JP2014507143A - アンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents

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Abstract

本発明の実施形態は一般には、筋ジストロフィーを処置するためのアンチセンス化合物および組成物に関し、具体的には、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を処置するためのアンチセンス化合物および組成物に関する。１つの実施形態において、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子を含む医薬用の組成物および配合物、ならびに、筋ジストロフィーに関連した疾患および障害を処置する方法に関しており、ただし、この場合、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、配列番号５〜８、１０、１２、１４、１６、２４、２７、２８、３４、３５、３７、４０、４２、４４〜４６、７９、９７、９７、９７、９７、１００、１０１、および１１６ならびにそれらの組合せからなる群から選択される塩基配列を含む。

Description

（連邦政府援助による研究開発）
本発明は、アメリカ国立衛生研究所の国立神経疾患・脳卒中研究所（ＮＩＨ／ＮＩＮＤＳ）によって与えられる補助金番号Ｕ０１ＮＳ０６２７０９のもと、合衆国政府援助によりなされた。合衆国政府は本発明において一定の権利を有する。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は筋ジストロフィーの最も一般的かつ重篤な形態である。ＤＭＤは、１／３５００で新生児男児が発症するが、ヒトＤＭＤ遺伝子のナンセンス変異およびアウト・オブ・フレーム変異によって引き起こされる重篤なＸ連鎖の筋消耗疾患である。ＤＭＤ患者は典型的には、車イスが１０歳〜１２歳までに必要となり、１０代後半〜３０代前半で死亡する。
ＤＭＤは、機能タンパク質の合成を妨げるジストロフィン遺伝子内の変異によって引き起こされる。ジストロフィン遺伝子は、２３０万塩基対超に及ぶ７９個のエクソンを含有するヒトゲノムにおける最も大きい遺伝子の１つである。一般に、１つもしくは複数のエクソン全体が除かれるか、または、１つもしくは複数のエクソンが重複することによる読み枠における変化を生じさせるか、あるいは、停止コドンを導入するジストロフィン遺伝子のエクソン部分のいずれかにおける変異は、機能的ジストロフィンの産生を乱す可能性があり、これにより、ＤＭＤがもたらされる場合がある。
近年、研究により、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）に基づく治療法は、ＤＭＤを含む遺伝子関連疾患の有望な処置をもたらすかもしれないことが示されている。具体的には、標的とする遺伝子発現に対する特異性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）が開発されている。例えば、様々なアンチセンスオリゴヌクレオチドにより、特異的なエクソンスキッピングが誘導され、それにより、機能的ジストロフィンの読み枠および発現が回復させられることが示されている。ジストロフィン遺伝子のアウト・オブ・フレーム変異をスキッピングすることによって、その読み枠を回復させることができ、そして、短縮型の、それでいて機能的なベッカー様ジストロフィンタンパク質が発現される。
インビトロでのヒト細胞における研究およびインビボでのこの疾患の動物モデルにおける研究では、エクソンスキッピングの原理がＤＭＤのための可能性のある治療法として証明されている。２つの異なるＡＯ化学構造（ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）およびホスホロチオエート連結の２’−β−メチルＲＮＡ（２’ＯＭｅＰＳ））を使用する初期の臨床試験が近年には行われており、勇気づける結果が得られている。エクソン５１に対する２’ＯＭｅＰＳ型ＡＯが注入された４名のＤＭＤ患者のＴＡ筋肉におけるジストロフィン発現の回復が、ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍ他によって報告されている。
ジストロフィンの読み枠を回復するための特定のエクソンの標的化された除去の効果を決定する１つの非常に重要な要因が、特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの特定である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは通常、ヌクレオチドがほんの２０個〜３０個にすぎない配列を有するので、可能性のある１００以上の候補ＡＯが、それぞれのエクソンジストロフィンエクソンを標的化するために存在し得る。実際には、多くのアンチセンスオリゴヌクレオチドは効率的なエクソンスキッピングをもたらさない。したがって、あるエクソンをＤＭＤの処置のためのジストロフィンの読み枠の回復のために効果的に除くためには、それぞれのヒトジストロフィンエクソンを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングし、選択する必要がある。しかしながら、個々のエクソンを標的化する最も効果的なＡＯを選択するために適用される役割は１つもない。そのうえ、すべての従前の技術で特定されたＡＯは、ＤＭＤの患者における筋線維の最終的な標的用細胞とは大きく異なる細胞培養におけるエクソンスキッピング効果を示すだけである。細胞培養で選択された個々のＡＯの生物学的効果は、インビボでの筋肉における潜在的効果とは著しく異なり得る。
したがって、ジストロフィン遺伝子の標的化されたエクソンにおける効率的なエクソンスキッピングを引き起こす改善されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが依然として求められている。
本発明の実施形態は一般には、筋ジストロフィーを処置するためのアンチセンス化合物および組成物に関し、具体的には、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を処置するためのアンチセンス化合物および組成物に関する。
１つの実施形態において、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子を含む医薬用の組成物および配合物、ならびに、筋ジストロフィーに関連した疾患および障害を処置する方法に関しており、ただし、この場合、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、下記の配列：
GCTGGGAGAGAGCTTCCTGTAGCTTCAC (配列番号5);
TGTTACCTACCCTTGTCGGTCCTTGTAC (配列番号6);
CTGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGTC (配列番号7);
GGCGTTGCACTTTGCAATGCTGCTGTCT (配列番号8);
TTGGAAATCAAGCTGGGAGAGAGCTTCC (配列番号10);
CTACCCTTGTCGGTCCTTGTACATTTTG (配列番号12),
GTCAATCCGACCTGAGCTTTGTTGTAGA (配列番号14);
CTTGCTATGAATAATGTCAATCCGACC (配列番号16);
TATATGTGTTACCTACCCTTGTCGGTCC (配列番号24);
GCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG (配列番号27);
CCAATGCCATCCTGGAGTTCCT (配列番号28);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGA (配列番号34);
CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCC (配列番号35);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT (配列番号37);
CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG (配列番号40);
TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG (配列番号42);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG (配列番号44);
TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTA (配列番号45);
GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG (配列番号46)
AACUUCCUCUUUAACAGAAAAGCAUAC (配列番号79);
GGGAUCCAGUAUACUUACAGGCUCC (配列番号97);
CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCT (配列番号100);
CATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGT (配列番号101);および
CAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAG (配列番号116)
ならびにそれらのアナログおよび組合せからなる群から選択される塩基配列を含み、かつ、標的部位に結合してジストロフィン遺伝子におけるエクソンスキッピングを引き起こすことができる。１個または２個のヌクレオチドの欠失または付加をそれぞれの末端に有するこれらの配列は、類似する効果を有することが予想され、したがってまた、ジストロフィン遺伝子における標的化されたエクソンスキッピングのために使用される場合がある。
本発明の実施形態のさらなる態様は、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子の高まった細胞送達のためのポリマーに関する。１つの実施形態において、本発明は、ポロキサマーおよびポリエチレミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｍｉｎｅ）（ＰＥＩ）のコンジュゲートである一群のポリマーを提供する。ポロキサマーは、ポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心の疎水性鎖と、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの隣接する親水性鎖とを含む。
本発明が上記のように一般的用語で記載されているが、次に、添付された図面が参照される（ただし、図面は必ずしも縮尺通りには描かれていない）。
本発明の実施形態によるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を使用した様々なエクソンのスキッピングを示すウエスタンブロットの画像である。 本発明の実施形態によるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を使用した様々なエクソンのスキッピングを示すウエスタンブロットの画像である。 本発明の実施形態によるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を使用した様々なエクソンのスキッピングを示すウエスタンブロットの画像である。 本発明の実施形態によるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を使用した様々なエクソンのスキッピングを示すウエスタンブロットの画像である。 本発明の実施形態によるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を使用した様々なエクソンのスキッピングを示すウエスタンブロットの画像である。 本発明の実施形態によるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を使用した様々なエクソンのスキッピングを示すウエスタンブロットの画像である。 本発明の実施形態によるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子の送達において使用されるポリマーの構造化学を示す。
本発明が次に、本願発明の必ずしもすべての実施形態ではないが、いくつかの実施形態が示される添付された図面を参照して本明細書中下記においてより詳しく記載される。実際、これらの発明は多くの異なる形態で具体化されることがあり、本明細書中に示される実施形態に限定されるように解釈してはならない。むしろ、これらの実施形態は、本開示により、該当し得る法的要件が満たされることなるように提供される。類似する数字により、類似する要素が全体を通して示される。
本発明の実施形態は、特定の標的に結合してエクソンスキッピングを誘導することができる１つまたは複数のアンチセンス分子に関する。本発明のある種の実施形態はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を含むジストロフィー関連疾患を処置する方法に関する。
本発明の実施形態によるアンチセンス分子は、エクソン４３、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１およびエクソン５３のうちの少なくとも１つのヒトジストロフィン遺伝子におけるエクソンスキッピングを誘導することができるオリゴヌクレオチド配列を含む。
望ましいことに、本発明の実施形態によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的化された配列におけるエクソンスキッピングを誘導するための大きい効率を有する。１つの実施形態において、様々なアンチセンスオリゴヌクレオチド分子が、エクソンスキッピングを少なくとも２０％の効率で、より好ましくは少なくとも４０％の効率で、一層より好ましくは少なくとも５０％の効率で、さらにより好ましくは、少なくとも６０％の効率で、より好ましくは少なくとも８０％の効率で引き起こすことができる。
１つの実施形態において、本発明は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４３のエクソンスキッピングを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子に関する。エクソン４３を標的化するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子には、下記の配列およびそれらのアナログの１つまたは複数が含まれる場合がある：
GCTGGGAGAGAGCTTCCTGTAGCTTCAC (配列番号5);
TGTTACCTACCCTTGTCGGTCCTTGTAC (配列番号6);
CTGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGTC (配列番号7);
GGCGTTGCACTTTGCAATGCTGCTGTCT (配列番号8);
TTGGAAATCAAGCTGGGAGAGAGCTTCC (配列番号10);
CTACCCTTGTCGGTCCTTGTACATTTTG (配列番号12),
GTCAATCCGACCTGAGCTTTGTTGTAGA (配列番号14);
CTTGCTATGAATAATGTCAATCCGACC (配列番号16);および
TATATGTGTTACCTACCCTTGTCGGTCC (配列番号24)。
さらなる実施形態において、本発明は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５のエクソンスキッピングを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子に関する。本発明によるエクソン４５を標的化するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子には、下記の配列およびそれらのアナログの１つまたは複数が含まれる場合がある：
GCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG (配列番号27);
CCAATGCCATCCTGGAGTTCCT (配列番号28);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGA (配列番号34);
CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCC (配列番号35);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT (配列番号37);
CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG (配列番号40);
TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG (配列番号42);
CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG (配列番号44);
TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTA (配列番号45);および
GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG (配列番号46)。
さらに別の実施形態において、本発明は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５０のエクソンスキッピングを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子に関する。エクソン５０を標的化するための本発明の実施形態によるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子には、下記の配列およびそれらのアナログの１つまたは複数が含まれる場合がある：
AACUUCCUCUUUAACAGAAAAGCAUAC (配列番号79);および
GGGAUCCAGUAUACUUACAGGCUCC (配列番号97)。
本発明の実施形態はまた、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１のエクソンスキッピングを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子に関する。エクソン５１を標的化するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子には、下記の配列およびそれらのアナログの１つまたは複数が含まれる場合がある：
CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCT (配列番号100);および
CATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGT (配列番号101)。
本発明の実施形態はまた、ジストロフィン遺伝子のエクソン５３のエクソンスキッピングを誘導することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子に関する。エクソン５３を標的化するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子には、下記の配列およびそのアナログの１つまたは複数が含まれる場合がある：
CAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAG (配列番号116)。
本発明はまた、上記オリゴヌクレオチド配列のアナログをも包含することを認識しなければならない。本発明において、本発明のオリゴヌクレオチド配列の用語「アナログ」には、１つまたは複数のチミン（Ｔ）塩基がウラシル（Ｕ）塩基に置換されているか、あるいは、逆に、１つまたは複数のウラシル（Ｕ）塩基がチミン（Ｔ）塩基に置換されている配列が含まれる場合がある。例えば、どちらかの塩基が配列に存在することにより、一般には、分子がジストロフィン遺伝子のプレｍＲＮＡに結合することが依然として可能となる。これは、プレｍＲＮＡが相補的配列であるからである。したがって、どちらかの塩基が分子に存在することにより、一般には、エクソンスキッピングが誘導されることになる。分子の上記配列はまた、チミンだけ、ウラシルだけ、または、これら２つの組合せを含有する場合がある。当業者には知られているように、配列におけるＴまたはＵの選択は少なくとも部分的には、当該分子を産生するために使用される化学的性質に基づくことができる。例えば、分子がホスホロジアミダートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）であるならば、Ｘは望ましくは、Ｔであり得る。これは、この塩基が、ＰＭＯを産生するときに使用されるからである。あるいは、分子がホスホロチオエート連結の２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド（２’ＯＭｅＰＳ）であるならば、Ｘは望ましくは、Ｕであり得る。これは、この塩基が、２’ＯＭｅＰＳを産生するときに使用されるからである。
本発明のオリゴヌクレオチド配列のさらなるアナログには、分子が、標的化されたエクソンのエクソンスキッピングを誘導することができるならば、塩基の２つまでが欠失されているか、または、他の塩基により置換されている配列が含まれる場合がある。本発明によるさらなるアナログには、前記配列の一方の末端または両方の末端にさらなる塩基が付加されたオリゴヌクレオチド配列、あるいは、配列の向かい合った末端の１つまたは複数における１つの塩基が欠失されているオリゴヌクレオチド配列が含まれる場合がある。例えば、CTGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGTC (配列番号7)のアナログには、下記のものが含まれる場合がある：
XCTGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGTCX’ (配列番号119)
（配列中、ＸおよびＸ’は独立して、Ｃ、Ｔ、Ｇ、ＵおよびＡのうちの１つである）、
TGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGTC (配列番号120)
CTGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGT (配列番号121);および
TGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGT (配列番号122)。
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、選択された塩基配列を有し、かつ、ジストロフィンのプレｍＲＮＡの標的部位に結合して、エクソンスキッピングを引き起こすことができるならば、どのようなタイプの分子であっても可能である。例えば、分子は、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）またはホスホロチオエート連結の２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド（２’ＯＭｅＰＳ）であり得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドはＰＭＯである。好ましくは、分子は、他の化合物または混入物を含まないように単離される。
１つの実施形態において、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、ＰＭＯおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。モルホリノオリゴマーは、典型的なポリヌクレオチドに水素結合することができる塩基を支える骨格を有するポリマー分子であって、ペントース糖の骨格成分を有さず、より具体的には、ヌクレオチドおよびヌクレオシドに典型的であるホスホジエステル結合によって連結されるリボース骨格を有さず、しかし、その代わり、（環窒素を、その環窒素を介したカップリングを伴って）含有するポリマー分子である。好適なモルホリノオリゴマーの例としては、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーが挙げられる。本発明の実施において使用され得るモルホリノオリゴマーの様々な例が、下記の米国特許においてより詳しく記載されている：
米国特許第５，６９８，６８５号、米国特許第５，２１７，８６６号、米国特許第５，１４２，０４７号、米国特許第５，０３４，５０６号、米国特許第５，１６６，３１５号、米国特許第５，１８５，４４４号、米国特許第５，５２１，０６３号、米国特許第５，５０６，３３７号、米国特許第６，１２４，２７１号、米国特許第６，７８４，２９１号、米国特許第７，０４９，４３１号、米国特許第７，５８２，６１５号、および米国特許第７，６２５，８７３号。
ペプチド核酸ポリマー（ＰＮＡ）もまた、本発明の実施においてアンチセンスオリゴマーとして使用することができる。ＰＮＡは、デオキシリボース骨格と構造的に同形である骨格を有しており、核酸塩基が結合するＮ−（２−アミノエチル）グリシンユニットからなる。ＰＮＡは、ヒト疾患に関連する遺伝子を標的化する潜在的能力のためにアンチセンスオリゴマーとして研究されている。ＰＮＡを正荷電ポリマーと一緒に合成することは容易であるので、ＰＮＡおよびそのコンジュゲートが、ガン、遺伝病および他の疾患に対する実験的治療の薬物として広く試験されている。
ある種の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子、具体的には、モルホリノオリゴマーおよびＰＮＡは本発明によれば、広範囲の様々な異なる正荷電ポリマーとコンジュゲートすることができる。正荷電ポリマーの例としては、ペプチド（例えば、アルギニンリッチのペプチドなど）（本発明の実施において使用され得る正荷電ペプチドの例としては、Ｒ９Ｆ２Ｃ；（ＲＸＲ）４ＸＢ（式中、Ｘは任意のアミノ酸が可能である）、Ｒ５Ｆ２Ｒ４Ｃ、（ＲＦＦ）３、Ｔａｔタンパク質（例えば、ＴＡＴ配列ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲなど）、および、（ＲＦＦ）３Ｒなどが挙げられる）、カチオン性ポリマー（例えば、デンドリマー型オクタグアニジン（ｏｃｔａｇｕａｎｉｎｄｉｎｅ）ポリマーなど）、および、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物へのコンジュゲート化のためにこの技術分野で知られているような他の正荷電分子が挙げられる。１つの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１，０００ダルトン〜２０，０００ダルトン（好ましくは約５，０００ダルトン〜１０，０００ダルトン）である分子量を有するポリマーを含む正荷電ポリマーとコンジュゲートされる。正荷電ポリマーの別の一例が、多数の正荷電アミン基をその分岐鎖または非分岐鎖に有するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ＰＥＩが、遺伝子送達ベシクルおよびオリゴマー送達ベシクルとして代わりに広く使用されている。
本発明の実施形態はまた、ＤＭＤを処置するための、具体的には、ＤＭＤの影響を改善するための医薬用の配合物および組成物に関する。個体（例えば、哺乳動物、例えば、ヒトなど）または細胞の「処置」、あるいは、個体（例えば、哺乳動物、例えば、ヒトなど）または細胞を「処置する」には、どのようなタイプの介入であれ、個体または細胞の自然の経過を変化させるための試みにおいて使用される介入が含まれ得る。処置には、医薬組成物の投与が含まれるが、これに限定されず、また、処置は、予防的であるか、あるいは、病理学的事象の開始または病原因子との接触の後であるかのどちらでも行うことができる。処置には、筋ジストロフィーのある種の形態における場合と同様に、ジストロフィンタンパク質に関連する疾患または状態の症状または病理に対するどのような望ましい影響も含まれ、また、例えば、処置されている疾患または状態の１つまたは複数の測定可能なマーカーにおける最低限の変化または改善が含まれる場合がある。「予防的」処置もまた含まれ、この場合、「予防的」処置は、処置されている疾患または状態の進行速度を低下させること、その疾患または状態の発症を遅らせること、あるいは、その発症の重篤度を軽減することに向けることができる。「処置」または「予防」は、必ずしも疾患または状態あるいはその関連症状の完全な根絶、治癒または防止を示すわけではない。
具体的には、筋ジストロフィー（例えば、ＤＭＤおよびＢＭＤなど）を処置する方法であって、本発明の１つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号５〜８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号７９、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０１および配列番号１１６、ならびに、それらのアナログおよび組合せ）を、必要な場合には医薬配合物または投薬形態物の一部として、その必要性のある対象に投与することによって処置する方法が含まれる。同様に含まれるものが、対象におけるエクソンスキッピングを、１つまたは複数のアンチセンスオリゴマーを投与することによって誘導する方法であり、ただし、この場合、エクソンが、ヒトジストロフィン遺伝子に由来するエクソン４２、エクソン４４、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１およびエクソン５３ならびにそれらの組合せのうちの１つである。本明細書中で使用される場合、「対象」には、本発明のアンチセンス化合物により処置することができる症状を示すか、または、示す危険性があるいずれかの動物が含まれ、例えば、ＤＭＤもしくはＢＭＤまたはこれらの状態に関連する症状のいずれか（例えば、筋線維喪失）を有するか、あるいは、有する危険性がある対象などが含まれる。好適な対象（患者）には、そのような対象が本発明の相補的配列を含有する限り、実験室動物（例えば、マウス、ラット、ウサギまたはモルモットなど）、農場動物、および、飼育動物またはペット（例えば、ネコまたはイヌなど）が含まれる。ヒト以外の霊長類が含まれ、好ましくはヒト患者が含まれる。
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を含む医薬配合物は、どのようなビヒクルであれ、好都合な生理学的に許容されるビヒクルにおいて投与することができる。標準的な医薬的に許容されるキャリアの例としては、生理食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水、水性エタノール、乳化物（例えば、油／水型乳化物など）、トリグリセリド乳化物、湿潤化剤、錠剤およびカプセルが挙げられる。好適な生理学的に許容されるキャリアの選定は、選ばれた投与様式に依存して変化するであろうことを認識しなければならない。
１つの実施形態において、前記医薬組成物は、それぞれの分子が異なるエクソンにおけるエクソンスキッピングに向けられる本発明の複数の分子を含むことができる。あるいは、前記医薬組成物は、それぞれの分子が同じエクソンにおけるエクソンスキッピングに向けられる本発明の複数の分子を含むことができる。
本発明の医薬組成物は、直接投与（例えば、インビトロでは培養培地への添加によって、あるいは、インビボでの動物では処置部位における注射または局所投与によって局所的に）、または、全身的投与（例えば、非経口的または経口的に、あるいは、静脈内に、皮下に）を含む、いずれかの好適な手段によって標的細胞に与えることができる。１つの実施形態において、前記化合物および組成物は、生理学的に許容される溶液の一部を構成し、その結果、標的細胞への所望される薬剤の送達に加えて、前記溶液はそれ以外の点では、細胞または組織または対象の電解質および／または体積および／または代謝に悪影響を及ぼさない。
本発明において利用されるような医薬組成物および化合物は、鼻腔内手段、経口的手段、吸入的手段、経腸的手段、局所的手段、子宮内手段、膣的手段、舌下的手段、直腸的手段、筋肉内手段、胸膜内手段、脳室内手段、腹腔内手段、眼科的手段、静脈内手段または皮下的手段によって投与することができる。好ましい実施形態において、医薬溶液が静脈内注射により与えられる。
本発明による医薬組成物は液体形態または固体形態で供給され得る。本発明による組成物はさらに、溶媒、希釈剤、賦形剤、保存剤、乳化剤、臭気、風味またはｐＨなどを調節するための化合物を含むことができる。一般に、活性な化合物に加えて、本発明の医薬組成物は、医薬品として使用することができる調製物への活性な化合物の加工および送達を容易にする好適な賦形剤および補助剤を含有することができる。好適な賦形剤としては、フィラー、例えば、糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール）、セルロース調製物、各種リン酸カルシウムなど、ならびに、バインダー、例えば、デンプン、ゼラチン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドンなどが挙げられる。所望されるならば、崩壊剤を加えることができる（例えば、上記デンプン類、ならびに、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩など）。補助剤としては、流動調節剤および滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸もしくはその塩、および／または、ポリエチレングリコールが挙げられる。
配合物は、さらなるキャリアまたは希釈剤を用いて、あるいは用いることなく、経口、全身注入、経皮経路、経粘膜経路または他の局所的経路によって投与することができる。本発明による医薬配合物は、カプレット、錠剤、粒子、顆粒または粉末の形態で経口投与される場合がある。
本発明はまた、１つまたは複数の病状の影響を、上記医薬配合物の治療効果的な量および／または予防的量をその必要性のある罹患者に投与することによって処置および／または改善する方法を提供する。本発明によれば、本発明の化合物、組合せ物または医薬組成物の「治療効果的な量」は、所望される薬理学的効果を達成するために十分である量である。一般には、組成物の効果的な量を提供するために必要な、当業者が調節することができる投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態、体調、性別、体重および疾患の程度に依存して変化するであろう。加えて、投薬量は、処置頻度、ならびに、所望される効果の性質および範囲によって決定される場合がある。
医薬配合物におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子の典型的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／ｋｇ体重にまで及ぶ場合があり、具体的には、約５ｍｇ／ｋｇ体重から５００ｍｇ／ｋｇ体重にまで及ぶ場合がある。１つの実施形態において、投薬量は、２週間に１回で、あるいは、１週間あたり１回または２回で、あるいは、治療効果を達成するために必要な任意の頻度で、約５０ｍｇ／ｋｇ体重〜３００ｍｇ／ｋｇ体重である。
投与される投薬量は、当然のことながら、用法および知られている要因、例えば、有効成分の薬力学的特性；レシピエントの年齢、健康状態および体重；症状の性質および程度；併用処置の種類、処置頻度、および、所望される効果などに依存して変化するであろう。レシピエントはどのようなタイプの哺乳動物であってもよく、しかし、好ましくはヒトである。１つの実施形態において、本発明の医薬組成物の投薬形態物（組成物）は、単位物あたり約１マイクログラム〜２０，０００マイクログラムの有効成分を含有することができ、具体的には、単位物あたり約１０マイクログラム〜１０００マイクログラムの有効成分を含有することができる。
（なお、単位物がバイアルまたは１回の注射のための１個の包装物を意味するならば、投薬量は、はるかにより大きくなり、患者の体重が５０ｋｇである場合には１５ｇにまで達するであろう。）静脈内送達については、医薬配合物の単位用量物は一般に、０．５マイクログラム／ｋｇ体重〜５００マイクログラム／ｋｇ体重のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を含有するであろうが、好ましくは、５マイクログラム／ｋｇ体重〜３００マイクログラム／ｋｇ体重（μｇ／ｋｇ体重）（具体的には、１０μｇ／ｋｇ体重、１５μｇ／ｋｇ体重、２０μｇ／ｋｇ体重、３０μｇ／ｋｇ体重、４０μｇ／ｋｇ体重、５０μｇ／ｋｇ体重、１００μｇ／ｋｇ体重、２００μｇ／ｋｇ体重または３００μｇ／ｋｇ体重）のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を含有するであろう。好ましい静脈内投薬量は、体重１ｋｇあたり金属が１０ｎｇ〜２０００μｇ（好ましくは３μｇ〜３００μｇ、より好ましくは１０μｇ〜１００μｇ）の範囲である。あるいは、単位用量物は２マイクログラム〜２０マイクログラムのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を含有することができ、そして、所望されるならば、前述の１日用量を与えるために２つ以上で投与することができる。これらの医薬組成物において、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は通常、組成物の総重量に基づいて約０．５重量％〜９５重量％の量で存在するであろう。
１つの具体的な実施形態において、投薬量は個々の患者の応答に基づいて増減され得ることを認識しなければならない。使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子の実際の量は、利用されている特定のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子、配合された具体的な組成物、適用様式、および、具体的な投与部位に従って変化するであろうことが理解されるであろう。
経口投与については、組成物が錠剤またはカプセルの形態であるとき、有効成分は、経口用の非毒性で、医薬的に許容される不活性なキャリアと一緒にすることができ、そのようなキャリアとしては、ラクトース、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトールおよびソルビトールなどが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、所望されるか、または、必要であるときには、好適なバインダー、滑剤、崩壊剤および着色剤もまた、混合物に配合することができる。好適なバインダーとしては、デンプン、ゼラチン、天然糖（例えば、グルコースまたはベータ−ラクトースなど）、トウモロコシ甘味料、天然ゴムおよび合成ゴム（例えば、アラビアゴム、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコールおよびワックスなど）が挙げられる場合がある。これらの投薬形態物において使用される滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムなどが挙げられる場合がある。崩壊剤としては、限定されないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイトおよびキサンタンガムなどが挙げられる。
いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子配合物はまた、標的設定可能な薬物キャリアとしての可溶性ポリマーとカップリングすることができる。そのようなポリマーとして、例えば、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルタミドフェノール、または、パルミトイル残基により置換されるポリエチレンオキシド−ポリリシン、あるいは、ポロキサマーおよびポリエチレミン（ＰＥＩ）、または、ポロキサマーおよびＰＥＩのコンジュゲート化ポリマーを挙げることができる。ポロキサマーはどのようなものも可能である（例えば、Ｌ４４、Ｌ６４、Ｐ８５、Ｐ１２３およびＦ１２７など）。これに関連して、図７には、本発明のある種の実施形態に従って細胞送達のために使用することができるポリマーが示される。
１つの実施形態において、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子配合物は、薬物の制御された放出を達成することにおいて有用である一群の生分解性ポリマーに対して、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリε−カプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリラート、ポロキサマーおよびＰＥＩのコンジュゲート化ポリマー、ならびに、ヒドロゲルの架橋ブロックコポリマーまたは両親媒性ブロックコポリマーに対してカップリングすることができる。
本明細書中に記載される組成物は、持続放出配合物（すなわち、投与後における調節剤の緩速放出を達成するカプセルまたは樹脂または海綿状物などの配合物）の一部として投与することができる。そのような配合物は一般に、広く知られている技術を使用して調製することができ、そして、例えば、口腔、直腸または皮下の埋め込みによって、あるいは、所望される標的部位における埋め込みによって投与することができる。持続放出配合物は、キャリアマトリックスに分散され、かつ／または、速度制御膜によって取り囲まれるリザーバーの中に含有される調節剤を含有することができる。そのような配合物において使用されるキャリアは生体適合性であり、生分解性を有する場合もある；好ましくは、このような配合物は、比較的一定したレベルの調節剤放出をもたらす。
ヒトは一般に、本明細書中で例示されるマウスまたは他の実験動物よりも長く処置されることには留意されたい。したがって、処置の長さは一般に、疾患または病態生理学的プロセスの長さまたは強さまたは以前の継続期間に比例するかもしれず、また、さらには、動物種、要求されるか、または推奨される薬物有効性および効果の程度に依存するかもしれない。用量物は、１日、１週間、１年から、全生存期間までの期間にわたって単回用量物または多回用量物であり得る。
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物および化合物は、とりわけ、処置標的として、眼、皮膚または下部消化管の疾患を含めて、局所適用によって容易に到達可能な領域または器官が含まれるとき、局所投与される。局所適用はまた、本発明の組合せ物、化合物および組成物を皮下の組織（例えば、筋肉など）に投与するために容易に使用することができる。好適な局所配合物をこれらの領域または器官のそれぞれのために調製することができる。
下部消化管のための局所適用を直腸坐薬配合物において、または、好適な浣腸剤配合物において行うことができる。局所的経皮パッチもまた使用することができる。局所適用のために、医薬組成物は、１つまたは複数のキャリアに懸濁または溶解された活性成分を含有する好適な軟膏で配合することができる。本発明の化合物を局所投与するためのキャリアとしては、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化用ワックスおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、医薬組成物は、１つまたは複数の医薬的に許容されるキャリアに懸濁または溶解された活性成分を含有する好適なローションまたはクリームで配合することができる。好適なキャリアとしては、鉱油、ソルビタンモノステアラート、ポリソルバート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。
眼用使用のために、医薬組成物は、保存剤（例えば、塩化ベンジルアルコニウムなど）を伴うか、または伴うことなく、そのどちらであれ、等張性の、ｐＨ調節された無菌の生理食塩水における微粒子化した懸濁物として、または、好ましくは、等張性の、ｐＨ調節された無菌の生理食塩水における溶液として配合することができる。あるいは、眼用使用のために、医薬組成物は軟膏（例えば、ワセリンなど）で配合することができる。
眼への局所投与のために好適な配合物にはまた、有効成分が、好適なキャリアに、とりわけ、有効成分のための水性溶媒に溶解または懸濁された点眼剤が含まれる。有効成分は好ましくは、０．５％（ｗ／ｗ）〜２０％（ｗ／ｗ）の濃度（好都合には０．５％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の濃度、特に約１．５％（ｗ／ｗ）の濃度）でそのような配合物に存在した。
局所投与を、患者の全身循環への活性薬剤の経皮通過によって本発明の医薬配合物を送達するために使用することができる。そのような皮膚部位には、薬物を経皮投与するための解剖学的領域、例えば、前腕部、腹部、胸部、背中、臀部、大腿部および耳介後方領域などが含まれる。化合物は、化合物を含む局所配合物、または、化合物を投与する経皮薬物送達デバイスのどちらかを皮膚に置くことによって皮膚に投与される。どちらの実施形態であっても、送達ビヒクルは、皮膚における容易な設置および快適な保持のために設計され、形状化され、サイズ化され、かつ、適合化され、または、配合物は、処方された量およびスケジュールで皮膚に直接に適用される。
局所投与のために好適な配合物には、皮膚を介した浸透のために好適な液体調製物または半液体調製物（例えば、リニメント剤、ローション、軟膏、クリーム、ゲルまたはペースト）、および、眼、耳または鼻への投与のために好適な滴剤が含まれる。本発明の化合物の有効成分の好適な局所用量は、いずれかの他の局所経路および全身経路によって使用される用量と類似していることが予想される。
軟膏で配合されるとき、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、パラフィン系または水混和性のどちらの軟膏基剤とでも一緒に用いることができる。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、乳化されたクリーム基剤と一緒にクリームで配合することができる。所望されるならば、クリーム基剤の水相は、例えば、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）の多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物）を含むことができる。局所用配合物は望ましくは、皮膚または他の患部領域を介した有効成分の吸収または浸透を高める化合物を含むことができる。そのような皮膚浸透強化剤の例には、メトカルバモール、長鎖アルコール、ジメチルスルホキシドおよび関連アナログが含まれる。
様々な経皮薬物送達デバイスを本発明の医薬配合物と一緒に用いることができる。例えば、裏張り材およびアクリラート系接着剤を含む単純な接着性パッチを調製することができる。薬物および何らかの浸透強化剤を接着剤流し込み成形溶液に配合することができる。接着剤流し込み成形溶液は、接着性被覆を形成するために裏張り材の表面に直接に流し込むことができるか、または、皮膚に塗布することができる。
経皮投与を、リザーバー／多孔性膜タイプのパッチまたは固体マトリックス型のパッチのどちらであれ、そのようなパッチを使用して達成することができる。どちらの場合においても、活性薬剤が、リザーバーまたはマイクロカプセルから膜を通って、レシピエントの皮膚または粘膜と接触している活性薬剤透過性接着剤の中に連続的に送達される。活性薬剤が皮膚を介して吸収されるならば、活性薬剤の制御された所定の流れがレシピエントに施される。マイクロカプセルの場合には、カプセル化剤もまた、膜として機能することができる。
他の実施形態においては、本発明の化合物は、液体リザーバーシステムの薬物送達デバイスを使用して送達されるであろう。これらのシステムは典型的には、裏張り材、膜、アクリラート系接着剤および剥離ライナーを含む。膜は、リザーバーを形成するために裏張り材に封止される。その後、薬物または化合物、ならびに、何らかのビヒクル、強化剤、安定剤およびゲル化剤などがリザーバーの中に組み込まれる。
裏張り材、薬物／浸透強化剤マトリックス、膜および接着剤を含むマトリックスパッチもまた、本発明の化合物を経皮送達するために用いることができる。マトリックス材料は典型的には、ポリウレタンフォームを含むであろう。薬物、何らかの強化剤、ビヒクルおよび安定剤などがフォーム前駆体と一緒にされる。フォームは、裏張り材に直接に取りつけられ得る粘着性のエラストマーマトリックスを製造するために硬化させられる。
本発明に同様に含まれるものが、本発明の化合物を、非毒性の医薬的に許容される局所用キャリアと一緒に、典型的には約０．００１％〜１０％の範囲における濃度で含む、皮膚に局所適用するための調製物である。これらの局所用調製物は、本発明による有効成分を、局所用の乾燥配合物、液体配合物およびクリーム配合物において一般に使用される従来の医薬用の希釈剤およびキャリアと一緒にすることによって調製することができる。例えば、軟膏およびクリームを、好適な増粘剤および／またはゲル化剤の添加により、水性または油性の基剤を用いて配合することができる。そのような基剤には、水および／またはオイル（例えば、流動パラフィンまたは植物油（例えば、ピーナッツ油またはひまし油など）など）が含まれる場合がある。基剤の性質に従って使用され得る増粘剤には、軟パラフィン、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、羊毛脂、水素化ラノリンおよび蜜ろうなどが含まれる。
ローションを、水性または油性の基剤を用いて配合することができ、ローションはまた、一般には、下記の１つまたは複数を含むであろう：安定化剤、乳化剤、分散化剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、矯味矯臭剤、着色剤および香料など。粉末剤を、いずれかの好適な粉末基剤（例えば、タルク、ラクトースおよびデンプンなど）の助けをかりて形成することができる。滴剤を、１つまたは複数の分散化剤、懸濁化剤、可溶化剤、矯味矯臭剤および着色剤などもまた含む水性基剤または非水性基剤を用いて配合することができる。
本発明の乳化物の油相は既知の様式で既知の成分から構成され得る。この相は単に乳化剤だけを含む場合がある一方で、少なくとも１つの乳化剤と、脂肪またはオイルとの混合物、あるいは、脂肪およびオイルの両方との混合物を含む場合がある。好ましくは、親水性の乳化剤が、安定剤として作用する親油性の乳化剤と一緒に含まれる。オイルおよび脂肪の両方を含むこともまた好ましい。まとめると、乳化剤（１つまたは複数）は安定剤（１つまたは複数）を伴って、または伴うことなく、いわゆる乳化性ワックスを構成し、ワックスはオイルおよび脂肪と一緒になって、クリーム配合物の油性分散相を形成するいわゆる乳化性軟膏基剤を構成する。本発明の配合物における使用のために好適な乳化剤および乳化物安定剤には、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０、ＳＰＡＮ（登録商標）８０、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、グリセリルモノステアラート、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリルジステアラート単独またはワックスを伴うグリセリルジステアラート、あるいは、この技術分野でよく知られている他の材料が含まれる。
配合物のための好適なオイルまたは脂肪の選定は、所望される美容特性を達成することに基づく。これは、医薬用乳化物配合物において使用される可能性が高いほとんどのオイルにおける活性化合物の溶解性が非常に低いからである。したがって、クリームは好ましくは、チューブまたは他の容器からの漏出を避けるための好適な粘稠性を有する、べたべたせず、汚さず、かつ、洗浄可能な製造物でなければならない。直鎖または分岐鎖の一塩基性アルキルエステルまたは二塩基性アルキルエステル、例えば、ジ−イソアジパート、ステアリン酸イソセチル、ココナツ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸２−エチルヘキシル、または、分岐鎖エステルのブレンド物などを使用することができる。これらは、要求される性質に依存して、単独または組合せで使用することができる。あるいは、高融点の脂質（例えば、白色軟パラフィンおよび／または流動パラフィンあるいは他の鉱油など）を使用することができる。
本発明による局所用医薬組成物はまた、１つまたは複数の保存剤または静菌剤、例えば、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、クロロクレゾールおよびベンザルコニウム塩化物などを含む場合がある。局所用医薬組成物はまた、他の有効成分、例えば、抗菌剤（特に抗生物質）、麻酔剤、鎮痛剤および止痒剤、同様にまた、抗真菌剤を含有することができる。蒸発することによって局所配合物／適用物を「固まらせ」ながら、または乾かしながら、においを組成物に与える香料または揮発性薬剤もまた含まれる場合がある。
本発明の医薬組成物はまた、粘膜を介して送達することができる。経粘膜（すなわち、舌下、口腔内および膣）薬物送達は全身循環への活性物質の効率的な進入をもたらし、肝臓および腸壁細菌叢による即時代謝を減らす。経粘膜用薬物投薬形態物（例えば、錠剤、坐薬、軟膏、膣坐薬、膜および粉末）は典型的には、粘膜との接触状態で保持され、迅速に崩壊および／または溶解して、即時的な全身吸収を可能にする。
１つの実施形態において、本発明の方法は、特定の遺伝子発現を回復すること、または、遺伝子のイソ型を取り換えることを目的として特定の遺伝子領域を標的とするために選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、具体的には、そのように選択されるモルホリノオリゴマーを対象に投与することによって行われる。一般に、本発明の方法は、統合、転写またはスプライシングを妨げ、これによりタンパク質の正常な発現を抑制するか、または回復するために、あるいは、種々のイソ型の発現を切り換えるために効果的である量のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子を好適な医薬用キャリアにおいて対象に投与することを含む。好ましい実施形態において、本発明の方法はタンパク質の優性ネガティブ変化体の発現をもたらす。本発明の方法の１つの態様において、対象はヒト対象である。抗ウイルス処置における使用のために、経口経路および非経口経路（例えば、静脈内送達、皮下送達、腹腔内送達および筋肉内送達、同様にまた、吸入送達、経皮送達および局所送達）を含めて、様々な全身送達経路を使用することができる。
典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子の１つまたは複数の用量物が、一般には一定の間隔で、好ましくは１日に１回から１ヶ月に１回までで投与される。経口投与のための好ましい用量は、体重１ｋｇあたり約１ｍｇのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子から体重１ｋｇあたり約６００ｍｇのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子までであり、より好ましくは、体重１ｋｇあたり約３０ｍｇのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子から体重１ｋｇあたり約３００ｍｇのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子までである。ＩＶ投与については、好ましい用量は上記用量と類似している。投薬量は、患者の年齢、健康状態、性別、大きさおよび体重、投与経路、ならびに、具体的な疾患状態に関してのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子の効力などの要因に従って変化するであろう。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する効果的なインビボ処置療法は、投与頻度および投与経路、同様にまた、処置中の対象の状態に従って変化するであろう。所与の経路のための最適な投薬量を、この技術分野で知られている方法による通例の実験法によって決定することができる。そのようなインビボ治療は一般に、処置されている具体的なタイプの病気に対して適切である試験によってモニターされ、そして、用量または処置療法における対応する調節を、最適な治療結果を達成するために行うことができる。
別の態様において、本発明は、本発明の分子と、その使用のための説明書とを含む、患者におけるＤＭＤの改善のためのキットを提供する。１つの実施形態において、該キットは、同じエクソンまたは複数のエクソンにおけるエクソンスキッピングを引き起こすことにおいて使用される複数の分子を含有することができる。
下記の実施例では、３つの異なるインビトロモデルおよびインビボモデルが、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子の効力を試験するために利用された：１）ＤＭＤ筋芽細胞、２）正常なヒト筋芽細胞、および、３）ヒト化ＤＭＤ（ｈＤＭＤ）マウス（これは、正常に近いレベルのジストロフィンを発現するヒトジストロフィン遺伝子全体を含有する）。これら３つのモデルを使用して、特定のヒトジストロフィンエクソンを標的とするアンチセンスオリゴマーをスクリーニングした。
ＤＭＤ筋芽細胞および正常なヒト筋芽細胞を２４ウェルプレートで成長させ、２．５μＭのＰＭＯまたは２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド（２’ＯＭｅＰＳ）を、それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチドについての二連での最初のスクリーニングのために使用した。ＡＯ処置の２４時間後、細胞を分化培地でさらに２日間培養した。
ｈＤＭＤマウスにおける試験のために、２０μｇのＰＭＯアンチセンスオリゴヌクレオチドを４０μｌの生理食塩水において調製し、それぞれ２匹における筋肉内注射によって投与した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、筋線維送達を助けるために、ポロキサマーおよびポリエチレミン（ＰＥＩ）のコンジュゲート、または、デンドリマー型オクタグアニジン（ｏｃｔａｇｕａｎｉｎｄｉｎｅ）ポリマーとコンジュゲートされたＰＭＯを含むポリマーと一緒に送達された。ポロキサマーは、ポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心の疎水性鎖と、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの隣接する親水性鎖とを含む。図７を参照のこと。
処置された筋肉を１回だけの注射の７日後に集め、筋肉を液体窒素冷却のイソペンタンで急速冷凍し、−８０℃で保存した。切片を筋肉から作製し、微量遠心分離チューブに集め、その後、ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲのために抽出した。
それぞれのモデル系におけるエクソンスキッピング効率をＤＭＤ由来細胞およびヒト筋芽細胞においてはＲＴ−ＰＣＲおよびネステッドＰＣＲによって求め、ｈＤＭＤマウスにおいてはＲＴ−ＰＣＲによって求めた。下記の手順を使用した：オリゴマーにより処置された細胞または筋肉組織からのＲＮＡを、ＴｒｉＺｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を製造者の説明書に従って用いて抽出した。ＲＮＡをその後の使用のために−８０℃で保存した。ＲＴ−ＰＣＲを、ＲＴ−Ｆｉｄｅｌｉｔａｑ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を用いて行って、目的とする配列を増幅した。１００ｎｇのテンプレートＲＮＡを２５μｌのそれぞれのＲＴ−ＰＣＲ反応において使用した。ＰＣＲ条件は、４３℃で１５分間、９４℃で２分間、その後、９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間および６８℃で１分間を３０回繰り返した。ネステッドＰＣＲのための条件は、９４℃で２分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間および７２℃で５分間を３０回繰り返した。
下記のプライマー対をＲＴ−ＰＣＲおよびネステッドＰＣＲのために使用した。
RT-PCR プライマー 1:
フォワードプライマー: Ex47/48F3, 5’ - GTGGATAAAGGTTTCCAGAGC - 3’
リバースプライマー Ex53/52R3, 5’ - GAATTCTTTCAATTCGATCCGTA - 3’。
ネステッド PCR プライマー1:
フォワードプライマー: Ex48F2, 5’ - TCTGCTGCTGTGGTTATCTC - 3’;
リバースプライマー: Ex52R2, 5’ - TTTTGGGCAGCGGTAATGAG - 3’。
RT-PCR プライマー 2:
フォワードプライマー: E43F6206/6230, 5’-TGGAAAGGGTGAAGCTACAGGAAG-3’
リバースプライマー: E46-47R6780/6775 5’-CAACTCTTCCACCAGTAACTTGACT-3’
ネステッドPCR プライマー 2:
フォワードプライマー: E43F6265/6290, 5’-AACAAAATGTACAAGGACCGACAAGG-3’
リバースプライマー: E46R6732/6708, 5’-CTGCTCTTTTCCAGGTTCAAGTGG-3’
RT-PCR プライマー 3:
フォワードプライマー: E43F6206/6230, 5’-TGGAAAGGGTGAAGCTACAGGAAG-3’
リバースプライマー: E49R7111/7137, 5’- CACATCCGGTTGTTTAGCTTGAACTGC -3’
ネステッド PCR プライマー 3:
フォワードプライマー: E43F6265/6290, 5’-AACAAAATGTACAAGGACCGACAAGG-3’
リバースプライマー: E48R7034/7017, 5’-CTAATAGGAGATAACCACAGCAGCAGA-3’。
RT-PCR プライマー 4:
hDysEx41F1: GGGAAATTGAGAGCAAATTTGC;
hDysEx45R1:GAGGATTGCTGAATTATTTCTTCC。
ネステッド PCR プライマー 4:
hDysEx41/42F2: CAACTTTGCACAAATTCACAC;
hDysEx45R2: CAATGTTCTGACAACAGTTTGCCG。
ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルでの電気泳動によって調べた。臭化エチジウム染色によって明らかにされるＰＣＲ産物の強度を、ＮＩＨ ｉｍａｇｅ Ｊ１．４２ソフトウエアを用いて測定した。
一般には、標的とされたエクソンがスキッピングを受けているｍＲＮＡを表すＰＣＲ産物が、標的とされたエクソンのスキッピングを有しないｍＲＮＡを表すＰＣＲ産物に対して比較されるであろう。これら２つのバンドに由来する全シグナル強度が１００％であると見なされるであろう。したがって、標的とされたエクソンがスキッピングを受けている転写物のシグナル強度が、エクソンスキッピングを有しない正常なｍＲＮＡのシグナル強度と等しいならば、エクソンスキッピング効率が５０％であると見なされるであろう。別の一例では、標的とされたエクソンがスキッピングを受けている転写物のシグナル強度が、標的とされたエクソンがスキッピングを受けている転写物と、標的とされたエクソンがスキッピングを受けていない転写物との両方を表す全シグナル強度の９０％であるならば、エクソンスキッピング効率が９０％であると見なされるであろう。
調製および評価が行われたアンチセンスオリゴヌクレオチド配列についての結果が下記の表にまとめられる。
Figure 2014507143
 ＊エクソン４３およびエクソン４４の両方の欠失を伴う転写物、同様にまた、エクソン４３のみの欠失を伴う転写物が示される。＊＊エクソン４３およびエクソン４４の両方の欠失を伴う高レベルの転写物、同様にまた、エクソン４３のみの欠失を伴う高レベルの転写物。細胞培養と、インビボでの筋肉との間における個々のＡＯ配列による標的化されたエクソンスキッピングの効率における不一致が明瞭に存在する。１つの実施形態において、ジストロフィンのエクソン４３を標的化するための好ましいＡＯ配列には、ＨＥ４３（＋１５６−１０）、ＨＥ４３（＋２６＋５３）、ＨＥ４３（＋４０＋６７）、ＨＥ４３（＋１４＋４２）、ＨＥ４３（＋３１＋５７）、ＨＥ４３（＋１０８＋１３５）、ＨＥ４３（＋１５０−４）、ＨＥ４３（＋５９＋８６）、ＨＥ４３（＋１６２−１６）が含まれる；配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１４、配列番号１６および配列番号２４は、エクソンスキッピング効率に関して、インビボでの筋肉において３０％以上に達する。
Figure 2014507143
Figure 2014507143
１つの実施形態において、ジストロフィンのエクソン４５を標的化するための好ましい配列には、ＨＥ４５（−３＋２２）、ＨＥ４５（−２＋２０）、ＨＥ４５（−８＋２１）、ＨＥ４５（−１＋２７）、ＨＥ４５（−９＋２１）、ＨＥ４５（−３＋２７）、ＨＥ４５（−７＋２３）、ＨＥ４５（−７＋２１）、ＨＥ４５（−５＋２３）、ＨＥ４５（−３＋２５）が含まれる；配列番号２７、配列番号２７、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６。
Figure 2014507143
 １つの実施形態において、ジストロフィンのエクソン５０を標的化するための好ましいＡＯ配列には、ＨＥ５０（−１９＋８）（７９）、ＨＥ５０（＋１０３−１８）（配列番号９７）が含まれる。
Figure 2014507143
 １つの実施形態において、ジストロフィンのエクソン５１を標的化するための好ましいＡＯ配列には、ＨＥ５１（＋６８＋９５）（１００）、ＨＥ５１（＋６５＋８９）（配列番号１０１）が含まれる。
Figure 2014507143
 １つの実施形態において、ジストロフィンのエクソン５３を標的化するための好ましいＡＯ配列には、ＨＥ５３（＋４２＋６５）（配列番号１１６）が含まれる。
本明細書中に示される発明の多くの改変および他の実施形態が、上記説明および関連した図面において示される教示の助けをかりて、これらの発明が関連する技術分野の当業者には想到されるであろう。したがって、これらの発明は、開示される特定の実施形態に限定されるべきではないこと、また、様々な改変および他の実施形態が、添付された請求項の範囲に含まれることが意図されることを理解しなければならない。特定の用語が本明細書中では用いられるが、それらは、限定するという目的のためではなく、包括的かつ説明的な意味でのみ使用される。

Claims (21)

  1. 下記の配列：
    GCTGGGAGAGAGCTTCCTGTAGCTTCAC (配列番号5);
    TGTTACCTACCCTTGTCGGTCCTTGTAC (配列番号6);
    CTGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGTC (配列番号7);
    GGCGTTGCACTTTGCAATGCTGCTGTCT (配列番号8);
    TTGGAAATCAAGCTGGGAGAGAGCTTCC (配列番号9);
    CTACCCTTGTCGGTCCTTGTACATTTTG (配列番号12),
    GTCAATCCGACCTGAGCTTTGTTGTAGA (配列番号14);
    CTTGCTATGAATAATGTCAATCCGACC (配列番号16);
    TATATGTGTTACCTACCCTTGTCGGTCC (配列番号24);
    GCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG (配列番号27);
    CCAATGCCATCCTGGAGTTCCT (配列番号28);
    CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGA (配列番号34);
    CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCC (配列番号35);
    CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT (配列番号37);
    CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG (配列番号40);
    TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG (配列番号42);
    CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG (配列番号44);
    TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTA (配列番号45);
    GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG (配列番号46)
    AACUUCCUCUUUAACAGAAAAGCAUAC (配列番号79);
    GGGAUCCAGUAUACUUACAGGCUCC (配列番号97);
    CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCT (配列番号100);
    CATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGT (配列番号101);および
    CAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAG (配列番号116)
    ならびにそれらのアナログおよび組合せからなる群から選択される塩基配列を含み、かつ、標的部位に結合してジストロフィン遺伝子のエクソンにおけるエクソンスキッピングを引き起こすことができる、ＤＭＤを処置するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子。
  2. エクソンスキッピングが引き起こされるジストロフィン遺伝子の前記エクソンが、エクソン４３、エクソン４５、エクソン５０、エクソン５１およびエクソン５３からなる群から選択される、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子。
  3. 別個の化学的実体にコンジュゲートされるか、または、別個の化学的実体と複合体化される、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子。
  4. ホスホロジアミダートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子。
  5. その相補的ＲＮＡ配列に結合することができるオリゴマーである、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子。
  6. １個〜２個のさらなるヌクレオチド塩基をそのどちらかの末端に含むか、または、１個〜２個のヌクレオチド塩基の欠失を配列の末端に含み、かつ、前記１個〜２個のヌクレオチド塩基がその標的配列に対して相補的および／または非相補的であり得る、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子。
  7. 請求項１に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子と、医薬的に許容されるキャリア、アジュバントまたはビヒクルとを含む、ＤＭＤを処置するための医薬組成物。
  8. ポリマーとコンジュゲートしてアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達およびアンチセンス効果を高めるアンチセンスオリゴヌクレオチド
    を含み、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、下記の配列：
    GCTGGGAGAGAGCTTCCTGTAGCTTCAC (配列番号5);
    TGTTACCTACCCTTGTCGGTCCTTGTAC (配列番号6);
    CTGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGTC (配列番号7);
    GGCGTTGCACTTTGCAATGCTGCTGTCT (配列番号8);
    TTGGAAATCAAGCTGGGAGAGAGCTTCC (配列番号9);
    CTACCCTTGTCGGTCCTTGTACATTTTG (配列番号12),
    GTCAATCCGACCTGAGCTTTGTTGTAGA (配列番号14);
    CTTGCTATGAATAATGTCAATCCGACC (配列番号16);
    TATATGTGTTACCTACCCTTGTCGGTCC (配列番号24);
    GCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG (配列番号27);
    CCAATGCCATCCTGGAGTTCCT (配列番号28);
    CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGA (配列番号34);
    CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCC (配列番号35);
    CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT (配列番号37);
    CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG (配列番号40);
    TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG (配列番号42);
    CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG (配列番号44);
    TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTA (配列番号45);
    GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG (配列番号46);
    AACUUCCUCUUUAACAGAAAAGCAUAC (配列番号79);
    GGGAUCCAGUAUACUUACAGGCUCC (配列番号97);
    CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCT (配列番号100);
    CATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGT (配列番号101);および
    CAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAG (配列番号116)
    ならびにそれらのアナログおよび組合せからなる群から選択される、医薬組成物。
  9. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、約１５個〜４０個の塩基対形成ユニット（モノマー）を有するモルホリノオリゴマーまたはＰＮＡオリゴマーを含む、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記モルホリノオリゴマーがホスホロジアミダート連結モルホリノオリゴマーを含む、請求項８に記載の組成物。
  11. 前記ポリマーがペプチドである、請求項８に記載の組成物。
  12. 前記ポリマーがカチオン性ポリマーである、請求項８に記載の組成物。
  13. 前記ポリマーがデンドリマー型オクタグアニジン（ｏｃｔａｇｕａｎｉｎｄｉｎｅ）ポリマーである、請求項８に記載の組成物。
  14. 対象における筋ジストロフィーを処置する方法であって、下記の配列：
    GCTGGGAGAGAGCTTCCTGTAGCTTCAC (配列番号5);
    TGTTACCTACCCTTGTCGGTCCTTGTAC (配列番号6);
    CTGCTGTCTTCTTGCTATGAATAATGTC (配列番号7);
    GGCGTTGCACTTTGCAATGCTGCTGTCT (配列番号8);
    TTGGAAATCAAGCTGGGAGAGAGCTTCC (配列番号9);
    CTACCCTTGTCGGTCCTTGTACATTTTG (配列番号12),
    GTCAATCCGACCTGAGCTTTGTTGTAGA (配列番号14);
    CTTGCTATGAATAATGTCAATCCGACC (配列番号16);
    TATATGTGTTACCTACCCTTGTCGGTCC (配列番号24);
    GCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG (配列番号27);
    CCAATGCCATCCTGGAGTTCCT (配列番号28);
    CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGA (配列番号34);
    CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCC (配列番号35);
    CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAGAT (配列番号37);
    CCGCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG (配列番号40);
    TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG (配列番号42);
    CCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTAAG (配列番号44);
    TGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTGTA (配列番号45);
    GCTGCCCAATGCCATCCTGGAGTTCCTG (配列番号46)
    AACUUCCUCUUUAACAGAAAAGCAUAC (配列番号79);
    GGGAUCCAGUAUACUUACAGGCUCC (配列番号97);
    CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCT (配列番号100);
    CATCAAGGAAGATGGCATTTCTAGT (配列番号101);および
    CAACTGTTGCCTCCGGTTCTGAAG (配列番号116)
    ならびにそれらのアナログおよび組合せからなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子の効果的な量を前記対象に投与することを含む方法。
  15. 前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記筋ジストロフィーがベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）である、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記配列が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号２４からなる群から選択され、かつ、前記エクソンがエクソン４３である、請求項１４に記載の方法。
  18. 前記配列が、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５および配列番号４６からなる群から選択され、かつ、前記エクソンがエクソン４５である、請求項１４に記載の方法。
  19. 前記配列が、配列番号７９および配列番号９７からなる群から選択され、かつ、前記エクソンがエクソン５０である、請求項１４に記載の方法。
  20. 前記配列が、配列番号１００および配列番号１０１からなる群から選択され、かつ、前記エクソンがエクソン５１である、請求項１４に記載の方法。
  21. 前記配列が配列番号１１６であり、かつ、前記エクソンがエクソン５３である、請求項１４に記載の方法。
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