TWI726914B - 肌萎縮症治療用反義核酸 - Google Patents
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Abstract
本發明冀求可在mRNA層次抑阻肌肉生長抑制素的新穎反義核酸等。
本發明提供可使肌肉生長抑制素基因第2號外顯子跳讀，誘導肌肉生長抑制素基因的mRNA分解之特定反義寡聚物。
Description
本發明係有關於可使肌肉生長抑制素基因之第2號外顯子(exon)跳讀(skipping)的反義寡聚物、及含該寡聚物之醫藥組成物。
肌肉生長抑制素(又稱，GDF-8)，係於1997年所發現屬於TGF-β-超級家族(super family)的新穎細胞激素。表現組織特異性地為運動及代謝活動的主要負責組織之骨骼肌。肌肉生長抑制素缺損變異的動物，由於骨骼肌量呈現增大為野生型的2倍量之顯著地肌肉肥大，因此肌肉生長抑制素被認為係骨骼肌量的負調控因子。
由於上述發現，一般認為抑阻肌肉生長抑制素可作為肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病的治療策略。骨骼肌的萎縮，不僅因肌力降低而限制日常生活動作，亦引發營養不良及呼吸衰竭等嚴重的全身併發症。作為治療策略的對象疾病，一般認為包含肌營養不良症、先天性肌病變、包涵體肌炎等肌原性肌萎縮症，肌萎縮性側索硬化症、脊髓性肌萎縮症、脊髓延髓肌萎縮症等神經原性肌萎縮症，腦中
風引發的廢用症候群等廢用性肌萎縮症，癌惡病質、敗血症所伴隨之肌萎縮等肌消耗性疾病，伴隨老化之老年性骨骼肌少症(老年性骨骼肌少症)的各種肌少症等。
人類的肌肉生長抑制素基因係位於第2號染色體的長臂。由構成要件的3個外顯子轉錄股長約2.8千鹼基的成熟mRNA，再轉譯為包含375個胺基酸殘基之前驅體多胜肽。肌肉生長抑制素前驅體多胜肽經由C末端功能域(domain)間之雙硫鍵形成2聚體之後，再於內質網(endoplasmic reticulum)中經由Furin家族的蛋白酶，在第266號與第267號的胺基酸殘基(R-D)之間切斷，分割為N-末端側之原胜肽(propeptide)及之後功能為活性型肌肉生長抑制素的C-末端功能域2聚體。該等胜肽藉由非共價鍵結合，以非活性型複合體分泌至細胞外。該複合體，再藉由BMP1/Tolloid家族的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase)，在第98號與第99號的胺基酸殘基(R-D)之間切斷N-末端原胜肽而解開結合，出現活性型肌肉生長抑制素之2聚體。
近年來，設計、化學合成以與mRNA前驅體的一部分互補結合的短反義人工核酸，以mRNA的機能阻礙為目標之反義核酸醫藥受到注意。在正常之基因轉錄機制中，mRNA前驅體之內含子(intron)，係由稱為剪接體的酵素複合體切斷、去除，而生成成熟mRNA。外顯子跳讀反義核酸，係藉由改變經由該剪接體之剪接調節機制，誘導與正常之成熟mRNA不同的mRNA生成，而抑阻該基因機能者。同時，mRNA，在剪接體以外，亦可經由與mRNA安
定化蛋白及表現轉譯調節因子(包含miRNA)等結合，而調節mRNA之分解、表現、轉譯。因此推想反義核酸，藉由此種抑阻mRNA結合蛋白質對目標mRNA之結合，而抑阻該基因之機能。
其中，肌肉生長抑制素的外顯子跳讀反義核酸已知有數種(專利文獻1至3及非專利文獻1至4)。
[專利文獻1]US 2013/0085139A1
[專利文獻2]WO 2006/086667A2
[專利文獻3]特開2007-104971
[非專利文獻1]Kang JK et al., Mol. Ther. (2011) 19(1): 159-164
[非專利文獻2]Kemaladewi et al., BMC Med. Genomics. (2011) 4: 36
[非專利文獻3]Alberto Malerba et al., Mol. Ther. Nucleic Acids. (2012) 1: e62
[非專利文獻4]Bestas B et al., Nucleic Acid Ther. (2014) 24(1): 13-24
在如上述之情形下，冀求於mRNA層次抑阻肌肉生長抑制素的新穎反義核酸。
本發明人等，為解決上述問題再三刻意研究之結果，發現使用對肌肉生長抑制素基因為特定之機能抑阻的反義核酸時，可有效率地於mRNA層次抑阻肌肉生長抑制素，而完成本發明。
亦即，本發明為下述之諸項。
一種反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，前述反義寡聚物係將(a)包含與人類或小鼠的肌肉生長抑制素基因第2號外顯子內連續7至15鹼基的第1核苷酸序列為互補之鹼基序列的第1單元寡聚物；及(b)包含與前述第2號外顯子內連續7至15鹼基的第2核苷酸序列互補之鹼基序列的第2單元寡聚物連結而成之14至30鹼基長的反義寡聚物，且前述第1核苷酸序列及第2核苷酸序列不為連續或互相重複者。
如前述[1]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述反義寡聚物，為下述之(c)或(d)，(c)將自下述之(c-1)至(c-6)之單元寡聚物所成之群組選擇的2個單元寡聚物連結而成之14至30鹼基長的反義寡聚物：(c-1)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯
子的5'末端算起第-10號至第45號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基的核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(c-2)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第91號至第135號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(c-3)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第121號至第155號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(c-4)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第166號至第210號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(c-5)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第204號至第233號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、及(c-6)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第326號至第374號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物；(d)將自下述之(d-1)至(d-7)之單位寡聚物所成群組選擇的2個單位寡聚物連結而成之14至30鹼基長的反義寡聚物：(d-1)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第65號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(d-2)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第91號至第135號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(d-3)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第121號至第155號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(d-4)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第151號至第210號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(d-5)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第196號至第233好核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(d-6)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第266號至第295號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、及(d-7)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第326號至第374號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物；
如前述[1]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，前述反義寡聚物係下述之(e)或(f)，(e)將自下述之(e-1)至(e-6)之單位寡聚物所成之群組選擇的2個單元寡聚物連結而成之14至30鹼基長的反義寡聚物：(e-1)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第-4號至第25號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基的核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(e-2)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第112號至第131號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基的核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(e-3)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第128號至第142號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基的核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(e-4)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第169號至第206號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基的核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(e-5)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第209號至第228號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基的核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、及(e-6)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第331號至第365號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基的核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物；
(f)將自下述之(f-1)至(f-7)之單位寡聚物所成群組選擇的2個單元寡聚物連結而成之14至30鹼基長的反義寡聚物：(f-1)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第1號至第18號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(f-2)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子自5'末端算起第116號至第131號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(f-3)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第130號至第140號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(f-4)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第160號至第206號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(f-5)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第211號至第225號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(f-6)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第271號至第282號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、及(f-7)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第341號至第365號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物；
如前述[2]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述(c)之反義寡聚物係包含自序列編號103(NMS-48)、序列編號116(NMS-89)、序列編號117(NMS-90)、序列編號120(NMS-93)、序列編號128(NMS-101)、序列編號131(NMS-104)、序列編號136(NMS-113)、序列編號137(NMS-117)、序列編號140(NMS-123)、序列編號145(NMS-136)、序列編號146(NMS-139)、序列編號147(NMS-140)、序列編號148(NMS-141)、序列編號149(NMS-142)、序列編號152(NMS-145)、序列編號155(NMS-148)、序列編號156(NMS-149)、序列編號157(NMS-150)、序列編號159(NMS-152)、序列編號162(NMS-156)、序列編號163(NMS-157)、序列編號165(NMS-162)、序列編號166(NMS-163)、序列編號167(NMS-164)、序列編號168(NMS-166)、序列編號169(NMS-167)、序列編號170(NMS-168)、序列編號171(NMS-169)、序列編號176(NMS-174)、序列編號177(NMS-175)、序列編號178(NMS-176)、序列編號179(NMS-177)、序列編號180(NMS-178)、序列編號183(NMS-181)、序列編號187(NMS-185)、序列編號189(NMS-188)、序列編號190(NMS-189)、序列編號191(NMS-190)、序列編號192(NMS-191)、序列編號193(NMS-192)、序列編號196(NMS-195)、序列編號199(NMS-198)、序列編號200(NMS-199)、序列編號201(NMS-200)、序列編號203(NMS-202)、
序列編號204(NMS-203)、序列編號206(NMS-206)、序列編號208(NMS-208)、序列編號212(NMS-212)、序列編號213(NMS-213)、序列編號214(NMS-214)、序列編號215(NMS-215)、序列編號217(NMS-217)、序列編號225(NMS-225)、序列編號226(NMS-228)、序列編號228(NMS-230)、序列編號229(NMS-231)、序列編號231(NMS-233)、序列編號232(NMS-234)、序列編號233(NMS-235)、序列編號236(NMS-240)、序列編號237(NMS-241)、序列編號240(NMS-244)、序列編號243(NMS-247)、序列編號244(NMS-248)、序列編號245(NMS-249)、序列編號246(NMS-250)、序列編號247(NMS-251)、序列編號248(NMS-252)、序列編號252(NMS-256)、序列編號261(NMS-272)、序列編號273(NMS-284)、序列編號274(NMS-285)、序列編號275(NMS-286)及序列編號277(NMS-297)所成之群組選擇的任意1種鹼基序列。
[5]
如前述[2]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述(d)之反義寡聚物係包含自序列編號95(NMS-38)、序列編號96(NMS-39)、序列編號107(NMS-66)、序列編號223(NMS-223)、序列編號234(NMS-238)、序列編號235(NMS-239)、序列編號242(NMS-246)、序列編號249(NMS-253)、序列編號250(NMS-254)、序列編號251(NMS-255)、序列編號257(NMS-268)、序列編號(NMS-280)、序列編號(NMS-281)、序列編號(NMS-282)、序列編號(NMS-288)、序列編號(NMS-289)、序列編號(NMS-290)、
序列編號(NMS-292)、序列編號(NMS-293)、序列編號(NMS-294)、序列編號(NMS-295)、序列編號(NMS-298)、序列編號(NMS-299)、序列編號(NMS-300)、序列編號(NMS-302)及序列編號(NMS-303)所成之群組選擇的任意1種鹼基序列。
如前述[1]項至[5]項之任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述反義寡聚物為寡核苷酸。
如前述[6]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸的糖部分及/或至少1個磷酸鍵結部分係經修飾。
如前述[7]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸的糖部分為2'位之-OH基經選自OR、R、R'OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br及I所成群組的任意之基取代的核糖，(上述R表示烷基或芳基，上述R'表示伸烷基。)
如前述[7]項或[8]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸的磷酸鍵結部分係自硫代磷酸酯(phosphorothioate)鍵、二硫
代磷酸酯(phosphorodithioate)鍵、烷基膦酸酯(alkylphosphonate)鍵、胺基磷酸酯(phosphoramidate)鍵、及硼烷膦酸(boranophosphate)鍵所成之群組選擇的任意1種。
如前述[1]項至[5]項之任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述反義寡聚物為N-嗎啉基寡聚物。
如前述[10]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述N-嗎啉基寡聚物為二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物。
如前述[10]項或[11]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中5'末端為下述化學式(1)至化學式(3)之任意之基。
如前述[4]項、[6]項至[12]項之任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述反義寡聚物包含自序列編號171(NMS-169)、序列編號192(NMS-191)、序列編號
245(NMS-249)、及序列編號231(NMS-233)所成之群組選擇的任意1種鹼基序列。
一種醫藥組成物，其係含有如前述[3]項至[13]項之任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物。
如前述[14]項記載之醫藥組成物，其更含有醫藥上容許之支持體。
如前述[14]項或[15]項記載之醫藥組成物，其係肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病之治療用。
如前述[16]項記載之醫藥組成物，其係肌營養不良症治療用。
一種肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病的預防或治療之方法，其係包含對需要預防或治療肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病的對象，以治療上有效量的如前述[1]項至[13]項之任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物進行投藥。
如前述[18]項記載之方法，其中肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病為肌營養不良症。
如前述[18]項或[19]項記載之方法，其中對象為人類。
如前述[1]項至[13]項之任一項記載的反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物之用途，其係用於肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病之治療用醫藥組成物之製造。
如前述[1]項至[13]項之任一項記載的反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其係使用於肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病的治療。
一種反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，前述反義寡聚物係選擇自下述的(A)至(H)所成群組的任意1種，(A)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第45號核苷酸序列選擇的連續14至30鹼基長的核苷酸序列互補的鹼基序列之反義寡聚物，(B)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第91號至第145號核苷酸序列選擇的連續14至30鹼基長的核苷酸序列互補的鹼基序列之反義寡聚物，(C)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第146號至第180號核苷酸序列選擇的連續14至30鹼基長的核苷酸序列互補的鹼基序列之反義寡聚物，(D)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯
子的5'末端算起第331號至第374號核苷酸序列選擇的連續14至30鹼基長的核苷酸序列互補的鹼基序列之反義寡聚物，(E)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第31號核苷酸序列選擇的連續14至30鹼基長的核苷酸序列互補的鹼基序列之反義寡聚物，(F)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第111號至第162號核苷酸序列選擇的連續14至30鹼基長的核苷酸序列互補的鹼基序列之反義寡聚物，(G)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第166號至第195號核苷酸序列選擇的連續14至30鹼基長的核苷酸序列互補的鹼基序列之反義寡聚物，及(H)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第331號至第374號核苷酸序列選擇的連續14至30鹼基長的核苷酸序列互補的鹼基序列之反義寡聚物
一種反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，前述反義寡聚物係包含選擇自下述之(I)至(L)所成之群組之任意一種。
(I)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第31號核苷酸序列選擇的連續14
至30鹼基長的核苷酸序列互補的鹼基序列之反義寡聚物，(J)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第111號至第140號核苷酸序列選擇的連續14至30鹼基長的核苷酸序列互補的鹼基序列之反義寡聚物，前述14至30鹼基長的核苷酸序列之3'末端的鹼基為自前述第2號外顯子的5'末端的第140號鹼基，(K)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第146號至第180號核苷酸序列選擇的連續14至30鹼基長的核苷酸序列互補的鹼基序列之反義寡聚物，及(L)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第331號至第374號核苷酸序列選擇的連續14至30鹼基長的核苷酸序列互補的鹼基序列之反義寡聚物
如前述[23]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述(A)之反義寡聚物係包含自序列編號13(NMS-17)、序列編號76(NMS-138)、序列編號68(NMS-120)、序列編號75(NMS-137)、序列編號51(NMS-76)、序列編號52(NMS-79)、序列編號54(NMS-81)、序列編號55(NMS-82)、序列編號56(NMS-83)、序列編號53(NMS-80)、序列編號33(NMS-49)、序列編號63(NMS-114)、序列編號69(NMS-124)、序列編號70(NMS-125)、序列編號61(NMS-110)、序列編號31(NMS-46)、序列編號34(NMS-50)、序列
編號50(NMS-75)、序列編號45(NMS-67)及序列編號64(NMS-115)所成之群組選擇之任意1種鹼基序列。
如前述[23]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述(B)之反義寡聚物係包含自序列編號3(NMS-6)、序列編號66(NMS-118)、序列編號67(NMS-119)、序列編號28(NMS-33)、序列編號72(NMS-127)、序列編號16(NMS-20)、序列編號82(NMS-187)及序列編號25(NMS-30)所成之群組選擇的任意1種鹼基序列。
如前述[23]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述(C)之反義寡聚物係包含序列編號12(NMS-16)之鹼基序列。
如前述[23]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述(D)之反義寡聚物係包含序列編號4(NMS-7)之鹼基序列。
如前述[23]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述(E)之反義寡聚物係包含序列編號90(NMS-51)之鹼基序列。
如前述[23]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述(F)之反義寡聚物係包含自序列編號
91(NMS-52)、序列編號28(NMS-33)及序列編號25(NMS-30)、序列編號41(NMS-61)、序列編號24(NMS-29)、序列編號42(NMS-62)、序列編號43(NMS-63)、序列編號11(NMS-15)、序列編號67(NMS-119)、序列編號80(NMS-161)、以及序列編號82(NMS-187)所成之群組選擇之任意1種鹼基序列。
如前述[23]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述(G)之反義寡聚物係包含序列編號7(NMS-10)之鹼基序列。
如前述[23]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述(H)之反義寡聚物係包含自序列編號4(NMS-7)、序列編號9(NMS-12)、序列編號10(NMS-14)及序列編號14(NMS-18)所成之群組選擇的任意1種鹼基序列。
如前述[23]項至[32]項之任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，前述反義寡聚物係寡核苷酸。
如前述[33]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中構成前述寡核苷酸的至少1個核苷酸的糖部分及/或至少1個磷酸鍵結部分受修飾。
如前述[34]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中構成前述寡核苷酸的至少1核苷酸的糖部
分，為2'位之-OH基經選自OR、R、R'OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br及I所成群組的任意之基取代的核糖。
(上述R表示烷基或芳基，上述R'表示伸烷基。)
如前述[34]項或[35]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸的磷酸鍵結部分包含自：硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基膦酸鍵、胺基磷酸酯鍵、及硼烷膦酸鍵所成之群組選擇的任意1種。
如前述[23]項至[32]項之任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述反義寡聚物為N-嗎啉基寡聚物。
如前述[37]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述N-嗎啉基寡聚物為二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物。
如前述[37]項或[38]項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中5'末端為下述化學式(1)至化學式(3)之任意之基。
一種醫藥組成物，其含有如前述[23]項至[39]項之任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物。
如前述[40]項記載之醫藥組成物，其更含有醫藥上容許之支持體。
如前述[40]項或[41]項記載之醫藥組成物，其係肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病之治療用。
如前述[42]項記載之醫藥組成物，其係肌營養不良症治療用。
一種肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病的預防或治療之方法，其係包含對需要預防或治療肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病的對象，以治療上有效量的如前述[23]項至[39]項中任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物進行投藥。
如前述[44]項記載之方法，其中肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病為肌營養不良症。
如前述[44]項或[45]項記載之方法，其中對象為人類。
如前述[23]項至[39]項之任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物之使用，其係用於肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病之治療用醫藥組成物之製造。
如前述[23]項至[39]項之任一項記載之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其係使用於治療肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病。
本發明各實施態樣之反義寡聚物，可誘導肌肉生長抑制素基因的外顯子跳讀。而且，藉由本發明的較佳態樣之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或水合物投藥至肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病的預防或治療為必要的對象，可預防或治療肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病。
第1圖所示為人類橫紋肌肉瘤細胞株(RD細胞)中人類肌肉生長抑制素基因之外顯子2的跳讀效率圖。
第2圖所示為人類橫紋肌肉瘤細胞株(RD細胞)中人類肌肉生長抑制素基因之外顯子2的跳讀效率圖。
第3圖所示為人類橫紋肌肉瘤細胞株(RD細胞)中人類肌肉生長抑制素基因之外顯子2的跳讀效率圖。
第4圖所示為人類橫紋肌肉瘤細胞株(RD細胞)中人類肌肉生長抑制素基因之外顯子2的跳讀效率圖。
第5圖所示為人類橫紋肌肉瘤細胞株(RD細胞)中人類肌肉生長抑制素基因之外顯子2的跳讀效率圖。
第6圖所示為人類橫紋肌肉瘤細胞株(RD細胞)中人類肌肉生長抑制素基因之外顯子2的跳讀效率圖。
第7圖所示為人類橫紋肌肉瘤細胞株(RD細胞)中人類肌肉生長抑制素基因之外顯子2的跳讀效率圖。
第8圖所示為人類橫紋肌肉瘤細胞株(RD細胞)中人類肌肉生長抑制素基因之外顯子2的跳讀效率圖。
第9圖所示為人類橫紋肌肉瘤細胞株(RD細胞)中人類肌肉生長抑制素基因之外顯子2的跳讀效率圖。
第10圖所示為人類橫紋肌肉瘤細胞株(RD細胞)中人類肌肉生長抑制素基因之外顯子2的跳讀效率圖。
第11圖所示為人類橫紋肌肉瘤細胞株(RD細胞)中人類肌肉生長抑制素基因之外顯子2的跳讀效率圖。
第12圖所示為人類橫紋肌肉瘤細胞株(RD細胞)中人類肌肉生長抑制素基因之外顯子2的跳讀效率圖。
第13圖所示為人類橫紋肌肉瘤細胞株(RD細胞)中人類肌肉生長抑制素基因之外顯子2的跳讀效率圖。
第14圖所示為人類橫紋肌肉瘤細胞株(RD細胞)中人類肌肉生長抑制素基因之外顯子3的跳讀效率圖。
第15圖所示為試驗例2的結果圖。
以下，詳細說明本發明。惟以下之實施形態，係例舉以說明本發明，本發明之概念並不單限定於此實施形態。本發明，在不脫離其概念之下，亦可以各種形態實施。
再者，本說明書中所引用之所有文獻、及公開公報、專利公報的其他專利文獻，亦併入於本說明書中以供參考。又，本說明書，亦包含2015年9月16日提出申請之本申請案主張優先權之基礎的日本專利申請案(特願2015-18214號)之說明書及圖式所記載之內容。
本發明，係提供可使人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子跳讀的反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物(以下，總稱為「本發明之反義寡聚物」)。
以下之「本發明之反義寡聚物A」及「本發明之反義寡聚物B」，有時亦總稱為「本發明之反義寡聚物」。
本發明之反義寡聚物A，係連結自以下的(a)及(b)所成之群組選擇的2個單元寡聚物之14至30鹼基長之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物。
(a)包含與人類或小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子內連續7至15鹼基的第1核苷酸序列互補的鹼基序列的第1單元寡聚物；及
(b)包含與前述第2外顯子內連續7至15鹼基的第2核苷酸序列互補的鹼基序列的第2單元寡聚物其中，前述第1核苷酸序列及第2核苷酸序列並不連續或互相重複。
本發明之反義寡聚物A，具體地為以下之(c)或(d)之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物。
(c)連結自下述之(c-1)至(c-6)單元寡聚物所成之群組選擇的2個單元寡聚物之14至30鹼基長的反義寡聚物：(c-1)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第45號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基的核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(c-2)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第91號至第135號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(c-3)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第121號至第155號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(c-4)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第166號至第210號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(c-5)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第204號至第233號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、及(c-6)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第326號至第374號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物；(d)連結自下述之(d-1)至(d-7)單元寡聚物所成之群組選擇的2個單元寡聚物之14至30鹼基長的反義寡聚物：(d-1)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第-1號至第65號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(d-2)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第91號至第135號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(d-3)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第121號至第155號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(d-4)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第151號至第210號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(d-5)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第196號至第233號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(d-6)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第266號至第295號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、及(d-7)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第326號至第374號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物
又，本發明之反義寡聚物A，具體地係以下之(e)或(f)之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物。
(e)連結自下述之(e-1)至(e-6)單元寡聚物所成之群組選擇的2個單元寡聚物之14至30鹼基長的反義寡聚物：(e-1)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第-4號至第25號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基的核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(e-2)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第112號至第131號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基的核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(e-3)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第128號至第142號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基的核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(e-4)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第169號至第206號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基的核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(e-5)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第209號至第228號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基的核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、及(e-6)包含與自人類肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第331號至第365號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基的核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物；(f)連結自下述之(f-1)至(f-7)單元寡聚物所成之群組選擇的2個單元寡聚物之14至30鹼基長的反義寡聚物：(f-1)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第1號至第18號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(f-2)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第116號至第131號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(f-3)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第130號至第140號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、(f-4)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第160號至第206號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物、及
(f-5)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第211號至第225號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物(f-6)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第271號至第282號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物(f-7)包含與自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子的5'末端算起第341號至第365號核苷酸序列選擇的連續7至15鹼基核苷酸序列互補的鹼基序列之單元寡聚物
本發明之反義寡聚物A中，「基因」，除基因組以外，亦包含cDNA、mRNA前驅體及mRNA。該基因，以mRNA前驅體，亦即，pre-mRNA較佳。
肌肉生長抑制素基因的轉錄物之pre-mRNA，以(5'末端)第1號外顯子-第1號內含子-第2號外顯子-第2號內含子-第3號外顯子(3'末端)之順序包含3個外顯子及2個內含子。pre-mRNA，經過剪接而生成成熟之mRNA。人類及小鼠之野生型肌肉生長抑制素基因的鹼基序列為一般已知(分別為：RefSeq Accession No.NM 005259(人類)；及RefSeq Accession No.NM 010834(小鼠))。野生型肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子之鹼基序列如下。
第2號外顯子(人類)：序列編號323；及第2號外顯子(小鼠)：序列編號324
在前述(c-1)的單元寡聚物中，「自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第
45號核苷酸序列」，係表示為序列編號337。
在前述(c-2)的單元寡聚物中，「自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第91號至第135號核苷酸序列」，係表示為序列編號338。
在前述(c-3)的單元寡聚物中，「自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第121號至第155號核苷酸序列」，係表示為序列編號339。
在前述(c-4)的單元寡聚物中，「自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第166號至第210號核苷酸序列」，係表示為序列編號340。
在前述(c-5)的單元寡聚物中，「自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第204號至第233號核苷酸序列」，係表示為序列編號341。
在前述(c-6)的單元寡聚物中，「自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第326號至第374號核苷酸序列」，係表示為序列編號342。
在前述(d-1)的單元寡聚物中，「自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第65號核苷酸序列」，係表示為序列編號343。
在前述(d-2)的單元寡聚物中，「自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第91號至第135號核苷酸序列」，係表示為序列編號344。
在前述(d-3)的單元寡聚物中，「自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第121號至第155號核
苷酸序列」，係表示為序列編號345。
在前述(d-4)的單元寡聚物中，「自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第151號至第210號核苷酸序列」，係表示為序列編號346。
在前述(d-5)的單元寡聚物中，「自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第196號至第233號核苷酸序列」，係表示為序列編號347。
在前述(d-6)的單元寡聚物中，「自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第266號至第295號核苷酸序列」，係表示為序列編號364。
在前述(d-7)的單元寡聚物中，「自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第326號至第374號核苷酸序列」，係表示為序列編號348。
在前述(e-1)的單元寡聚物中，「自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-4號至第25號核苷酸序列」，係表示為序列編號349。
在前述(e-2)的單元寡聚物中，「自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第112號至第131號核苷酸序列」，係表示為序列編號350。
在前述(e-3)的單元寡聚物中，「自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第128號至第142號核苷酸序列」，係表示為序列編號351。
在前述(e-4)的單元寡聚物中，「自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第169號至第206號核苷
酸序列」，係表示為序列編號352。
在前述(e-5)的單元寡聚物中，「自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第209號至第228號核苷酸序列」，係表示為序列編號353。
在前述(e-6)的單元寡聚物中，「自人類肌肉生長抑制素基因第2外顯子的5'末端算起第331號至第365號核苷酸序列」，係表示為序列編號354。
在前述(f-1)的單元寡聚物中，「自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第1號至第18號核苷酸序列」，係表示為序列編號355。
在前述(f-2)的單元寡聚物中，「自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第116號至第131號核苷酸序列」，係表示為序列編號356。
在前述(f-3)的單元寡聚物中，「自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第130號至第140號核苷酸序列」，係表示為序列編號357。
在前述(f-4)的單元寡聚物中，「自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第160號至第206號核苷酸序列」，係表示為序列編號358。
在前述(f-5)的單元寡聚物中，「自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第211號至第225號核苷酸序列」，係表示為序列編號359。
在前述(f-6)的單元寡聚物中，「自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第271號至第282號核苷
酸序列」，係表示為序列編號365。
在前述(f-7)的單元寡聚物中，「自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第341號至第365號核苷酸序列」，係表示為序列編號366。
本發明之反義寡聚物A，係以使小鼠肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子跳讀，而使肌肉生長抑制素基因所譯碼的蛋白質，改變為不具有肌肉生長抑制素機能之變異蛋白質為目的而製作。「肌肉生長抑制素的機能」，係指如負向調控骨骼肌量之機能或活性。成為本發明之反義寡聚物A外顯子跳讀對象的肌肉生長抑制素基因第2號外顯子，不只為野生型，亦包含變異型。
變異型的肌肉生長抑制素基因第2號外顯子或其部分，具體上，為下述(a)或(b)所記載之多核苷酸。
(a)與包含自序列編號323(人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子)、序列編號337(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第45號核苷酸序列)、序列編號338(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第91號至第135號核苷酸序列)、序列編號339(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第121號至第155號核苷酸序列)、序列編號340(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第166號至第210號核苷酸序列)、序列編號341(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第204號至第233號核苷酸序列)、序列編號342(自人類肌肉生長抑
制素基因第2號外顯子的5'末端算起第326號至第374號核苷酸序列)、序列編號349(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-4號至第25號核苷酸序列)、序列編號350(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第112號至第131號核苷酸序列)、序列編號351(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第128號至第142號核苷酸序列)、序列編號352(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第169號至第206號核苷酸序列)、序列編號353(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第209號至第228號核苷酸序列)、序列編號354(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第365號核苷酸序列)、序列編號324(小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子)、序列編號343(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第65號核苷酸序列)、序列編號344(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第91號至第135號核苷酸序列)、序列編號345(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第121號至第155號核苷酸序列)及序列編號346(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第151號至第210號核苷酸序列)、序列編號347(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第196號至第233號核苷酸序列)、序列編號364(小鼠肌肉生長抑制素基因第2外顯子自5'末端算起第266至第295核苷酸序列)、序列編號348(自
小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第326號至第374號核苷酸序列)、序列編號355(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第1號至第18號核苷酸序列)、序列編號356(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第116號至第131號核苷酸序列)、序列編號357(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第130號至第140號核苷酸序列)、序列編號358(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第160號至第206號核苷酸序列)、序列編號359(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子自5'末端算起第211號至第255號核苷酸序列)、序列編號365(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第271號至第282號核苷酸序列)及序列編號366(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第341號至第365號核苷酸序列)所成之群組選擇之任意一鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸，在嚴苛雜合條件條件下可雜合之多核苷酸；(b)包含對於自序列編號323(人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子)、序列編號337(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第45號核苷酸序列)、序列編號338(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第91號至第135號核苷酸序列)、序列編號339(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第121號至第155號核苷酸序列)、序列編號340(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第166
號至第210號核苷酸序列)、序列編號341(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第204號至第233號核苷酸序列)、序列編號342(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第326號至第374號核苷酸序列)、序列編號349(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-4號至第25號核苷酸序列)、序列編號350(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第112號至第131號核苷酸序列)、序列編號351(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第128號至第142號核苷酸序列)、序列編號352(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第169號至第206號核苷酸序列)、序列編號353(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第209號至第228號核苷酸序列)、序列編號354(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第365號核苷酸序列)、序列編號324(小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子)、序列編號343(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第65號核苷酸序列)、序列編號344(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第91號至第135號核苷酸序列)、序列編號345(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子自5'末端算起第121號至第155號核苷酸序列)及序列編號346(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第151號至第210號核苷酸序列)、序列編號347(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的
5'末端算起第196號至第233號核苷酸序列)、序列編號364(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第266號至第295號核苷酸序列)、序列編號348(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第326號至第374號核苷酸序列)、序列編號355(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第1號至第18號核苷酸序列)、序列編號356(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第116號至第131號核苷酸序列)、序列編號357(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第130號至第140號核苷酸序列)、序列編號358(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第160號至第206號核苷酸序列)、序列編號359(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第211號至第255號核苷酸序列)、序列編號365(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第271號至第282號核苷酸序列)及序列編號366(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第341號至第365號核苷酸序列)所成之群組選擇之任意之鹼基序列，具有90%以上相同性之鹼基序列之多核苷酸
本說明書中，「多核苷酸」，意指DNA或RNA。
本說明書中，「互補的鹼基序列」，並不限定為可與成為對象之鹼基序列形成華特生-克里克鹼基對的鹼基序列，亦包含可形成搖擺鹼基對(Wobble base pair)之鹼基序
列。其中，華特生-克里克鹼基對，意指在腺嘌呤-胸腺嘌呤、腺嘌呤-尿嘧啶及鳥嘌呤-胞嘧啶之間形成氫鍵之鹼基對；搖擺鹼基對，意指在鳥嘌呤-尿嘧啶、肌苷-尿嘧啶、肌苷-腺嘌呤及肌苷-胞嘧啶之間形成氫鍵之鹼基對。又，「互補的鹼基序列」，亦可指與對象鹼基序列並未有100%之互補性，例如對於成為對象之鹼基序列，亦可含有1至3個、1至2個或1個非互補之鹼基。
本說明書中，「在嚴苛雜合條件下雜合之多核苷酸」，係指如以包含與自序列編號323(人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子)、序列編號337(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第45號核苷酸序列)、序列編號338(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第91號至第135號核苷酸序列)、序列編號339(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第121號至第155號核苷酸序列)、序列編號340(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第166號至第210號核苷酸序列)、序列編號341(自人類肌肉生長抑制素基因第2烙外顯子的5'末端算起第204號至第233號核苷酸序列)、序列編號342(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第326號至第374號核苷酸序列)、序列編號349(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-4號至第25號核苷酸序列)、序列編號350(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第112號至第131號核苷酸序列)、序列編號
351(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第128號至第142號核苷酸序列)、序列編號352(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第169號至第206號核苷酸序列)、序列編號353(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第209號至第228號核苷酸序列)、序列編號354(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第365號核苷酸序列)、序列編號324(小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子)、序列編號343(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第65號核苷酸序列)、序列編號344(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第91號至第135號核苷酸序列)、序列編號345(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第121號至第155號核苷酸序列)及序列編號346(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第151號至第210號核苷酸序列)、序列編號347(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第196號至第233號核苷酸序列)、序列編號364(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第266號至第295號核苷酸序列)、序列編號348(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第326號至第374號核苷酸序列)、序列編號355(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第1號至第18號核苷酸序列)、序列編號356(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第116號至第131號
核苷酸序列)、序列編號357(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子5'末端算起第130號至第140號核苷酸序列)、序列編號358(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第160號至第206號核苷酸序列)、序列編號359(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第211號至第255號核苷酸序列)、序列編號365(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第271號至第282號核苷酸序列)及序列編號366(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第341號至第365號核苷酸序列)所成之群組選擇之任意之鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸之全部或部分作為探針，並以菌落雜合法、溶菌斑雜合法或南氏雜合法等所得之反義寡聚物。雜合之方法方面，可利用如，"Sambrook & Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Fourth Edition),Cold Spring Harbor,Laboratory Press 2012"、"Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons 1987-1997"等之中記載的方法。
本說明書中，「嚴苛雜合條件」，可包含任意之低嚴苛雜合條件、中嚴苛雜合條件及高嚴苛雜合條件。「低嚴苛雜合條件」，指如5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、32℃之條件。又，「中嚴苛雜合條件」，指如5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、42℃或5×SSC、1%SDS、50mM Tris-HCl(pH7.5)、50%甲醯胺、42℃之條件。「高嚴苛雜合條件」，指如(1)5×SSC、5×Denhardt溶液、
0.5%SDS、50%甲醯胺、50℃，(2)0.2×SSC、0.1%SDS、60℃，(3)0.2×SSC、0.1%SDS、62℃，(4)0.2×SSC、0.1%SDS、65℃，或者(5)0.1×SSC、0.1%SDS、65℃之條件，但並不限定於此。在此些條件下，可期待有效地獲得具有溫度越上昇越高序列相同性的反義寡聚物。惟，作為影響雜合嚴苛程度的因子，應考慮溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等複數的因子，本技術範疇人員只要適當選擇此些因子可以實現同樣的嚴苛程度。
又，雜合中使用市售套組時，可使用如Alkphos Direct Labelling and Detection System(GE Healthcare)。該情形時，可依照套組所附之方案，與經標識的探針先行培養一夜後，再於55℃的條件下以含0.1%(w/v)SDS的1次洗淨緩衝液洗淨膜之後，檢測雜合的反義寡聚物。或者，在依據與自序列編號323(人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子)、序列編號337(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第45號核苷酸序列)、序列編號338(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第91號至第135號核苷酸序列)、序列編號339(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第121號至第155號核苷酸序列)、序列編號340(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第166號至第210號核苷酸序列)、序列編號341(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第204號至第233號核苷酸序列)、序列編號342(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯
子的5'末端算起第326號至第374號核苷酸序列)、序列編號349(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-4號至第25號核苷酸序列)、序列編號350(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第112號至第131號核苷酸序列)、序列編號351(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第128號至第142號核苷酸序列)、序列編號352(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第169號至第206號核苷酸序列)、序列編號353(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第209號至第228號核苷酸序列)、序列編號354(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第365號核苷酸序列)、序列編號324(小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子)、序列編號343(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第65號核苷酸序列)、序列編號344(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第91號至第135號核苷酸序列)、序列編號345(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第121號至第155號核苷酸序列)、序列編號346(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第151號至第210號核苷酸序列)、序列編號347(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第196號至第233號核苷酸序列)、序列編號364(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第266號至第295號核苷酸序列)、序列編號348(自小鼠肌肉生長抑
制素基因第2號外顯子的5'末端算起第326號至第374號核苷酸序列)、序列編號355(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第1號至第18號核苷酸序列)、序列編號356(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第116號至第131號核苷酸序列)、序列編號357(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第130號至第140號核苷酸序列)、序列編號358(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第160號至第206號核苷酸序列)、序列編號359(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第211號至第255號核苷酸序列)、序列編號365(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第271號至第282號核苷酸序列)及序列編號366(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第341號至第365號核苷酸序列)所成之群組選擇的任意之鹼基序列互補的鹼基序列之全部或部分製作探針時，使用市售藥劑(例如，PCR Labelling Mix(Roche Diagnostic公司)等)以毛地黃素(digoxigenin)(DIG)標識該探針時，亦可使用DIG核酸檢測套組(Roche Diagnostic公司)檢測雜合。
上述以外可雜合之反義寡聚物方面，可例舉如以BLAST之相同性篩檢軟體，使用預設參數計算時，與自序列編號323(人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子)、序列編號337(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第45號核苷酸序列)、序列編號338(自人
類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第91號至第135號核苷酸序列)、序列編號339(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第121號至第155號核苷酸序列)、序列編號340(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第166號至第210號核苷酸序列)、序列編號341(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第204號至第233號核苷酸序列)、序列編號342(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第326號至第374號核苷酸序列)、序列編號349(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-4號至第25號核苷酸序列)、序列編號350(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第112號至第131號核苷酸序列)、序列編號351(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第128號至第142號核苷酸序列)、序列編號352(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第169號至第206號核苷酸序列)、序列編號353(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第209號至第228號核苷酸序列)、序列編號354(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第365號核苷酸序列)、序列編號324(小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子)、序列編號343(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第65號核苷酸序列)、序列編號344(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第91號至第135號核苷酸序列)、
序列編號345(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第121號至第155號核苷酸序列)及序列編號346(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第151號至第210號核苷酸序列)、序列編號347(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第196號至第233號核苷酸序列)、序列編號364(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第266號至第295號核苷酸序列)、序列編號348(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第326號至第374號核苷酸序列)、序列編號355(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第1號至第18號核苷酸序列)、序列編號356(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第116號至第131號核苷酸序列)、序列編號357(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第130號至第140號核苷酸序列)、序列編號358(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第160號至第206號核苷酸序列)、序列編號359(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第211號至第255號核苷酸序列)、序列編號365(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第271號至第282號核苷酸序列)及序列編號366(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第341號至第365號核苷酸序列)所成之群組選擇之任意一種鹼基序列具有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、
99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、或99.9%以上之相同性的多核苷酸。
再者，鹼基序列之相同性，可以BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268,1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873,1993)決定。在使用BLAST時，可使用各方程式之預設參數。
前述(c)至(f)中之各單元寡聚物(以下，有時單稱為「單元」)的大小，可為7至15鹼基長，而以8至15鹼基長、9至15鹼基長、10至15鹼基長、10至14鹼基長、10至13鹼基長、11至13鹼基長較佳。上述(c)至(f)中之各單元的大小可相同，亦可不同。
前述(c)之反義寡聚物中，自前述(c-1)至(c-6)所成之群組選擇的2個單元的任一者皆可配置在5'末端側。
前述(d)之反義寡聚物中，自前述(d-1)至(d-7)所成之群組選擇的2個單元的任一者皆可配置在5'末端側。
前述(e)之反義寡聚物中，自前述(e-1)至(e-6)所成之群組選擇的2個單元的任一者皆可配置在5'末端側。
前述(f)之反義寡聚物中，自前述(f-1)至(f-7)所成之群組選擇的2個單元的任一者皆可配置在5'末端側。
其中，「連結」，意指2個單元為直接連接。亦即，意指在2個單元連結時，位在5'末端側的單元之3'末端與位在3'末端側的單元之5'末端係形成磷酸鍵或以下之基。
本發明之較佳實施態樣的反義寡聚物A中，前述(c)之反義寡聚物，係包含自序列編號103(NMS-48)、序列編號116(NMS-89)、序列編號117(NMS-90)、序列編號120(NMS-93)、序列編號128(NMS-101)、序列編號131(NMS-104)、序列編號136(NMS-113)、序列編號137(NMS-117)、序列編號140(NMS-123)、序列編號145(NMS-136)、序列編號146(NMS-139)、序列編號147(NMS-140)、序列編號148(NMS-141)、序列編號149(NMS-142)、序列編號152(NMS-145)、序列編號155(NMS-148)、序列編號156(NMS-149)、序列編號157(NMS-150)、序列編號159(NMS-152)、序列編號162(NMS-156)、序列編號163(NMS-157)、序列編
號165(NMS-162)、序列編號166(NMS-163)、序列編號167(NMS-164)、序列編號168(NMS-166)、序列編號169(NMS-167)、序列編號170(NMS-168)、序列編號171(NMS-169)、序列編號176(NMS-174)、序列編號177(NMS-175)、序列編號178(NMS-176)、序列編號179(NMS-177)、序列編號180(NMS-178)、序列編號183(NMS-181)、序列編號187(NMS-185)、序列編號189(NMS-188)、序列編號190(NMS-189)、序列編號191(NMS-190)、序列編號192(NMS-191)、序列編號193(NMS-192)、序列編號196(NMS-195)、序列編號199(NMS-198)、序列編號200(NMS-199)、序列編號201(NMS-200)、序列編號203(NMS-202)、序列編號204(NMS-203)、序列編號206(NMS-206)、序列編號208(NMS-208)、序列編號212(NMS-212)、序列編號213(NMS-213)、序列編號214(NMS-214)、序列編號215(NMS-215)、序列編號217(NMS-217)、序列編號225(NMS-225)、序列編號226(NMS-228)、序列編號228(NMS-230)、序列編號229(NMS-231)、序列編號231(NMS-233)、序列編號232(NMS-234)、序列編號233(NMS-235)、序列編號236(NMS-240)、序列編號237(NMS-241)、序列編號240(NMS-244)、序列編號243(NMS-247)、序列編號244(NMS-248)、序列編號245(NMS-249)、序列編號246(NMS-250)、序列編號247(NMS-251)、序列編號248(NMS-252)、序列編號252(NMS-256)、序列編號261(NMS-272)、序列編號273(NMS-284)、序列編號274(NMS-285)、序列編號275(NMS-286)及序列編號277(NMS-297)所成之群
組選擇之任意1種鹼基序列。
本發明另外之較佳實施態樣的反義寡聚物A中，前述(d)之反義寡聚物，係包含自序列編號95(NMS-38)、序列編號96(NMS-39)、序列編號107(NMS-66)、序列編號223(NMS-223)、序列編號234(NMS-238)、序列編號235(NMS-239)、序列編號242(NMS-246)、序列編號249(NMS-253)、序列編號250(NMS-254)、序列編號251(NMS-255)、序列編號257(NMS-268)、序列編號(NMS-280)、序列編號(NMS-281)、序列編號(NMS-282)、序列編號(NMS-288)、序列編號(NMS-289)、序列編號(NMS-290)、序列編號(NMS-292)、序列編號(NMS-293)、序列編號(NMS-294)、序列編號(NMS-295)、序列編號(NMS-298)、序列編號(NMS-299)、序列編號(NMS-300)、序列編號(NMS-302)及序列編號(NMS-303)所成之群組選擇之任意1種鹼基序列。
本發明特別較佳之實施態樣的反義寡聚物A中，前述(c)或(e)之反義寡聚物，係包含自序列編號171(NMS-169)、序列編號192(NMS-191)、序列編號245(NMS-249)、及序列編號231(NMS-233)所成之群組選擇之任意1種鹼基序列。
「可使肌肉生長抑制素基因第2號外顯子跳讀」，意指藉由使人類肌肉生長抑制素基因的轉錄物(例如：pre-mRNA)結合在本發明之反義寡聚物A，使該轉錄物在接受剪接時，第2號外顯子之全部或部分缺損，而形成編碼不具有肌肉生長抑制素機能的變異肌肉生長抑制素之成熟mRNA。
本發明之反義寡聚物A，只要可使肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子跳讀，亦可不具有對於目標序列100%互補之鹼基序列。例如，本發明之反義寡聚物B中，對目標序列，亦可含有1至3個、1至2個或1個非互補之鹼基。
其中，前述「結合」，意指在以本發明之反義寡聚物A與肌肉生長抑制素基因轉錄物混合時，可在生理條件下使兩者雜合而形成雙股。上述「生理條件下」，意指調節為與體內類似之pH、鹽組成、溫度的條件。例如可為25至40℃，而以37℃更佳，可為pH5至8，而以pH7.4更佳，且氯化鈉濃度為150mM的條件。
跳讀效率方面，後述將更詳細說明。
本發明之反義寡聚物A，可為寡核苷酸、N-嗎啉基寡聚物或胜肽-核酸寡聚物。寡核苷酸、N-嗎啉基寡聚物或胜肽-核酸寡聚物方面，後述將更詳細說明。
本發明之反義寡聚物B，係選自以下之(A)至(H)所成之群組之任意1反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物。
(A)由選自人類肌肉生長抑制素基因的第2外顯子自5'末端算起第-10至第45核苷酸序列的連續14至30鹼基長的核苷酸序列之互補鹼基序列所構成之反義寡聚物
(B)由選自人類肌肉生長抑制素基因的第2外顯子自5'末端算起第91至第145核苷酸序列的連續14至30鹼基長的核苷酸序列之互補鹼基序列所構成之反義寡聚物(C)由選自人類肌肉生長抑制素基因的第2外顯子自5'末端算起第146至第180核苷酸序列的連續14至30鹼基長的核苷酸序列之互補鹼基序列所構成之反義寡聚物外顯子(D)由選自人類肌肉生長抑制素基因的第2外顯子自5'末端算起第331至第374核苷酸序列的連續14至30鹼基長的核苷酸序列之互補鹼基序列所構成之反義寡聚物(E)由選自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2外顯子自5'末端算起第-10至第31核苷酸序列的連續14至30鹼基長的核苷酸序列之互補鹼基序列所構成之反義寡聚物(F)由選自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2外顯子自5'末端算起第111至第162核苷酸序列的連續14至30鹼基長的核苷酸序列之互補鹼基序列所構成之反義寡聚物(G)由選自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2外顯子自5'末端算起第166至第195核苷酸序列的連續14至30鹼基長的核苷酸序列之互補鹼基序列所構成之反義寡聚物；及(H)由選自小鼠肌肉生長抑制素基因的第2外顯子自5'末端算起第331至第374核苷酸序列的連續14至30鹼基長的核苷酸序列之互補鹼基序列所構成之反義寡聚物
本發明之更佳實施態樣之反義寡聚物B，係選自下述(I)至(L)所成之群組的任意1反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物。
(I)由選自人類肌肉生長抑制素基因的第2外顯子自5'末端算起第-10至第31核苷酸序列的連續14至30鹼基長的核苷酸序列之互補鹼基序列所構成之反義寡聚物
(J)由選自人類肌肉生長抑制素基因的第2外顯子自5'末端算起第111至第140核苷酸序列的連續14至30鹼基長的核苷酸序列之互補鹼基序列所構成之反義寡聚物，而前述14至30鹼基長的核苷酸序列之3'末端的鹼基為前述第2外顯子自5'末端算起第140的鹼基之反義寡聚物
(K)由選自人類肌肉生長抑制素基因的第2外顯子自5'末端算起第146至第180核苷酸序列的連續14至30鹼基長的核苷酸序列之互補鹼基序列所構成之反義寡聚物；及
(L)由選自人類肌肉生長抑制素基因的第2外顯子自5'末端算起第331至第374核苷酸序列的連續14至30鹼基長的核苷酸序列之互補鹼基序列所構成之反義寡聚物
本發明之反義寡聚物B中，「基因」，在基因組以外，亦包含cDNA、mRNA前驅體及mRNA。而基因，以mRNA前驅體，亦即，pre-mRNA較佳。
肌肉生長抑制素基因轉錄產物之pre-mRNA，含3外顯子及2插入序列，而依序為(5'末端)第1外顯子-第1插入序列-第2外顯子-第2插入序列-第3外顯子(3'末端)。pre-mRNA，再接受剪接而生成成熟之mRNA。人類及小鼠的野生型肌肉生長抑制素基因之鹼基序列已為一般所知(RefSeq Accession No.NM 005259(人類)；及RefSeq
Accession No.NM 010834(小鼠))。野生型肌肉生長抑制素基因的第2外顯子之鹼基序列如下。
第2外顯子(人類)：序列編號323；及
第2外顯子(小鼠)：序列編號324；
第2外顯子(人類)自5'末端算起第-10至3'末端之核苷酸序列，係表示為序列編號325。
第2外顯子(小鼠)自5'末端算起第-10至3'末端之核苷酸序列，則表示為序列編號326。
前述(A)之反義寡聚物中，「人類肌肉生長抑制素基因第2外顯子自5'末端算起第-10至第45核苷酸序列」，係表示為序列編號327。
前述(B)之反義寡聚物中，「人類肌肉生長抑制素基因第2外顯子自5'末端算起第91至第145核苷酸序列」，則表示為序列編號328。
前述(C)之反義寡聚物中，「人類肌肉生長抑制素基因第2外顯子自5'末端算起第146至第180核苷酸序列」，則表示為序列編號329。
前述(D)之反義寡聚物中，「人類肌肉生長抑制素基因第2外顯子自5'末端算起第331至第374核苷酸序列」，則表示為序列編號330。
前述(E)之反義寡聚物中，「小鼠肌肉生長抑制素基因第2外顯子自5'末端算起第-10至第31核苷酸序列」，係表示為序列編號331。
前述(F)之反義寡聚物中，「小鼠肌肉生長抑制素基因
第2外顯子自5'末端算起第111至第162核苷酸序列」，則表示為序列編號332。
前述(G)之反義寡聚物中，「小鼠肌肉生長抑制素基因第2外顯子自5'末端算起第166至第195核苷酸序列」，則表示為序列編號333。
前述(H)之反義寡聚物中，「小鼠肌肉生長抑制素基因第2外顯子自5'末端算起第331至第374核苷酸序列」，則表示為序列編號334。
前述(I)之反義寡聚物中，「人類肌肉生長抑制素基因第2外顯子自5'末端算起第-10至第31核苷酸序列」，係表示為序列編號335。
前述(J)之反義寡聚物中，「人類肌肉生長抑制素基因第2外顯子自5'末端算起第111至第140核苷酸序列」，係表示為序列編號336。
前述(K)之反義寡聚物中，「人類肌肉生長抑制素基因第2外顯子自5'末端算起第146至第180核苷酸序列」，係表示為序列編號362。
前述(L)之反義寡聚物中，「人類肌肉生長抑制素基因第2外顯子自5'末端算起第331至第374核苷酸序列」，係表示為序列編號363。
本發明之反義寡聚物B，係以藉由肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的跳讀，使以肌肉生長抑制素基因編碼之蛋白質，改變為不具有肌肉生長抑制素機能之變異蛋白質為目的而製作者。「肌肉生長抑制素之機能」，係
指如負向調控骨骼肌量的機能或活性。成為本發明反義寡聚物B的外顯子跳讀之對象的肌肉生長抑制素基因之第2號外顯子，不只野生型，亦包含變異型。
變異型之肌肉生長抑制素基因的第2號外顯子或其部分，具體地，係下述之(a)或(b)中記載之多核苷酸。
(a)與包含自序列編號323(人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子)、序列編號325(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至3'末端之核苷酸序列)、序列編號327(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第45號核苷酸序列)、序列編號328(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第91號至第145號核苷酸序列)、序列編號329(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第146號至第180號核苷酸序列)、序列編號330(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第374號核苷酸序列)、序列編號335(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第31號核苷酸序列)、序列編號336(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第111號至第140號核苷酸序列)、序列編號362(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第146號至第180號核苷酸序列)、序列編號363(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第374號核苷酸序列)、序列編號324(小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子)、序列編號326(自小鼠肌肉生長抑制
素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至3'末端之核苷酸序列)、序列編號331(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第31號核苷酸序列)、序列編號332(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第111號至第162號核苷酸序列)、序列編號333(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第166號至第195號核苷酸序列)、序列編號334(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第374號核苷酸序列)所成之群組選擇之任意鹼基序列互補之鹼基序列的多核苷酸在嚴苛雜合條件下雜合之多核苷酸；(b)包含對於自序列編號323(人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子)、序列編號325(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至3'末端之核苷酸序列)、序列編號327(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第45號核苷酸序列)、序列編號328(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第91號至第145號核苷酸序列)、序列編號329(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第146號至第180號核苷酸序列)、序列編號330(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第374號核苷酸序列)、序列編號335(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第31號核苷酸序列)、序列編號336(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的
5'末端算起第111號至第140號核苷酸序列)、序列編號362(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第146號至第180號核苷酸序列)、序列編號363(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第374號核苷酸序列)、序列編號324(小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子)、序列編號326(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至3'末端之核苷酸序列)、序列編號331(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第31號核苷酸序列)、序列編號332(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第111號至第162號核苷酸序列)、序列編號333(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第166號至第195號核苷酸序列)及序列編號334(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第374號核苷酸序列)所成之群組選擇之任意鹼基序列，具有90%以上相同性之鹼基序列之多核苷酸
本說明書中，「多核苷酸」，意指DNA或RNA。
本說明書中，「互補的鹼基序列」，並不限定為與成為對象之鹼基序列可形成華特生-克里克鹼基對的鹼基序列，亦包含可形成搖擺鹼基對(Wobble base pair)之鹼基序列。其中，華特生-克里克鹼基對，意指在腺嘌呤-胸腺嘌呤、腺嘌呤-尿嘧啶及鳥嘌呤-胞嘧啶之間可形成氫鍵之鹼基對；搖擺鹼基對，意指在鳥嘌呤-尿嘧啶、肌苷-尿嘧啶、肌苷-腺嘌呤及肌苷-胞嘧啶之間可形成氫鍵之鹼基對。
又，「互補的鹼基序列」，亦可指與成為對象之鹼基序列不具有100%之互補性，如對於成為對象之鹼基序列，亦可含有1至3個、1至2個或1個非互補性鹼基。
本說明書中，所稱之「在嚴苛雜合條件下雜合之多核苷酸」，係指以包含自序列編號323(人類肌肉生長抑制素基因之第2號外顯子)、序列編號325(自人類肌肉生長抑制素基因第2外顯子的5'末端算起第-10號至3'末端之核苷酸序列)、序列編號327(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子自5'末端算起第-10號至第45號核苷酸序列)、序列編號328(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第91號至第145號核苷酸序列)、序列編號329(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第146號至第180號核苷酸序列)、序列編號330(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第374號核苷酸序列)、序列編號335(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第31號核苷酸序列)、序列編號336(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第111號至第140號核苷酸序列)、序列編號362(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第146號至第180號核苷酸序列)、序列編號363(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第374號核苷酸序列)、序列編號324(小鼠肌肉生長抑制素基因之第2號外顯子)、序列編號326(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算
起第-10號至3'末端之核苷酸序列)、序列編號331(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第31號核苷酸序列)、序列編號332(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第111號至第162號核苷酸序列)、列編號333(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第166號至第195號核苷酸序列)及序列編號334(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第374號核苷酸序列)所成之群組選擇之任意鹼基序列互補的鹼基序列之多核苷酸的全部或部分作為探針，藉由菌落雜合法、溶菌斑雜合法或南氏雜合法等所得之反義寡聚物。雜合之方法方面，可例舉如："Sambrook & Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Fourth Edition),Cold Spring Harbor,Laboratory Press 2012"、"Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons 1987-1997"等之中所載之方法。
本說明書中，所稱之「嚴苛之雜合條件」，可為低嚴苛之雜合條件、中嚴的之雜合條件及高嚴苛之雜合條件之任意者。「低嚴苛之雜合條件」，係指如5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、32℃之條件。「中嚴苛之雜合條件」，係指如5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、42℃或5×SSC、1%SDS、50mM之Tris-HCl(pH7.5)、50%甲醯胺、42℃之條件。「高嚴苛之雜合條件」，係指如：(1)5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、50℃，(2)0.2×SSC、0.1%SDS、60℃，(3)0.2×SSC、0.1%SDS、62
℃，(4)0.2×SSC、0.1%SDS、65℃，或者(5)0.1×SSC、0.1%SDS、65℃之條件，但並不限定於此。此些條件中，可期待溫度越提升而有效率地獲得高的序列相同性之反義寡聚物。惟，作為影響雜合之嚴苛條件的要件，須考慮溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等複數要件，本技術範疇技術者可由適當選擇此些要件即可實現相同之嚴苛條件。
又，在雜合使用市售套組時，可使用如Alkphos Direct Labelling and Detection System(GE Healthcare)。在該情形時，可依照套組所附之方案，與經標識的探針靜置培養一夜後，於55℃的條件下以含0.1%(w/v)SDS的1次洗淨緩衝液洗淨膜之後，檢測雜合的反義寡聚物。或者，以包含自序列編號323(人類肌肉生長抑制素基因之第2號外顯子)、序列編號325(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至3'末端之核苷酸序列)、序列編號327(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第45號核苷酸序列)、序列編號328(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子自5'末端算起第91號至第145號核苷酸序列)、序列編號329(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第146號至第180號核苷酸序列)、序列編號330(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第374號核苷酸序列)、序列編號335(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第31號核苷酸序列)、序列編號
336(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第111號至第140號核苷酸序列)、序列編號362(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第146號至第180號核苷酸序列)、序列編號363(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第33號至第374號核苷酸序列)、序列編號324(小鼠肌肉生長抑制素基因之第2號外顯子)、序列編號326(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至3'末端之核苷酸序列)、序列編號331(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第31號核苷酸序列)、序列編號332(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第111號至第162號核苷酸序列)、序列編號333(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第166號至第195號核苷酸序列)、序列編號334(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第374號核苷酸序列)所成之群組選擇之任意鹼基序列互補的鹼基序列之全部或部分製作探針時，使用市售之藥劑(例如：PCR Labelling Mix(Roche Diagnostic公司)等)以毛地黃素(DIG)標識該探針時，亦可使用DIG核酸檢測套組(Roche Diagnostic公司)檢測雜合。
上述以外之可雜合的反義寡聚物方面，藉由BLAST相同性篩檢軟體，使用預設參數計算時，可舉如與自：序列編號323(人類肌肉生長抑制素基因之第2號外顯子)、序列編號325(自人類肌肉生長抑制素基因第2外顯
子的5'末端算起第-10號至3'末端之核苷酸序列)、序列編號327(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第45號核苷酸序列)、序列編號328(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第91號至第145號核苷酸序列)、序列編號329(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第146號至第180號核苷酸序列)、序列編號330(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第374號核苷酸序列)、序列編號335(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第31號核苷酸序列)、序列編號336(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第111號至第140號核苷酸序列)、序列編號362(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第146號至第180號核苷酸序列)、序列編號363(自人類肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第374號核苷酸序列)、序列編號324(小鼠肌肉生長抑制素基因之第2號外顯子)、序列編號326(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至3'末端之核苷酸序列)、序列編號331(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第-10號至第31號核苷酸序列)、序列編號332(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第111號至第162號核苷酸序列)、序列編號333(自小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子的5'末端算起第166號至第195號核苷酸序列)及序列編號334(自小鼠肌肉生長抑
制素基因第2號外顯子的5'末端算起第331號至第374號核苷酸序列)所成之群組選擇之任意鹼基序列具有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上相同性之多核苷酸序列。
又，鹼基序列之相同性，可使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268,1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873,1993)決定。在使用BLAST時，可使用各程式之預設參數。
「可使小鼠肌肉生長抑制素基因第2號外顯子跳讀」，係指藉由使人類肌肉生長抑制素基因的轉錄物(例如：pre-mRNA)與本發明之反義寡聚物B結合，使該轉錄物在接受剪接時，第2號外顯子之全部或部分缺損，而形成編碼不具有肌肉生長抑制素機能的變異肌肉生長抑制素之成熟mRNA。
本發明之反義寡聚物B，只要可使肌肉生長抑制素基因的第2耗外顯子跳讀，亦可不具有對於目標序列100%互補性鹼基序列。例如，本發明之反義寡聚物B，對目標序列，可含有1至3個、1至2個或1個非互補性鹼基。
其中，前述「結合」，意指在本發明之反義寡聚物B與肌肉生長抑制素基因轉錄物混合時，在生理條件下使兩者雜合而形成雙股。上述「生理條件下」，意指調節為與體內類似之pH、鹽組成、溫度的條件。例如可為25至40℃，
而以37℃更佳，可為pH5至8，而以pH7.4更佳，且氯化鈉濃度為150mM的條件。
本發明另外之較佳實施態樣的反義寡聚物B中，前述(A)之反義寡聚物，可包含自序列編號13(NMS-17)、序列編號76(NMS-138)、序列編號68(NMS-120)、序列編號75(NMS-137)、序列編號51(NMS-76)、序列編號52(NMS-79)、序列編號54(NMS-81)、序列編號55(NMS-82)、序列編號56(NMS-83)、序列編號53(NMS-80)、序列編號33(NMS-49)、序列編號63(NMS-114)、序列編號69(NMS-124)、序列編號70(NMS-125)、序列編號61(NMS-110)、序列編號31(NMS-46)、序列編號34(NMS-50)、序列編號50(NMS-75)、序列編號45(NMS-67)及序列編號64(NMS-115)所成之群組選擇之任意1種鹼基序列。
本發明之較佳實施態樣之反義寡聚物B中，前述(B)之反義寡聚物，可包含自序列編號3(NMS-6)、序列編號66(NMS-118)、序列編號67(NMS-119)、序列編號28(NMS-33)、序列編號72(NMS-127)、序列編號16(NMS-20)、序列編號82(NMS-187)及序列編號25(NMS-30)所成之群組選擇之任1種鹼基序列。
本發明其他較佳實施態樣之反義寡聚物B中，前述(C)之反義寡聚物，可包含序列編號12(NMS-16)之鹼基序列。
本發明另外較佳實施態樣之反義寡聚物B中，前述(D)之反義寡聚物，可包含序列編號4(NMS-7)之
鹼基序列。
本發明再另外較佳實施態樣之反義寡聚物B中，前述(E)之反義寡聚物，可包含序列編號90(NMS-51)之鹼基序列。
本發明再另外較佳實施態樣之反義寡聚物B中，前述(F)之反義寡聚物，可包含自序列編號91(NMS-52)、序列編號28(NMS-33)及序列編號25(NMS-30)、序列編號41(NMS-61)、序列編號24(NMS-29)、序列編號42(NMS-62)、序列編號43(NMS-63)、序列編號11(NMS-15)、序列編號67(NMS-119)、序列編號80(NMS-161)及序列編號82(NMS-187)所成之群組選擇之任意1種鹼基序列。
本發明又另外較佳實施態樣之反義寡聚物B中，前述(G)之反義寡聚物，可包含序列編號7(NMS-10)之鹼基序列。
本發明再另外較佳實施態樣之反義寡聚物B中，前述(H)之反義寡聚物，可包含自序列編號4(NMS-7)、序列編號9(NMS-12)、序列編號10(NMS-14)及序列編號14(NMS-18)所成之群組選擇之任意1種鹼基序列。
跳讀效率方面，後述將更詳細說明。
本發明之反義寡聚物B，可為寡核苷酸、N-嗎啉基寡聚物或胜肽核酸寡聚物。寡核苷酸、N-嗎啉基寡聚物或胜肽核酸寡聚物方面，後述將更詳細說明。
1.3.跳讀效率
肌肉生長抑制素基因發生外顯子跳讀與否，可藉由在肌肉生長抑制素基因表現細胞(例如：人類橫紋肌肉瘤細胞)中導入本發明之反義寡聚物，再由前述肌肉生長抑制素表現細胞之總RNA(total RNA)，經由RT-PCR擴增肌肉生長抑制素基因mRNA的外顯子周邊區域，對該PCR擴增產物進行巢式PCR(nested PCR)或序列解析予以確定。
跳讀效率，可自檢測細胞回收肌肉生長抑制素基因之mRNA，測定該mRNA中，外顯子跳讀的區帶之多核苷酸量「A」、及外顯子未跳讀的區帶之多核苷酸量「B」，以該「A」及「B」之測定值為基準，依照以下之式計算。
跳讀效率(%)={A/(A+B)}×100
本發明較佳實施態樣之反義寡聚物，可以10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、或90%以上之效率使外顯子跳讀。
跳讀效率的計算方面，可參考國際公開公報第2012/029986號。
1.4.寡核苷酸、N-嗎啉基寡聚物或胜肽核酸寡聚物
本發明之反義寡聚物方面，可舉如具有14至30鹼基長度之寡核苷酸、N-嗎啉基寡聚物、或胜肽核酸(Peptide Nucleic Acid：PNA)寡聚物。而以15至29鹼基、16至28鹼基、17至27鹼基、或18至26鹼基之長度為佳，N-嗎啉基寡聚物更佳。
前述寡核苷酸(以下，有時稱為「本發明之寡核苷
酸」)，係以核苷酸作為構成單位之本發明之反義寡聚物，該核苷酸，可為核糖核苷酸、去氧核醣核苷酸或修飾核苷酸之任意者。
修飾核苷酸，係指構成核糖核苷酸或去氧核醣核苷酸的核酸鹼基、糖部分、及磷酸鍵部分之全部或部分受修飾者。
本發明中，核酸鹼基方面，可舉如腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其修飾鹼基。該修飾鹼基方面，可舉如假尿嘧啶(pseudouracil)、3-甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、5-烷基胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶)、5-烷基尿嘧啶(例如，5-乙基尿嘧啶)、5-鹵化尿嘧啶(例如，5-溴尿嘧啶)、6-氮雜嘧啶、6-烷基嘧啶(6-甲基尿嘧啶)、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、4-乙醯基胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基尿嘧啶、1-甲基腺嘌呤、1-甲基次黃嘌呤、2,2-二甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲氧基胺基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲基羰基甲基尿嘧啶、5-甲基氧基尿嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸、2-硫代胞嘧啶、嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、異鳥嘌呤、吲哚、咪唑、呫噸等，但並不限定於此。
糖部分之修飾方面，可例舉如修飾核糖之2'位及糖其他部分之修飾。修飾核糖之2'位方面，可如修飾核糖之2'
位-OH基置換為OR、R、R'OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br、I。其中，R表示烷基或芳基。R'表示伸烷基。
糖的其他部分之修飾方面，可如核糖或去氧核糖之4'位之O置換為S者、糖之2'位及4'位交聯者，例如：LNA(Locked Nucleic Acid，鎖核酸)或ENA(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids，2'-O,4'-C-伸乙基架橋核酸)等，但並不限定於此。
磷酸鍵部分之修飾方面，可如磷酸二酯鍵置換為硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基膦酸鍵、胺基磷酸酯鍵、硼烷膦酸鍵(Enya et al.,Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008,18,9154-9160)之修飾(可參考如，日本專利再公表公報第2006/129594號及第2006/038608號)。
本發明中，烷基方面，以直鏈或支鏈而碳數1至6之烷基為佳。具體言之，可舉如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、第三戊基、正己基、異己基。該烷基亦可取代，此類取代基方面，可為如鹵素、烷氧基、氰基、硝基，該等可為1至3個取代。
本發明中，環烷基方面，以碳數5至12之環烷基為佳。具體言之，可為如環戊基、環己基、環庚基、環辛基、環癸基、環十二碳烷基。
本發明中，鹵素方面，可為如氟、氯、溴、碘。
烷氧基方面，可為直鏈或支鏈之碳數1至6之烷氧基，
可舉如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基、正戊氧基、異戊氧基、正己氧基、異己氧基等。特別，以碳數1至3之烷氧基更佳。
本發明中，芳基方面，以如碳數6至10之芳基為佳。具體言之，可舉如苯基、α-萘基、β-萘基。特別以苯基更佳。該芳基亦可取代，此類取代基方面，可為如烷基、鹵素、烷氧基、氰基、硝基，該等可為1至3個取代。
本發明中，伸烷基方面，以直鏈或支鏈之碳數1至6之伸烷基為佳。具體言，可為如亞甲基、伸乙基、三亞甲基、四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、2-(乙基)三亞甲基、1-(甲基)四亞甲基。
本發明中，醯基方面，可舉如直鏈或支鏈之烷醯基、或芳醯基。烷醯基方面，可為如甲醯基、乙醯基、2-甲基乙醯基、2,2-二甲基乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、2,2-二甲基丙醯基、己醯基等。芳醯基方面，可為如苯甲醯基、甲苯甲醯基、萘甲醯基。該芳醯基可在可取代之位置取代，亦可以烷基取代。
本發明之寡核苷酸，以核糖之2'位之-OH基為甲氧基取代，磷酸鍵部分為硫基磷酸酯鍵之以下述通式所示之基作為構成單位之本發明之反義寡聚物為佳。
本發明之寡核苷酸，以各種自動合成裝置(例如，FOCUS(Aapptec公司)、AKTA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare公司))可容易地合成，或者，亦可委託第三之機關(例如：Promega公司、Takara公司、或日本Bioservice公司)等製作。
本發明之N-嗎啉基寡聚物，係以下述通式所示之基作為構成單元的本發明之反義寡聚物。
N-嗎啉基寡聚物，較佳為以下述之式所示之基作為構成單位之寡聚物(二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物(以下，稱為「PMO」))。
N-嗎啉基寡聚物，可依照如國際公開公報第1991/009033號、或國際公開公報第2009/064471號製造。特別地，PMO可依照國際公開公報第2009/064471號所載之方法製造，或者依照以下所示之方法製造。
[PMO的製法]
PMO之1態樣方面，可如下述之通式(I)所示之化合物(以下，稱為PMO(I)。)。
PMO(I)，可依照一般已知之方法製造，例如進行下述步驟之操作製造。
下述步驟中所使用之化合物及藥劑，只要係PMO製造上一般使用者即可並無特別之限定。
又，下述所有之步驟，可以液相法或固相法(可使用人工或市售之固相自動合成機)進行。在以固相法製造PMO時，由操作順序之簡單化及合成之正確性之觀點言之以使用自動合成機為佳。
(1)步驟A：
係以下述通式(Ⅱ)所示之化合物(以下，稱為化合物(Ⅱ)。)藉由與酸作用，製造為下述通式(Ⅲ)所示之化合物(以下，稱為化合物(Ⅲ)。)之步驟。
BP相關之「核酸鹼基」方面，可例舉與Base相同之「核酸鹼基」。惟，BP相關之核酸鹼基之胺基或羥基亦可受保護。
該胺基之保護基方面，只要為使用作為核酸之保護基者即可並無特別之限定，具體地，可例舉如苯甲醯基、4-甲氧基苯甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、苯基乙醯基、苯氧基乙醯基、4-第三丁基苯氧基乙醯基、4-異丙基苯氧基乙醯基、(二甲基胺基)亞甲基。羥基之保護基方面，可例舉如2-氰基乙基、4-硝基苯乙基、苯基磺醯基乙基、甲基磺醯基乙基、三甲基矽基乙基、在可取代之任意位置以1至5個吸電子性基取代之苯基、二苯基胺甲醯基、二甲基胺甲醯基、二乙基胺甲醯基、甲基苯基胺甲醯基、1-吡咯啶基胺甲醯基、N-嗎啉基胺甲醯基、4-(第三丁基羧基)苯甲基、4-[(二甲基胺基)羧基]苯甲基、4-(苯基羧基)苯甲基(可參考如國際公開公報第2009/064471號公報)。
「固相支持體」方面，只要為可使用在核酸之固相反應中之支持體即可並無特別之限定，以如：(i)幾乎不溶解於可使用在合成N-嗎啉基核酸衍生物之藥劑(例如，二氯甲烷、乙腈、四唑、N-甲基咪唑、吡啶、乙酸酐、二甲基吡啶、三氟乙酸)，(ii)對於可使用在合成N-嗎啉基核酸衍
生物之藥劑為化學上安定，(iii)可化學修飾，(iv)可填裝所欲之N-嗎啉基核酸衍生物，(v)具有可耐處理中之高壓的充分之強度，(vi)分布在特定粒徑範圍者為佳。具體地，可列舉膨潤性聚苯乙烯(例如，胺基甲基聚苯乙烯樹脂1%二乙烯基苯交聯(200至400網目)(2.4至3.0mmol/g)(東京化成公司製造)、Aminomethylated Polystyrene Resin‧HCl[二乙烯基苯1%，100至200網目](Peptide研究所公司製造))、非膨潤性聚苯乙烯(例如，Primer Support(GE Healthcare公司製造))、PEG鏈結合型聚苯乙烯(例如：NH2-PEG樹脂(渡邊化學公司製造)、TentaGel樹脂)、定孔玻璃(controlled pore glass；CPG)(例如：CPG公司製造)、草醯化-定孔玻璃(可參考如Alul等，Nucleic Acids Research,Vol.19,1527(1991))、TentaGel支持體-胺基聚乙二醇衍生物化支持體(可參考如：Wright人等，Tetrahedron Letters,Vol.34,3373(1993))、Poros-聚苯乙烯/二乙烯基苯之共聚物。
「連結基」方面，可使用通常連結核酸與N-嗎啉基核酸衍生物所使用之一般已知者，舉例如3-胺基丙基、琥珀醯基、2,2'-二乙醇磺醯基、長鏈烷基胺基(LCAA)。
本步驟，可以化合物(Ⅱ)與酸作用進行。
本步驟中可使用之「酸」方面，可例舉如三氟乙酸、二氯乙酸或三氯乙酸。酸之使用量方面，以如相對於化合物(Ⅱ)1莫耳為0.1莫耳當量至1000莫耳當量之範圍內為宜，而以1莫耳當量至100莫耳當量之範圍內為佳。
又，亦可與前述酸共同，使用有機胺。有機胺方面，
並無特別之限定，可舉如三乙胺。有機胺之使用量，以如相對於酸1莫耳，在0.01莫耳當量至10莫耳當量之範圍內為宜，而以0.1莫耳當量至2莫耳當量之範圍內為佳。
本步驟中在使用酸與有機胺之鹽或混合物時，可例舉如三氟乙酸與三乙胺之鹽或混合物，更具體地，可為如相對於三氟乙酸2當量經混合三乙胺1當量者。
本步驟中可使用之酸，可以溶劑使濃度成為0.1%至30%之範圍內適當地稀釋後使用。溶劑方面，只要與反應無關聯即可並無特別之限定，可舉如二氯甲烷、乙腈、醇類(乙醇、異丙醇、三氟乙醇等)、水或其混合物。
上述反應中之反應溫度，以如在10℃至50℃之範圍內為佳，20℃至40℃之範圍內更佳，25℃至35℃之範圍內又更佳。
反應時間，係視使用的酸之種類、反應溫度而異，而通常以0.1分鐘至24小時之範圍內為宜。以1分鐘至5小時之範圍內為佳。
又，本步驟終了後，亦可視需要，可添加鹼用於中和系中存在之酸。「鹼」方面，並無特別之限定，可為如二異丙胺。鹼可以濃度成為0.1%(v/v)至30%(v/v)之範圍內而使用適當之溶劑稀釋後使用。
本步驟中所使用之溶劑方面，只要與反應無關聯即可並無特別之限定，可例舉如二氯甲烷、乙腈、醇類(乙醇、異丙醇、三氟乙醇等)、水或其混合物。反應溫度，以如在10℃至50℃之範圍內為佳，20℃至40℃之範圍內更佳，25
℃至35℃之範圍內又更佳。
反應時間，係視使用之鹼之種類、反應溫度而異，而通常以0.1分鐘至24小時之範圍內為宜，以1分鐘至5小時之範圍內為佳。
又，化合物(Ⅱ)中，n=1、L為基(Ⅳ)、下述之通式(Ⅱa)所示之化合物(以下，亦稱為化合物(Ⅱa)。)，可依照下述方法製造。
步驟1：
係藉由以下通式(V)所示之化合物與醯化劑作用，以製造以下通式(Ⅵ)所示之化合物(以下，稱為化合物(Ⅵ)。)之步驟。
本步驟，可以化合物(V)為起始原料，再以一般已知
之連結基的導入反應進行。
特別，以下之通式(Ⅵa)所示之化合物，可藉由使用化合物(V)及琥珀酸酐之酯化反應之已知之方法進行而製造。
步驟2：
化合物(Ⅵ)係藉由與縮合劑等作用，再與固相支持體反應，製造化合物(Ⅱa)之步驟。
本步驟，係藉由以化合物(Ⅵ)與固相支持體之縮合反應之已知之方法進行製造。
化合物(Ⅱ)中，n=2至99(以13至29、14至28、15至27、16至26或17至25之範圍內之任意整數為佳)、L為基(Ⅳ)、下述之通式(Ⅱa2)所示之化合物，可以化合物(Ⅱa)為起始原料，再以本說明書中記載之PMO之製造方法中
的步驟A及步驟B經過所欲之次數重複進行而製造。
(2)步驟B：
化合物(Ⅲ)在鹼存在下藉由與N-嗎啉基單體化合物作用，製造下述通式(Ⅶ)所示之化合物(以下，稱為化合物(Ⅶ)。)之步驟。
本步驟，可以化合物(Ⅲ)在鹼存在下藉由與N-嗎啉基單體化合物作用而進行。
N-嗎啉基單體化合物方面，可例舉如下述通式(Ⅷ)所示之化合物。
本步驟中所使用之「鹼」方面，可例舉如二異丙胺、三乙胺、或N-乙基嗎啉。鹼之使用量，以如相對於化合物(Ⅲ)1莫耳，在1莫耳當量至1000莫耳當量之範圍內為宜，而以10莫耳當量至100莫耳當量之範圍內為佳。
本步驟中可使用之N-嗎啉基單體化合物及鹼，可以適當之溶劑稀釋使濃度為0.1%至30%後使用。溶劑方面，只要與反應無關聯即可並無特別之限定，可舉如N,N-二甲基四氫咪唑酮、N-甲基哌啶酮、DMF、二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃、或其混合物。
反應溫度，以如在0℃至100℃之範圍內為佳，10℃至50℃之範圍內更佳。
反應時間，係視使用之鹼之種類、反應溫度而異，而通常以1分鐘至48小時之範圍內為宜，30分鐘至24小時之範圍內為佳。
又本步驟終了後，視需要，亦可再添加醯化劑。「醯化劑」方面，可例舉如乙酸酐、乙酸氯、苯氧基乙酸酐。
醯化劑，可如使濃度在0.1%至30%之範圍內以適當之溶劑稀釋後使用。溶劑方面，只要與反應無關聯即可並無特別之限定，可例舉如二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃、醇類(乙醇、異丙醇、三氟乙醇等)、水或其混合物。
又，必要時，亦可與醯化劑共同使用如吡啶、二甲基吡啶、柯林鹼(collidine)、三乙胺、二異丙基乙胺、N-乙基嗎啉等之鹼。醯化劑之使用量，以0.1莫耳當量至10000莫耳當量之範圍內為佳，1莫耳當量至1000莫耳當量之範圍內更佳。鹼之使用量，以如相對於醯化劑1莫耳，在0.1莫耳當量至100莫耳當量之範圍內為佳，1莫耳當量至10莫耳當量之範圍內更佳。
本反應之反應溫度，以在10℃至50℃之範圍內為佳，10℃至50℃之範圍內更佳，20℃至40℃之範圍內又更佳，25℃至35℃之範圍內再更佳。反應時間，係如視使用之醯化劑之種類、反應溫度而異，而通常以0.1分鐘至24小時之範圍內為宜，以1分鐘至5小時之範圍內為佳。
(3)步驟C：
在步驟B中所製造之化合物(Ⅶ)中，使用脫保護劑脫離保護基，製造通式(Ⅸ)所示之化合物之步驟。
本步驟，可藉由化合物(Ⅶ)與脫保護劑作用進行。
「脫保護劑」方面，可例舉如濃氨水、甲基胺。本步驟中可使用之「脫保護劑」，亦可以如水、甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃、DMF、N,N-二甲基四氫咪唑酮、N-甲基哌啶酮或其混合溶劑稀釋後使用。其中，以乙醇為佳。脫保護劑之使用量，以如相對於化合物(Ⅶ)1莫耳，在如1莫耳當量至100000莫耳當量之範圍內為宜，而以10莫耳當量至1000莫耳當量之範圍內為佳。
反應溫度，以如在15℃至75℃之範圍內為宜，而以40℃至70℃之範圍內為佳，50℃至60℃之範圍內更佳。脫保護反應之時間，視化合物(Ⅶ)之種類、反應溫度等而異，而以10分鐘至30小時之範圍內為宜，30分鐘至24小時之範圍內更佳，5小時至20小時之範圍內又更佳。
(4)步驟D：
藉由步驟C中所製造之化合物(Ⅸ)與酸作用，以製造PMO(I)之步驟。
本步驟中，可藉由於化合物(Ⅸ)中加入酸進行。
本步驟中可使用之「酸」方面，可例舉如三氯乙酸、二氯乙酸、乙酸、磷酸及鹽酸等。酸之使用量，以如使用使溶液之pH在0.1至4.0之範圍內為宜，而使用以在1.0至3.0之範圍內為佳。溶劑方面，只要與反應無關聯即可並無特別之限定，可例舉如乙腈、水或其混合溶劑。
反應溫度，以在10℃至50℃之範圍內為佳，20℃至40℃之範圍內更佳，25℃至35℃之範圍內又更佳。脫保護反應時間，視化合物(Ⅸ)之種類、反應溫度等而異，而通常以0.1分鐘至5小時之範圍內為宜，1分鐘至1小時之範圍內為佳，1分鐘至30分鐘之範圍內更佳。
PMO(I)，可由本步驟中所獲得之反應混合物以通常之分離精製手段，例如萃取、濃縮、中和、過濾、離心分離、再結晶、C8至C18之逆相管柱層析、陽離子交換管柱層析、陰離子交換管柱層析、膠體過濾層析、高速液相層析、透析、臨界過濾等手段單獨或組合使用而獲得，可純化精製所欲之PMO(I)(參考如國際公開公報WO 1991/09033)。
在使用逆相管柱層析精製PMO(I)時，溶出溶劑方面，可如使用20mM之三乙胺/乙酸緩衝液與乙腈之混合溶液。
又，在使用離子交換管柱層析精製PMO(I)時，可如使用1M之食鹽水與10mM之氫氧化鈉水溶液之混合溶液。
胜肽核酸，係下述通式所示之基作為構成單位的本發明之反義寡聚物。
胜肽核酸，可如依照以下之文獻製造。
1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991)
2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, Jacs., 114, 1895 (1992)
3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)
4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)
5) T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)
又，本發明之反義寡聚物，5'末端，亦可為下述化學式(1)至(3)之任意之基。而以(3)-OH為佳。
本發明較佳實施態樣之反義寡聚物，可藉由誘導使外顯子跳讀或mRNA分解，在mRNA層次抑阻肌肉生長抑制素。因此，以本發明較佳實施態樣之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或水合物，藉由投藥予有預防或治療肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病必要之對象，可預防或治療肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病。
本發明之數種態樣，可提供有效成分含有本發明之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或水合物之醫藥組成物(以下，稱為「本發明之醫藥組成物」)。本發明之醫藥組成物，以肥胖、代謝症候群、糖尿病等代謝障礙、肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病治療用為佳。肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病之例，可舉如包含肌營養不良症(杜興型肌營養不良症、福山型肌營養不良症、肌僵直性營養不良症等)、先天性肌肉病變、包涵體肌炎等肌原性肌萎縮症、肌萎縮性側索硬化症、脊髓性肌萎縮症、脊髓延髓肌萎縮症等神經原性肌萎縮症、腦中風引發之廢用症候群等廢用性肌萎縮症、癌惡病質、伴隨敗血症之肌萎縮等肌消耗性疾病、伴隨老化之老年性骨骼肌肌少症(老年性肌少症)的各種肌少症等，而以肌營養不良症為佳。
本發明其他數種態樣，可提供包含對有預防或治療肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病必要之對象，以治療上有效量之本發明之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或水合物投藥，以預
防或治療肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病之方法。該治療方法中，本發明之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或水合物，可以本發明之醫藥組成物的形態投藥予對象。
本發明中，「對象」，係人類或非人類溫血動物，如：鳥類、及牛、猿猴、貓、小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、豬、犬、兔、綿羊、馬等非人類哺乳動物。該「對象」，以人類為佳。
本發明另外數種態樣，可提供在肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病之治療用醫藥組成物的製造中，使用本發明之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或水合物。
本發明再另外數種態樣，可提供在肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病之治療中使用本發明之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或水合物。
本發明之醫藥組成物中所含之本發明之反義寡聚物的醫藥上容許之鹽方面，可舉如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽之鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽之鹼土金屬鹽；鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等之金屬鹽；銨鹽；第三辛基胺鹽、二苯甲基胺鹽、嗎啉鹽、葡萄糖胺鹽、苯基甘胺酸烷酯鹽、乙烷二胺鹽、N-甲基還原葡萄糖胺鹽、胍鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、二環己胺鹽、N,N-二苯甲基乙二胺鹽、普魯卡因氯鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苯甲基-苯乙基胺鹽、哌嗪鹽、四甲基銨鹽、三(羥基甲基)胺基甲烷鹽之有機胺鹽；氟化氫酸鹽、鹽酸鹽、溴化氫酸鹽、碘化氫酸鹽之鹵化氫酸鹽；硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸
鹽；甲烷磺酸鹽、三氟甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽之低級烷磺酸鹽；苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽之芳磺酸鹽；乙酸鹽、蘋果酸鹽、反丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、順丁烯二酸鹽等有機酸鹽；甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽之胺基酸鹽等。此等鹽，可以一般已知之方法製造。
本發明之醫藥組成物中所含之本發明之反義寡聚物，亦可為其水合物之形態。該等水合物，可以一般已知之方法製造。
本發明之醫藥組成物之投藥形態，只要為醫藥上容許之投藥形態即可並無特別之限定，可視治療方法選擇，惟由對肌組織的運送之容易性之觀點言之，以靜脈內投藥、動脈內投藥、肌肉內投藥、皮下投藥、經口投藥、組織內投藥、經皮投藥等為佳。又，本發明之組成物可獲得之劑型方面，並無特別之限定，可如各種注射劑、經口劑、點滴劑、吸入劑、軟膏劑、乳液劑等。
本發明之醫藥組成物，亦可含有促進該寡聚物運送至肌肉織之支持體。此等支持體，只要為醫藥上容許者即可並無特別之限定，其例可舉如陽離子性之脂質體(liposome)、陽離子性聚合物等陽離子性支持體，或者利用病毒外套膜的支持體。陽離子性微脂粒方面之例，可舉如構成之必須成分為2-O-(2-二乙基胺基乙基)胺甲醯基-1,3-O-二油醯基丙三醇及磷脂質所形成之脂質體(以下，稱為「脂質體A」)、Oligofectamine(註冊商標)(Invitrogen公
司製造)、Lipofectin(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、Lipofectamine(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、Lipofectamine 2000(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、DMRIE-C(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、GeneSilencer(註冊商標)(Gene Therapy Systems公司製造)、TransMessenger(註冊商標)(QIAGEN公司製造)、TransIT TKO(註冊商標)(Mirus公司製造)、Nucleofector Ⅱ(Lonza公司製造)。其中，以脂質體A為佳。陽離子性聚合物方面之例，可舉如JetSI(註冊商標)(Qbiogene公司製造)、Jet-PEI(註冊商標)(聚乙二亞胺，Qbiogene公司製造)。利用病毒外套膜的支持體方面之例，可舉如GenomeOne(註冊商標)(HVJ-E脂質體，石原產業公司製造)。或者，亦可使用日本專利2924179號中記載之醫療器材、專利再公表公報第2006/129594號及專利再公表公報第2008/096690號中記載之陽離子性支持體。
詳細情形，可參考：美國專利第4,235,871號、同上第4,737,323號、國際公開公報第96/14057號、"New RRC,Liposomes：A practical approach,IRL Press,Oxford(1990),pages 33-104"等。
本發明之醫藥組成物中所含之本發明之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或水合物的濃度，係視支持體的種類等而不同，而以在0.1nM至100μM的範圍內為宜，在100nM至10μM的範圍內為佳。又，本發明之醫藥組成物中所含之本發明之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或水合物與支持體的重量比(支持體/本發明之反義寡聚物、其醫
藥上容許之鹽或水合物)，視該寡聚物之性質及該支持體的種類等而不同，而以在0.1至100的範圍內為宜，在0.1至10的範圍內為佳。
本發明之醫藥組成物中，除本發明之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或水合物及上述之支持體以外，亦可任意配合醫藥上容許之添加劑。該添加劑方面之例，可舉如乳化輔助劑(例如，碳數6至22之脂肪酸及其醫藥上容許之鹽、白蛋白、聚葡萄糖)、安定劑(例如，膽固醇、磷脂酸)、等滲透壓劑(例如，氯化鈉、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖)、pH調整劑(例如，鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、三乙醇胺)。此等可以一種或二種以上使用。本發明之醫藥組成物中該添加劑之含量，以90重量%以下為宜，而以70重量%以下為佳，50重量%以下更佳。
本發明之醫藥組成物，可在支持體之分散液中加入本發明之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或水合物，再經過適當地攪拌調製。又，添加劑，可在本發明之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或水合物添加前亦可在添加後在適當之步驟中添加。可在添加本發明之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或水合物時使用之水性溶劑方面，只要為醫藥上容許者即可並無特別之限定，可舉如注射用水、注射用蒸餾水、生理食鹽水等電解質液，葡萄糖液、麥芽糖液等糖液。又，該情形下之pH及溫度等條件，本技術範疇技術人員可適當選擇。
本發明之醫藥組成物，可為如液劑及其冷凍乾燥製
劑。該冷凍乾燥製劑，可以常法，將具有液劑形態之本發明之醫藥組成物冷凍乾燥處理而調製。例如，可在具有液劑形態之本發明之醫藥組成物加以適當地滅菌後，再以預定量分裝於小瓶，之後於約-40至-20℃之條件下進行預備冷凍2小時左右，於約0至10℃之減壓下進行一次乾燥，其次，再於約15至25℃之減壓下進行二次乾燥進行冷凍乾燥。然後，一般而言，小瓶內部以氮氣置換，封栓之後即可獲得本發明之醫藥組成物的冷凍乾燥製劑。
本發明之醫藥組成物的冷凍乾燥製劑，一般可藉由添加任意之適當溶液(再溶解液)再溶解後使用。此等再溶解液方面，可舉如注射用水、生理食鹽水、其他一般之輸注液。該再溶解液之液量，係視用途等不同惟並無特別之限定，以冷凍乾燥前液量之0.5至2倍量、或500mL以下為宜。
本發明之醫藥組成物投藥時之使用量，以考慮含有本發明之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或水合物之種類，劑形、年齡及體重等對象之狀態，投藥途徑，疾病之性質及程度而調製為佳，在對象為人類時，本發明之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或水合物之量對成人，可在每1日0.1mg至10g/人之範圍內，而一般以在1mg至1g/人之範圍內為佳。該數量亦有視目標疾病之種類、投藥形態、目標分子而異之情形。因此，視情形會有其以下即可，相反地亦會有需要其以上之用量的情形。或者亦可以1日1次至數次或間隔1日至數日投藥。
本發明之醫藥組成物另外之態樣，可舉含有可表現本發明之反義寡核苷酸的載體及上述支持體的醫藥組成物。該表現載體，亦可為可表現複數的本發明之反義寡核苷酸者。該類醫藥組成物中，與前述相同，亦可添加醫藥上容許之添加劑。該醫藥組成物中所含之表現載體的濃度，視支持體的種類等而不同，而以在0.1nM至100μM的範圍內為宜，在100nM至10μM的範圍內為佳。該醫藥組成物中所含之表現載體與支持體的重量比(支持體/表現載體)，視表現載體的性質、支持體的種類等而異，而以在0.1至100的範圍內為宜，在0.1至10的範圍內為佳。又，該醫藥組成物中所含之支持體的含量，亦與前述相同，關於其調製方法等，亦與前述相同。
再者，本說明書中所引用之全部的文獻、及公開公報、專利公報、其他之專利文獻，亦併入於本說明書中以為參考。
以下，再舉實施例，進一步詳細說明本發明，惟本發明並不限定於實施例中所示之範圍。
以下，再舉實施例及試驗例，進一步詳細說明本發明，惟本發明並不限定於實施例所示之範圍。
支持在胺基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基
丁酸
步驟1：4-{[(2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸之製造
於氬氣氛圍下，將41.11g之1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-5-甲基嘧啶-2,4-二酮及15.58g之4-二甲基胺基吡啶(4-DMAP)懸浮於850mL之二氯甲烷，加入12.76g之琥珀酸酐，於室溫攪拌反應3.5小時。該反應液使用二氯甲烷及1M磷酸二氫鈉水溶液進行萃取之操作。所獲得之有機層依序以1M磷酸二氫鈉水溶液、飽和食鹽水滌洗淨。所獲得之有機層以硫酸鈉乾燥、減壓濃縮。所獲得之固體中加入600mL之二氯甲烷結晶，並進行過濾。再次加入300mL之二氯甲烷並攪拌5分鐘之後，進行過濾及減壓乾燥一夜，獲得50.2g之目的物。
步驟2：支持在胺基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸之製造
將50.2g之4-{[(2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸溶於吡啶(脫水)600mL中，加入12.4g之4-DMAP、77.6g之1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。其次，加入40.5g之胺基聚苯乙烯樹脂：Aminomethyl resin(渡邊化學公司製造，A00673，200至400網目，1mmol/g，1%DVB)、69.6mL之三乙胺，並於室溫振盪4日。反應後，過濾樹脂。所得
之樹脂依序以吡啶、甲醇、二氯甲烷洗淨，減壓乾燥。在該獲得之樹脂中加入四氫呋喃(脫水)500mL、乙酸酐104mL、2,6-二甲基吡啶128mL，並在室溫振盪4小時。過濾樹脂，並依序以吡啶、甲醇、二氯甲烷洗淨，減壓乾燥，獲得59.0g之目的物。
該目的物之附載量(loading amount)，使用一般已知之方法，測定在每1g樹脂之三苯甲基莫耳量於409nm之UV吸光度決定。該樹脂之附載量，為467.83μmol/g。
UV測定條件
機器：U-2910(日立製作所公司)
溶劑：甲烷磺酸
波長：409nm
ε值：45000
支持在胺基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸
係依照參考例1相同之方法，製造標題之化合物。惟，替代參考例1之步驟1中所使用之1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-5-甲基嘧啶-2,4-二酮，本步驟中，係使用N-{1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-2-側氧基-1,2-二氫嘧啶-4-基}苯甲醯胺。
該目的物之附載量，係使用一般已知之方法，測定在每1g樹脂之三苯甲基莫耳量於409nm之UV吸光度決定。該樹脂之附載量，為460.28μmol/g。
支持在胺基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(6-苯甲醯胺嘌呤-9-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸
係依照參考例1相同之方法，製造標題之化合物。惟，替代參考例1之步驟1中所使用之1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-5-甲基嘧啶-2,4-二酮，本步驟中，係使用N-{9-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]嘌呤-6-基}苯甲醯胺。
該目的物之附載量，係使用一般已知之方法，測定在每1g樹脂之三苯甲基莫耳量於409nm之UV吸光度決定。該樹脂之附載量，為425.13μmol/g。
支持在胺基聚苯乙烯樹脂之4-{{(2S,6R)-6-{6-(2-氰基乙氧基)-2-[(2-苯氧基乙醯基)胺基]嘌呤-9-基}-4-三苯甲基嗎啉-2-基}甲氧基}-4-側氧基丁酸
係依照參考例1相同之方法，製造標題之化合物。惟，替代參考例1之步驟1中所使用之1-[(2R,6S)-6-(羥基甲基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]-5-甲基嘧啶-2,4-二酮，本步驟中，係使用N-{6-(2-氰基乙氧基)-9-[(2R,6S)-6-(羥基甲
基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]嘌呤-2-基}-2-苯氧基乙醯胺。
該目的物之附載量，係使用一般已知之方法，測定在每1g樹脂之三苯甲基莫耳量於409nm之UV吸光度決定。該樹脂之附載量，為341.09μmol/g。
依照以下的實施例1之記載、或PCT/JP2015/57180中記載的方法使用核酸合成機(AKTA Oligopilot 10 plus)，合成表1至表3之PMO No.1至191、198、199、201至316、321至323、325至327、333(5'末端為基(3))。
對應5'末端鹼基，支持在胺基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(5-甲基-2,4-二側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸(參考例1)、支持在胺基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(4-苯甲醯胺-2-側氧基嘧啶-1-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸(參考例2)、支持在胺基聚苯乙烯樹脂之4-{[(2S,6R)-6-(6-苯甲醯胺嘌呤-9-基)-4-三苯甲基嗎啉-2-基]甲氧基}-4-側氧基丁酸(參考例3)、或支持在胺基聚苯乙烯樹脂之4-{{(2S,6R)-6-{6-(2-氰基乙氧基)-2-[(2-苯氧基乙醯基)胺基]嘌呤-9-基}-4-三苯甲基嗎啉-2-基}甲氧基}-4-側氧基丁酸(參考例4)0.1g填充於含過濾器之反應容器中，使用胜肽合成機(FOCUS)，開始下述合成循環。之後以形成表1至表4中記載的各化合物之鹼基序列，在各偶合循環反應中添加所欲之嗎啉代單體化合物(參考下述表4)。
又，脫保護溶液方面，係使用三氟乙酸(2當量)及三乙胺(1當量)之混合物成為3%(w/v)的方式，經以含有1%(v/v)乙醇及10%(v/v)2,2,2-三氟乙醇的二氯甲烷溶液溶解者。中和溶液方面，係使用N,N-二異丙基乙胺成為5%(v/v)的方式，經以含有25%(v/v)2-丙醇之二氯甲烷溶液溶解者。活化劑溶液方面，係使用含有20%(v/v)N,N-二異丙基乙胺之1,3-二甲基-2-咪唑啶酮溶液。單體溶液，係使用嗎啉基單體化合物成為0.20M的方式，經以四氫呋喃溶
解者。封端溶液方面，使用對二氯甲烷經以10%(v/v)之乙酸酐及15%(v/v)之2,6-二甲基吡啶溶解者。
經支持有上述所合成之PMO的胺基聚苯乙烯樹脂自反應容器回收吸，並在30℃減壓乾燥2小時以上。經乾燥之支持於胺基聚苯乙烯樹脂的PMO加入容器中，添加5mL之28%氨水-乙醇(1/3)，並於55℃靜置16小時。過濾胺基聚苯乙烯樹脂，以水-乙腈(1/1)洗淨。於所得之濾液中加入乙醇3mL及二乙醚35mL，經過離心分離後，傾液去除上清液，減壓乾燥餘留物。獲得之餘留物溶於10mL之20mM乙酸銨水溶液與乙腈之混合溶劑(4/1)中，以逆相HPLC精製。使用之條件，如以下之表5所示。
分析各分液，回收目的物。獲得之溶液中加入4mL之0.1M鹽酸水溶液，靜置2小時。反應後，加入0.4mL之1M氫氧化鈉水溶液中和，並以膜過濾器(0.22μm)過濾。
所獲得之含有目的物之水溶液中加入0.4mL之1M氫氧化鈉水溶液成為鹼性，並以陰離子交換樹脂管柱精製。使用之條件如下述表6所示。
分析各分液(HPLC)，可以水溶液獲得目的物。於所獲得之水溶液中添加0.1M之磷酸緩衝液(pH6.0)中和。其次，以下述表7所示之條件實施逆相HPLC脫鹽。
回收目的物，減壓濃縮。所獲得之餘留物溶於水中，冷凍乾燥，可獲得白色棉狀固體之目的化合物。ESI-TOF-MS之計算值、測定值如表1至表3所示。
對RD細胞(人類橫紋肌肉瘤細胞株)3×105個，以表1或表3之反義寡聚物-1、3、及10μM，使用Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L以Nucleofector Ⅱ(Lonza)導入。使用T-030之程式。
在導入後，細胞，再以含10%胎牛血清(FCS)(Invitrogen公司製造)之Dulbecco修改Eagle氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM)(Sigma公司製造，以下亦同)2mL中，於37℃、5%CO2之條件下培養三夜。
細胞以PBS(日本水產公司製造，以下亦同)洗淨1次之後，於細胞中添加350μL含1% 2-氫硫基乙醇(NACALAI TESQUE公司製造)的Buffer RLT(QIAGEN公司製造)，並於室溫靜置數分鐘以使細胞溶解，然後以QIAshredder均質機(QIAGEN公司製造)回收。經過20,400×g離心2分鐘，製作成均質物。再依照RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司製造)所附之方案抽取總RNA。所抽取之總RNA的濃度以NanoDrop ND-1000(LMS公司製造)測定。
然後以10ng所抽取之總RNA為模版，使用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit(QIAGEN公司製造)進行One-Step RT-PCR。依照套組中所附之方案，調製反應液。循環加熱機(thermal cycler)係使用TaKaRa PCR Thermal
Cycler Dice Touch(TaKaRa Bio公司製造)。RT-PCR之程序，係如下操作。
50℃，30分鐘：反轉錄反應
95℃，15分鐘：聚合酶活化，反轉錄酶失活
[94℃，30秒；61℃，30秒；72℃，1分鐘]×27循環：PCR
72℃，7分鐘：最終伸長反應
RT-PCR中所使用之正向引子及反向引子之鹼基序列如下。
正向引子：5'-TTCGTCTGGAAACAGCTCCT-3'(序列編號360)
反向引子：5'-AGAGGGTAACGACAGCATCG-3'(序列編號361)
1μL上述PCR的反應產物使用Bioanalyzer(Agilent公司製造)進行解析。
測定第2號外顯子跳讀之PCR擴增子的多核苷酸量「A」、及野生型之PCR擴增子的多核苷酸量「B」。再由該「A」及「B」之測定值，依照以下之式求出跳讀效率。
跳讀效率(%)=A/(A+B)×100
實驗結果
結果如第1圖至第14圖所示。
由第1圖至第14圖可知，本發明之中反義寡聚物可高效地使第2號外顯子跳讀。
活體外分析
以試驗例1相同之方法進行實驗。惟，對RD細胞(人類橫紋肌肉瘤細胞株)3×105個，係以PMO No.100(NMS-191)、PMO No.139(NMS-233)、PMO No.79(NMS-169)、PMO No.114(NMS-206)之本發明寡聚物單獨、或構成其等之2股單元寡聚物之各自單獨或2股單元寡聚物之混合體，使用Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L以Nucleofector Ⅱ(Lonza)導入。使用T-030之脈衝程式。導入之序列之組合如下。
實驗結果
結果如第15圖所示。由本實驗可知，與以第2號外顯子之不同位置為目標的2股反義核酸之混合物(PMO No.290(NMS-258)及PMO No.289(NMS-257)、PMO No.290(NMS-258)及PMO No.288(NMS-237)、PMO No.287(NMS-236)
及PMO No.293(NMS-265)、PMO No.287(NMS-236)及PMO No.288(NMS-237)、PMO No.291(NMS-263)及PMO No.292(NMS-264))比較，各個連結之本發明之寡聚物PMO No.100(NMS-191)、PMO No.139(NMS-233)、PMO No.79(NMS-169)、PMO No.114(NMS-206)之本發明之寡聚物，可以高效率地使第2號外顯子跳讀。
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<223> 合成核酸
<400> 379
實驗結果圖非本案之代表圖，故無指定代表圖
Claims (14)
- 一種反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，前述反義寡聚物係由選自序列編號103、序列編號116、序列編號117、序列編號120、序列編號128、序列編號131、序列編號136、序列編號137、序列編號140、序列編號145、序列編號146、序列編號147、序列編號148、序列編號149、序列編號152、序列編號155、序列編號156、序列編號157、序列編號159、序列編號162、序列編號163、序列編號165、序列編號166、序列編號167、序列編號168、序列編號169、序列編號170、序列編號171、序列編號176、序列編號177、序列編號178、序列編號179、序列編號180、序列編號183、序列編號187、序列編號189、序列編號190、序列編號191、序列編號192、序列編號193、序列編號196、序列編號199、序列編號200、序列編號201、序列編號203、序列編號204、序列編號206、序列編號208、序列編號212、序列編號213、序列編號214、序列編號215、序列編號217、序列編號225、序列編號226、序列編號228、序列編號229、序列編號231、序列編號232、序列編號233、序列編號236、序列編號237、序列編號240、序列編號243、序列編號244、序列編號245、序列編號246、序列編號247、序列編號248、序列編號252、序列編號261、序列編號273、序列編號274、序列編號275、序列編號277、序列編號95、 序列編號96、序列編號107、序列編號223、序列編號234、序列編號235、序列編號242、序列編號249、序列編號250、序列編號251、序列編號257、序列編號290、序列編號291、序列編號292、序列編號293、序列編號294、序列編號295、序列編號297、序列編號298、序列編號299、序列編號300、序列編號301、序列編號302、序列編號303、序列編號304及序列編號305所成之群組中的任意1種鹼基序列組成者。
- 如專利申請範圍第1項所述之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述反義寡聚物為寡核苷酸。
- 如專利申請範圍第2項所述之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸的糖部分及/或至少1個磷酸鍵結部分係經修飾。
- 如專利申請範圍第3項所述之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸的糖部分為2'位之-OH基經選自OR、R、R'OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br及I所成群組的任意之基取代的核糖，上述R表示烷基或芳基，上述R'表示伸烷基。
- 如專利申請範圍第3項或第4項所述之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸的磷酸鍵結部分，為自硫代磷酸酯(phosphorothioate)鍵、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate) 鍵、烷基膦酸(alkylphosphonate)鍵、胺基磷酸酯(phosphoramidate)鍵、及硼烷膦酸(boranophosphate)鍵所成之群組選擇的任意1種。
- 如專利申請範圍第1項所述之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述反義寡聚物為N-嗎啉基寡聚物。
- 如專利申請範圍第6項所述之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述N-嗎啉基寡聚物為二胺基磷酸酯N-嗎啉基寡聚物。
- 如專利申請範圍第6項或第7項所述之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中5'末端為下述化學式(1)至化學式(3)之任意之基，
- 如專利申請範圍第1項、第4項、第6項及第7項中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽或水合物，其中前述反義寡聚物由選自序列編號171、序列編號192、序列編號245、及序列編號231所成之群組中的任意1種鹼基序列組成者。
- 一種醫藥組成物，其係含有如專利申請範圍第1項至第9項中任一項所述之反義寡聚物或其醫藥上容許之鹽 或水合物。
- 如專利申請範圍第10項所述之醫藥組成物，更含有醫藥上容許之支持體。
- 如專利申請範圍第10項或第11項所述之醫藥組成物，其係肌萎縮性疾病或肌消耗性疾病之治療用。
- 如專利申請範圍第12項所述之醫藥組成物，其係肌營養不良症治療用。
- 如專利申請範圍第12項所述之醫藥組成物，該醫藥組成物為用以投藥予人類者。
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