JP7041879B2

JP7041879B2 - アンチセンス核酸

Info

Publication number: JP7041879B2
Application number: JP2020080938A
Authority: JP
Inventors: 直樹渡辺; 悠一郎戸根; 伸一武田; 哲也永田
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd; National Center of Neurology and Psychiatry
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd; National Center of Neurology and Psychiatry
Priority date: 2014-06-17
Filing date: 2020-05-01
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2035-06-16
Also published as: KR20170017939A; KR102335810B1; AU2021203383A1; RU2017101172A3; CA2951221A1; US20180044675A1; CN111575282A; BR122020020864B1; RS59764B1; RU2019121781A; SI3159409T1; EP3159409B1; US9840706B2; IL249574A0; LT3159409T; JP2018027087A; SG10201912858VA; MX2016016526A; AU2024201290A1; WO2015194520A1

Description

本発明は、標的エクソン内の異なる2カ所以上の配列に相補的なヌクレオチド配列を含
む、エクソンスキッピング用アンチセンスオリゴマーに関する。より具体的には、ヒトジ
ストロフィン遺伝子の第44番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリ
ゴマー及び該オリゴマーを含む医薬組成物に関する。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は出生男子約3,500人に1人が発症する最も頻
度の高い遺伝性進行性筋疾患である。乳幼児期には正常のヒトとほとんど変わらない運動
機能を示すが、4～5歳頃から筋力低下がみられる。その後筋力低下は進行し12歳頃までに
歩行不能になり、20歳代で心不全又は呼吸不全により死に至る重篤な疾患である。現在、
DMDに対する有効な治療法はなく、新たな治療薬の開発が強く求められている。

DMDはジストロフィン遺伝子の変異が原因であることが知られている。ジストロフィン
遺伝子はX染色体に存在し、220万塩基のDNAから成る巨大な遺伝子である。DNAからmRNA前
駆体に転写され、さらにスプライシングによりイントロンが除かれ79のエクソンが結合し
たmRNAは13,993塩基になる。このmRNAから3,685のアミノ酸に翻訳され、ジストロフィン
タンパク質が生成される。ジストロフィンタンパク質は筋細胞の膜安定性の維持に関与し
ており、筋細胞を壊れにくくするために必要である。DMD患者のジストロフィン遺伝子は
変異を有するため、筋細胞において機能を持つジストロフィンタンパク質が殆ど発現され
ない。そのため、DMD患者体内では、筋細胞の構造を維持できなくなり、多量のカルシウ
ムイオンが筋細胞内に流れ込む。その結果、炎症に似た反応が生じ、線維化が進むために
筋細胞が再生されにくくなる。

ベッカー型筋ジストロフィー（BMD）もジストロフィン遺伝子の変異が原因であるが、
その症状は筋力低下を呈するものの一般にDMDと比較して軽く、筋力低下の進行も遅く、
多くの場合、成人期に発症する。DMDとBMDとの臨床症状の違いは、変異によりジストロフ
ィンのmRNAがジストロフィンタンパク質へと翻訳される際のアミノ酸読み取り枠が破壊さ
れるか、あるいは維持されるかによるものと考えられている（非特許文献1）。つまり、D
MDでは、アミノ酸読み取り枠がずれる変異を有することにより、機能を持つジストロフィ
ンタンパク質がほとんど発現しないが、BMDでは変異によりエクソンの一部は欠失してい
るが、アミノ酸読み取り枠は維持されているために不完全ながらも機能を有するジストロ
フィンタンパク質が産生される。

DMDの治療法として、エクソンスキッピング法が期待されている。この方法は、スプラ
イシングを改変することでジストロフィンのmRNAのアミノ酸読み取り枠を修復し、部分的
に機能を回復したジストロフィンタンパク質の発現を誘導する方法である（非特許文献2
）。エクソンスキッピングの対象となるアミノ酸配列部分は失われることになる。そのた
めこの治療で発現されるジストロフィンタンパク質は正常のものより短くなるが、アミノ
酸読み取り枠が維持されるために筋細胞を安定化する機能が部分的に保持される。従って
、エクソンスキッピングにより、DMDは、より軽症のBMDと同じような症状を呈するように
なると期待されている。エクソンスキッピング法は、マウスやイヌによる動物実験を経て
、ヒトDMD患者に対する臨床試験が行われている。

エクソンスキッピングは、5’又は3’スプライス部位のいずれか若しくは両方、又はエ
クソンの内部を標的とするアンチセンス核酸の結合により誘導することができる。エクソ
ンは両方のスプライス部位がスプライソソーム複合体によって認識された場合のみmRNAに
包含される。従って、スプライス部位をアンチセンス核酸でターゲッティングすることに
より、エクソンスキッピングを誘導することができる。また、エクソンがスプライシング
の機構に認識されるためにはエクソンスプライシングエンハンサー（ESE）へのセリンと
アルギニンに富むSRタンパク質の結合が必要であると考えられており、ESEをターゲッテ
ィングすることでもエクソンのスキッピングを誘導することができる。

ジストロフィン遺伝子の変異はDMD患者によって異なるため、遺伝子変異の場所や種類
に応じたアンチセンス核酸が必要になる。ジストロフィン遺伝子の単一エクソンに対して
、一つの連続する配列を標的としてエクソンスキッピングを誘導するアンチセンス核酸に
ついて複数の報告がある（特許文献1～6、並びに非特許文献1及び2）。また、ジストロフ
ィン遺伝子の同一エクソンを標的とする二種類のアンチセンス核酸を混合して作用させる
と（二重標的化）、各アンチセンス核酸を単独で用いた場合よりスキッピング活性が増強
される場合があることが報告されている（特許文献7）。

しかし、同一のエクソン内の2箇所以上を標的とする連結された一本鎖アンチセンス核
酸（連結型）がスキッピング活性を示すことは未だ報告されていない（特許文献1）。

国際公開公報第2004/048570号国際公開公報第2009/139630号国際公開公報第2010/048586号米国特許公開公報第2010/0168212号国際公開公報第2011/057350号国際公開公報第2006/000057号国際公開公報第2007/135105号

Annemieke Aartsma-Rus et al., (2002) Neuromuscular Disorders 12: S71-S77 Wilton S. D., e t al., Molecular Therapy 2007: 15: p. 1288-96

上記のような状況において、本発明は、ジストロフィン遺伝子の同一エクソン内の別の
2箇所の塩基配列を標的としてエクソンスキッピングを誘導する新規な連結型アンチセン
スオリゴマー及び同オリゴマーを含む筋ジストロフィー治療薬を提供することを主な目的
とする。

本発明者らは、上記文献に記載の技術内容及びジストロフィン遺伝子の構造などを詳細
に研究した結果、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44の異なる2か所を標的とするオ
リゴマーを連結して得られるアンチセンスオリゴマーが同エクソンのスキッピングを誘導
できることを見出した。本発明者らは、この知見に基づき、本発明を完成させた。

即ち、本発明は、以下のとおりである。
［１］
（a）標的エクソン内の連続する7～15塩基の第1のヌクレオチド配列に相補的な塩基配
列を含む第1のユニットオリゴマー；及び
（b）前記標的エクソン内の連続する7～15塩基の第2のヌクレオチド配列に相補的な塩基
配列を含む第2のユニットオリゴマー、
が連結した15～30塩基長のアンチセンスオリゴマーであって、
前記第1のヌクレオチド配列及び第2のヌクレオチド配列は連続又は互いに重複するもの
ではない、
前記標的エクソンのスキッピングを誘導する、アンチセンスオリゴマー、またはその医
薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
［２］
前記第1及び/又は第2のユニットオリゴマーが、前記標的エクソンに隣接するイントロ
ンの部分ヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む、前記［1］に記載のアンチセンス
オリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
［３］
前記標的エクソンがヒトジストロフィン遺伝子のエクソンである、前記［1］又は［2］
に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
［４］
前記第1のヌクレオチド配列が配列番号1に示すヌクレオチド配列から選択される連続す
る7～15塩基のヌクレオチド配列である、前記［1］又は［2］に記載のアンチセンスオリ
ゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
［５］
前記第2のヌクレオチド配列が配列番号2に示すヌクレオチド配列から選択される連続す
る7～15塩基のヌクレオチド配列である、前記［1］～［3］のいずれか一項に記載のアン
チセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
［６］
以下の（c）～（e）よりなる群より選ばれる2つのユニットオリゴマーが連結したもの
である、前記［1］又は［2］に記載のアンチセンスオリゴマー：
（c）配列番号3に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7～15塩基のヌクレオチ
ド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー；
（d）配列番号4に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7～15塩基のヌクレオチ
ド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー；及び
（e）配列番号5に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7～15塩基のヌクレオチ
ド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な
塩もしくは水和物。
［７］
配列番号6～9よりなる群から選ばれるいずれか一つの塩基配列からなる、前記［1］又
は［2］に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水
和物。
［８］
オリゴヌクレオチドである、前記［1］～［7］のいずれか一項に記載のアンチセンスオ
リゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
［９］
前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分及び/又はリ
ン酸結合部分が修飾されている、前記［8］に記載のアンチセンスオリゴマー、またはそ
の医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
［１０］前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分が
、2’位の-OH基が、OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br及びIか
らなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、前記［8］又は［9］
に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
（上記Rは、アルキル又はアリールを示し、上記R’は、アルキレンを示す。）

［１１］前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドのリン酸結
合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート
結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択され
るいずれか1つのものである、前記［8］～［10］のいずれか一項に記載のアンチセンスオ
リゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。

［１２］モルホリノオリゴマーである、前記［1］～［7］のいずれか一項に記載のアン
チセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。

［１３］ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、前記［12］に記載のアン
チセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。

［１４］ 5’末端が、下記化学式（1）～（3）のいずれかの基である、前記［12］又は
［13］に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和
物。

［１５］前記［1］～［14］のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、または
その医薬的に許容可能な塩もしくは水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医
薬組成物。

［１６］さらに医薬的に許容可能な担体を含む、前記［15］に記載の医薬組成物。

［１７］
前記［1］～［12］のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬
的に許容可能な塩もしくは水和物、あるいは前記［1］もしくは［16］に記載の前記医薬
組成物を筋ジストロフィー患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法。
［１８］前記筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子にエクソン44スキップの
対象となる変異を有する患者である、前記［17］に記載の治療方法。

［１９］
前記患者がヒトである、前記［17］又は［18］に記載の治療方法。
［２０］
筋ジストロフィー治療用医薬組成物の製造における前記［1］～［14］のいずれか一項
に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物の使
用。
［２１］
筋ジストロフィー治療に使用するための前記［1］～［14］のいずれか一項に記載のア
ンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
［２２］
前記治療において、筋ジストロフィー患者が、ジストロフィン遺伝子にエクソン44スキ
ップの対象となる変異を有する患者である、前記［21］に記載のアンチセンスオリゴマー
、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
［２３］
前記患者がヒトである、前記［21］又は［22］に記載のアンチセンスオリゴマー、また
はその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
［２４］
（a）標的エクソン内の連続する7～15塩基の第1のヌクレオチド配列に相補的な塩基配
列を含む第1のユニットオリゴマー；及び
（b）前記標的エクソン内の連続する7～15塩基の第2のヌクレオチド配列に相補的な塩基
配列を含む第2のユニットオリゴマー、
を連結することにより15～30塩基長のアンチセンスオリゴマーを作製する工程を含み、
ここで前記第1のヌクレオチド配列及び第2のヌクレオチド配列は連続又は互いに重複す
るものではない、
前記［1］に記載のアンチセンスオリゴマーの製造方法。
［２５］
前記工程で得られたアンチセンスオリゴマーのスキッピング効率を測定する工程、及び
基準値を超えるスキッピング効率を有するアンチセンスオリゴマーを選択する工程、
をさらに含む、前記［24］に記載の方法。
［２６］
（a）（i）標的エクソン内の連続する7～15塩基の第1のヌクレオチド配列に相補的な塩
基配列を含む第1のユニットオリゴマー；及び
（ii）前記標的エクソン内の連続する7～15塩基の第2のヌクレオチド配列に相補的
な塩基配列を含む第2のユニットオリゴマー、
を選択する工程（ここで前記第1のヌクレオチド配列及び第2のヌクレオチド配列は連続
又は互いに重複するものではない）、
(b)前記第1及び第2のユニットオリゴマーを連結することにより15～30塩基長のアンチ
センスオリゴマーを作製する工程、
(c)前記工程(b)で得られたアンチセンスオリゴマーのスキッピング効率を測定する工程
、及び
(d)基準値を超えるスキッピング効率を有するアンチセンスオリゴマーを選択する工程
、
を含む、アンチセンスオリゴマーのスクリーニング方法。

本発明のアンチセンスオリゴマーにより、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のス
キッピングを高効率に誘導することが可能である。また、本発明の医薬組成物を投与する
ことにより、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの症状を、効果的に軽減することができる
。

ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率（オリゴマー濃度別）を示す図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率を、異なる部位を標的とする2本のユニットオリゴマーを連結したものと、混合したものとで比較した図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率を、異なる部位を標的とする2本のユニットオリゴマーを連結したものと、混合したものとで比較した図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率を、異なる部位を標的とする2本のユニットオリゴマーを連結したものと、混合したものとで比較した図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率を、異なる部位を標的とする2本のユニットオリゴマーそれぞれ単独と、連結したものと、混合したものとで比較した図である。ヒト横紋筋肉腫細胞（RD細胞）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率を、異なる部位を標的とする2本のユニットオリゴマーそれぞれ単独と、連結したものと、混合したものとで比較した図である。エクソン45欠損DMD患者由来細胞におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピング効率を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示で
あり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱
しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許
文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2014年6 月17日
に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願2014-124157号）の明細
書及び図面に記載の内容を包含する。

1．アンチセンスオリゴマー
本発明は、（a）標的エクソン内の連続する7～15塩基の第1のヌクレオチド配列に相補
的な塩基配列を含む第1のユニットオリゴマー；及び
（b）前記標的エクソン内の連続する7～15塩基の第2のヌクレオチド配列に相補的な塩基
配列を含む第2のユニットオリゴマー、
が連結した15～30塩基長のアンチセンスオリゴマーであって、
前記第1のヌクレオチド配列及び第2のヌクレオチド配列は連続又は互いに重複するもの
ではない、前記標的エクソンのスキッピングを誘導する、アンチセンスオリゴマー、また
はその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物を提供する。
以下、「アンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物」
を単に「アンチセンスオリゴマー」と総称する場合がある。

上記アンチセンスオリゴマーは、

（a）標的エクソン内の連続する7～15塩基の第1のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列
を含む第1のユニットオリゴマー；及び
（b）前記標的エクソン内の連続する7～15塩基の第2のヌクレオチド配列に相補的な塩基
配列を含む第2のユニットオリゴマー、
を連結することにより15～30塩基長のアンチセンスオリゴマーを作製する工程を含み、
ここで前記第1のヌクレオチド配列及び第2のヌクレオチド配列は連続又は互いに重複す
るものではない、製造方法によって製造することができる。
上記製造方法は、前記工程で得られたアンチセンスオリゴマーのスキッピング効率を測
定する工程、及び
基準値を超えるスキッピング効率を有するアンチセンスオリゴマーを選択する第2の工
程、
をさらに含んでいてもよい。

前記製造方法の第2の工程において、スキッピング効率は、標的エクソンを含む遺伝子
のmRNAを被検細胞から回収し、該mRNAのうち、標的エクソンがスキップしたバンドのポリ
ヌクレオチド量「A」と、標的エクソンがスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド
量「B」を測定し、これら「A」及び「B」の測定値に基づき、以下の式に従って計算する
ことができる。

スキッピング効率（％）= A /（ A ＋ B ）x 100

またはスキッピング効率の計算については、国際公開公報第2012/029986号を参照する
こともできる。

第2の工程において、基準値となるスキッピング効率は、10％以上、20％以上、30％以
上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上である。
このように複数のユニットオリゴマーを連結することにより、ユニットオリゴマーのそ
れぞれのスキッピング活性が低い（あるいは同活性がない）場合であっても、スキッピン
グ活性の向上したアンチセンスオリゴマーが得られることになる。

同様に、
（a）（i）標的エクソン内の連続する7～15塩基の第1のヌクレオチド配列に相補的な塩
基配列を含む第1のユニットオリゴマー；及び
（ii）前記標的エクソン内の連続する7～15塩基の第2のヌクレオチド配列に相補的
な塩基配列を含む第2のユニットオリゴマー、
を選択する工程（ここで前記第1のヌクレオチド配列及び第2のヌクレオチド配列は連続
又は互いに重複するものではない）、
(b)前記第1及び第2のユニットオリゴマーを連結することにより15～30塩基長のアンチ
センスオリゴマーを作製する工程、
(c)前記工程(b)で得られたアンチセンスオリゴマーのスキッピング効率を測定する工程
、及び
(d)基準値を超えるスキッピング効率を有するアンチセンスオリゴマーを選択する工程
、
を含む、アンチセンスオリゴマーのスクリーニング方法が提供される。

上記アンチセンスオリゴマーにおいて前記第1及び第2のユニットオリゴマーは、いずれ
が5’側又は3’側に位置して連結していてもよいが、ある実施態様では第1のユニットオ
リゴマーが5’側に位置し、第2のユニットオリゴマーが3’側に位置して連結する。
また、前記アンチセンスオリゴマーは、前記標的エクソン内の連続する7～15塩基の第3
のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含む第3のユニットオリゴマーを含んでいても
よい。

ここで、「連結」とは、2つのユニットオリゴマーが直結しているか、あるいは媒介物
を介して結合していることを意味する。2つのユニットオリゴマーが直結している場合、5
’末端側に位置するユニットオリゴマーの3’末端と、3’末端側に位置するユニットオリ
ゴマーの5’末端とがリン酸結合又は以下の基を形成することを意味する。媒介物の例と
しては、1～5残基の核酸（鎖）の他、通常核酸やモルホリノ核酸誘導体を連結するために
使用される公知のものを用いることができるが、例えば、3-アミノプロピル、スクシニル
、2,2’-ジエタノールスルホニル、ロングチェーンアルキルアミノ（LCAA）を挙げること
ができる。

(式中、Xは、-OH、-CH₂R¹、-O-CH₂R¹、-S-CH₂R¹、-NR²R³又はFを表し；
R¹は、H、アルキルを表し；
R²及びR³は、同一又は異なって、H、アルキル、シクロアルキル、又は、アリールを表
し；
Y₁は、0、S、CH₂又はNR¹を表し；
Y₂は、0、S又はNR¹を表し；
Zは、0又はSを表す。)

前記第1及び/又は第2のユニットオリゴマーは、前記標的エクソンに隣接するイントロ
ンの部分ヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を含むものであってもよい。例えば、第1
のユニットオリゴマーが5’側に位置し、第2のユニットオリゴマーが3’側に位置して連
結する実施態様においては、第1のユニットオリゴマーの5’側に、標的エクソンの5’側
に隣接するイントロンの3’末端周辺部ヌクレオチド配列に相補的な塩基配列が含まれ、
及び/又は第2のユニットオリゴマーの3’側に、標的エクソンの3’側に隣接するイントロ
ンの5’末端周辺部ヌクレオチド配列に相補的な塩基配列が含まれていてもよい。

前記第１及び/又は第2のユニットオリゴマーがは、前記標的エクソンのエクソンスプライ
シングエンハンサー（ESE：Exonic Splicing Enhancer）の部分ヌクレオチド配列に相補
的な塩基配列を含むものであってもよい。

前記標的エクソンは特に限定されないが、ある実施態様ではヒトの遺伝子のエクソンで
あり、さらにはヒトジストロフィン遺伝子のエクソンである。
さらに具体的には、ヒトジストロフィン遺伝子の第44番目のエクソンである。
従って、本発明はある実施態様においてヒトジストロフィン遺伝子の第44番目のエクソ
ンをスキッピングしうるアンチセンスオリゴマー（以下、「本発明のオリゴマー」という
）を提供する。以下において、本発明のアンチセンスオリゴマーの構造について詳細に説
明する。

[ヒトジストロフィン遺伝子の第44番目のエクソン]
本発明において、「遺伝子」には、ゲノム遺伝子以外に、cDNA、mRNA前駆体及びmRNAも
含まれる。好ましくは、遺伝子は、mRNA前駆体、即ち、pre-mRNAである。
ヒトゲノムにおいて、ヒトジストロフィン遺伝子は遺伝子座Xp21.2に存在する。ヒトジ
ストロフィン遺伝子は、3.0 Mbpのサイズを有しており、既知のヒト遺伝子としては最大
の遺伝子である。但し、ヒトジストロフィン遺伝子のコード領域はわずか14kbに過ぎず、
該コード領域は79個のエクソンとしてジストロフィン遺伝子内に分散している（Roberts,
RG., et al., Genomics, 16: 536-538 (1993)）。ヒトジストロフィン遺伝子の転写物で
あるpre-mRNAは、スプライシングを受けて14kbの成熟mRNAを生成する。ヒトの野生型ジス
トロフィン遺伝子の塩基配列は公知である（GenBank Accession No. NM_004006）。
ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン44の塩基配列を配列番号10に示す。

ある実施態様において、本発明のオリゴマーは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン
44のスキッピングにより、DMD型ジストロフィン遺伝子でコードされるタンパク質を、BMD
型ジストロフィンタンパク質に改変することを目的として作製されたものである。従って
、本発明のオリゴマーのエクソンスキッピングの対象となるジストロフィン遺伝子のエク
ソン44には、野生型だけではなく、変異型も含まれる。
変異型のヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44は、具体的には、以下の（I）又は（I
I）に記載のポリヌクレオチドである。
（I）配列番号10の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（II）配列番号10の塩基配列に対して、90％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、DNA又はRNAを意味する。
本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」と
は、例えば、配列番号10の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部
又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイ
ゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリ
ヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook ＆ R
ussell， Molecular Cloning： A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, La
boratory Press 2001"及び"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John W
iley ＆ Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書中、「相補的な塩基配列」とは、対象となる塩基配列とワトソン・クリック対
を形成する塩基配列に限定されるものではなく、揺らぎ塩基対（Wobble base pair）を形
成する塩基配列も含む。ここで、ワトソン・クリック対とは、アデニン-チミン、アデニ
ン-ウラシル及びグアニン-シトシン間に水素結合が形成される塩基対を意味し、揺らぎ塩
基対とは、グアニン-ウラシル、イノシン-ウラシル、イノシン-アデニン及びイノシン-シ
トシン間に水素結合が形成される塩基対を意味する。また、「相補的な塩基配列」とは、
対象となる塩基配列と100％の相補性を有していなくてもよく、例えば、対象となる塩基
配列に対して、1～3個、1～2個又は1個の非相補的塩基が含まれていてもよい。
本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリ
ンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェン
トな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32
℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハ
ルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃又は5×SSC、1％ SDS、50 mM Tris－HCl（
pH7.5）、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例
えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃又は0.2×SSC、0
.1％ SDS、65℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有
するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼー
ションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長
さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素
を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct
Labelling and Detection System（GE Healthcare）を用いることができる。この場合は
、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを
一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1％（w/v）SDSを含む1次洗浄バッファーで
洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドを検出することができる。あるいは、配列
番号10の塩基配列と相補的な塩基配列の全部又は一部に基づいてプローブを作製する際に
、市販の試薬（例えば、PCRラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノス社）等）を用い
て該プローブをジゴキシゲニン（DIG）ラベルした場合には、DIG核酸検出キット（ロシュ
・ダイアグノス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
上記のハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドとしては、相同
性検索ソフトウェアであるBLASTにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したと
きに、配列番号10のポリヌクレオチドからなる配列と90％以上、91％以上、92％以上、93
％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、
99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以
上、又は99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
なお、塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST (Bas
ic Local Alignment Search Tool)（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; P
roc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに
基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al:
J Mol Biol 215: 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメータ
ーは、例えばscore = 100、wordlength = 12とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを
用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。

本発明のオリゴマーは、具体的には以下の(a)及び(b)よりなる群より選ばれる2つのユ
ニットオリゴマーが連結した、15～30塩基長のアンチセンスオリゴマーである。
（a）配列番号1に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7～15塩基のヌクレオチ
ド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー；及び
（b）配列番号2に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7～15塩基のヌクレオチ
ド配列に相補的な塩基配列からなるユニットオリゴマー
例えば、前記第1のヌクレオチド配列が配列番号1に示すヌクレオチド配列から選択され
る連続する7～15塩基のヌクレオチド配列であってもよく、及び/又は前記第2のヌクレオ
チド配列が配列番号2に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7～15塩基のヌクレ
オチド配列であってもよい。
好ましくは、本発明のオリゴマーは、以下の（c）～（e）よりなる群より選ばれる2つの
ユニットオリゴマーが連結した、15～30塩基長のアンチセンスオリゴマーである。
（c）配列番号3に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7～15塩基のヌクレオチ
ド配列に相補的な配列からなるユニットオリゴマー；
（d）配列番号4に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7～15塩基のヌクレオチ
ド配列に相補的な配列からなるユニットオリゴマー；及び
（e）配列番号5に示すヌクレオチド配列から選択される連続する7～15塩基のヌクレオチ
ド配列に相補的な配列からなるユニットオリゴマー

ここで、配列番号1及び2に示すヌクレオチド配列は、ヒトの野生型ジストロフィン遺伝
子のエクソン44のヌクレオチド配列（配列番号10）のうち、5’末端から数えてそれぞれ-
1～44番目の塩基からなる配列及び58～115番目の塩基からなる配列である。配列番号3
に示すヌクレオチド配列は、ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン44のヌクレオ
チド配列（配列番号10）のうち、5’末端から数えて18～34番目の塩基からなる配列であ
る。同様に、配列番号4及び5に示すヌクレオチド配列は、それぞれ61～77番目の塩基から
なる配列及び88～104番目の塩基からなる配列である。

上記（a）～（e）の各ユニットオリゴマー（以下、単に「ユニット」と称する場合もあ
る）のサイズは、7～15塩基長であり、好ましくは8～15塩基長、9～15塩基長、10～15塩
基長、10～14塩基長、10～13塩基長、11～13塩基長である。（a）～（e）の各ユニットの
サイズは同じであってもよく、異なっていてもよい。

(a)及び(b)よりなる群より2つのユニットオリゴマーを選ぶ際、2つのユニットオリゴマ
ーは同じユニットオリゴマーの組合せであってもよく、あるいは異なったユニットオリゴ
マーの組合せであってもよい。すなわち、2つのユニットオリゴマーは(a)及び(a)の組合
せ又は(b)及び(b)の組合せであってもよく、あるいは (a)及び(b) の組合せであってもよ
い。
また、（c）～（e）よりなる群より2つのユニットオリゴマーを選ぶ際、2つのユニットオ
リゴマーは同じユニットオリゴマーの組合せであってもよく、あるいは異なったユニット
オリゴマーの組合せであってもよいが、好ましくは異なる種類のユニットが1つずつ選ば
れる。例えば、1つのユニットとして（c）を選んだ場合、他方のユニットは（d）又は（e
）となることが好ましい。同様に一方にユニット（d）を選んだ場合、他方のユニットは
（c）又は（e）となることが好ましく、また、一方にユニット（e）を選んだ場合、他方
のユニットは（c）又は（d）となることが好ましい。

（a）及び(b)のユニットを選択した場合、選択された2つのユニットのいずれが5’末端
側に配置されてもよいが、（a）と（b）を選択した場合であればユニット（a）が3’末端
側に連結されることが好ましい。
（c）～（e）より2つのユニットを選択した場合、選択された2つのユニットのいずれが
5‘末端側に配置されてもよいが、（c）と（d）を選択した場合であればユニット（c）が
3’末端側に連結され、（d）と（e）を選択した場合であればユニット（d）が3’末端側
に連結され、（c）と（e）を選択した場合であればユニット（c）が3’末端側に連結され
ることが好ましい。

ここで、「連結」とは、(a)及び(b) より選択された2つのユニット、又は（c）～（e）
より選択された2つのユニットが直結していることを意味する。すなわち、2つのユニット
が連結している場合、5‘末端側に位置するユニットの3’末端と、3‘末端側に位置する
ユニットの5’末端とがリン酸結合又は以下の基を形成することを意味する。

「ヒトジストロフィン遺伝子の第44番目のエクソンのスキッピングを可能にする」とは
、ヒトジストロフィン遺伝子の転写物（例えば、pre-mRNA）のエクソン44に相当する部位
に本発明のオリゴマーが結合することにより、該転写物がスプライシングを受けた際に、
例えばエクソン45に欠失を有するDMD患者の場合、エクソン43の3’末端に相当する塩基配
列にエクソン46の5’末端に相当する塩基配列が連結し、コドンのフレームシフトが起こ
っていない成熟mRNAが形成されることを意味する。

ここで、前記「結合」は、本発明のオリゴマーとヒトジストロフィン遺伝子の転写物と
を混合した場合に、生理的条件下で両者がハイブリダイズして二本鎖を形成することを意
味する。上記「生理的条件下」とは、生体内と類似のpH、塩組成、温度に調節された条件
を意味する。例えば、25～40℃、好ましくは37℃、pH 5～8、好ましくは、pH 7.4であっ
て、塩化ナトリウム濃度が150 mMの条件が挙げられる。

ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピングが生じたか否かは、ジストロフ
ィン発現細胞（例えば、ヒト横紋筋肉腫細胞）に本発明のオリゴマーを導入し、前記ジス
トロフィン発現細胞のtotal RNAから、ヒトジストロフィン遺伝子のmRNAのエクソン44の
周辺領域をRT-PCR増幅し、該PCR増幅産物に対してnested PCR又はシークエンス解析を行
うことにより確認することができる。スキッピング効率は、ヒトジストロフィン遺伝子
のmRNAを被検細胞から回収し、該mRNAのうち、エクソン44がスキップしたバンドのポリヌ
クレオチド量「A」と、エクソン44がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「B
」を測定し、これら「A」及び「B」の測定値に基づき、以下の式に従って計算することが
できる。

スキッピング効率（％）= A /（ A ＋ B ）x 100

またはスキッピング効率の計算については、国際公開公報第2012/029986号を参照する
こともできる。

好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴマーは、10％以上、20％以上、30％以上、40
％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上の効率で標的エクソン（例
えば、エクソン44を）スキッピングする。

本発明のアンチセンスオリゴマーとしては、例えば、15～30塩基の長さを有する、オリ
ゴヌクレオチド、モルホリノオリゴマー、又はペプチド核酸（Peptide Nucleic Acid:PNA
）オリゴマーを挙げることができる。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴマーは、
16～30塩基、17～30塩基、18～30塩基、19～30塩基、20～30塩基、20～29塩基、20～28塩
基、20～27塩基、20～26塩基、21～26塩基又は22～26塩基の長さにあり、モルホリノオリ
ゴマーであることが好ましい。

前記オリゴヌクレオチド（以下、「本発明のオリゴヌクレオチド」という）は、ヌクレ
オチドを構成単位とする本発明のオリゴマーであり、かかるヌクレオチドは、リボヌクレ
オチド、デオキシリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドのいずれであってもよい。

修飾ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを構成する核
酸塩基、糖部分、及びリン酸結合部分の全部又は一部が修飾されているものをいう。

核酸塩基としては、例えば、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、チミン
、ウラシル又はそれらの修飾塩基を挙げることができる。かかる修飾塩基としては、例え
ば、シュードウラシル、3-メチルウラシル,ジヒドロウラシル、5-アルキルシトシン（例
えば、5-メチルシトシン）、5-アルキルウラシル（例えば、5-エチルウラシル）、5-ハロ
ウラシル（5-ブロモウラシル）、6-アザピリミジン、6-アルキルピリミジン（6-メチルウ
ラシル）、2-チオウラシル、4-チオウラシル、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒド
ロキシメチル) ウラシル、5'-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボ
キシメチルアミノメチルウラシル、1-メチルアデニン、1-メチルヒポキサンチン、2,2-ジ
メチルグアニン、3-メチルシトシン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、N6-メチル
アデニン、7-メチルグアニン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、5-メチルアミ
ノメチルウラシル、5-メチルカルボニルメチルウラシル、5-メチルオキシウラシル、5-メ
チル-2-チオウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢
酸、2-チオシトシン、プリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノプリン、イソグアニン、イ
ンドール、イミダゾール、キサンチン等が挙げられるが、これらに限定されるものではな
い。

糖部分の修飾としては、例えば、リボースの2’位の修飾及び糖のその他の部分の修飾
を挙げることができる。リボースの2’位の修飾としては、例えば、リボースの2’位の-O
H基をOR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br、Iに置換する修飾を挙
げることができる。ここで、Rはアルキル又はアリールを表す。R’はアルキレンを表す。
糖のその他の部分の修飾としては、例えば、リボース又はデオキシリボースの4’位のO
をSに置換したもの、糖の 2' 位と 4' 位を架橋したもの、例えば、LNA（Locked Nucleic
Acid）又はENA(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids)などが挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。

リン酸結合部分の修飾としては、例えば、ホスホジエステル結合をホスホロチオエート
結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合
、ボラノフォスフェート結合（Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry ,2008,
18, 9154-9160 ）に置換する修飾を挙げることができる（例えば、特許再公表公報第2006
/129594号及び第2006/038608号を参照）。

アルキルとしては、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数1～6のアルキルが好ましい。具体的に
は、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-
ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、n-ヘ
キシル、イソヘキシルが挙げられる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換
基としては、例えば、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これ
らが1～3個置換されていてもよい。
シクロアルキルとしては、炭素数5～12のシクロアルキルが好ましい。具体的には、例
えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシ
ル、シクロドデシルが挙げられる。
ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
アルコキシとしては、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数1～6のアルコキシ、例えば、メトキ
シ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキ
シ、tert-ブトキシ、n-ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、n-ヘキシルオキシ、イソ
ヘキシルオキシ等を挙げることができる。とりわけ、炭素数1～3のアルコキシが好ましい
。
アリールとしては、炭素数6～10のアリールが好ましい。具体的には、例えば、フェニ
ル、α-ナフチル、β-ナフチルを挙げることができる。とりわけフェニルが好ましい。当
該アリールは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、アルキル、ハロゲ
ン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが1～3個置換されていても
よい。
アルキレンとしては、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数1～6のアルキレンが好ましい。具体
的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン
、ヘキサメチレン、2-（エチル）トリメチレン、1-（メチル）テトラメチレンを挙げるこ
とができる。アシルとしては、直鎖状若しくは分枝鎖状のアルカノイル、又はアロイル
を挙げることができる。アルカノイルとしては、例えば、ホルミル、アセチル、2－メチ
ルアセチル、2，2－ジメチルアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ペンタ
ノイル、2，2－ジメチルプロピオニル、ヘキサノイル等が挙げられる。アロイルとしては
、例えば、ベンゾイル、トルオイル、ナフトイルを挙げることができる。かかるアロイル
は置換可能な位置において置換されていてもよく、アルキルで置換されていてもよい。

本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、リボースの2’位の-OH基がメトキシで置
換され、リン酸結合部分がホスホロチオエート結合である、下記一般式で表される基を構
成単位とする本発明のオリゴマーである。

（式中、Baseは、核酸塩基を表す。）

本発明のオリゴヌクレオチドは、各種自動合成装置（例えば、AKTA oligopilot plus 1
0 / 100（GE Healthcare））を用いて容易に合成することが可能であり、あるいは、第三
者機関（例えば、Promega社又はTakara社）等に委託して作製することもできる。

前記モルホリノオリゴマーは、下記一般式で表される基を構成単位とする本発明のオリ
ゴマーである。

（式中、Baseは、前記と同義であり；
Wは、以下のいずれかの式で表わされる基を表す。

(式中、Xは、-CH₂R¹、-O-CH₂R¹、-S-CH₂R¹、-NR²R³又はFを表し；
R¹は、H、アルキルを表し；
R²及びR³は、同一又は異なって、H、アルキル、シクロアルキル、又は、アリールを表
し；
Y₁は、0、S、CH₂又はNR¹を表し；
Y₂は、0、S又はNR¹を表し；
Zは、0又はSを表す。))

モルホリノオリゴマーは、好ましくは、以下の式で表わされる基を構成単位とするオリ
ゴマー（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（以下、「PMO」という））である
。

（式中、Base、R²、R³は、前記と同義である。）

モルホリノオリゴマーは、例えば、国際公開公報第1991/009033号、又は国際公開公報
第2009/064471号に従って製造することができる。特に、PMOは、国際公開公報第2009/064
471号に記載の方法に従って製造するか、又は国際公開公報第2013/100190号に記載の方法
に従って製造することができる。

[PMOの製法]
PMOの1つの態様として、例えば、次の一般式(I)で表される化合物（以下、PMO(I)とい
う。）を挙げることができる。

［式中、各Base、R²、R³は、前記と同義であり；
nは、1～99の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、18～28の範囲内にある任意
の整数である。］

PMO（I）は、公知の方法に従い製造することができるが、例えば、下記工程の操作を実
施することにより製造することができる。
下記工程に使用されている化合物及び試薬は、PMOの製造に一般的に使用されているも
のであれば特に限定されない。

また、下記のすべての工程は、液相法又は固相法（マニュアル又は市販の固相自動合成
機を用いる）で実施することができる。固相法でPMOを製造する場合、操作手順の簡便化
及び合成の正確性の点から自動合成機を用いる方法が望ましい。

（1）工程A：
次の一般式（II）で表される化合物（以下、化合物（II）という。）に酸を作用させる
ことによって、次の一般式（III）で表される化合物（以下、化合物（III）という。）を
製造する工程。

［式中、n、R²、R³は、前記と同義であり；
各B^Pは，独立して、保護されていてもよい核酸塩基を表し；
Tは、トリチル基、モノメトキシトリチル基、又はジメトキシトリチル基を表し；
Lは、水素、アシル、又は次の一般式（IV）で表される基（以下、基（IV）という。）
を表す。］

B^Pに係る「核酸塩基」としては、Baseと同じ「核酸塩基」を挙げることができる。但し
、B^Pに係る核酸塩基のアミノ基又は水酸基は保護されていてもよい。
かかるアミノ基の保護基としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制
限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、4-メトキシベンゾイル、アセチル、プロピ
オニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、4-tert-ブ
チルフェノキシアセチル、4-イソプロピルフェノキシアセチル、(ジメチルアミノ)メチレ
ンを挙げることができる。水酸基の保護基としては、例えば、2-シアノエチル、4－ニト
ロフェネチル、フェニルスルホニルエチル、メチルスルホニルエチル、トリメチルシリル
エチル、置換可能な任意の位置で1～5個の電子吸引性基で置換されていてもよいフェニル
、ジフェニルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、メチルフェ
ニルカルバモイル、1-ピロリジニルカルバモイル、モルホリノカルバモイル、4-（tert-
ブチルカルボキシ）ベンジル、4-[(ジメチルアミノ)カルボキシ]ベンジル、4-(フェニル
カルボキシ)ベンジルを挙げることができる（例えば、国際公開公報第2009/064471号公報
参照）。
「固相担体」としては、核酸の固相反応に使用しうる担体であれば特に制限されないが
、例えば、（i）モルホリノ核酸誘導体の合成に使用しうる試薬（例えば、ジクロロメタ
ン、アセトニトリル、テトラゾール、N-メチルイミダゾール、ピリジン、無水酢酸、ルチ
ジン、トリフルオロ酢酸）にほとんど溶解せず、（ii）モルホリノ核酸誘導体の合成に使
用しうる試薬に対して化学的に安定であり、（iii）化学修飾ができ、（iv）望ましいモ
ルホリノ核酸誘導体の装填ができ、（v）処理中にかかる高圧に耐える十分な強度をもち
、（vi）一定の粒径範囲と分布であるものが望ましい。具体的には、膨潤性ポリスチレン
（例えば、アミノメチルポリスチレン樹脂 1%ジベンジルベンゼン架橋（200～400メッシ
ュ）（2.4～3.0mmol/g）（東京化成社製）、Aminomethylated Polystyrene Resin・HCl［
ジベンジルベンゼン1%，100～200メッシュ］（ペプチド研究所社製））、非膨潤性ポリス
チレン（例えば、Primer Support(GE Healthcare社製））、PEG鎖結合型ポリスチレン（
例えば、NH₂-PEG resin（渡辺化学社製）、TentaGel resin）、定孔ガラス（controlled
pore glass;CPG）（例えば、CPG社製）、オキサリル化－定孔ガラス（例えば、Alulら，N
ucleic Acids Research,Vol.19,1527(1991)を参照）、TentaGel支持体－アミノポリエチ
レングリコール誘導体化支持体（例えば、Wrightら，Tetrahedron Letters,Vol.34,3373(
1993)を参照）、Poros-ポリスチレン/ジビニルベンゼンのコポリマーを挙げることができ
る。
「リンカー」としては、通常核酸やモルホリノ核酸誘導体を連結するために使用される
公知のものを用いることができるが、例えば、3-アミノプロピル、スクシニル、2,2’-ジ
エタノールスルホニル、ロングチェーンアルキルアミノ（LCAA）を挙げることができる。

本工程は、化合物（II）に酸を作用させることにより実施することができる。

本工程に使用しうる「酸」としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸又はト
リクロロ酢酸を挙げることができる。酸の使用量としては、例えば、化合物（II）1モル
に対して0.1モル当量～1000モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは1モル当量～100
モル当量の範囲内である。
また、前記酸と一緒に、有機アミンを使用することができる。有機アミンとしては、特
に限定されるものではないが、例えば、トリエチルアミンを挙げることができる。有機ア
ミンの使用量は、例えば、酸1モルに対して、0.01モル当量～10モル当量の範囲内が適当
であり、好ましくは、0.1モル当量～2モル当量の範囲内である。
本工程において酸と有機アミンとの塩又は混合物を使用する場合には、例えば、トリフ
ルオロ酢酸とトリエチルアミンの塩又は混合物を挙げることができ、より具体的には、ト
リフルオロ酢酸2当量に対してトリエチルアミン1当量を混合したものを挙げることができ
る。
本工程に使用しうる酸は、0.1%～30%の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈し
て使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例
えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロパノール
、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。

上記反応における反応温度は、例えば、10℃～50℃の範囲内が好ましく、より好ましく
は、20℃～40℃の範囲内であり、さらに好ましくは、25℃～35℃の範囲内である。
反応時間は、使用する酸の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分～24時間の範
囲内が適当である。好ましくは、1分～5時間の範囲内である。

また、本工程が終了した後、必要に応じて、系中に存在する酸を中和するために塩基を
添加することができる。「塩基」としては、特に限定されないが、例えば、ジイソプロピ
ルアミンが挙げられる。塩基は、0.1%（v/v）～30%（v/v）の範囲内の濃度になるように
適当な溶媒で希釈して使用することもできる。
本工程に用いる溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメ
タン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエ
タノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。反応温度は、例えば、10
℃～50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、20℃～40℃の範囲内であり、さらに好ま
しくは、25℃～35℃の範囲内である。
反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常0.1分～24時間の
範囲内が適当であり、好ましくは、1分～5時間の範囲内である。

なお、化合物（II）において、n=1であって、Lが基（IV）である、次の一般式（IIa）
で表される化合物（以下、化合物（IIa）という。）は、以下の方法に従って製造するこ
とができる。

［式中、B^P、T、リンカー、固相担体は、前記と同義である。］

工程1：
次の一般式（V）で表される化合物にアシル化剤を作用させることによって、次の一般
式（VI）で表される化合物（以下、化合物（VI）という。）を製造する工程。

［式中、B^P、T、リンカーは、前記と同義であり；
R⁴は、水酸基、ハロゲン、又は、アミノを表す。］

本工程は、化合物（V）を出発原料として、公知のリンカーの導入反応により実施する
ことができる。
特に、次の一般式（VIa）で表される化合物は、化合物（V）と無水コハク酸とを用いて
エステル化反応として知られた方法を実施することにより製造することができる。

［式中、B^P、Tは、前記と同義である。］

工程2：
化合物（VI）に縮合剤等を作用させることによって、固相担体と反応させ、化合物（II
a）を製造する工程。

［式中、B^P、R⁴、T、リンカー、固相担体は、前記と同義である。］
本工程は、化合物(VI)と固相担体とを用いて縮合反応として知られた方法により製造す
ることができる。

化合物(II)において、n=2～99であって、Lが基(IV)である、次の一般式(IIa2)で表され
る化合物は、化合物(IIa)を出発原料とし、本明細書に記載のPMOの製法にかかる工程A及
び工程Bを所望の回数繰り返し実施することにより製造することができる。

［式中、B^P、R²、R³、T、リンカー、固相担体は、前記と同義であり；
n’は、1～98を表す。］

また、化合物(II)において、n=1であって、Lが水素である、次の一般式(IIb)で表され
る化合物は、例えば、国際公開公報第1991/009033号に記載の方法により製造することが
できる。

［式中、B^P、Tは、前記と同義である。］

化合物（II）において、n=2～99であって、Lが水素である、次の一般式（IIb2）で表さ
れる化合物は、化合物（IIb）を出発原料とし、本明細書に記載のPMOの製法にかかる工程
A及び工程Bを所望の回数繰り返し実施することにより製造することができる。

［式中、B^P、n’、R²、R³、Tは、前記と同義である。］

また、化合物（II）において、n=1であって、Lがアシルである、次の一般式（IIc）で
表される化合物は、化合物（IIb）に対してアシル化反応として知られた方法を実施する
ことにより製造することができる。

［式中、B^P、Tは、前記と同義であり；
R⁵は、アシルを表す。］

化合物（II）において、n=2～99であって、Lがアシルである、次の一般式（IIc2）で表
される化合物は、化合物（IIc）を出発原料とし、本明細書に記載のPMOの製法にかかる工
程A及び工程Bを所望の回数繰り返し実施することにより製造することができる。

［式中、B^P、n’、R²、R³、R⁵、Tは、前記と同義である。］

（2）工程B：
化合物（III）に塩基存在下にモルホリノモノマー化合物を作用させることによって、
次の一般式（VII）で表される化合物（以下、化合物（VII）という。）を製造する工程。

［式中、各B^P、L、n、R²、R³、Tは、前記と同義である。］

本工程は、化合物（III）に塩基存在下にモルホリノモノマー化合物を作用させること
により実施することができる。

モルホリノモノマー化合物としては、例えば、次の一般式（VIII）で表される化合物を
挙げることができる。

［式中、B^P、R²、R³、Tは前記と同義である。］
本工程に使用しうる「塩基」としては、例えば、ジイソプロピルアミン、トリエチルア
ミン、又は、N-エチルモルホリンを挙げることができる。塩基の使用量としては、例えば
、化合物（III）1モルに対して、1モル当量～1000モル当量の範囲内が適当であり、好ま
しくは10モル当量～100モル当量の範囲内である。
本工程に使用しうるモルホリノモノマー化合物および塩基は、0.1%～30%の濃度になる
ように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなけれ
ば特に限定されないが、例えば、N,N-ジメチルイミダゾリドン、N-メチルピペリドン、DM
F、ジクロロメタン、アセトニトリル、テロラヒドロフラン、又はこれらの混合物を挙げ
ることができる。

反応温度は、例えば、0℃～100℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、10℃～50℃の
範囲内である。
反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常1分～48時間の範
囲内が適当であり、好ましくは、30分～24時間の範囲内である。

さらに本工程の終了後、必要に応じて、アシル化剤を添加することができる。「アシル
化剤」としては、例えば、無水酢酸、酢酸クロライド、フェノキシ酢酸無水物を挙げるこ
とができる。アシル化剤は、例えば、0.1%～30%の範囲内の濃度になるように適当な溶媒
で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されな
いが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロ
パノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる
。
また、必要であれば、アシル化剤と一緒に、例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン、
トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-エチルモルホリン等の塩基を使用す
ることができる。アシル化剤の使用量としては、0.1モル当量～10000モル当量の範囲内が
好ましく、1モル当量～1000モル当量の範囲内がより好ましい。塩基の使用量としては、
例えば、アシル化剤1モルに対して、0.1モル当量～100モル当量の範囲内が適当であり、
好ましくは1モル当量～10モル当量の範囲内である。
本反応の反応温度は、10℃～50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、10℃～50℃の
範囲内が好ましく、より好ましくは、20℃～40℃の範囲内であり、さらに好ましくは、25
℃～35℃の範囲内である。反応時間は、例えば、使用するアシル化剤の種類、反応温度に
よって異なるが、通常0.1分～24時間の範囲内が適当であり、好ましくは、1分から5時間
の範囲内である。

（3）工程C：
工程Bにおいて製造される化合物（VII）において、脱保護剤を用いて保護基を脱離し、
一般式（IX）で表される化合物を製造する工程。

［式中、Base、B^P、L、n、R²、R³、Tは、前記と同義である。］

本工程は、化合物（VII）に脱保護剤を作用させることにより実施することができる。

「脱保護剤」としては、例えば、濃アンモニア水、メチルアミンを挙げることができる
。本工程に使用しうる「脱保護剤」は、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロ
ピルアルコール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、DMF、N,N-ジメチルイミダゾリ
ドン、N-メチルピペリドン又はこれらの混合溶媒で希釈して使用することもできる。なか
でも、エタノールが好ましい。脱保護剤の使用量としては、例えば、化合物（VII）1モル
に対して、例えば、1モル当量～100000モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは10モ
ル当量～1000モル当量の範囲内である。

反応温度は、例えば、15℃～75℃の範囲内が適当であり、好ましくは40℃～70℃の範囲
内であり、より好ましくは50℃～60℃の範囲内である。脱保護反応時間は、化合物（VII
）の種類、反応温度等によって異なるが、10分～30時間の範囲内が適当であり、好ましく
は30分～24時間の範囲内であり、より好ましくは5時間～20時間の範囲内である。

（4）工程D：
工程Cにおいて製造される化合物（IX）に酸を作用させることによって、PMO（I）を製
造する工程。

［式中、Base、n、R²、R³、Tは、前記と同義である。］

本工程は、化合物（IX）に酸を加えることによって実施することができる。

本工程において使用しうる「酸」としては、例えば、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、
酢酸、リン酸及び塩酸等を挙げることができる。酸の使用量としては、例えば、溶液のpH
が0.1～4.0の範囲内になるように使用するのが適当であり、より好ましくは1.0～3.0の範
囲内になるように使用する。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、
例えば、アセトニトリル、水、又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。

反応温度は、10℃～50℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、20℃～40℃の範囲内で
あり、さらに好ましくは、25℃～35℃の範囲内である。脱保護反応時間は、化合物（IX）
の種類、反応温度等によって異なるが、0.1分～5時間の範囲内が適当であり、好ましくは
1分～1時間の範囲内であり、より好ましくは1分～30分の範囲内である。

PMO(I)は、本工程で得られた反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、濃縮
、中和、濾過、遠心分離、再結晶、C₈からC₁₈の逆相カラムクロマトグラフィー、陽イオ
ン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カ
ラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析、限界ろ過などの手段を単
独若しくは組み合わせて用いることにより得ることができ、所望のPMO(I)を単離精製する
ことができる（例えば、国際公開公報WO1991/09033を参照）。
逆相クロマトグラフィーを用いてPMO(I)を精製する場合には、溶出溶媒として、例えば
20mMのトリエチルアミン／酢酸緩衝液とアセトニトリルの混合溶液を使用することができ
る。
また、イオン交換クロマトグラフィーを用いてPMO(I)を精製する場合には、例えば、1M
の食塩水と10mMの水酸化ナトリウム水溶液の混合溶液を使用することができる。

前記ペプチド核酸オリゴマーは、下記一般式で表される基を構成単位とする本発明のオ
リゴマーである。

（式中、Baseは、前記と同義である。）
ペプチド核酸は、例えば、以下の文献に従って製造することができる。
1）P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt，Science, 254, 1497 (1991)
2）M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg，Jacs., 114, 1895 (1992)
3）K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpiu
s, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt，J. Org. Chem., 59, 57
67 (1994)
4）L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. K
och, M. Egholm，O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci.,
1, 175 (1995)
5）T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Oru
m, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)

また、本発明のオリゴマーは、5’末端が、下記化学式（1）～（3）のいずれかの基であ
ってもよい。好ましくは(3)-OHである。

以下、上記(1)、(2)及び(3)で示される基を、それぞれ「基(1)」、「基(2)」及び「基(
3)」と呼ぶ。

2．医薬組成物
本発明のオリゴマーは、ジストロフィン遺伝子のエクソン44のスキッピングを可能にす
る。従って、本発明のオリゴマーを含む医薬組成物をジストロフィン遺伝子にエクソン44
スキップの対象となる変異（エクソン44スキッピングでin-frame化する変異）を有するDM
D患者に投与することにより、筋ジストロフィーの症状を緩和することができると予測さ
れる。また、短い鎖長からなる本発明のオリゴマーは製造工程が簡便であり、さらに製造
コストが抑えられるというメリットがある。
そこで、別の実施態様として、本発明のオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水
和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医薬組成物（以下、「本発明の組成物」
という）を提供する。

本発明の組成物に含まれる本発明のオリゴマーの医薬的に許容可能な塩の例としては、
ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネ
シウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル
塩、コバルト塩などの金属塩;アンモニウム塩；t-オクチルアミン塩、ジベンジルアミン
塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジ
アミン塩、N-メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン
塩、ジシクロヘキシルアミン塩、N， N' -ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカ
イン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、N-ベンジル-フェネチルアミン塩、ピペ
ラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩のよ
うな有機アミン塩;弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のようなハロゲ
ン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩;メタンスルホン
酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスル
ホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸
塩；酢酸塩、りんご酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸
塩、マレイン酸塩などの有機酸塩;グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩
、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩などが挙げられる。これらの塩
は、公知の方法で製造することができる。あるいは、本発明の組成物に含まれる本発明の
オリゴマーは、その水和物の形態にあってもよい。

本発明の組成物の投与形態は、医薬的に許容可能な投与形態であれば特に制限されず、
治療方法に応じて選択することができるが、筋組織への送達容易性の観点から、静脈内投
与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、組織内投与、経皮投与等が好ましい
。また、本発明の組成物が取り得る剤型としては、特に制限されないが、例えば、各種の
注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤等を挙げることができる。

本発明のオリゴマーを筋ジストロフィー患者に投与する場合、本発明の組成物は、該オ
リゴマーの筋組織への送達を促進する担体を含むことが好ましい。このような担体は、医
薬的に許容可能なものであれば特に制限されず、その例として、カチオン性リポソーム、
カチオン性ポリマー等のカチオン性担体、又はウイルスエンベロープを利用した担体を挙
げることができる。カチオン性リポソームとしては、例えば、2-O-（2-ジエチルアミノエ
チル）カルバモイル-1,3-O-ジオレオイルグリセロールとリン脂質とを必須構成成分とし
て形成されるリポソーム（以下、「リポソームA」という）、オリゴフェクトアミン（登
録商標）（Invitrogen社製）、リポフェクチン（登録商標）（Invitrogen社製）、リポフ
ェクトアミン（登録商標）（Invitrogen社製）、Lipofectamine 2000（登録商標）（Invi
trogen社製）、DMRIE-C（登録商標）（Invitrogen社製）、GeneSilencer（登録商標）（G
ene Therapy Systems社製）、TransMessenger（登録商標）（QIAGEN社製）、TransIT TKO
（登録商標）（Mirus社製）、Nucleofector II（Lonza）を挙げることができる。それら
の中で、リポソームAが好ましい。カチオン性ポリマーとしては、例えば、JetSI（登録商
標）（Qbiogene社製）、Jet-PEI（登録商標）（ポリエチレンイミン、Qbiogene社製）を
挙げることができる。ウイルスエンベロープを利用した担体としては、例えば、GenomeOn
e（登録商標）（HVJ-Eリポソーム、石原産業社製）を挙げることができる。あるいは、特
許2924179号に記載の医薬デバイス、特許再公表公報第2006/129594号及び特許再公表公報
第2008/096690号に記載のカチオン性担体を用いることもできる。

本発明の組成物に含まれる本発明のオリゴマーの濃度は、担体の種類等によって異なるが
、0.1 nM～100 μMの範囲内が適当であり、1 nM～10 μMの範囲内が好ましく、10 nM～1
μMの範囲内がより好ましい。また、本発明の組成物に含まれる本発明のオリゴマーと担
体との重量比（担体/本発明のオリゴマー）は、該オリゴマーの性質及び該担体の種類等
によって異なるが、0.1～100の範囲内が適当であり、1～50の範囲内が好ましく、10～20
の範囲内がより好ましい。

本発明の組成物には、本発明のオリゴマーと上述した担体以外に、任意に医薬的に許容
可能な添加剤を配合することができる。かかる添加剤として、例えば、乳化補助剤（例え
ば、炭素数6～22の脂肪酸やその医薬的に許容可能な塩、アルブミン、デキストラン）、
安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩化ナト
リウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、pH調整剤
（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノ
ールアミン）を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。
本発明の組成物中の当該添加剤の含有量は、90重量％以下が適当であり、70重量％以下が
好ましく、50重量％以下がより好ましい。

本発明の組成物は、担体の分散液に本発明のオリゴマーを加え、適当に攪拌することに
より調製することができる。また、添加剤は、本発明のオリゴマーの添加前でも添加後で
も適当な工程で添加することができる。本発明のオリゴマーを添加させる際に用い得る水
性溶媒としては、医薬的に許容可能なものであれば特に制限されず、例えば、注射用水、
注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液、マルトース液等の糖液を挙げるこ
とができる。また、かかる場合のpH及び温度等の条件は、当業者が適宜選択することがで
きる。

本発明の組成物は、例えば、液剤やその凍結乾燥製剤とすることができる。当該凍結乾
燥製剤は、常法により、液剤の形態を有している本発明の組成物を凍結乾燥処理すること
により調製することができる。例えば、液剤の形態を有している本発明の組成物を適当な
滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約－40～－20℃の条件で予備凍結を2時
間程度行い、約0～10℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約15～25℃で減圧下に二次
乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換
し、打栓して本発明の組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。

本発明の組成物の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によ
って再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩
水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異な
り特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の0.5～2倍量、又は500 mL以下が適当である。

本発明の組成物を投与する際の用量としては、含有される本発明のオリゴマーの種類、
剤形、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度を考慮した上で調製する
ことが望ましいが、成人に対して本発明のオリゴマーの量として、1日当たり0.1mg～10g/
ヒトの範囲内が、好ましくは1 mg～1 g/ヒトの範囲内が一般的である。この数値は標的と
する疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によっ
てはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。また
1日1回から数回の投与又は1日から数日間の間隔で投与することができる。

本発明の組成物の別の態様として、本発明のオリゴヌクレオチドを発現し得るベクター
と上述した担体とを含む医薬組成物を挙げることができる。かかる発現ベクターは、複数
の本発明のオリゴヌクレオチドを発現し得るものであってもよい。当該組成物には、本発
明のオリゴマーを含有する本発明の組成物と同様に、医薬的に許容可能な添加剤を添加す
ることができる。当該組成物中に含まれる発現ベクターの濃度は、担体の種類等によって
異なるが、0.1 nM～100 μMの範囲内が適当であり、1 nM～10 μMの範囲内が好ましく、1
0 nM～1 μMの範囲内がより好ましい。当該組成物中に含まれる発現ベクターと担体との
重量比（担体/発現ベクター）は、発現ベクターの性質、担体の種類等によって異なるが
、0.1～100の範囲内が適当であり、1～50の範囲内が好ましく、10～20の範囲内がより好
ましい。また、当該組成物中に含まれる担体の含有量は、本発明のオリゴマーを含有する
本発明の組成物の場合と同様であり、その調製方法等に関しても、本発明の組成物の場合
と同様である。

以下に、実施例及び試験例を掲げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は実施例
に示される範囲に限定されるものではない。

［参考例1］
アミノポリスチレン樹脂に担持された4－｛［（2S，6R）－6－（4－ベンズアミド－2－オ
キソピリミジン－1－イル）－4－トリチルモルホリン－2－イル］メトキシ｝－4－オキソ
ブタン酸
工程1：4－｛［（2S，6R）－6－（4－ベンズアミド－2－オキソピリミジン－1（2H）－イ
ル）－4－トリチルモルホリン－2－イル］メトキシ｝－4－オキソブタン酸の製造
アルゴン雰囲気下、N－｛1－［（2R，6S）－6－（ヒドロキシメチル）－4－トリチルモ
ルホリン－2－イル］－2－オキソ－1，2－ジヒドロピリミジン－4－イル｝ベンズアミド3
.44gと4－ジメチルアミノピリジン（4－DMAP）1.1gをジクロロメタン50mLに懸濁し、無水
コハク酸0.90gを加え、室温で3時間撹拌した。反応液にメタノール10mLを加え、減圧濃縮
した。残渣に酢酸エチルと0.5Mのリン酸二水素カリウム水溶液を用いて抽出操作を行った
。得られた有機層を0.5Mのリン酸二水素カリウム水溶液、水、飽和食塩水の順で洗浄した
。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮し、4.0gの目的物を得た。

工程2：アミノポリスチレン樹脂に担持された4－｛［（2S，6R）－6－（4－ベンズアミド
－2－オキソピリミジン－1－イル）－4－トリチルモルホリン－2－イル］メトキシ｝－4
－オキソブタン酸の製造
4－｛［（2S，6R）－6－（4－ベンズアミド－2－オキソピリミジン－1（2H）－イル）
－4－トリチルモルホリン－2－イル］メトキシ｝－4－オキソブタン酸4.0gをピリジン（
脱水）200mLに溶解し、4－DMAP0.73g、1－エチル－3‐（3－ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩11.5gを加えた。次いで、アミノポリスチレン樹脂 Primer support
200 amino（GE Healthcare Japan社製、17-5214-97）25.0g、トリエチルアミン8.5mLを
加え、室温で4日間振とうした。反応後、樹脂をろ取した。得られた樹脂をピリジン、メ
タノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥した。得られた樹脂にテトラヒドロフ
ラン（脱水）200mL、無水酢酸15mL、2，6－ルチジン15mLを加え、室温で2時間振とうした
。樹脂をろ取し、ピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥し、26
.7gの目的物を得た。
当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂1g当たりのトリチルのモル
量を409nmにおけるUV吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、1
29.2μmol/gであった。

UV測定条件
機器：U-2910（日立製作所）
溶媒：メタンスルホン酸
波長：409 nm
ε値：45000

［参考例2］
アミノポリスチレン樹脂に担持された4－｛［（2S，6R）－6－（5-メチル－2,4－ジオキ
ソピリミジン－1－イル）－4－トリチルモルホリン－2－イル］メトキシ｝－4－オキソブ
タン酸
参考例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、参考例1の工程1で用いたN
－｛1－［（2R，6S）－6－（ヒドロキシメチル）－4－トリチルモルホリン－2－イル］－
2－オキソ－1，2－ジヒドロピリミジン－4－イル｝ベンズアミドの代わりに、本工程では
、1－［（2R，6S）－6－（ヒドロキシメチル）－4－トリチルモルホリン－2－イル］－5
－メチルピリミジン－2，4（1H，3H）－ジオンを使用した。
当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂1g当たりのトリチルのモル量
を409nmにおけるUV吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、164
.0μmol/gであった。

［参考例3］
アミノポリスチレン樹脂に担持された4－｛［（2S，6R）－6－（6－ベンズアミドプリン
－9－イル）－4－トリチルモルホリン－2－イル］メトキシ｝－4－オキソブタン酸
参考例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、参考例1の工程1で用いたN
－｛1－［（2R，6S）－6－（ヒドロキシメチル）－4－トリチルモルホリン－2－イル］－
2－オキソ－1，2－ジヒドロピリミジン－4－イル｝ベンズアミドの代わりに、本工程では
、N-｛9-[(2R,6S)-6-(ヒドロキシメチル)-4-トリチルモルフォリン-2-イル]プリン-6-イ
ル｝ベンズアミドを使用した。
当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂1g当たりのトリチルのモル量
を409nmにおけるUV吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、185
.7μmol/gであった。

［参考例4］
アミノポリスチレン樹脂に担持された4－｛｛（2S，6R）－6－｛6－（2－シアノエトキシ
）－2－［（2－フェノキシアセチル）アミノ]プリン－9－イル}－4－トリチルモルホリン
－2－イル｝メトキシ｝－4－オキソブタン酸
参考例1と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、参考例1の工程1で用いたN
－｛1－［（2R，6S）－6－（ヒドロキシメチル）－4－トリチルモルホリン－2－イル］－
2－オキソ－1，2－ジヒドロピリミジン－4－イル｝ベンズアミドの代わりに、本工程では
、N－｛6－（2－シアノエトキシ）－9－[（2R，6S）－6－（ヒドロキシメチル）－4－ト
リチルモルホリン－2－イル]プリン－2－イル｝－2－フェノキシアセトアミドを使用した
。
当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂1g当たりのトリチルのモル量
を409nmにおけるUV吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、164
.8μmol/gであった。

以下の実施例1の記載に従い、表1 のPMO No. 1～118に示すPMOを合成した。PMO No. 119
及び120はジーンツール社より購入した。合成したPMOを注射用水（大塚製薬工場社製）で
溶解した。

［実施例1］
5’末端塩基に対応する、アミノポリスチレン樹脂に担持された4－｛［（2S，6R）－6
－（4－ベンズアミド－2－オキソピリミジン－1（2H）－イル）－4－トリチルモルホリン
－2－イル］メトキシ｝－4－オキソブタン酸（参考例1）、もしくは、アミノポリスチレ
ン樹脂に担持された4－｛［（2S，6R）－6－（5-メチル－2,4－ジオキソピリミジン－1－
イル）－4－トリチルモルホリン－2－イル］メトキシ｝－4－オキソブタン酸（参考例2）
、もしくは、アミノポリスチレン樹脂に担持された4－｛［（2S，6R）－6－（6－ベンズ
アミドプリン－9－イル）－4－トリチルモルホリン－2－イル］メトキシ｝－4－オキソブ
タン酸（参考例3）、もしくは、アミノポリスチレン樹脂に担持された4－｛｛（2S，6R）
－6－｛6－（2－シアノエトキシ）－2－［（2－フェノキシアセチル）アミノ]プリン－9
－イル}－4－トリチルモルホリン－2－イル｝メトキシ｝－4－オキソブタン酸（参考例4
）0.2gをフィルター付きカラムに充填し、核酸合成機（AKTA Oligopilot 10 plus）を使
用して、下記合成サイクルを開始した。表1に記載の各化合物の塩基配列になるよう、各
カップリングサイクルにおいて所望のモルホリノモノマー化合物を添加した(下記表2を参
照)。

なお、デブロック溶液としては、3％（w/v）トリフルオロ酢酸を含有するジクロロメタン
溶液を用いた。中和・洗浄溶液としては、N，N－ジイソプロピルエチルアミンを10％（v/
v）になるように、かつテトラヒドロフランを5％（v/v）になるように、35％（v/v）のア
セトニトリル含有するジクロロメタン溶液で溶解したものを用いた。カップリング溶液A
としては、モルホリノモノマー化合物を0.10Mになるように、テトラヒドロフランで溶解
したものを用いた。カップリング溶液Bとしては、N，N－ジイソプロピルエチルアミンを2
0％（v/v）になるように、かつテトラヒドロフランを10％（v/v）になるように、アセト
ニトリルで溶解したものを用いた。キャッピング溶液としては、アセトニトリルに対して
20％（v/v）の無水酢酸と30％（v/v）の2，6－ルチジンを溶解したものを使用した。

上記で合成したPMOが担持されたアミノポリスチレン樹脂を反応容器から回収し、2時間以
上室温で減圧乾燥した。乾燥したアミノポリスチレン樹脂に担持されたPMOを反応容器に
入れ、28％アンモニア水－エタノール（1/4）5mLを加え、55℃で15時間撹拌した。アミノ
ポリスチレン樹脂をろ別し、水－エタノール（1/4）1mLで洗浄した。得られたろ液を減圧
濃縮した。得られた残渣を20mMの酢酸－トリエチルアミン緩衝液（TEAA緩衝液）とアセト
ニトリルの混合溶媒（4/1）10mLに溶解し、メンブレンフィルターでろ過した。得られた
ろ液を逆相HPLCにて精製した。使用した条件は、以下の表3に示す通りである。

各フラクションを分析して、目的物を回収し、減圧濃縮した。濃縮残渣に2Mのリン酸水溶
液0.5mLを加え、15分間攪拌した。さらに、2Mの水酸化ナトリウム水溶液2mLを加えてアル
カリ性とし、メンブレンフィルター（0.45μm）でろ過した。
得られた目的物を含有する水溶液を陰イオン交換樹脂カラムで精製した。使用した条件
は下記表4に示す通りである。

各フラクションを分析（HPLC）し、目的物を水溶液として得た。得られた水溶液に0.1Mの
リン酸緩衝液（pH 6.0）を添加し中和した。次いで、下記表5に示す条件で逆相HPLCにて
脱塩した。

目的物を回収し、減圧濃縮した。得られた残渣を水に溶かし、凍結乾燥して、白色綿状固
体として目的化合物を得た。ESI-TOF-MSの計算値、測定値を下記表6に示す。

[試験例1]
In vitroアッセイ
RD細胞（ヒト横紋筋肉腫細胞株）3.5×10⁵個に対して、表1のアンチセンスオリゴマー0.1
～30μMをAmaxa Cell Line Nucleofector Kit Lを用いてNucleofector II（Lonza）によ
り導入した。プログラムはT-030を用いた。
導入後、細胞を、10％ウシ胎児血清（FCS）（インビトロジェン社製）を含むEagle's m
inimal essential medium(EMEM)培地（シグマ社製、以下同じ） 2mL中、37℃、5％CO2条
件下で三晩培養した。
細胞をPBS（ニッスイ社製、以下同じ）で1回洗浄した後、1%の2-メルカプトエタノール（
ナカライテスク社製）を含むBuffer RLT（キアゲン社製）を350 μL細胞に添加し、数分
間室温に放置して細胞を溶解させ、QIAshredder ホモジナイザー（キアゲン社製）に回収
した。15,000 rpmで2分間遠心し、ホモジネートを作製した。RNeasy Mini Kit （キアゲ
ン社製）に添付のプロトコールに従ってtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNAの濃度
はNanoDrop ND-1000（エル・エム・エス社製）を用いて測定した。

抽出したtotal RNA 400 ngに対し、QIAGEN OneStep RT-PCR Kit（キアゲン社製）を用
いてOne-Step RT-PCRを行った。キットに添付のプロトコールに従って、反応液を調製し
た。サーマルサイクラーはPTC-100（MJ Research社製）又はTaKaRa PCR Thermal Cycler
Dice Touch（タカラバイオ社製）を用いた。用いたRT-PCRのプログラムは、以下の通りで
ある。

50℃、30分間：逆転写反応
95℃、15分間：ポリメラーゼ活性化、逆転写酵素不活性化、cDNA熱変性
[94℃、30秒間；60℃、30秒間；72 ℃、1分間]x 35サイクル：PCR増幅
72℃、10分間：最終伸長反応

RT-PCRに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通り
である。

フォワードプライマー：5’-GCTCAGGTCGGATTGACATT-3’ （配列番号125）
リバースプライマー：5’-GGGCAACTCTTCCACCAGTA -3’ （配列番号126）

上記PCRの反応産物1 μLをBioanalyzer（アジレント社製）を用いて解析した。
エクソン44 がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「A」と、エクソン44がスキッ
プしなかったバンドのポリヌクレオチド量「B」を測定した。これら「A」及び「B」の測
定値（単位：ｎｍｏｌ／Ｌ）に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。

スキッピング効率（％）= A /（ A ＋ B ）x 100

実験結果結果を図1から26に示す。本実験により、ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子の
エクソン44のヌクレオチド配列（配列番号10）のうち、5‘末端から数えて-1～44番目（
配列番号1）、および58～115番目（配列番号2）から選択される短いユニットオリゴマー
を連結して得られる本発明のオリゴマーはエクソン44を有効にスキッピングさせることが
判明した。

[試験例2]
In vitroアッセイ
試験例1と同様の方法で実験を行った。但し、RD細胞（ヒト横紋筋肉腫細胞株）3.5×10⁵
個に対して、PMO No.34、100、45、73、49、47の本発明オリゴマーを単独で、あるいはそ
れぞれを構成している2本のユニットオリゴマーをそれぞれ単独又は混合させて、各1、3
、又は10 μMの濃度でAmaxa Cell Line Nucleofector Kit Lを用いてNucleofector II（L
onza）により導入した。プログラムはT-030を用いた。導入した配列の組み合わせは以下
の通りである。

実験結果
結果を図27から31に示す。本実験により、エクソン44内を標的とするPMO No.110～115
、PMO No.117及びPMO No.118はそれぞれ単独ではエクソン44をスキッピングさせないこと
が判明した。また、エクソン44内の異なる部位を標的とする2本のアンチセンス核酸の混
合物（PMO No.114とPMO No.115、PMO No.109と PMO No.114、PMO No.110と PMO No.111、
PMO No.112と PMO No.113、PMO No.117とPMO No.118、及びPMO No.119と PMO No.120）と
比較して、それぞれを連結したPMO No.34、 PMO No.100、 PMO No.45、 PMO No.73、 PMO
No.49、 PMO No.47の本発明のオリゴマーは高い効率でエクソン44をスキッピングさせる
ことが判明した。

[試験例3]ヒト線維芽細胞を用いたIn vitroアッセイ
GM05112細胞（エクソン45欠損DMD患者由来線維芽細胞、Coriell Institute for Medical
Research）を使用し、本発明のオリゴマーのエクソン44スキッピング活性を検討した。増
殖培地は10％FCS（ハイクローンラボラトリーズ）及び1％Penicillin/Streptomycin（P/S
）(シグマアルドリッチ社)を含むDulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixtur
e F-12（DMEM/F-12）(ライフテクノロジーズ社)を使用し、5% CO₂存在下、37℃で培養し
た。

細胞はT225フラスコで培養し、増殖培地30 mLに対して2.5 mLのヒト由来myoD（配列番号1
27）発現レトロウイルス（ZsGreen1共発現）及び終濃度8 μg/mLでポリブレン（シグマ
アルドリッチ社）を添加した。32℃で2日間培養後、新鮮な増殖培地で培地交換を行い、
さらに37℃で3日間培養した。BD FACSAria Cell Sorter（BD Bioscience社）にてZsGreen
1陽性細胞を選択することでMyoD転換線維芽細胞を回収した。回収した細胞は、分化培地
（2％ウマ血清(ライフテクノロジーズ社)、1％P/S及びITS Liquid Media Supplement（シ
グマアルドリッチ社）含有DMEM/F-12）に懸濁し、コラーゲンコートされた24-wellプレ
ートに9.4×10⁴ cells/wellで播種した。2～3日ごとに培地交換を行いながら培養し、筋
管細胞へ分化誘導した。

24-wellプレートに播種してから7日目に、終濃度10 μMとなるようにPMO No.34、45、4
9及び73を添加した分化培地に交換した。2日間インキュベート後に、PMOを含まない分化
培地に交換し、さらに5日間インキュベートした。細胞を回収し、RNeasy Mini Kit（キア
ゲン社）を用いてtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNA 50 ngに対し、QIAGEN OneS
tep RT-PCR Kitを用いてRT-PCRを行った。添付のプロトコールに従って、反応液を調製し
た。サーマルサイクラーはiCycler（Bio-Rad Laboratories）を用いた。用いたRT-PCRの
プログラムは、以下の通りである。

50℃、30分間：逆転写反応
95℃、15分間：ポリメラーゼ活性化、逆転写酵素不活性化、cDNA熱変性
[94℃、1分間；60℃、1分間；72℃、1分間]x 35サイクル：PCR増幅
72℃、7分間：最終伸長反応

RT-PCRに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通り
である。

フォワードプライマー：5’- GCTCAGGTCGGATTGACATT-3’ （配列番号125）
リバースプライマー：5’- GGGCAACTCTTCCACCAGTA-3’ （配列番号126）

Experion DNA 1K Analysis Kits（Bio-Rad Laboratories）を用いて、PCR産物1 μLをE
xperion Electrophoresis Station（Bio-Rad Laboratories）を用いて解析した。 Experi
on Software version 3.2（Bio-Rad Laboratories）上でDNA 1K assayを選択し、測定し
た。Experion Softwareで317 bp付近のバンド（A）及び465 bp付近のバンド（B）を定量
（単位：nmol/L）した。Excel 2007 SP3（Microsoft）を用いて、以下の式によりスキッ
ピング効率（%）を求めた。

スキッピング効率（％）= A /（ A ＋ B ）x 100

実験結果

結果を図３２に示す。本実験により、PMO No. 34、45、49及び73の本発明のオリゴマー
は、エクソン45欠損DMD患者由来細胞において、高い効率でエクソン44をスキッピングさ
せることが判明した。

試験例に示す実験結果から、短いオリゴマーを連結した本発明のオリゴマーは、RD細胞
においてエクソン44スキッピングを引き起こすことが示された。従って、本発明のオリゴ
マーは、DMDの治療において非常に有用である。

Claims

ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン４４のスキッピングを誘導する、配列番号５５または配列番号１０６から選ばれるいずれか一つの塩基配列からなるアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドの糖部分および／またはリン酸結合部分が修飾されている、請求項２に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドの糖部分が、２’位の－ＯＨ基が、ＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、Ｎ_３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、請求項２または３に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
（上記Ｒは、アルキル又はアリールを示し、上記Ｒ’は、アルキレンを示す。）
前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合およびボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか１つのものである、請求項２～４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
モルホリノオリゴマーである、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、請求項６に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
５’末端が、下記化学式（１）～（３）のいずれかの基である、請求項６または７に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物。
請求項１～８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医薬組成物。
さらに医薬的に許容可能な担体を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
筋ジストロフィー治療用医薬組成物の製造における請求項１～８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴマー、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは水和物の使用。