TW202200162A

TW202200162A - 誘導外顯子５１跳讀的反義核酸

Info

Publication number: TW202200162A
Application number: TW110107021A
Authority: TW
Inventors: 本多優; 鞭馬奏萌; 福井崇弘; 長谷川佐季; 武田伸一; 青木吉嗣
Original assignee: 日商日本新藥股份有限公司; 國立研究開發法人國立精神神經醫療研究中心
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2021-02-26
Publication date: 2022-01-01
Also published as: US20230097387A1; ECSP22074446A; US11781140B2; CO2022013685A2; US20230140736A1; WO2021172498A1; CA3173049A1; JPWO2021172498A1; EP4112083A1; MX2022010545A; CN115210376A; PE20230237A1; JP7292636B2; IL295967A; JP2022180420A; BR112022017066A2; CL2022002279A1; AU2021226089A1; ZA202209294B; KR20220145865A

Abstract

本說明書中係提供一種藥劑，其係使人類肌肉萎縮蛋白的基因之第51號外顯子高效率地跳讀。再者，在本說明書中，係提供一種反義寡聚物，其係具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因之第51號外顯子之跳讀的活性者。

Description

誘導外顯子51跳讀的反義核酸

本發明係有關一種誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因之第51號外顯子之跳讀的反義寡聚物(Antisense oligomer)及含有該反義寡聚物之醫藥組成物。

杜興氏型肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)係出生男性約3,500人中有1人發症之頻率最高的嚴重地遺傳性進行性肌肉萎縮症。嬰幼兒期顯示與正常人幾乎相同的運動功能，惟從4至5歲左右開始可觀察到肌力降低。之後，DMD患者的肌力持續降低，DMD患者至12歲左右變得無法步行不能，於20歲左右由於心臟衰竭或呼吸器官衰竭導致死亡。目前，對於DMD還沒有充分有效的治療法，因而強力地謀求開發出有效的治療藥。

DMD之原因已知為肌肉萎縮蛋白的基因變異。肌肉萎縮蛋白的基因存在於X染色體，係從220萬鹼基對的DNA形成之巨大的基因。從DNA轉錄為mRNA前驅物，進一步藉由剪接去除內含子(intro)，結合79個外顯子，對應轉譯區域之mRNA成為11,058鹼基。從該mRNA轉譯成3,685個胺基酸，生成肌肉萎縮蛋白的蛋白質。肌肉萎縮蛋白的蛋白質係參予維持肌肉細胞之膜穩定性，為了使肌肉細胞不易崩壞為必須。由於DMD患者之肌肉萎縮蛋白的基因具有變異，在肌肉細胞中幾乎沒有表現具有功能之肌肉萎縮蛋白的蛋白質。因此，DMD患者體內，變得無法維持肌肉細胞的結構，大量的鈣離子流入肌肉細胞內。此結果，產生類似炎症之反應，朝纖維化進展，導致變得難以再生肌肉細胞。

貝克氏型肌肉萎縮症(Becker muscular dystrophy,BMD)之原因亦為肌肉萎縮蛋白的基因變異，惟其症狀雖因肌肉萎縮而呈現肌力降低，然而通常與DMD相比較輕微，肌力降低之進展亦緩慢，大多時候於成人期才發症。DMD與BMD臨床症狀的不同，推測係由於藉由變異導致肌肉萎縮蛋白之mRNA轉譯為肌肉萎縮蛋白的蛋白質時之胺基酸讀取框遭到破壞，或者是被維持所致者(非專利文獻1)。亦即，在DMD中，藉由胺基酸讀取框有錯位變異，導致幾乎沒有表現具有功能之肌肉萎縮蛋白的蛋白質，在BMD中，藉由變異導致外顯子的一部分缺失，然而，由於胺基酸讀取框仍維持，因而產生即便為不完全仍具有功能之肌肉萎縮蛋白的蛋白質。

外顯子跳讀法係作為DMD的治療法而被期待。該方法，係藉由改變剪接而修復肌肉萎縮蛋白之mRNA的胺基酸讀取框，誘導表現部分功能經回復之肌肉萎縮蛋白的蛋白質的方法(非專利文獻2)。成為外顯子跳讀對象之胺基酸序列部分變成缺失。因此，於該治療中被表現之肌肉萎縮蛋白的蛋白質係變得較正常者短，惟為了維持胺基酸讀取框，仍部份地保持將肌肉細胞穩定化之功能。因此，藉由外顯子跳讀，可期待DMD係變得如較輕症之BMD般呈現相同的症狀。外顯子跳讀法係經由利用小鼠或狗進行之動物實驗，對於人類DMD患者進行臨床試驗。

外顯子跳讀係可藉由將5’或3’剪接部位中之任一者或雙方，或外顯子內部作為標的之反義核酸的結合而誘導。外顯子係在僅雙方的剪接部位藉由剪接體複合物辨識時包含於mRNA中。因此，將剪接部位藉由反義核酸進行靶向作用(targeting)，可誘導外顯子跳讀。再者，為了使外顯子被剪接機構所辨識，推測必須與外顯子剪接增強子(enhancer)(ESE)之SR蛋白質結合，將ESE進行靶向作用亦可誘導外顯子之跳讀。

由於肌肉萎縮蛋白基因之變異係根據DMD患者而不同，對應基因變異之場所或種類之反義核酸成為必須。至今為止，由西澳大學之Steve Wilton人等針對全部79個外顯子製作出誘導外顯子跳讀之反義核酸(非專利文獻3)，由荷蘭之Annemieke Aartsma-Rus人等針對39種類的外顯子製作出誘導外顯子跳讀之反義核酸(非專利文獻4)。

推測全部DMD患者的13%左右，係可藉由跳讀第51號外顯子(以下，亦稱為「外顯子51」)而治療。近年來，關於將肌肉萎縮蛋白的基因之外顯子51作為外顯子跳讀標的之研究，已有複數篇報導(專利文獻1至10及非專利文獻3至7)。

[先前技術文獻]

[專利文獻]

[專利文獻1] 國際公開第2015/137409號

[專利文獻2] 國際公開第2019/241385號

[專利文獻3] 國際公開第2002/024906號

[專利文獻4] 國際公開第2004/048570號

[專利文獻5] 國際公開第2004/083432號

[專利文獻6] 國際公開第2006/000057號

[專利文獻7] 國際公開第2010/048586號

[專利文獻8] 國際公開第2009/054725號

[專利文獻9] 國際公開第2010/050801號

[專利文獻10] 國際公開第2010/050802號

[非專利文獻1] Monaco A. P. et al., Genomics 2:90-95 (1988)

[非專利文獻2] Matsuo M., Brain and Development 18:167-172 (1996)

[非專利文獻3] Wilton S. D. et al., Molecular Therapy 15:1288-1296 (2007)

[非專利文獻4] Annemieke Aartsma-Rus et al., Neuromuscular Disorders 12:S71-S77 (2002)

[非專利文獻5] Aoki Y. et al., Molecular Therapy 18:1995-2005 (2010)

[非專利文獻6] Nakano S. et al., Pediatrics International 53:524-529 (2011)

[非專利文獻7] Echigoya Y et al., Molecular Therapy 25:2561-2572 (2017)

在如上述之狀況中，期望一種以高效率地誘導肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀的新穎反義寡聚物。再者，期望一種維持高效率地誘導肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀的活性，並且，具有作為醫藥之優異性質(例如溶解性，安全性)之反義寡聚物。

本發明者等，詳細地研究上述文獻所記載之技術內容及肌肉萎縮蛋白的基因的結構等之結果，發現藉由投予具有序列編號1至89及91至93之任一者所示之鹼基序列的反義寡聚物，可高效率地誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀。再者，研究的結果，發現一種反義寡聚物，其係高效率地誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀，並且具有優異的溶解性及安全性。本發明者等基於上述見解，而完成本發明。

亦即，本發明係如下所述。

[1]

一種選自由下述(a1)至(d1)所組成之群組中的反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，惟排除由序列編號90及97至126之任一個鹼基序列構成的反義寡聚物：

(a1)包含序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列之反義寡聚物；

(b1)包含相對於序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列有1至5個鹼基經缺失、置換、插入、及/或附加之鹼基序列，並且，具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性之反義寡聚物；

(c1)包含相對於序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列，具有80%以上之序列一致性(sequence identity)之鹼基序列，並且，具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性之反義寡聚物；及

(d1)會與由與序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列互補之鹼基序列構成之寡核苷酸在嚴苛之條件下雜交之反義寡聚物，並且該反義寡聚物具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性。

[2]

一種選自由下述(e)至(h)所組成之群組中的反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，惟排除由序列編號90及97至126之任一個鹼基序列構成的反義寡聚物：

(e)由序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列構成之反義寡聚物；

(f)由相對於序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列有1至5個鹼基經缺失及/或置換之鹼基序列構成，並且，具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性之反義寡聚物；

(g)由相對於序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列，具有80%以上序列一致性之鹼基序列構成，並且，具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性之反義寡聚物；及

(h)會與由與序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列互補之鹼基序列構成之寡核苷酸在高嚴苛之條件下雜交之反義寡聚物，並且該反義寡聚物具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性。

[3]

如上述[1]或[2]所記載之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其中，前述反義寡聚物為具有相對於序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列，具有90%以上之序列一致性之核苷酸序列，並且，具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性之反義寡聚物。

[4]

如上述[1]所記載之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其中，前述反義寡聚物為選自由下列(a2)至(d2)所組成之群組中的反義寡聚物：

(a2)包含序列編號7、8、10、16、21、24、31、42、67及76中之任一個鹼基序列的反義寡聚物；

(b2)包含相對於序列編號7、8、10、16、21、24、31、42、67及76中之任一個鹼基序列有1至5個鹼基經缺失、置換、插入、及/或附加之鹼基序列，並且，具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性之反義寡聚物；

(c2)包含相對於序列編號7、8、10、16、21、24、31、42、67及76中之任一個鹼基序列，具有80%以上序列一致性之鹼基序列，並且，具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性之反義寡聚物；及

(d2)會與由與序列編號7、8、10、16、21、24、31、42、67及76中之任一個鹼基序列互補的鹼基序列構成之寡核苷酸在嚴苛之條件下雜交之反義寡聚物，並且該反義寡聚物具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性。

[5]

如上述[1]至[4]中任一項所記載之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其係寡核苷酸。

[6]

如上述[5]所記載之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸的糖部分及/或磷酸鍵結部分係經修飾。

[7]

如上述[5]或[6]所記載之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸的糖部分為2’位的-OH基經選自由OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br及I所組成之群組中之任一個基置換的核糖，其中，上述R表示烷基或芳香基，上述R’表示伸烷基。

[8]

如上述[5]至[7]中任一項所記載之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸的磷酸鍵結部分為選自由硫代磷酸酯(Phosphorothioate)鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基磷酸酯鍵、胺基磷酸酯(Phosphoramidate)鍵、及硼烷磷酸酯鍵(Boranophosphate)所組成之群組中之至少1者。

[9]

如上述[1]至[4]中任一項所記載之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其係N-嗎啉寡聚物。

[10]

如上述[9]所記載之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其係磷醯二胺(phosphorodiamidate)N-嗎啉寡聚物。

[11]

如上述[9]或[10]所記載之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其中，5’末端為下述化學式(1)至(3)中之任一種基，

[12]

一種肌肉萎縮症治療用醫藥組成物，係含有上述[1]至[11]中任一項所記載之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物。

[13]

如上述[12]所記載之醫藥組成物，係更含有藥學上可容許之擔體。

[14]

如上述[12]或[13]所記載之醫藥組成物，係用以對肌肉萎縮症患者進行投予者，前述患者係在肌肉萎縮蛋白的基因中具有成為外顯子51之跳讀之對象的變異者。

[15]

如上述[14]所記載之醫藥組成物，其中，前述患者具有肌肉萎縮蛋白的基因，該肌肉萎縮蛋白的基因係至少由外顯子51附近之外顯子缺失所導致之框移突變(Frameshift mutation)，並且，藉由外顯子51之跳讀而修正胺基酸之讀取框。

[16]

如上述[14]或[15]所記載之醫藥組成物，其中，前述患者係在肌肉萎縮蛋白的基因中具有由外顯子13-50、29-50、40-50、43-50、45-50、47-50、48-50、49-50、50、52、52-63之缺失所導致之框移突變。

[17]

如上述[14]至[16]中任一項所記載之醫藥組成物，其中，前述患者係人類。

[18]

一種上述[1]至[11]中任一項所述之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物之用途，係用於肌肉萎縮症治療用醫藥的製造。

[19]

一種肌肉萎縮症之治療方法，係包含對肌肉萎縮症患者投予有效量之上述[1]至[11]中任一項所述之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物、或上述[12]至[16]中任一項所述之醫藥組成物之步驟。

[20]

如上述[19]所記載之治療方法，其中，前述患者係人類。

[21]

如上述[1]至[11]中任一項所記載之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物、或上述[12]至[16]中任一項所記載之醫藥組成物，係使用於肌肉萎縮症的治療。

[22]

如上述[21]所記載之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物、或醫藥組成物，其中，在前述治療中，肌肉萎縮症患者係人類。

藉由本發明，可提供一種高效率地誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀的反義寡聚物。再者，藉由本發明，可提供一種維持高效率地誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀的活性，並且，具有優異的溶解性之反義寡聚物。進一步，藉由本發明，可提供一種維持高效率地誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀的活性，並且，具有優異的溶解性及安全性(例如，對腎臟及肝臟的功能沒有影響，或者是造成影響之可能性極低)之反義寡聚物。

圖1係顯示PMO No.43、44、45、46之反義寡聚物在人類橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)中人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀效率。

圖2係顯示PMO No.42、45、47、48、49、50之反義寡聚物在RD細胞中人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀效率。

圖3係顯示PMO No.42、62、63、89之反義寡聚物在RD細胞中人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀效率。

圖4係顯示PMO No.83、85之反義寡聚物在RD細胞中人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀效率。

圖5係顯示PMO No.33、34、35、36、37、38之反義寡聚物在RD細胞中人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀效率。

圖6係顯示PMO No.83、85、90之反義寡聚物在RD細胞中人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀效率。

圖7係顯示PMO No.82、84、86、87之反義寡聚物在RD細胞中人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀效率。

圖8係顯示PMO No.45、51、52、56、57、58、59、60、61之反義寡聚物在RD細胞中人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀效率。

圖9係顯示PMO No.42、64、65、66、85之反義寡聚物在RD細胞中人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀效率。

圖10係顯示PMO No.1、2、42、66、67、85、88、92、93之反義寡聚物在RD細胞中人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀效率。

圖11係顯示PMO No.3、4、5、6、7、8、42、68、69、70、85之反義寡聚物在RD細胞中人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀效率。

圖12係顯示PMO No.8、9、10、11、12、13、14、42、71、72、73、91之反義寡聚物在RD細胞中人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀效率。

圖13係顯示PMO No.8、15、16、17、42、74、75、76之反義寡聚物在RD細胞中人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀效率。

圖14係顯示PMO No.8、18、19、20、42、63、75、76、77之反義寡聚物在RD細胞中人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀效率。

圖15係顯示PMO No.8、21、22、23、24、25、26、42、77、78之反義寡聚物在RD細胞中人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀效率。

圖16係顯示PMO No.8、21、27、28、29、30、42、79、80、81之反義寡聚物在RD細胞中人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀效率。

圖17係顯示PMO No.8、16、21、31、32、67之反義寡聚物在RD細胞中人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀效率。

圖18係顯示PMO No.16、21、94之反義寡聚物在RD細胞中人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀效率。

圖19係顯示PMO No.42之反義寡聚物在小鼠中的安全性試驗結果。從左開始將天門冬胺酸轉胺酶(Aspartate aminotransferase,AST)值、丙胺酸轉胺酶(Alanine aminotransferase,ALT)值、尿素氮量(BUN)值、肌酸酐值以平均值±標準偏差顯示(以學生氏(Student)之t檢定所得之顯著量級(significance level)：p<0.05)。

圖20係顯示PMO No.16及90之反義寡聚物在小鼠中的安全性試驗結果。從左開始將AST值、ALT值、BUN值、肌酸酐值以平均值±標準偏差顯示、在觀察到顯著有意上昇之值顯示p值(以鄧奈特(Dunnett)之檢定所得之顯著量級：p<0.05)。

圖21係顯示PMO No.21在小鼠中的安全性試驗結果。從左開始將AST值、ALT值、BUN值、肌酸酐值以平均值±標準偏差顯示(以學生氏之t檢定所得之顯著量級：p<0.05)。

以下，詳細地說明本發明。以下之實施形態為用以說明本發明之例示，其意旨並非用以將本發明僅限定該實施形態。本發明只要不脫離該要旨，可以各種形態實施。

1.反義寡聚物

本發明係提供高效率地跳讀人類肌肉萎縮蛋白的基因之第51號外顯子之反義寡聚物(以下，亦稱為「本發明之反義寡聚物」)。

[人類肌肉萎縮蛋白的基因之第51號外顯子]

在本發明中，「基因」除了基因體基因，亦包含cDNA、mRNA前驅物及mRNA。基因較佳為mRNA前驅物，亦即，pre-mRNA。

於人類基因體中，人類肌肉萎縮蛋白的基因存在於基因座Xp21.2。人類肌肉萎縮蛋白的基因具有220萬鹼基對之大小，就已知之人類基因而言，為最大之基因。然而，人類肌肉萎縮蛋白的基因之編碼區域只不過14kb，該編碼區係79個外顯子分散於肌肉萎縮蛋白的基因內(Roberts,RG.,et al.,Genomics,16：536-538(1993))。屬於人類肌肉萎縮蛋白的基因的轉錄物之pre-mRNA，係接受剪接而生成14kb之成熟mRNA。人類之野生型肌肉萎縮蛋白的基因之鹼基序列為公知(GenBank Accession No.NM_004006)。

將人類之野生型肌肉萎縮蛋白的基因之外顯子51的鹼基序列表示於序列編號3。

[反義寡聚物]

本發明之反義低聚物係以將DMD型肌肉萎縮蛋白的基因編碼之蛋白質改變成BMD型肌肉萎縮蛋白的蛋白質為目的，藉由人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀而製作者。因此，在成為反義低聚物外顯子跳讀對象的肌肉萎縮蛋白的基因之外顯子51中，不僅為野生型，亦包含變異型。

本發明之反義寡聚物具體而言為選自由下列(a1)至(d1)所成之群組中之任一者所記載之反義低聚物。

(b1)包含相對於序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列有1至5個、1至4個、1至3個、1至2個、或1個鹼基經缺失、置換、插入、及/或附加之鹼基序列，並且，具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性之反義寡聚物；

(c1)包含相對於序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列，具有80%以上、84%以上、85%以上、89%以上、90%以上、94%以上、或95%以上之序列一致性之鹼基序列，並且，具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性之反義寡聚物；及

(d1)會與由與序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列互補之鹼基序列構成之寡核苷酸在嚴荷之條件下雜交之反義寡聚物，並且該反義寡聚物具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性。

就另一態樣而言，本發明之反義寡聚物具體是選自由下述(e)至(h)所組成之群組中任一者所記載之反義寡聚物。

(f)由相對於序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列有1至5個、1至4個、1至3個、1至2個、或1個鹼基經缺失及/或置換之鹼基序列構成，並且，具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性之反義寡聚物；

(g)由相對於序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列，具有80%以上、84%以上、85%以上、89%以上、90%以上、94%以上、或95%以上之序列一致性之鹼基序列構成，並且，具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性之反義寡聚物；及

(h)會與由與序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列互補之鹼基序列構成之寡核苷酸在高嚴荷之條件下雜交之反義寡聚物，並且該反義寡聚物具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性。

本發明之反義寡聚物更佳為選自由下列(a2)至(d2)所組成之群組中之任一者所記載之反義寡聚物。

上述(b1)至(d1)、(f)至(h)、及(b2)至(d2)之反義寡聚物具體而言，係分別為(a1)、(e)、及(a2)之反義寡聚物的變異物，係以對應患者的肌肉萎縮蛋白的基因之變異(例如多型)等為念頭者。

但是，本發明之反義寡聚物係排除(不包含)國際公開第2015/137409號所記載之由下述鹼基序列構成之反義寡聚物者。

本說明書中，「在嚴苛條件下雜交之反義寡聚物」係指例如將由與序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列互補之鹼基序列構成的寡核苷酸之全部或一部分作成探針，藉由使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或南方雜交法等獲得之反義寡聚物。雜交之方法可利用例如“Sambrook & Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor,Laboratory Press 2001”及“Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons 1987-1997”等中所記載之方法。

本說明書中，所謂「嚴苛之條件」可為低嚴苛條件、中嚴苛條件及高嚴苛條件中之任何一種。所謂「低嚴苛條件」係例如5×SSC、5×丹哈德溶液(Denhardt's solution)、0.5%SDS、50%甲醯胺、32℃之條件。再者，所謂「中嚴苛條件」為例如5×SSC、5×丹哈德溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、42℃或5×SSC、1%SDS、50mM Tris-HCl(pH7.5)、50%甲醯胺、42℃之條件。所謂「高嚴苛條件」係例如(1)5×SSC、5×丹哈德溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、50℃；(2)0.2×SSC、0.1% SDS、60℃；(3)0.2×SSC、0.1% SDS、62℃；(4)0.2×SSC、0.1% SDS、65℃；或(5)0.1×SSC、0.1% SDS、65℃之條件，惟不限定於此等。於該等條件中，可期待溫度越上昇，越可有效率地獲得具有高序列一致性之反義寡聚物。但是，影響雜交嚴苛度之要素認為有溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等之複數要素，只要是所屬技術領域具有通常知識者，可適當地選擇該等要素，而實現同樣的嚴苛度。在此，所謂「序列一致性」係指針對某2個核酸之配對，在作為比較對象之鹼基序列的全範圍中的一致性，在本發明之技術領域中使用公知之數學演算法所作成之鹼基序列的最佳對準(alignment)中，以成為一致之鹼基比率(%)所表示者。例如，相對於某個由20鹼基之鹼基序列構成之反義寡聚物，由具有「80%序列一致性」之鹼基序列構成之反義寡聚物，意指相對於前述20鹼基之反義寡聚物，具有16鹼基以上一致之鹼基的反義寡聚物。

序列一致性係可使用FASTA(Science 227(4693)：1435-1441,(1985))、或卡林及阿酋(Karlin S & Altschul SF)之演算法BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268,1990；Proc Natl Acad Sci USA 90：5873,1993)決定。已開發出以BLAST之演算法為基礎，且被稱為blastn、blastx、tblastn或tblastx之程式(Altschul SF,et al：J Mol Biol 215：403,1990)。使用blastn解析鹼基序列時，參數例如設為score=100、wordlength=12。使用BLAST及Gapped BLAST程式時，使用各程式之預設參數。

於雜交使用市售之套組時，可使用例如鹼性磷酸酶直接標記和檢測系統(Alkphos Direct Labelling and Detection System)(GE Healthcare)。此時，可依照套組所附加之指南(protocol)，進行一晚與經標記之探針的培養後，將膜於55℃之條件下以含有0.1%(w/v)SDS之1次洗淨緩衝液洗淨後，檢測出經雜交之反義寡聚物。或者是，在以與序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列互補的鹼基序列之全部或一部分為基礎製作探針之際，使用市售之試藥(例如，PCRLabeling Mix(羅氏-診斷公司(Roche-diagnostics))等)，將該探針進行洋地黃毒苷(digoxigenin，DIG)標記時，可使用DIG核酸檢出套組(羅氏-診斷公司)檢測出雜交。

上述以外之可雜交的反義寡聚物係藉由FASTA、BLAST等相同性檢索軟體，使用預設之參數進行計算時，可列舉與序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列具有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、或99.9%以上之序列一致性的反義寡聚物。

所謂「誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因之第51號外顯子之跳讀」，係指藉由在人類肌肉萎縮蛋白的基因之轉錄物(例如，pre-mRNA)之相當於外顯子51及/或其鄰接內含子的部位與本發明之反義寡聚物結合，該轉錄物接受剪接之際，產生外顯子51的排除外，例如缺失外顯子52之DMD患者的情形，相當於外顯子50之3’末端的鹼基序列與相當於外顯子53之5’末端之鹼基序列連結，形成沒有引起密碼子(codon)框移之成熟mRNA。

因此，只要是在肌肉萎縮蛋白的基因中具有成為外顯子51之跳讀對象之變異的DMD患者，則可藉由外顯子51之跳讀進行治療。如此之DMD患者係可舉出例如，具有至少由外顯子51附近之外顯子缺失所導致之框移突變，並且，具有藉由外顯子51之跳讀而修正胺基酸之讀取框的肌肉萎縮蛋白的基因之DMD患者，更舉體而言，可舉出例如具有讀取框轉移突變之DMD患者，該框移突變係因具有肌肉萎縮蛋白的基因之外顯子13-50、29-50、40-50、43-50、45-50、47-50、48-50、49-50、50、52、52-63等缺失所導致者。

在此，前述「結合」係意指在本發明之反義寡聚物與人類肌肉萎縮蛋白的基因之轉錄物混合時，在生理條件下兩者進行雜交而形成雙股。上述「生理的條件下」係意指調節成與生體內類似之pH、鹽組成、溫度之條件。例如，25至40℃，較佳為37℃，pH5至8，較佳為pH7.4，氯化鈉濃度為150mM之條件。

人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51是否產生跳讀，係可藉由在肌肉萎縮蛋白表現細胞(例如，人類橫紋肌肉瘤細胞)中導入本發明之反義寡聚物，從上述肌肉萎縮蛋白表現細胞之總(total)RNA，將人類肌肉萎縮蛋白的基因之mRNA的外顯子51的周邊區域進行RT-PCR擴增，針對該PCR擴增產物進行巢式PCR或定序(Sequencing)解析，藉此而確認。

跳讀效率ES(單位：%)係可將人類肌肉萎縮蛋白的基因之mRNA從被檢測細胞回收，在該mRNA中，測定外顯子51經跳讀之條帶(band)的多核苷酸量「A」、及外顯子51未經跳讀之條帶的多核苷酸量「B」，以該等「A」及「B」之測定值為基礎，依據下式(1)進行計算。關於跳讀效率之計算係可參照國際公開第2012/029986號。

ES=100×A/(A+B)‧‧‧(1)

本發明之反義寡聚物較佳為以10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上之效率跳讀外顯子51。

本發明之反義寡聚物更佳為對生理食鹽水之溶解性高。對生理食鹽水之溶解性高的反義寡聚物，係與溶解性低者不同，製劑保存時產生析出導致無法使用之可能性極低，再者，利用含有鹽之輸液時產生析出而導致無法使用之可能性亦極低。進一步，對生理食鹽水之溶解性高的反義寡聚物係由於不容易析出，投予時顯示毒性之可能性(Bulletin of Osaka University of Pharmaceutical Sciences 1,91-99(2007))亦極低。因此，對生理食鹽水之溶解性高的反義寡聚物係作為醫藥之有效成分而言具有非常高的利用價值。

對於生理食鹽水之溶解性較佳為20mg/mL以上，更佳為30mg/mL以上，又更佳為40mg/mL以上，特佳為50mg/mL以上。反義寡聚物之對於生理食鹽水的溶解性，係可將反義寡聚物以目標濃度溶解於生理食鹽水，在一定時間後藉由目視確認有無沉澱而進行評估。

再者，反義寡聚物作為醫藥之有效成分為安全性高而較佳。安全性係例如可以反義寡聚物投予後之血中的天門冬胺酸轉胺酶(AST)值、丙胺酸轉胺酶(ALT)值、尿素氮(BUN)值及肌酸酐值作為指標進行評估。AST值係對肝臟造成障礙時有變高之傾向，ALT值係肝臟有問題時有變高之傾向，BUN值係腎臟的功能降低時有變高之傾向，肌酸酐值係腎臟之腎絲球的過濾功能降低時有變高之傾向，因此，可以該等值作為指標而評估反義寡聚物對腎臟及肝臟功能造成之影響。

具體而言，例如，對正常小鼠投予反義寡聚物後，測定血中之AST值、ALT值、BUN值及肌酸酐值並進行統計學上的顯著差異檢定，與對照群(投予溶劑或無處置)之測定值相比，觀察到顯著上昇時判定為異常值，可判斷為經投予之反義寡聚物是否對腎臟及肝臟之功能造成影響，或造成影響之可能性高。相反地，未觀察到顯著上昇時，可判斷為不會對腎臟及肝臟之功能造成影響，或造成影響之可能性低。再者，與對照群之測定值相比，特定之上昇率，具體而言，例如觀察到30%以上之上昇率時亦可判定為異常值。

本發明之反義寡聚物係可列舉例如：具有16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35鹼基長度之寡核苷酸、N-嗎啉寡聚物、或胜肽核酸(Peptide Nucleic Acid：PNA)寡聚物。反義寡聚物之長度較佳為20至30鹼基、20至29鹼基、22至30鹼基、22至29鹼基或25至29鹼基之長度，更佳為22至30鹼基、22至29鹼基或25至29鹼基之長度，較佳為N-嗎啉寡聚物。

上述寡核苷酸(以下，亦稱為「本發明之寡核苷酸」)，係以核苷酸作為構成單元之本發明之反義寡聚物，所述之核苷酸係核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸或修飾核苷酸之任一者。

所謂修飾核苷酸係指構成核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸之核酸鹼基、糖部分、及磷酸鍵結部分之全部或一部分經修飾者。

在本發明中，核酸鹼基可列舉例如：腺嘌呤、鳥糞嘌呤、次黃嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或此等之修飾鹼基。所述之修飾鹼基可列舉例如：偽尿嘧啶、3-甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、5-烷基胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶)、5-烷基尿嘧啶(例如，5-乙基尿嘧啶)、5-鹵尿嘧啶(5-溴尿嘧啶)、6-氮雜嘧啶、6-烷基嘧啶(6-甲基尿嘧啶)、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、4-乙醯基胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5’-羧基甲基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基尿嘧啶、1-甲基腺嘌呤、1-甲基次黃嘌呤、2,2-二甲基鳥糞嘌呤、3-甲基胞嘧啶、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥糞嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥糞嘌呤、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲基羰基甲基尿嘧啶、5-甲基氧基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸、2-硫胞嘧啶、嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、異鳥糞嘌呤、吲哚、嘧唑、黃嘌呤等，惟不限定於該等。

糖部分之修飾可列舉例如核糖2’位的修飾及糖其他部分之修飾。核糖2’位的修飾可列舉例如將核糖2’位的-OH基置換成OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br、I之修飾。在此，R表示烷基或芳香基。R’表示伸烷基。

糖其他部分之修飾可列舉例如：將核糖或去氧核糖4’位之O置換成S者、糖之2’位與4’位經交聯者，例如，LNA(Locked Nucleic Acid)或ENA(2’-O,4’-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids)等，惟不限定於該等。

磷酸鍵結部分之修飾可列舉例如將磷酸二酯鍵置換成硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基磷酸酯鍵、胺基磷酸酯鍵、硼烷磷酸酯鍵(Enya et al：Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008,18,9154-9160)之修飾(例如，參照日本專利再公表公報第2006/129594號及第2006/038608號)。

在本發明中，烷基較佳為直鏈狀或分枝鏈狀之碳數1至6的烷基。具體而言，可列舉例如：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、第三戊基、正己基、異己基。該烷基亦可經取代，所述之取代基可列舉例如：鹵素、烷氧基、氰基、硝基，該等可經1至3個取代。

在本發明中，環烷基較佳為碳數5至12之環烷基。具體而言，可列舉例如：環戊基、環己基、環庚基、環辛基、環癸基、環十二烷基。

在本發明中，鹵素可列舉：氟、氯、溴、碘。

烷氧基可舉出直鏈狀或分枝鏈狀之碳數1至6的烷氧基，例如：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基、正戊基氧基、異戊基氧基、正己基氧基、異己基氧基等。較佳為碳數1至3之烷氧基。

在本發明中，芳香基較佳為碳數6至10之芳香基。具體而言，可列舉例如：苯基、α-萘基、β-萘基。較佳為苯基。該芳基亦可經取代，所述之取代基可列舉例如：烷基、鹵素、烷氧基、氰基、硝基，該等可經1至3個取代。

在本發明中，伸烷基較佳為直鏈狀或分枝鏈狀之碳數1至6的伸烷基。具體而言，可列舉例如：亞甲基、伸乙基、三亞甲基、四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、2-(乙基)三亞甲基、1-(甲基)四亞甲基。

在本發明中，醯基可列舉直鏈狀或分枝鏈狀之烷醯基或芳醯基。烷醯基可列舉例如：甲醯基、乙醯基、2-甲基乙醯基、2,2-二甲基乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、2,2-二甲基丙醯基、己醯基等。芳醯基可列舉例如：苯甲醯基、甲苯甲醯基、萘醯基。所述之芳醯基可在可取代之位置經取代，亦可經烷基取代。

本發明之寡核苷酸較佳為以下述通式所示之基作為構成單元之本發明之反義寡聚物，該基係核糖2’位的-OH基經甲氧基取代，磷酸鍵結部分為硫代磷酸酯鍵者。

(式中，Base表示核酸鹼基)

本發明之寡核苷酸係可使用各種自動合成裝置(例如，AKTA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare))而容易地合成，或者是，亦可委託第三機關(例如，Promega公司、Takara公司或日本Bio Services公司)等製作。

本發明之N-嗎啉寡聚物係以下述通式所示之基作為構成單元之本發明之反義寡聚物。

(式中，Base係與前述同意義；

W係表示下列任一式所示之基。

(式中，X係表示-CH₂R¹、-O-CH₂R¹、-S-CH₂R¹、-NR²R³或F；

R¹表示H、烷基；

R²及R³可相同或相異，表示H、烷基、環烷基或芳香基；

Y₁表示O、S、CH₂或NR¹；

Y₂表示O、S或NR¹；

Z表示O或S))。

本發明之N-嗎啉寡聚物之合成所使用之N-嗎啉單體化合物之例可列舉下述表所記載之N-嗎啉單體化合物(A)、N-嗎啉單體化合物(C)、N-嗎啉單體化合物(T)，及N-嗎啉單體化合物(G)，但不是限定為該等者。

N-嗎啉寡聚物較佳為以下式所示之基作為構成單元之寡聚物(磷醯二胺N-嗎啉寡聚物(以下，亦稱為「PMO」))。

(式中，Base、R²、R³係與前述同意義)

本發明N-嗎啉寡聚物係包含構成所述之寡聚物的核酸鹼基、N-嗎啉環部分、磷酸鍵結部分、3’末端及/或5’末端之全部或一部份經修飾者。

磷酸鍵結部分之修飾可列舉例如：置換成磷醯二胺鍵、硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基磷酸酯鍵、胺基磷酸酯鍵、硼烷磷酸酯鍵(Enya et al.,Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008,18,9154-9160)之修飾(例如，參照日本專利再公表公報第2006/129594號及第2006/038608號參照)。

N-嗎啉寡聚物係可依據例如國際公開第1991/009033號、或國際公開第2009/064471號進行製造。特別是，PMO係可依據國際公開第2009/064471號所記載之方法進行製造，或者是，依據下述所示之方法進行製造。

[PMO之製法]

PMO之1種態樣係可舉出例如下述通式(I)所示之化合物(以下，亦稱為PMO(I))。

[式中，各Base、R²、R³係與前述同意義；

n係1至99範圍內之任意整數，較佳為19至29、19至28、21至29、21至28或24至28之範圍內的任意整數，更佳為21至29、21至28或24至28]

PMO(I)係可依照公知之方法進行製造，或者是，例如可藉由實施下述步驟之操作而製造。

下述步驟所使用之化合物及試藥，只要是在PMO之製造通常使用者，則沒有特別地限定。

再者，下述全部步驟係可藉由液相法或固相法(使用手動或市售之固相自動合成機)實施。藉由固相法製造PMO時，從操作程序之簡便化及合成之正確性的點而言，較佳為使用自動合成機之方法。

(1)步驟A：

藉由使下述通式(II)所示之化合物(以下，亦稱為化合物(II))與酸進行作用，製造下述通式(III)所示之化合物(以下，亦稱為化合物(III))之步驟。

[式中，n、R²、R³係與前述同意義；

各B^P係獨立且表示可經保護之核酸鹼基；

T係表示三苯甲基、單甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基；

L係表示氫、醯基或下述通式(IV)所示之基(以下，亦稱為基(IV))]。

B^P中所述之「核酸鹼基」係可舉出與Base相同之「核酸鹼基」。然而，B^P中所述之核酸鹼基之胺基或羥基係可經保護。

所述之胺基保護基只要是可作為核酸之保護基使用者，則沒有特別的限制，具體而言，可列舉例如：苯甲醯基、4-甲氧基苯甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、苯基乙醯基、苯氧基乙醯基、4-第三丁基苯氧基乙醯基、4-異丙基苯氧基乙醯基、(二甲胺基)亞甲基。羥基之保護基可列舉例如：2-氰基乙基、4-硝基苯乙基、苯基磺醯基乙基、甲基磺醯基乙基、三甲基矽基乙基、在可取代之任意位置可經1至5個電子吸引基取代之苯基、二苯基胺基甲醯基、二甲基胺基甲醯基、二乙基胺基甲醯基、甲基苯基胺基甲醯基、1-吡咯啶基胺基甲醯基、N- 嗎啉基胺基甲醯基、4-(第三丁基羧基)苯甲基、4-[(二甲胺基)羧基]苯甲基、4-(苯基羧基)苯甲基(例如，參照國際公開第2009/064471號)。

「固相擔體」只要是可使用於核酸之固相反應中之擔體，則沒有特別的限制，較佳為例如(i)幾乎不溶解於N-嗎啉核酸衍生物合成中可使用之試藥(例如，二氯甲烷、乙腈、四唑、N-甲基嘧唑、吡啶、乙酸酐、二甲基吡啶、三氟乙酸)者、(ii)對於可使用於N-嗎啉核酸衍生物合成中之試藥在化學上穩定者、(iii)可經化學修飾者、(iv)可填裝所期望之N-嗎啉核酸衍生物者、(v)對於處理中所述之高壓具有充分忍受強度者、(vi)以一定粒徑範圍分布者。具體而言，可列舉：膨潤性聚苯乙烯(例如，胺基甲基聚苯乙烯樹脂1%二乙烯基苯交聯(200至400網目)(2.4至3.0mmol/g)(東京化成公司製造)、胺基甲基化聚苯乙烯樹脂鹽酸鹽(Aminomethylated Polystyrene Resin．HCl)[二乙烯基苯1%，100至200網目](胜肽研究所公司製造))、非膨潤性聚苯乙烯(例如Primer Support(GE Healthcare公司製造))、PEG鏈結合型聚苯乙烯(例如，NH₂-PEG resin(渡邊化學公司製造)、TentaGel resin)、定孔玻璃(controlled pore glass；CPG)(例如，CPG公司製造)、草醯化-定孔玻璃(參照例如Alul等，Nucleic Acids Research,Vol.19,1527(1991))、TentaGel支撐體-胺基聚乙二醇衍生物化支撐體(參照例如Wright人等，Tetrahedron Letters,Vol.34,3373(1993))、Poros-聚苯乙烯/二乙烯基苯之共聚物。

「連結基」可使用通常為了將核酸或N-嗎啉核酸衍生物連結所使用之公知的基，可列舉例如：3-胺基丙基、琥珀醯基、2,2’-二乙醇磺醯基、長鏈烷基胺基(LCAA)。

本步驟係可藉由使化合物(II)與酸進行作用而實施。

在本步驟可使用之「酸」係可列舉例如：三氟乙酸、二氯乙酸或三氯乙酸。酸的使用量適當的是例如相對於化合物(II)1莫耳，在0.1莫耳當量至1000莫耳當量範圍內，較佳為在1莫耳當量至100莫耳當量範圍內。

再者，可將有機胺與前述酸一起使用。有機胺不是受到特別限制者，可列舉例如三乙胺。有機胺之使用量適當的是例如相對於酸1莫耳，在0.01莫耳當量至10莫耳當量範圍內，較佳為在0.1莫耳當量至2莫耳當量範圍內。

在本步驟中，使用酸與有機胺之鹽或混合物時，可列舉例如：三氟乙酸與三乙胺之鹽或混合物，更具體而言，可舉出相對於三氟乙酸2當量，將三乙胺以1當量混合者。

本步驟中可使用之酸亦可以成為0.1%至30%範圍內之濃度之方式，利用適當的溶劑進行稀釋而使用。溶劑只要不參予反應者即可，則沒有特別限制，可列舉例如：二氯甲烷、乙腈、醇類(乙醇、異丙醇、三氟乙醇等)、水或此等之混合物。

上述反應中之反應溫度例如較佳為在10℃至50℃範圍內，更佳為在20℃至40℃範圍內，又更佳為在25℃至35℃範圍內。

反應時間係可依據使用之酸的種類、反應溫度而不同，通常以在0.1分鐘至24小時範圍內為適當。較佳為在1分鐘至5小時範圍內。

再者，本步驟完成後，因應所需，為了將系統中存在之酸中和，可添加鹼。「鹼」並無特別限制，可列舉例如二異丙基乙基胺。鹼可以成為0.1%(v/v)至30%(v/v)範圍內之濃度的方式，利用適當的溶劑稀釋而使用。

本步驟中所使用之溶劑只要不參予反應者，則沒有特別限制，可列舉：二氯甲烷、乙腈、醇類(乙醇、異丙醇、三氟乙醇等)、水或該等之混合物。反應溫度例如較佳為在10℃至50℃範圍內，更佳為在20℃至40℃範圍內，又更佳為在25℃至35℃範圍內。

反應時間係依據使用之鹼的種類、反應溫度而不同，通常以在0.1分鐘至24小時範圍內較適當，較佳為在1分鐘至5小時範圍內。

此外，於化合物(II)中，屬於n=1，L為基(IV)之下述通式(IIa)所示之化合物(以下，亦稱為化合物(IIa))係可依照以下之方法製造。

[式中，B^P、T、連結基、固相擔體係與前述同意義]

步驟1：

藉由使下述通式(V)所示之化合物與醯基化劑進行作用，而製造下述通式(VI)所示之化合物(以下，亦稱為化合物(VI))之步驟。

[式中，B^P、T、連結基係與前述同意義；

R⁴表示羥基、鹵素、羧基、或胺基]

本步驟係可以化合物(V)作為起始原料，藉由公知連結基之導入反應進行實施。

特別是，下述通式(VIa)表示之化合物可藉由實施使用化合物(V)及琥珀酸酐進行酯化反應之已知方法進行製造。

[式中，B^P、T係與前述同意義]

步驟2：

藉由使化合物(VI)與縮合劑等進行作用，使固相擔體進行反應，而製造化合物(IIa)之步驟。

[式中，B^P、R⁴、T、連結基、固相擔體係與前述同意義]

本步驟係可藉由使用化合物(VI)及固相擔體進行縮合反應之已知方法而製造。

於化合物(II)中，屬於n=1至99(在特定態樣中，n係例如，2至29、2至28、2至27、2至26、2至25、2至24、2至23、2至22、2至21或2至20，較佳為19至29、19至28、21至29、21至28或24至28的範圍內之任意整數，更佳為21至29、21至28或24至28)，L為基(IV)之下述通式(IIa2)所示之化合物，係可以化合物(IIa)作為起始原料，藉由將本說明書所記載之PMO的製法中所述之步驟A及步驟B重複實施期望的次數而製造。

[式中，B^P、n、R²、R³、T、連結基、固相擔體係與前述同意義]

(2)步驟B：

藉由使化合物(III)在鹼存在下與N-嗎啉單體化合物進行作用，製造下述通式(VII)所示之化合物(以下，亦稱為化合物(VII))之步驟。

[式中，各B^P、L、n、R²、R³、T係與前述同意義]

本步驟係可藉由使化合物(III)在鹼存在下與N-嗎啉單體化合物進行作用而實施。

N-嗎啉單體化合物係可舉出例如下述通式(VIII)所示之化合物。

[式中，B^P、R²、R³、T係與前述同意義]

本步驟中可使用之「鹼」可列舉例如：二異丙基乙基胺、三乙胺或N-乙基嗎啉。鹼之使用量例如相對於化合物(III)1莫耳，以在1莫耳當量至1000莫耳當量範圍內較適當，較佳為在10莫耳當量至100莫耳當量範圍內。

本步驟中可使用之N-嗎啉單體化合物及鹼係可以成為0.1%至30%之濃度的方式，利用適當之溶劑稀釋而使用。溶劑只要不參予反應者即可，則沒有特別限制，可列舉例如：N,N-二甲基咪唑酮、N-甲基哌啶酮、DMF、二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃或此等之混合物。

反應溫度例如較佳為在0℃至100℃之範圍內，更佳為在10℃至50℃之範圍內。

反應時間係依據使用之鹼的種類、反應溫度而不同，通常以在1分鐘至48小時範圍內較適當，較佳為在30分鐘至24小時範圍內。

進一步，本步驟完成後，因應所需可添加醯化劑。「醯化劑」可列舉例如：乙酸酐、乙醯氯、苯氧基乙酸酐。醯化劑可以成為0.1%至30%範圍內之濃度的方式，利用適當之溶劑稀釋而使用。溶劑只要不參予反應者，則沒有特別限制，可列舉例如：二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃、醇類(乙醇、異丙醇、三氟乙醇等)、水或此等之混合物。

再者，必要時可與醯化劑一起，使用例如吡啶、二甲基吡啶(Lutidine)、三甲基吡啶(Collidine)、三乙胺、二異丙基乙胺、N-乙基嗎啉等鹼。醯化劑之使用量較佳為在0.1莫耳當量至10000莫耳當量範圍內，更佳為在1莫耳當量至1000莫耳當量範圍內。鹼之使用量係例如相對於醯化劑1莫耳，以在0.1莫耳當量至100莫耳當量範圍內較適當，較佳為在1莫耳當量至10莫耳當量範圍內。

本反應之反應溫度較佳為在10℃至50℃範圍內，更佳為在10℃至50℃範圍內，再佳為在20℃至40℃範圍內，又更佳為在25℃至35℃範圍內。反應時間例如依據使用之醯化劑的種類、反應溫度而不同，通常在0.1分鐘至24小時範圍內較適當，較佳為在1分鐘至5小時範圍內。

(3)步驟C：

在步驟B中所製造之化合物(VII)中，使用脫保護劑將保護基脫離，製造通式(IX)所示之化合物之步驟。

[式中，Base、B^P、L、n、R²、R³、T係與前述同意義]

本步驟係可藉由使化合物(VII)與脫保護劑進行作用而實施。

「脫保護劑」可列舉例如：濃氨水、甲基胺。本步驟中可使用之「脫保護劑」亦可以例如：將水、甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃、DMF、N,N-二甲基咪唑酮、N-甲基哌啶酮或此等之混合溶劑稀釋而使用。其中，較佳為乙醇。脫保護劑之使用量係例如相對於化合物(VII)1莫耳，以在例如1莫耳當量至100000莫耳當量範圍內較適當，較佳為在10莫耳當量至1000莫耳當量範圍內。

反應溫度係在例如15℃至75℃之範圍內為適當，較佳為40℃至70℃之範圍內，更佳為50℃至60℃之範圍內。脫保護反應時間係依據化合物(VII)之種類、反應溫度等而不同，以10分鐘至30小時之範圍內為適當，較佳為30分鐘至24小時之範圍內，更佳為5小時至20小時之範圍內。

(4)步驟D：

藉由使在步驟C中所製造之化合物(IX)與酸進行作用，而製造PMO(I)之步驟。

[式中，Base、n、R²、R³、T係與前述同意義]

本步驟係可藉由在化合物(IX)中添加酸而實施。

本步驟中可使用之「酸」可列舉例如：三氯乙酸、二氯乙酸、乙酸、磷酸及鹽酸等。酸之使用量以例如以使溶液之pH值成為0.1至4.0範圍內之方式使用較適當，更佳為成為在1.0至3.0範圍內之方式使用。溶劑只要不參予反應，則沒有特別限制，可列舉例如：乙腈、水或此等之混合溶劑。

反應溫度較佳為在10℃至50℃範圍內，更佳為在20℃至40℃範圍內，又更佳為在25℃至35℃範圍內。脫保護反應時間係依據化合物(IX)之種類、反應溫度等而不同，以在0.1分鐘至5小時範圍內較適當，較佳為在1分鐘至1小時範圍內，更佳為在1分鐘至30分鐘範圍內。

PMO(I)係可從本步驟獲得之反應混合物藉由通常之分離精製手段，例如：將萃取、濃縮、中和、過濾、離心分離、再結晶、C8至C18之逆相管柱層析、陽離子交換管柱層析、陰離子交換管柱層析、凝膠過濾管柱層析、高效液體層析、透析、超濾等手段單獨或組合使用而獲得，可將期望之PMO(I)單離精製(例如，參照國際公開第1991/09033號)。

使用逆相層析將PMO(I)精製時，溶出溶劑可使用例如：20mM三乙胺/乙酸緩衝液與乙腈之混合溶液。

再者，使用離子交換層析將PMO(I)精製時，可使用例如：1M食鹽水與10mM氫氧化鈉水溶液之混合溶液。

胜肽核酸係以下述通式所示之基作為構成單元之本發明之反義寡聚物。

(式中，Base係與前述同意義)

胜肽核酸係可例如依據下列文獻進行製造。

1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991)

2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, Jacs., 114, 1895 (1992)

3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)

4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)

5) T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)

再者，本發明之反義寡聚物，係5’末端可為下述化學式(1)至(3)之任一者的基。較佳為(3)-OH。

以下，將上述(1)、(2)及(3)所示之基分別稱為「基(1)」、「基(2)」及「基(3)」。

本發明之反義寡聚物係由於磷酸鍵結部分之磷原子成為不對稱中心，亦可為包含磷原子之立體化學為光學上純粹的化合物者。只要是所屬技術領域具有通常知識者則可從異構物之混合物獲得純粹的光學活性物(國際公開第2017/024264號)。再者，本發明之反義寡聚物亦可為作為純粹的光學活性物而合成者。只要是所屬技術領域具有通常知識者則可控制合成反應而獲得純粹的光學活性物(日本公表專利公報第2018-537952號)。

2.胜肽結合型反義寡聚物

本發明之反義寡聚物亦可為形成與以提升有效性為目的之功能性胜肽(例如，以提升對標的細胞之輸送效率為目的之膜穿透性胜肽)的複合物者(國際公開第2008/036127號、國際公開第2009/005793號、國際公開第2012/150960號、國際公開第2016/187425號、國際公開第2018/118662號、國際公開第2018/118599號、國際公開第2018/118627號、J.D.Ramsey,N.H.Flynn,Pharmacology & Therapeutics 154,78-86(2015)、M.K.Tsoumpra et al.,EBioMedicine,45,630-645(2019))。鍵結部位沒有特別的限定，較佳為反義寡聚物之5’端或3’端與功能性胜肽之胺基末端或羧基末端鍵結。

再者，就其他態樣而言，本發明之反義寡聚物與功能性胜肽，係可經由連結基形成複合物。連結基沒有特別的限定，特別為反義寡聚物之5’端或3’端與連結基之一端鍵結，功能性胜肽之胺基末端或羧基末端與連結基之另一端鍵結。再者，功能性胜肽與連結基之間，亦可存在附加的胺基酸。

3.醫藥組成物

本發明之反義寡聚物係與先前技術所述之反義寡聚物相比，即使其長度較短之情形，仍可高效率地誘導外顯子51之跳讀。再者，本發明之反義寡聚物係可維持高效率地誘導外顯子51之跳讀的活性，並且，具有優異的溶解性。進一步，本發明之反義寡聚物係可維持高效率地誘導外顯子51之跳讀的活性，並且，具有優異的溶解性及安全性。因此，只要是在肌肉萎縮蛋白的基因中具有成為外顯子51之跳讀對象的變異(例如，框移突變、外顯子51之中之誤義突變(Missense mutation)/無意義突變(Nonsense mutation)等)之DMD患者，藉由投予本發明之反義寡聚物，預測可高效率地緩和肌肉萎縮症之症狀。例如，藉由對具有至少缺失外顯子51附近之外顯子的預定之變異肌肉萎縮蛋白的基因的DMD患者投予本發明之反義寡聚物，預測可高效率地緩和肌肉萎縮症之症狀。此外，所謂預定之變異肌肉萎縮蛋白的基因，意指至少缺失外顯子51附近之外顯子而具有框移突變，並且，在省略外顯子51時(跳讀時)胺基酸之讀取框被修正之肌肉萎縮蛋白的基因。DMD患者可列舉例如：具有因缺失外顯子13-50、29-50、40-50、43-50、45-50、47-50、48-50、49-50、50、52、52-63等所導致之框移突變的DMD患者。

更具體而言，藉由將包含本發明之反義寡聚物之醫藥組成物，對DMD患者(具有利用外顯子51跳讀進行訊框化(in-frame)之變異的患者，例如，外顯子13-50缺失患者、外顯子29-50缺失患者、外顯子40-50缺失患者、外顯子43-50缺失患者、外顯子45-50缺失患者、外顯子47-50缺失患者、外顯子48-50缺失患者、外顯子49-50缺失患者、外顯子50缺失患者、外顯子52缺失患者、外顯子52-63缺失患者等)，預測可高效率地緩和肌肉萎縮症之症狀。例如，使用含有本發明之反義寡聚物之醫藥組成物時，由於與先前技術所述之寡聚物相比，即便為少量的投予量仍可獲得相同程度的治療效果，因而可減輕副作用且具有經濟性。

再者，本發明之反義寡聚物係維持高效率地誘導外顯子51之跳讀的活性，並且具有優異的溶解性，因此在醫藥組成物之調製中有用。進一步，本發明之反義寡聚物係維持高效率地誘導外顯子51之跳讀的活性，並且具有優異的溶解性，因而可用作為醫藥組成物。

因此，在另一實施態樣，係提供將本發明之反義寡聚物、其藥學上可容許之鹽或水合物作為有效成分之肌肉萎縮症治療用醫藥組成物(以下，亦稱為「本發明之組成物」)。

再者，本發明係提供肌肉萎縮症之治療方法，該治療方法係包含對DMD患者投予本發明之反義寡聚物的步驟。

在該治療方法中，本發明之反義寡聚物係可作為前述肌肉萎縮症治療用醫藥組成物進行投予。

進一步，本發明係提供在肌肉萎縮症治療用醫藥組成物之製造中本發明之反義寡聚物的用途、及用以使用於肌肉萎縮症治療之本發明的反義寡聚物。

本發明之組成物中所含有之本發明之反義寡聚物醫藥學上容許之鹽之例可列舉：如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽之鹼金屬鹽，如鈣鹽、鎂鹽之鹼土金屬鹽；鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等金屬鹽；銨鹽；如第三-辛基胺鹽、二苯甲基胺鹽、嗎啉鹽、葡萄糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、伸乙基二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽、胍鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、二環己胺鹽、N,N’-二苯甲基乙二胺鹽、氯普魯卡因(chloroprocaine)鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苯甲基-苯乙基胺鹽、六氫吡嗪鹽、四甲基銨鹽、三(羥甲基)胺基甲烷鹽等有機胺鹽；如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽等氫鹵酸鹽；如硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；如甲烷磺酸鹽、三氟甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽等低級烷基磺酸鹽；如苯磺酸鹽、對-甲苯磺酸鹽之芳基磺酸鹽；如乙酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽等有機酸鹽；如甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽等胺基酸鹽等。該等鹽可以公知之方法製造。或者是，本發明組成物中所含有之本發明之反義寡聚物亦可為其水合物之形態。

本發明組成物之投予形態只要是醫藥學上可容許之投予形態，則沒有特別限制，可因應治療方法加以選擇，從對肌肉組織送達容易性之觀點而言，較佳為靜脈內投予、動脈內投予、肌肉內投予、皮下投予、經口投予、組織內投予、經皮投予等。再者，本發明組成物採取之劑型並無特別限制，可列舉例如：各種注射劑、經口劑、點滴劑、吸入劑、軟膏劑、乳液劑等。

對肌肉萎縮患者投予本發明之反義寡聚物時，本發明之組成物可含有促進將該寡聚物送達至肌肉組織之載體。如此之載體只要是醫藥學上可容許者，則沒有特別限制，其例可列舉：陽離子性脂質體、陽離子性聚合物等陽離子性載體，或利用病毒鞘膜之載體。陽離子性脂質體可列舉例如2-O-(2-二乙胺基乙基)胺基甲醯基-1,3-O-二油醯基甘油與磷脂質作為必須構成成分而形成之脂質體(以下，亦稱為「脂質體A」)、Oligofectamine(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、Lipofectin(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、Lipofectamin(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、Lipofectamine 2000(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、DMRIE-C(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、GeneSilencer(註冊商標)(Gene Therapy Systems公司製造)、TransMessenger(註冊商標)(QIAGEN公司製造)、TransIT TKO(註冊商標)(Mirus公司製造)、Nucleofector II(Lonza)。此等中較佳為脂質體A。陽離子性聚合物可列舉例如：JetSI(註冊商標)(Qbiogene公司製造)、Jet-PEI(註冊商標)(聚乙烯亞胺、Qbiogene公司製造)。利用病毒鞘膜之載體可列舉例如：GenomeOne(註冊商標)(HVJ-E脂質體、石原產業公司製造)。或者是，可使用日本專利2924179號中記載之醫藥裝置、日本專利再公表公報第2006/129594號及日本專利再公表公報第2008/096690號中記載之陽離子性載體。

詳細而言，可參照美國專利第4,235,871號、美國專利第4,737,323號、國際公開第96/14057號、“New RRC,Liposomes：A practical approach,IRL Press,Oxford(1990)pages 33-104”等。

本發明組成物中所含有之本發明之反義寡聚物之濃度係依據載體之種類等而不同，一態樣中，以在0.1nM至100μM範圍內較適當，較佳為在100nM至10μM範圍內。再者，本發明組成物中所含有之本發明之反義寡聚物與載體之重量比(載體/本發明之反義寡聚物)，係依據該寡聚物之性質及該載體種類等而不同，以在0.1至100範圍內較適當，較佳為在0.1至10範圍內。

本發明之組成物亦可為水溶液之形態。此時，本發明之組成物，係可將本發明之反義寡聚物以2.5至500mg/mL、5至450mg/mL、10至400mg/mL、15至350mg/mL、20至300mg/mL、20至250mg/mL、20至200mg/mL、20至150mg/mL、20至100mg/mL、20至50mg/mL、20至40mg/mL、20至30mg/mL、23至27mg/mL、24至26mg/mL、或25mg/mL的濃度含有。或者是，本發明之組成物係可將本發明之反義寡聚物以10至100mg/mL、15至95mg/mL、20至80mg/mL、25至75mg/mL、30至70mg/mL、35至65mg/mL、40至60mg/mL、45至55mg/mL、47至53mg/mL、48至52mg/mL、49至51mg/mL、或50mg/mL之濃度含有。

本發明之組成物亦可為乾燥形態。此時，為了調製水溶液形態之本發明之組成物，例如，可使用將125mg或250mg之包含乾燥形態的本發明之反義寡聚物的乾燥形態之本發明之組成物，與0.5mL至100mL之水混合(相當於1.25mg/mL至250mg/mL或2.5mg/mL至500mg/mL的本發明之反義寡聚物的濃度)，較佳為與1mL至50mL之水混合(相當於2.5mg/mL至125mg/mL或5mg/mL至250mg/mL的本發明之反義寡聚物的濃度)，更佳為與5mL至10mL之水混合(相當於12.5mg/mL至25mg/mL或25mg/mL至50mg/mL的本發明之反義寡聚物的濃度)。

本發明之組成物中除了本發明之反義寡聚物及上述之載體以外，亦可任意地調配醫藥學上可容許之添加劑。所述之添加劑可列舉例如：乳化輔助劑(例如，碳數6至22之脂肪酸或其醫藥學上容許之鹽、白蛋白、葡聚糖)、穩定化劑(例如，膽固醇、磷脂酸、蔗糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇)、等張化劑(例如，氯化鈉、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇)、pH調整劑(例如鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、三乙醇胺)。此等可使用一種或二種以上。本發明組成物中該添加劑之含量以在90重量%以下較適當，較佳為在70重量%以下，更佳為在50重量%以下。

本發明之組成物可藉由在載體之分散液中添加本發明之反義寡聚物，適當地攪拌而調製。再者，添加劑可在本發明反義寡聚物添加前，亦可在添加後在適當步驟中添加。本發明之組成物為水溶液形態時，添加本發明反義寡聚物之際可使用之水性溶劑只要是醫藥學上可容許者，則沒有特別限制，可列舉例如：注射用水、注射用蒸餾水、生理食鹽水等電解質液；葡萄糖液、麥芽糖液等糖液。再者，所述情況之pH值及溫度等之條件係所屬技術領域具有通常知識者可適當地選擇。

本發明之組成物可作成例如液劑或其凍結乾燥製劑。本發明之組成物的乾燥形態之一態樣，係該凍結乾燥製劑可依照常法，將具有液劑形態之本發明組成物藉由凍結乾燥處理而調製。例如，可將具有液劑形態之本發明組成物進行適當的滅菌後，於小瓶中分注預定量，以約-40至-20℃之條件進行2小時左右之預備凍結，於約0至10℃，在減壓下進行一次乾燥，接著於約15至25℃，在減壓下進行二次乾燥而進行凍結乾燥。然後，通常將小瓶內部以氮氣置換，封瓶，而可獲得本發明組成物之凍結乾燥製劑。

本發明組成物之凍結乾燥製劑通常可藉由添加任意適當之溶液(再溶解液)再溶解而使用。如此之再溶解液可列舉：注射用水、生理食鹽水、其他一般輸液。該再溶解液之液量依據用途等而不同，並無特別限制，以凍結乾燥前之液量的0.5至2倍量或500mL以下較適當。

投予本發明組成物時之用量以考慮含有之本發明反義寡聚物之種類、劑型、年齡或體重等患者之狀態、投予途徑、疾病之性質及程度進行調製較佳，對於成人，本發明反義寡聚物之量，係每日在0.1mg至10g/人之範圍內，通常較佳為在1mg至1g/人之範圍內。該數值有依據作為標的之疾病種類、投予形態、標的分子而不同之情況。因此，根據情況有在該等量以下即充足，或相反地，有必須設成該等以上之用量的時候。再者，可以1日1次至數次進行投予或以1日至數日之間隔進行投予。

本發明組成物之另一態樣可列舉含有可表現本發明之寡核苷酸之載體及上述擔體之醫藥組成物。所述之表現載體可為可表現複數本發明寡核苷酸者。該組成物與含有本發明寡聚物之本發明之組成物同樣地，可添加醫藥學上可容許之添加劑。該組成物中所含有之表現載體之濃度，係依據擔體之種類等而不同，在一態樣中，以在0.1nM至100μM範圍內較適當，較佳為在100nM至10μM範圍內。該組成物中含有之表現載體與擔體之重量比(擔體/表現載體)依據表現載體之性質、擔體之種類等而不同，以在0.1至100範圍內較適當，較佳為在0.1至10範圍內。再者，該組成物中所含有之擔體之含量，係與含有本發明反義寡聚物之本發明組成物時同樣地，其調製方法等亦與本發明組成物之情況相同。

以下，列舉實施例及試驗例，對本發明進行更詳細的說明，惟本發明不限定於該等實施例所示之範圍。

[實施例]

[實施例1：反義寡聚物之合成]

依照國際公開第2015/137409號所記載之方法，以人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51及/或屬於其5’側鄰接內含子的內含子50之一部份鹼基序列作為標的，合成出表1所示之反義寡聚物(PMO No.1至93(序列編號1至93))。表中，亦顯示各反義寡聚物之分子量的理論值及利用ESI-TOF-MS獲得之實測值。

表1中，例如「H51_67-81_131-142」，在以人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之5’末端的鹼基設為第1號鹼基，對3’側接續之鹼基依序賦予編號時，反義寡聚物顯示為以第67號至第81號的鹼基序列及第131號至第142號的鹼基序列作為標的者。此外，標的鹼基序列中之第-1號以前之鹼基序列，係內含子50中的鹼基序列。包含人類野生型肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之序列與內含子50之3’端附近序列之鹼基序列以序列編號128表示。

[實施例2：反義寡聚物之外顯子跳讀活性試驗]

人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的試管內(In vitro)試驗

(1)試驗方法

對於RD細胞(人類橫紋肌肉瘤細胞株，CCL-136，自ATCC購入)3.5×10⁵個，將表1、2的各反義寡聚物0.3至120μM使用Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L藉由Nucleofector II(Lonza)進行導入。用以導入之脈衝程式係使用T-030。

將導入後之RD細胞於含有10%胎牛血清(FBS)(Invitrogen公司製造)之Eagle’s minimal essential medium(EMEM)培養基(Sigma公司製造，以下相同)2mL中，在37℃、5%CO₂條件下培養三晚。

將培養後之RD細胞以PBS(Nissui公司製造，以下相同)洗淨1次後，將含有1%之2-巰基乙醇(Nacalai Tesque公司製造)之Buffer RA1(Takara Bio公司製造)添加至350μL細胞中，於室溫放置數分鐘使細胞溶解，於NucleoSpin(註冊商標)Filter(Takara Bio公司製)上進行回收。以11,000×g離心1分鐘，製作出均質物。根據NucleoSpin(註冊商標)RNA(Takara Bio公司製)所附加之指南萃取全RNA。萃取出之全RNA濃度係使用NanoDrop ONE(Thermo Fisher社製)測定。

對於萃取出之全RNA 400ng，使用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit(QIAGEN公司製造)及熱循環儀(Thermal cycler)進行One-Step RT-PCR。根據上述套組所附加之指南，調製反應液。熱循環儀係使用TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch(Takara Bio公司製)。使用之RT-PCR程式係如下所述。

50℃，30分鐘：逆轉錄反應

95℃，15分鐘：聚合酶活性化，逆轉錄酶不活化，cDNA熱變性

[94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，1分鐘]×35循環：PCR擴增

72℃，10分鐘：最終延伸反應

於RT-PCR使用之前置引子及反置引子之鹼基序列係如下所述。

前置引子：5’-CTGAGTGGAAGGCGGTAAAC-3’(序列編號95)

反置引子：5’-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3’(序列編號96)

將上述PCR之反應產物1μL使用Bioanalyzer(Agilent公司製造)，或MultiNA(島津製作所製)進行解析。

將外顯子51經跳讀之條帶的聚核苷酸量「A」、外顯子51未經跳讀之條帶的聚核苷酸量「B」，作為條帶之訊號強度進行測定。根據此等「A」及「B」之測定值，依照上述式(1)求得跳讀效率。

(2)試驗結果

將針對各反義寡聚物所得之外顯子51之跳讀效率的結果示於圖1至18。此外，就直接的或間接的比較對照而言，將與屬於外顯子51之跳讀藥之eteplirsen(WHO Drug Information 24,2,137-139(2010),Proposed INN List 103)具有相同鹼基序列並且具有相同5’末端修飾(亦即，5’末端為上述基(1))而因此全體結構相同之表2所示之反義寡聚物(PMO No.94(序列編號94))，依照日本特開2015-91229號公報所記載之方法進行合成並使用。

相較於與eteplirsen具有全體結構相同一之表2之反義寡聚物，表1之本發明之反義寡聚物係跳讀效率顯著較高，使外顯子51極有效率地跳讀。

[實施例3：反義寡聚物之溶解性試驗]

反義寡聚物對於生理食鹽水之溶解性試驗

針對在實施例2中跳讀效率非常高之PMO No.7、8、10、16、21、24、31、42、67、76及90的各反義寡聚物，為了進一步驗證醫藥用途之有用性，進行對於生理食鹽水之溶解性試驗。

(1)試驗方法

在置入有5.7mg上述各反義寡聚物之樣品瓶中添加注射用水57μL，使用超音波及振盪器(Vortex)使其溶解後，添加2倍濃度生理食鹽水57μL，使用振盪器進行攪拌製成50mg/mL之生理食鹽水溶液。在室溫靜置24小時，以目視確認靜置後有無沈澱，將未觀察到沈澱者評估為溶解性高之反義寡聚物。

(2)試驗結果

試驗之各反義寡聚物之中，PMO No.7、8、10、16、21、24、31、42、67及76的各反義寡聚物係對於生理食鹽水顯示50mg/mL以上之溶解性。

從此結果可知，該等反義寡聚物，係具有顯著高的外顯子51之跳讀效率，對於生理食鹽水之溶解性亦高，因此是作為醫藥之利用價值高的反義寡聚物。

[實施例4：反義寡聚物之安全性評估]

在實施例3中實施對於生理食鹽水之溶解性試驗的各反義寡聚物之中，針對PMO No.16、21、42、90，為了驗證醫藥用途的安全性，進行安全性評估。

(1)評估方法

將各反義寡聚物溶解於生理食鹽水中，對C57BL/6N雄性6週齡小鼠進行尾靜脈內投予。隔天，從小鼠回收血清，測定血中之天門冬胺酸轉胺酶(AST)值、丙胺酸轉胺酶(ALT)值、尿素氮量(BUN)值及肌酸酐值。將僅投予作為媒介使用之生理食鹽水的小鼠、無處置小鼠的對照群之測定值作為正常值，進行統計學的顯著差異檢定(Student之t檢定或鄧奈特之檢定)，在各反義寡聚物之投予群p<0.05 的顯著量級下觀察到值有顯著地上昇時，判定為異常值。各檢定中，使用統計解析系統SAS(註冊商標，SAS Institute公司)版本9.3。1000mg/kg之用量中，AST值、ALT值、BUN值及肌酸酐值皆未觀察到異常值時，判斷為安全性高之反義寡聚物。

(2)評估結果

關於PMO No.16、21、42之各反義寡聚物，在1000mg/kg之用量中，AST值、ALT值、BUN值及肌酸酐值皆未觀察到異常值，確認為安全性高(具體而言，對腎臟及肝臟功能沒有影響，或者是，造成影響之可能性極低)之反義寡聚物。針對該等結果顯示於圖19至21。此外，在p<0.05之顯著量級下觀察到顯著地上昇之值(異常值)中顯示p值。

從上述結果可知，本發明之反義寡聚物係顯示高效率地誘導肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51之跳讀的活性，並且，作為醫藥顯示具有優異的物性及安全性。

序列編號1至126：合成核酸

<110> 日商日本新藥股份有限公司(Nippon Shinyaku Co.,Ltd.) 國立研究開發法人國立精神‧神經醫療研究中心(National Center of Neurology and Psychiatry)

<120> 誘導外顯子51之跳讀的反義核酸(ANTISENSE NUCLEIC ACIDS THAT INDUCE EXoN 51 SKIPPING)

<150> JP2020-033483

<151> 2020-02-28

<160> 128

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 1

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 2

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 3

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 4

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 5

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 6

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 7

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 8

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 9

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 10

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 11

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 12

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 13

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 14

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 15

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 16

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 17

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 18

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 19

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 20

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 21

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 22

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 23

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 24

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 25

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 26

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 27

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 28

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 29

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 30

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 31

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 32

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 33

<210> 34

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 34

<210> 35

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 35

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 36

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 37

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 38

<210> 39

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 39

<210> 40

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 40

<210> 41

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 41

<210> 42

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 42

<210> 43

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 43

<210> 44

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 44

<210> 45

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 45

<210> 46

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 46

<210> 47

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 47

<210> 48

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<4400> 48

<210> 49

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 49

<210> 50

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 50

<210> 51

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 51

<210> 52

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 52

<210> 53

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 53

<210> 54

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 54

<210> 55

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 55

<210> 56

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 56

<210> 57

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 57

<210> 58

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 58

<210> 59

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 59

<210> 60

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 60

<210> 61

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 61

<210> 62

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 62

<210> 63

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 63

<210> 64

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 64

<210> 65

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 65

<210> 66

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 66

<210> 67

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 67

<210> 68

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 68

<210> 69

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 69

<210> 70

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 70

<210> 71

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 71

<210> 72

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 72

<210> 73

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 73

<210> 74

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 74

<210> 75

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 75

<210> 76

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 76

<210> 77

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 77

<210> 78

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 78

<210> 79

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 79

<210> 80

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 80

<210> 81

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 81

<210> 82

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 82

<210> 83

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 83

<210> 84

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 84

<210> 85

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 85

<210> 86

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 86

<210> 87

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 87

<210> 88

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 88

<210> 89

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 89

<210> 90

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 90

<210> 91

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 91

<210> 92

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 92

<210> 93

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 93

<210> 94

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 94

<210> 95

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 95

<210> 96

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 96

<210> 97

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 97

<210> 98

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 98

<210> 99

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 99

<210> 100

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 100

<210> 101

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 101

<210> 102

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 102

<210> 103

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 103

<210> 104

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 104

<210> 105

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 105

<210> 106

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 106

<210> 107

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 107

<210> 108

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 108

<210> 109

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 109

<210> 110

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 110

<210> 111

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 111

<210> 112

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 112

<210> 113

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 113

<210> 114

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 114

<210> 115

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 115

<210> 116

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 116

<210> 117

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 117

<210> 118

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 118

<210> 119

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 119

<210> 120

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 120

<210> 121

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 121

<210> 122

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 122

<210> 123

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 123

<210> 124

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 124

<210> 125

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 125

<210> 126

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 126

<210> 127

<211> 233

<212> DNA

<213> 智人

<400> 127

<210> 128

<211> 251

<212> DNA

<213> 智人

<400> 128

Claims

一種反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其中該反義寡聚物為選自由下述(a1)、(b1)、(c1)及(d1)所組成之群組中的反義寡聚物，惟排除由序列編號90及97至126之任一個鹼基序列構成的反義寡聚物，

(a1)包含序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列之反義寡聚物；

(b1)包含相對於序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列有1至5個鹼基經缺失、置換、插入、及/或附加之鹼基序列，並且，具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性之反義寡聚物；

(c1)包含相對於序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列，具有80%以上之序列一致性之鹼基序列，並且，具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性之反義寡聚物；及

(d1)會與由與序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列互補之鹼基序列構成之寡核苷酸在嚴苛之條件下雜交之反義寡聚物，並且該反義寡聚物具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性。
一種反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其中該反義寡聚物為選自由下述(e)、(f)、(g)及(h)所組成之群組中的反義寡聚物，惟排除由序列編號90及97至126之任一個鹼基序列構成的反義寡聚物，

(e)由序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列構成之反義寡聚物；

(f)由相對於序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列有1至5個鹼基經缺失及/或置換之鹼基序列構成，並且，具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性之反義寡聚物；

(g)由相對於序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列，具有80%以上序列一致性之鹼基序列構成，並且，具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性之反義寡聚物；及

(h)會與由與序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列互補之鹼基序列構成之寡核苷酸在高嚴苛之條件下雜交之反義寡聚物，並且該反義寡聚物具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性。
如請求項1或2所述之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其中，前述反義寡聚物為具有相對於序列編號1至89及91至93中之任一個鹼基序列，具有90%以上之序列一致性之核苷酸序列，並且，具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性之反義寡聚物。
如請求項1所述之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其中，前述反義寡聚物為選自由下列(a2)、(b2)、(c2)及(d2)所組成之群組中的反義寡聚物，

(a2)包含序列編號7、8、10、16、21、24、31、42、67及76中之任一個鹼基序列的反義寡聚物；

(b2)包含相對於序列編號7、8、10、16、21、24、31、42、67及76中之任一個鹼基序列有1至5個鹼基經缺失、置換、插入、及/或附加之鹼基序列，並且，具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性之反義寡聚物；

(c2)包含相對於序列編號7、8、10、16、21、24、31、42、67及76中之任一個鹼基序列，具有80%以上序列一致性之鹼基序列，並且，具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性之反義寡聚物；及

(d2)會與由與序列編號7、8、10、16、21、24、31、42、67及76中之任一個鹼基序列互補的鹼基序列構成之寡核苷酸在嚴苛條件下雜交之反義寡聚物，並且該反義寡聚物具有誘導人類肌肉萎縮蛋白的基因的外顯子51跳讀的活性。
如請求項1至4中任一項所述之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其係寡核苷酸。
如請求項5所述之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸的糖部分及/或磷酸鍵結部分係經修飾。
如請求項5或6所述之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸的糖部分為2’位的-OH基經選自由OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br及I所組成之群組中之任一個基置換的核糖，其中，上述R表示烷基或芳香基，上述R’表示伸烷基。
如請求項5至7中任一項所述之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸的磷酸鍵結部分為選自由硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基磷酸酯鍵、胺基磷酸酯鍵、及硼烷磷酸酯鍵所組成之群組中之至少1者。
如請求項1至4中任一項所述之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其係N-嗎啉寡聚物。
如請求項9所述之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其係磷醯二胺N-嗎啉寡聚物。
如請求項9或10所述之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物，其中，5’末端為下述化學式(1)至(3)中之任一種基，
一種肌肉萎縮症治療用醫藥組成物，係含有請求項1至11中任一項所述之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物。
如請求項12所述之醫藥組成物，係更含有藥學上可容許之擔體。
如請求項12或13所述之醫藥組成物，其為用以對肌肉萎縮症患者進行投予者，前述患者為在肌肉萎縮蛋白的基因中具有成為外顯子51之跳讀之對象的變異者。
如請求項14所述之醫藥組成物，其中，前述患者係具有肌肉萎縮蛋白的基因，該肌肉萎縮蛋白的基因係至少具有由外顯子51附近之外顯子缺失所導致之框移突變，並且，藉由外顯子51之跳讀而修正胺基酸之讀取框。
如請求項14或15所述之醫藥組成物，其中，前述患者係在肌肉萎縮蛋白的基因中具有由外顯子13-50、29-50、40-50、43-50、45-50、47-50、48-50、49-50、50、52、52-63之缺失所導致之框移突變。
如請求項14至16中任一項所述之醫藥組成物，其中，前述患者係人類。
一種如請求項1至11中任一項所述之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物之用途，係用於肌肉萎縮症治療用醫藥的製造。
一種肌肉萎縮症之治療方法，係包含對肌肉萎縮症患者投予有效量之如請求項1至11中任一項所述之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物、或如請求項12至16中任一項所述之醫藥組成物之步驟。
如請求項19所述之治療方法，前述患者係人類。
如請求項1至11中任一項所述之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物、或如請求項12至16中任一項所述之醫藥組成物，係使用於肌肉萎縮症的治療。
如請求項21所述之反義寡聚物或者是其藥學上可容許之鹽或此等的水合物、或醫藥組成物，其中，在前述治療中，肌肉萎縮症患者係人類。