TW202136511A - 能進行外顯子跳讀之反義核酸 - Google Patents

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Abstract

本說明書係提供使目的pre-mRNA之複數個外顯子能同時地跳讀之反義寡聚物以及包含該寡聚物之醫藥組成物。此外，本說明書提供使目的pre-mRNA之2個以上編號順序為連續之外顯子同時地跳讀之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，前述反義寡聚物係包含與前述目的pre-mRNA中任一內含子之供體附近之領域，或前述目的pre-mRNA中任一內含子之接受體附近之領域之鹼基序列或其部分鹼基序列互補的鹼基序列。

Description

能進行外顯子跳讀之反義核酸
本發明係關於使標的基因之複數個外顯子能同時地跳讀之反義寡聚物以及包含該寡聚物之醫藥組成物。
近年，將具有因使具有引發疾病之變異的基因之外顯子跳讀之部分的機能的蛋白質產生，藉此治療疾病之外顯子跳讀療法受到關注。藉由如此之外顯子跳讀療法作為能治療疾病之一例可舉例如杜興氏肌肉萎縮症(DMD)。
DMD係出生男子約3,500人中1人會發症之頻率最高之遺傳性進行性肌肉疾病。DMD患者於嬰幼兒時期顯示與正常者幾乎沒有差異的運動機能，然而4至5歲左右起會呈現肌力降低。之後，DMD患者之隨著年齡肌力減低惡化至12歲左右即變得無法行走，在20多歲時因心功能不全或呼吸不全而致死。因此，強烈地需求有效的治療藥之開發。
已知DMD之原因係肌肉萎縮蛋白基因之變異。肌肉萎縮蛋白基因係存在於X染色體，由220萬個鹼基之DNA所組成之巨大的基因。由DNA轉錄為pre-mRNA，進一步藉由剪接除去內含子而將79個外顯子 進行結合之mRNA係成為13993個鹼基。由此mRNA轉譯為3685個胺基酸，而生成肌肉萎縮蛋白的蛋白質。肌肉萎縮蛋白的蛋白質係關於肌肉細胞之膜安定性的維持，用以不易使肌肉細胞損壞所必須。由於DMD患者在肌肉萎縮蛋白基因具有變異，患者之肌肉細胞中，幾乎未發現具有機能之肌肉萎縮蛋白的蛋白質。因此，於DMD患者體內，在肌肉收縮時變得無法維持肌肉細胞之構造，有許多的鈣離子流入肌肉細胞內。其結果，導致肌肉細胞壞死與纖維化，接著肌肉細胞變得難以再生。
貝克氏肌肉萎縮症(BMD)亦是肌肉萎縮蛋白基因之變異為原因，惟其症狀係呈現肌力降低然而普遍與DMD相比症狀較輕，肌力降低之進展亦較緩慢，多數之情形為在成人期發症。DMD與BMD之臨床症狀之差異，認為係因變異而肌肉萎縮蛋白脂mRNA轉譯為肌肉萎縮蛋白的蛋白質時，胺基酸讀框(reading frame)受到破壞或維持所導致者(非專利文獻1)。亦即，在DMD之情形，由於具有因胺基酸之讀框錯位之變異，而幾乎未表現機能的肌肉萎縮蛋白的蛋白質，在BMD之情形，因變異導致外顯子之一部分缺損，然而由於胺基酸讀框仍受到維持故得到不具完整卻仍有機能之肌肉萎縮蛋白的蛋白質產生。
就DMD之治療法而言，外顯子跳讀法受到期待。此方法係經由改變剪接而修復肌肉萎縮蛋白mRNA之胺基酸讀框，誘導經部分回復機能之肌肉萎縮蛋白的蛋白質的表現之方法(非專利文獻2)。由成為外顯子跳讀對象之外顯子所轉譯之胺基酸序列係部分喪失。因此在此治療中所表現之肌肉萎縮蛋白的蛋白質相較於正常者變得較短，然而由於胺基酸讀框受到維持故仍部份地保持安定化肌肉細胞之機能。因此，藉由外顯子跳讀 可期待DMD變得與較輕症之BMD呈現相同的症狀。外顯子跳讀法係經歷藉由小鼠或犬等動物實驗，而進行對於人DMD患者之臨床試驗。
外顯子跳讀係能藉由5’或3’剪接部位週邊中任一方或兩方，或外顯子之內部作為標的之反義核酸的結合而誘導。外顯子僅在兩方的剪接部位因被剪接體複合體辨識之情形而包含於mRNA中。因此，藉由將剪接部位週邊以反義核酸標定，能誘導外顯子跳讀。此外，外顯子為了被剪接之機制所辨識有必要與針對外顯子剪接增強子(ESE)而富含絲胺酸和精胺酸之SR蛋白質結合，經由標定ESE亦能誘導外顯子之跳讀。
由於肌肉萎縮蛋白基因之變異係根據DMD患者而有所差異，故需要可因應基因變異之處所或種類之反義核酸。關於針對肌肉萎縮蛋白基因之單一外顯子，將一個連續的鹼基序列作為標的而誘導外顯子跳讀之反義核酸已有多數報告揭示(專利文獻1至6及非專利文獻1以及2)。再者，有報告指出，將肌肉萎縮蛋白基因之同一外顯子作為標的之二種的反義核酸混合並使其作用時(雙重標的化)，有時比各反義核酸以單獨使用之情形跳讀活性受到增強(專利文獻7)。
此外，並非如上述般使1個外顯子跳讀，而使複數個外顯子(外顯子群)跳讀之多外顯子跳讀這樣的方法受到關注。只要藉由該方法，肌肉萎縮蛋白基因之廣範圍的變異即成為能夠作為藉由外顯子跳讀治療的對象。例如有報告指出，肌肉萎縮蛋白基因中，外顯子45至55係作為基因變異的熱點所熟知，經由此等11個外顯子之跳讀，能使具有缺失變異之DMD患者之約60%作為治療對象(非專利文獻3)。此外，外顯子45至55為先天性的缺失時BMD之發症，已知幾乎該患者均為無症狀或輕症(非專 利文獻4)。經由此等得知，可誘導外顯子45至55跳讀之藥劑，係有望作為DMD治療藥而受到期待。
就誘導多外顯子跳讀之方法而言，有報告指出係例如，使用將成為外顯子跳讀對象之領域之所有外顯子作為各別標的之反義核酸的方法(非專利文獻5、7、8及10)，使用成為使外顯子跳讀之對象之領域其3’側以及5’側之2個相異的外顯子作為各別標的之反義核酸的方法(非專利文獻6及9以及專利文獻8)。
然而尚未有報告指出，將含有內含子之供體附近或接受體附近之領域作為標的之反義核酸誘導多外顯子跳讀。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]國際公開公報第2004/048570號
[專利文獻2]國際公開公報第2009/139630號
[專利文獻3]國際公開公報第2010/048586號
[專利文獻4]美國專利公開公報第2010/0168212號
[專利文獻5]國際公開公報第2011/057350號
[專利文獻6]國際公開公報第2006/000057號
[專利文獻7]國際公開公報第2007/135105號
[專利文獻8]國際公開公報第2004/083446號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Annemieke Aartsma-Rus et al., (2002) Neuromuscular Disorders 12: S71-S77
[非專利文獻2] Wilton S. D., et al., Molecular Therapy 2007: 15: p. 1288-96
[非專利文獻3] Christophe Beroud et al., Human Mutation, 28(2), 2007, 196-202
[非專利文獻4] Yusuke Echigoya et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids, 4(2), 2015, e225
[非專利文獻5] Yoshitsugu Aoki et al., PNAS, 109(34), 2012, 13763-13768
[非專利文獻6] Laura van Vliet et al., BMC Medical Genetics, 9, 105, 2008
[非專利文獻7] Joshua Lee et al., PLoS ONE, 13(5), e0197084, 2018
[非專利文獻8] Joshua Lee et al., Methods in Molecular Biology, 1828, 141-150, 2018
[非專利文獻9] Annemieke Aartsma-Rus et al, Am. J. Hum. Genet. 74(1), 83-92, 2004
[非專利文獻10] Yusuke Echigoya et al., Molecular Therapy, 27(11), 1-13, 2019
在上述的狀況需要藉由使目的pre-mRNA之複數個外顯子(外顯子群)同時地跳讀而用以治療具有各種變異的患者之醫藥。
本發明者們，針對上述文獻所述之技術內容以及肌肉萎縮蛋白基因的構造等詳細地進行研究後發現，將人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之特定的領域作為標的之反義核酸，能使外顯子45至55之中複數個外顯子同時地跳讀。本發明者們即根據如此的知見遂而完成本發明。
亦即，本發明係如下之內容。
[1]
一種反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，係使由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA中的第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任2個以上編號順序為連續之外顯子同時地跳讀者，其中，
前述反義寡聚物，係包含與由領域R1至R24所構成之群組選擇之至少1個領域之鹼基序列或其部分鹼基序列互補的鹼基序列，前述領域R1至R24為由下列者所表示者：
由前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第NA號之外顯子之3’末端起至5’末端方向NX鹼基之鹼基序列以及第NB號之內含子之5’末端起至3’末端方向NY鹼基之鹼基序列所構成之領域Rn(n為1至23之奇數)，以及
由前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第NA號之內含子之3’末端起至5’末端方向NX鹼基之鹼基序列以及第NB號之外顯子之5’末端起至3’末端方向NY鹼基之鹼基序列所構成之領域Rn(n為2至24之偶數)，
在此，
n=1時，NA=44，NB=44，NX=20，以及NY=400，或
n=2時，NA=44，NB=45，NX=600，以及NY=50，或
n=3時，NA=45，NB=45，NX=20，以及NY=400，或
n=4時，NA=45，NB=46，NX=400，以及NY=50，或
n=5時，NA=46，NB=46，NX=20，以及NY=400，或
n=6時，NA=46，NB=47，NX=400，以及NY=50，或
n=7時，NA=47，NB=47，NX=20，以及NY=400，或
n=8時，NA=47，NB=48，NX=400，以及NY=50，或
n=9時，NA=48，NB=48，NX=20，以及NY=400，或
n=10時，NA=48，NB=49，NX=400，以及NY=50，或
n=11時，NA=49，NB=49，NX=20，以及NY=400，或
n=12時，NA=49，NB=50，NX=400，以及NY=50，或
n=13時，NA=50，NB=50，NX=20，以及NY=400，或
n=14時，NA=50，NB=51，NX=400，以及NY=50，或
n=15時，NA=51，NB=51，NX=20，以及NY=400，或
n=16時，NA=51，NB=52，NX=400，以及NY=50，或
n=17時，NA=52，NB=52，NX=20，以及NY=400，或
n=18時，NA=52，NB=53，NX=400，以及NY=50，或
n=19時，NA=53，NB=53，NX=20，以及NY=400，或
n=20時，NA=53，NB=54，NX=400，以及NY=50，或
n=21時，NA=54，NB=54，NX=20，以及NY=400，或
n=22時，NA=54，NB=55，NX=400，以及NY=50，或
n=23時，NA=55，NB=55，NX=20，以及NY=400，或
n=24時，NA=55，NB=56，NX=400，以及NY=50。
[2]
如[1]所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，
領域R1係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第44號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第44號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R2係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第44號之內含子之3’末端起至5’末端方向600鹼基之鹼基序列以及第45號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R3係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第45號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R4係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第46號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R5係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第46號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第46號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R6係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第46號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第47號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R7係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第47號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第47號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R8係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第47號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第48號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R9係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第48號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第48號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R10係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第48號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第49號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R11係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第49號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第49號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R12係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第49號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第50號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R13係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第50號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第50號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R14係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第50號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第51號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R15係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第51號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第51號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R16係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第51號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第52號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R17係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第52號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第52號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R18係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第52號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第53號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R19係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第53號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第53號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R20係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第53號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第54號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R21係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第54號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第54號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R22係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第54號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第55號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R23係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第55號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第55號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，或
領域R24係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第55號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第56號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域。
[3]
如[1]或[2]所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，
前述反義寡聚物係包含與下列者互補的鹼基序列：
(a)由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列，
(b)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列所互補的鹼基序列和在嚴苛的條件下雜交之鹼基序列，
(c)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列，或
(d)由前述(a)、(b)及(c)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列之部分鹼基序列。
[4]
如[1]至[3]中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，
前述反義寡聚物係2個以上之單元寡聚物所連結而成之反義寡聚物，
前述各個單元寡聚物係包含與由前述領域R1至R24所構成之群組選擇之任1個領域之鹼基序列或其部分鹼基序列互補的鹼基序列，且各個單元寡聚物之鹼基序列並非為連續或相互重複者。
[5]
如[1]至[3]中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，
前述反義寡聚物係2個以上之單元寡聚物所連結而成之反義寡聚物，前述各個單元寡聚物係包含與下列者互補的鹼基序列：
(a)由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列，
(b)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列互補的鹼基序列和在嚴苛的條件下雜交之鹼基序列，
(c)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列，或
(d)由前述(a)、(b)及(c)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列之部分鹼基序列，
且各個單元寡聚物之鹼基序列並非為連續或相互重複者。
[6]
如[4]或[5]所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，前述各個單元寡聚物係包含與前述領域中連續5至20鹼基長之鹼基序列互補的鹼基序列。
[7]
如[1]至[3]中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，係包括
(1)由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列，或
(2)與由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列。
[8]
如[1]至[3]以及[7]中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，係包括由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列。
[9]
如[1]至[3]以及[7]至[8]中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，係包括由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列。
[10]
如[1]至[9]中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其係寡核苷酸。
[11]
如[10]所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分以及/或磷酸鍵部分係經修飾。
[12]
如[10]或[11]所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分為其2’位之-OH基由-OR、-R、-R’OR、-SH、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-N3、-CN、-F、-Cl、-Br以及-I所構成之群組選擇之任一基置換之核糖
(前述R係表示烷基或芳基，前述R’係表示伸烷基)。
[13]
如[10]至[12]中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸之磷酸鍵部分係由硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基磷酸酯鍵、胺基磷酸酯鍵、以及硼酸磷酸酯鍵所構成之群組選擇之任1者。
[14]
如[1]至[9]中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其係N-嗎啉寡聚物。
[15]
如[14]所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其係二胺基磷酸酯N-嗎啉寡聚物。
[16]
如[14]或[15]所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，5’末端係下述化學式(1)至(3)中任一基。
Figure 109145043-A0202-12-0015-501
[17]
一種抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，係抑制由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任1個外顯子單一地進行跳讀，其中，
前述抑制因子反義寡聚物係含有與下列者互補的鹼基序列：
(a)由序列編號370至384所構成之群組選擇之鹼基序列之任1個鹼基序列，或
(b)與由序列編號370至384所構成之群組選擇之鹼基序列之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列，或
(c)前述(a)或(b)之鹼基序列之一部鹼基序列。
[18]
如[17]所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，係包括：(1)由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列，或(2)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列 具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列。
[19]
如[17]或[18]所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，係包括由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列。
[20]
如[17]至[19]中任一項所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其係寡核苷酸。
[21]
如[20]所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分以及/或磷酸鍵部分係經修飾。
[22]
如[20]或[21]所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分，其2’位之-OH基係經以由-OR、-R、-R’OR、-SH、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-N3、-CN、-F、-Cl、-Br以及-I所構成之群組選擇之任一基所置換之核糖
(前述R係表示烷基或芳基，前述R’係表示伸烷基)。
[23]
如[20]至[22]中任一項所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸之磷酸鍵部分係由硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基磷酸酯鍵、胺基磷酸酯鍵以及硼酸磷酸酯鍵所構成之群組選擇之任1者。
[24]
如[17]至[19]中任一項所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其係N-嗎啉寡聚物。
[25]
如[24]所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其係二胺基磷酸酯N-嗎啉寡聚物。
[26]
如[24]或[25]所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，5’末端係下述化學式(1)至(3)中任一基。
Figure 109145043-A0202-12-0017-502
[27]
一種醫藥組成物，係含有[1]至[16]中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
[28]
如[27]所述之醫藥組成物，係進一步含有[17]至[26]中任一項所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
[29]
一種醫藥組成物，係含有[1]至[16]中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，和[17]至[26]中任一項所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
[30]
如[28]或[29]所述之醫藥組成物，其中，
(1)前述反義寡聚物係包括序列編號75之寡聚物，前述抑制因子反義寡聚物係包括序列編號260之寡聚物，或
(2)前述反義寡聚物係包括序列編號75之寡聚物，前述抑制因子反義寡聚物係包括序列編號261之寡聚物，或
(3)前述反義寡聚物係包括序列編號75之寡聚物，前述抑制因子反義 寡聚物係包括序列編號263之寡聚物。
[31]
如[27]至[30]中任一項所述之醫藥組成物，係進一步含有醫藥上可許容的擔體。
[32]
如[27]至[31]中任一項所述之醫藥組成物，係用於肌肉萎縮症之治療。
[33]
如[27]至[32]中任一項所述之醫藥組成物，係用以投與於人類患者。
[34]
一種肌肉萎縮症之治療方法，係包含將如[1]至[16]中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，或[27]至[33]中任一項所述之醫藥組成物投與於肌肉萎縮症患者之步驟。
[35]
如[34]所述之治療方法，其中，前述肌肉萎縮症患者為在肌肉萎縮蛋白基因具有成為外顯子45至55跳讀對象之變異之患者。
[36]
如[34]或[35]所述之治療方法，其中，前述患者係人。
[37]
一種前述醫藥係[1]至[16]中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物或[27]至[33]中任一項所述之醫藥組成物的用途，其係用於製造肌肉萎縮症治療用醫藥。
[38]
如[1]至[16]中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物或[27]至[33]中任一項所述之醫藥組成物，其係使用在肌肉萎縮症治療。
[39]
如[38]所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物或醫藥組成物，其中，前述治療係伴隨外顯子之跳讀；前述外顯子為由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任2個以上編號順序為連續之外顯子。
[40]
如[38]或[39]所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物或醫藥組成物，其中，前述治療中，肌肉萎縮症患者係人。
[41]
一種使前述2個以上編號順序為連續之外顯子跳讀之效率增加之方法，該方法係包含在跳讀目的pre-mRNA之2個以上編號順序為連續之外 顯子時，阻礙前述目的pre-mRNA之剪接緘默子序列、剪接部位序列或分支部位序列之步驟。
[42]
如[41]所述之方法，其中，前述剪接緘默子序列係異質核核醣核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1(hnRNPA1))之辨識序列。
[43]
如[41]或[42]所述之方法，其中，前述目的pre-mRNA係人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA。
[44]
如[41]至[43]中任一項所述之方法，其中，前述2個以上編號順序為連續之外顯子係由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇。
[45]
如[44]所述之方法，其中，前述目的pre-mRNA之2個以上編號順序為連續之外顯子之跳讀係使用[1]至[16]中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物進行。
[46]
如[44]或[45]所述之方法，其中，特異性地阻礙前述剪接緘默子序列、剪接部位序列或分支部位序列之步驟，係使用請求17項至26中任一項所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物進行。
此外，本發明能包含以下之態樣。
[47]
一種反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，係同時地跳讀目的pre-mRNA之2個以上編號順序為連續之外顯子之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，
前述反義寡聚物係包含與由下列領域所構成之群組選擇之任1個領域之鹼基序列或其部分鹼基序列互補的鹼基序列：
(1)前述目的pre-mRNA之任一外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及相對於該外顯子鄰接於3’側之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，或
(2)前述目的pre-mRNA之任一內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基或600鹼基的範圍之鹼基序列以及相對於該內含子鄰接於3’側之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基的範圍之鹼基序列所構成之領域。
[48]
如[47]所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，前述目的pre-Mrna係人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA。
藉由本發明提供使標的複數個外顯子同時地跳讀之反義寡聚物。此外，藉由本發明之另一態樣，提供因同時地跳讀目的pre-mRNA之複數個外顯子而用以治療具有各種變異之患者之醫藥組成物。再者，藉由本發明之其他態樣，提供抑制目的pre-Mrna之外顯子單一地跳讀之抑制因子反義寡聚物或包含該寡聚物之醫藥組成物。並且，藉由本發明另一態樣，能同時地高效率地跳讀人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55。
圖1係表示將RD細胞(人橫紋肌肉瘤細胞)中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55之跳讀藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖2係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55之跳讀藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖3係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55之跳讀藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖4係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55之跳讀藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖5係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55之跳讀藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖6係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55之跳讀藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖7係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55之跳讀藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖8係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55之跳讀藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖9係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55之跳讀藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖10係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55之跳讀藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖11係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55之跳讀藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖12係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55之跳讀藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖13係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55之跳讀藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖14係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55之跳讀藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖15係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55之跳讀藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖16係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55之跳讀藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖17係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55之多跳讀以及外顯子45之單跳讀，藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖18係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至55之多跳讀以及外顯子45之單跳讀，藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖19係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至49之多跳讀以及外顯子45之單跳讀，藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖20係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至49之多跳讀藉由RT-PCR進行探討，並將外顯子45至46、外顯子45至47、外顯子45至48以及外顯子45至49之各跳讀之合計量(全多跳讀產物)算出之結果圖。認為該各跳讀均具有治療效果。
圖21係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至52之多跳讀以及外顯子45之單跳讀，藉由RT-PCR進行探討之結果圖。
圖22係表示將RD細胞中的人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之外顯子45至52之多跳讀藉由RT-PCR進行探討，並將外顯子45至47、外顯子45 至48、外顯子45至49、外顯子45至50、外顯子45至51以及外顯子45至52之各跳讀之合計量(左)，或外顯子45至47、外顯子45至48、外顯子45至49以及外顯子45至51之各跳讀之合計量(右)算出之結果圖。外顯子45至47、外顯子45至48、外顯子45至49、以及外顯子45至51之各跳讀均具有治療效果。
以下詳細地說明本發明。以下之實施方式係用以說明本發明所例示者，惟本發明之本旨不限定於以下之實施方式。本發明只要不脫離於該要旨，可以各種形態之方式實施。
1．反義寡聚物
本發明提供一種反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，係同時地跳讀目的pre-mRNA之2個以上編號順序為連續之外顯子之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，
前述反義寡聚物，係包含與下列領域所構成之群組選擇之任1個領域之鹼基序列或其部分鹼基序列互補的鹼基序列：
(1)前述目的pre-mRNA中任一外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及相對於該外顯子鄰接於3’側之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，或
(2)前述目的pre-mRNA中任一內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基或600鹼基的範圍之鹼基序列以及相對於該內含子鄰接於3’側之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基的範圍之鹼基序列所構成之領域。
本說明書中，所謂使2個以上編號順序為連續之外顯子「同時地跳讀」，係不僅指各外顯子由pre-mRNA除去之時點完全地同一之情形，亦包含pre-mRNA至成熟mRNA產生期間內將各外顯子順次地進行除去之情形。亦即，使2個以上編號順序為連續之外顯子「同時地跳讀」係指針對pre-mRNA，將2個以上編號順序為連續之複數個外顯子除去。
本說明書中，「2個以上編號順序為連續之外顯子」係意指目的pre-mRNA中所含有之外顯子之中(將所有之外顯子數當作Texon時)，外顯子編號逐個增加之複數個外顯子。所謂外顯子編號，係意指將在pre-mRNA最接近5’側所存在之外顯子設定為第1號之外顯子，再將由5’側起至3’側依次存在之外顯子依順序分別編列為第2號、第3號之編號。跳讀某基因之2個以上編號順序為連續之外顯子之情形其外顯子編號a1，‧‧‧，aj係可作為數列{aj}表示。數列{aj}之一般項aj係以下式表示。
[式1]aj=m+(j-1)
在此m係滿足1≦m≦(Texon-1)之任意的自然數，j係滿足2≦(m+j)≦Texon+1之自然數。
例如，目的pre-mRNA為人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之情形，Texon為79。
某態樣中j係由1至11選擇之任意的自然數。此外，在別的態樣中j係11、j係10、j係9、j係8、j係7、j係6、j係5、j係4、j係3、j係2、j係1。
本說明書中，「基因」之中，除了基因體基因以外，亦包含cDNA、pre-mRNA以及mRNA，基因較佳係pre-mRNA。本說明書中，所謂「pre-mRNA」，係包含基因體上之標的基因所轉錄之外顯子以及內含子之RNA分子，為mRNA前驅物。
某態樣中，本發明係提供反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其係使由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA中的第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任2個以上編號順序為連續之外顯子同時地跳讀(以下，將前述反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物總括稱為「本發明之反義寡聚物」。本發明之反義寡聚物有時係各別指稱前述反義寡聚物、或其醫藥上可容許的鹽、或此等的水合物。)。
人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA係包含基因體上的人肌肉萎縮蛋白基因所轉錄之外顯子以及內含子之RNA分子，為mRNA前驅物。本發明所屬領域之通常知識者能由人肌肉萎縮蛋白基因之基因體序列(GenBank Accession No.NG_012232.1)藉由類推得到人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之鹼基序列之資訊。
人基因體中，人肌肉萎縮蛋白基因係存在於基因座Xp21.2。人肌肉萎縮蛋白基因係具有約3.0Mbp之大小，為已知之人基因中最大之基因。然而，人肌肉萎縮蛋白基因編碼領域僅不過約14kb，該編碼領域係以79個外顯子之方式分散於肌肉萎縮蛋白基因內(Roberts,RG.,et al.,Genomics,16：536-538(1993))。人肌肉萎縮蛋白基因之轉錄物之pre-mRNA係受到剪接而生成約14kb之成熟mRNA。人之野生型肌肉萎縮蛋 白基因成熟mRNA之鹼基序列為週知者(GenBank Accession No.NM_004006)。
上述態樣中的本發明之反義寡聚物，係將由領域R1至R24所構成之群組選擇之至少任1個領域作為標的，其中領域R1至R24係由下列者所表示者：
人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第NA號之外顯子之3’末端起至5’末端方向NX鹼基之鹼基序列以及第NB號之內含子之5’末端起至3’末端方向NY鹼基之鹼基序列所構成之領域Rn(n為1至23之奇數)，以及
人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第NA號之內含子之3’末端起至5’末端方向NX鹼基之鹼基序列以及第NB號之外顯子之5’末端起至3’末端方向NY鹼基之鹼基序列所構成之領域Rn(n為2至24之偶數)。
以下，將領域R1至R24稱為「本發明之反義寡聚物之標的領域」或相互交換地稱為「本發明之標的領域」。
本說明書中，所謂「作為標的」係指成為對象之鹼基序列係與標的領域之鹼基序列或標的序列之部分鹼基序列互補的鹼基序列。
此外，上述態樣中的本發明之反義寡聚物係包含與由本發明之標的領域R1至R24所構成之群組選擇之至少任1個領域之鹼基序列或其部分鹼基序列互補的鹼基序列。
就上述態樣中的本發明之標的領域Rn之一例而言，可列舉以下者。
n=1時，NA=44，NB=44，NX=20，以及NY=400，或
n=2時，NA=44，NB=45，NX=600，以及NY=50，或
n=3時，NA=45，NB=45，NX=20，以及NY=400，或
n=4時，NA=45，NB=46，NX=400，以及NY=50，或
n=5時，NA=46，NB=46，NX=20，以及NY=400，或
n=6時，NA=46，NB=47，NX=400，以及NY=50，或
n=7時，NA=47，NB=47，NX=20，以及NY=400，或
n=8時，NA=47，NB=48，NX=400，以及NY=50，或
n=9時，NA=48，NB=48，NX=20，以及NY=400，或
n=10時，NA=48，NB=49，NX=400，以及NY=50，或
n=11時，NA=49，NB=49，NX=20，以及NY=400，或
n=12時，NA=49，NB=50，NX=400，以及NY=50，或
n=13時，NA=50，NB=50，NX=20，以及NY=400，或
n=14時，NA=50，NB=51，NX=400，以及NY=50，或
n=15時，NA=51，NB=51，NX=20，以及NY=400，或
n=16時，NA=51，NB=52，NX=400，以及NY=50，或
n=17時，NA=52，NB=52，NX=20，以及NY=400，或
n=18時，NA=52，NB=53，NX=400，以及NY=50，或
n=19時，NA=53，NB=53，NX=20，以及NY=400，或
n=20時，NA=53，NB=54，NX=400，以及NY=50，或
n=21時，NA=54，NB=54，NX=20，以及NY=400，或
n=22時，NA=54，NB=55，NX=400，以及NY=50，或
n=23時，NA=55，NB=55，NX=20，以及NY=400，或
n=24時，NA=55，NB=56，NX=400，以及NY=50。
在其他態樣中，就本發明之標的領域Rn之一例而言，可列舉以下者，惟不限定於此。
n=1時，NA=44，NB=44，NX=20，以及NY=400，或
n=2時，NA=44，NB=45，NX=600，以及NY=19，或
n=3時，NA=45，NB=45，NX=20，以及NY=400，或
n=4時，NA=45，NB=46，NX=400，以及NY=50，或
n=5時，NA=46，NB=46，NX=20，以及NY=400，或
n=6時，NA=46，NB=47，NX=400，以及NY=37，或
n=7時，NA=47，NB=47，NX=20，以及NY=400，或
n=8時，NA=47，NB=48，NX=400，以及NY=19，或
n=9時，NA=48，NB=48，NX=20，以及NY=400，或
n=10時，NA=48，NB=49，NX=400，以及NY=42，或
n=11時，NA=49，NB=49，NX=20，以及NY=400，或
n=12時，NA=49，NB=50，NX=400，以及NY=44，或
n=13時，NA=50，NB=50，NX=20，以及NY=400，或
n=14時，NA=50，NB=51，NX=400，以及NY=25，或
n=15時，NA=51，NB=51，NX=20，以及NY=400，或
n=16時，NA=51，NB=52，NX=400，以及NY=24，或
n=17時，NA=52，NB=52，NX=20，以及NY=400，或
n=18時，NA=52，NB=53，NX=400，以及NY=34，或
n=19時，NA=53，NB=53，NX=20，以及NY=400，或
n=20時，NA=53，NB=54，NX=400，以及NY=43，或
n=21時，NA=54，NB=54，NX=20，以及NY=400，或
n=22時，NA=54，NB=55，NX=400，以及NY=25，或
n=23時，NA=55，NB=55，NX=20，以及NY=400，或
n=24時，NA=55，NB=56，NX=400，以及NY=50。
本發明之標的領域Rn之例之R1至R24，在其他之態樣中可舉例如以下所表記者，惟不限定於此。
例如，某態樣中，領域R1係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第44號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第44號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R2係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第44號之內含子之3’末端起至5’末端方向600鹼基之鹼基序列以及第45號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R3係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第45號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R4係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第46號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R5係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第46號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第46號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R6係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第46號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第47號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R7係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第47號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第47號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R8係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第47號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第48號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R9係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第48號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第48號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R10係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第48號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第49號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R11係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第49號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第49號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R12係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第49號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第50號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R13係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第50號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第50號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R14係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第50號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第51號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R15係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第51號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第51號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R16係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第51號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第52號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R17係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第52號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第52號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R18係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第52號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第53號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R19係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第53號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第53號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R20係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第53號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第54號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R21係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第54號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第54號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R22係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第54號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第55號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R23係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第55號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第55號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，或
領域R24係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第55號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第56號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域。
其他之態樣中，本發明之標的領域Rn之例之R1至R24係在上述之態樣中可舉例如以下所表記者，惟不限定於此。
例如，某態樣中，領域R1係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第44號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第44號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R2係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第44號之內含子之3’末端起至5’末端方向600鹼基之鹼基序列以及第45號之外顯子之5’末端起至3’末端方向19鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R3係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第45號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R4係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第46號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R5係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第46號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第46號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R6係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第46號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第47號之外顯子之5’末端起至3’末端方向37鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R7係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第47號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第47號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R8係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第47號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第48號之外顯子之5’末端起至3’末端方向19鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R9係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第48號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第48號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R10係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第48號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第49號之外顯子之5’末端起至3’末端方向42鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R11係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第49號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第49號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R12係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第49號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第50號之外顯子之5’末端起至3’末端方向44鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R13係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第50號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第50號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R14係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第50號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第51號之外顯子之5’末端起至3’末端方向25鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R15係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第51號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第51號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R16係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第51號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第52號之外顯子之5’末端起至3’末端方向24鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R17係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第52號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第52號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R18係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第52號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第53號之外顯子之5’末端起至3’末端方向34鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R19係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第53號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第53號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R20係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第53號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第54號之外顯子之5’末端起至3’末端方向43鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R21係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第54號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第54號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R22係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第54號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第55號之外顯子之5’末端起至3’末端方向25鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R23係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第55號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第55號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，或
領域R24係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第55號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第56號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域。
此外，本發明之標的領域Rn之例之R1至R24，在其他之態樣中可舉例如以下所表記者，惟不限定於此。
(A1)領域R1
領域R1係將外顯子44之3’末端和內含子44之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-20鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-20鹼基至-1鹼基之範圍所表示領域屬於外顯子44，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子44。
(A2)領域R2
領域R2係將內含子44之3’末端和外顯子45之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-600鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-600鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子44，在+1鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子45。
(A3)領域R3
領域R3係將外顯子45之3’末端和內含子45之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下 游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-20鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-20鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子45，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子45。
(A4)領域R4
領域R4係將內含子45之3’末端和外顯子46之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子45，在+1鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子46。
(A5)領域R5
領域R5係將外顯子46之3’末端和內含子46之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-20鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-20鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子46，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子46。
(A6)領域R6
領域R6係將內含子46之3’末端和外顯子47之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子46，在+1鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子47。
(A7)領域R7
領域R7係將外顯子47之3’末端和內含子47之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下 游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-20鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-20鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子47，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子47。
(A8)領域R8
領域R8係將內含子47之3’末端和外顯子48之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子47，在+1鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子48。
(A9)領域R9
領域R9係將外顯子48之3’末端和內含子48之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-20鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-20鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子48，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子48。
(A10)領域R10
領域R10係將內含子48之3’末端和外顯子49之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子48，在+1鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子49。
(A11)領域R11
領域R11係將外顯子49之3’末端和內含子49之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側 (下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-20鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-20鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子49，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子49。
(A12)領域R12
領域R12係將內含子49之3’末端和外顯子50之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子49，在+1鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子50。
(A13)領域R13
領域R13係將外顯子50之3’末端和內含子50之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-20鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-20鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子50，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子50。
(A14)領域R14
領域R14係將內含子50之3’末端和外顯子51之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子50，在+1鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子51。
(A15)領域R15
領域R15係將外顯子51之3’末端和內含子51之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側 (下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-20鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-20鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子51，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子51。
(A16)領域R16
領域R16係將內含子51之3’末端和外顯子52之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子51，在+1鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子52。
(A17)領域R17
領域R17係將外顯子52之3’末端和內含子52之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-20鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-20鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子52，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子52。
(A18)領域R18
領域R18係將內含子52之3’末端和外顯子53之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子52，在+1鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子53。
(A19)領域R19
領域R19係將外顯子53之3’末端和內含子53之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側 (下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-20鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-20鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子53，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子53。
(A20)領域R20
領域R20係將內含子53之3’末端和外顯子54之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)，3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子53，在+1鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子54。
(A21)領域R21
領域R21係將外顯子54之3’末端和內含子54之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-20鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-20鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子54，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子54。
(A22)領域R22
領域R22係將內含子54之3’末端和外顯子55之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子54，在+1鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子55。
(A23)領域R23
領域R23係將外顯子55之3’末端和內含子55之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側 (下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-20鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-20鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子55，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子55。
(A24)領域R24
領域R24係將內含子55之3’末端和外顯子56之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子55，在+1鹼基至+50鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子56。
另一態樣中，本發明之標的領域Rn之例之R2、R6、R8、R10、R12、R14、R16、R18、R20以及R22，在上述之態樣中可舉例如以下所表記者，惟不限定於此。
(A2)領域R2
領域R2係將內含子44之3’末端和外顯子45之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-600鹼基至+19鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-600鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子44，在+1鹼基至+19鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子45。
(A6)領域R6
領域R6係將內含子46之3’末端和外顯子47之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+37鹼基之範圍所表 示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子46，在+1鹼基至+37鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子47。
(A8)領域R8
領域R8係將內含子47之3’末端和外顯子48之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+19鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子47，在+1鹼基至+19鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子48。
(A10)領域R10
領域R10係將內含子48之3’末端和外顯子49之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+42鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子48，在+1鹼基至+42鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子49。
(A12)領域R12
領域R12係將內含子49之3’末端和外顯子50之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+44鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子49，在+1鹼基至+44鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子50。
(A14)領域R14
領域R14係將內含子50之3’末端和外顯子51之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+25鹼基之範圍所 表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子50，在+1鹼基至+25鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子51。
(A16)領域R16
領域R16係將內含子51之3’末端和外顯子52之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+24鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子51，在+1鹼基至+24鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子52。
(A18)領域R18
領域R18係將內含子52之3’末端和外顯子53之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+34鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子52，在+1鹼基至+34鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子53。
(A20)領域R20
領域R20係將內含子53之3’末端和外顯子54之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+43鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子53，在+1鹼基至+43鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子54。
(A22)領域R22
領域R22係將內含子54之3’末端和外顯子55之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示，將3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在-400鹼基至+25鹼基之範圍所 表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子54，在+1鹼基至+25鹼基之範圍所表示之領域屬於外顯子55。
領域R1至R24之鹼基序列之具體例可列舉以下者。本說明書中，胸腺嘧碇「T」可與尿嘧啶「U」相互交換，無論為「T」或為「U」由於對於本發明之反義寡聚物之外顯子跳讀活性在本質上不產生影響，故本說明書中所表示之鹼基序列中亦包含「T」為「U」之情形，即以同一之序列編號表示。在以下之表中，pre-mRNA中的鹼基序列亦有時將「U」以「T」進行表記，只要為本發明所屬領域之通常知識者即能理解適當地將「T」置換為「U」之RNA序列。
[表1]
Figure 109145043-A0202-12-0046-503
Figure 109145043-A0202-12-0047-504
Figure 109145043-A0202-12-0048-505
Figure 109145043-A0202-12-0049-506
Figure 109145043-A0202-12-0050-507
其他之態樣中，領域R2、R6、R8、R10、R12、R14、R16、R18、R20及R22之鹼基序列之具體例可列舉以下者。
[表2]
Figure 109145043-A0202-12-0051-508
Figure 109145043-A0202-12-0052-509
進一步於其他之態樣中，本發明之反義寡聚物，係將領域R1至R24所構成之群組選擇之至少任1個領域作為標的，其中領域R1至R24為下列所表示者：
人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第NB號之內含子之5’末端起至3’末端方向NY鹼基之鹼基序列所構成之領域Rn(n為1至23之奇數)，以及
人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第NA號之內含子之3’末端起至5’末端方向NX鹼基之鹼基序列所構成之領域Rn(n為2至24之偶數)。
上述態樣中，就本發明之標的領域Rn之一例而言，可列舉以下者，惟不限定於此。
n=1時，NB=44以及NY=400，或
n=2時，NA=44以及NX=600，或
n=3時，NB=45以及NY=400，或
n=4時，NA=45以及NX=400，或
n=5時，NB=46以及NY=400，或
n=6時，NA=46以及NX=400，或
n=7時，NB=47以及NY=400，或
n=8時，NA=47以及NX=400，或
n=9時，NB=48以及NY=400，或
n=10時，NA=48以及NX=400，或
n=11時，NB=49以及NY=400，或
n=12時，NA=49以及NX=400，或
n=13時，NB=50以及NY=400，或
n=14時，NA=50以及NX=400，或
n=15時，NB=51以及NY=400，或
n=16時，NA=51以及NX=400，或
n=17時，NB=52以及NY=400，或
n=18時，NA=52以及NX=400，或
n=19時，NB=53以及NY=400，或
n=20時，NA=53以及NX=400，或
n=21時，NB=54以及NY=400，或
n=22時，NA=54以及NX=400，或
n=23時，NB=55以及NY=400，或
n=24時，NA=55以及NX=400。
上述態樣中為本發明之標的領域Rn之例之R1至R24，進一步在其他之態樣中可舉例如以下所表記者，惟不限定於此。
例如，某態樣中，領域R1係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第44號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R2係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第44號之內含子之3’末端起至5’末端方向600鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R3係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R4係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R5係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第46號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R6係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第46號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R7係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第47號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R8係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第47號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基序列所構成之領域，
領域R9係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第48號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R10係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第48號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R11係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第49號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R12係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第49號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R13係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第50號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R14係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第50號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R15係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第51號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R16係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第51號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R17係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第52號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R18係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第52號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R19係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第53號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R20係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第53號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R21係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第54號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R22係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第54號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
領域R23係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第55號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，或
領域R24係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第55號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域。
此外，上述態樣中本發明之標的領域Rn之例之R1至R24，在其他之態樣中可舉例如以下所表記者，惟不限定於此。
(A1)領域R1
領域R1係將外顯子44之3’末端和內含子44之5’末端之交界作為基點0，將基點起3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子44。
(A2)領域R2
領域R2係將內含子44之3’末端和外顯子45之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示時，在-600鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-600鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子44。
(A3)領域R3
領域R3係將外顯子45之3’末端和內含子45之5’末端之交界作為基點0，將基點起3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子45。
(A4)領域R4
領域R4係將內含子45之3’末端和外顯子46之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子45。
(A5)領域R5
領域R5係將外顯子46之3’末端和內含子46之5’末端之交界作為基點0，將基點起3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子46。
(A6)領域R6
領域R6係將內含子46之3’末端和外顯子47之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子46。
(A7)領域R7
領域R7係將外顯子47之3’末端和內含子47之5’末端之交界作為基點0，將基點起3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子47。
(A8)領域R8
領域R8係將內含子47之3’末端和外顯子48之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子47。
(A9)領域R9
領域R9係將外顯子48之3’末端和內含子48之5’末端之交界作為基點0，將基點起3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子48。
(A10)領域R10
領域R10係將內含子48之3’末端和外顯子49之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子48。
(A11)領域R11
領域R11係將外顯子49之3’末端和內含子49之5’末端之交界作為基點0，將基點起3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在+1鹼基 至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子49。
(A12)領域R12
領域R12係將內含子49之3’末端和外顯子50之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子49。
(A13)領域R13
領域R13係將外顯子50之3’末端和內含子50之5’末端之交界作為基點0，將基點起3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子50。
(A14)領域R14
領域R14係將內含子50之3’末端和外顯子51之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子50。
(A15)領域R15
領域R15係將外顯子51之3’末端和內含子51之5’末端之交界作為基點0，將基點起3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子51。
(A16)領域R16
領域R16係將內含子51之3’末端和外顯子52之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子51。
(A17)領域R17
領域R17係將外顯子52之3’末端和內含子52之5’末端之交界作為基點0，將基點起3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子52。
(A18)領域R18
領域R18係將內含子52之3’末端和外顯子53之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子52。
(A19)領域R19
領域R19係將外顯子53之3’末端和內含子53之5’末端之交界作為基點0，將基點起3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子53。
(A20)領域R20
領域R20係將內含子53之3’末端和外顯子54之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子53。
(A21)領域R21
領域R21係將外顯子54之3’末端和內含子54之5’末端之交界作為基點0，將基點起3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子54。
(A22)領域R22
領域R22係將內含子54之3’末端和外顯子55之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子54。
(A23)領域R23
領域R23係將外顯子55之3’末端和內含子55之5’末端之交界作為基點0，將基點起3’側(下游)之鹼基序列領域以「+」表示時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域。此時，在+1鹼基至+400鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子55。
(A24)領域R24
領域R24係將內含子55之3’末端和外顯子56之5’末端之交界作為基點0，將基點起5’側(上游)之鹼基序列領域以「-」(minus)表示時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域。此時，在-400鹼基至-1鹼基之範圍所表示之領域屬於內含子55。
上述之態樣中，領域R1至R24可列舉以下者。
[表3]
Figure 109145043-A0202-12-0062-510
Figure 109145043-A0202-12-0063-511
Figure 109145043-A0202-12-0064-512
Figure 109145043-A0202-12-0065-513
Figure 109145043-A0202-12-0066-514
此外，本發明之反義寡聚物之標的領域R1至R24中，關於人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA，不僅只包含野生型(例如序列編號233至256、341至369以及385至389所表示之領域)，亦包含變異型者。此種之變異型具體而言，係具有由以下之鹼基序列(B0)以及(B1)至(B16)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列：
(B0)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列互補的鹼基序列和在嚴苛的條件下雜交之鹼基序列；
(B1)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
(B2)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有86%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±14%以內之長度之鹼基序列；
(B3)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有87%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±13%以內之長度之鹼基序列；
(B4)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有88%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±12%以內之長度之鹼基序列；
(B5)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有89%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±11%以內之長度之鹼基序列；
(B6)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有90%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±10%以內之長度之鹼基序列；
(B7)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有91%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±9%以內之長度之鹼基序列；
(B8)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有92%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±8%以內之長度之鹼基序列；
(B9)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有93%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±7%以內之長度之鹼基序列；
(B10)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有94%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±6%以內之長度之鹼基序列；
(B11)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有95%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±5%以內之長度之鹼基序列；
(B12)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有96%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±4%以內之長度之鹼基序列；
(B13)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有97%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±3%以內之長度之鹼基序列；
(B14)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有98%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±2%以內之長度之鹼基序列；
(B15)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±1%以內之長度之鹼基序列；
(B16)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99.5%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±0.5%以內之長度之鹼基序列。
本說明書中，所謂「在嚴苛的條件下雜交之鹼基序列」，係指將例如與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列互補的鹼基序列之全部或部分作為探針，藉由使用菌落雜交(colony hybridization)法、溶菌斑雜交(plaque hybridization)法或南方雜交(Southern hybridization)法等所得到之鹼基序列。就雜交的 方法而言，能利用例如“Sambrook & Russel,Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001”，“Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,1987-1997”等中所記載之方法。
本說明書中，所謂「互補的鹼基序列」，並不限定於與成為對象之鹼基序列形成沃森-克里克配對(Watson-Crick base pairing)之鹼基序列者，亦包含形成搖擺鹼基對(Wobble base pair)之鹼基序列。在此，所謂「沃森-克里克配對」係意指腺嘌呤-胸腺嘧碇、腺嘌呤-尿嘧啶，以及鳥糞嘌呤-胞嘧啶間由氫鍵形成之鹼基對；所謂「搖擺鹼基對」係意指鳥糞嘌呤-尿嘧啶、肌核苷-尿嘧啶、肌核苷-腺嘌呤以及肌核苷-胞嘧啶間由氫鍵形成之鹼基對。此外，所謂「互補的鹼基序列」亦可與成為對象之鹼基序列不具有100%互補性，例如，相對於成為對象之鹼基序列亦可含有1鹼基、2鹼基、3鹼基、4鹼基或5鹼基之非互補的鹼基，並且，相對於成為對象之鹼基序列亦可為短1鹼基、2鹼基、3鹼基、4鹼基或5鹼基之鹼基序列。
本說明書中，所謂「嚴苛的條件」可為低嚴苛的條件、中嚴苛的條件、以及高嚴苛的條件之任一者。所謂「低嚴苛的條件」係例如在5×SSC、5×丹哈特溶液(Denhardt's solution)、0.5%SDS、50%甲醯胺、32℃之條件。此外，所謂「中嚴苛的條件」係例如在5×SSC、5×丹哈特溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、42℃，或5×SSC、1%SDS、50mM Tris-HCl(pH7.5)、50%甲醯胺、42℃之條件。所謂「高嚴苛的條件」係例如在5×SSC、5×丹哈特溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、50℃或0.2×SSC、0.1%SDS、65℃之條件。此等的條件中，可期待隨著溫度越上升能有效率地得到越具 有高度之序列同一性之鹼基序列。然而，作為影響雜交之嚴苛度之要素認為有溫度、探針濃度、探針之長度、離子強度、時間、鹽濃度等複數個要素，只要為本發明所屬領域之通常知識者經由適當地選擇此等的要素即能實現同樣的嚴苛度。
此外，於雜交使用市售之套組之情形，能使用例如AlkPhos Direct Labelling and Detection System(GE Healthcare公司)。此時，依從套組所添附之規程，與經標識之探針進行培養一晚後，將膜在55℃之條件下以含有0.1%(w/v)SDS之1次洗淨緩衝液洗淨後，能檢測出雜交。或者，製作基於與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列之全部或部分為互補的鹼基序列作為探針時，使用市售之試藥(例如PCR Labeling Mix(Roche Diagnostics股份有限公司)等)並將該探針經長葉毛地黃配質(Digoxigenin(DIG))進行標記之情形，使用DIG核酸檢出套組(Roche Diagnostics股份有限公司)等能檢測出雜交。
此外，鹼基序列之同一性能使用藉由Karlin以及Altschul(Karlin S,Altschul SF)之演算法BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268,1990；Proc Natl Acad Sci USA 90：5873,1993)決定。且基於BLAST演算法之稱為BLASTN或BLASTX之程式正在開發中(Altschul SF,et al：J Mol Biol 215：403,1990)。使用BLASTN解析鹼基序列之情形，參數係例如設定為score=100，wordlength=12。使用BLAST和Gapped BLAST程式之情形，係使用各程式之內建參數。
本發明之反義寡聚物係含有與由本發明之標的領域R1至R24所構成之群組選擇之至少任1個領域之鹼基序列或其部分鹼基序列互補的鹼基序列。所謂「其部分」係意指由標的領域R1至R24所構成之群組選擇之至少任1個領域之除全長外之領域，亦即由標的領域R1至R24所構成之群組選擇之至少任1個領域之部分領域。部分領域之長度亦可為10至60鹼基長、10至55鹼基長、10至50鹼基長、10至45鹼基長、10至40鹼基長、10至35鹼基長、10至30鹼基長、10至25鹼基長、15至60鹼基長、15至55鹼基長、15至50鹼基長、15至45鹼基長、15至40鹼基長、15至35鹼基長、15至30鹼基長、15至25鹼基長、16至60鹼基長、16至55鹼基長、16至50鹼基長、16至45鹼基長、16至40鹼基長、16至35鹼基長、16至30鹼基長、16至25鹼基長、17至60鹼基長、17至55鹼基長、17至50鹼基長、17至45鹼基長、17至40鹼基長、17至35鹼基長、17至30鹼基長、17至25鹼基長、18至60鹼基長、18至55鹼基長、18至50鹼基長、18至45鹼基長、18至40鹼基長、18至35鹼基長、18至30鹼基長、18至25鹼基長、19至60鹼基長、19至55鹼基長、19至50鹼基長、19至45鹼基長、19至40鹼基長、19至35鹼基長、19至30鹼基長、19至25鹼基長、20至60鹼基長、20至55鹼基長、20至50鹼基長、20至45鹼基長、20至40鹼基長、20至35鹼基長、20至30鹼基長、20至25鹼基長、15至30鹼基長、15至29鹼基長、15至28鹼基長、15至27鹼基長、15至26鹼基長、15至25鹼基長、15至24鹼基長、15至23鹼基長、15至22鹼基長、15至21鹼基長、15至20鹼基長、15至19鹼基長、15至18鹼基長、16至30鹼基長、16至29鹼基 長、16至28鹼基長、16至27鹼基長、16至26鹼基長、16至25鹼基長、16至24鹼基長、16至23鹼基長、16至22鹼基長、16至21鹼基長、16至20鹼基長、16至19鹼基長、16至18鹼基長、17至30鹼基長、17至29鹼基長、17至28鹼基長、17至27鹼基長、17至26鹼基長、17至25鹼基長、17至24鹼基長、17至23鹼基長、17至22鹼基長、17至21鹼基長、17至20鹼基長、17至19鹼基長、17至18鹼基長、18至30鹼基長、18至29鹼基長、18至28鹼基長、18至27鹼基長、18至26鹼基長、18至25鹼基長、18至24鹼基長、18至23鹼基長、18至22鹼基長、18至21鹼基長、18至20鹼基長、18至19鹼基長、19至30鹼基長、19至29鹼基長、19至28鹼基長、19至27鹼基長、19至26鹼基長、19至25鹼基長、19至24鹼基長、19至23鹼基長、19至22鹼基長、19至21鹼基長、19至20鹼基長、20至30鹼基長、20至29鹼基長、20至28鹼基長、20至27鹼基長、20至26鹼基長、20至25鹼基長、20至24鹼基長、20至23鹼基長、20至22鹼基長、20至21鹼基長、5至25鹼基長、5至24鹼基長、5至23鹼基長、5至22鹼基長、5至21鹼基長、5至20鹼基長、5至19鹼基長、5至18鹼基長、5至17鹼基長、5至16鹼基長、5至15鹼基長、5至14鹼基長、5至13鹼基長、5至12鹼基長、7至25鹼基長、7至24鹼基長、7至23鹼基長、7至22鹼基長、7至21鹼基長、7至20鹼基長、7至19鹼基長、7至18鹼基長、7至17鹼基長、7至16鹼基長、7至15鹼基長、7至14鹼基長、7至13鹼基長、7至12鹼基長、9至25鹼基長、9至24鹼基長、9至23鹼基長、9至22鹼基長、9至21鹼基長、9至20鹼基長、9至19鹼基長、9至18鹼基長、9至17鹼基長、9至 16鹼基長、9至15鹼基長、9至14鹼基長、9至13鹼基長、9至12鹼基長、10至25鹼基長、10至24鹼基長、10至23鹼基長、10至22鹼基長、10至21鹼基長、10至20鹼基長、10至19鹼基長、10至18鹼基長、10至17鹼基長、10至16鹼基長、10至15鹼基長、10至14鹼基長、10至13鹼基長、10至12鹼基長、60鹼基長、59鹼基長、58鹼基長、57鹼基長、56鹼基長、55鹼基長、54鹼基長、53鹼基長、52鹼基長、51鹼基長、50鹼基長、49鹼基長、48鹼基長、47鹼基長、46鹼基長、45鹼基長、44鹼基長、43鹼基長、42鹼基長、41鹼基長、40鹼基長、39鹼基長、38鹼基長、37鹼基長、36鹼基長、35鹼基長、34鹼基長、33鹼基長、32鹼基長、31鹼基長、30鹼基長、29鹼基長、28鹼基長、27鹼基長、26鹼基長、25鹼基長、24鹼基長、23鹼基長、22鹼基長、21鹼基長、20鹼基長、19鹼基長、18鹼基長、17鹼基長、16鹼基長、15鹼基長、14鹼基長、13鹼基長、12鹼基長、11鹼基長、10鹼基長、9鹼基長、8鹼基長、7鹼基長、6鹼基長，或5鹼基長，惟不限定於此等，上述之長度亦可增加或減少1、2或3鹼基長。
本發明之反義寡聚物係具有同時地跳讀人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA中的由第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任2個以上編號順序為連續之外顯子之活性。本說明書中，將如此目的之pre-mRNA之2個以上編號順序為連續之外顯子之跳讀稱為「多外顯子跳讀」或「多跳讀」，將此活性稱為「多外顯子跳讀活性」或「多跳讀活性」。
在此，所謂由第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任2個以上編號順序為連續之外顯子，係意指pre-mRNA中所含有第45號外顯子起至第55號外顯子之11個外顯子之中，外顯子編號逐個增加之複數個外顯子。所謂外顯子編號係意指人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA中所含有79個外顯子之中，將在pre-mRNA最接近5’側所存在之外顯子設定為第1號之外顯子，再將由5’側起至3’側依次存在之外顯子依順序分別編列為第2號、第3號…第79號之編號。此外，關於內含子係與其存在於5’側之外顯子相同之編號。亦即，第45號之內含子係其5’側存在有第45號之外顯子，其3’側存在有第46號之外顯子。此外，本說明書中，所謂「第n號」之外顯子或內含子係意指在pre-mRNA之5’末端起朝向3’末端計數之n號之外顯子或內含子。
將由第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任2個以上編號順序為連續之外顯子中所含有之外顯子之組合表示於表4。
[表4]
Figure 109145043-A0202-12-0075-515
表4中所記載之外顯子之組合中，對於DMD能期待發揮更高治療效果之跳讀模式係例如組合1、2、3、4、6、8、10、18、20、21、23、25、27、28、30、32、34、36、38、40、41、43、45、46、50、52，或55。藉由在此等組合之多外顯子跳讀，期待對於DMD患者能發揮更多的治療效果。
此外，所謂由第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任2個以上編號順序為連續之外顯子，亦可包含複數個連續外顯子群，並無特別限定，例如亦可為(例1)外顯子45至46(第1外顯子群)和外顯子48至53(第2外顯子群)，(例2)外顯子46至47(第1外顯子群)和外顯子49至50(第2外顯子群)和外顯子52至54(第3外顯子群)。
本發明中所謂「跳讀活性」(亦即多跳讀活性)，舉人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA為例時，係意指使人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA中由第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任2個以上編號順序為連續之外顯子為缺失之人肌肉萎縮蛋白mRNA產生之活性。
換言之，此活性係意指本發明之反義寡聚物藉由結合於人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA上之標的部位，該pre-mRNA受到剪接時，缺失之外顯子之相鄰上游之外顯子的3’末端之核苷酸，與缺失之外顯子之相鄰下游之外顯子的5’末端之核苷酸連結，而形成未引起密碼子框移之成熟mRNA(亦即，未引起框移而外顯子為缺失之成熟mRNA)。
本發明之反義寡聚物係在生理的條件下顯示多跳讀活性。上述所謂「生理的條件下」係意指調節成與生物體內類似之pH、鹽組成、溫度等條件。可舉例如為25至40℃，較佳為37℃，pH 5至8，較佳為pH 7.4，氯化鈉濃度為150mM之條件。誘導多跳讀時，本發明之反義寡聚物能使用1種或複數種，例如組合2、3、4、5、6、7、8、9或10種之反義寡聚物。
多跳讀發生與否，能藉由下述之方式確認：將本發明之反義寡聚物導入肌肉萎縮蛋白表現細胞(例如，人橫紋肌肉瘤細胞)，由前述肌肉 萎縮蛋白表現細胞之全RNA，將人肌肉萎縮蛋白基因的mRNA之外顯子45至55的週邊領域進行RT-PCR擴增，針對該PCR擴增產物進行nested PCR或序列解析。多跳讀效率係藉由將人肌肉萎縮蛋白基因之mRNA由被檢細胞回收，該mRNA之中，測定外顯子45至55之中任2個以上編號順序為連續之外顯子經跳讀段之多核苷酸量作為「A」，外顯子45至55之中任1個外顯子經跳讀段之多核苷酸量作為「B」，未發生跳讀的段之多寡核苷酸量作為「C」，依據此等「A」、「B」及「C」之測定值能依照以下之算式進行計算。
跳讀效率(%)=A/(A+B+C)×100
例如，外顯子45至55之多跳讀效率係能使用針對外顯子44之前置引子和針對外顯子56之反置引子，測定外顯子45至55經多跳讀段之多核苷酸量作為「A」，並使用針對外顯子44之前置引子和針對外顯子46之反置引子，測定外顯子45經單跳讀段之多核苷酸量作為「B」，再使用針對外顯子44之前置引子和針對外顯子46之反置引子測定未發生跳讀段之多核苷酸量作為「C」，依據此等「A」、「B」及「C」之測定值能依照上述之算式進行計算。
因本發明之反義寡聚物之人肌肉萎縮蛋白mRNA中缺失之外顯子的數目為2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個，或11個。將此稱為缺失模式，惟有時在以1次的跳讀實驗或跳讀治療所得到之結果混合存在有各種的缺失模式。例如，將本發明之反義寡聚物導入於表現人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之細胞中，將該mRNA回收後可得到 形成混合存在有2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個，或11個外顯子經缺失之mRNA。
某實施態樣中「跳讀之活性」係能以以下之(C1)至(C10)定義。
(C1)由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA中的第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任2個編號順序為連續之外顯子係以5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之效率跳讀。
在此前述2個編號順序為連續之外顯子亦可為第45號以及第46號之外顯子、第46號以及第47號之外顯子、第47號以及第48號之外顯子、第48號以及第49號之外顯子、第49號以及第50號之外顯子、第50號以及第51號之外顯子、第51號以及第52號之外顯子、第52號以及第53號之外顯子、第53號以及第54號之外顯子，或第54號以及第55號之外顯子。
(C2)由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA中的第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任3個編號順序為連續之外顯子係以5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之效率跳讀。
在此前述3個編號順序為連續之外顯子亦可為第45號至第47號之外顯子、第46號至第48號之外顯子、第47號至第49號之外顯子、第48號至第50號之外顯子、第49號至第51號之外顯子、第50號至第52號之外顯子、第51號至第53號之外顯子、第52號至第54號之外顯子，或第53號至第55號之外顯子。
(C3)由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA中的第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任4個編號順序為連續之外顯子係以5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之效率跳讀。
在此前述4個編號順序為連續之外顯子亦可為第45號至第48號之外顯子、第46號至第49號之外顯子、第47號至第50號之外顯子、第48號至第51號之外顯子、第49號至第52號之外顯子、第50號至第53號之外顯子，第51號至第54號之外顯子，或第52號至第55號之外顯子。
(C4)由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA中第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任5個編號順序為連續之外顯子係以5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之效率跳讀。
在此前述5個編號順序為連續之外顯子亦可為第45號至第49號之外顯子、第46號至第50號之外顯子、第47號至第51號之外顯子、第48號至第52號之外顯子、第49號至第53號之外顯子、第50號至第54號之外顯子，或第51號至第55號之外顯子。
(C5)由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA中的第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任6個編號順序為連續之外顯子係以5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之效率跳讀。
在此前述6個編號順序為連續之外顯子亦可為第45號至第50號之外顯子、第46號至第51號之外顯子、第47號至第52號之外顯子、第48號至第53號之外顯子、第49號至第54號之外顯子、或第50號至第55號之外顯子。
(C6)由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA中的第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任7個編號順序為連續之外顯子係以5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之效率跳讀。
在此前述7個編號順序為連續之外顯子亦可為第45號至第51號之外顯子、第46號至第52號之外顯子、第47號至第53號之外顯子、第48號至第54號之外顯子，或第49號至第55號之外顯子。
(C7)由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA中的第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任8個編號順序為連續之外顯子係以5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之效率跳讀。
在此前述8個編號順序為連續之外顯子亦可為第45號至第52號之外顯子、第46號至第53號之外顯子、第47號至第54號之外顯子，或第48號至第55號之外顯子。
(C8)由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA中的第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任9個編號順序為連續之外顯子係以5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之效率跳讀。
在此前述9個編號順序為連續之外顯子亦可為第45號至第53號之外顯子、第46號至第54號之外顯子，或第47號至第55號之外顯子。
(C9)由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA中的第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任10個編號順序為連續之外顯 子係以5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之效率跳讀。
在此前述10個編號順序為連續之外顯子亦可為第45號至第54號之外顯子，或第46號至第55號之外顯子。
(C10)由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA中的第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之11個編號順序為連續之外顯子係以5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之效率跳讀。
在此前述11個編號順序為連續之外顯子為第45號至第55號之外顯子。
本發明之反義寡聚物亦可為10至60鹼基長、10至55鹼基長、10至50鹼基長、10至45鹼基長、10至40鹼基長、10至35鹼基長、10至30鹼基長、10至25鹼基長、15至60鹼基長、15至55鹼基長、15至50鹼基長、15至45鹼基長、15至40鹼基長、15至35鹼基長、15至30鹼基長、15至25鹼基長、16至60鹼基長、16至55鹼基長、16至50鹼基長、16至45鹼基長、16至40鹼基長、16至35鹼基長、16至30鹼基長、16至25鹼基長、17至60鹼基長、17至55鹼基長、17至50鹼基長、17至45鹼基長、17至40鹼基長、17至35鹼基長、17至30鹼基長、 17至25鹼基長、18至60鹼基長、18至55鹼基長、18至50鹼基長、18至45鹼基長、18至40鹼基長、18至35鹼基長、18至30鹼基長、18至25鹼基長、19至60鹼基長、19至55鹼基長、19至50鹼基長、19至45鹼基長、19至40鹼基長、19至35鹼基長、19至30鹼基長、19至25鹼基長、20至60鹼基長、20至55鹼基長、20至50鹼基長、20至45鹼基長、20至40鹼基長、20至35鹼基長、20至30鹼基長、20至25鹼基長、15至30鹼基長、15至29鹼基長、15至28鹼基長、15至27鹼基長、15至26鹼基長、15至25鹼基長、15至24鹼基長、15至23鹼基長、15至22鹼基長、15至21鹼基長、15至20鹼基長、15至19鹼基長、15至18鹼基長、16至30鹼基長、16至29鹼基長、16至28鹼基長、16至27鹼基長、16至26鹼基長、16至25鹼基長、16至24鹼基長、16至23鹼基長、16至22鹼基長、16至21鹼基長、16至20鹼基長、16至19鹼基長、16至18鹼基長、17至30鹼基長、17至29鹼基長、17至28鹼基長、17至27鹼基長、17至26鹼基長、17至25鹼基長、17至24鹼基長、17至23鹼基長、17至22鹼基長、17至21鹼基長、17至20鹼基長、17至19鹼基長、17至18鹼基長、18至30鹼基長、18至29鹼基長、18至28鹼基長、18至27鹼基長、18至26鹼基長、18至25鹼基長、18至24鹼基長、18至23鹼基長、18至22鹼基長、18至21鹼基長、18至20鹼基長、18至19鹼基長、19至30鹼基長、19至29鹼基長、19至28鹼基長、19至27鹼基長、19至26鹼基長、19至25鹼基長、19至24鹼基長、19至23鹼基長、19至22鹼基長、19至21鹼基長、19至20鹼基長、20至30鹼基長、20至29鹼基長、20至28鹼基長、20至27鹼基長、20至26鹼 基長、20至25鹼基長、20至24鹼基長、20至23鹼基長、20至22鹼基長、20至21鹼基長、60鹼基長、59鹼基長、58鹼基長、57鹼基長、56鹼基長、55鹼基長、54鹼基長、53鹼基長、52鹼基長、51鹼基長、50鹼基長、49鹼基長、48鹼基長、47鹼基長、46鹼基長、45鹼基長、44鹼基長、43鹼基長、42鹼基長、41鹼基長、40鹼基長、39鹼基長、38鹼基長、37鹼基長、36鹼基長、35鹼基長、34鹼基長、33鹼基長、32鹼基長、31鹼基長、30鹼基長、29鹼基長、28鹼基長、27鹼基長、26鹼基長、25鹼基長、24鹼基長、23鹼基長、22鹼基長、21鹼基長、20鹼基長、19鹼基長、18鹼基長、17鹼基長、16鹼基長、15鹼基長、14鹼基長、13鹼基長、12鹼基長、11鹼基長，或10鹼基長，惟不限定於此等，上述之長度亦可增加或減少1、2或3鹼基長。
本發明之反義寡聚物之一態樣係複數個單元寡聚物為具有相互連結之構成之連結型反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物(以下稱為「本發明之連結型反義寡聚物」)。所謂單元寡聚物係意指構成本發明之連結型反義寡聚物之各寡聚物。亦即，本發明之連結型反義寡聚物為包含下述鹼基序列之部分(單元)：結合於人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA上之標的鹼基序列時，與具有連續之鹼基序列之標的鹼基序列發生雜交之鹼基序列。
具體而言，本發明之連結型反義寡聚物，係
2個以上之單元寡聚物所連結而成之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，
前述各個單元寡聚物係包含與由前述領域R1至R24(屬於野生型之序列編號233至256、341至369以及385至389中所示之領域以及亦可包含其變異型)所構成之群組選擇之任1個領域之鹼基序列或其部分鹼基序列互補的鹼基序列，且各個單元寡聚物之鹼基序列並非為連續或相互重複者之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
單元寡聚物亦可經由無助於雜交之連接子連結，或者亦可不經由連接子而直接連結。單元寡聚物彼此直接連結之情形，在位於5’末端側之單元的3’末端，和位於3’末端側之單元的5’末端形成磷酸鍵或以下中任一個基。
Figure 109145043-A0202-12-0085-516
(式中，X係表示-OH、-CH2R1、-O-CH2R1、-S-CH2R1、-NR2R3，或F；
R1係表示H、烷基；
R2以及R3係相同或相異地表示H、烷基、環烷基，或芳基；
Y1係表示O、S、CH2，或NR1；
Y2係表示O、S，或NR1；
Z係表示O或S。)
本發明之連結型反義寡聚物中，各單元寡聚物亦可將領域R1至R24中各別的領域中所含之鹼基序列作為標的，亦可將同一領域中所含之鹼基序列作為標的。此外，本發明之連結型反義寡聚物係各個單元寡聚物之鹼基序列並非為連續或相互重複者。所謂各個單元寡聚物之鹼基序列並非為連續者係意指構成本發明之連結型反義寡聚物之各單元寡聚物之標的鹼基序列，以人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA上之鹼基序列而言為不連續。因此，將各單元寡聚物之標的鹼基序列與人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之鹼基序列比對時，在前述標的鹼基序列之間以人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之鹼基序列而言至少隔著1鹼基。另一方面，所謂各個單元寡聚物之鹼基序列並非為相互重複者係意指單元寡聚物之標的鹼基序列就人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA上之鹼基序列而言未重複。容許各個單元寡聚物之鹼基序列中偶然地存在有約1、2、3、4、5、6、7、8、9，或10個鹼基一致。
本發明之連結型反義寡聚物中，前述各個單元寡聚物係包含與下列者互補的鹼基序列：
(D1)由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列，
(D2)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列，
(D3)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列互補的鹼基序列和在嚴苛的條件下雜交之鹼基序列，或
(D4)由前述(D1)、(D2)以及(D3)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列之部分鹼基序列，
且各個單元寡聚物之鹼基序列亦可具有並非連續或相互重複之構成。
本發明之連結型反義寡聚物係如上述可包含與由(D1)、(D2)、(D3)以及(D4)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列互補的鹼基序列。(D2)之鹼基序列係前述(D1)之鹼基序列之變異體，就其例而言，亦可舉例如：
(D2-1)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
(D2-2)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有86%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±14%以內之長度之鹼基序列；
(D2-3)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有87%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±13%以內之長度之鹼基序列；
(D2-4)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有88%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±12%以內之長度之鹼基序列；
(D2-5)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有89%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±11%以內之長度之鹼基序列；
(D2-6)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有90%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±10%以內之長度之鹼基序列；
(D2-7)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有91%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±9%以內之長度之鹼基序列；
(D2-8)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有92%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±8%以內之長度之鹼基序列；
(D2-9)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有93%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±7%以內之長度之鹼基序列；
(D2-10)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有94%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±6%以內之長度之鹼基序列；
(D2-11)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有95%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±5%以內之長度之鹼基序列；
(D2-12)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有96%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±4%以內之長度之鹼基序列；
(D2-13)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有97%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±3%以內之長度之鹼基序列；
(D2-14)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有98%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±2%以內之長度之鹼基序列；
(D2-15)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±1%以內之長度之鹼基序列；以及
(D2-16)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99.5%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±0.5%以內之長度之鹼基序列。
因此，構成本發明之連結型反義寡聚物之前述各個單元寡聚物可包含與由前述(D1)、(D2-1)至(D2-16)、(D3)以及(D4)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列互補的鹼基序列。
此外，本發明之連結型反義寡聚物係如上述可包含與由(D1)、(D2)、(D3)以及(D4)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列互補的鹼基序列。鹼基序列(D4)係關於由前述(D1)、(D2)以及(D3)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列之部分鹼基序列。關於(D4)，所謂「其部分」係意指「(D1)、(D2)或(D3)之除全長外之連續之部分領域」。部分領域之長度為5至25鹼基長、5至24鹼基長、5至23鹼基長、5至22鹼基長、5至21鹼基長、5至20鹼基長、5至19鹼基長、5至18鹼基長、5至17鹼基長、5至16鹼基長、5至15鹼基長、5至14鹼基長、5至13鹼基長、5至12鹼基長、7至25鹼基長、7至24鹼基長、7至23鹼基長、7至22鹼基長、7至21鹼基長、7至20鹼基長、7至19鹼基長、7至18鹼基長、7至17鹼基長、7至16鹼基長、7至15鹼基長、7至14鹼基長、7至13鹼基長、 7至12鹼基長、9至25鹼基長、9至24鹼基長、9至23鹼基長、9至22鹼基長、9至21鹼基長、9至20鹼基長、9至19鹼基長、9至18鹼基長、9至17鹼基長、9至16鹼基長、9至15鹼基長、9至14鹼基長、9至13鹼基長、9至12鹼基長、10至25鹼基長、10至24鹼基長、10至23鹼基長、10至22鹼基長、10至21鹼基長、10至20鹼基長、10至19鹼基長、10至18鹼基長、10至17鹼基長、10至16鹼基長、10至15鹼基長、10至14鹼基長、10至13鹼基長、10至12鹼基長、25鹼基長、24鹼基長、23鹼基長、22鹼基長、21鹼基長、20鹼基長、19鹼基長、18鹼基長、17鹼基長、16鹼基長、15鹼基長、14鹼基長、13鹼基長、12鹼基長、11鹼基長、10鹼基長、9鹼基長、8鹼基長、7鹼基長、6鹼基長、5鹼基長，惟不限定於此等，上述之長度亦可增加或減少1、2或3鹼基長。
各單元寡聚物之大小亦可為5至30鹼基長、5至29鹼基長、5至28鹼基長、5至27鹼基長、5至26鹼基長、5至25鹼基長、5至24鹼基長、5至23鹼基長、5至22鹼基長、5至21鹼基長、5至20鹼基長、5至19鹼基長、5至18鹼基長、5至17鹼基長、5至16鹼基長、5至15鹼基長、5至14鹼基長、5至13鹼基長、5至12鹼基長、7至30鹼基長、7至29鹼基長、7至28鹼基長、7至27鹼基長、7至26鹼基長、7至25鹼基長、7至24鹼基長、7至23鹼基長、7至22鹼基長、7至21鹼基長、7至20鹼基長、7至19鹼基長、7至18鹼基長、7至17鹼基長、7至16鹼基長、7至15鹼基長、7至14鹼基長、7至13鹼基長、7至12鹼基長、9至30鹼基長、9至29鹼基長、9至28鹼基長、9至27鹼基長、9至26鹼基長、9至25鹼基長、9至24鹼基長、9至23鹼基長、9至22鹼基 長、9至21鹼基長、9至20鹼基長、9至19鹼基長、9至18鹼基長、9至17鹼基長、9至16鹼基長、9至15鹼基長、9至14鹼基長、9至13鹼基長、9至12鹼基長、10至30鹼基長、10至29鹼基長、10至28鹼基長、10至27鹼基長、10至26鹼基長、10至25鹼基長、10至24鹼基長、10至23鹼基長、10至22鹼基長、10至21鹼基長、10至20鹼基長、10至19鹼基長、10至18鹼基長、10至17鹼基長、10至16鹼基長、10至15鹼基長、10至14鹼基長、10至13鹼基長、10至12鹼基長、30鹼基長、29鹼基長、28鹼基長、27鹼基長、26鹼基長、25鹼基長、24鹼基長、23鹼基長、22鹼基長、21鹼基長、20鹼基長、19鹼基長、18鹼基長、17鹼基長、16鹼基長、15鹼基長、14鹼基長、13鹼基長、12鹼基長、11鹼基長、10鹼基長、9鹼基長、8鹼基長、7鹼基長、6鹼基長、5鹼基長，惟不限定於此等，上述之長度亦可增加或減少1、2或3鹼基長。各單元寡聚物之大小可為相同亦可相異。
某態樣中，本發明之連結型反義寡聚物亦可為包含
(E1)由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列；或
(E2)與由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
所成之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
在此，(E2)之鹼基序列係(E1)之鹼基序列之變異型，就變異型而言可列舉例如：
(E2-1)與由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
(E2-2)與由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有86%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±14%以內之長度之鹼基序列；
(E2-3)與由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有87%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±13%以內之長度之鹼基序列；
(E2-4)與由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有88%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±12%以內之長度之鹼基序列；
(E2-5)與由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有89%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±11%以內之長度之鹼基序列；
(E2-6)與由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有90%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±10%以內之長度之鹼基序列；
(E2-7)與由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有91%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±9%以內之長度之鹼基序列；
(E2-8)與由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有92%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±8%以內之長度之鹼基序列；
(E2-9)與由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有93%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±7%以內之長度之鹼基序列；
(E2-10)與由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有94%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±6%以內之長度之鹼基序列；
(E2-11)與由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有95%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±5%以內之長度之鹼基序列；
(E2-12)與由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有96%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±4%以內之長度之鹼基序列；
(E2-13)與由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有97%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±3%以內之長度之鹼基序列；
(E2-14)與由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有98%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±2%以內之長度之鹼基序列；
(E2-15)與由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±1%以內之長度之鹼基序列；以及
(E2-16)與由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99.5%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±0.5%以內之長度之鹼基序列。
因此，本發明之連結型反義寡聚物，亦可為由前述(E1)以及(E2-1)至(E2-16)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列所構成者。
本發明之連結型反義寡聚物較佳係包含由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列。此外，某態樣中本發明之連結型反義寡聚物係由序列編號18至21、80至111以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列所構成。
再者，本發明之反義寡聚物亦可為
(E’1)由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列；或
(E’2)與由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列而有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列，
所成之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
在此，(E’2)之鹼基序列係(E’1)之鹼基序列之變異型，就變異型而言可列舉例如：
(E’2-1)與由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之 任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
(E’2-2)與由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有86%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±14%以內之長度之鹼基序列；
(E’2-3)與由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有87%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±13%以內之長度之鹼基序列；
(E’2-4)與由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193,195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有88%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±12%以內之長度之鹼基序列；
(E’2-5)與由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有89%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±11%以內之長度之鹼基序列；
(E’2-6)與由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有90%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±10%以內之長度之鹼基序列；
(E’2-7)與由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之 任1個鹼基序列具有91%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±9%以內之長度之鹼基序列；
(E’2-8)與由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193,195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有92%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±8%以內之長度之鹼基序列；
(E’2-9)與由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有93%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±7%以內之長度之鹼基序列；
(E’2-10)與由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有94%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±6%以內之長度之鹼基序列；
(E’2-11)與由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有95%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±5%以內之長度之鹼基序列；
(E’2-12)與由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有96%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±4%以內之長度之鹼基序列；
(E’2-13)與由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之 任1個鹼基序列具有97%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±3%以內之長度之鹼基序列；
(E’2-14)與由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有98%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±2%以內之長度之鹼基序列；
(E’2-15)與由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±1%以內之長度之鹼基序列，以及
與由(E’2-16)序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99.5%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±0.5%以內之長度之鹼基序列。
因此，本發明之反義寡聚物亦可包含由前述(E’1)以及(E’2-1)至(E’2-16)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列。
本發明之反義寡聚物較佳係包含由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列。此外，某態樣中本發明之反義寡聚物係包含由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列。
某態樣中，本發明之反義寡聚物亦可為
(E”1)由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列；或
(E”2)與由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
所成之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
在此，(E”2)之鹼基序列係(E”1)之鹼基序列之變異型，就變異型而言可列舉例如：
(E”2-1)與由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、 156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
(E”2-2)與由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有86%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±14%以內之長度之鹼基序列；
(E”2-3)與由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有87%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±13%以內之長度之鹼基序列；
(E”2-4)與由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、 97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有88%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±12%以內之長度之鹼基序列；
(E”2-5)與由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有89%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±11%以內之長度之鹼基序列；
(E”2-6)與由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有90%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±10%以內之長度之鹼基序列；
(E”2-7)與由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有91%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±9%以內之長度之鹼基序列；
(E”2-8)與由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有92%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±8%以內之長度之鹼基序列；
(E”2-9)與由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所 構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有93%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±7%以內之長度之鹼基序列；
(E”2-10)與由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有94%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±6%以內之長度之鹼基序列；
(E”2-11)與由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有95%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±5%以內之長度之鹼基序列；
(E”2-12)與由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、 58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有96%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±4%以內之長度之鹼基序列；
(E”2-13)與由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有97%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±3%以內之長度之鹼基序列；
(E”2-14)與由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有98%以上之序列同一性，且 與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±2%以內之長度之鹼基序列；
(E”2-15)與由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±1%以內之長度之鹼基序列；以及
(E”2-16)與由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99.5%以上之序列同一性，且前述選擇之任1個鹼基序列與之長度相比具有±0.5%以內之長度之鹼基序列。
因此，本發明之反義寡聚物亦可包含由前述(E”1)以及(E”2-1)至(E”2-16)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列。
某態樣中，本發明之反義寡聚物亦可為
(E'''1)由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列；或
(E'''2)與由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列，
所成之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
在此，(E'''2)之鹼基序列係(E'''1)之鹼基序列之變異型，就變異型而言可列舉例如：
(E'''2-1)與由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列，
(E'''2-2)與由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有86%以上之序列同一 性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±14%以內之長度之鹼基序列；
(E'''2-3)與由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有87%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±13%以內之長度之鹼基序列；
(E'''2-4)與由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有88%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±12%以內之長度之鹼基序列；
(E'''2-5)與由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有89%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±11%以內之長度之鹼基序列；
(E'''2-6)與由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有90%以上之序列同一 性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±10%以內之長度之鹼基序列；
(E'''2-7)與由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有91%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±9%以內之長度之鹼基序列；
(E'''2-8)與由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有92%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±8%以內之長度之鹼基序列，
(E'''2-9)與由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有93%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±7%以內之長度之鹼基序列；
(E'''2-10)與由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有94%以上之序列同 一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±6%以內之長度之鹼基序列；
(E'''2-11)與由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有95%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±5%以內之長度之鹼基序列；
(E'''2-12)與由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有96%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±4%以內之長度之鹼基序列；
(E'''2-13)與由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有97%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±3%以內之長度之鹼基序列；
(E'''2-14)與由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有98%以上之序列同 一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±2%以內之長度之鹼基序列；
(E'''2-15)與由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±1%以內之長度之鹼基序列；以及
(E'''2-16)與由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99.5%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±0.5%以內之長度之鹼基序列。
因此，本發明之反義寡聚物係包含由前述(E'''1)以及(E'''2-1)至(E'''2-16)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列。
本發明之反義寡聚物較佳係包含由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列之反義 寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。此外，某態樣中本發明之反義寡聚物為包含由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
本發明之反義寡聚物更佳為包含由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。此外，某態樣中本發明之反義寡聚物為包含由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
此外，某態樣中本發明之連結型反義寡聚物為包含由序列編號80、82、86、92、97、98、100、102、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等 的水合物。此外，某態樣中，本發明之連結型反義寡聚物係包含由序列編號80、82、86、92、97、98、100、102、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列。再者較佳為，本發明之連結型反義寡聚物係包含序列編號102、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列。此外，某態樣中，本發明之連結型反義寡聚物為包含由序列編號102、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
本發明之反義寡聚物係包含與由領域R1至R24所構成之群組選擇之至少任1個領域之鹼基序列或其部分鹼基序列互補的鹼基序列。就與領域R1至R24中所含有之各別領域之鹼基序列或其部分鹼基序列互補的鹼基序列而言，可選擇由上述(E1)以及(E2-1)至(E2-16)所構成之群組、由(E’1)以及(E’2-1)至(E’2-16)所構成之群組、由(E”1)以及(E”2-1)至(E”2-16)所構成之群組，或由(E'''1)以及(E'''2-1)至(E'''2-16)所構成之群組選擇之任一鹼基序列。例如，就與領域R1至R24之鹼基序列或其部分鹼基序列互補的鹼基序列而言，關於領域R4至R24可設為與各別領域之鹼基序列或其部分鹼基序列互補的鹼基序列，關於領域R1至R3可設為由(E1)以及(E2-1)至(E2-16)所構成之群組選擇之鹼基序列，亦即R1至R3之領域中所含有之鹼基序列。
本發明之反義寡聚物(包含本發明之連結型反義寡聚物)亦可為寡核苷酸、N-嗎啉寡聚物，或肽核酸(Peptide Nueleic Acid：PNA)寡聚物(以下分別稱之為「本發明之反義寡核苷酸」、「本發明之反義N-嗎啉寡聚物」，或「本發明之反義肽核酸寡聚物」。)。
本發明之反義寡核苷酸係將核苷酸作為構成單元之反義寡聚物，如此之核苷酸亦可為核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸，或修飾核苷酸中的任一者。
所謂修飾核苷酸係指構成核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸之核酸鹼基、糖部分以及磷酸鍵部分之全部或部分係經修飾者。
就核酸鹼基而言，可列舉例如腺嘌呤、鳥糞嘌呤、次黃嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧碇、尿嘧啶，或此等的修飾鹼基。就如此的修飾鹼基而言，可舉例如假尿嘧啶、3-甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、5-烷基胞嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶)、5-烷基尿嘧啶(例如5-乙基尿嘧啶)、5-鹵尿嘧啶(例如5-溴尿嘧啶)、6-氮雜嘧啶、6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿嘧啶)、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、4-乙醯胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基尿嘧啶、1-甲基腺嘌呤、1-甲基次黃嘌呤、2,2-二甲基鳥糞嘌呤、3-甲基胞嘧啶、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥糞嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥糞嘌呤、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲基羰基甲基尿嘧啶、5-甲基氧尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸、2-硫胞嘧啶、嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、異鳥糞嘌呤、吲哚、咪唑、黃嘌呤等，惟不限定於此等。
就糖部分之修飾而言，可舉例如核糖之2’位之修飾以及糖之其他部分之修飾。就核糖之2’位之修飾而言，可舉例如亦可將核糖之2’位之-OH基置換為-OR、-R、-R’OR、-SH、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、 -N3、-CN、-F、-Cl、-Br、-I之修飾。在此，R係表示烷基或芳基。R’係表示伸烷基。
就糖之其他部分之修飾而言，可舉例如核糖或去氧核糖之4’位的O經置換為S者，將糖之2’位和4’位經橋聯者，例如LNA(Locked Nucleic Acid)或ENA(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids)等，惟不限定於此等。
就磷酸鍵部分之修飾而言，可舉例如亦可將磷酸二酯鍵置換為硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基磷酸酯鍵、胺基磷酸酯鍵、硼酸磷酸酯鍵(例如參照Enya et al：Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008,18,9154-9160)之修飾(例如參照再公表專利公開案第2006/129594號以及再公表專利公開案第2006/038608號)。
本說明書中，就烷基而言，較佳為直鏈狀或分支鏈狀之碳數1至6之烷基。具體而言，可舉例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基、三級丁基、正戊基、異戊基、新戊基、三級戊基、正己基、異己基。該烷基亦可被取代，就如此的取代基而言，可舉例如鹵素、烷氧基、氰基、硝基，亦可以此等1至3個取代。
本說明書中，就環烷基而言，較佳為碳數3至12之環烷基。具體而言，可舉例如環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基、環癸基、環十二烷基。
本說明書中，就鹵素而言，可舉例如氟、氯、溴、碘。
本說明書中，就烷氧基而言，可舉直鏈狀或分支鏈狀之碳數1至6之烷氧基，例如甲氧基、乙氧基，正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、 異丁氧基、二級丁氧基、三級丁氧基、正戊基氧基、異戊基氧基、正己基氧基、異己基氧基等。尤其，較佳為碳數1至3之烷氧基。
本說明書中，就芳基而言，較佳為碳數6至10之芳基。具體而言，可舉例如苯基、α-萘基、β-萘基。尤其較佳為苯基。該芳基亦可被取代，就如此之取代基而言，可舉例如烷基、鹵素、烷氧基、氰基、硝基，此等亦可取代1至3個。
本說明書中，就伸烷基而言，較佳為直鏈狀或分支鏈狀之碳數1至6之伸烷基。具體而言，可舉例如亞甲基、伸乙基、三亞甲基、四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、2-(乙基)三亞甲基、1-(甲基)四亞甲基。
本說明書中，就醯基而言，可舉例如直鏈狀或分支鏈狀之烷醯基或芳醯基。就烷醯基而言，可舉例如甲醯基、乙醯基、2-甲基乙醯基、2,2-二甲基乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、2,2-二甲基丙醯基、己醯基等。就芳醯基而言，可舉例如苯甲醯基、甲苯甲醯基、萘甲醯基。如此之芳醯基亦可在能取代的位置中取代，亦可以烷基取代。
本發明之反義寡核苷酸較佳係核糖之2’位之-OH基以甲氧基置換，磷酸鍵部分係硫代磷酸酯鍵，且以下述一般式所表示之基作為構成單元之本發明之反義寡聚物。
Figure 109145043-A0202-12-0115-517
(式中，鹼基係表示核酸鹼基。)
本發明之反義寡核苷酸係使用各種自動合成裝置(例如，AKTA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare))可容易地進行合成，或者，亦可委託第三者機關(例如Promega公司或Takara公司)等進行製作。
本發明之反義N-嗎啉寡聚物係將以下述一般式所表示之基作為構成單元之反義寡聚物。
Figure 109145043-A0202-12-0115-518
(式中，鹼基係與前述為相同意義；
W係表示以下中任一式所表示之基。
Figure 109145043-A0202-12-0116-519
(式中，X係表示-CH2R1、-O-CH2R1、-S-CH2R1、-NR2R3，或F；
R1係表示H、烷基；
R2以及R3係相同或相異地表示H、烷基、環烷基，或芳基；
Y1係表示O、S、CH2，或NR1；
Y2係表示O、S，或NR1；
Z係表示O或S。))
就合成本發明之反義N-嗎啉寡聚物中所使用之N-嗎啉單體化合物之例而言，可舉例如表5中所表示之N-嗎啉單體化合物(A)、N-嗎啉單體化合物(C)、N-嗎啉單體化合物(T)、以及N-嗎啉單體化合物(G)，惟不限定於此等者。
[表5]
Figure 109145043-A0202-12-0117-520
本發明中，N-嗎啉寡聚物較佳係將以下式所表示之基作為構成單元之寡聚物(二胺基磷酸酯N-嗎啉寡聚物(以下稱為「PMO」))。
Figure 109145043-A0202-12-0117-521
(式中，鹼基、R2、R3係與前述相同意義。)
N-嗎啉寡聚物係能依照例如國際公開公報第1991/009033號，或國際公開公報第2009/064471號所述之方法進行製造。尤其，PMO係能依照國際公開公報第2009/064471號，或國際公開公報第2013/100190號所述之方法進行製造。
本發明之反義肽核酸寡聚物係將以下述一般式所表示之基作為構成單元之反義寡聚物。
Figure 109145043-A0202-12-0118-522
(式中，鹼基係與前述相同意義。)
肽核酸寡聚物係能依照例如以下之文獻進行製造。
1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991) 2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, JACS, 114, 1895 (1992) 3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)
4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995) 5) T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)
本發明之反義寡聚物(包含本發明之連結型反義寡聚物)亦可為其醫藥上可容許的鹽之形態、水合物之形態，或醫藥上可許容的鹽之水合物之形態。
就本發明之反義寡聚物以醫藥上可許容的鹽之一例而言，可舉例如如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽之鹼金屬鹽；如鈣鹽、鎂鹽之鹼土金屬鹽；如 鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等金屬鹽；銨鹽；如三級辛基胺鹽、二苯甲基胺鹽、嗎啉鹽、葡萄糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基葡萄糖胺鹽、胍鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苯甲基乙二胺鹽、氯普魯卡因鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苯甲基-苯乙胺鹽、哌
Figure 109145043-A0202-12-0119-496
鹽、四甲基銨鹽、三(羥基甲基)胺基甲烷鹽之有機胺鹽；如氟化氫酸鹽、鹽酸鹽、溴化氫酸鹽、碘化氫酸鹽之鹵化氫酸鹽；如硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽之低級烷磺酸鹽；如苯磺酸鹽、p-甲苯磺酸鹽之芳基磺酸鹽；如乙酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、順丁烯二酸鹽等有機酸鹽；如甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天門冬酸鹽之胺基酸鹽等。此等的鹽能以周知之方法進行製造。或者，本發明之反義寡聚物亦可為其水合物之形態。
2．抑制因子反義寡聚物
本發明之其他態樣中，提供抑制外顯子單一地跳讀(以下稱為「單跳讀」)之抑制因子反義寡聚物。抑制因子反義寡聚物係藉由抑制單跳讀，能提高反義寡聚物所致之多外顯子跳讀之效果。單跳讀並非使複數個外顯子同時地跳讀，係關於僅只1個外顯子之跳讀。
具體而言，本發明係提供抑制由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任1個外顯子單一地跳讀之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。以下，將前述抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物總括稱為本發明之抑制因子反義寡聚物。本發明之抑制因子反義寡聚 物亦有各別指稱前述抑制因子反義寡聚物、其醫藥上可容許的鹽，或此等的水合物之情形。
本發明之抑制因子反義寡聚物係經由將人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA上之剪接緘默子序列、分支部位序列或剪接部位序列之部位作為標的而阻礙剪接，抑制單跳讀。藉由本發明之抑制因子反義寡聚物與對照組比較，成為對象之外顯子之單跳讀效率減低。
例如，抑制由第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任1個外顯子單一地跳讀之抑制因子反義寡聚物，係將第44號起至第56號之任一外顯子之剪接緘默子序列，或第44號起至第55號之任一內含子之剪接緘默子序列、分支部位序列，或剪接部位序列作為標的。
本說明書中，剪接緘默子序列，係具有發揮抑制外顯子之辨識之pre-mRNA上之鹼基序列要素。就剪接緘默子序列而言，可舉例如異質核核糖蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1(hnRNP A1))、hnRNP A2/B1、DAZAP1、hnRNP I、Fox-1、Fox-2、hnRNP H1、hnRNP H2、hnRNP H3、hnRNP L、Sam68、SRp40等蛋白質或蛋白質複合體之辨識序列等。
本說明書中，剪接部位係在外顯子和內含子之交界。剪接部位係在內含子之5’末端以GU、AU等開始，在內含子之3’末端以AG、AC等結束，能由此進行推定。
本說明書中，分支部位係在剪接反應中攻撃5’剪接部位，共價結合之內含子中的序列。分支部位序列係指含有分支部位之內含子中的鹼基序列。
就形成為本發明之抑制因子反義寡聚物之標的(以下稱為「抑制因子序列」)之剪接緘默子序列、分支部位序列，或剪接部位序列而言，可舉例如以下之鹼基序列(序列編號370至384以及390)。此外，抑制因子序列、分支部位序列、以及剪接部位序列之位置，能使用SpliceAid(Francesco Piva et al.,Bioinformatics,25(9),1211-1213,2009)、SpliceAid-2(Francesco Piva et al.,Human Mutation,33(1),81-85,2012)、SpliceAid-F(Matteo Giulietti et al.,Nucleic Acids Res.,41,D125-D131,2012)、ATtRACT-a(Girolamo Giudice et al.,Data鹼基(Oxford),baw035,2016)、SROOGLE(Schraga Schwartz et al.,Nucleic Acids Res.,37,W189-W192,2009)、Reg RNA(Hsi-Yuan Huang et al.,Nucleic Acids Res.,34,W429-W434,2006)、Reg RNA 2.0(Tzu-Hao Chang et al.,BMC bioinformatics,14(Suppl 2),S4,2013)、Human Splicing Finder(Francois-Olivier Desmet et al.,Nucleic Acids Res.,37,9,e67,2009)、SVM-BPfinder(Andre Corvelo et al.,PLoS Comput Biol.,6,11,e1001016,2010)等軟體檢測出。
[表6]
Figure 109145043-A0202-12-0122-523
y表示A或U、n表示A、G、C、U或T。
在此，就剪接緘默子序列之具體例而言，可舉例如序列編號370至382。此外，就序列編號370至382之變異體而言，亦可舉例如：
(F1)與由序列編號370至382所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
(F2)與由序列編號370至382所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有86%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±14%以內之長度之鹼基序列；
(F3)與由序列編號370至382所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有87%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±13%以內之長度之鹼基序列；
(F4)與由序列編號370至382所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有88%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±12%以內之長度之鹼基序列；
(F5)與由序列編號370至382所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有89%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±11%以內之長度之鹼基序列；
(F6)與由序列編號370至382所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有90%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±10%以內之長度之鹼基序列；
(F7)與由序列編號370至382所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有91%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±9%以內之長度之鹼基序列；
(F8)與由序列編號370至382所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有92%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±8%以內之長度之鹼基序列；
(F9)與由序列編號370至382所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有93%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±7%以內之長度之鹼基序列；
(F10)與由序列編號370至382所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有94%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±6%以內之長度之鹼基序列；
(F11)與由序列編號370至382所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有95%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±5%以內之長度之鹼基序列；
(F12)與由序列編號370至382所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有96%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±4%以內之長度之鹼基序列；
(F13)與由序列編號370至382所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有97%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±3%以內之長度之鹼基序列；
(F14)與由序列編號370至382所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有98%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±2%以內之長度之鹼基序列；
(F15)與由序列編號370至382所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±1%以內之長度之鹼基序列；以及
(F16)與由序列編號370至382所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99.5%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±0.5%以內之長度之鹼基序列。
本發明之某態樣中，前述剪接緘默子序列亦可為異質核核糖核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1(hnRNP A1)之辨識序列。將人hnRNP A1之辨識序列之一例表示於序列編號370至379。
此外在此，就剪接部位序列之具體例而言，可舉例如序列編號384或390。此外，就序列編號384或390之變異體而言，亦可舉例如
(G1)與序列編號384或390之鹼基序列具有80%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±20%以內之長度之鹼基序列。
此外在此，就分支部位序列之具體例而言，可舉例如序列編號383。另外，就序列編號383之變異體而言，可舉例如
(H1)與序列編號383之鹼基序列具有80%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±20%以內之長度之鹼基序列。
此外，就上述抑制因子序列之變異型而言，以下之標的領域亦包含於本發明之抑制因子反義寡聚物之標的鹼基序列。
(I1)與由序列編號370至384以及390所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
(I2)與由序列編號370至384以及390所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有86%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±14%以內之長度之鹼基序列；
(I3)與由序列編號370至384以及390所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有87%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±13%以內之長度之鹼基序列；
(I4)與由序列編號370至384以及390所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有88%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±12%以內之長度之鹼基序列；
(I5)與由序列編號370至384以及390所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有89%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±11%以內之長度之鹼基序列；
(I6)與由序列編號370至384以及390所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有90%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±10%以內之長度之鹼基序列；
(I7)與由序列編號370至384以及390所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有91%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±9%以內之長度之鹼基序列；
(I8)與由序列編號370至384以及390所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有92%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±8%以內之長度之鹼基序列；
(I9)與由序列編號370至384以及390所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有93%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±7%以內之長度之鹼基序列；
(I10)與由序列編號370至384以及390所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有94%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±6%以內之長度之鹼基序列；
(I11)與由序列編號370至384以及390所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有95%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±5%以內之長度之鹼基序列；
(I12)與由序列編號370至384以及390所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有96%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±4%以內之長度之鹼基序列；
(I13)與由序列編號370至384以及390所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有97%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±3%以內之長度之鹼基序列；
(I14)與由序列編號370至384以及390所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有98%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±2%以內之長度之鹼基序列；
(I15)與由序列編號370至384以及390所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±1%以內之長度之鹼基序列；以及
(I16)與由序列編號370至384以及390所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99.5%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±0.5%以內之長度之鹼基序列。
就本發明之抑制因子反義寡聚物之一態樣而言，係可舉例如包含與由序列編號370至384以及390中所示之鹼基序列以及上述(I1)至(I16)中所示之變異型鹼基序列所構成之群組選擇之鹼基序列之任1個鹼基序列或其部分鹼基序列互補的鹼基序列者。此外，在其他態樣中，可舉例如本發明之抑制因子反義寡聚物係包含由序列編號370至384以及390中所示鹼基序列所構成之群組選擇之鹼基序列之任1個鹼基序列或其部分鹼基序列互補的鹼基序列者。
在此所謂「其部分」係與在本發明之反義寡聚物之項目中所述之定義相同。
就本發明之抑制因子反義寡聚物之進一步的態樣而言，可舉例如：
(J1)由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列，或
(J2)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述進行選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列，
所成之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
在此，(J2)之鹼基序列係(J1)之鹼基序列之變異型，就變異型而言可舉例如：
(J2-1)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
(J2-2)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有86%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±14%以內之長度之鹼基序列；
(J2-3)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有87%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±13%以內之長度之鹼基序列；
(J2-4)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有88%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±12%以內之長度之鹼基序列；
(J2-5)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有89%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±11%以內之長度之鹼基序列；
(J2-6)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有90%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±10%以內之長度之鹼基序列；
(J2-7)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有91%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±9%以內之長度之鹼基序列；
(J2-8)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有92%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±8%以內之長度之鹼基序列；
(J2-9)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有93%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±7%以內之長度之鹼基序列；
(J2-10)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有94%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±6%以內之長度之鹼基序列；
(J2-11)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有95%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±5%以內之長度之鹼基序列；
(J2-12)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有96%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±4%以內之長度之鹼基序列；
(J2-13)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有97%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±3%以內之長度之鹼基序列；
(J2-14)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有98%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±2%以內之長度之鹼基序列；
(J2-15)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±1%以內之長度之鹼基序列；以及
(J2-16)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99.5%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±0.5%以內之長度之鹼基序列。
因此，就本發明之抑制因子反義寡聚物之進一步之態樣而言，可舉例如(J1)以及(J2-1)至(J2-16)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列所構成之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
就本發明之抑制因子反義寡聚物之進一步之態樣而言，可舉例如：
(J’1)由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列；或
(J’2)與由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
所成之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
在此，(J’2)之鹼基序列係(J’1)之鹼基序列之變異型，就變異型而言可舉例如：
(J’2-1)與由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
(J’2-2)與由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有86%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±14%以內之長度之鹼基序列；
(J’2-3)與由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有87%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±13%以內之長度之鹼基序列；
(J’2-4)與由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有88%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±12%以內之長度之鹼基序列；
(J’2-5)與由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有89%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±11%以內之長度之鹼基序列；
(J’2-6)與由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有90%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±10%以內之長度之鹼基序列；
(J’2-7)與由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有91%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±9%以內之長度之鹼基序列；
(J’2-8)與由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有92%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±8%以內之長度之鹼基序列；
(J’2-9)與由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有93%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±7%以內之長度之鹼基序列；
(J’2-10)與由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有94%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±6%以內之長度之鹼基序列；
(J’2-11)與由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有95%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±5%以內之長度之鹼基序列；
(J’2-12)與由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有96%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±4%以內之長度之鹼基序列；
(J’2-13)與由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有97%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±3%以內之長度之鹼基序列；
(J’2-14)與由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有98%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±2%以內之長度之鹼基序列；
(J’2-15)與由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±1%以內之長度之鹼基序列；以及
(J’2-16)與由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99.5%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±0.5%以內之長度之鹼基序列。
因此，本發明之抑制因子反義寡聚物之進一步之態樣而言，可舉例如由(J’1)以及(J’2-1)至(J’2-16)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列所構成之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
本發明之抑制因子反義寡聚物在生理的條件下提高多跳讀效果。所謂上述「生理的條件下」係意指調節成與生物體內類似之pH、鹽組成、溫度之條件。可舉例如25至40℃，較佳為37℃、pH 5至8，較佳為pH 7.4，氯化鈉濃度為150mM之條件。
本發明之抑制因子反義寡聚物是否提高多外顯子跳讀之效果，係可藉由以下之方式進行確認：準備(i)僅使用本發明之反義寡聚物之多外顯子跳讀之實驗系統、(ii)使用本發明之反義寡聚物和本發明之抑制因子反義寡聚物之多外顯子跳讀之實驗系統，在具備其他之條件下，進行觀察在實驗系統(ii)中所得之多外顯子跳讀效果和在實驗系統(i)中所得之多外顯子跳讀效果之差異。
多跳讀之效果之測定，係如在本發明之反義寡聚物之項目「1．反義寡聚物」中所述之內容。
本發明之抑制因子反義寡聚物係10至60鹼基長、10至55鹼基長、10至50鹼基長、10至45鹼基長、10至40鹼基長、10至35鹼基長、10至30鹼基長、10至25鹼基長、15至60鹼基長、15至55鹼基長、15至50鹼基長、15至45鹼基長、15至40鹼基長、15至35鹼基長、15至30鹼基長、15至25鹼基長、16至60鹼基長、16至55鹼基長、16至50鹼基長、16至45鹼基長、16至40鹼基長、16至35鹼基長、16至30鹼基長、16至25鹼基長、17至60鹼基長、17至55鹼基長、17至50 鹼基長、17至45鹼基長、17至40鹼基長、17至35鹼基長、17至30鹼基長、17至25鹼基長、18至60鹼基長、18至55鹼基長、18至50鹼基長、18至45鹼基長、18至40鹼基長、18至35鹼基長、18至30鹼基長、18至25鹼基長、19至60鹼基長、19至55鹼基長、19至50鹼基長、19至45鹼基長、19至40鹼基長、19至35鹼基長、19至30鹼基長、19至25鹼基長、20至60鹼基長、20至55鹼基長、20至50鹼基長、20至45鹼基長、20至40鹼基長、20至35鹼基長、20至30鹼基長、20至25鹼基長、15至30鹼基長、15至29鹼基長、15至28鹼基長、15至27鹼基長、15至26鹼基長、15至25鹼基長、15至24鹼基長、15至23鹼基長、15至22鹼基長、15至21鹼基長、15至20鹼基長、15至19鹼基長、15至18鹼基長、16至30鹼基長、16至29鹼基長、16至28鹼基長、16至27鹼基長、16至26鹼基長、16至25鹼基長、16至24鹼基長、16至23鹼基長、16至22鹼基長、16至21鹼基長、16至20鹼基長、16至19鹼基長、16至18鹼基長、17至30鹼基長、17至29鹼基長、17至28鹼基長、17至27鹼基長、17至26鹼基長、17至25鹼基長、17至24鹼基長、17至23鹼基長、17至22鹼基長、17至21鹼基長、17至20鹼基長、17至19鹼基長、17至18鹼基長、18至30鹼基長、18至29鹼基長、18至28鹼基長、18至27鹼基長、18至26鹼基長、18至25鹼基長、18至24鹼基長、18至23鹼基長、18至22鹼基長、18至21鹼基長、18至20鹼基長、18至19鹼基長、19至30鹼基長、19至29鹼基長、19至28鹼基長、19至27鹼基長、19至26鹼基長、19至25鹼基長、19至24鹼基長、19至23鹼基長、19至22鹼基長、19至21鹼基長、19至20鹼基長、20 至30鹼基長，或亦可為20至29鹼基長、20至28鹼基長、20至27鹼基長、20至26鹼基長、20至25鹼基長、20至24鹼基長、20至23鹼基長、20至22鹼基長、20至21鹼基長、60鹼基長、59鹼基長、58鹼基長、57鹼基長、56鹼基長、55鹼基長、54鹼基長、53鹼基長、52鹼基長、51鹼基長、50鹼基長、49鹼基長、48鹼基長、47鹼基長、46鹼基長、45鹼基長、44鹼基長、43鹼基長、42鹼基長、41鹼基長、40鹼基長、39鹼基長、38鹼基長、37鹼基長、36鹼基長、35鹼基長、34鹼基長、33鹼基長、32鹼基長、31鹼基長、30鹼基長、29鹼基長、28鹼基長、27鹼基長、26鹼基長、25鹼基長、24鹼基長、23鹼基長、22鹼基長、21鹼基長、20鹼基長、19鹼基長、18鹼基長、17鹼基長、16鹼基長、15鹼基長、14鹼基長、13鹼基長、12鹼基長、11鹼基長，或10鹼基長，惟不限定於此等，上述之長度亦可增加或減少1、2，或3鹼基長。
本發明之抑制因子反義寡聚物亦可為具有複數個單元寡聚物經相互連結之構成之連結型反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。單元寡聚物係如前述之內容，亦可經由並無助於雜交之連接子連結，或者亦可不經由連接子而直接連結。本發明之抑制因子反義寡聚物為連結型之情形，各個單元寡聚物之鹼基序列並非為連續或相互重複者。
本發明之抑制因子反義寡聚物亦可為寡核苷酸、N-嗎啉寡聚物，或肽核酸(Peptide Nucleic Acid：PNA)寡聚物。
本發明之抑制因子反義寡聚物為寡核苷酸之情形(以下稱為「本發明之抑制因子反義寡核苷酸」)，本發明之抑制因子反義寡核苷酸係 將核苷酸作為構成單元之抑制因子反義寡聚物，如此之核苷酸亦可為核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸，或修飾核苷酸之任一者。
修飾核苷酸係如前述之內容。
本發明之抑制因子反義寡核苷酸較佳係核糖之2’位之-OH基以甲氧基置換，磷酸鍵部分為硫代磷酸酯鍵，將下述一般式中所表示之基作為構成單元之本發明之抑制因子反義寡聚物。
Figure 109145043-A0202-12-0136-524
(式中，鹼基係與前述相同意義。)
本發明之抑制因子反義寡核苷酸係能使用各種自動合成裝置(例如，AKTA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare))容易地進行合成，或者能委託第三者機關(例如Promega公司或Takara公司)等進行製作。
本發明之抑制因子反義寡聚物係N-嗎啉寡聚物之情形(以下稱為「本發明之抑制因子反義N-嗎啉寡聚物」)，本發明之抑制因子反義N-嗎啉寡聚物係將以下述一般式所表示之基作為構成單元之抑制因子反義寡聚物。
Figure 109145043-A0202-12-0137-525
(式中，鹼基、W係與前述相同意義。)
就合成本發明之抑制因子反義N-嗎啉寡聚物中所使用之N-嗎啉單體化合物之一例而言，可舉例如表7中所示之N-嗎啉單體化合物(A)、N-嗎啉單體化合物(C)、N-嗎啉單體化合物(T)以及N-嗎啉單體化合物(G)，惟不限定於此等。
[表7]
Figure 109145043-A0202-12-0137-526
本發明之抑制因子反義N-嗎啉寡聚物中，N-嗎啉寡聚物較佳係PMO。
Figure 109145043-A0202-12-0138-497
啉寡聚物係能依照例如國際公開公報第1991/009033號，或國際公開公報第2009/064471號所述之方法進行製造。尤其，PMO係能依照國際公開公報第2009/064471號，或國際公開公報第2013/100190號所述之方法進行製造。
本發明之抑制因子反義寡聚物為肽核酸寡聚物之情形(以下稱為「本發明之抑制因子反義肽核酸寡聚物」)，本發明之抑制因子反義肽核酸寡聚物係將以下述一般式所表示之基作為構成單元之抑制因子反義寡聚物。
Figure 109145043-A0202-12-0138-527
(式中，鹼基係與前述相同意義。)
肽核酸能如前述之內容進行製造。
本發明之抑制因子反義寡聚物亦可為其醫藥上可容許的鹽之形態、水合物之形態，或醫藥上可許容的鹽之水合物之形態。
就本發明之抑制因子反義寡聚物之醫藥上可許容的鹽之一例而言，可舉例如如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽之鹼金屬鹽；如鈣鹽、鎂鹽之鹼土金屬鹽；如鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等金屬鹽；銨鹽；如三級 辛基胺鹽、二苯胺鹽、嗎啉鹽、葡萄糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基葡萄糖胺鹽、肌鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苯甲基乙二胺鹽、氯普魯卡因鹽、普魯卡因鹽，二乙醇胺鹽、N-苯甲基-苯乙胺鹽、哌
Figure 109145043-A0202-12-0139-498
鹽、四甲基銨鹽、三(羥基甲基)胺基甲烷鹽之有機胺鹽；如氟化氫酸鹽、鹽酸鹽、溴化氫酸鹽、碘化氫酸鹽之鹵化氫酸鹽；如硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽之低級烷磺酸鹽；如苯磺酸鹽、p-甲苯磺酸鹽之芳基磺酸鹽；如乙酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、順丁烯二酸鹽等有機酸鹽；如甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天門冬酸鹽之胺基酸鹽等。此等的鹽能以周知之方法進行製造。或者，本發明之抑制因子反義寡聚物亦可為其水合物之形態。
[PMO之製法]
本發明之反義寡聚物以及本發明之抑制因子反義寡聚物亦可為PMO。就PMO之1個態樣而言，可舉例如以下以一般式(I)所表示之化合物(以下稱為「PMO(I)」。)。
Figure 109145043-A0202-12-0140-528
(式中，各鹼基、R2、R3係與前述相同意義；
n為1至99之範圍內某任意之整數，較佳係18至28之範圍內某任意之整數。)
PMO(I)能依照周知之方法(例如參照國際公開公報第2009/064471號，或國際公開公報第2013/100190號)進行製造。
此外，本發明之反義寡聚物或本發明之抑制因子反義寡聚物，5’末端亦可為下述化學式(1)至(3)中任一基。較佳係(3)-OH。
Figure 109145043-A0202-12-0140-529
以下將以上述(1)、(2)及(3)所表示之基各別稱為「基(1)」、「基(2)」以及「基(3)」。
3．醫藥用途
本發明係提供包含本發明之反義寡聚物(亦包含其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物)之醫藥組成物(以下亦稱為「本發明之醫藥組成物」)。本發明之醫藥組成物亦可進一步包含本發明之抑制因子反義寡聚物(亦包含其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物)，以及/或醫藥上可許容之擔體。
此外，本發明係提供包含本發明之反義寡聚物(亦包含其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物)，和本發明之抑制因子反義寡聚物(亦包含其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物)之醫藥組成物(以下亦稱為「本發明之組合醫藥」)。
本發明之醫藥組成物在包含本發明之反義寡聚物和本發明之抑制因子反義寡聚物之情形，亦包含此等的寡聚物之任一組合。此外，本發明之組合醫藥中，亦包含本發明之反義寡聚物和本發明之抑制因子反義寡聚物之任一組合。本發明之醫藥組成物或本發明之組合醫藥中所含有之反義寡聚物只要為本發明之反義寡聚物之任一者即可，並沒有特別限定，惟較佳為由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列所構成之反義寡聚物，更佳為由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、 125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列所構成之反義寡聚物，再佳為由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43,45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列所構成之反義寡聚物。
此外，本發明之醫藥組成物或本發明之組合醫藥中所含有之抑制因子反義寡聚物只要為本發明之抑制因子反義寡聚物之任一者即可，並沒有特別限定，惟較佳為由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列所構成之抑制因子反義寡聚物，更佳為序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27，再佳為由序列編號260、261及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列所構成之抑制因子反義寡聚物。
本發明之醫藥組成物包含本發明之反義寡聚物和本發明之抑制因子反義寡聚物之情形，較佳係包含上述本發明之反義寡聚物和本發明之抑制因子反義寡聚物之組合。此外，本發明之組合醫藥較佳係含有上述本發明之反義寡聚物和本發明之抑制因子反義寡聚物之組合者。
本發明之組合醫藥中，就本發明之反義寡聚物和本發明之抑制因子反義寡聚物之組合之一例而言可舉例如下。
(K1)反義寡聚物係由序列編號75所構成之寡聚物，抑制因子反義寡聚物係由序列編號260所構成之寡聚物之組合；
(K2)反義寡聚物係由序列編號75所構成之寡聚物，抑制因子反義寡聚物係由序列編號261所構成之寡聚物之組合；
(K3)反義寡聚物係由序列編號75所構成之寡聚物，抑制因子反義寡聚物係由序列編號263所構成之寡聚物之組合；
(K4)反義寡聚物係由序列編號65所構成之寡聚物，抑制因子反義寡聚物係由序列編號260所構成之寡聚物之組合；
(K5)反義寡聚物係由序列編號65所構成之寡聚物，抑制因子反義寡聚物係由序列編號261所構成之寡聚物之組合；
(K6)反義寡聚物係由序列編號65所構成之寡聚物，抑制因子反義寡聚物係由序列編號263所構成之寡聚物之組合；
(K7)反義寡聚物係由序列編號55和59所構成之寡聚物之組合，抑制因子反義寡聚物係由序列編號260所構成之寡聚物之組合；
(K8)反義寡聚物係由序列編號55和59所構成之寡聚物之組合，抑制因子反義寡聚物係由序列編號261所構成之寡聚物之組合；
(K9)反義寡聚物係由序列編號55和59所構成之寡聚物之組合，抑制因子反義寡聚物係由序列編號263所構成之寡聚物之組合。
本發明之醫藥組成物能包含上述組合之本發明之反義寡聚物以及本發明之抑制因子反義寡聚物。
本發明之醫藥組成物以及本發明之組合醫藥，分別能使用於用以治療例如杜興氏肌肉萎縮症、貝克氏肌肉萎縮症、肢帶肌肉失養症(LGMD)、先天性肌肉萎縮症、Emery-Dreifuss二氏肌肉失養症、臉肩胛肱骨失養症、眼咽型肌肉失養症、體顯性腦動脈血管病變合併皮質下腦梗塞及腦白質病變(CADASIL)、Alport症候群等。此外，本發明之組合醫藥以及本發明之醫藥組成物能分別投予於人類患者，尤其肌肉萎縮症之人類患者。成為本發明之組合醫藥或本發明之醫藥組成物之投與對象之患者，亦 可為肌肉萎縮蛋白基因具有由外顯子45至55所構成之群組選擇之2個以上成為外顯子之跳讀對象之變異之患者。
本發明之一態樣中，係提供包含將本發明之反義寡聚物，或本發明之反義寡聚物和本發明之抑制因子反義寡聚物之組合投與於肌肉萎縮症患者之步驟，而治療肌肉萎縮症之方法。
本發明之另一態樣中，係提供包含將本發明之醫藥組成物或本發明之組合醫藥投與於肌肉萎縮症患者之步驟，而治療肌肉萎縮症之方法。
前述治療方法，亦可伴隨進行由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任2個以上編號順序為連續之外顯子的跳讀。前述治療方法中，前述肌肉萎縮症患者亦可為肌肉萎縮蛋白基因具有成為外顯子45至55跳讀對象之變異之患者。前述患者亦可為人，亦可為肌肉萎縮蛋白基因具有成為外顯子45至55跳讀對象之變異之人類患者。
本發明係進一步提供肌肉萎縮症治療用醫藥之製造中的本發明之反義寡聚物，或本發明之反義寡聚物和本發明之抑制因子反義寡聚物之組合，或本發明之醫藥組成物，或本發明之組合醫藥之使用。
再者本發明係提供用以在肌肉萎縮症治療中使用之本發明之反義寡聚物，或本發明之反義寡聚物和本發明之抑制因子反義寡聚物之組合，或本發明之醫藥組成物，或本發明之組合醫藥。前述治療亦可伴隨進行由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任2個以上編號順序為連續之外顯子的跳讀。前述治療中，前述肌肉萎縮症患者亦可為在肌肉萎縮蛋白基因具有成為外顯子 45至55跳讀對象之變異之患者。前述患者亦可為人，亦可為肌肉萎縮蛋白基因具有成為外顯子45至55跳讀對象之變異之人類患者。
本發明之反義寡聚物或本發明之反義寡聚物和本發明之抑制因子反義寡聚物之組合，或者本發明之醫藥組成物或本發明之組合醫藥之投與形態，只要為醫藥上可許容之投與形態即沒有特別限制，能因應治療之方法進行選擇，惟由送達於肌肉組織之送達容易性之觀點而言，以靜脈內投與、動脈內投與、肌肉內投與、皮下投與、經口投與、組織內投與、經皮投與等較佳。此外，就本發明之組成物可採取之劑型而言，沒有特別限制，可舉例如各種注射劑、經口劑、點滴劑、吸入劑、軟膏劑、乳液劑等。
將本發明之反義寡聚物以及/或本發明之抑制因子反義寡聚物投與於肌肉萎縮症患者之情形，本發明之組成物係含有促進該寡聚物送達於肌肉組織之送達之擔體者較佳。如此之擔體只要為醫藥上可許容者即沒有特別限制，就其例而言，可舉例如陽離子性脂質體、陽離子性聚合物等陽離子性擔體，或利用病毒套膜之擔體。就陽離子性脂質體而言，可舉例如2-O-(2-二乙胺基乙基)胺甲醯基-1,3-O-二油醯基甘油和磷脂質作為必須構成成分所形成之脂質體(以下稱為「脂質體A」)、Oligofectamine(註冊商標)(Invitrogen公司製)、Lipofectin(註冊商標)(Invitrogen公司製)、Lipofectamine(註冊商標)(Invitrogen公司製)、Lipofectamine 2000(註冊商標)(Invitrogen公司製)、DMRIE-C(註冊商標)(Invitrogen公司製)、GeneSilencer(註冊商標)(Gene Therapy Systems公司製)、TransMessenger(註冊商標)(QIAGEN公司製)、TransIT TKO(註冊商標)(Mirus公司製)、 Nucleofector II(Lonza)。在該等之中，以脂質體A較佳。就陽離子性聚合物而言，可舉例如JetSI(註冊商標)(Qbiogene公司製)、Jet-PEI(註冊商標)(聚乙亞胺，Qbiogene公司製)。就利用病毒套膜之擔體可舉例如GenomeOne(註冊商標)(HVJ-E脂質體，石原產業公司製)。或者，亦能使用專利2924179號所述之醫藥裝置，再公表專利公報第2006/129594號以及再公表專利公報第2008/096690號所述之陽離子性擔體。
本發明之醫藥組成物以及/或本發明之組合醫藥中所含有之本發明之反義寡聚物的濃度，係根據擔體之種類等而不同，惟在0.1nM至100μM之範圍內為適當，1nM至10μM之範圍內較佳，10nM至1μM之範圍內更佳。此外，本發明之組成物中所含有之本發明之反義寡聚物和擔體之重量比(擔體/本發明之反義寡聚物)，係根據該寡聚物之性質以及該擔體之種類等而不同，惟在0.1至100之範圍內為適當，1至50之範圍內較佳，10至20之範圍內更佳。
本發明之醫藥組成物以及/或本發明之組合醫藥中所含有之本發明之抑制因子反義寡聚物的濃度，係根據擔體之種類等而不同，惟在0.1nM至100μM之範圍內為適當，1nM至10μM之範圍內較佳，10nM至1μM之範圍內更佳。此外，本發明之組成物中所含有之本發明之抑制因子反義寡聚物和擔體之重量比(擔體/本發明之抑制因子反義寡聚物)，係依據該寡聚物之性質以及該擔體之種類等而不同，惟在0.1至100之範圍內為適當，1至50之範圍內較佳，10至20之範圍內更佳。
本發明之醫藥組成物以及/或本發明之組合醫藥，亦可為水溶液之形態。此種情形，本發明之醫藥組成物以及/或本發明之組合醫藥亦 可以2.5至500mg/mL、5至450mg/mL、10至400mg/mL、15至350mg/mL、20至300mg/mL、20至250mg/mL、20至200mg/mL、20至150mg/mL、20至100mg/mL、20至50mg/mL、20至40mg/mL、20至30mg/mL、23至27mg/mL、24至26mg/mL或25mg/mL之濃度含有本發明之反義寡聚物。或，本發明之醫藥組成物以及/或本發明之組合醫藥，亦可以10至100mg/mL、15至95mg/mL、20至80mg/mL、25至75mg/mL、30至70mg/mL、35至65mg/mL、40至60mg/mL、45至55mg/mL、47至53mg/mL、48至52mg/mL、49至51mg/mL或50mg/mL之濃度含有本發明之反義寡聚物。
此外，本發明之醫藥組成物以及/或本發明之組合醫藥為水溶液之形態之情形，亦可以2.5至500mg/mL、5至450mg/mL、10至400mg/mL、15至350mg/mL、20至300mg/mL、20至250mg/mL、20至200mg/mL、20至150mg/mL、20至100mg/mL、20至50mg/mL、20至40mg/mL、20至30mg/mL、23至27mg/mL、24至26mg/mL，或25mg/Ml之濃度含有本發明之抑制因子寡聚物。或，本發明之醫藥組成物以及/或本發明之組合醫藥，亦可以10至100mg/mL、15至95mg/mL、20至80mg/mL、25至75mg/mL、30至70mg/mL、35至65mg/mL、40至60mg/mL、45至55mg/mL、47至53mg/mL、48至52mg/mL、49至51mg/mL或50mg/mL之濃度含有本發明之抑制因子寡聚物。
本發明之醫藥組成物以及/或本發明之組合醫藥亦可為乾燥之形態。此種情形，為了調製水溶液形態之本發明之醫藥組成物以及/或本發明之組合醫藥，亦可使用例如將125mg或250mg之乾燥形態的本發明 之反義寡聚物和0.5mL至100Ml的水混合(相當於1.25mg/mL至250mg/mL或2.5mg/mL至500mg/mL的本發明之反義寡聚物的濃度)，較佳係和1mL至50mL的水混合(相當於2.5mg/mL至125mg/mL或5mg/mL至250mg/mL的本發明之反義寡聚物的濃度)，更佳係和5mL至10mL的水混合(相當於12.5mg/mL至25mg/mL或25mg/mL至50mg/mL的本發明之反義寡聚物的濃度)。
此外，本發明之醫藥組成物以及/或本發明之組合醫藥為乾燥形態之情形，為了調製水溶液形態之本發明之醫藥組成物以及/或本發明之組合醫藥，亦可使用例如將125mg或250mg之乾燥形態的本發明之抑制因子寡聚物和0.5mL至100mL的水混合(相當於1.25mg/mL至250mg/mL或2.5mg/mL至500mg/mL的本發明之抑制因子寡聚物的濃度)，較佳係和1mL至50mL的水混合(相當於2.5mg/mL至125mg/mL或5mg/mL至250mg/mL的本發明之抑制因子寡聚物的濃度)，更佳係和5mL至10mL的水混合(相當於12.5mg/mL至25mg/mL或25mg/mL至50mg/mL的本發明之抑制因子寡聚物的濃度)。
本發明之醫藥組成物以及/或本發明之組合醫藥中所含有之本發明之反義寡聚物以及本發明之抑制因子寡聚物之前述濃度，可為本發明之反義寡聚物以及本發明之抑制因子寡聚物的各別濃度，亦可為本發明之反義寡聚物以及本發明之抑制因子寡聚物的合計濃度。
本發明之醫藥組成物以及/或本發明之組合醫藥中，除了本發明之反義寡聚物以及/或本發明之抑制因子反義寡聚物合上述擔體以外，能任意地與醫藥上可許容之添加劑進行調配。就如此的添加劑而言，可舉 例如乳化輔助劑(例如碳數6至22之脂肪酸或其醫藥上可容許的鹽、白蛋白、類糊精)、安定化劑(例如膽固醇、磷脂酸、甘露醇、山梨醇)、等張化劑(例如氯化鈉、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖)、pH調整劑(例如鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、三乙醇胺)。能使用此等之一種或二種以上。本發明之組成物中該添加劑之含有量係90重量%以下為適當，較佳為70重量%以下，更佳為50重量%以下。
本發明之醫藥組成物以及/或本發明之組合醫藥，係能在擔體之分散液中添加本發明之反義寡聚物以及/或本發明之抑制因子反義寡聚物，藉由適當地攪拌進行調製。此外，添加劑能在本發明之反義寡聚物以及/或本發明之抑制因子反義寡聚物添加前或添加後在適當的步驟中添加。就添加本發明之反義寡聚物以及/或本發明之抑制因子反義寡聚物時得使用之水性溶劑而言，只要為醫藥上可許容者即沒有特別限制，可舉例如注射用水、注射用蒸餾水、生理食鹽水等電解質液，葡萄糖液、麥芽糖液等糖液。此外，此種情形之pH以及溫度等條件，本發明所屬領域之通常知識者能適當地進行選擇。
本發明之醫藥組成物以及/或本發明之組合醫藥係能作為例如液劑或其凍結乾燥製劑。該凍結乾燥製劑係能藉由常法，將具有液劑形態之本發明之組成物藉由凍結乾燥處理進行調製。可舉例如，將具有液劑形態之本發明之組成物進行適當的滅菌後，將指定量分注於小瓶中，在約-40℃至-20℃之範圍內的條件進行預備凍結2小時左右，在約0℃至10℃之範圍內在減壓下進行一次乾燥，然後，在約15℃至25℃之範圍內在減壓 下進行二次乾燥而凍結乾燥。接著，將一般的小瓶內部之氣體以氮氣進行置換，進行打栓而能得到本發明之組成物之凍結乾燥製劑。
本發明之醫藥組成物以及/或本發明之組合醫藥之凍結乾燥製劑，係能藉由添加一般任意之適當的溶液(再溶解液)進行再溶解而使用。就如此之再溶解液而言，可舉例如注射用水、生理食鹽水、其他一般輸液。此再溶解液之液量係因用途等而不同並沒有特別限制，惟以凍結乾燥前之液量之0.5倍量至2倍量或500mL以下為適當。
就投與本發明之醫藥組成物以及/或本發明之組合醫藥時之用量而言，期望為考量所含有之本發明之反義寡聚物以及/或本發明之抑制因子反義寡聚物之種類、劑形、年齡或體重等患者之狀態、投與路徑、疾病之性質和程度之後進行調節，就針對成人之本發明之反義寡聚物以及/或本發明之抑制因子反義寡聚物的量而言，在1次投與中能以每1kg體重為0.1mg至1g，較佳係每1kg體重為1mg至100mg，再佳係每1kg體重為1mg至90mg，更佳係每1kg體重為1mg至80mg之方式進行投與。投與頻率亦可為1至3日一次、1週1次、或2至3週1次。此數值有因作為標的之疾病種類、投與形態、標的分子而不同之情形。因此，根據情況，在此等以下的用量或投與頻率亦足夠充分，此外相反地亦有必須在此等以上的用量或投與頻率之情形。
就本發明之醫藥組成物以及/或本發明之組合醫藥之其他的態樣而言，可舉例如含有載體(vector)和上述擔體之醫藥組成物，該載體係能表現本發明之反義寡聚物以及/或本發明之抑制因子反義寡聚物。此種之表現載體，亦可為能表現複數之本發明之反義寡聚物以及/或本發明之抑制 因子反義寡聚物者。該組成物中，與含有本發明之反義寡聚物以及/或本發明之抑制因子反義寡聚物之本發明之組成物相同，能添加醫藥上可許容之添加劑。該組成物中所含有之表現載體的濃度係因擔體之種類而不同，惟在0.1nM至100μM之範圍內為適當，在1nM至10μM之範圍內較佳，在10nM至1μM之範圍內更佳。該組成物中所含有之表現載體和擔體之重量比(擔體/表現載體)係因表現載體之性質、擔體之種類等而不同，惟在0.1至100之範圍內為適當，在1至50之範圍內較佳，在10至20之範圍內更佳。此外，該組成物中所含有之擔體之含有量，與含有本發明之反義寡聚物以及/或本發明之抑制因子反義寡聚物之本發明之組成物之情形相同，關於其調製方法等亦與本發明之組成物之情形相同。
4．人肌肉萎縮蛋白以外之目的pre-mRNA
本說明書係針對目的pre-mRNA為人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之情形具體地說明，惟不限定於此，人肌肉萎縮蛋白以外之目的pre-mRNA之情形，關於反義寡聚物以及抑制因子反義寡聚物之設計、製造、使用方法，亦能依照本說明書之開示或該領域所周知之技術以及方法進行實施。只要為本發明所屬領域之通常知識者基於本說明書之開示或該領域所周知之技術以及方法，針對人肌肉萎縮蛋白以外之目的pre-mRNA亦能設計、製造以及使用其反義寡聚物或抑制因子反義寡聚物。同樣地，本發明所屬領域之通常知識者基於本說明書之開示以及該領域所周知之技術以及方法，能使用反義寡聚物而進行目的pre-mRNA之多外顯子跳讀，以及能使用抑制因子反義寡聚物而提高多外顯子跳讀之效率。
本說明書中，就目的pre-mRNA而言，可舉例如人γ-肌聚糖(SGCG)、人Notch3以及人肌肉萎縮蛋白之pre-mRNA。本發明之某態樣中目的pre-mRNA亦可為人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA。此外，本發明之其他態樣中，目的pre-mRNA亦可為SGCG或人Notch3。
人SGCG以及人Notch3之目的pre-mRNA中的多外顯子跳讀中所使用之反義寡聚物之標的領域的鹼基序列係如以下之內容。
本發明中的人SGCG之pre-mRNA之標的領域，係在以下以序列編號283以及284表示。
[表8]
Figure 109145043-A0202-12-0152-530
本發明中的人Notch3之pre-mRNA標的領域係在以下表示。
[表9]
Figure 109145043-A0202-12-0153-531
就針對人SGCG之pre-mRNA而誘導多外顯子跳讀之人SGCG用反義寡聚物而言，可舉例如將內含子3之3’末端作為基點而-400至+50鹼基之範圍作為標的者，具體例而言，可舉例如
(L1)由序列編號287至308所構成之群組選擇之任1個鹼基序列，或
(L2)與由序列編號287至308所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列，
所成之人SGCG用反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
在此，(L2)之鹼基序列係(L1)之鹼基序列之變異型，就變異型而言可舉例如：
(L2-1)與由序列編號287至308所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
(L2-2)與由序列編號287至308所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有86%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±14%以內之長度之鹼基序列；
(L2-3)與由序列編號287至308所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有87%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±13%以內之長度之鹼基序列；
(L2-4)與由序列編號287至308所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有88%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±12%以內之長度之鹼基序列；
(L2-5)與由序列編號287至308所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有89%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±11%以內之長度之鹼基序列；
(L2-6)與由序列編號287至308所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有90%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±10%以內之長度之鹼基序列；
(L2-7)與由序列編號287至308所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有91%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±9%以內之長度之鹼基序列；
(L2-8)與由序列編號287至308所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有92%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±8%以內之長度之鹼基序列；
(L2-9)與由序列編號287至308所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有93%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±7%以內之長度之鹼基序列；
(L2-10)與由序列編號287至308所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有94%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±6%以內之長度之鹼基序列；
(L2-11)與由序列編號287至308所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有95%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±5%以內之長度之鹼基序列；
(L2-12)與由序列編號287至308所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有96%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±4%以內之長度之鹼基序列；
(L2-13)與由序列編號287至308所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有97%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±3%以內之長度之鹼基序列；
(L2-14)與由序列編號287至308所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有98%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±2%以內之長度之鹼基序列；
(L2-15)與由序列編號287至308所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±1%以內之長度之鹼基序列；以及
(L2-16)與由序列編號287至308所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99.5%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±0.5%以內之長度之鹼基序列。
因此，就人SGCG用反義寡聚物之進一步之態樣而言，可舉例如
由(L1)以及(L2-1)至(L2-16)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列所構成之人SGCG用反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。本發明中係包含人SGCG用反義寡聚物。
就人SGCG之pre-mRNA之單跳讀抑制因子反義寡聚物(人SGCG用抑制因子反義寡聚物)而言，可舉例如，將內含子4之剪接緘默子序列或單跳讀之剪接部位作為標的者，就具體例而言，可舉例如
(M1)由序列編號331至335所構成之群組選擇之任1個鹼基序列，或
(M2)與由序列編號331至335所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
所成之人SGCG用抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
在此，(M2)之鹼基序列係(M1)之鹼基序列之變異型，就變異型而言可舉例如：
(M2-1)與由序列編號331至335所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
(M2-2)與由序列編號331至335所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有86%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±14%以內之長度之鹼基序列；
(M2-3)與由序列編號331至335所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有87%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±13%以內之長度之鹼基序列；
(M2-4)與由序列編號331至335所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有88%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±12%以內之長度之鹼基序列；
(M2-5)與由序列編號331至335所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有89%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±11%以內之長度之鹼基序列；
(M2-6)與由序列編號331至335所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有90%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±10%以內之長度之鹼基序列；
(M2-7)與由序列編號331至335所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有91%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±9%以內之長度之鹼基序列；
(M2-8)與由序列編號331至335所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有92%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±8%以內之長度之鹼基序列；
(M2-9)與由序列編號331至335所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有93%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±7%以內之長度之鹼基序列；
(M2-10)與由序列編號331至335所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有94%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±6%以內之長度之鹼基序列；
(M2-11)與由序列編號331至335所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有95%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±5%以內之長度之鹼基序列；
(M2-15)與由序列編號331至335所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有96%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±4%以內之長度之鹼基序列；
(M2-13)與由序列編號331至335所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有97%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±3%以內之長度之鹼基序列；
(M2-14)與由序列編號331至335所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有98%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±2%以內之長度之鹼基序列；
(M2-15)與由序列編號331至335所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±1%以內之長度之鹼基序列；以及
(M2-16)與由序列編號331至335所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99.5%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±0.5%以內之長度之鹼基序列。
因此，就人SGCG用抑制因子反義寡聚物之進一步之態樣而言，可舉例如
由(M1)以及(M2-1)至(M2-16)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列所構成之人SGCG用抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。本發明中係包含人SGCG用抑制因子反義寡聚物。本發明中係包含人SGCG用抑制因子反義寡聚物。人SGCG用抑制因子反義寡聚物係可使SGCG之pre-mRNA多跳讀之效率增加。
就針對人Notch3之pre-mRNA而誘導多外顯子跳讀之人Notch3用反義寡聚物而言，可舉例如將內含子3之接受體附近之領域，亦即，將內含子3之3’末端作為基點而-400至+50鹼基之範圍作為標的者，可舉例如，
(N1)由序列編號309至330所構成之群組選擇之任1個鹼基序列；或
(N2)與由序列編號309至330所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
所成之人Notch3用反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
在此，(N2)之鹼基序列係(N1)之鹼基序列之變異型，就變異型而言可舉例如：
(N2-1)與由序列編號309至330所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
(N2-2)與由序列編號309至330所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有86%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±14%以內之長度之鹼基序列；
(N2-3)與由序列編號309至330所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有87%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±13%以內之長度之鹼基序列；
(N2-4)與由序列編號309至330所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有88%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±12%以內之長度之鹼基序列；
(N2-5)與由序列編號309至330所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有89%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±11%以內之長度之鹼基序列；
(N2-6)與由序列編號309至330所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有90%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±10%以內之長度之鹼基序列；
(N2-7)與由序列編號309至330所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有91%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±9%以內之長度之鹼基序列；
(N2-8)與由序列編號309至330所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有92%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±8%以內之長度之鹼基序列；
(N2-9)與由序列編號309至330所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有93%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±7%以內之長度之鹼基序列；
(N2-10)與由序列編號309至330所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有94%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±6%以內之長度之鹼基序列；
(N2-11)與由序列編號309至330所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有95%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±5%以內之長度之鹼基序列；
(N2-12)與由序列編號309至330所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有96%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±4%以內之長度之鹼基序列；
(N2-13)與由序列編號309至330所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有97%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±3%以內之長度之鹼基序列；
(N2-14)與由序列編號309至330所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有98%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±2%以內之長度之鹼基序列；
(N2-15)與由序列編號309至330所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±1%以內之長度之鹼基序列；以及
(N2-16)與由序列編號309至330所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99.5%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±0.5%以內之長度之鹼基序列。
因此，就人Notch3用反義寡聚物之進一步之態樣而言，可舉例如由(N1)以及(N2-1)至(N2-16)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列 所構成之人Notch3用反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。本發明中係包含人Notch3用反義寡聚物。
就人Notch3之pre-mRNA單跳讀之抑制因子反義寡聚物(人Notch3用抑制因子反義寡聚物)而言，可舉例如將內含子4之剪接緘默子序列或單跳讀之剪接部位作為標的者，具體例可舉例如：
(O1)由序列編號336至340所構成之群組選擇之任1個鹼基序列；或
(O2)與由序列編號336至340所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
所成之人Notch3用抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
在此，(O2)之鹼基序列係(O1)之鹼基序列之變異型，就變異型而言可舉例如：
(O2-1)與由序列編號336至340所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列；
(O2-2)與由序列編號336至340所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有86%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±14%以內之長度之鹼基序列；
(O2-3)與由序列編號336至340所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有87%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±13%以內之長度之鹼基序列；
(O2-4)與由序列編號336至340所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有88%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±12%以內之長度之鹼基序列；
(O2-5)與由序列編號336至340所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有89%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±11%以內之長度之鹼基序列；
(O2-6)與由序列編號336至340所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有90%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±10%以內之長度之鹼基序列；
(O2-7)與由序列編號336至340所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有91%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±9%以內之長度之鹼基序列；
(O2-8)與由序列編號336至340所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有92%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±8%以內之長度之鹼基序列；
(O2-9)與由序列編號336至340所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有93%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±7%以內之長度之鹼基序列；
(O2-10)與由序列編號336至340所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有94%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±6%以內之長度之鹼基序列；
(O2-11)與由序列編號336至340所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有95%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±5%以內之長度之鹼基序列；
(O2-12)與由序列編號336至340所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有96%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±4%以內之長度之鹼基序列；
(O2-13)與由序列編號336至340所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有97%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±3%以內之長度之鹼基序列；
(O2-14)與由序列編號336至340所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有98%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±2%以內之長度之鹼基序列；
(O2-15)與由序列編號336至340所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±1%以內之長度之鹼基序列；以及
(O2-16)與由序列編號336至340所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有99.5%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±0.5%以內之長度之鹼基序列。
因此，就人Notch3用抑制因子反義寡聚物之進一步之態樣而言可舉例如：
由(O1)以及(O2-1)至(O2-16)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列所構成之人Notch3用抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。本發明中係包含人Notch3用抑制因子反義寡聚物。人Notch3用抑制因子反義寡聚物係可使Notch3之pre-mRNA多跳讀之效率增加。
以下表示序列編號287至340之鹼基序列。
Figure 109145043-A0202-12-0165-56
Figure 109145043-A0202-12-0166-57
5．使多外顯子跳讀之效率增加之方法
本發明係包含在目的pre-mRNA之2個以上編號順序為連續之外顯子跳讀時，阻礙前述目的pre-mRNA之剪接緘默子序列、剪接部位序列，或分支部位序列之步驟。
本發明係提供使前述2個以上編號順序為連續之外顯子跳讀之效增加之方法(以下稱為「本發明之增加方法」)。
本發明之增加方法中，前述目的pre-mRNA之2個以上編號順序為連續之外顯子之跳讀，係能使用誘導多外顯子跳讀之反義寡聚物進行，例如本發明之反義寡聚物，或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
本發明之增加方法係由於阻礙目的pre-mRNA上的剪接緘默子序列、剪接部位序列或分支部位序列而抑制單跳讀，能使多外顯子跳讀之效率增加。本發明之增加方法係包含阻礙此等目的pre-mRNA上之剪接緘默子序列、剪接部位序列，或分支部位序列之機能，更具體而言，係包含經由將此等之序列以抑制因子反義寡聚物進行標的，而抑制外顯子之單跳讀。
此外，本發明之增加方法中，阻礙前述剪接緘默子序列、剪接部位或分支部位序列之步驟，能使用本發明之抑制因子反義寡聚物等抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物進行。
本發明之增加方法中，就抑制因子反義寡聚物而言，能將包含目的pre-mRNA上之剪接緘默子序列、分支部位序列以及剪接部位序列所互補的鹼基序列之寡聚物，使用於阻礙剪接緘默子序列、分支部位序列以及剪接部位序列之步驟中。
剪接緘默子序列、分支部位序列及剪接部位序列係如前述之內容。本發明之增加方法之某態樣中，前述剪接緘默子序列亦可為異質核核醣核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1(hnRNP A1)之辨識序列。將人hnRNP A1之辨識序列之一例表示於序列編號370至379。
本發明之增加方法中，所謂「使用」前述反義寡聚物以及前述抑制因子反義寡聚物，係意指使表現目的pre-mRNA之細胞攝入前述反義寡聚物以及前述抑制因子反義寡聚物，在目的pre-mRNA發生外顯子跳讀。就前述細胞攝入前述反義寡聚物以及前述抑制因子反義寡聚物之方法而言，可舉例如使用陽離子性脂質體，陽離子性聚合物等陽離子性擔體，或利用病毒套膜之擔體之導入方法。就陽離子性脂質體而言，可舉例如將2-O-(2-二乙胺基乙基)胺甲醯基-1,3-O-二油醯基甘油和磷脂質作為必須構成成分而形成之脂質體(以下稱為「脂質體A」)、Oligofectamine(註冊商標)(Invitrogen公司製)、Lipofectin(註冊商標)(Invitrogen公司製)，Lipofectamine(註冊商標)(Invitrogen公司製)、Lipofectamine 2000(註冊商標)(Invitrogen公司製)、DMRIE-C(註冊商標)(Invitrogen公司製)、GeneSilencer(註冊商標)(Gene Therapy Systems公司製)、TransMessenger(註冊商標)(QIAGEN公司製)、TransIT TKO(註冊商標)(Mirus公司製)、 Nucleofector II(Lonza)。該等之中，脂質體A較佳。就陽離子性聚合物而言，可舉例如JetSI(註冊商標)(Qbiogene公司製)、Je t-PEI(註冊商標)(聚乙亞胺，Qbiogene公司製)。就利用病毒套膜之擔體而言，可舉例如GenomeOne(註冊商標)(HVJ-E脂質體，石原產業公司製)。或者，亦可使用專利2924179號所述之醫藥裝置、再公表專利公報第2006/129594號以及再公表專利公報第2008/096690號所述之陽離子性擔體。
此外，就患者之體內中表現目的pre-mRNA之細胞攝入前述反義寡聚物以及前述抑制因子反義寡聚物之方法而言，可參照項目「3．醫藥用途」中所記載之投與方法。
本發明之增加方法中，將未進行相同阻礙時所得之多外顯子跳讀之效率設定為100之情形，藉由阻礙前述目的pre-mRNA之剪接緘默子序列、剪接部位序列或分支部位序列，該同效率增加2%以上、4%以上、6%以上、8%以上、10%以上、12%以上、14%以上、16%以上、18%以上、20%以上、22%以上、24%以上、26%以上、28%以上、30%以上、32%以上、34%以上、36%以上、38%以上、40%以上、42%以上、44%以上、46%以上、48%以上、50%以上、52%以上、54%以上、56%以上、58%以上、60%以上、62%以上、64%以上、66%以上、68%以上、70%以上、72%以上、74%以上、76%以上、78%以上、80%以上、82%以上、84%以上、86%以上、88%以上、90%以上、92%以上、94%以上、96%以上、98%以上或100%以上。
本發明之增加方法中，目的pre-mRNA係可舉例如人γ-肌聚糖(SGCG)、人Notch3以及人肌肉萎縮蛋白之pre-mRNA。本發明之某 態樣中目的pre-mRNA係人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA。目的pre-mRNA係人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之情形，前述2個以上編號順序為連續之外顯子係由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之外顯子。
[實施例]
以下可舉實施例以及試驗例，進一步詳細地說明本發明，惟本發明不限定於實施例中所表示之範圍。
[實施例1：反義寡聚物之製造]
胺基聚苯乙烯樹脂所擔持之4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸(化合物1)之製造
步驟1：4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸之製造
在氬環境下，將N-{1-[(2R，6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-2-側氧基-1，2-二氫嘧啶-4-基}苯甲醯胺3.44g和4-二甲胺基吡啶(4-DMAP)1.1g懸濁於二氯甲烷50mL，添加琥珀酸酐0.90g，在室溫攪拌3小時。在反應液中添加甲醇10mL，進行減壓濃縮。將殘渣使用乙酸乙酯和0.5M之磷酸二氫鉀水溶液進行萃取操作。將所得到之有機層依次以0.5M之磷酸二氫鉀水溶液、水、飽和食鹽水之順序進行洗淨。將所得到之有機層以硫酸鈉乾燥，並進行減壓濃縮，得到4.0g之目的物。
步驟2：胺基聚苯乙烯樹脂所擔持之4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸之製造
將4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1(2H)-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸4.0g溶解於吡啶(脫水)200mL，添加4- DMAP0.73g、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽11.5g。接著，添加胺基聚苯乙烯樹脂：Primer support 200 amino(GE Healthcare Japan公司製，17-5214-97)25.0g、三乙胺8.5mL，在室溫震盪4日。反應後，濾取樹脂。將所得到之樹脂依次以吡啶、甲醇、二氯甲烷之順序進行洗淨，並進行減壓乾燥。將所得到之樹脂添加四氫呋喃(脫水)200mL，乙酸酐15mL、2,6-二甲吡啶15mL，在室溫震盪2小時。濾取樹脂，依次以吡啶、甲醇、二氯甲烷之順序進行洗淨，並進行減壓乾燥，得到26.7g之目的物。
該目的物之填裝量係使用周知之方法，將每1g樹脂之三苯甲基之莫耳量藉由進行測定409nm中的UV吸光度決定。樹脂之填裝量係129.2μmol/g。
UV測定條件
機器：U-2910(日立製作所)
溶劑：甲磺酸
波長：409nm
ε值：45000
胺基聚苯乙烯樹脂所擔持之4-{[(2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸(化合物2)之製造
依照與化合物1同樣之方法，製造標記化合物。然而，取代化合物1製造之步驟1中所使用之N-{1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-2-側氧基-1,2-二氫嘧啶-4-基}苯甲醯胺，在本步驟中，使用1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。
該目的物之填裝量係使用周知之方法，將每1g樹脂之三苯甲基之莫耳量藉由進行測定409nm中的UV吸光度決定。樹脂之填裝量係164.0μmol/g。
胺基聚苯乙烯樹脂所擔持之4-{[(2S,6R)-6-(6-苯甲醯胺嘌呤-9-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸(化合物3)之製造
依照與化合物1同樣之方法，製造標記化合物。然而，取代化合物1製造之步驟1中所使用之N-{1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-2-側氧基-1,2-二氫嘧啶-4-基}苯甲醯胺，在本步驟中，使用N-{9-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]嘌呤-6-基}苯甲醯胺。
該目的物之填裝量係使用周知之方法，將每1g樹脂之三苯甲基之莫耳量藉由進行測定409nm中的UV吸光度決定。樹脂之填裝量係185.7μmol/g。
胺基聚苯乙烯樹脂所擔持之4-{{(2S,6R)-6-{6-(2-氰基乙氧基)-2-[(2-苯氧基乙醯)胺基]嘌呤-9-基}-4-三苯甲基嗎啉-2-基}甲氧基}-4-側氧基丁酸(化合物4)之製造
依照與化合物1同樣之方法，製造標記化合物。然而，取代化合物1製造之步驟1中所使用之N-{1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-2-側氧基-1,2-二氫嘧啶-4-基}苯甲醯胺，在本步驟中，使用N-{6-(2-氰基乙氧基)-9-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]嘌呤-2-基}-2-苯氧基乙醯胺。
該目的物之填裝量係使用周知之方法，將每1g樹脂之三苯甲基之莫耳量藉由進行測定409nm中的UV吸光度決定。樹脂之填裝量係164.8μmol/g。
將人肌肉萎縮蛋白基因之內含子之供體附近或接受體附近之領域作為標的之反義PMO之製造
根據以下之記載，將表10中所表示之人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之內含子44至55其在供體附近或接受體附近之領域作為標的，合成具有表11之PMO No.1至232之鹼基序列(序列編號1至232)之PMO。PMO之5’末端係下述基(3)。將合成脂PMO以注射用水(大塚製藥工場公司製)溶解。
Figure 109145043-A0202-12-0172-58
此外，本發明之反義寡聚物或本發明之抑制因子反義寡聚物之標的鹼基序列係記載如「Ha1_b1-c1」、「Ha2_b2-c2_Ha3_b3-c3」，或「Ha4_b4-c4_Ha5_b5-c5_Ha6_b6-c6」。
「Ha1_b1-c1」係本說明書中的第一態樣之反義寡聚物之標的鹼基序列。「Ha1」係表示人肌肉萎縮蛋白基因之第a號之外顯子，「b1」係表示標的鹼基序列之5’末端之鹼基，「c1」係表示標的鹼基序列之3’末端之鹼基。「Ha1_b1-c1」在其3’末端亦可具有付加的1個鹼基，此種之標的鹼基序列係以「Ha1_b1-c1_N」表示(「N」係表示任意之鹼基)。
「b1」、「c1」為正整數之情形，「b1」、「c1」係分別表示將第a號之外顯子之5’末端鹼基作為1號之鹼基時，3’末端方向之某號鹼基。另一方面，「b1」、「c1」為負整數之情形，「b1」、「c1」係分別表示第(a-1)號之內含子之3’末端鹼基作為-1號時，5’末端方向之某號鹼基。
例如為「H45_(-10)-15」之情形，係意指該標的鹼基序列之5’末端在第44號之內含子之3’末端起至5’末端方向之10號鹼基，該標的鹼基序列之3’末端在第45號之外顯子之5’末端起至3’末端方向之15號鹼基之鹼基序列。
「Ha2_b2-c2_Ha3_b3-c3」係本說明書中的第二態樣之反義寡聚物之標的鹼基序列。屬於「Ha2_b2-c2_Ha3_b3-c3」第1部分之「Ha2_b2-c2」，係意指構成該反義寡聚物之3’末端側單元寡聚物之標的鹼基序列，屬於第2部分之「Ha3_b3-c3」，係意指構成該反義寡聚物之5’末端側單元寡聚物之標的鹼基序列。「Ha3_b3-c3」在其3’末端亦可具有附加的1個鹼基，此種之標的鹼基序列係以「Ha2_b2-c2_Ha3_b3-c3_N」表示(「N」係表示任意之鹼基)。各「Ha2_b2-c2」以及「Ha3_b3-c3」係與上述「Ha1_b1-c1」之表記方法相同。
此外，在「Ha2」和「Ha3」為相同之情形，「_Ha3」部分亦可省略。
例如為「H45_(-5)-5_25-35」或「H45_(-5)-5_H45_25-35」之情形，係意指構成反義寡聚物之3’末端側單元寡聚物之標的鹼基序列為「H45_(-5)-5」，5’末端側單元寡聚物之標的鹼基序列為「H45_25-35」之鹼基序列。
「Ha4_b4-c4_Ha5_b5-c5_Ha6_b6-c6」係本說明書中的第三態樣之反義寡聚物之標的鹼基序列。屬於「Ha4_b4-c4_Ha5_b5-c5_Ha6_b6-c6」之第1部分之「Ha4_b4-c4」，係意指構成該反義寡聚物之3’末端側單元寡聚物之標的鹼基序列，屬於第2部分之「Ha5_b5-c5」，係意指構成該反義寡聚物之中間部單元寡聚物之標的鹼基序列，屬於第3部分之「Ha6_b6-c6」，係意指構成該反義寡聚物之5’末端側單元寡聚物之標的鹼基序列。「Ha6_b6-c6」在其3’末端亦可具有附加的1個鹼基，此種之標的鹼基序列係以「Ha4_b4-c4_Ha5_b5-c5_Ha6_b6-c6_N」表示(「N」係表示任意之鹼基)。各「Ha4_b4- c4」、「Ha5_b5-c5」以及「Ha6_b6-c6」係與上述「Ha1_b1-c1」之表記方法相同。
此外，在「Ha4」和「Ha5」以及「Ha6」為相同之情形，「_Ha5」部分亦可省略。
例如為「H45_(-5)-5_25-35_60-70」或「H45_(-5)-5_H45_25-35_H45_60-70」之情形，係意指構成反義寡聚物之3’末端側單元寡聚物之標的鹼基序列為「H45_(-5)-5」，中間部分單元寡聚物之標的鹼基序列為「H45_25-35」，5’末端側單元寡聚物之標的鹼基序列為「H45_60-70」之鹼基序列。
[表10]
Figure 109145043-A0202-12-0175-59
Figure 109145043-A0202-12-0176-60
[表11]
Figure 109145043-A0202-12-0177-62
Figure 109145043-A0202-12-0178-63
Figure 109145043-A0202-12-0179-64
Figure 109145043-A0202-12-0180-65
Figure 109145043-A0202-12-0181-66
Figure 109145043-A0202-12-0182-67
表11之PMO中，
將R2作為標的領域者，在其他態樣中係可舉例如PMO為No.22至71、91至93、98至99，進一步在其他態樣中係可舉例如PMO為No.22至59、91至93、98至99；
將R4作為標的領域者，在其他態樣中係可舉例如PMO為No.150至163，進一步在其他態樣中係可舉例如PMO為No.150至160；
將R6作為標的領域者，在其他態樣中係可舉例如PMO為No.171至177，進一步在其他態樣中係可舉例如PMO為No.171至176；
將R8作為標的領域者，在其他態樣中係可舉例如PMO為No.180；
將R10作為標的領域者，在其他態樣中係可舉例如PMO為No.183；
將R12作為標的領域者，在其他態樣中係可舉例如PMO為No.186至191；
將R16作為標的領域者，在其他態樣中係可舉例如PMO為No.197、198，進一步在其他態樣中係可舉例如PMO為No.197；
將R18作為標的領域者，在其他態樣中係可舉例如PMO為No.201至206；
將R22作為標的領域者，在其他態樣中係可舉例如PMO為No.217至223，進一步在其他態樣中係可舉例如PMO為No.217至222；
將R24作為標的者，在其他態樣中係可舉例如PMO為No.128至142。
對應於5’末端鹼基，將胺基聚苯乙烯樹脂所擔持之4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸(化合物1)、胺基聚苯乙烯樹脂所擔持之4-{[(2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸(化合物2)、胺基聚苯乙烯樹脂所擔持之4-{[(2S,6R)-6-(6-苯甲醯胺嘌呤-9-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸(化合物3)，或胺基聚苯乙烯樹脂所擔持之4-{{(2S,6R)-6-{6-(2-氰基乙氧基)-2-[(2-苯氧基乙醯)胺基]嘌呤-9-基}-4-三苯甲基嗎啉-2-基}甲氧基}-4-側氧基丁酸(化合物4)0.2g填充於附過濾器之管柱，並使用核酸合成機(AKTA Oligopilot 10 plus)，開始進行表12中所示之合成循環。以形成如表11所述之各PMO之鹼基序列之方式，添加各耦合循環中所期望之N-嗎啉單體化合物(參照表12)。
[表12]
Figure 109145043-A0202-12-0183-496
 (註)於僅3’末端為乙醯化之情形，最終循環後，再實施階段1、2、7、8。
此外，就解塊(Deblocking)溶液而言，係使用含有3%(w/v)三氟乙酸之二氯甲烷溶液。就中和/洗淨溶液而言，係使用以二氯甲烷溶液所溶解者，其中，二氯甲烷溶液係含有成為10%(v/v)之N,N-二異丙基乙基胺，且成為5%(v/v)之四氫呋喃，以及35%(v/v)之乙腈。就耦合溶液A而言，係使用將N-嗎啉單體化合物以成為0.10M之方式而以四氫呋喃所溶解者。就耦合溶液B而言，係使用將N,N-二異丙基乙基胺以成為20%(v/v)之方式，且將四氫呋喃以成為10%(v/v)之方式，而以乙腈所溶解者。就封蓋(capping)溶液而言，係使用經溶解相對於乙腈為20%(v/v)之乙酸酐和30%(v/v)之2,6-二甲吡啶者。
就N-嗎啉單體化合物而言，係使用表13所述之N-嗎啉單體化合物(A)、N-嗎啉單體化合物(C)、N-嗎啉單體化合物(T)以及N-嗎啉單體化合物(G)。
[表13]
Figure 109145043-A0202-12-0184-69
將上述中經合成之PMO所擔持之胺基聚苯乙烯樹脂由反應容器回收，在室溫經2小時以上減壓乾燥。將經乾燥之胺基聚苯乙烯樹脂所擔持之PMO置入反應容器，添加28%氨水-乙醇(1/4)5mL，在55℃攪拌15小時。濾別胺基聚苯乙烯樹脂，以水-乙醇(1/4)1mL洗淨。將所得到之濾液進行減壓濃縮。將所得到之殘渣溶解於20mM之乙酸-三乙胺緩衝液(TEAA緩衝液)和乙腈之混合溶劑(4/1)10mL，以薄膜過濾器進行過濾。將所得到之液以逆相高效液相層析法(Reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)進行精製。所使用之條件表示於表14。
[表14]
Figure 109145043-A0202-12-0185-497
 CV：管柱容積
分析各分劃，回收目的物並進行減壓濃縮。在濃縮殘中加入2M之磷酸水溶液0.5mL並攪拌15分鐘。進一步添加2M之氫氧化鈉水溶液2mL使其成為鹼性，並以薄膜過濾器(0.45μm)進行過濾。
將含有所得目的物之水溶液以陰離子交換樹脂管柱進行精製。將所使用之條件表示於表15。
[表15]
Figure 109145043-A0202-12-0186-71
分析(HPLC)各分劃，得到使目的物成為水溶液者。在所得到之水溶液中添加0.1M之磷酸緩衝液(pH6.0)並進行中和。接著，以表16中所表示之條件以逆相高效液相層析法(Reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)進行脫鹽。
[表16]
Figure 109145043-A0202-12-0186-72
回收目的物並進行減壓濃縮。將所得到之殘渣溶於水並進行凍結乾燥，得到形成白色綿狀固體作為目的化合物之各PMO。將ESI-TOF-MS之計算值、測定值表示於下述表17。
[表17]
Figure 109145043-A0202-12-0187-73
Figure 109145043-A0202-12-0188-74
Figure 109145043-A0202-12-0189-75
Figure 109145043-A0202-12-0190-76
Figure 109145043-A0202-12-0191-77
人肌肉萎縮蛋白基因之內含子中剪接緘默子或單跳讀相關之剪接部位作為標的之反義PMO之製造
以與內含子之供體附近或接受體附近之領域作為標的之PMO同樣之方法，進行合成人肌肉萎縮蛋白基因之(i)具有將內含子44之剪接緘默子序列或單跳讀相關之剪接部位作為標的之PMO No.233鹼基序列(序列編號257)之PMO，(ii)具有將內含子45之剪接緘默子序列或單跳讀相關之剪接部位作為標的之PMO No.234至244之鹼基序列(序列編號258至268)PMO，(iii)具有將內含子44受體附近之領域(R2)和內含子45之剪接緘默子序列或單跳讀相關之剪接部位作為標的之PMO No.245至249鹼基序列(序列編號269至273)之PMO(連結型)，以及(iv)具有將外顯子45之剪接緘默子序列作為標的之PMO No.250至251鹼基序列(序列編號274至275)之PMO。各PMO之5’末端係與內含子之供體附近或接受體附近領域作為標的之PMO相同之基(3)。將各PMO表示於表18，將ESI-TOF-MS之計算值、測定值表示於表19。
[表18]
Figure 109145043-A0202-12-0193-79
 下底線係表示預測對應於內含子中剪接緘默子序列或單跳讀相關之剪接部位之鹼基序列。
下底線係表示預測對應於內含子中剪接緘默子序列或單跳讀相關之剪接部位之鹼基序列。
[表19]
Figure 109145043-A0202-12-0194-80
實施例2：反義寡聚物之多外顯子跳讀活性試驗]
<試驗例1>
人肌肉萎縮蛋白基因之多外顯子跳讀之生體外檢定(In vitro assay)(1)：多外顯子跳讀之誘導
程序
對於3.5×105個RD細胞(人橫紋肌肉瘤細胞株，CCL-136，由ATCC購入)，將表11之反義寡聚物(PMO No.55、59、78、65、75、77、102、35、52、47、50、46、43、40、139、119、142、113、51、11、45、54、41、74、66、64、63、68、76、28、27、225、228、1、5、132、131、128、163、162以及161(序列編號55、59、78、65、75、77、102、35、52、 47、50、46、43、40、139、119、142、113、51、11、45、54、41、74、66、64、63、68、76、28、27、225、228、1、5、132、131、128、163、162以及161))分別以25至50μM之濃度以單獨，或2、3個的組合導入。試藥係使用Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L-而藉由Nucleofector II(Lonza)進行導入。程式係使用T-030。
導入後，將細胞置於含有10%胎牛血清(FBS)(英傑生命技術股份有限公司(Invitrogen)製)之Eagle's minimal essential medium(EMEM)培養基(SIGMA公司製，以下同)2mL中，在37℃、5%CO2之條件下培養三晚。
將細胞以PBS(日本水產股份有限公司製，以下同)洗淨1次後，將含有1%之2-巰基乙醇(Nacalai Tesque股份有限公司製)之Buffer RLT(QIAGEN公司製)添加於350μL細胞，在室溫放置數分鐘使細胞溶解，回收於QIAshredder均質機(QIAGEN公司製)。以15,000rpm離心2分鐘製作均質物。依照RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司製)附件之規程抽取全RNA。經抽取之全RNA之濃度係使用NanoDrop ND-1000(LMS公司製)進行測定。
針對經抽取之全RNA800ng，使用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit(QIAGEN公司製)進行One-Step RT-PCR。依照套組中附件之規程調製反應液。聚合酶反應器(Thermal Cycler)係使用TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch(寶生物(Takara Bio)股份有限公司製)。所使用之RT-PCR之程式，係如以下之內容。
50℃，30分鐘：反轉錄反應
95℃，15分鐘：聚合酶活性化、反轉錄酶不活性化、cDNA熱變性
[94℃，10秒鐘：57℃，30秒間；72℃，1分間]×33循環：PCR擴增
72℃，10分鐘：最終延長反應
RT-PCR中所使用之前置引子和反置引子之鹼基序列係如以下之內容。
前置引子：5'-ATTTGACAGATCTGTTGAGAAATGG-3'(序列編號276)
反置引子1：5'-GGCTGTTTTCATCCAGGTTGTG-3'(序列編號277)
反置引子2：5'-AGTTGCTGCTCTTTTCCAGG三級3'(序列編號278)
以前置引子和反置引子2之組合能檢測出外顯子45至55之多外顯子跳讀所產生之轉錄產物。此外，以前置引子和反置引子1之組合，能檢測出不發生跳讀之轉錄產物以及外顯子45發生單獨外顯子跳讀之轉錄產物。
將上述PCR之反應產物使用Bioanalyzer(Agilent股份有限公司製)以及MultiNA(島津製作所公司製)進行解析。
測定外顯子45至55之中任2個以上編號順序為連續之外顯子所跳讀段之多寡核苷酸量「A」、外顯子45至55之中任1個外顯子所跳讀段之多核苷酸量「B」，和不發生跳讀段之多寡核苷酸量「C」。根據此等「A」、「B」及「C」之測定值，依照以下之式，求得多外顯子跳讀之跳讀效率。
跳讀效率(%)=A/(A+B+C)×100
結果
將結果表示於圖1至16。藉由將PMO No.55、59、78、65、75、77、102、35、52、47、50、46、43、40、139、119、142、113、51、11、45、 54、41、74、66、64、63、68、76、28、27、225、228、1、5、132、131、128、163、162以及161(序列編號55、59、78、65、75、77、102、35、52、47、50、46、43、40、139、119、142、113、51、11、45、54、41、74、66、64、63、68、76、28、27、225、228、1、5、132、131、128、163、162以及161)以單獨，或組合進行導入，而誘導外顯子45至55之多外顯子跳讀。
因此得知，表11所述之本發明之反義寡聚物係藉由單獨或組合使用，可有效地誘導，或可認為有誘導多外顯子跳讀。
此外亦確認，藉由將PMO No.6、7、8、10、14、26、29、38、39、53、58、67、80、82、86、92、97、98、100、121、122、124、125、126、130、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、231、232(序列編號6、7、8、10、14、26、29、38、39、53、58、67、80、82、86、92、97、98、100、121、122、124、125、126、130、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、231、232)進行導入，可誘導外顯子45至55之多外顯子跳讀。
<試驗例2>
人肌肉萎縮蛋白基因之多外顯子跳讀之生體外檢定(In vitro assay)(2)：多外顯子跳讀之促進
程序
對於3.5×105個RD細胞(人橫紋肌肉瘤細胞株，CCL-136，由ATCC購入)，加入表11之反義寡聚物(PMO No.75)25至50μM，組合表18之反 義寡聚物(PMO No.236,237，或239)25至50μM進行導入，與試驗例1相同樣之程序進行檢定。
結果
將結果表示於圖17以及18。與單獨使用PMO No.75(序列編號75)之情形進行比較，組合PMO No.236、237或239(序列編號260、261或263)進行導入之情形中，外顯子45至55之多外顯子跳讀之跳讀效率增加。另一方面，外顯子45之單獨外顯子跳讀之跳讀效率減少。
因此得知，藉由使表11所述之本發明之反義寡聚物和表18所述之本發明之抑制因子反義寡聚物進行組合使用，可促進多外顯子跳讀，或可認為有促進者。
<試驗例3>
人肌肉萎縮蛋白基因之外顯子跳讀之生體外檢定(In vitro assay)(3)：整體性的多外顯子跳讀之促進
程序
試驗例3係除了使One-Step RT-PCR以以下之方式進行之外，以與試驗例2同樣之程序進行。
針對經抽取之全RNA800ng，使用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit(QIAGEN公司製)進行One-Step RT-PCR。依照套組中附件之規程調製反應液。聚合酶反應器係使用TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch(寶生物(Takara Bio)股份有限公司製)。所使用之RT-PCR之程式，係如以下之內容。
50℃，30分鐘：反轉錄反應
95℃，15分鐘：聚合酶活性化、反轉錄酶不活性化、cDNA熱變性[94℃，10秒鐘；60℃，30秒間；72℃，2分間]×40循環：PCR擴增72℃，10分鐘：最終延長反應
RT-PCR中所使用之前置引子和反置引子之鹼基序列係如以下之內容。
前置引子2：5'-ATTTGACAGATCTGTTGAGAAATGG-3'(序列編號279)
反置引子3：5'-GGCTCCAATAGTGGTCAGTCC-3'(序列編號280)
前置引子3：5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3'(序列編號281)
反置引子4：5'-CCTCCTTCCATGACTCAAGC-3'(序列編號282)
人肌肉萎縮蛋白基因之外顯子45至46、外顯子45至47、外顯子45至48，或外顯子45至49之多外顯子跳讀所產生之轉錄產物，能以前置引子2和反置引子3之組合檢測出。另一方面，外顯子45至46、外顯子45至47、外顯子45至48、外顯子45至49、外顯子45至50、外顯子45至51，或外顯子45至52之多外顯子跳讀所產生之轉錄產物，能以前置引子3和反置引子4之組合檢測出。
將上述PCR之反應產物使用Bioanalyzer(Agilent股份有限公司製)以及MultiNA(島津製作所公司製)進行分析，將各外顯子跳讀所產生之轉錄產物之PCR產物量進行定量。
結果
將結果表示於圖19至22。與單獨使用PMO No.75(序列編號75)之情形進行比較，組合PMO No.236或239(序列編號260或263)進行導入之 情形中，除外顯子45至55之多外顯子跳讀之跳讀(試驗例2)之外，外顯子45至46、外顯子45至47、外顯子45至48，或外顯子45至49、外顯子45至50、外顯子45至51、以及外顯子45至52之多外顯子跳讀之跳讀效率亦增加。
因此得知，藉由使表11所述之本發明之反義寡聚物和表18所述之本發明之抑制因子反義寡聚物進行組合使用，可促進整體性的多外顯子跳讀，或可認為有促進者。
[產業上之利用可能性]
藉由本發明可提供能進行人肌肉萎縮蛋白多外顯子跳讀之反義寡聚物以及抑制因子反義寡聚物。藉由使用本發明之反義寡聚物以及抑制因子反義寡聚物，可提供新穎的DMD治療藥以及治療方法。
<110> 日商日本新藥股份有限公司(NIPPON SHINYAKU CO.,LTD.) 國立研究開發法人國立精神‧神經醫療研究中心(NATIONAL CENTER OF NEUROLOGY AND PSYCHIATRY)
<120> 能進行外顯子跳讀之反義核酸 (ANTISENSE NUCLEAR ACIDS CAUSING EXON SKIPPING)
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<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成核酸
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<210> 72
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 72
Figure 109145043-A0202-12-0218-153
<210> 73
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 73
Figure 109145043-A0202-12-0218-154
<210> 74
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 74
Figure 109145043-A0202-12-0219-155
<210> 75
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 75
Figure 109145043-A0202-12-0219-156
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 76
Figure 109145043-A0202-12-0219-157
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 77
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<210> 78
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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Figure 109145043-A0202-12-0219-159
<210> 79
<211> 25
<212> DNA
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<220>
<223> 合成核酸
<400> 79
Figure 109145043-A0202-12-0220-160
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 80
Figure 109145043-A0202-12-0220-161
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
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<220>
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Figure 109145043-A0202-12-0220-162
<210> 82
<211> 30
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<400> 82
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<212> DNA
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<220>
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Figure 109145043-A0202-12-0221-164
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<211> 30
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<400> 84
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<211> 28
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<210> 86
<211> 28
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<210> 87
<211> 28
<212> DNA
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<210> 88
<211> 28
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Figure 109145043-A0202-12-0222-169
<210> 89
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 90
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<210> 91
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<220>
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Figure 109145043-A0202-12-0223-173
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Figure 109145043-A0202-12-0223-175
<210> 95
<211> 28
<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0224-176
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<211> 28
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Figure 109145043-A0202-12-0224-178
<210> 97
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Figure 109145043-A0202-12-0224-179
<210> 98
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<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0224-180
<210> 99
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<211> 28
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Figure 109145043-A0202-12-0225-182
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Figure 109145043-A0202-12-0225-183
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Figure 109145043-A0202-12-0225-184
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Figure 109145043-A0202-12-0226-187
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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Figure 109145043-A0202-12-0226-188
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<220>
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Figure 109145043-A0202-12-0226-189
<210> 108
<211> 28
<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0227-190
<210> 109
<211> 28
<212> DNA
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<220>
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Figure 109145043-A0202-12-0227-191
<210> 110
<211> 28
<212> DNA
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<220>
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Figure 109145043-A0202-12-0227-192
<210> 111
<211> 28
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<210> 112
<211> 21
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<211> 28
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<211> 28
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Figure 109145043-A0202-12-0228-196
<210> 115
<211> 28
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Figure 109145043-A0202-12-0228-197
<210> 116
<211> 28
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Figure 109145043-A0202-12-0229-198
<210> 117
<211> 28
<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0229-199
<210> 118
<211> 28
<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0229-200
<210> 119
<211> 28
<212> DNA
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<220>
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<400> 119
Figure 109145043-A0202-12-0229-201
<210> 120
<211> 28
<212> DNA
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<400> 120
Figure 109145043-A0202-12-0230-202
<210> 121
<211> 28
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Figure 109145043-A0202-12-0230-203
<210> 122
<211> 28
<212> DNA
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<220>
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<400> 122
Figure 109145043-A0202-12-0230-204
<210> 123
<211> 28
<212> DNA
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<220>
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<400> 123
Figure 109145043-A0202-12-0230-205
<210> 124
<211> 28
<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0231-206
<210> 125
<211> 28
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<210> 126
<211> 28
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<210> 127
<211> 28
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Figure 109145043-A0202-12-0231-209
<210> 128
<211> 28
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Figure 109145043-A0202-12-0231-210
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<211> 26
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<223> 合成核酸
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<210> 130
<211> 28
<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0232-212
<210> 131
<211> 28
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<210> 137
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<210> 139
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Figure 109145043-A0202-12-0234-221
<210> 140
<211> 26
<212> DNA
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<223> 合成核酸
<400> 140
Figure 109145043-A0202-12-0234-222
<210> 141
<211> 26
<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0235-226
<210> 145
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<211> 28
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<220>
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<400> 146
Figure 109145043-A0202-12-0236-228
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<211> 28
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<400> 147
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<210> 148
<211> 28
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<400> 148
Figure 109145043-A0202-12-0236-230
<210> 149
<211> 28
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Figure 109145043-A0202-12-0237-231
<210> 150
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 150
Figure 109145043-A0202-12-0237-232
<210> 151
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 151
Figure 109145043-A0202-12-0237-233
<210> 152
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 152
Figure 109145043-A0202-12-0237-234
<210> 153
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 153
Figure 109145043-A0202-12-0237-235
<210> 154
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 154
Figure 109145043-A0202-12-0238-236
<210> 155
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 155
Figure 109145043-A0202-12-0238-237
<210> 156
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 156
Figure 109145043-A0202-12-0238-238
<210> 157
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 157
Figure 109145043-A0202-12-0238-239
<210> 158
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 158
Figure 109145043-A0202-12-0239-240
<210> 159
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 159
Figure 109145043-A0202-12-0239-241
<210> 160
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 160
Figure 109145043-A0202-12-0239-242
<210> 161
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 161
Figure 109145043-A0202-12-0239-243
<210> 162
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 162
Figure 109145043-A0202-12-0240-244
<210> 163
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 163
Figure 109145043-A0202-12-0240-245
<210> 164
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 164
Figure 109145043-A0202-12-0240-246
<210> 165
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 165
Figure 109145043-A0202-12-0240-247
<210> 166
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 166
Figure 109145043-A0202-12-0241-248
<210> 167
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 167
Figure 109145043-A0202-12-0241-249
<210> 168
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 168
Figure 109145043-A0202-12-0241-250
<210> 169
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 169
Figure 109145043-A0202-12-0241-251
<210> 170
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 170
Figure 109145043-A0202-12-0242-498
<210> 171
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 171
Figure 109145043-A0202-12-0242-253
<210> 172
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 172
Figure 109145043-A0202-12-0242-254
<210> 173
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 173
Figure 109145043-A0202-12-0242-255
<210> 174
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 174
Figure 109145043-A0202-12-0243-256
<210> 175
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 175
Figure 109145043-A0202-12-0243-257
<210> 176
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 176
Figure 109145043-A0202-12-0243-258
<210> 177
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 177
Figure 109145043-A0202-12-0243-259
<210> 178
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 178
Figure 109145043-A0202-12-0243-260
<210> 179
<211> 28
<212> DNA
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<220>
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<400> 179
Figure 109145043-A0202-12-0244-261
<210> 180
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 180
Figure 109145043-A0202-12-0244-262
<210> 181
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
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Figure 109145043-A0202-12-0244-263
<210> 182
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
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Figure 109145043-A0202-12-0244-264
<210> 183
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Figure 109145043-A0202-12-0245-265
<210> 184
<211> 26
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<220>
<223> 合成核酸
<400> 184
Figure 109145043-A0202-12-0245-266
<210> 185
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 185
Figure 109145043-A0202-12-0245-267
<210> 186
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 186
Figure 109145043-A0202-12-0245-268
<210> 187
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 187
Figure 109145043-A0202-12-0246-269
<210> 188
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 188
Figure 109145043-A0202-12-0246-270
<210> 189
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 189
Figure 109145043-A0202-12-0246-271
<210> 190
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 190
Figure 109145043-A0202-12-0246-272
<210> 191
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 191
Figure 109145043-A0202-12-0247-273
<210> 192
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 192
Figure 109145043-A0202-12-0247-274
<210> 193
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 193
Figure 109145043-A0202-12-0247-275
<210> 194
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 194
Figure 109145043-A0202-12-0247-276
<210> 195
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 195
Figure 109145043-A0202-12-0248-277
<210> 196
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 196
Figure 109145043-A0202-12-0248-278
<210> 197
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 197
Figure 109145043-A0202-12-0248-279
<210> 198
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 198
Figure 109145043-A0202-12-0248-280
<210> 199
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 199
Figure 109145043-A0202-12-0249-281
<210> 200
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 200
Figure 109145043-A0202-12-0249-282
<210> 201
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 201
Figure 109145043-A0202-12-0249-283
<210> 202
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 202
Figure 109145043-A0202-12-0249-284
<210> 203
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 203
Figure 109145043-A0202-12-0249-285
<210> 204
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 204
Figure 109145043-A0202-12-0250-286
<210> 205
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 205
Figure 109145043-A0202-12-0250-287
<210> 206
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 206
Figure 109145043-A0202-12-0250-288
<210> 207
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 207
Figure 109145043-A0202-12-0250-289
<210> 208
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 208
Figure 109145043-A0202-12-0251-290
<210> 209
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 209
Figure 109145043-A0202-12-0251-291
<210> 210
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 210
Figure 109145043-A0202-12-0251-292
<210> 211
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 211
Figure 109145043-A0202-12-0251-293
<210> 212
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 212
Figure 109145043-A0202-12-0252-294
<210> 213
<211> 28
<212> DNA
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<220>
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Figure 109145043-A0202-12-0252-295
<210> 214
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 214
Figure 109145043-A0202-12-0252-296
<210> 215
<211> 28
<212> DNA
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<220>
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<400> 215
Figure 109145043-A0202-12-0252-297
<210> 216
<211> 28
<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0253-298
<210> 217
<211> 28
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Figure 109145043-A0202-12-0253-299
<210> 218
<211> 28
<212> DNA
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<223> 合成核酸
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Figure 109145043-A0202-12-0253-300
<210> 219
<211> 28
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<400> 219
Figure 109145043-A0202-12-0253-301
<210> 220
<211> 28
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Figure 109145043-A0202-12-0254-302
<210> 221
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成核酸
<400> 221
Figure 109145043-A0202-12-0254-303
<210> 222
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 222
Figure 109145043-A0202-12-0254-304
<210> 223
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 223
Figure 109145043-A0202-12-0254-305
<210> 224
<211> 23
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<400> 224
Figure 109145043-A0202-12-0255-306
<210> 225
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 225
Figure 109145043-A0202-12-0255-307
<210> 226
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 226
Figure 109145043-A0202-12-0255-308
<210> 227
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 227
Figure 109145043-A0202-12-0255-309
<210> 228
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 228
Figure 109145043-A0202-12-0255-310
<210> 229
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 229
Figure 109145043-A0202-12-0256-311
<210> 230
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 230
Figure 109145043-A0202-12-0256-312
<210> 231
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 231
Figure 109145043-A0202-12-0256-313
<210> 232
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 232
Figure 109145043-A0202-12-0256-314
<210> 233
<211> 420
<212> DNA
<213> 智人
<400> 233
Figure 109145043-A0202-12-0257-315
<210> 234
<211> 650
<212> DNA
<213> 智人
<400> 234
Figure 109145043-A0202-12-0257-316
<210> 235
<211> 420
<212> DNA
<213> 智人
<400> 235
Figure 109145043-A0202-12-0258-317
<210> 236
<211> 450
<212> DNA
<213> 智人
<400> 236
Figure 109145043-A0202-12-0258-318
<210> 237
<211> 420
<212> DNA
<213> 智人
<400> 237
Figure 109145043-A0202-12-0259-319
<210> 238
<211> 450
<212> DNA
<213> 智人
<400> 238
Figure 109145043-A0202-12-0259-320
<210> 239
<211> 420
<212> DNA
<213> 智人
<400> 239
Figure 109145043-A0202-12-0259-321
Figure 109145043-A0202-12-0260-322
<210> 240
<211> 450
<212> DNA
<213> 智人
<400> 240
Figure 109145043-A0202-12-0260-323
<210> 241
<211> 420
<212> DNA
<213> 智人
<400> 241
Figure 109145043-A0202-12-0260-324
Figure 109145043-A0202-12-0261-325
<210> 242
<211> 450
<212> DNA
<213> 智人
<400> 242
Figure 109145043-A0202-12-0261-326
<210> 243
<211> 420
<212> DNA
<213> 智人
<400> 243
Figure 109145043-A0202-12-0261-327
<210> 244
<211> 450
<212> DNA
<213> 智人
<400> 244
Figure 109145043-A0202-12-0262-328
<210> 245
<211> 420
<212> DNA
<213> 智人
<400> 245
Figure 109145043-A0202-12-0262-329
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<211> 450
<212> DNA
<213> 智人
<400> 246
Figure 109145043-A0202-12-0262-330
Figure 109145043-A0202-12-0263-331
<210> 247
<211> 420
<212> DNA
<213> 智人
<400> 247
Figure 109145043-A0202-12-0263-332
<210> 248
<211> 450
<212> DNA
<213> 智人
<400> 248
Figure 109145043-A0202-12-0263-333
Figure 109145043-A0202-12-0264-334
<210> 249
<211> 420
<212> DNA
<213> 智人
<400> 249
Figure 109145043-A0202-12-0264-335
<210> 250
<211> 450
<212> DNA
<213> 智人
<400> 250
Figure 109145043-A0202-12-0264-337
<210> 251
<211> 420
<212> DNA
<213> 智人
<400> 251
Figure 109145043-A0202-12-0265-338
<210> 252
<211> 450
<212> DNA
<213> 智人
<400> 252
Figure 109145043-A0202-12-0265-339
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<211> 420
<212> DNA
<213> 智人
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Figure 109145043-A0202-12-0266-340
<210> 254
<211> 450
<212> DNA
<213> 智人
<400> 254
Figure 109145043-A0202-12-0266-341
<210> 255
<211> 420
<212> DNA
<213> 智人
<400> 255
Figure 109145043-A0202-12-0266-342
Figure 109145043-A0202-12-0267-343
<210> 256
<211> 450
<212> DNA
<213> 智人
<400> 256
Figure 109145043-A0202-12-0267-344
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<211> 24
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Figure 109145043-A0202-12-0267-345
<210> 258
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
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Figure 109145043-A0202-12-0268-346
<210> 259
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 259
Figure 109145043-A0202-12-0268-347
<210> 260
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 260
Figure 109145043-A0202-12-0268-349
<210> 261
<211> 24
<212> DNA
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<223> 合成核酸
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Figure 109145043-A0202-12-0268-350
<210> 262
<211> 24
<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0269-353
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<211> 24
<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0269-352
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
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Figure 109145043-A0202-12-0269-354
<210> 265
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 265
Figure 109145043-A0202-12-0269-355
<210> 266
<211> 24
<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0270-356
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<211> 24
<212> DNA
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<400> 267
Figure 109145043-A0202-12-0270-357
<210> 268
<211> 24
<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0270-358
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<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0270-499
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<211> 30
<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0270-360
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<211> 30
<212> DNA
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<220>
<223> 合成核酸
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Figure 109145043-A0202-12-0271-361
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<211> 30
<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0271-362
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
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Figure 109145043-A0202-12-0271-363
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 274
Figure 109145043-A0202-12-0271-364
<210> 275
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 275
Figure 109145043-A0202-12-0272-365
<210> 276
<211> 25
<212> DNA
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<220>
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<400> 276
Figure 109145043-A0202-12-0272-366
<210> 277
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 277
Figure 109145043-A0202-12-0272-367
<210> 278
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 合成核酸
<400> 278
Figure 109145043-A0202-12-0272-368
<210> 279
<211> 25
<212> DNA
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<210> 280
<211> 21
<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0273-370
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<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0273-371
<210> 282
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成核酸
<400> 282
Figure 109145043-A0202-12-0273-372
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<211> 450
<212> DNA
<213> 智人
<400> 283
Figure 109145043-A0202-12-0274-373
<210> 284
<211> 420
<212> DNA
<213> 智人
<400> 284
Figure 109145043-A0202-12-0274-374
<210> 285
<211> 450
<212> DNA
<213> 智人
<400> 285
Figure 109145043-A0202-12-0274-375
Figure 109145043-A0202-12-0275-376
<210> 286
<211> 420
<212> DNA
<213> 智人
<400> 286
Figure 109145043-A0202-12-0275-377
<210> 287
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 287
Figure 109145043-A0202-12-0275-378
<210> 288
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 288
Figure 109145043-A0202-12-0276-379
<210> 289
<211> 30
<212> DNA
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<220>
<223> 合成核酸
<400> 289
Figure 109145043-A0202-12-0276-380
<210> 290
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 290
Figure 109145043-A0202-12-0276-382
<210> 291
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 291
Figure 109145043-A0202-12-0276-383
<210> 292
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 292
Figure 109145043-A0202-12-0277-384
<210> 293
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成核酸
<400> 293
Figure 109145043-A0202-12-0277-385
<210> 294
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成核酸
<400> 294
Figure 109145043-A0202-12-0277-386
<210> 295
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 295
Figure 109145043-A0202-12-0277-387
<210> 296
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成核酸
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Figure 109145043-A0202-12-0278-388
<210> 297
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成核酸
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Figure 109145043-A0202-12-0278-389
<210> 298
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成核酸
<400> 298
Figure 109145043-A0202-12-0278-390
<210> 299
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成核酸
<400> 299
Figure 109145043-A0202-12-0278-391
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<211> 30
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<223> 合成核酸
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Figure 109145043-A0202-12-0278-392
<210> 301
<211> 30
<212> DNA
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Figure 109145043-A0202-12-0279-393
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<211> 30
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Figure 109145043-A0202-12-0279-394
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<211> 30
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<211> 30
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<223> 合成核酸
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成核酸
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Figure 109145043-A0202-12-0280-400
<210> 309
<211> 30
<212> DNA
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<220>
<223> 合成核酸
<400> 309
Figure 109145043-A0202-12-0281-401
<210> 310
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成核酸
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Figure 109145043-A0202-12-0281-402
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<223> 合成核酸
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<223> 合成核酸
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Figure 109145043-A0202-12-0281-404
<210> 313
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<212> DNA
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<223> 合成核酸
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Figure 109145043-A0202-12-0282-405
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 314
Figure 109145043-A0202-12-0282-406
<210> 315
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 315
Figure 109145043-A0202-12-0282-407
<210> 316
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<210> 317
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成核酸
<400> 317
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<210> 318
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 318
Figure 109145043-A0202-12-0283-410
<210> 319
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 319
Figure 109145043-A0202-12-0283-411
<210> 320
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 320
Figure 109145043-A0202-12-0283-412
<210> 321
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 321
Figure 109145043-A0202-12-0284-413
<210> 322
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 322
Figure 109145043-A0202-12-0284-414
<210> 323
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 323
Figure 109145043-A0202-12-0284-415
<210> 324
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 324
Figure 109145043-A0202-12-0284-416
<210> 325
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 325
Figure 109145043-A0202-12-0284-417
<210> 326
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 326
Figure 109145043-A0202-12-0285-418
<210> 327
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 327
Figure 109145043-A0202-12-0285-419
<210> 328
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 328
Figure 109145043-A0202-12-0285-420
<210> 329
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 329
Figure 109145043-A0202-12-0285-421
<210> 330
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 330
Figure 109145043-A0202-12-0286-422
<210> 331
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 331
Figure 109145043-A0202-12-0286-423
<210> 332
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 332
Figure 109145043-A0202-12-0286-424
<210> 333
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 333
Figure 109145043-A0202-12-0286-425
<210> 334
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 334
Figure 109145043-A0202-12-0287-426
<210> 335
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 335
Figure 109145043-A0202-12-0287-427
<210> 336
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 336
Figure 109145043-A0202-12-0287-428
<210> 337
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 337
Figure 109145043-A0202-12-0287-429
<210> 338
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 338
Figure 109145043-A0202-12-0288-430
<210> 339
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 339
Figure 109145043-A0202-12-0288-431
<210> 340
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成核酸
<400> 340
Figure 109145043-A0202-12-0288-432
<210> 341
<211> 619
<212> DNA
<213> 智人
<400> 341
Figure 109145043-A0202-12-0288-433
Figure 109145043-A0202-12-0289-434
<210> 342
<211> 425
<212> DNA
<213> 智人
<400> 342
Figure 109145043-A0202-12-0289-435
<210> 343
<211> 424
<212> DNA
<213> 智人
<400> 343
Figure 109145043-A0202-12-0289-500
Figure 109145043-A0202-12-0290-437
<210> 344
<211> 434
<212> DNA
<213> 智人
<400> 344
Figure 109145043-A0202-12-0290-438
<210> 345
<211> 425
<212> DNA
<213> 智人
<400> 345
Figure 109145043-A0202-12-0290-439
Figure 109145043-A0202-12-0291-440
<210> 346
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 346
Figure 109145043-A0202-12-0291-441
<210> 347
<211> 600
<212> DNA
<213> 智人
<400> 347
Figure 109145043-A0202-12-0291-442
<210> 348
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 348
Figure 109145043-A0202-12-0292-443
<210> 349
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 349
Figure 109145043-A0202-12-0292-444
<210> 350
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 350
Figure 109145043-A0202-12-0292-445
Figure 109145043-A0202-12-0293-446
<210> 351
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 351
Figure 109145043-A0202-12-0293-447
<210> 352
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 352
Figure 109145043-A0202-12-0293-448
Figure 109145043-A0202-12-0294-449
<210> 353
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 353
Figure 109145043-A0202-12-0294-450
<210> 354
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 354
Figure 109145043-A0202-12-0294-451
<210> 355
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 355
Figure 109145043-A0202-12-0295-452
<210> 356
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 356
Figure 109145043-A0202-12-0295-453
<210> 357
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 357
Figure 109145043-A0202-12-0295-454
Figure 109145043-A0202-12-0296-455
<210> 358
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 358
Figure 109145043-A0202-12-0296-456
<210> 359
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 359
Figure 109145043-A0202-12-0296-457
Figure 109145043-A0202-12-0297-458
<210> 360
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 360
Figure 109145043-A0202-12-0297-459
<210> 361
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 361
Figure 109145043-A0202-12-0297-460
<210> 362
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 362
Figure 109145043-A0202-12-0298-461
<210> 363
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 363
Figure 109145043-A0202-12-0298-462
<210> 364
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 364
Figure 109145043-A0202-12-0298-463
Figure 109145043-A0202-12-0299-464
<210> 365
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 365
Figure 109145043-A0202-12-0299-465
<210> 366
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 366
Figure 109145043-A0202-12-0299-466
<210> 367
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 367
Figure 109145043-A0202-12-0300-467
<210> 368
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 368
Figure 109145043-A0202-12-0300-468
<210> 369
<211> 400
<212> DNA
<213> 智人
<400> 369
Figure 109145043-A0202-12-0300-469
Figure 109145043-A0202-12-0301-470
<210> 370
<211> 5
<212> RNA
<213> 智人
<400> 370
Figure 109145043-A0202-12-0301-471
<210> 371
<211> 6
<212> RNA
<213> 智人
<400> 371
Figure 109145043-A0202-12-0301-472
<210> 372
<211> 6
<212> RNA
<213> 智人
<400> 372
Figure 109145043-A0202-12-0301-473
<210> 373
<211> 6
<212> RNA
<213> 智人
<400> 373
Figure 109145043-A0202-12-0301-474
<210> 374
<211> 6
<212> RNA
<213> 智人
<400> 374
Figure 109145043-A0202-12-0302-475
<210> 375
<211> 6
<212> RNA
<213> 智人
<400> 375
Figure 109145043-A0202-12-0302-476
<210> 376
<211> 6
<212> RNA
<213> 智人
<400> 376
Figure 109145043-A0202-12-0302-477
<210> 377
<211> 6
<212> RNA
<213> 智人
<400> 377
Figure 109145043-A0202-12-0302-478
<210> 378
<211> 8
<212> RNA
<213> 智人
<400> 378
Figure 109145043-A0202-12-0302-479
<210> 379
<211> 5
<212> RNA
<213> 智人
<400> 379
Figure 109145043-A0202-12-0303-481
<210> 380
<211> 6
<212> RNA
<213> 智人
<400> 380
Figure 109145043-A0202-12-0303-482
<210> 381
<211> 6
<212> RNA
<213> 智人
<400> 381
Figure 109145043-A0202-12-0303-483
<210> 382
<211> 6
<212> RNA
<213> 智人
<400> 382
Figure 109145043-A0202-12-0303-484
<210> 383
<211> 5
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n為a,c,g,or u
<400> 383
Figure 109145043-A0202-12-0303-485
<210> 384
<211> 2
<212> RNA
<213> 智人
<400> 384
Figure 109145043-A0202-12-0304-486
<210> 385
<211> 437
<212> DNA
<213> 智人
<400> 385
Figure 109145043-A0202-12-0304-487
<210> 386
<211> 419
<212> DNA
<213> 智人
<400> 386
Figure 109145043-A0202-12-0304-488
<210> 387
<211> 442
<212> DNA
<213> 智人
<400> 387
Figure 109145043-A0202-12-0305-489
<210> 388
<211> 444
<212> DNA
<213> 智人
<400> 388
Figure 109145043-A0202-12-0305-490
<210> 389
<211> 443
<212> DNA
<213> 智人
<400> 389
Figure 109145043-A0202-12-0306-491
<210> 390
<211> 2
<212> RNA
<213> 智人
<400> 390
Figure 109145043-A0202-12-0306-492

Claims (46)

  1. 一種反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，係使由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA中的第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任2個以上編號順序為連續之外顯子同時地跳讀者，其中，
    前述反義寡聚物係包含與由領域R1至R24所構成之群組選擇之至少1個領域之鹼基序列或其部分鹼基序列互補的鹼基序列，前述領域R1至R24為由下列者所表示者：
    前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第NA號之外顯子之3’末端起至5’末端方向NX鹼基之鹼基序列以及第NB號之內含子之5’末端起至3’末端方向NY鹼基之鹼基序列所構成之領域Rn(n為1至23之奇數)，以及
    前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第NA號之內含子之3’末端起至5’末端方向NX鹼基之鹼基序列以及第NB號之外顯子之5’末端起至3’末端方向NY鹼基之鹼基序列所構成之領域Rn(n為2至24之偶數)，
    在此，
    n=1時，NA=44，NB=44，NX=20，以及NY=400，或
    n=2時，NA=44，NB=45，NX=600，以及NY=50，或
    n=3時，NA=45，NB=45，NX=20，以及NY=400，或
    n=4時，NA=45，NB=46，NX=400，以及NY=50，或
    n=5時，NA=46，NB=46，NX=20，以及NY=400，或
    n=6時，NA=46，NB=47，NX=400，以及NY=50，或
    n=7時，NA=47，NB=47，NX=20，以及NY=400，或
    n=8時，NA=47，NB=48，NX=400，以及NY=50，或
    n=9時，NA=48，NB=48，NX=20，以及NY=400，或
    n=10時，NA=48，NB=49，NX=400，以及NY=50，或
    n=11時，NA=49，NB=49，NX=20，以及NY=400，或
    n=12時，NA=49，NB=50，NX=400，以及NY=50，或
    n=13時，NA=50，NB=50，NX=20，以及NY=400，或
    n=14時，NA=50，NB=51，NX=400，以及NY=50，或
    n=15時，NA=51，NB=51，NX=20，以及NY=400，或
    n=16時，NA=51，NB=52，NX=400，以及NY=50，或
    n=17時，NA=52，NB=52，NX=20，以及NY=400，或
    n=18時，NA=52，NB=53，NX=400，以及NY=50，或
    n=19時，NA=53，NB=53，NX=20，以及NY=400，或
    n=20時，NA=53，NB=54，NX=400，以及NY=50，或
    n=21時，NA=54，NB=54，NX=20，以及NY=400，或
    n=22時，NA=54，NB=55，NX=400，以及NY=50，或
    n=23時，NA=55，NB=55，NX=20，以及NY=400，或
    n=24時，NA=55，NB=56，NX=400，以及NY=50。
  2. 如請求項1所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，
    領域R1係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第44號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第44號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R2係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第44號之內含子之3’末端起至5’末端方向600鹼基之鹼基序列以及第45號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R3係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第45號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R4係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第46號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R5係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第46號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第46號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R6係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第46號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第47號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R7係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第47號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第47號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R8係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第47號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第48號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R9係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第48號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第48號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R10係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第48號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第49號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R11係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第49號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第49號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R12係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第49號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第50號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R13係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第50號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第50號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R14係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第50號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第51號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R15係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第51號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第51號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R16係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第51號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第52號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R17係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第52號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第52號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R18係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第52號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第53號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R19係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第53號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第53號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R20係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第53號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第54號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R21係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第54號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第54號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R22係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第54號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第55號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域，
    領域R23係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第55號之外顯子之3’末端起至5’末端方向20鹼基之鹼基序列以及第55號之內含子之5’末端起至3’末端方向400鹼基之鹼基序列所構成之領域，或
    領域R24係前述人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第55號之內含子之3’末端起至5’末端方向400鹼基之鹼基序列以及第56號之外顯子之5’末端起至3’末端方向50鹼基之鹼基序列所構成之領域。
  3. 如請求項1或2所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，
    前述反義寡聚物係包含與下列者互補的鹼基序列：
    (a)由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列，
    (b)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列互補的鹼基序列和在嚴苛的條件下雜交之鹼基序列，
    (c)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列，或
    (d)由前述(a)、(b)及(c)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列之部分鹼基序列。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，
    前述反義寡聚物係2個以上之單元寡聚物所連結而成之反義寡聚物，
    前述各個單元寡聚物係包含與由前述領域R1至R24所構成之群組選擇之任1個領域之鹼基序列或其部分鹼基序列互補的鹼基序列，且各個單元寡聚物之鹼基序列並非為連續或相互重複者。
  5. 如請求項1至3中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，
    前述反義寡聚物係2個以上之單元寡聚物所連結而成之反義寡聚物，前述各個單元寡聚物係包含與下列者互補的鹼基序列：
    (a)由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列，
    (b)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列互補的鹼基序列和在嚴苛的條件下進行雜交之鹼基序列，
    (c)與由序列編號233至256、341至369以及385至389所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列，或
    (d)由前述(a)、(b)以及(c)所構成之群組選擇之任1個鹼基序列之部分鹼基序列，
    且各個單元寡聚物之鹼基序列並非為連續或相互重複者。
  6. 如請求項4或5所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，前述各個單元寡聚物係包含與前述領域中連續5至20鹼基長之鹼基序列互補的鹼基序列。
  7. 如請求項1至3中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，係由下列者所構成：
    (1)由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列，或
    (2)與由序列編號1至111、113至177、179、180、182、183、185至193、195至198、200至223以及225至232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列。
  8. 如請求項1至3及7中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，係包括由序列編號1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、 125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231以及232所構成之群組選擇之任1個鹼基序列。
  9. 如請求項1至3及7至8中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，係包括由序列編號1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225以及228所構成之群組選擇之任1個鹼基序列。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其係寡核苷酸。
  11. 如請求項10所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分以及/或磷酸鍵部分係經修飾。
  12. 如請求項10或11所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分為其2’位之-OH基由-OR、-R、-R’OR、-SH、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-N3、-CN、-F、-Cl、-Br以及-I所構成之群組選擇之任一基所置換之核糖，
    前述R係表示烷基或芳基，前述R’係表示伸烷基。
  13. 如請求項10至12中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸之磷酸鍵部分係由硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基磷酸酯鍵、氨基磷酸酯鍵、以及硼酸磷酸酯鍵所構成之群組選擇之任1個。
  14. 如請求項1至9中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其係N-嗎啉寡聚物。
  15. 如請求項14所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其係二胺基磷酸酯N-嗎啉寡聚物。
  16. 如請求項14或15所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，5’末端係下述化學式(1)至(3)中任一基，
    Figure 109145043-A0202-13-0009-493
  17. 一種抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，係抑制由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任1個外顯子單獨地進行跳讀，其中，
    前述抑制因子反義寡聚物係包含與下列者互補的鹼基序列：
    (a)由序列編號370至384所構成之群組選擇之鹼基序列之任1個鹼基序列，或
    (b)與由序列編號370至384所構成之群組選擇之鹼基序列之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列，或
    (c)前述(a)或(b)之鹼基序列之部分鹼基序列。
  18. 如請求項17所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，係包括：(1)由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列，或(2)與由序列編號257至275所構成之群組選擇之任1個鹼基序列具有85%以上之序列同一性，且與前述選擇之任1個鹼基序列之長度相比具有±15%以內之長度之鹼基序列。
  19. 如請求項17或18所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，係包括由序列編號260、261以及263所構成之群組選擇之任1個鹼基序列。
  20. 如請求項17至19中任一項所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其係寡核苷酸。
  21. 如請求項20所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分以及/或磷酸鍵部分係經修飾。
  22. 如請求項20或21所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分為其2’位之-OH基由-OR、-R、-R’OR、-SH、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-N3、-CN、-F、-Cl、-Br及-I所構成之群組選擇之任一基所置換之核糖，
    前述R係表示烷基或芳基，前述R’係表示伸烷基。
  23. 如請求項20至22中任一項所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸之磷酸鍵部分係由硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基磷酸酯鍵、胺基磷酸酯鍵以及硼酸磷酸酯鍵所構成之群組選擇之任1個。
  24. 如請求項17至19中任一項所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其係N-嗎啉寡聚物。
  25. 如請求項24所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其係二胺基磷酸酯N-嗎啉寡聚物。
  26. 如請求項24或25所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，其中，5’末端係下述化學式(1)至(3)中任一基，
    Figure 109145043-A0202-13-0011-494
  27. 一種醫藥組成物，係包含如請求項1至16中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
  28. 如請求項27所述之醫藥組成物，更包含如請求項17至26中任一項所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
  29. 一種醫藥組成物，係包含如請求項1至16中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，和如請求項17至26中任一項所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物。
  30. 如請求項28或29所述之醫藥組成物，其中，
    (1)前述反義寡聚物係由序列編號75所構成之寡聚物，前述抑制因子反義寡聚物係由序列編號260所構成之寡聚物，或
    (2)前述反義寡聚物係由序列編號75所構成之寡聚物，前述抑制因子反義寡聚物係由序列編號261所構成之寡聚物，或
    (3)前述反義寡聚物係由序列編號75所構成之寡聚物，前述抑制因子反義寡聚物係由序列編號263所構成之寡聚物。
  31. 如請求項27至30中任一項所述之醫藥組成物，更含有醫藥上可許容的擔體。
  32. 如請求項27至31中任一項所述之醫藥組成物，係用於肌肉萎縮症之治療。
  33. 如請求項27至32中任一項所述之醫藥組成物，係用以投與於人類患者。
  34. 一種肌肉萎縮症之治療方法，係包含將如請求項1至16中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，或如請求項27至33中任一項所述之醫藥組成物投與於肌肉萎縮症患者之步驟。
  35. 如請求項34所述之治療方法，其中，前述肌肉萎縮症患者為在肌肉萎縮蛋白基因具有成為外顯子45至55跳讀對象之變異之患者。
  36. 如請求項34或35所述之治療方法，其中，前述患者係人。
  37. 一種如請求項1至16中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，或如請求項27至33中任一項所述之醫藥組成物的用途，其係用於製造肌肉萎縮症治療用醫藥。
  38. 如請求項1至16中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物，或如請求項27至33中任一項所述之醫藥組成物，其係使用在肌肉萎縮症治療。
  39. 如請求項38所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物或醫藥組成物，其中，前述治療係伴隨由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇之任2個以上編號順序為連續之外顯子的跳讀者。
  40. 如請求項38或39所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物或醫藥組成物，其中，前述治療中，肌肉萎縮症患者係人。
  41. 一種使外顯子跳讀之效率增加之方法，該方法係包含在跳讀目的pre-mRNA之2個以上編號順序為連續之外顯子時，阻礙前述目的pre-mRNA之剪接緘默子序列、剪接部位序列或分支部位序列之步驟，而使前述2個以上編號順序為連續之外顯子跳讀之效率增加。
  42. 如請求項41所述之方法，其中，前述剪接緘默子序列係異質核核醣核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1(hnRNPA1))之辨識序列。
  43. 如請求項41或42所述之方法，其中，前述目的pre-mRNA係人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA。
  44. 如請求項41至43中任一項所述之方法，其中，前述2個以上編號順序為連續之外顯子係由人肌肉萎縮蛋白pre-mRNA之第45號之外顯子起至第55號之外顯子所構成之群組選擇。
  45. 如請求項44所述之方法，其中，前述目的pre-mRNA之2個以上編號順序為連續之外顯子之跳讀係使用如請求項1至16中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物進行。
  46. 如請求項44或45所述之方法，其中，特異性地阻礙前述剪接緘默子序列、剪接部位序列或分支部位序列之步驟，係使用如請求項17至26中任一項所述之抑制因子反義寡聚物或其醫藥上可容許的鹽或此等的水合物進行。
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