, прокаїнову сіль, діетаноламінову сіль, М-бензилфенетиламінову сіль, піперазинову сіль, тетраметиламонійну сіль, три(гідроксиметил)амінометан сіль); солі галогенованої гідрокислоти (наприклад, гідрофторидну сіль, гідрохлоридну сіль, гідробромідну сіль, гідройодидну сіль); солі неорганічної кислоти (тобто, нітратну сіль, перхлоратну сіль, сульфатну сіль, фосфатну сіль); солі нижчих алкансульфонових кислот (наприклад, метансульфонатну сіль, трифторметансульфонатну сіль, етансульфонатну сіль); солі арилсульфонових кислот (наприклад, бензолсульфонатну сіль, п-толуолсульфонатну сіль); солі органічних кислот (наприклад, ацетатну сіль, малатну сіль, фумаратну сіль, сукцинатну сіль, цитратну сіль, тартратну сіль, оксалатну сіль, малеатну сіль); амінокислотні солі (наприклад,

Зо гліцинову сіль, лізинову сіль, аргінінову сіль, орнітинову сіль, глутаматну сіль, аспартатну сіль), тощо. Дані солі можуть бути отримані за будь-яким відомим способом. Альтернативно, олігомер за представленим винаходом, який міститься в композиції за представленим винаходом, може знаходитись в формі свого гідрату. (0088| Композиція за представленим винаходом може вводитись в будь-якому фармацевтично прийнятному режимі, який може бути вибраний відповідно до запланованого терапевтичного способу. Однак, з точки зору легкої доставки до м'язової тканини, переважним є внутрішньовенне введення, внутрішньоартеріальне введення, внутрішньом'язове введення, підшкірне введення, пероральне введення, інтерстиціальне введення, крізшкірне введення і так далі. Крім того, композиція за представленим винаходом може бути в будь-якій дозованій формі, та приклади включають різні типи ін'єкцій, пероральні композиції, краплі, інгалятори, мазі, лосьйони, тощо.

ІЇ0089| У випадку, коли олігомер за представленим винаходом вводиться пацієнтам з м'язовою дистрофією, композиція за представленим винаходом переважно містить носій, який сприяє доставці олігомера до м'язової тканини. Такий носій не обмежується будь-яким способом, оскільки він є фармацевтично прийнятним, та приклади включають катіонні носії (наприклад, катіонні ліпосоми, катіонні полімери) або носії, які використовують вірусну оболонку.

Приклади катіонних ліпосом включають ліпосоми, утворені З 2-0-(2- діетиламіноетил)карбамоїлом-1,3-О-діолеоїлгліцерину та фосфоліпіду, як основних складових компонентів (далі в даному документі називається як "ліпосома А"), Олігофектамін? (Іпмігодеп), Ліпофектин" (Іпимігодеп), Ліпофектамін" (Іпмігодеп), Ліпофектамін 20002 (Іпмігодеп), ОМАЇЕ-С? (Іпийгодеп), Сепебіїєпсе!? (Сепе Тпегару бузієтв), ТгапеМеззепде!? (ОІАСЕМ), ТгапвІіТ ТКО? (Мігиб5) та Мисіеотесіог ІІ (опа). Серед інших, переважною є ліпосома А. Приклади катіонних полімерів включають єї" (ОБбіодепе) та де-РЕЇ!" (поліетиленімін, Обіодепе). Приклади носіїв з використанням вірусної оболонки включають СепотеОпе" (НМО-Е ліпосоми, Ізпіпага Запдуо

Каїзпа, Ца., дарап). Альтернативно, можливим також є використовувати фармацевтичний пристрій, показаний в Японському патенті Мо 2924179, або катіонні носії, показані в ОР

УМО2006/129594 та Р ММО2008/096690. 0090) Концентрація олігомера за представленим винаходом, який міститься в композиції за представленим винаходом, буде варіювати в залежності від виду носія, але знаходиться, 60 відповідним чином, в діапазоні від 0,1 нМ до 100 мкМ, переважно в діапазоні - від 1 нМ до 10

МКМ, та більш переважно в діапазоні - від 10 НМ до 1 мкМ. Аналогічним чином, масове співвідношення носія до олігомера за представленим винаходом, який міститься в композиції за представленим винаходом (тобто, співвідношення носій/олігомер) буде варіювати, наприклад, в залежності від властивостей олігомеру, типу носія, але знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 0,1 до 100, переважно в діапазоні від 1 до 50, та більше переважно в діапазоні від до 20.

ЇО091| Композиція за представленим винаходом може необов'язково містити фармацевтично прийнятну добавку, на додаток до олігомера за представленим винаходом та носія, описаного вище. Приклади таких добавки включають емульгуючі допоміжні речовини 10 (наприклад, жирну кислоту, яка містить від б до 22 атомів вуглецю або її фармацевтично прийнятні солі, альбумін та декстран), стабілізуючий агент (наприклад, холестерин та фосфатидну кислоту), ізотонічний агент (наприклад, натрію хлорид, глюкозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу), та рН контролюючий агент (наприклад, гідрохлоридну кислоту, сірчану кислоту, фосфорну кислоту, оцтову кислоту, натрію гідроксид, калію гідроксид, триетаноламін).

Дані добавки можуть використовуватись або самостійно або в комбінації. Вміст добавки/добавок в композиції за представленим винаходом становить, відповідним чином, 90 95 за масою або менше, переважно 70 95 за масою або менше, та більш переважно 50 95 за масою або менше.

І0092| Композиція за представленим винаходом може бути отримана шляхом додавання олігомера за представленим винаходом до дисперсії носія, з наступним достатнім перемішуванням. Добавка(и) тау можуть бути додані на будь-якій відповідній стадії або перед або після додавання олігомера за представленим винаходом. Будь-який водний розчинник може використовуватись для додавання олігомера за представленим винаходом за умови, що він є фармацевтично прийнятним, та приклади включають воду для ін'єкцій, дистильовану воду для ін'єкцій, електролітні розчини (наприклад, фізіологічний сольовий розчин), та розчини цукрів (наприклад, глюкозний розчин, мальтозний розчин). Більш того, в даному випадку, кваліфікований фахівець в даній галузі може, відповідним чином, вибрати умови, включаючи рн та температуру.

І0093| Композиція за представленим винаходом може бути сформульована як приклад, у

Зо вигляді розчину або його ліофілізованого препарату. Такий ліофілізований препарат може бути отриманий за стандартним способом за рахунок висушування при заморозці композиції за представленим винаходом в рідкій формі. Наприклад, композиція за представленим винаходом у вигляді розчину може бути стерилізованою відповідним чином, та потім дозується в заданих кількостях у флакони, з наступним попереднім заморожуванням в умовах від приблизно -40 "С до -20 "С протягом приблизно 2 годин, первинним висушуванням при від приблизно 0 "С до 10 "С при зниженому тиску та потім здійснення вторинного висушування при приблизно 15 "С о 25"С при зниженому тиску. Більш того, в більшості випадків, флакони можуть продуватися газом-азотом та потім закупорюватися, таким чином, отримуючи ліофілізований препарат композиції за представленим винаходом.

І0094| Такий ліофілізований препарат композиції за представленим винаходом може, як правило, використовуватись після відновлення шляхом додавання будь-якого прийнятного розчину (тобто, розчину для відновлення). Приклади такого розчину для відновлення включають воду для ін'єкції, фізіологічний сольовий розчин, та інші загальновикористовувані інфузійні розчини. Об'єм такого розчину для відновлення буде варіювати, наприклад, в залежності від призначеного застосування та не обмежується будь-яким чином, але, відповідним чином, становить від 0,5- до 2-разів більше, ніж об'єм розчину перед ліофілізацією, або 500 мл або менше. 0095) Доза для введення композиції за представленим винаходом за потреби регулюється з урахуванням типу олігомера за представленим винаходом, який міститься в ній, передбачуваної лікарської форми, стану пацієнта, такого як вік та маса тіла, способу введення, та природи та тяжкості захворювання. Однак, добова доза для дорослих, як правило, знаходиться в діапазоні від 0,1 мг до 10 г/людина, переважно в діапазоні від 1 мг до 1 г/людина, розрахована на кількість олігомера за представленим винаходом. Даний числовий діапазон може варіюватися в залежності від типу захворювання, що підлягає лікуванню, способу введення, та/або типу молекули-мішені. Таким чином, доза нижче, ніж даний діапазон, може бути достатньою в деяких випадках, та, навпаки, в деяких випадках необхідною може бути доза вища, ніж діапазон. Більш того, композиція за представленим винаходом може вводитись від одного до декількох разів на день або з інтервалом від одного дня до декількох днів.

І0096| В іншому варіанті здійснення, композиція за представленим винаходом може бо представляти собою фармацевтичну композицію, яка містить вектор, здатний експресувати олігонуклеотид за представленим винаходом, та носій, як описано вище. Такий вектор експресії може бути здатним експресувати множину олігонуклеотидів відповідно до представленого винаходу. Така композиція може необов'язково включати фармацевтично прийнятну добавку, як у випадку композиції за представленим винаходом, яка містить олігомер за представленим винаходом. Концентрація вектора експресії, який міститься в даній композиції буде варіювати, наприклад, в залежності від типу носія, але знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 0,1

НМ до 100 мкМ, переважно в діапазоні від 1 1 нМ до 10 мкМ, та більше переважно в діапазоні від 10 нМ до 1 мкМ. Масове співвідношення носія до вектора експресії, який міститься в даній композиції (тобто, співвідношення носій/вектор експресії) буде варіювати, наприклад, в залежності від властивостей вектора експресії та типу носія, але знаходиться, відповідним чином, в діапазоні від 0,1 до 100, переважно в діапазоні від 1 до 50, та більше переважно в діапазоні від 10 до 20. Більш того, вміст носія, який міститься в даній композиції є таким самим як у випадку з композицією за представленим винаходом, яка містить олігомер за представленим винаходом, та спосіб її отримання також є таким самим, як у випадку з композицією за представленим винаходом.

І0097| Представлений винахід далі буде описаний більш детально з посиланням на ілюстративні приклади та приклади дослідження, зазначені нижче, але не слід вважати, що винахід обмежується ними.

ПРИКЛАДИ

(0098) (Порівняльний приклад 11) 4-Д(25,68)-6-(4-Бензамідо-2-оксопіримідин-1-іл)-4-тритилморфолін-2-іл|метоксі)-4- оксобутанова кислота, завантажена на амінополістирольну смолу

ЇО099| Стадія 1: Отримання /-4-((25,68)-6-(4-бензамідо-2-оксопіримідин-1(2Н)-іл)-4- тритилморфолін-2-іл|метоксі)-4-оксобутанової кислоти

В атмосфері аргону, М-1-К2В8, 65)-6-(гідроксиметил)-4-тритилморфолін-2-іл|-2-оксо-1,2- дигідропіримидин-4-іл)убензаміду (3,44 г) та 4-диметиламінопіридину (4-ОМАР) (1,1. г) суспендували в дихлорметані (50 мл), та потім до суспензії додавали бурштиновий ангідрид (0,90 г), з наступним перемішуванням при кімнатній температурі протягом З годин. Реакційний розчин перемішували з метанолом (10 мл), та концентрували при зниженому тиску. Залишок

Зо екстрагували, використовуючи етилацетат та 0,5 М водний розчин дигідрофосфату калію.

Отриманий в результаті органічний шар промивали послідовно 0,5 М водним розчином дигідрофосфату калію, водою та насиченим сольовим розчином в зазначеному порядку.

Отриманий в результаті органічний шар сушили над сульфатом натрію та концентрували при зниженому тиску, отримуючи 4,0 г бажаного продукту.

ІО1О0)І Стадія 2: Отримання 4-(25,68)-6-(4-бензамідо-2-оксопіримідин-1-іл)-4- тритилморфолін-2-іл|метоксі)-4-оксобутанової кислоти, завантаженої на амінополістирольну смолу.

А-(25,68)-6-(4-Бензамідо-2-оксопіримідин-1 (2Н)-іл)-4-тритилморфолін-2-іл|метокси)-4- оксобутанову кислоту (4.0 г) розчиняли в піридині (безводного) (200 мл), з наступним додаванням 4-ЮОМАР (0,73 г) та 1-етил-3-(З-диметиламінопропіл)карбодіїміду гідрохлориду (11,5 г). Потім, амінополістирольну смолу первинної підложки 200 аміно (ЗЕ Неайрсаге дарап, 17- 5214-97) (25.0 г) та триєтиламін (8,5 мл) додавали до даної суміші, з наступним перемішуванням при кімнатній температурі протягом 4-х днів. Після завершення реакції, смолу збирали фільтруванням.

Отриману в результаті смолу промивали послідовно піридином, метанолом та дихлорметаном, та потім сушили при зниженому тиску. До отриманої в результаті смоли додавали тетрагідрофуран (безводний) (200 мл), оцтовий ангідрид (15 мл) та 2,6-лютидин (15 мл), з наступним перемішуванням при кімнатній температурі протягом 2 годин. Смолу збирали фільтруванням, промивали послідовно піридином, метанолом та дихлорметаном та потім сушили при зниженому тиску, отримуючи 26,7 г бажаного продукту.

ІО101| Для того, щоб визначити кількість завантаження бажаного продукту, молярну кількість тритилу на грам смоли вимірювали за відомим методом, таким як УФ-поглинання на 409 нм.

Кількість завантаження смоли, як виявилось, становила 129,2 мкмоль/г.

Умови УФ вимірювання

Пристрій: 0О-2910 (Нізасні, | ю., дарап)

Розчинник: метансульфонова кислота

Довжина хвилі: 409 нм є значення: 45000 (0102) (Порівняльний приклад 21

4-((25,68)-6-(5-метил-2,4-діоксопіримідин-1-іл)-4--ритилморфолін-2 -іл| метоксі)-4- оксобутанова кислота завантажена на амінополістирольну смолу

Названу сполуку отримували за таким самим способом, як показано в порівняльному прикладі 1, за винятком того, що М-11-К2А, 65)-6-(«гідроксиметил)-4-тритилморфолін-2-іл|-2-оксо- 1,2-дигідропіримидин-4-іл)бензамід, використовуваний на стадії 1 порівняльного приклада 1 був замінений на даній стадії на 1-М28, 65)-6-(гідроксиметил)-4-тритилморфолін-2-іл|-5- метилпіримідин-2,А(1Н, ЗН)-діон.

Для того, щоб визначити кількість завантаження бажаного продукту, молярну кількість тритилу на грам смоли вимірювали за відомим методом, таким як УФ-поглинання на 409 нм.

Кількість завантаження смоли, як виявилось, становила 164,0 мкмоль/г. 0103) (Порівняльний приклад З) 4-Д(25,68)-6-(6-бензамідопурин-9-іл)-4--ритилморфолін-2-іл|метоксі)-4-оксобутанова кислота, завантажена на амінополістирольну смолу

Названу сполуку отримували за таким самим способом, як показано в порівняльному прикладі 1, за винятком того, що М-11-К2А, 65)-6-(«гідроксиметил)-4-тритилморфолін-2-іл|-2-оксо- 1,2-дигідропіримидин-4-іл)бензамід, використовуваний на стадії 1 порівняльного приклада 1 був замінений на даній стадії на М-9-(28, 65)-6-(гідроксиметил)-4-тритилморфолін-2-іл|пурин-6- іл)бензамід.

Кількість завантаження смоли, як виявилось, становила 185,7 мкмоль/г. (0104) (Порівняльний приклад 4) 4-Ц25,68)-6-16-(2-Ціаноетоксі)-2-К(2-феноксіацетил)аміно|пурин-9-ілу-4-тритилморфолін-2- іл)уметокси)-4-оксобутанова кислота, завантажена на амінополістирольну смолу

Названу сполуку отримували за таким самим способом, як показано в порівняльному прикладі 1, за винятком того, що М-11-К2А, 65)-6-(«гідроксиметил)-4-тритилморфолін-2-іл|-2-оксо- 1,2-дигідропіримидин-4-іл)бензамід, використовуваний на стадії 1 порівняльного приклада 1 був замінений на даній стадії она /М-/(6-(2-ціаноетоксі)-9-М2А, 65)-6-(гідроксиметил)-4- тритилморфолін-2-іл|пурин-2-іл).2-феноксіацетамід.

Зо Для того, щоб визначити кількість завантаження бажаного продукту, молярну кількість тритилу на грам смоли вимірювали за відомим методом, таким як УФ-поглинання на 409 нм.

Кількість завантаження смоли, як виявилось, становила 164,8 мкмоль/г.

ІО1051) Відповідно до описів в прикладі 1, показаному нижче, були синтезовані РМО, які мають нуклеотидні послідовності РМО Мо. 1-81, зазначені в таблиці 1 (причому кожен К:2 та КЗ представляє собою метил, та 5'--ермінальний кінець представляє собою групу (3)). Таким чином синтезовані РМО, кожна, були розчинені у воді для ін'єкції (Ої5иКа Рпаптасеціїса! Расіогу,

Іпс., УЧарап).

ІО1О6) (Таблиця 1-1) 6 |птОасСОсСтТОсСсСАТоСТабАсТТоСТ (наб 2-13 21-31...-./:/У/рол 8 |ТоссостТОоСССОсСсСАТоСтТасАсТТС 0 (наб 1-1519-29.4.2;;.:/| | 20 9 |стттоссостасостасАоттостТ 0/0 (наб 2-10 21-32....:/(|Н | 8 ло |САоТТТОосСОсСтТОСсСсСАТоСТОсАсТТоСТ (наб 2-13 20-34...:/ /" | 9

(Таблиця 1-1)

ІО1О71 (Таблиця 1-2) 53 |СТОСТОССАССОоСтТоссСАТСТОТТТТ 0 (наб 85-97 132-144. .-/-:З | 60 59 |ТТТСТОТСТОАСАОСТОСТОССАССОСАСА (Н45 129-143 156-470. | 66 бо |ТССТОССАССОСАСАСАОСАТТОСТОААТТ (На5 69-83 129-143. .-: | 67 61 |ТССТОССАССОСАСАСТОССАТСТОТТТТТ (наб 84-98 129-143..-:/ | 68 62 |ГССТОССАССОСАСАТТТТССТСТАСААТА (Наб5 99-113 129-143. | 69 і 66 |тСстоблсттосТ 77777777 наб 21777777 | З

(Таблиця 1-2)

І 68 |сСТоСТОССАССоСоССастасссААтТ (наб 16-28 132-144. .-:З | 75

А-(25,68)-6-(4-Бензамідо-2-оксопіримідин-1 (2Н)-іл)-4-тритилморфолін-2-іл|метокси)-4- оксобутанову кислоту, завантажена на амінополістирольну смолу (Порівняльний приклад 1), або 4-((25,68)-6-(5-метил-2,4-діоксопіримідин-1-іл)-4А-тритилморфолін-2-іл|метокси)-4- оксобутанова кислота, завантажена на амінополістирольну смолу (Порівняльний приклад 2), або 4-д(25,68)-6-(6-бензамідопурин-9-іл)-4-тритилморфолін-2-іл|метокси)-4-оксобутанова кислота, завантажена на амінополістирольну смолу (Порівняльний приклад 3), або 4-4(25,68)- 6-16-(2-ціаноетоксі)-2-((2-феноксіацетил)аміно|пурин-9-ілу-4--ритилморфолін-2-ілуметокси)-4- оксобутанова кислота, завантажена на амінополістирольну смолу (Порівняльний приклад 4), кожна з яких відповідає 5'--ермінальній основі, була завантажена в кількості 0,2 г в колонку, оснащену фільтром для ініціювання наступних циклів синтезу, використовуючи синтезатор нуклеїнової кислоти (АКТА Оіїдорйої 10 плюс). Для того, щоб отримати нуклеотидну послідовність кожної сполуки, зазначеної в таблиці 1, бажану морфолінову мономерну сполуку додавали в кожен цикл сполучення (дивіться таблицю 2 нижче).

ІО110І

ІТаблиця 21 з неси рон додавали на стадіях З та 4 006 фАцетонтрил/7///777777777777111111111111Ї11111201 11111101 007 Ірозчиндлякепрування.//-:|/ 7 /|Ї77779 11111201 (08 фАцетонтрил.7//7777777771111111111111Ї1111790 11111201 (Примітка) Тільки у випадку 3--термінального ацетилювання, Стадії 1, 2, 7 та 8 здійснювали знову після останнього циклу.

ІО111| Слід зазначити, що використовуваний деблокуючий розчин представляв собою розчин дихлорметану, який містить З 95 (мас./0б.) трифтороцтової кислоти. Використовуваний розчин для нейтралізації / промивання одержували шляхом розчинення М, /М- діізопропілетиламіну в кількості 10 95 (06б./06.) та тетрагідрофурану в кількості 5 95 (об./06.) в розчині дихлорметану, який містить 35 95 (0об./06.) ацетонітрилу. Використовуваний розчин сполучення А одержували шляхом розчинення морфолінової мономерної сполуки в кількості 0,10 М в тетрагідрофурані. Використовуваний розчин сполучення В одержували шляхом розчинення М, М-діїззопропілетиламіну в кількості 20 95 (об./06.) та тетрагідрофурану в кількості 95 (06./06.) в ацетонітрилі. Використовуваний розчин для кепірування одержували шляхом 10 розчинення оцтового ангідрида в кількості 20 95 (06./06.) та 2,б-лютидину в кількості 30 95 (об./06.) в ацетонітрилі.

І0112| Амінополістиролова смола, завантажена за допомогою синтезованого РМО як зазначено вище, збирали з реакційної ємності та сушили при кімнатній температурі протягом 2 годин або довше при зниженому тиску. Висушений РМО, завантажений на амінополістирольну смолу завантажували в реакційну ємність та туди ж додавали 5 мл 28 95 водного аміаку - етанолу (1/4), з наступним перемішуванням при 55 "С протягом 15 годин. Амінополістирольну смолу відокремлювали фільтруванням та промивали 1 мл вода-етанол (1/4). Одержаний в результаті фільтрат концентрували при зниженому тиску. Одержаний в результаті залишок розчиняли в 10 мл змішаного розчинника, який містить 20 мМ оцтової кислоти - триетиламінного буферу (ТЕАА буферу) та ацетонітрил (4/1), та потім фільтрували через мембранний фільтр.

Одержаний в результаті фільтрат чистили, застосовуючи ВЕРХ з оберненою фазою.

Використовувані умови є такими, як зазначено в таблиці З нижче.

ІО11ЗІ

ІТаблиця 3)

СУ: об'єм колонки 0114 Кожну з фракцій аналізували щодо збору бажаного продукту, який потім концентрували при зниженому тиску. Концентрований залишок розбавляли 2 М водною фосфорною кислотою (0,5 мл) та перемішували протягом 15 хвилин. Далі залишок робили

Зо лужним, застосовуючи 2М водний розчин натрію гідроксиду (2 мл) та фільтрували через мембранний фільтр (0,45 мкм).

Одержаний в результаті водний розчин, який містить бажаний продукт, чистили, застосовуючи колонку з аніонообмінною смолою. Використовувані умови є такими, як зазначено в таблиці 4 нижче.

ІО115І

ІТаблиця 41 1 М водний розчин натрію хлориду

ІЇО116Ї Кожну з фракцій аналізували (застосовуючи ВЕРХ) щодо отримання бажаного продукту, у вигляді водного розчину. Одержаний в результаті водний розчин нейтралізували 0,1

М фосфатним буфером (рН 6,0) та потім обезсолювали, застосовуючи ВЕРХ з оберненою фазою в умовах, зазначених в таблиці 5 нижче.

ІО1171

ІТаблиця 5)

ІО118| Бажаний продукт збирали та концентрували при зниженому тиску. Одержаний залишок розчиняли у воді та сушили при заморожуванні, щоб отримати бажану сполуку у вигляді білої флокулентної твердої речовини. Розраховані та виміряні значення ЕБІ-ТОЕ-М5 показані в таблиці 6.

ІО119)І

ІТаблиця 5-1) . . Розраховане Виміряне 6 |ттоссосСтТассАТоСтТосСАстТтоСТ | 8526094. | 852707 Щ 8 |тоссоСтасссассАТоСТтасАстто | 8521,95 | 852198 щ 9 |стттоссостоссстосАсттоСТт | 7897,72 | 789771 9 Щ (0120

Таблиця 6-2) 60 |ТОСТОССАССОСАСАСАССАТТОСТаААТТ | 995745 | 99578 66 |(тостобАсСТТОСТ 77777777 | 422647 | 4226503

І 68 |сСтоСтТоСсАССоСосССастосСссСААТ | 843593 | 843658 4 (О121)

ІТаблиця 6-3) 69 АТТСАСОСТІСССТІССССАСТТасСА | 847993 | 847903 80 тассоСтТасссСАТОСТОСАСТТОС 177 7851,72 | 78521 (

ІТаблиця 6-3) 0122) (Приклад дослідження 1)

Іп міго аналіз

Використовуючи Атаха Сеї І іпе Мисіеоїтесіог КИ І на Мисіеогїесіог ІІ (Гопла), від 1 до 10 мкм антисенсових олігомерів, показаних в таблиці 1, кожен, були трансфіковані з 3,5х105 КО клітин (клітинна лінія рабдоміосаркоми людини). Використовували програму Т-030.

Після трансфекції клітини культивували протягом трьох ночей в умовах при 37 "С та 5 95

Со» в 2 мл мінімального есенціального середовища Ігла (ЕМЕМ) (виробництва компанії БІСМА, далі в даному документі застосовують так само), яке містить 10 95 фетальної телячої сироватки (ЕС5) (Іпмийгкодеп).

Після того, як клітини промивали один раз РВ5 (Міззиці Рпаптасеціїса!5 Со., Ц., Уарап; далі в даному документі те ж саме) та до клітин додавали 350 мкл буфера КІТ (ОІАСЕМ), який містить 1 95 2-меркаптоетанол (Масаїаї Тездие, Іпс., дарап), та після того, як клітинам давали постояти при кімнатній температурі протягом декількох хвилин, клітини лізували. Клітинний лізат збирали в гомогенізаторі ОІА;5пгеадег (ОІАСЕМ) та центрифугували на 15 000 обертах на хвилину протягом 2 хвилин, щоб отримати гомогенат. Загальну РНК екстрагували відповідно до протоколу, що додається до КМеазу Міпі КИ (ОІАСЕМ). Концентрацію екстрагованої загальної

РНК вимірювали з використанням спектрофотометра МапоОгор МО-1000 (І М5 Со., І ю., дарап).

І0123| Одностадійний ОТ-ПЛР проводили з 400 нг екстрагованої загальної РНК, використовуючи набір ОІАСЕМ для одностадійної ОТ-ПЛР (ОІАСЕМ). Реакційний розчин отримували відповідно до протоколу, що додається до набору. Використовувана термокомірка для реакції представляла собою РТС-100 (Му Кезеагсі) або ТаКака ПЛР Тпепгтаї Сусіег Оісе

Тоисп (ТаКага Віо Іпс., харап). ОТ-ПЛР програма, яку використовують, є такою, як наведено далі. 50 "С протягом 30 хвилин: реакція зворотної транскрипції 95"С протягом 15 хвилин: активація полімерази, інактивація зворотної транскриптази, теплова денатурація КкКДНК

І94 "С протягом 30 секунд; 60 "С протягом 30 секунд; 72 "С протягом 1 хвилини)|х35 циклів:

ПЛР ампліфікації

Зо 7270 протягом 10 хвилин: остаточна реакція подовження.

І0124| Нуклеотидні послідовності прямого праймера та зворотного праймера, які використовують для ОТ-ПЛР, є наведеними нижче.

Прямий праймер: 5-4СтСсАсСсатСаасАТТО,аАСАТТ-З3" (ЗЕО ІЮО МО: 1)

Зворотний праймер: 5-2йС(ССААСТОТТОСАССАСТА-3" (5ЕО І МО: 2)

ІЇО125| Зазначений вище продукт ПЛР реакції (1 мкл) аналізували з використанням

Віоапаїугег (Адіеп) та системи МийіМА (Зпітад2и Согрогайоп, Уарап).

Вимірювали рівень полінуклеотиду "А" в смузі з пропуском екзона 45 та рівень полінуклеотиду "В" в смузі без пропуску екзона 45. На основі даних значень вимірювання "А" та "В", ефективність пропуску визначали за наступним рівнянням:

Ефективність пропуску (95) - АЛАЖВ)х100 (0126) Експериментальні результати

Отримані результати є показаними на фігурах 1-5, 8, 10, 11 та 16-24. Даний експеримент показав, що олігомер за представленим винаходом ефективно викликав пропуск екзона 45.

І0127| (Приклад дослідження 2

Іп міго аналіз

Такі самі процедури, як показано в Прикладі дослідження 1 повторювали для того, щоб провести даний експеримент, за виключенням того, що 3,5х105 КО клітин (клітинна лінія рабдоміосаркоми людини) трансфікували з оолігомером за представленим винаходом самостійно (РМО Мо. 11 або РМО Мо. 9) або з будь-яким з двох одиничних олігомерів, які утворюють олігомер за представленим винаходом або з їх сумішшю в концентрації З мкМ через

Мисіеотесіог ЇЇ (Гопла) використовуючи Атаха СеїЇ Гіпе Мисіеоїтесіог КИ Г. Використовували програму Т-030. Комбінації трансфікованих послідовностей є такими як показано нижче.

ІО128І

ІТаблиця 71

Комбінації трансфікованих послідовностей (РМО Мо. 27 та РМО Мо. 28 зв'язані разом) (РМО Мо. 25 та РМО Мо. 26 зв'язані разом)

РМО Мо. 82 та РМО Мо. 83 зв'язані разом

І0129| Експериментальні результати

Отримані результати є показаними на фігурах б та 25. Даний експеримент показав, що олігомер за представленим винаходом, тобто, РМО Мо. 11 (ЗЕО ІЮО МО: 10), РМО Мо. 9 (ЗЕО ІЮ

МО: 8) або РМО Мо. 72 (ЗЕБО ІЮ МО: 79), кожен з яких складається зі зв'язаних двох антисенсових олігомерів, націлених на різні сайти в екзоні 45, викликав пропуск екзона 45 з більш високою ефективністю при порівнянні з відповідними антисенсовими олігомерами, які утворюють кожен олігомер (тобто, РМО Мо. 27 (ЗЕО ІЮ МО: 36), РМО Мо. 28 (ЗЕО ІЮ МО: 37),

РМО Мо. 25 (ЗЕО ІО МО: 34), РМО Мо. 26 (ЗЕО ІО МО: 35), РМО Мо. 82 (ЗЕО ІЮО МО: 144) або

РМО Мо. 83 (5ЕО ІЮ МО: 145)) або їх суміш (тобто, РМО Мо. 27 та РМО Мо. 28, РМО Мо. 25 та

РМО Мо. 26, або РМО Мо. 82 та РМО Мо. 83).

І0130) |Приклад дослідження З)

Іп міго аналіз

Даний експеримент проводився з використанням антисенсових олігомерів в формі 2'-0- метоксифосфоротіоату (2''ОМе-5-ЕМА), показаних в ЗЕО ІЮ МОз5: 89-141, 11 та 12. Дані різні антисенсові олігомери, які використовуються для аналізу, були придбані у дарап Віо бегмісе5

Со., Ца. Послідовності даних різних антисенсових олігомерів є показаними нижче. 01911 (Таблиця 8-1) наб 1-15 48-62 ОССССсАсООаСАООСОССАуССОсСеАСОС | 89 2 щ пКео'г наб 1-15 56-70 ООАОООСООССССАсСосСсСАОССвсАсОЮС | 7790 2 наб 2-13 56-70 ООАОООСООСсСсСАссАОССусСоАвОСсСу | 7796 шщж жі" наб 2-13 139-153 (ООО0САбАССОССОССАОССусСвАвООССсу | 798 2 6щ КЗ наб 1-17 135-147 САССОССООССАСАЦОСсСАОССссАсИОС | 7799 2 6щж КРЗІ

Зо

(Таблиця 8-1)

ІО1З21 (Таблиця 8-2) 0133) В 24-лункових планшетах, 5х107 КО клітин (клітинна лінія рабдоміосаркоми людини) висівали на лунку та культивували протягом ночі в умовах при 37 "С та 595 СО» в 0,5 мл мінімального есенціального середовища Ігла (ЕМЕМ) (виробництва компанії 5ІОМА, далі в даному документі застосовують так само), яке містить 10 95 фетальної телячої сироватки (ЕС5) (Іпмігодеп). Зазначені вище різні антисенсові олігомери для пропуску екзона 45 (дарап Віо

Зегмісе5 Со., Ма., дарап) (1 мкМ або 300 нМ) були сформовані в кон'югати з ліпофектамін 2000 (Іпмігодеп), та кожен кон'югат додавали до клітин КО, який був заміщений в 0,45 мл свіжого середовища, в об'ємі 50 мкл на лунку для отримання кінцевої концентрації 100 нМ або 30 нМ.

Після додавання клітини культивували протягом ночі. Після того, як клітини були один раз промиті РВЗ (Міззиці Рпаптпасешіса!5 Со., Ч., дарап; далі в даному документі застосовують так само), 350 мкл буферу КІТ (ОІАСЕМ), який містить 1 95 2-меркаптоетанолу (Масаїаі Тездие,

Іпс., Чарап) додавали до клітин, та після того, як клітинам давали постояти при кімнатній температурі протягом декількох хвилин, клітини лізували. Клітинний лізат збирали в гомогенізаторі ОІА5пгедаег (ОІАСЕМ) та центрифугували на 15 000 обертах на хвилину протягом 2 хвилин, щоб отримати гомогенат. Загальну РНК екстрагували відповідно до протоколу, що додається до набору КМеазу Міпі Ки (ОІАСЕМ). Концентрацію екстрагованої загальної РНК вимірювали з використанням спектрофотометра МапоОгор МО-1000 (І М5 Со.,

Га., Чарап).

І0134| Одностадійний ОТ-ПЛР проводили з 400 нг екстрагованої загальної РНК, використовуючи набір ОІАСЕМ для одностадійної ОТ-ПЛР (ОІАСЕМ). Реакційний розчин отримували відповідно до протоколу, що додається до набору. Використовувана термокомірка для реакції представляла собою РТС-100 (Му Кезеагсі) або ТаКака ПЛР Тпепгтаї Сусіег Оісе

ПЛР ампліфікації 7270 протягом 10 хвилин: остаточна реакція подовження.

ІО135| Нуклеотидні послідовності прямого праймера та зворотного праймера, які використовують для ОТ-ПЛР, є наведеними нижче.

Зворотний праймер: 5-Ч4СССААСТОТТОСАССАСТА-3" (5ЕО І МО: 2)

ІЇО136| Зазначений вище продукт ПЛР реакції (1 мкл) аналізували з використанням

Вимірювали рівень полінуклеотиду "А" в смузі з пропуском екзона 45 та рівень полінуклеотиду "В" в смузі без пропуску екзона 45. На основі даних значень вимірювання "А" та "В", визначали ефективність пропуску за наступним рівнянням:

Зо Ефективність пропуску (95) - АЛАЖВ)х100

І0137| Експериментальні результати

Отримані результати є показаними на фігурах 7 та 12-15. Даний експеримент показав, що антисенсовий олігомер за представленим винаходом ефективно викликав пропуск екзона 45.

І0138) |Приклад дослідження 4)

Іп міго аналіз

Такі самі процедури, як показано в Прикладі дослідження 1 повторювали для того, щоб провести даний експеримент, за виключенням того, що 3,5х105 КО клітин (клітинна лінія рабдоміосаркоми людини) трансфікували з оолігомером за представленим винаходом самостійно (РМО Мо. 2, РМО Мо. 31 або РМО Мо. 32) або з будь-яким з двох одиничних олігомерів, які утворюють олігомер за представленим винаходом в концентрації З мкМ або 10

МКМ через Мисіеоїтесіог І (Гопла), використовуючи Атаха СеїЇ Гіпе Мисіеобтесіог КИ І.

Використовували програму Т-030. Комбінації трансфікованих послідовностей є такими як показано нижче.

ІО139І

ІТаблиця 91 трансфекції

РМО Мо. 2 (РМО Мо. 66 та РМО Мо. 67 зв'язані З мкМ або 10 мкм разом)

РМО Мо. 31 (РМО Мо. 63 та РМО Мо. 64 зв'язані З мкМ або 10 мкм разом)

ІТаблиця 91 трансфекції (РМО Мо. 63 та РМО Мо. 65 зв'язані разом)

РМО Мо. 65 З мкМ або 10 мкм (0140) Експериментальні результати

Отримані результати є показаними на фігурі 9. Даний експеримент показав, що олігомер за представленим винаходом, тобто, РМО Мо. 2 (ЗЕО ІЮ МО: 7), РМО Мо. 31 (З5ЕО ІО МО: 11) та

РМО Мо. 32 (5ЕБО ІЮ МО: 12), кожен з яких складається зі зв'язаних двох антисенсових нуклеїнових кислот, націлених на різні сайти в екзоні 45, викликав пропуск екзона 45 з більш високою ефективністю при порівнянні з відповідними антисенсовими нуклеїновими кислотами, які утворюють кожен олігомер (тобто, РМО Мо. 66, РМО Мо. 63, РМО Мо. 64 або РМО Мо. 65).

ПРОМИСЛОВА ПРИДАТНІСТЬ

(0141) Як видно з експериментальних результатів, показаних в прикладах дослідження, олігомер за представленим винаходом, який складається з коротких олігомерів, зв'язаних разом, як виявлено, викликає пропуск екзона 45 в КО клітинах. Таким чином, олігомер за представленим винаходом є дуже корисним в лікування ОМО.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 МІРРОМ 5БНІМУАКО СО., ГТ.

МАТІОМАТ СЕМТЕК ОЕ МЕОВОГОСУ АМО РБУСНІАТВУ

«1205 Антисенсова нуклеїнова кислота «1305 РО248158 «1505 ОР20О15-182145 «1515 2015-09-15 «1605 146 «1705 РагепсІп уегзіоп 3.5

Коо) «2105 1 «2115 20 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 1 дсЕСаддЕс даєєдасаєє 20 «2105 12 «2115 20 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 2 дддсаасесеЕ Ессассадга 20 «2105 з «2115 20 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 з

Басаддаасє ссаддаєддс 20 «2105 4 «2115 23 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 4 чааєдсаасс доаоддаадааа гаа 23 «2105 15 «2115 23

Зо «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 -5 асєсЕдсддед дсаддаддеЕс гдД9с 23 «2105 6 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 6 саєгєєдддсад сддсааасьуд ЕедеЕса 26 «2105 17 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна

«223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 7

ЧФЕЄЕДссоЯсЕ дссЕссвЕдда деЕсссе 26 «2105 8 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 8

ФЧФЕЄЕЕдссудсЕ дссстддадеЕ Ессе 24 «2105 9 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 щ-Бр 95 садеЕсеєдссуд сЕдсссаєсс ЄддададеЕєсся 6)

Зо «2105 10 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 10 садЕседссуд сЕдссстдда деЕссе 26 «2105 11 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 11 вЕСьЕеЕСсСссса ДЯДЕєДдсдссає сстддадеєс 6) «2105 12

«2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна 2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 12 садассессе дссасдссає сстддаднЕс 6) «2105 13 «2115 176 «2125 ДНК «213» Ното взаріепв «4005 13 чаасеЕссадд аєддсаєєсєдда дсадсуддсаа асеЕдсеЕдеЕса даасаєсєдаа Едсааседдад бо чЧаадааасаа сСЕСсСадсааєс сссаааааса даєсєдссадса ссссасадда ааааєссддда 120 адссеЕдааєс ЕдсоддеЕддса чдаваддеЕссдас ааасадседе садасадааа ааадад 176 «2105 14 «2115 26

Зо «2125 ДНК «2135 Штучна 2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 14

Еєдссдсвдс ссасаєсстуд дадсес 26 «2105 15 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна 2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 15 дссдсєдссс асаєссвЕдда ДдДЕССсСЕ 26 «2105 16 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна

«223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 16 ссдсєдссса асдеЕСсстєдда деЕсссе 26 «2105 17 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 17

Еєдссдсвдс ссаєссведда дДдЕССсСЕ 26 «2105 18 «2115 26 «2125 Днк «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 18

ЕЕєдссдсвд ссаєссведда дДдЕССсСЕ 26

Зо «2105 19 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 19

ЕЕгдссдсвд ссЕССтддад Ессе 24 «2105 20 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 2х20

Бдссудсебдсс сдссаєсстуд дадьес 26 «2105 21

«2115 25 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 21 дФЕЄЕЕдссудсЕ дссаєссьдядда адесес 25

«2105 22 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 Д 4Ь22 садЕседссуд сЕдсЕддаде Єссе 24 «2105 23 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 23 асадеЕсєсдсс дсЕСтддаде єссь 24

«2105 24 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна

«2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 24 садессєдссу сЕдссоодадеЕ сссе 24 «2105 25 «2115 23 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота

«4005 125

ФЧФЕЄЕЕдссусЕ дссстддаде сс 23 «2105 26 «2115 -225 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 26 садеЕсєдссд сЕдссуддадеЕ Єссед 25 «2105 527 «2115 -225 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 227 ссдсєдссса аєдсддчадуес ввседе 25 «2105 28 «2115 24

Зо «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 28 садЕседссуд сЕдссстдда дес 24 «2105 29 «2115 23 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 -Рюш9 ссдсгЕдссса аєстддадеьЕ ссе 23 «2105 з0 «2115 -225 «2125 ДНК «2135 Штучна

«223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 30 садесєсдссд сЕдссссдда дЕссс 25 «2105 31 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 31

Еєдссдсвдс ссасеєддаде Ессе 24 «2105 32 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 32

Еєдссдсвдс ссастддаде Есстьде 26

Зо «2105 33 «2115 22 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 33 асадеЕсєсдсс дсседдадсс сс 22 «2105 34 «2115 12 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 КЩ34

ФдФЕЕЕдссосЕ дес 12 «2105 35

«2115 12 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 35 ссЕддадеєсс се 12 «2105 36 «2115 10 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 36 гЕддадеєсссе 10 «2105 37 «2115 16 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 37 садеЕседссуд седссс 16 «2105 38 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 38

ЕсЕЕсСсссад ЕЄдссаєссят додадес 26 «2105 39 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 39

Ал адассєсствд ссассаєсст ддадиес 26 «2105 40 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 40 дассЕСсСстьдс сассаєсстуд дадеЕс 26 «2105 41 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 41

Ессссадевд содссаєссту дадеес 26 «2105 2472 «2115 26

Зо «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 42 чдассЕСстьдс сдссаєсстуд дадеьеЕс 26 «2105 а43 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 43 сСЕЕСсСссадЕ Едссаєссту дадесс 26 «2105 1144 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна

«223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 44

БЕСсСсссадес дсасаєсстуд дадеес 26 «2105 45 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 45 ссЕССсСтдсса ссдсаєссту дадеЕєс 26 «2105 46 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 46 ассЕСстдсс асссаєсстуд дадсееЕс 26

Зо «2105 47 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 47

ЕЕЕСЕссссс адесаєссту дадьес 26 «2105 48 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 48 дсадассесс Едссаєсстуд дадсееЕс 26 «2105 49

«2115 28 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 49

ВЕС ЕеЕСсСссса ДдЕєЄДдссаєсс Еддаде єс 28 «2105 50 «2115 23 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 Д ьЬ50 ссссадеЕєЄдс аєстддадеьЕ ссе 23 «2105 51 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 КЬ(051

ВЕЕСЕЕССсСсСса ДЕЄДСсСсСсвДдуд ад двсесс 26 «2105 52 «2115 28 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 Д Ь52 сЕЕСсСсссаде єдссаєссту дадессся 28 «2105 53 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 юиЯЮ53 садассеЕссеї дссасеЕссту дадесс 26 «2105 ББа «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 54

ЕдсадассеЕс сеЕдссеЕСсСсту дадьес 26 «2105 55 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 Ь55 сЕДЕссдсад асссаєссту дадссс 26 «2105 56 «2115 26

Зо «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 Ь56

ЕЕгдсадасс Есстддадеє сседка 26 «2105 Б57 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 57 ссЕдссассуд садаєдссає сстддаднеЕс 6) «2105 (58 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна

«223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 ББ58 ассЕСстдсс ассудсеЕєдсесс дсеєдсссаає 6) «2105 59 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 :-юмКМ59

ЕссЕдсадаа гассаєсстуд дадсееЕс 26 «2105 «560 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 мб60 сЕССЕдссас судсеЕддсаєс єдДЕСКЕ 26

Зо «2105 61 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 61 ассЕСстдсс ассудсеЕсьсс сссадеЕєсдса 6) «2105 «(62 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 мб62

ЕддсасєстдЕ ЕЕсСсСаєссту дадеьес 26 «2105 63

«2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 63

ЕсавеЕсєсьес сссадеЕєсст деЕаада 26 «2105 64 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 БМБ4 дсЕЕСсСсаає дссаєсстдуд адеесс 26 «2105 «65 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 Кчю65 ддсЕЕСсСсаа Едссаєсстуд дадсеес 26 «2105 66 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 «66

ЕсЕСЕДдДЕСсСвд асадсесссд ссассдсада 6) «2105 67 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 67

ЕссеЕдссасс дсадададда ЕЄДдстеЕдаацсье 6) «2105 «68 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 68

ЕссеЕдссасс дсадасеЕддс ассЕдеЕсеЕе 6) «2105 69 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 669

ЕссеЕдссасс дсадасєтєвесєс ссдесадаата 6) «2105 70 «2115 15

Зо «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 й70 дссаєсстддад адсеес 15 «2105 71 «2115 15 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 71

ЕЕСЕЕССсССсСса ДЕЄДС 15 «2105 72 «2115 15 «2125 ДНК «2135 Штучна

«223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 ЬьК72 садчассессе дссас 15 «2105 73 «2115 13 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 73

ЕссЕддадьєс ссе 13 «2105 74 «2115 13 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 ЬьК74

ФЧФЕЕЕДдсссЕ дес 13

Зо «2105 75 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 75 сЕССЕдссас сдсдссдсвд сссаає 26 «2105 76 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 /76 асєсаддсеє сссЕЕсссса дДдЕєЄДдса 26 «2105 77

«2115 9 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 177

Еддадессс 9 «2105 78 «2115 8 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 178

Еддадесс 8 «2105 79 «2115 21 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 79 садЕседссуд сседдадевс с 21 «2105 80 «2115 22 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 К«щ80 асадЕссдсс дсеєддадеЕсс се 22 «2105 81 «2115 22 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота

«4005 81

ФЧФЕЄЕЕдссусЕ дссгддадсєс сс 22 «2105 82 «2115 22 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 К"з82 аасадеЕсєвдс сссгддадсєс сс 22 «2105 83 «2115 20 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 83 садЕстдссуд сседдадеЕєс 20 «2105 84

Зо «2115 22 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 "(84 садЕседссуд сЕССЕДдадеЕ ЕС 22 «2105 85 «2115 21 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 "85 аєвЕвЕдссоас єсстдддадеьс с 21 «2105 86 «2115 21 «2125 ДНК «2135 Штучна

БІ

«223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 86 асадеЕсєсдсес дсеЕддадеєсс с 21 «2105 87 «2115 24 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 87

Бдссудсбдсс саєсстддад Ессе 24 «2105 88 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 88

Зо сЕдссассдс адссодссдсс сааєдс 26 «2105 89 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 89 иссссадаид сациасдссац сспиддадаис зо «2105 50 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 КпЛюБ50 пшаццисцис сссаддссац сспиддадаис зо

«2105 191 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 7191 ссиссидсса ссдсадссац ссиддадацс зо «2105 92 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 Б92 ссиссипдсса ссдсасацес пддадациасси зо «2105 93 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна

Зо «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 жМж93 садассиссоа дссассацес пддадациасси зо «2105 94 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 КБ94 иссссадаид сациассацсс пддадаассиа зо «2105 95 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота

«4005 щаЬ95 иасццдсссса диийдссацсс пддадаиссиа зо «2105 96 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 щоб пшаццисцис сссадсацсс пддадаассиа зо «2105 97 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 197 дипидссдси дсссасацсс пддадиацессиа зо «2105 98

Зо «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 2198 иидсадасс пйссидсацсс пддадацссиа зо «2105 59 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 юмЬр 59 дассиассадс сасацдссач сспддадиацс зо «2105 100 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна

«223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 100 сицссссадиа пдсацдссац ссиддадацс зо «2105 101 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 101 иидсадасс пйссипддссац ссиддадаис зо

«2105 102 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна

«2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 102 ишисспдца даацасацсс пддадацсси зо «2105 103 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота

«4005 103 ассиссидсс ассдсецлиси ийссссадацд зо «2105 104 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 104 пшисспдча даацашидсс дсидсссаац зо

«2105 105 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 105 сидисидаса дсидидссац ссиддадаис зо «2105 106 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 106 ддацидсида ашшіиайдссай ссиддадиаис зо «2105 107 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна

Зо «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 107 пшиссцдча даацадссац сспиддадаис зо «2105 108 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 108 садиацдсациа саасацссид дадиацс 26 «2105 109 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота

«4005 109 иаспцесссса диадсацссид дадаис 26 «2105 110 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 110 идааццацйци спидсацссид дадаис 26 «2105 111 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 111 садиацдсациа сааваацдсса пассцпд 26 «2105 112

Зо «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 112 иаспцесссса дицаацдсса пссидд 26 «2105 113 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 113 пдаашиаации спцаацдсса псспдд 26 «2105 114 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна

«223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 114 дсадачисад дсиасацйссад дадиаис 26 «2105 115 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 115 сидссассдс адасацссид дадиацс 26

«2105 116 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна

«2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 116 садассисса дсссацссад дадалис 26 «2105 117 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота

«4005 117 дсадачисад дсааацдсса пссидд 26 «2105 118 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 118 сидссассудс адааацдсса йассцпдд 26

«2105 119 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 119 писаддсцис ссадссдсиауд сссаацй 26 «2105 120 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 120 ассдсадаци саддссдсцад сссаай 26 «2105 121 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна

Зо «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 121 сиссипдссас сдсдссдсеад сссаац 26 «2105 122 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 122 иасаддсицис ссаасаасад пипдесс 26 «2105 123 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота

«4005 123 ассдсадаци садасаасад пицдсс 26 «2105 124 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 124 сиссипдссас сдсасаасад пиацдсс 26 «2105 125 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 125 сипсссаациа пиицисссса дицдса 26 «2105 126

Зо «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 126 ацдисаддсци сссциасссса дицдса 26 «2105 127 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 127 ассдсадаші садциасссса дицдса 26 «2105 128 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна

«223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 128 списссааци шицааштаци псписс 26 «2105 129 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 129 ацдйисаддсци сссаашцацчи псцисс 26

«2105 130 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна

«2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 130 ассдсадаші садаашцлаци ппсцписс 26 «2105 131 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота

«4005 131 сипсссааци пиидацидси даацца 26 «2105 132 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 132 ацдйисаддсци сссдацидси дааша 26

«2105 133 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 133 ассдсадаші саддашидси даашлца 26 «2105 134 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 134 пиасццсссса диддсадцис сидааадацча зо «2105 135 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна

Зо «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 135 садассиссоа дссасадциас сидцоаадача зо «2105 136 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 136 сспидчадаац аспдддадда пшидсидааци зо «2105 137 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота в2

«4005 137 сиддсацсид пипиицидсс дсидсссаац зо «2105 138 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 138 пшисцисссс адайдицдсс дсидсссаац зо «2105 139 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 139 сиддсацсид пиццидссач ссиддадацс зо «2105 140

Зо «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 140 ассиссидсс ассдссиддас айсидацици зо «2105 141 «2115 30 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 141 иишсспидцча даацацициси пссссадалид зо «2105 142 «2115 26 «2125 ДНК «2135 Штучна

«223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 142 садассисса дссаацдсса пассцпд 26 «2105 143 «2115 16 «2125 ДНК «2135 Штучна «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 143 аааавааєсддад аадссе 16 «2105 144 «2115 11 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 144

Зо ссгЕддадессс с 11 «2105 145 «2115 10 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 145 садЕсведссд 10 «2105 146 «2115 11 «2125 ДНК «2135 Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична нуклеїнова кислота «4005 146 асадеЕсєсдсс д 11

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Антисенсовий олігомер з від 14 до 32 основ в довжину, який містить зв'язані два одиничні олігомери, вибрані з групи, яка складається з (а)-(є), показаних нижче, або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат, причому два одиничні олігомери не є суміжними один до одного або не перекриваються один з одним: (а) одиничний олігомер, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності, яка складається з суміжних від 7 до 16 основ, вибраних з нуклеотидної послідовності, розташованої в положеннях від -5 до 15 від 5-термінального кінця екзона 45 в гені дистрофіну людини; (Б) одиничний олігомер, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності, яка складається з суміжних від 7 до 16 основ, вибраних з нуклеотидної послідовності, розташованої в положеннях від 48 до 70 від 5'-т"ермінального кінця екзона 45 в гені дистрофіну людини; (с) одиничний олігомер, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності, яка складається з суміжних від 7 до 16 основ, вибраних з нуклеотидної послідовності, розташованої в положеннях від 128 до 150 від 5'--ермінального кінця екзона 45 в гені дистрофіну людини; (4) одиничний олігомер, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності, яка складається з суміжних від 7 до 16 основ, вибраних з нуклеотидної послідовності, розташованої в положеннях від 15 до 40 від 5'-т"ермінального кінця екзона 45 в гені дистрофіну людини; та (є) одиничний олігомер, який складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної до нуклеотидної послідовності, яка складається з суміжних від 7 до 16 основ, вибраних з нуклеотидної послідовності, розташованої в положеннях від 110 до 125 від 5'--ермінального кінця екзона 45 в гені дистрофіну людини.

2. Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат за п. 1, причому один з двох одиничних олігомерів являє собою (а). Зо 3. Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат за п. 1 або 2, який складається з будь-якої однієї нуклеотидної послідовності, вибраної з групи, яка складається з ЗЕО ІО МО: 7-12, 14-33, 40-52, 57, 64, 65 та 79-86.

4. Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат за будь-яким одним 3 пп. 1-3, який складається з будь-якої однієї нуклеотидної послідовності, вибраної з групи, яка складається з 5ЕО ІО МО: 8, 10, 25, 30, 33, 79 та 80.

5. Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат за будь-яким одним з пп. 1-4, який являє собою олігонуклеотид.

6. Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат за п. 5, причому щонайменше один нуклеотид, який утворює олігонуклеотид, є модифікованим в цукровому фрагменті та/або в фрагменті фосфатного зв'язку.

7. Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат за п. 5 або 6, причому цукровий фрагмент щонайменше одного нуклеотиду, який утворює олігонуклеотид, являє собою рибозу, в якій -«ОН-група в 2'--положенні є заміщеною на будь-яку групу, вибрану з групи, яка складається з ОВ, В, Е'ОВ, 5Н, 5А, МН», МНЕ, МР», М», СМ, Е, СІ, Вг та І (причому В являє собою алкіл або арил, та В" являє собою алкілен).

8. Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат за п. 6 або 7, причому фрагмент фосфатного зв'язку щонайменше одного нуклеотиду, який утворює олігонуклеотид, являє собою будь-яку одну, вибрану з групи, яка складається з фосфоротіоатного зв'язку, фосфородитіоатного зв'язку, алкілфосфонатного зв'язку, фосфороамідатного зв'язку та боранофосфатного зв'язку.

9. Антисенсовий олігомер за будь-яким одним з пп. 1-4, який являє собою морфоліноолігомер або його фармацевтично прийнятну сіль або гідрат.

10. Антисенсовий олігомер за п. 9, який являє собою фосфородіамідатний морфоліноолігомер або його фармацевтично прийнятну сіль або гідрат.

11. Антисенсовий олігомер за п. 4, який являє собою фосфородіамідатний морфоліноолігомер або його фармацевтично прийнятну сіль або гідрат.

12. Антисенсовий олігомер за будь-яким одним з пп. 9-11, 5'-термінальний кінець якого являє собою будь-яку одну з груп, представлених хімічними формулами (1)-(3), показаними нижче, або його фармацевтично прийнятну сіль або гідрат бо ІФормула 25)

й пеСНЬ чай ее М ен ня ДИР, пк шт - З ен ! СН Фо б й он (1) (2) (3)

13. Фармацевтична композиція для лікування м'язової дистрофії, яка містить антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятну сіль або гідрат за будь-яким одним з пп. 1-12 як активний інгредієнт.

14. Фармацевтична композиція за п. 13, яка додатково містить фармацевтично прийнятний носій.

15. Спосіб лікування м'язової дистрофії, який включає стадію введення пацієнту з м'язовою дистрофією антисенсового олігомеру або його фармацевтично прийнятної солі або гідрату за будь-яким одним з пп. 1-12 або фармацевтичної композиції за п. 13 або 14.

16. Спосіб лікування за п. 15, в якому пацієнт з м'язовою дистрофією являє собою пацієнта, який має мутацію, яка має бути націленою на пропуск екзона 45 в гені дистрофіну.

17. Спосіб лікування за п. 15 або 16, в якому пацієнт являє собою пацієнта-людину.

18. Застосування антисенсового олігомеру або його фармацевтично прийнятної солі або гідрату за будь-яким одним з пп. 1-12 у виробництві фармацевтичної композиції для лікування м'язової дистрофії.

19. Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат за будь-яким одним з пп. 1-12 для застосування в лікуванні м'язової дистрофії.

20. Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат за п. 19, де в лікуванні пацієнт з м'язовою дистрофією має мутацію, яка має бути націленою на пропуск екзона 45 в гені дистрофіну.

21. Антисенсовий олігомер або його фармацевтично прийнятна сіль або гідрат за п. 19 або 20, де пацієнт являє собою пацієнта-людину.

- 1 мкм шо с ос ВЗ мкм їж ! : 8 60 лом Б 40 : - ВО ОХ КОХ 59 До ор-чнняє Ох У й - д.а к п, са м й «о «о «8 и НИ Я 9 Ф Ф о Фіг, 1 100 | птн і щі мкм шк яке 23 мкм т Во о як є о -к о мк ! й о о о

В о. . - Е о о о 570 о о о ши п о ШИ о шШ "о ш ш РМО Мо. 11 РМО Мо.13 РМО Мо. 14

Фіг. 2

108. тре ; шімкМ ж ВО ВЗ мкм. й ще відмкм ши о в бо о. ООЕЕе ; Е о о жо 40 . о. о В о о о ! шо о с РМО Мо.

2 РМОМо5 РМОМОЄ

Фіг. З і - с Гі 1 МКМ Н Я ти й ха н ! : в 80 щщ ВЗ мкм у оз А з ов, ; 2: щу се : (а м Кк й Н ра ра а в ВСЯ

Фіг. 4 во ВО ше ше щк с. .

ЕЕ . . шщ ши 8 во шщщ- щ 5 щ Га шщщ- щ ке щі : а її . й -кое о. ! ою ва ее т с и НИ НИК ЗИ Я ши В В МИ МИ 9 9 с Фе 9 «г

Фіг. 5 що 100 т- -- пін к т ' Ух | ЖЗмМКМ |. БО щ ! а Н ї-ж 8 во і їх і Ме) Б «юю ше . о сш | пня ОВ я сю т А ою 5 З о ек не Я о 5 М. ж ж Ж о5Б ОО Ж х 55 ! о о о хо 50 ДО 55 Еш г ОБ й г Кк Оо5 6 паж в б. БЕ і В. о інт фЕТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТ здані кухонне неначе дулі тктнтнтнсннечнннеттетнтен нка нкттт нок кн он ШЕ вів нмМ ваш і КЕ В Ї й НЕ (рю снення | же нечи

51. Е КЕ. " ї 1 Е а АЖ В км нини ам ме ши шк ув вк я в ж шинввевВвисо: ву аваВаМВЕ й Фавпехалу іль ав шов ен еавесавенегикв ВО М ОК ІК ОМ и Од и Ок ОК Ок ОК ОК ОК ОК ВИСО о ттлававросетенявявооОисия я : МУ ШУ МО МУ МУ МУ же яти ФВ ФО ФО ж хх ж юю 5 сю Е і р СЯ Х х щі у - щі Мо з! ще м т с, см, см, ЧУ, ю, ЧУ, й «о, в, «Фо, є, Ф. і нин ЕЕ НН І й уХхТХІХІХхІТІТІХІ Е ОКО ОН

Фіг. 7 : Щі мМ. В во пн п нн З мкм ' ї | й 10 мкм і о 6 0 що : Н і» І Я і ше: : с і ПО бреннно р оня що щш і і су «5 о та 4 ! І НН ЯН НН. о о о о «о ; Н і ши и ВИ ВИ ВИС шк б б 4 4

Фіг. 8 ре | Зм г 80 й нн Ю мкм є ОБО рт Я І с : 40 --. -3ОИ ще їх т ет Фе ве ооо ооо о и ВИ ВИ а ВИ Я з з В

Фіг. 9 100 фе - / сп ВУ МКМ Е о | ЕЕ З й Ж во. СГ в'Омкм З | й о ! а 0 пет нн нн ОО рн ше і чі О ВИН яви В ВИШ ня и о ща 3 Кз Кз Ко о о шк Ф ФУ

Фіг. 10 шімм - | БУ мМ. ЕЕ ВО) ення ще | М В 1 0 МКМ о 40 - ши ШИН шини сен шини і СОЯ ЕЯ ве ОО 0 нн ше пон.. -Вк ши. ке ко Ф а Се су і ж ту і «У «х Я З (6 о що Ки ша Фе 4 «є З дюхлжеккюєсьюсесвхествствссвесствттосеодогодоооекюккєссевесевоетвесевосгоєстогосегооосео ок стессе от ог КТ ТТН АРКА Кк В

Фіг. 11 р 1300 ТТ онМ ЩО 80 др і Є во тчтнинининлнтлєлєвжвНИЯНЯ ИН ННЯ В бо М Е ши й в Ії ни Є о ко Вт ан ше НИК гани що щі о. 8 дн Я 0-3 «ши ші ші щі ші ши ші шк й що що ше с а и о х М у це Мак м»и ми ки ки я те на а аа ВИ Ар ВОАС хи и І п в а и а Аа УТ : СА КЯ - я пр 5 й в їх їх й їх чх Св яке де де де Ко ях

Фіг. 12 де Яд доня ої я ЗНМ. і сі ЗЕ Енн нн нн жан і ї ї ше ше | т. він. ши шо й. ; : ще ше М в жи лк НИ ши с; ж ши шк ше ше ИН о е з и ! шк ак и а ВИ ши

Фіг. 13 ФО100 ретттттннннннннннння Ж ов Го ШИ м 100 НМ ни пишшшшн ІЧ пиши нич и --ї- З и ; и ни ши ще І Іл т Мн. ик КК и р. рей в р: М май кВ ІК А А, І ОМ У ви це КО ви ов Кс че нс У чи к ке

Фіг. 14

Ж ї а і уп п пп тн ї не нн нн 30 ній і ї Е З БВ уру доню ше н 10 нМ. : з ТВ: пенні нн нн нн нн ай і ї- я і ЩО Шфосненнннтиттетеіт ооо оеентннтнннт ноті гсссексснтнткнт ооо ссскесєсєкннняннтя я сок Вся Н ' ях Н і Е З

І . Я Ффренннннетееесеввесенетеосоввссксаснсенаее носок евеевесеввсеесевестюьнини сс псвевсевосесссв свого прості Ясне : ї ; З ях є: : 5 кіш нн поп п п ВИМ ЇХ - -я щх що Я В ї а 5 «фонняхєєчюєкєєксскокх др чннннннячнкюєєєсскюксєсссюсо со В ннчннжннннникюєси ос В нжннижни СК сю 3 ВЕ дини в й : 8 за пі о с НК п : 1 ЖК С КАК СУ МКК ях 3 Шк й СО сн сен ше о М І г | Я ще кове ов з в о ЕТ їх Х є су Е с !

ЕЕ. 8 Ко я КЕ їх я «ї ! : С «в є - . . щи В АЙ А ни ик м МИ МА ся ; Ж шви ау миши ни У : Е й я Бу Я є ще Буж; ; І ША ше МИ та ше ОК нн Ше ї ке й г й І . ве ж ї і "

Фіг. 15 а : У Н Е і : б щої мкА З : г ЩО вн нн нн Й ї що Б як Не : ; в цк ЕІ і я ах Пт ІДД т тт у п тт т УМ У тт ї : Я ЕК З РЕ : о З ро : М: ї У «й - І ЕТ З : й ж гония» З : ас а нн пон пт по З У В ОХ зола 5 Б х рон ї КЕ КО Я 5 ІЗ Го і 5 КСО й Б дО Ї Н ря. ск же Н ЖК КОН НЕ Ко я х Е о фунта ДН нею чні же ж ВК ління ВВ осот В нн З ще М Її КОЖ ЗХ ПИ . ВАВ КО ї : гі х ОХ КИ КИ Я В їх ія че З жа я 5 ї і щ Од р-ни НН птреесіннен НН ет ЯКЕ ОВО нний У нн нн нн ; : сх й З чо к ! , ть пу т п пе Її З вою Її за чут се с сн Й 9 Ф я Ф «г : Я "

Фіг. 15 ши ниннннннннннаажал ал л длдлдлд,длджжи а нн ВИ Ще і 5 о подо до АМС АЛ МАХ МАМА АКАЖААМК ся тпм п вдн дв ве В ААААВАЛААВ МАААААМАМ ААМАААХ МАЛ А АлАТ "З мк м 10 мкм, є З ше шщ щ Щі Б 40 рен фех й нини ни і і " . м ш ши шк ше Її ЕН ОС: ШАХ: З ї : Й Е те 53 . сферою 000 ов юю кю сю в в ее шик А АК А АКА ЗД ОК осел

Фіг. 17 н! о 0 нн нн нн інн нині нні нн повно з ш Я мкій ДОВ) нт о ВУ МКМ в ! "ШІ я мо мкм во -- «5 - - -- ш є и : Р --х- шини нишннннни нишкннннннннн Е в я З де У » оф ІЗ «у а ще е г Ся їй Я че че ще че ке Ох: ни ин нн не не Коокхккююккккккнк Кк КА НКАУ К КК А КТК КОКС ССС ССС ОСС СОСОК ки

Фіг. 18 пон КК КН В КН : КЕЙ ШЕ ен ОО : 1 х Не ше щш | м Ж : Н ваги КУ Й Н : т 1 ж З ше Н г К з і ж ДІЙ, | пненененювтюювттеьовювотаосовноосооноогоооологогодасооснесецововннстнютотеюеессоювеюювоео» З ай МА Гея; з ЩЕ я Е Ще їх В : Н 1 о Е : І 3 ЗВ щ НЕ: сш ї ї он З і, К ЕЕ : о якМ. Н - ї КТК з : Кей ко фон В кккюкАКККАКККККАК Д УкаКААККАКККККААКАКАКАКАККАКК КК НК клік жНКАНККХККХККХХ кю», К ї С ї КИТИ вах Е : : 3 ПИЛ щошх з ї ї ПОПИ вок Е З ї БП, КИ Ї; 1 Е 3 ПИТИ КК 1 Ь Я ІЗ ик ВЕК Е З Е 4 ж о с нн В В Е 1 й ї дах нених 1 : ї ден ох 1 х й оку Н ї В вх З ї ох М З з ї Я В х - «Мсгсггг В, Ва о ІпІг222222о2 гг ішогішт ї «фрсеееетню КК ТИН ення тт чне скін сяккктнкттх х . б. ї Е СЯ У кое ї ї ХК н КИ З ЩЕ ІЗ КОМ МКК ІЗ ї й ХК ЗО І х АК ОО ї ї ВК КЮ ї СКМ зва ї їх Ж ВАК нідввяк; Ко В ЕІ ї й сждння ААУ окнжукн ВИНИК УМОВ знан нання ях плждрнлннлняя я МКК пкклянннях ГУ . о ї : М, я ди що св. і : й їх М К. З . : і їх я й х І р ГІ ї ані чані еще а х ї у й ч ІЗ о , о се нн и и и а в в т

Фіг. 19 пане в нн 4100. пр ІЗ й рак і В : | ШТ мМ, ІЗ ї І: В лою, Е З З З З ж вв. ВЗ мим. й кодек кс Кк кн ння, спкнікю скж осокою ЗМ ж ВЕН З : 3 : т ШО мкм. х | Е ІЗ Я 3 і 3 ІЗ 3 ІЗ у х ; І х і 5 БО не ек А ки а ІЗ і Бе І ПИТ ІЗ ай Во ІУ Вона х і ВХ В г В повних х не КН ден х Е ЕКС Вин х Е ЕК ох х г чий ад окре ВВ ОХ скжжи оскжжкннжжютютююн ІЗ ш- ма 5 5 ак ; Ге Е ПІНКИ ПІК вх З зе ; ПЕШИШКИ ПИ ПКС З Ь ЗХ Кия ох З : ря І Кене Де Я 3 : е і ЕТ ВХ ПИ ї КК Вих дан 3 я . ПЕТ ПН ЕТО З а. Ко ВИШШИІ ЗИИТИ КІ 2 «пф» Сх. ПИ в в гне СИС З І " й; ПЕКИКОЙ Вих яонннх ІЗ т ДОН до дн І : КК до Ян ІЗ я НК Я ЛИ Ява Яке ІЗ ОХ Я ХАН Як ПНЯ х ОО УЯ З о ПОПИ МО І УООООВНЯК Ан Я КОХ х Е КОКОН Я ИН ОВО Її Е ПеМИМК МКМ СПИС ОМКИИИИ ГУ . КМ ОКХ сонних ХАІ ІЗ і ій поофчн ВВ ОВ б оссдтсся ОО доосрсся Хо: ТЯ МОХ -- Н ЕІ з х ! ї І ї і і : С Де Я в ІЗ я ІЗ я і; Ще пе а ІЗ х » Ж ІЗ я ІЗ їх ук . У іже чо -о се х я Е х о с о І й » х І Хккеке КК ККККАКАА ОК ККККАКККККААКААКАКК КАК КАКАКАК АК АКК КК КККККККККНК КНТ не ККККККККККККККККККККО

Фіг. 20

І. 2

Ен тт х щи ІЗ - ІЗ ї я и т Кк ін. : : ІЯ І : Н н КЕ лем 4 ІН й ! : : х : же ; х 8 Я Же ще І ро- | В'імем ї з й Н У Ж Н о Н з Рч ія ї Н з Я М Я Н - х : У Н зва: ОЗ "й ГТ ІЯ : За : й Вони Й й Я ; Н Ко х ї Е Й Н не ПИШИ М Н м Н ех ТНК Н : К--Я що о п м і : у КК, КСО Н х ЕХ Я С ЕК ІЗ х Н МІК Зо ТУ : й : Зх Зоо х Н ца ! Зх ЗОжоех сій х Н Й ЩЕ кох КК «око. ІЯ Н «ж ай пен с, нн. нен С пн нн Я : з я : ж жо БО ія : г Н ох КККОНЕ БОНН Ій Я й : ККну ОНИ КО Е : я Н ж з МЕ БОКИ Н : Н ях : ЗО КК : Н Н КО ОХ Мн сих : і х 1 ох ОХ ТО ОКУ З. ї ІЗ о Месесогстсссе вх дв пот ня жжжятижякин ВК сплнніяжкжжжлнккя кн ВВ кикях ІЗ х Я Е Н ОККО : Е КОХ ОВВВВ Я з В БОНН ія : Се Н о Я Е о. ха Ух КО х І Н ОВ: КХХ НН ХО МНК І і ЩІ Н о Е о о. ОК І : Н ЗАКО МКК ОК « БОБООВХ х ї Н Я КО: ГАК - ХАН Ма МО Е : ; І ве ш ПМ Ко ОХ НІ Н ЕЙ Не: ВИДНА ОХ ЗОН сееє КО сосни ЕКОН ї Н мот З і ЕК ї Я їв це ше с ї З у. А х Е х Кр і в, ва » х х я Е Ех Е Й Я ї х - с. : з щи ІЗ Е «ЕК жи с сяой : : х ож я х С од Ка ой .

Н . я х : ї х і Ве - Ще і: ІЯ « « я « ; ї я Й Ж ї і ї нн НК НК НК НМ НМ НМ НМ НМНКММЙМ НМ НМ ХМНХМКНХМИВКМВ М НХНМНМИВМВМНМНМИНМВМКК КК

Фіг. 21 «ФІГ. Е хвосоввссх віко вові воскові КУ В о вові вві УК УК КК оповите і РМ ІЗ х с СКК УЮ ХУ ХУ ХУ УМ є т нн НЕТ ТТ ТЮ ТУТ Кіт ТК тк тт Тіт Чт т ЛК ВК ВК КТ М чт пк кт т піт п піаніст, КЕ їсте Ї ШЕ Н 1 ее Ко ІЗ й ІЗ рок 3 ж щх Е й ІЗ і! 3 Я Б й ІЗ К п пн с в я Е ІЗ Ні що о З жії шк: Н оз ІЗ же ж ПІ 10 й ІЗ ! р І сх с НЕ й 5 3 ке ІЗ жен ох ще ГУ ї ВО п в в в х й І ах ВХ Б х З З х ща ща ВХ. ІЗ р З СК КВК А І Н З у Я НКИ Б: ІЗ х З ІК КС вени с вини зон вна 5 ії : ях ж ще ще ї оч ї я й Вк я ПИ ІЗ Н щ І ХА ЗХ що КО СІ ІЗ і її . бохо КК сх. ВІ ВХ сооссскня зваяя; В КІ х

! з. ЕК нн С номен ни мен НИМ ки х май ї КІ КЕ БИ КК КТ ПК їх З ІЗ 5 КХ ЗХ 5 5 СЕ Я З З ТЯ КОКО 2 ожКщя ВЕНУ. Я. НУ ЗК х ї ОО В СО ШО: АК. БО СОС І і й і ВИХ КОМ ВХ. М. СО ШЕ ІЗ Е ОН Ярі : згорос ВВЕ содеее усе ВЕ ВЕНУ З І Я їй ІЗ ; ІЗ Ге ; ся «Же й ІЗ пк «В «і «В «і «в : Я Й ; ІЗ Н ІЗ ше Я ч вк ІЗ І Ще У х є ЩІ м ср ІЗ ! де о хе ща че сі Е І и с у зи о ; Е з Е Ї У во Я І ши ми и НИ ми Ф Х ха шу Я у я ІЗ Х х Я і ІЗ іх ІЗ я ІЗ ІЗ ІЗ и -

Фіг. 22

КК Кок Кк кккккк кс ккккккккк кн кккн жк ОККО КК КК Кк Кк кккни Кк ккАКААЖАХ ОО КК ккккик Кк кккик КА осокою М Н і Н Н ! Н ! Н ж ' Н с: і У ІЗ ! і ій ; НЯ ї х І і, в же. І З | КН ЇЇ Чикеж Н Ь нев ВЕ З в І т ж | в мем. Н сн М й Я ї З ще і Я я Жид ЖК: 3 з Н Я ї З - ї я . ях ї з Н ПЕК К зеякяея с Ж: ря Ї КІ І ПИШНИМИ - і ПМК ї З З КОХ Х ПЕК й ї : -к нн ст нн М пт па ї З еЕ Же У пон схов ко: нн СВ й Нй ї З з й БО ПК БО ІЗ З Гі БОС КОХ БОНН І ВІ 1 ОП ЗО "ЗХ х Н Ек ІЗ ВХ Кох ПОНОЯ ї її як ї -Х МОХ КККШНЯ ї Н ч І СХ КО ЕКНЯ КЗ ї ї БА лнлАллАААЛЛЛЛААНАН нн Алл ва нон ий дм КІ ї «В , жк ОН НК КН ї З Н ЕЕ ОО ОКО ПИШННК НКИ ї Я фе ! ЖК ПЕККО ех - ї З - Н Е п. УК ПИШИ ПИШИ ї З ща вк І Н В я ТИКИ ОХ ШИНИ ї З ук МД пяляня КО нот В. ння СС. и ОО. ї З жк Я ох НН МАЯ ОХ ІЗ З Й | ПККККОИ З ох - Її З и З Х ПО ЗК но ї 5 З Я КИ ЗО - ЗО іх. ЗОМ ї З 1 ех В КОКОС МК НИК в ОО у у «ерісн ВЕН ок ОС СКК кс ВИННИЙ КУ сссскрссссх ВК КК сту І ї 0 г, Ку х ІЗ І ІЗ ї ї ї ї І: 3 ке Кк В. я : ї ; Ка чя У ї х й х ї ї ї ІЗ ік і ї . ву жу Кі де ГУ і; І: х У» о о ї сш и шо я я ! . С І а с. : З г | і х рі й |: ї З З г ї Ві сх хх » ї В Щх Ка З І ї і ї ї я Е х й ї ї х х ї ї ї ї нн и ККУ

Фіг. 23

ІГ. вн в в в в во Н ї Н і Н я с І Н Я Я роняак ї ЕЕ нн нн нн Н й : іч; ї ї ! й З ї 3 І Н З 3 Іо З

ЖК. бо Н ТИМИ Н І п Н ПЕНЯ са Е і : ПЕКИ Бу г і Е р ен Твен Е З х 1 Е З Я Н МПК - -3 ї Ьх Н г: Кох хе і Н иа Н особою Я с ЖК КЗ ще А 1 Н 2 : Б: ВОК: с ОХ Б в ї Н Ен дл уд Н Б В: ї 1 555 І Н т ЩЕ Бонн нн. о мн о КЕ ванн щ Е З Н Ме : В КО: Ко КАК т ; Н : ШКО В: ІК ОО Ку й а щи Н С чАк Н НКИ В: ПН о Оля ок Н Н ЕКО В: КОХ ЗХ і ох Н КК, В: КН Кн ї Н Енн 1 жк ВИ: ПК ОО ї Н ся ї КК КВ СИ СХ ї ої ПКККК БООИЙ КОН ПКНККО Н ; Б: в ее Коня» І Н Кі ях Її КК, СКС КК ох І Н Я НН «р МОХ Ка ПКККК І Н жк Н КОКО ОХОНКНИХ Кен ПЕК Е Н НЕ Н ВХ п КОКО Кох ї

1. В ЗХ ПЕ ВОК Зах ІЗ фо її ВХ ЕНН Кох ПЕК І е ве я КА г: ЖД нлккжтнтнй МЕ нюх ккккюккккккя ОО нт тт КК кю порох я Кк 1 же І МАЕ КК КОХ Коен ЗК Е Ек і З З: ОВО ОНА Зх І Н Н о: Ден: ЕККН ПИ Кн 3 х Н я: щ я: -к Ден ПИ ПЕК 3 Н КК Ден: Х ПЕКК ПВ ох ав Н ообо Й Б 3 ПТІИШТВ МОН ПИСК ОХ І а ї ВМО ВХ ПЕКИ ДЕН ПК Ден М ох ї з т х З ї У ІЗ і їх ї І! ї й г Як - п х і ке 3 Її ІЙ фо й Ще Ї Е І ш й Ж й ЗУ 1 х дей х х Я Н Н Я с Я Н с » х Я Н З . : Я З у г Й Х і Я 3 є З я г Я З ся Я Я 3 х з - Я

З . -й ; З Ї ї ї І і: ен в в в в ріг. 24