JP6384845B2 - アンチセンス核酸 - Google Patents
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Description
[1]
以下の(a)〜(e)よりなる群より選ばれる2つのユニットオリゴマーが連結した、14〜32塩基長のアンチセンスオリゴマーであって、2つのユニットオリゴマーは連続又は互いに重複するものではない、アンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物:
(a)ヒトジストロフィン遺伝子の第45番目のエクソンの5’末端から第−5〜15番目のヌクレオチド配列から選択される連続する7〜16塩基のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー;
(b)ヒトジストロフィン遺伝子の第45番目のエクソンの5’末端から第48〜70番目のヌクレオチド配列から選択される連続する7〜16塩基のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー;
(c)ヒトジストロフィン遺伝子の第45番目のエクソンの5’末端から第128〜150番目のヌクレオチド配列から選択される連続する7〜16塩基のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー;
(d)ヒトジストロフィン遺伝子の第45番目のエクソンの5’末端から第15〜40番目のヌクレオチド配列から選択される連続する7〜16塩基のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー;及び
(e)ヒトジストロフィン遺伝子の第45番目のエクソンの5’末端から第110〜125番目のヌクレオチド配列から選択される連続する7〜16塩基のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー。
[2]
前記2つのユニットオリゴマーのうちの一つが(a)である、前記[1]に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
[3]
配列番号7〜12、14〜33、40〜52、57、64、65、79〜86よりなる群から選ばれるいずれか一つの塩基配列からなる、前記[1]又は[2]に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
[4]
配列番号8、10、25、30、33、79、80よりなる群から選ばれるいずれか一つの塩基配列からなる、前記[1]〜[3]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
[5]
オリゴヌクレオチドである、前記[1]〜[4]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
[6]
前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分及び/又はリン酸結合部分が修飾されている、前記[5]に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
[7] 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分が、2’位の-OH基が、OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br及びIからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、前記[5]又は[6]に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
(上記Rは、アルキル又はアリールを示し、上記R’は、アルキレンを示す。)
[8] 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか1つのものである、前記[6]又は[7]に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
[9] モルホリノオリゴマーである、前記[1]〜[4]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
[10] ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、前記[9]に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
[11] ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、前記[4]に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
[12] 5’末端が、下記化学式(1)〜(3)のいずれかの基である、前記[9]〜[11]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
[14] さらに医薬的に許容可能な担体を含む、前記[13]に記載の医薬組成物。
[15]
前記[1]〜[12]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬上許容される塩若しくは水和物、又は前記[13]若しくは[14]に記載の前記医薬組成物を筋ジストロフィー患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法。
[16] 前記筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子にエクソン45スキップの対象となる変異を有する患者である、前記[15]に記載の治療方法。
[17]
前記患者がヒトである、前記[15]又は[16]に記載の治療方法。
[18]
筋ジストロフィー治療用医薬組成物の製造における前記[1]〜[12]のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬上許容される塩若しくは水和物の使用。
[19]
筋ジストロフィー治療に使用するための前記[1]〜[12]のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
[20]
前記治療において、筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子にエクソン45スキップの対象となる変異を有する患者である、前記[19]に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
[21]
前記患者がヒトである、前記[19]又は[20]に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2015年9 月15日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願(特願2015−182145号)の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第45番目のエクソンをスキッピングしうるアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物(以下、「本発明のオリゴマー」という)を提供する。
本発明において、「遺伝子」には、ゲノム遺伝子以外に、cDNA、mRNA前駆体及びmRNAも含まれる。好ましくは、遺伝子は、mRNA前駆体、即ち、pre-mRNAである。
ヒトゲノムにおいて、ヒトジストロフィン遺伝子は遺伝子座Xp21.2に存在する。ヒトジストロフィン遺伝子は、3.0 Mbpのサイズを有しており、既知のヒト遺伝子としては最大の遺伝子である。但し、ヒトジストロフィン遺伝子のコード領域はわずか14kbに過ぎず、該コード領域は79個のエクソンとしてジストロフィン遺伝子内に分散している(Roberts, RG., et al., Genomics, 16: 536-538 (1993))。ヒトジストロフィン遺伝子の転写物であるpre-mRNAは、スプライシングを受けて14kbの成熟mRNAを生成する。ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子の塩基配列は公知である(GenBank Accession No. NM_004006)。
ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン45の塩基配列を配列番号13に示す。また、ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン45のヌクレオチド配列(配列番号13)のうち、5’末端から数えて-5〜15番目の塩基からなる配列を配列番号3に示す。同様に、48〜70番目の塩基からなる配列、128〜150番目の塩基からなる配列、15〜40番目の塩基からなる配列及び110〜125番目の塩基からなる配列を、それぞれ配列番号4〜6、143に示す。
変異型のヒトジストロフィン遺伝子のエクソン45又はその一部は、具体的には、以下の(I)又は(II)に記載のポリヌクレオチドである。
(I)配列番号13、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6及び配列番号143からなる群より選択されるいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
(II)配列番号13、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6及び配列番号143からなる群より選択されるいずれかの塩基配列に対して、90%以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号13、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6及び配列番号143からなる群より選択されるいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001"及び"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。
なお、塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993)を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990)。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore = 100、wordlength = 12とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
(a)ヒトジストロフィン遺伝子の第45番目のエクソンの5’末端から第−5〜15番目のヌクレオチド配列から選択される連続する7〜16塩基のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるユニットオリゴマー;
(b)ヒトジストロフィン遺伝子の第45番目のエクソンの5’末端から第48〜70番目のヌクレオチド配列から選択される連続する7〜16塩基のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるユニットオリゴマー;
(c)ヒトジストロフィン遺伝子の第45番目のエクソンの5’末端から第128〜150番目のヌクレオチド配列から選択される連続する7〜16塩基のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるユニットオリゴマー;
(d)ヒトジストロフィン遺伝子の第45番目のエクソンの5’末端から第15〜40番目のヌクレオチド配列から選択される連続する7〜16塩基のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるユニットオリゴマー;及び
(e)ヒトジストロフィン遺伝子の第45番目のエクソンの5’末端から第110〜125番目のヌクレオチド配列から選択される連続する7〜16塩基のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー。
R1は、H、アルキルを表し;
R2及びR3は、同一又は異なって、H、アルキル、シクロアルキル、又は、アリールを表し;
Y1は、0、S、CH2又はNR1を表し;
Y2は、0、S又はNR1を表し;
Zは、0又はSを表す。)
スキッピング効率(%)= A /( A + B )x 100
スキッピング効率の計算については、国際公開公報第2012/029986号を参照することができる。
糖のその他の部分の修飾としては、例えば、リボース又はデオキシリボースの4’位のOをSに置換したもの、糖の 2' 位と 4' 位を架橋したもの、例えば、LNA(Locked Nucleic Acid)又はENA(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids)などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
アルコキシとしては、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数1〜6のアルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、n-ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、n-ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ等を挙げることができる。とりわけ、炭素数1〜3のアルコキシが好ましい。
アルキレンとしては、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数1〜6のアルキレンが好ましい。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、2-(エチル)トリメチレン、1-(メチル)テトラメチレンを挙げることができる。
(式中、Baseは、核酸塩基を表す。)
(式中、Baseは、前記と同義であり;
Wは、以下のいずれかの式で表わされる基を表す。
(式中、Xは、-CH2R1、-O-CH2R1、-S-CH2R1、-NR2R3又はFを表し;
R1は、H、アルキルを表し;
R2及びR3は、同一又は異なって、H、アルキル、シクロアルキル、又は、アリールを表し;
Y1は、0、S、CH2又はNR1を表し;
Y2は、0、S又はNR1を表し;
Zは、0又はSを表す。))
(式中、Base、R2、R3は、前記と同義である。)
PMOの1つの態様として、例えば、次の一般式(I)で表される化合物(以下、PMO(I)という。)を挙げることができる。
[式中、各Base、R2、R3は、前記と同義であり;
nは、1〜99の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、13〜31の範囲内にある任意の整数である。]
下記工程に使用されている化合物及び試薬は、PMOの製造に一般的に使用されているものであれば特に限定されない。
次の一般式(II)で表される化合物(以下、化合物(II)という。)に酸を作用させることによって、次の一般式(III)で表される化合物(以下、化合物(III)という。)を製造する工程。
[式中、n、R2、R3は、前記と同義であり;
各BPは,独立して、保護されていてもよい核酸塩基を表し;
Tは、トリチル基、モノメトキシトリチル基、又はジメトキシトリチル基を表し;
Lは、水素、アシル、又は次の一般式(IV)で表される基(以下、基(IV)という。)を表す。]
BPに係る「核酸塩基」としては、Baseと同じ「核酸塩基」を挙げることができる。但し、BPに係る核酸塩基のアミノ基又は水酸基は保護されていてもよい。
かかるアミノ基の保護基としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、4-メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、4-tert-ブチルフェノキシアセチル、4-イソプロピルフェノキシアセチル、(ジメチルアミノ)メチレンを挙げることができる。水酸基の保護基としては、例えば、2-シアノエチル、4−ニトロフェネチル、フェニルスルホニルエチル、メチルスルホニルエチル、トリメチルシリルエチル、置換可能な任意の位置で1〜5個の電子吸引性基で置換されていてもよいフェニル、ジフェニルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、メチルフェニルカルバモイル、1-ピロリジニルカルバモイル、モルホリノカルバモイル、4-(tert-ブチルカルボキシ)ベンジル、4-[(ジメチルアミノ)カルボキシ]ベンジル、4-(フェニルカルボキシ)ベンジルを挙げることができる(例えば、国際公開公報第2009/064471号公報参照)。
また、前記酸と一緒に、有機アミンを使用することができる。有機アミンとしては、特に限定されるものではないが、例えば、トリエチルアミンを挙げることができる。有機アミンの使用量は、例えば、酸1モルに対して、0.01モル当量〜10モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは、0.1モル当量〜2モル当量の範囲内である。
本工程に使用しうる酸は、0.1%〜30%の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類(エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど)、水又はこれらの混合物を挙げることができる。
反応時間は、使用する酸の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分〜24時間の範囲内が適当である。好ましくは、1分〜5時間の範囲内である。
本工程に用いる溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類(エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど)、水又はこれらの混合物を挙げることができる。反応温度は、例えば、10℃〜50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、20℃〜40℃の範囲内であり、さらに好ましくは、25℃〜35℃の範囲内である。
反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分〜24時間の範囲内が適当であり、好ましくは、1分〜5時間の範囲内である。
[式中、BP、T、リンカー、固相担体は、前記と同義である。]
次の一般式(V)で表される化合物にアシル化剤を作用させることによって、次の一般式(VI)で表される化合物(以下、化合物(VI)という。)を製造する工程。
[式中、BP、T、リンカーは、前記と同義であり;
R4は、水酸基、ハロゲン、又は、アミノを表す。]
特に、次の一般式(VIa)で表される化合物は、化合物(V)と無水コハク酸とを用いてエステル化反応として知られた方法を実施することにより製造することができる。
[式中、BP、Tは、前記と同義である。]
化合物(VI)に縮合剤等を作用させることによって、固相担体と反応させ、化合物(IIa)を製造する工程。
[式中、BP、R4、T、リンカー、固相担体は、前記と同義である。]
本工程は、化合物(VI)と固相担体とを用いて縮合反応として知られた方法により製造することができる。
[式中、BP、R2、R3、T、リンカー、固相担体は、前記と同義であり;
n’は、1〜98を表す。]
[式中、BP、Tは、前記と同義である。]
[式中、BP、n’、R2、R3、Tは、前記と同義である。]
[式中、BP、Tは、前記と同義であり;
R5は、アシルを表す。]
[式中、BP、n’、R2、R3、R5、Tは、前記と同義である。]
化合物(III)に塩基存在下にモルホリノモノマー化合物を作用させることによって、次の一般式(VII)で表される化合物(以下、化合物(VII)という。)を製造する工程。
[式中、各BP、L、n、R2、R3、Tは、前記と同義である。]
[式中、BP、R2、R3、Tは前記と同義である。]
本工程に使用しうる「塩基」としては、例えば、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、又は、N-エチルモルホリンを挙げることができる。塩基の使用量としては、例えば、化合物(III)1モルに対して、1モル当量〜1000モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは10モル当量〜100モル当量の範囲内である。
反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常1分〜48時間の範囲内が適当であり、好ましくは、30分〜24時間の範囲内である。
また、必要であれば、アシル化剤と一緒に、例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-エチルモルホリン等の塩基を使用することができる。アシル化剤の使用量としては、0.1モル当量〜10000モル当量の範囲内が好ましく、1モル当量〜1000モル当量の範囲内がより好ましい。塩基の使用量としては、例えば、アシル化剤1モルに対して、0.1モル当量〜100モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは1モル当量〜10モル当量の範囲内である。
本反応の反応温度は、10℃〜50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、10℃〜50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、20℃〜40℃の範囲内であり、さらに好ましくは、25℃〜35℃の範囲内である。反応時間は、例えば、使用するアシル化剤の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分〜24時間の範囲内が適当であり、好ましくは、1分から5時間の範囲内である。
工程Bにおいて製造される化合物(VII)において、脱保護剤を用いて保護基を脱離し、一般式(IX)で表される化合物を製造する工程。
[式中、Base、BP、L、n、R2、R3、Tは、前記と同義である。]
工程Cにおいて製造される化合物(IX)に酸を作用させることによって、PMO(I)を製造する工程。
[式中、Base、n、R2、R3、Tは、前記と同義である。]
逆相クロマトグラフィーを用いてPMO(I)を精製する場合には、溶出溶媒として、例えば20mMのトリエチルアミン/酢酸緩衝液とアセトニトリルの混合溶液を使用することができる。
また、イオン交換クロマトグラフィーを用いてPMO(I)を精製する場合には、例えば、1Mの食塩水と10mMの水酸化ナトリウム水溶液の混合溶液を使用することができる。
(式中、Baseは、前記と同義である。)
ペプチド核酸は、例えば、以下の文献に従って製造することができる。
1)P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt,Science, 254, 1497 (1991)
2)M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg,Jacs., 114, 1895 (1992)
3)K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt,J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)
4)L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm,O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)
5)T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)
以下、上記(1)、(2)及び(3)で示される基を、それぞれ「基(1)」、「基(2)」及び「基(3)」と呼ぶ。
本発明のオリゴマーは、ジストロフィン遺伝子のエクソン45のスキッピングを可能にする。従って、本発明のオリゴマーを含む医薬組成物をジストロフィン遺伝子にエクソン45スキップの対象となる変異(エクソン45スキッピングでin-frame化する変異)を有するDMD患者に投与することにより、筋ジストロフィーの症状を緩和することができると予測される。また、短い鎖長からなる本発明のオリゴマーは製造工程が簡便であり、さらに製造コストが抑えられるというメリットがある。
そこで、別の実施態様として、本発明のオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医薬組成物(以下、「本発明の組成物」という)を提供する。
アミノポリスチレン樹脂に担持された4−{[(2S,6R)−6−(4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸
アルゴン雰囲気下、N−{1−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]−2−オキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−4−イル}ベンズアミド3.44gと4−ジメチルアミノピリジン(4−DMAP)1.1gをジクロロメタン50mLに懸濁し、無水コハク酸0.90gを加え、室温で3時間撹拌した。反応液にメタノール10mLを加え、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチルと0.5Mのリン酸二水素カリウム水溶液を用いて抽出操作を行った。得られた有機層を0.5Mのリン酸二水素カリウム水溶液、水、飽和食塩水の順で洗浄した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮し、4.0gの目的物を得た。
4−{[(2S,6R)−6−(4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸4.0gをピリジン(脱水)200mLに溶解し、4−DMAP0.73g、1−エチル−3‐(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩11.5gを加えた。次いで、アミノポリスチレン樹脂 Primer support 200 amino(GE Healthcare Japan社製、17-5214-97)25.0g、トリエチルアミン8.5mLを加え、室温で4日間振とうした。反応後、樹脂をろ取した。得られた樹脂をピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥した。得られた樹脂にテトラヒドロフラン(脱水)200mL、無水酢酸15mL、2,6−ルチジン15mLを加え、室温で2時間振とうした。樹脂をろ取し、ピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥し、26.7gの目的物を得た。
UV測定条件
機器:U-2910(日立製作所)
溶媒:メタンスルホン酸
波長:409 nm
ε値:45000
アミノポリスチレン樹脂に担持された4−{[(2S,6R)−6−(5-メチル−2,4−ジオキソピリミジン−1−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸
参考例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、参考例1の工程1で用いたN−{1−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]−2−オキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−4−イル}ベンズアミドの代わりに、本工程では、1−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]−5−メチルピリミジン−2,4(1H,3H)−ジオンを使用した。
当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂1g当たりのトリチルのモル量を409nmにおけるUV吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、164.0μmol/gであった。
アミノポリスチレン樹脂に担持された4−{[(2S,6R)−6−(6−ベンズアミドプリン−9−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸
参考例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、参考例1の工程1で用いたN−{1−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]−2−オキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−4−イル}ベンズアミドの代わりに、本工程では、N-{9-[(2R,6S)-6-(ヒドロキシメチル)-4-トリチルモルフォリン-2-イル]プリン-6-イル}ベンズアミドを使用した。
当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂1g当たりのトリチルのモル量を409nmにおけるUV吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、185.7μmol/gであった。
アミノポリスチレン樹脂に担持された4−{{(2S,6R)−6−{6−(2−シアノエトキシ)−2−[(2−フェノキシアセチル)アミノ]プリン−9−イル}−4−トリチルモルホリン−2−イル}メトキシ}−4−オキソブタン酸
参考例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、参考例1の工程1で用いたN−{1−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]−2−オキソ−1,2−ジヒドロピリミジン−4−イル}ベンズアミドの代わりに、本工程では、N−{6−(2−シアノエトキシ)−9−[(2R,6S)−6−(ヒドロキシメチル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]プリン−2−イル}−2−フェノキシアセトアミドを使用した。
当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂1g当たりのトリチルのモル量を409nmにおけるUV吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、164.8μmol/gであった。
5’末端塩基に対応する、アミノポリスチレン樹脂に担持された4−{[(2S,6R)−6−(4−ベンズアミド−2−オキソピリミジン−1(2H)−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸(参考例1)、もしくは、アミノポリスチレン樹脂に担持された4−{[(2S,6R)−6−(5-メチル−2,4−ジオキソピリミジン−1−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸(参考例2)、もしくは、アミノポリスチレン樹脂に担持された4−{[(2S,6R)−6−(6−ベンズアミドプリン−9−イル)−4−トリチルモルホリン−2−イル]メトキシ}−4−オキソブタン酸(参考例3)、もしくは、アミノポリスチレン樹脂に担持された4−{{(2S,6R)−6−{6−(2−シアノエトキシ)−2−[(2−フェノキシアセチル)アミノ]プリン−9−イル}−4−トリチルモルホリン−2−イル}メトキシ}−4−オキソブタン酸(参考例4)0.2gをフィルター付きカラムに充填し、核酸合成機(AKTA Oligopilot 10 plus)を使用して、下記合成サイクルを開始した。表1に記載の各化合物の塩基配列になるよう、各カップリングサイクルにおいて所望のモルホリノモノマー化合物を添加した(下記表2を参照)。
得られた目的物を含有する水溶液を陰イオン交換樹脂カラムで精製した。使用した条件は下記表4に示す通りである。
[試験例1]
In vitroアッセイ
RD細胞(ヒト横紋筋肉腫細胞株)3.5×105個に対して、表1のアンチセンスオリゴマー1〜10μMをAmaxa Cell Line Nucleofector Kit Lを用いてNucleofector II(Lonza)により導入した。プログラムはT-030を用いた。
導入後、細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)(インビトロジェン社製)を含むEagle's minimal essential medium(EMEM)培地(シグマ社製、以下同じ) 2mL中、37℃、5% CO2条件下で三晩培養した。
細胞をPBS(ニッスイ社製、以下同じ)で1回洗浄した後、1%の2-メルカプトエタノール(ナカライテスク社製)を含むBuffer RLT(キアゲン社製)を350 μL細胞に添加し、数分間室温に放置して細胞を溶解させ、QIAshredder ホモジナイザー(キアゲン社製)に回収した。15,000 rpmで2分間遠心し、ホモジネートを作製した。RNeasy Mini Kit (キアゲン社製)に添付のプロトコールに従ってtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNAの濃度はNanoDrop ND-1000(エル・エム・エス社製)を用いて測定した。
50℃、30分間:逆転写反応
95℃、15分間:ポリメラーゼ活性化、逆転写酵素不活性化、cDNA熱変性
[94℃、30秒間;60℃、30秒間;72 ℃、1分間]x 35サイクル:PCR増幅
72℃、10分間:最終伸長反応
フォワードプライマー:5’-GCTCAGGTCGGATTGACATT-3’ (配列番号1)
リバースプライマー:5’-GGGCAACTCTTCCACCAGTA -3’ (配列番号2)
エクソン45がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「A」と、エクソン45がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「B」を測定した。これら「A」及び「B」の測定値に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。
スキッピング効率(%)= A /( A + B )x 100
In vitroアッセイ
試験例1と同様の方法で実験を行った。但し、RD細胞(ヒト横紋筋肉腫細胞株)3.5×105個に対して、本発明オリゴマー単独(PMO NO.11又はPMO NO.9)、それぞれを構成している2本の個々のユニットオリゴマー、又はその混合物を各3μMの濃度でAmaxa Cell Line Nucleofector Kit Lを用いてNucleofector II(Lonza)により導入した。プログラムはT-030を用いた。導入した配列の組み合わせは以下の通りである。
結果を図6、25に示す。本実験により、エクソン45内の異なる部位を標的とする2本のアンチセンスオリゴマーを連結したPMO NO.11(配列番号10)、PMO NO.9(配列番号8)、又はPMO NO.72(配列番号79)の本発明のオリゴマーは、それを構成する個々のアンチセンスオリゴマー(PMO NO.27(配列番号36)、PMO NO.28(配列番号37)、PMO NO.25(配列番号34)、PMO NO.26(配列番号35)、PMO NO.82(配列番号144)、又はPMO NO.83(配列番号145))又はその混合物(PMO NO.27 及び PMO NO.28、 PMO NO.25 及び PMO NO.26、又はPMO NO.82及びPMO NO.83)と比較して、高い効率でエクソン45をスキッピングさせることが判明した。
In vitroアッセイ 配列番号89〜141、11及び12に記載の2’−O−メトキシ−ホスホロチオエート体(2’−OMe−S−RNA)のアンチセンスオリゴマーを用いて実験を行った。アッセイに用いた各種アンチセンスオリゴマーは日本バイオサービス社より購入した。各種アンチセンスオリゴマーの配列を以下に示す。
添加後、一晩培養した。細胞をPBS(ニッスイ社製、以下同じ)で1回洗浄した後、1%の2-メルカプトエタノール(ナカライテスク社製)を含むBuffer RLT(キアゲン社製)を350 μL細胞に添加し、数分間室温に放置して細胞を溶解させ、QIAshredder ホモジナイザー(キアゲン社製)に回収した。15,000 rpmで2分間遠心し、ホモジネートを作製した。RNeasy Mini Kit (キアゲン社製)に添付のプロトコールに従ってtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNAの濃度はNanoDrop ND-1000(エル・エム・エス社製)を用いて測定した。
50℃、30分間:逆転写反応
95℃、15分間:ポリメラーゼ活性化、逆転写酵素不活性化、cDNA熱変性
[94℃、30秒間;60℃、30秒間;72 ℃、1分間]x 35サイクル:PCR増幅
72℃、10分間:最終伸長反応
フォワードプライマー:5’-GCTCAGGTCGGATTGACATT-3’ (配列番号1)
リバースプライマー:5’-GGGCAACTCTTCCACCAGTA -3’ (配列番号2)
エクソン45がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「A」と、エクソン45がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「B」を測定した。これら「A」及び「B」の測定値に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。
スキッピング効率(%)= A /( A + B )x 100
結果を図7、12〜15に示す。本実験により、本発明のアンチセンスオリゴマーは有効にエクソン45をスキッピングさせることが判明した。
In vitroアッセイ
試験例1と同様の方法で実験を行った。但し、RD細胞(ヒト横紋筋肉腫細胞株)3.5×105個に対して、本発明オリゴマー単独(PMO NO.2、PMO NO.31又はPMO NO.32)、それぞれを構成している2本の個々のユニットオリゴマーを各3μM又は10μMの濃度でAmaxa Cell Line Nucleofector Kit Lを用いてNucleofector II(Lonza)により導入した。プログラムはT-030を用いた。導入した配列の組み合わせは以下の通りである。
結果を図9に示す。本実験により、エクソン45内の異なる部位を標的とする2本のアンチセンス核酸を連結したPMO No.2(配列番号7)、PMO No.31(配列番号11)又は PMO No.32(配列番号12)の本発明のオリゴマーは、それを構成する個々のアンチセンス核酸(PMO No.66、PMO No.63、PMO No.64、又はPMO No.65)と比較して、高い効率でエクソン45をスキッピングさせることが判明した。
Claims (21)
- 配列番号30、25、33、79及び80よりなる群から選ばれるいずれか一つの塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
- 配列番号30の塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
- 配列番号25の塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
- 配列番号33の塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
- 配列番号79の塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
- 配列番号80の塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
- オリゴヌクレオチドである、請求項1〜6のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
- 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分及び/又はリン酸結合部分が修飾されている、請求項7に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
- 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分が、2’位の-OH基が、OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br及びIからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、請求項7又は8に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
(上記Rは、アルキル又はアリールを示し、上記R’は、アルキレンを示す。) - 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか1つのものである、請求項7〜9のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
- モルホリノオリゴマーである、請求項1〜6のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
- ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、請求項11に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
- ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、請求項1〜6のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
- 5’末端が、下記化学式(1)〜(3)のいずれかの基である、請求項11〜13のいずれかに記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬的に許容可能な塩若しくは水和物。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー患者の治療用医薬組成物。
- さらに医薬的に許容可能な担体を含む、請求項15に記載の医薬組成物。
- 前記筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子にエクソン45スキップの対象となる変異を有する患者である、請求項15又は16に記載の医薬組成物。
- 前記患者がヒトである、請求項15〜17のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 筋ジストロフィー治療用医薬組成物の製造における請求項1〜14のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー又はその医薬上許容される塩若しくは水和物の使用。
- 前記治療の対象となる筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子にエクソン45スキップの対象となる変異を有する患者である、請求項19に記載の使用。
- 前記患者がヒトである、請求項19又は20に記載の使用。
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