WO2023171820A1 - キャリアペプチドが連結された核酸 - Google Patents

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seq
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宏之 杉山
太寛 中村
真樹 野形
慧南 小宮山
孝男 河野
幹也 藤原
菜穂子 ベイリー小林
徹彦 吉田
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日本新薬株式会社
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid linked to a carrier peptide, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof, and a complex comprising a carrier peptide and a nucleic acid, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof. , the nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof, or a pharmaceutical composition comprising the complex, the nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof, or the pharmaceutical composition.
  • the present invention relates to a method for treating muscular dystrophy, etc., which includes the step of administering a composition to a muscular dystrophy patient.
  • nucleic acid drugs such as antisense oligomers and siRNA that target genes and pathogenic bacteria that cause diseases have been attracting attention.
  • Nucleic acids such as antisense oligomers and siRNAs may not be sufficiently taken up into cells, and as a result, their effects may not be sufficient. Furthermore, depending on the tissue, uptake into cells may be particularly insufficient.
  • the present invention relates to a nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof or a hydrate thereof linked to a carrier peptide, a complex of a carrier peptide and a nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
  • a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid linked to a carrier peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate or complex thereof; and a nucleic acid linked to a carrier peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof
  • the present invention provides a method for treating muscular dystrophy, which includes the step of administering a hydrate, a complex thereof, or the above-mentioned pharmaceutical composition to a muscular dystrophy patient.
  • the amino acid sequence of KKRTLRKSNRKKR (SEQ ID NO: 1) linked to the nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof or a hydrate thereof, or an addition, deletion, or deletion of 1 or 2 amino acids in SEQ ID NO: 1
  • a carrier peptide containing a substituted amino acid sequence (excluding those in which both amino acids at positions 8 and 9 from the N-terminus of SEQ ID NO: 1 are substituted); including; the nucleic acid is selected from the group consisting of antisense oligomers, siRNA, and shRNA;
  • 3-1 The nucleic acid according to (2) or a pharmaceutically acceptable thereof, wherein the exon is selected from the group consisting of exons 23, 43, 44, 45, 50, 51, 52, 53, and 55. Salts or their hydrates.
  • Nucleic acids or pharmaceutically acceptable salts thereof or hydrates thereof are linked via a linking moiety, according to any one of (1) to (5). Nucleic acids or pharmaceutically acceptable salts thereof or hydrates thereof. (7) The nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof or a hydrate thereof according to any one of (1) to (6), wherein the connecting portion is a linker. (8) The nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof or a hydrate thereof according to (7), wherein the linker is a peptidic linker or a non-peptidic linker.
  • nucleic acid represents the nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof
  • peptide represents the carrier peptide, or the nucleic acid according to any one of (6) to (10).
  • R represents a group selected from -NH 2 and -OH.
  • nucleic acid represents the nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof
  • peptide represents the carrier peptide, the nucleic acid according to any one of (6) to (11-1).
  • the amino acid sequence of KKRTLRKSNRKKR (SEQ ID NO: 1), or the amino acid sequence in which one or two amino acids are added, deleted, or substituted in SEQ ID NO: 1 (however, both positions 8 and 9 from the N-terminus of SEQ ID NO: 1) a carrier peptide containing (excluding those with amino acid substitutions), including; the nucleic acid is selected from the group consisting of antisense oligomers, siRNA, and shRNA; complex.
  • (17-2) The complex according to (16) or (17-1), wherein the exon is selected from the group consisting of exons 44, 45, 50, 51, 53, and 55.
  • (18-1) The complex according to any one of (13) to (17-2), wherein the carrier peptide contains the amino acid sequence of KKRTLRKSNRKKR (SEQ ID NO: 1).
  • (18-2) The complex according to (18-1), wherein the carrier peptide consists of the amino acid sequence KKRTLRKSNRKKR (SEQ ID NO: 1).
  • (20-1) the nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof or a hydrate thereof according to any one of (1) to (19), wherein the pre-mRNA is human-derived pre-mRNA; Or complex.
  • (20-2) The nucleic acid or the nucleic acid according to any one of (1) to (20-1), wherein the exon is exon 23, and the nucleic acid includes or consists of the base sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the exon is exon 43, and the nucleic acid includes or consists of the base sequence of SEQ ID NO: 146 or 147, according to any one of (1) to (20-1).
  • the exon is exon 44, and the nucleic acid includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 4 and 52 to 105, (1) to (20-1). Any of the nucleic acids or their pharmaceutically acceptable salts, their hydrates, or complexes.
  • the exon is exon 44, and the nucleic acid includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NO: 4, 56, and 62, (1) to (20-1)
  • (21-3) The nucleic acid or the nucleic acid according to any one of (1) to (20-1), wherein the exon is exon 44, and the nucleic acid includes or consists of the base sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the exon is exon 45, and the nucleic acid includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 29 to 33, 131, and 132, (1) to (20- The nucleic acid according to any one of 1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a hydrate thereof, or a complex.
  • the exon is exon 50, and the nucleic acid includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 9 to 12 and 119 to 130, (1) to (20-1) ) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate or complex thereof.
  • the exon is exon 50, and the nucleic acid includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 9 to 12, 119 to 125, 127, 129, and 130. 1) The nucleic acid according to any one of (20-1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a hydrate thereof, or a complex.
  • the exon is exon 51, and the nucleic acid includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOS: 5 to 8 and 106 to 118, (1) to (20-1) ) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate or complex thereof.
  • 24-2 The exon is exon 51, and the nucleic acid includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 5 to 8 and 106, (1) to (20-1).
  • nucleic acids or their pharmaceutically acceptable salts, their hydrates, or complexes Any of the nucleic acids or their pharmaceutically acceptable salts, their hydrates, or complexes.
  • nucleic acid includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 5 to 8. or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a hydrate thereof, or a complex thereof.
  • nucleic acid includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 6 to 8. or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a hydrate thereof, or a complex thereof.
  • the exon is exon 52, and the nucleic acid includes or consists of the base sequence of SEQ ID NO: 143 or 144, according to any one of (1) to (20-1).
  • a nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a hydrate thereof, or a complex thereof is obtained from any one of (1) to (20-1), wherein the exon is exon 52, and the nucleic acid includes or consists of the base sequence of SEQ ID NO: 229.
  • a pharmaceutically acceptable salt thereof or a hydrate or complex thereof is obtained from the exon 53, and the nucleic acid includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 3 and 42 to 51, (1) to (20-1). Any of the nucleic acids or their pharmaceutically acceptable salts, their hydrates, or complexes.
  • nucleic acid includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NO: 3 or 42. or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a hydrate thereof, or a complex thereof.
  • the exon is exon 55, and the nucleic acid includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOS: 13 to 28 and 133 to 140, (1) to (20-1) ) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate or complex thereof.
  • the exon is exon 55, and the nucleic acid includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 13 to 28 and 133, (1) to (20-1). Any of the nucleic acids or their pharmaceutically acceptable salts, their hydrates, or complexes.
  • the exon is exon 55, and the nucleic acid includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 13, 23, and 26, (1) to (20-1) The nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a hydrate thereof, or a complex according to any of the above.
  • a pharmaceutical composition comprising the nucleic acid according to any one of (1) to (26-4), a pharmaceutically acceptable salt thereof, a hydrate thereof, or a complex.
  • nucleic acid according to any one of (1) to (26-4) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate or complex thereof, or any one of (27) to (29).
  • a method for treating muscular dystrophy the method comprising administering the pharmaceutical composition described in 1. to a muscular dystrophy patient.
  • the present invention can provide nucleic acids with high efficiency of uptake into cells, complexes containing nucleic acids, or pharmaceutical compositions containing them.
  • the carrier peptide-linked nucleic acids, complexes comprising nucleic acids, or pharmaceutical compositions comprising them of the invention are highly effective, highly specific for distribution to cells or tissues (e.g. highly effective in the heart). ), and/or have low toxicity (cytotoxicity and biotoxicity) and high safety.
  • the present invention can provide a highly therapeutic and/or highly safe method for treating muscular dystrophy.
  • the skipping efficiency of exon 23 of the mouse dystrophin gene in C2C12 cells (mouse striated muscle-derived myoblast cell line) of antisense oligomers is shown (Gymnosis method). This is similar to FIG. This is similar to FIG. This is similar to FIG. This is similar to FIG.
  • the skipping efficiency of exon 23 of the mouse dystrophin gene in C2C12 cells of antisense oligomers is shown (Electroporation method).
  • the efficiency of skipping exon 23 of the dystrophin gene by antisense oligomers in the tibialis anterior muscle, quadriceps femoris muscle, heart, and diaphragm of wild-type mice is shown.
  • the efficiency of skipping exon 23 of the dystrophin gene by a peptide-linked antisense oligomer in the tibialis anterior muscle, quadriceps femoris muscle, heart, and diaphragm of wild-type mice is shown.
  • the blood test results in wild type mice administered with PPMO are shown.
  • the results of a simple toxicity test in wild type mice administered with PPMO are shown.
  • the skipping efficiency (%) of exon 23 of the dystrophin gene and the expression level of dystrophin protein (wild type %) in the tibialis anterior muscle, quadriceps femoris muscle, heart, and diaphragm of mdx mice according to the number of days that have passed after PPMO administration are shown.
  • Antisense oligomers were each treated at 100 ⁇ M.
  • the skipping efficiency of exon 51 of the human dystrophin gene in RD cells of antisense oligomers is shown (Gymnosis method).
  • Antisense oligomer is PMO No. 100 ⁇ M for PPMO No.7. 19, PPMO No. No. 22 was treated with 30 ⁇ M.
  • the skipping efficiency of exon 50 of the human dystrophin gene in RD cells of antisense oligomers is shown (Gymnosis method).
  • Antisense oligomers were treated at 50 ⁇ M each.
  • the skipping efficiency of exon 50 of the human dystrophin gene in RD cells of antisense oligomers is shown (Gymnosis method).
  • Antisense oligomers were treated at 50 ⁇ M each.
  • the skipping efficiency of exon 55 of the human dystrophin gene in RD cells of antisense oligomers is shown (Gymnosis method).
  • Antisense oligomers were each treated at 100 ⁇ M.
  • the skipping efficiency of exon 45 of the human dystrophin gene in RD cells of antisense oligomers is shown (Gymnosis method).
  • Antisense oligomers were each treated at 100 ⁇ M.
  • the present invention provides a nucleic acid, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof (hereinafter also referred to as "the nucleic acid of the present invention” in the present specification), and a nucleic acid or a pharmaceutical thereof.
  • KKRTLRKSNRKKR amino acid sequence of KKRTLRKSNRKKR (SEQ ID NO: 1), or an amino acid sequence in which one or two amino acids have been added, deleted, or substituted in SEQ ID NO: 1, linked to a legally acceptable salt or a hydrate thereof; (However, excluding those in which both amino acids at positions 8 and 9 from the N-terminus of SEQ ID NO: 1 are substituted) or a carrier peptide consisting of the amino acid sequence, and the nucleic acid is an antisense oligomer, siRNA
  • the present invention relates to a carrier peptide-linked nucleic acid selected from the group consisting of , and shRNA, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
  • carrier peptide described in this specification has cell membrane permeability, is linked to the nucleic acid of the present invention, or is included in a complex with the nucleic acid of the present invention, and allows the nucleic acid of the present invention to enter cells. refers to a peptide that improves uptake (hereinafter, the nucleic acid of the present invention linked with a carrier peptide is also referred to as the “carrier peptide-linked nucleic acid of the present invention", and the complex containing the nucleic acid of the present invention and the carrier peptide is referred to as the "carrier peptide-linked nucleic acid of the present invention”. ).
  • the carrier peptide comprises the amino acid sequence of KKRTLRKSNRKKR (SEQ ID NO: 1), or a modified amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, as long as it does not impair the cell membrane permeability of the carrier peptide, or a modified amino acid sequence of these amino acid sequences.
  • the "modified amino acid sequence" of SEQ ID NO: 1 means (i) an amino acid sequence in which one or two, preferably one amino acid is added, deleted, or substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 ( However, excluding those in which both amino acids at positions 8 and 9 from the N-terminus of SEQ ID NO: 1 are substituted, preferably excluding those in which both or either amino acid at positions 8 and 9 are substituted), or (ii) an amino acid sequence having sequence identity of 70% or more, 80% or more, or 90% or more compared to SEQ ID NO: 1 (provided that both amino acids at positions 8 and 9 from the N-terminus of SEQ ID NO: 1) (preferably excluding those in which either or both of the 8th and 9th amino acids are substituted).
  • the "modified amino acid sequence" of SEQ ID NO: 1 does not include addition, deletion, or substitution of amino acids at any of the 8th and 9th positions from the N-terminus of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence (i) include one in which one amino acid is added and one amino acid is deleted at positions other than positions 8 and 9 of SEQ ID NO: 1, and one in which one amino acid is added and one amino acid is deleted at positions other than positions 8 and 9 of SEQ ID NO: 1.
  • one amino acid substituted, one amino acid substituted and one amino acid deleted, one amino acid added, one amino acid substituted, one amino acid Examples include those that are deleted.
  • Sequences with one amino acid deleted in SEQ ID NO: 1 include KRTLRKSNRKKR (SEQ ID NO: 157), KKTLRKSNRKKR (SEQ ID NO: 158), KKRLRKSNRKKR (SEQ ID NO: 159), KKRTRKSNRKKR (SEQ ID NO: 160), KKRTLKSNRKKR (SEQ ID NO: 161), KKRTLRSNRKKR (SEQ ID NO: 162), KKRTLRKNRKKR (SEQ ID NO: 163), KKRTLRKSRKKR (SEQ ID NO: 164), KKRTLRKSNKR (SEQ ID NO: 165), KKRTLRKSNRKR (SEQ ID NO: 166), KKRTLRKSNRKK (SEQ ID NO: 167) are listed.
  • Sequences in which one amino acid is substituted in SEQ ID NO: 1 include, for example, KKRTLXKSNRKKR (SEQ ID NO: 173), KKRTLRXSNRKKR (SEQ ID NO: 174), KKRTLRKXNRKKR (SEQ ID NO: 175), KKRTLRKSXRKKR (SEQ ID NO: 176), KKRTLRKSNXKKR (SEQ ID NO: 177), KKRTLRKSNRXKR (SEQ ID NO: 177) 178), KKRTLRKSNRKXR (SEQ ID NO: 179), KKRTLRKSNRKKX (SEQ ID NO: 180).
  • Sequences in which one amino acid is added to SEQ ID NO: 1 include, for example, 85), KKRTLXRKSNRKKR (SEQ ID NO: 186), KKRTLRXKSNRKKR (SEQ ID NO: 187), KKRTLRKXSNRKKR (SEQ ID NO: 188), KKRTLRKSXNRKKR (SEQ ID NO: 189), KKRTLRKSNXRKKR (SEQ ID NO: 190), KKRTLRKSNRX KKR (SEQ ID NO: 191), KKRTLRKSNRKXKR (SEQ ID NO: 192), KKRTLRKSNRKKXR (SEQ ID NO: 193), and KKRTLRKSNRKKRX (SEQ ID NO: 194).
  • Whether or not a carrier peptide has cell membrane permeability is determined by determining whether or not the uptake of the nucleic acid into cells is increased by linking the carrier peptide and the nucleic acid, for example, as described in the Examples of this specification. This can be confirmed, for example, by investigation as described in the Examples herein.
  • modified sequences herein include so-called conservative amino acid substitutions in which one or two, preferably one, amino acid residue is replaced with an amino acid residue having similar biological activity.
  • conservative amino acid substitutions include sequences in which a basic amino acid residue is replaced with another basic amino acid residue (for example, mutual substitution of a lysine residue and an arginine residue), and a sequence in which a basic amino acid residue is replaced with another basic amino acid residue (for example, mutual substitution of a lysine residue and an arginine residue), and a hydrophobic amino acid residue. Sequences in which is substituted with another hydrophobic amino acid residue (for example, mutual substitution of leucine residue, isoleucine residue, and valine residue), etc. can be mentioned.
  • sequence identity of nucleotide sequences or amino acid sequences refers to ⁇ sequence identity'' of two nucleotide sequences or amino acid sequences that are aligned (by introducing gaps as necessary) so that the degree of identity between the two is highest. It refers to the percentage (%) of identical base sequences or amino acids between two sequences when they are aligned. Sequence identity of nucleotide sequences or amino acid sequences can be determined using the algorithm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) by Karlin and Arthur (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993), for example, using default parameters.
  • the carrier peptide can be easily produced according to methods known to those skilled in the art, such as general chemical synthesis methods. For example, any of the conventionally known solid phase synthesis methods or liquid phase synthesis methods may be employed. A solid phase synthesis method using Boc (t-butyloxycarbonyl) or Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) as a protecting group for an amino group is suitable. That is, the above-mentioned peptide having a desired amino acid sequence can be synthesized by solid-phase synthesis using a commercially available peptide synthesizer.
  • carrier peptide may be synthesized by the above method, or a peptide chain containing a carrier peptide and a linker portion (for example, a peptidic linker), or a nucleic acid of the present invention in which the carrier peptide is linked via a linker may be synthesized. You may.
  • the carrier peptide may be prepared by biosynthesis based on genetic engineering techniques. That is, a polynucleotide (typically DNA) of a nucleotide sequence (including the ATG start codon) encoding a desired amino acid sequence is synthesized, and the synthesized polynucleotide (DNA) and the amino acid sequence are expressed in a host cell. Depending on the host cell, a recombinant vector containing an expression gene construct containing various regulatory elements (including promoters, ribosome binding sites, terminators, enhancers, and various cis elements that control expression levels) to can be constructed.
  • various regulatory elements including promoters, ribosome binding sites, terminators, enhancers, and various cis elements that control expression levels
  • This recombinant vector is introduced into a host cell (eg, yeast, insect cell, plant cell) by a common technique, and the host cell or a tissue or individual containing the cell is cultured under appropriate conditions. This allows the desired peptide to be produced intracellularly.
  • the target peptide can then be obtained by isolating the peptide portion from the host cell (in the medium if secreted) and performing refolding, purification, etc. as necessary.
  • a fusion protein expression system can be used for efficient mass production within host cells. That is, a gene (DNA) encoding the amino acid sequence of the carrier peptide of interest is chemically synthesized, and the synthetic gene is used in an appropriate fusion protein expression vector (for example, the pET series provided by Novagen, or the pET series provided by Amersham Biosciences).
  • the vector is introduced into a suitable site of a GST (Glutathione S-transferase) fusion protein expression vector such as the pGEX series.
  • a host cell typically E. coli
  • the obtained transformant is cultured to prepare the desired fusion protein.
  • the protein is then extracted and purified.
  • the obtained purified fusion protein is cleaved with a predetermined enzyme (protease), and the liberated target peptide fragment (ie, the designed artificial polypeptide) is recovered by a method such as affinity chromatography.
  • a predetermined enzyme protease
  • affinity chromatography a method such as affinity chromatography.
  • a template DNA i.e., a synthetic gene fragment containing the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the carrier peptide
  • various compounds ATP, RNA polymerase,
  • the target polypeptide can be synthesized in vitro using a so-called cell-free protein synthesis system.
  • cell-free protein synthesis systems for example, Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755 (2001), Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000)).
  • cell-free protein synthesis kits for example, cell-free protein synthesis kits (for example, from Japan's Cell Free Science Co., Ltd.) available) are commercially available.
  • a single-stranded or double-stranded polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a carrier peptide and/or a nucleotide sequence complementary thereto can be easily produced (synthesized) by a conventionally known method. That is, by selecting codons corresponding to each amino acid residue constituting the designed amino acid sequence, the nucleotide sequence corresponding to the designed amino acid sequence can be easily determined and provided. Once the nucleotide sequence is determined, a polynucleotide (single strand) corresponding to the desired nucleotide sequence can be easily obtained using a DNA synthesizer or the like.
  • the desired double-stranded DNA can be obtained by using the obtained single-stranded DNA as a template and employing various enzymatic synthesis methods (typically PCR).
  • the polynucleotide may be in the form of DNA or RNA (such as mRNA).
  • DNA can be provided in double-stranded or single-stranded form. When provided as a single strand, it may be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand) having a complementary sequence thereto.
  • polynucleotides thus obtained can be used as materials for constructing recombinant genes (expression cassettes) for peptide production in various host cells or in cell-free protein synthesis systems, as described above. can.
  • the base length of the nucleic acid of the present invention is not limited, but for example, 15 bases or more, 16 bases or more, 17 bases or more, 18 bases or more, 19 bases or more, 20 bases or more, 21 bases or more, 22 bases may be at least 23 bases long, at least 24 bases long, at least 25 bases long, at least 26 bases long, at least 27 bases long, at least 28 bases long, at least 29 bases long, or at least 30 bases long, and may be 30 bases long 29 bases or less, 28 bases or less, 27 bases or less, 26 bases or less, 25 bases or less, 24 bases or less, 23 bases or less, 22 bases or less, 21 bases or less, 20 bases
  • the length may be 19 bases or less, 18 bases or less, 17 bases or less, 16 bases or less, or 15 bases long.
  • the nucleic acid of the present invention may consist of, for example, 15-30 bases, 15-25 bases, 16-24 bases, 17-23 bases, 18-22 bases, 19-21 bases, such as 20 bases.
  • Examples of pharmaceutically acceptable salts of nucleic acids include alkali metal salts such as sodium, potassium, and lithium salts; alkaline earth metal salts such as calcium and magnesium salts; aluminum, iron, and zinc salts. salts, metal salts such as copper salts, nickel salts, cobalt salts; ammonium salts; t-octylamine salts, dibenzylamine salts, morpholine salts, glucosamine salts, phenylglycine alkyl ester salts, ethylenediamine salts, N-methylglucamine salts , guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N,N'-dibenzylethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt, diethanolamine salt, N-benzyl-phenethylamine salt, piperazine salt, tetramethylammonium salt, Tris Organic amine salts such as (hydroxy
  • Aryl sulfonates organic acid salts such as acetate, malate, fumarate, succinate, citrate, tartrate, oxalate, maleate; glycine salt, lysine salt, arginine salt, ornithine Examples include amino acid salts such as salts, glutamate, and aspartate. These salts can be produced by known methods. Alternatively, the nucleic acids of the invention may be in the form of their hydrates.
  • the nucleic acid of the present invention may be an antisense oligomer, such as an oligonucleotide, a morpholino oligomer, or a peptide nucleic acid (PNA) oligomer (hereinafter referred to as "antisense oligonucleotide of the present invention", “ (Also referred to as “antisense morpholino oligomer of the present invention” or “antisense peptide nucleic acid oligomer of the present invention.”)
  • antisense oligonucleotide of the present invention " (Also referred to as “antisense morpholino oligomer of the present invention” or “antisense peptide nucleic acid oligomer of the present invention.”
  • the antisense oligonucleotide of the present invention is an antisense oligomer whose constituent units are nucleotides, and such nucleotides may be ribonucleotides, deoxyribonucleotides, or modified nucleotides.
  • a modified nucleotide refers to a ribonucleotide or deoxyribonucleotide in which all or part of the nucleobase, sugar moiety, and phosphate binding moiety that constitute it are modified.
  • nucleobase examples include adenine, guanine, hypoxanthine, cytosine, thymine, uracil, and modified bases thereof.
  • modified bases include, for example, pseudouracil, 3-methyluracil, dihydrouracil, 5-alkylcytosine (e.g., 5-methylcytosine), 5-alkyluracil (e.g., 5-ethyluracil), 5-halouracil (e.g. , 5-bromouracil), 6-azapyrimidine, 6-alkylpyrimidine (e.g.
  • 6-methyluracil 2-thiouracil, 4-thiouracil, 4-acetylcytosine, 5-(carboxyhydroxymethyl)uracil, 5-carboxy Methylaminomethyl-2-thiouracil, 5-carboxymethylaminomethyluracil, 1-methyladenine, 1-methylhypoxanthine, 2,2-dimethylguanine, 3-methylcytosine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, N6 -Methyladenine, 7-methylguanine, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, 5-methylaminomethyluracil, 5-methylcarbonylmethyluracil, 5-methyloxyuracil, 5-methyl-2-thiouracil, 2-methylthio -N6-isopentenyladenine, uracil-5-oxyacetic acid, 2-thiocytosine, purine, 2,6-diaminopurine, 2-aminopurine, isoguanine, indole, imidazole, xanthin
  • thymine “T” and uracil “U” are interchangeable, and whether it is “T” or “U” does not essentially affect the activity of the nucleic acid of the present invention. Therefore, in the base sequences shown in this specification, cases where “T” is “U” are also included, and these are indicated by the same sequence number.
  • a sequence containing a modified base is represented by the same sequence number as a sequence not containing a modified base; for example, “cytosine” and “methylcytosine” are interchangeable, and “cytosine” is " ⁇ Methylcytosine'' will also be indicated by the same sequence number.
  • Modification of the sugar moiety examples include modification of the 2' position of ribose and modification of other parts of the sugar. Modifications at the 2' position of ribose include, for example, changing the -OH group at the 2' position of ribose to -OR, -OROR, -R, -R'OR, -SH, -SR, -NH 2 , -NHR, - NR 2 , -N 3 , -CN, -F, -Cl, -Br, -I, such as -OMe (-O-CH 3 ) or -Omethoxyethyl (-O-MOE: -O-CH 2 CH 2 OCH 3 ) can be mentioned.
  • R represents alkyl or aryl.
  • R' represents alkylene.
  • modifications to other parts of the sugar include those in which O at the 4' position of ribose or deoxyribose is replaced with S, and those in which the 2' and 4' positions of the sugar are crosslinked, such as LNA (Locked Nucleic Acid ) or ENA (2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids), but are not limited to these.
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • ENA (2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids
  • Modifications of the phosphate binding moiety include, for example, modifying the phosphodiester bond with a phosphorothioate bond, a phosphorodithioate bond, an alkylphosphonate bond, a phosphoramidate bond, a boranophosphate bond (for example, Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 18, 9154-9160)).
  • the alkyl is preferably a linear or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, tert-pentyl, n-hexyl, and isohexyl. It will be done.
  • the alkyl may be substituted, and examples of such substituents include halogen, alkoxy, cyano, and nitro, and the alkyl may be substituted with 1 to 3 of these.
  • the cycloalkyl is preferably a cycloalkyl having 3 to 12 carbon atoms. Specific examples include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, cyclodecyl, and cyclododecyl.
  • halogen examples include fluorine, chlorine, bromine, and iodine.
  • alkoxy refers to linear or branched alkoxy having 1 to 6 carbon atoms, such as methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, tert -butoxy, n-pentyloxy, isopentyloxy, n-hexyloxy, isohexyloxy and the like. Particularly preferred is alkoxy having 1 to 3 carbon atoms.
  • the aryl is preferably an aryl having 6 to 10 carbon atoms. Specific examples include phenyl, ⁇ -naphthyl, and ⁇ -naphthyl. Particularly preferred is phenyl.
  • the aryl may be substituted, and examples of such substituents include alkyl, halogen, alkoxy, cyano, and nitro, and 1 to 3 of these may be substituted.
  • alkylene is preferably linear or branched alkylene having 1 to 6 carbon atoms.
  • specific examples include methylene, ethylene, trimethylene, tetramethylene, pentamethylene, hexamethylene, 2-(ethyl)trimethylene, and 1-(methyl)tetramethylene.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention can be easily synthesized using various automatic synthesizers (e.g., AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare)), or can be easily synthesized by a third party (e.g., Promega). It is also possible to entrust the production to a company such as Takara Co., Ltd. or Takara Co., Ltd.
  • the antisense morpholino oligomer of the present invention is an antisense oligomer whose constitutional unit is a group represented by the following general formula.
  • Base represents a nucleobase
  • W represents a group represented by any of the following formulas.
  • X represents -CH 2 R 1 , -O-CH 2 R 1 , -S-CH 2 R 1 , -NR 2 R 3 , or F
  • R 1 represents H, alkyl
  • R 2 and R 3 are the same or different and represent H, alkyl, cycloalkyl, or aryl
  • Y 1 represents O, S, CH 2 or NR 1
  • Y2 represents O, S, or NR1
  • Z represents O or S.
  • Examples of morpholino monomer compounds used to synthesize the antisense morpholino oligomer of the present invention include morpholino monomer compounds (A), morpholino monomer compounds (C), morpholino monomer compounds (T), and morpholino monomer compounds shown in Table 1. Examples include (G), but are not limited to these.
  • the morpholino oligomer is preferably an oligomer (phosphorodiamidate morpholino oligomer (hereinafter referred to as "PMO")) having a group represented by the following formula as a constituent unit. (In the formula, Base, R 2 and R 3 have the same meanings as above.)
  • PMO phosphorodiamidate morpholino oligomer
  • Morpholino oligomers can be produced, for example, according to the method described in International Publication No. 1991/009033 or International Publication No. 2009/064471.
  • PMO can be manufactured according to the method described in International Publication No. 2009/064471 or International Publication No. 2013/100190.
  • the antisense oligomer of the present invention may have a group represented by any of the following chemical formulas (1) to (2) at the 5' end.
  • the antisense peptide nucleic acid oligomer of the present invention is an antisense oligomer whose constitutional unit is a group represented by the following general formula. (In the formula, Base has the same meaning as above.)
  • Peptide nucleic acid oligomers can be produced, for example, according to the following literature. 1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991)2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, JACS, 114, 1895 (1992)3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)4) L.
  • the nucleic acids of the invention are antisense oligomers (also referred to as “antisense oligomers of the invention") that modulate the splicing of pre-mRNA or the function of a targeted RNA or target region thereof. inhibit.
  • pre-mRNA is an RNA molecule containing exons and introns transcribed from a target gene on the genome, and is an mRNA precursor.
  • regulating splicing of pre-mRNA means, for example, exon skipping (preventing the inclusion of a specific exon when mRNA is generated from pre-mRNA by splicing) and/or exon It means to promote inclusion (incorporating into mRNA an exon that would be mistakenly excluded when mRNA is generated from pre-mRNA by splicing).
  • target RNA includes viral genomic RNA, human pre-mRNA, mRNA, and the like.
  • inhibiting the function of a target RNA or its target region refers to a nucleic acid containing a target region that binds to a target region and forms a double strand with an antisense oligomer (e.g., viral genomic RNA).
  • human pre-mRNA, mRNA, etc. are cleaved by RNaseH, inhibiting the replication of nucleic acids containing the target region (e.g., viral genomic RNA, human pre-mRNA, mRNA, etc.), and inhibiting the translation of the target region.
  • nucleic acids containing the target region e.g., viral genomic RNA, human pre-mRNA, mRNA, etc.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • One of the functions is to promote the cleavage of a nucleic acid (e.g., viral genomic RNA, human pre-mRNA, mRNA, etc.) that is incorporated into a target region and binds to the target region. Including the above.
  • viral genomic RNA includes subgenomic RNA
  • “subgenomic RNA” refers to a portion of (-) strand RNA synthesized by RNA-dependent RNA polymerase using (+) strand genomic RNA as a template.
  • RNA-dependent RNA as a template refers to RNA that is shorter than genomic RNA synthesized by polymerase and serves as mRNA for viral protein synthesis (translation).
  • the antisense oligomer of the invention skips at least one exon of dystrophin pre-mRNA, preferably human dystrophin pre-mRNA.
  • Dystrophin pre-mRNA is an RNA molecule containing exons and introns transcribed from the dystrophin gene on the genome, and is an mRNA precursor.
  • Those skilled in the art can obtain information on the base sequence of dystrophin, eg, human dystrophin pre-mRNA, by analogy with the genome sequence of the dystrophin, eg, human dystrophin gene (GenBank Accession No. NG_012232.1).
  • the human dystrophin gene exists at the gene locus Xp21.2.
  • the human dystrophin gene has a size of approximately 3.0 Mbp, making it the largest known human gene.
  • the coding region of the human dystrophin gene is only about 14 kb, and the coding region is distributed within the dystrophin gene as 79 exons (Roberts, RG., et al., Genomics, 16: 536-538 (1993)).
  • Pre-mRNA which is a transcript of the human dystrophin gene, undergoes splicing to produce a mature mRNA of approximately 14 kb.
  • the nucleotide sequence of human wild-type dystrophin gene mature mRNA is known (GenBank Accession No. NM_004006).
  • skipping activity refers to at least one, for example one, two, three, four, human dystrophin pre-mRNA, taking human dystrophin pre-mRNA as an example. Alternatively, it refers to the activity of producing human dystrophin mRNA in which 5, preferably 1 exon is deleted. In other words, this activity is caused by the binding of the antisense oligomer described herein to the target site on human dystrophin pre-mRNA, so that when the pre-mRNA undergoes splicing, the deleted exon is immediately present.
  • the 5'-terminal nucleotide of the exon immediately downstream of the exon to be deleted is linked to the 3'-terminal nucleotide of the upstream exon, resulting in a mature mRNA with no codon frameshift (i.e., exon without frameshift). This means that a mature mRNA (in which a mature mRNA is deleted) is formed.
  • Whether or not skipping has occurred can be determined, for example, by introducing the antisense oligomer of the present invention into dystrophin-expressing cells (e.g., human rhabdomyosarcoma cells), and extracting the target exon of the mRNA of the human dystrophin gene from the total RNA of the dystrophin-expressing cells. This can be confirmed by RT-PCR amplifying the surrounding region and performing nested PCR or sequence analysis on the PCR amplification product.
  • dystrophin-expressing cells e.g., human rhabdomyosarcoma cells
  • the nucleic acid of the present invention may, for example, contain or consist of a complementary base sequence to the base sequence of the target region.
  • the length of the base sequence of the target region is, for example, 10 to 60 bases, 10 to 55 bases, 10 to 50 bases, 10 to 45 bases, 10 to 40 bases, 10 to 35 bases, or 10 to 30 bases.
  • a “complementary sequence” or “complementary base sequence” does not need to have 100% complementarity with the target base sequence, for example, 100% complementarity with the target base sequence.
  • Bases, 2 bases, 3 bases, 4 bases, or 5 bases of non-complementary bases may be included, and for the target base sequence, 1 base, 2 bases, 3 bases, 4 bases, Alternatively, the base sequence may be 5 bases shorter.
  • a base sequence that is "complementary" to a base sequence is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% %, 99%, or 100%, more preferably 100%.
  • Complementarity can be easily determined by a person skilled in the art, for example, by aligning two sequences and counting the number of bases that form Watson-Crick base pairs or wobble base pairs between the sequences, and determining the base pairs. It can be calculated by dividing the number of bases formed by the total number of bases in the sequence and multiplying this by 100.
  • base sequence that is "complementary" to a certain base sequence is a base sequence of a nucleic acid that can hybridize to a nucleic acid containing that base sequence, for example, under stringent conditions.
  • stringent conditions may be any of low stringency conditions, medium stringency conditions, and high stringency conditions.
  • Low stringency conditions are, for example, 5x SSC, 5x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32°C.
  • moderate stringency conditions are, for example, 5x SSC, 5x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42°C, or 5x SSC, 1% SDS, 50mM Tris-HCl (pH 7.
  • Highly stringent conditions are, for example, 5x SSC, 5x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50°C, or 0.2x SSC, 0.1% SDS, 65°C. be. Under these conditions, it can be expected that base sequences with higher sequence identity can be obtained more efficiently as the temperature is raised. However, there are multiple factors that can affect the stringency of hybridization, such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration, and those skilled in the art can select these factors appropriately. Similar stringency can be achieved by doing so.
  • a commercially available kit for hybridization for example, AlkPhos Direct Labeling and Detection System (GE Healthcare) can be used.
  • the membrane was washed in a primary wash buffer containing 0.1% (w/v) SDS at 55°C. After washing, hybridization can be detected.
  • DIG digoxigenin
  • a commercially available reagent e.g., PCR labeling mix (Roche Diagnostics), etc.
  • Hybridization can be detected using a DIG nucleic acid detection kit (Roche Diagnostics) or the like.
  • the exon skipped by the antisense oligomer of the invention is at least one selected from the group consisting of exons 23, 43, 44, 45, 50, 51, 52, 53, and 55, e.g. one, two, three, four or five, preferably one.
  • exon sequences and target sequences are also written as "bc" in exon a.
  • "b” represents the base at the 5' end of the target base sequence
  • “c” represents the base at the 3' end of the target base sequence.
  • “b” and “c” are positive integers
  • "b” and “c” respectively represent the 3' end direction when the 5' end base of the a-th exon is the 1st base. Indicates whether it is the th base.
  • exon 23 (+1+243) contains the base sequence of SEQ ID NO: 148 (+214 to +243 are the sequences of intron 23), exon 43 (+1+173) contains the base sequence of SEQ ID NO: 149, and exon 44 (-30+148)
  • Exon 45 (-10+176) contains the base sequence of SEQ ID NO: 150 (-30 to -1 is the sequence of intron 43), and exon 45 (-10+176) contains the base sequence of SEQ ID NO: 151 (-10 to -1 is the sequence of intron 44).
  • exon 50 (+1+139) contains the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 152 (+110 to +139 are the sequence of intron 50)
  • exon 51 (+1+233) contains the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 153
  • exon 52 (+1+118) contains the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 154
  • exon 53 (+1+212) contains the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 155
  • exon 55 (-30+190) contains the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 156 (-30 to -1 is intron 54).
  • the antisense oligomer of the present invention is complementary to any of the nth to (n+m)th regions Xn from the 5' end of exon 43 (SEQ ID NO: 149) of human dystrophin pre-mRNA (
  • the antisense oligomer of the present invention comprises or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 203-227.
  • the antisense oligomer of the present invention is complementary to any of the nth to (n+m)th regions Xn from the 5' end of exon 51 (SEQ ID NO: 153) of human dystrophin pre-mRNA (
  • the antisense oligomer of the present invention comprises or consists of the base sequence of SEQ ID NO: 228.
  • the antisense oligomer of the present invention comprises or consists of the base sequence of SEQ ID NO: 229.
  • the antisense oligomer of the present invention is complementary to any of the nth to (n+m)th regions Xn from the 5' end of exon 53 (SEQ ID NO: 155) of human dystrophin pre-mRNA (
  • Non-limiting examples of antisense oligomers that cause exon skipping of dystrophin pre-mRNA are shown below.
  • antisense oligomers include those containing or consisting of a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-33 and 42-147. Further examples of antisense oligomers include (i) base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 to 33 and 42 to 147, in which one or several bases are added, deleted, or substituted; , (ii) 80%, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% for the base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 42 to 142.
  • the number of bases is 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. It means 10 pieces or 10 pieces.
  • the exon skipped by the antisense oligomer of the present invention is exon 23, and the antisense oligomer of the present invention comprises or consists of the base sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the antisense oligomer of the present invention comprises (i) a base sequence in which one or several bases are added, deleted, or substituted in the base sequence of SEQ ID NO: 2, (ii) a base sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a stringent oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO. It contains or consists of the base sequence of an antisense oligomer that can hybridize under certain conditions, and induces skipping of exon 23.
  • the exon skipped by the antisense oligomer of the present invention is exon 43, and the antisense oligomer of the present invention comprises or consists of the base sequence of SEQ ID NO: 146 or 147.
  • the antisense oligomer of the present invention comprises (i) a base sequence in which one or several bases are added, deleted, or substituted in the base sequence of SEQ ID NO: 146 or 147; (ii) SEQ ID NO: 146 Or for 147 base sequences, 80%, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% a base sequence having a sequence identity of 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more, or (iii) a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 146 or 147. contains or consists of an antisense a base sequence in which
  • the exon skipped by the antisense oligomer of the invention is exon 44, and the antisense oligomer of the invention comprises a base sequence selected from SEQ ID NOs: 4 and 52-105, or Become.
  • the antisense oligomer of the present invention comprises (i) a base sequence in which one or several bases are added, deleted, or substituted in the base sequence selected from SEQ ID NOs: 4 and 52 to 105; ii) 80%, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, with respect to the base sequence selected from SEQ ID NO: 4 and 52 to 105; A base sequence having a sequence identity of 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more, or (iii) SEQ ID NO: 4 and 52 Contains or consists of an antisense oli
  • the antisense oligomer of the invention comprises or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 203-227.
  • the antisense oligomer of the present invention comprises (i) a base sequence in which one or several bases are added, deleted, or substituted in the base sequence selected from SEQ ID NOs: 4 and 203 to 227; ii) 80%, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% for the base sequence selected from SEQ ID NOS: 203 to 227.
  • the antisense oligomer contains or consists of an antisense oligomer base sequence that can hybridize under stringent conditions with an oligonucleotide consisting of a base sequence that is complementary to the base sequence that is complementary to the base sequence, and induces skipping of exon 44.
  • the exon skipped by the antisense oligomer of the present invention is exon 45, and the antisense oligomer of the present invention comprises a base sequence selected from SEQ ID NOs: 29-33, 131, and 132. , or consisting of.
  • the antisense oligomer of the present invention comprises (i) a base in which one or several bases are added, deleted, or substituted in the base sequence selected from SEQ ID NOs: 29-33, 131, and 132; sequence, (ii) 80%, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more with respect to the base sequence selected from SEQ ID NOS: 29-33 and 131-132.
  • the exon skipped by the antisense oligomer of the present invention is exon 50, and the antisense oligomer of the present invention comprises a base sequence selected from SEQ ID NOs: 9-12 and 119-130, or or consists of.
  • the antisense oligomer of the present invention comprises (i) a base sequence in which one or several bases are added, deleted, or substituted in a base sequence selected from SEQ ID NOs: 9 to 12 and 119 to 130; , (ii) 80%, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, A base sequence having a sequence identity of 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more, or (iii) sequence Contains or consists of the base sequence of an antisense oligomer that can hybridize under stringent conditions with an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to a base sequence selected from numbers 9 to 12 and 119 to 130. , and induces exon 50 skipping.
  • the exon skipped by the antisense oligomer of the present invention is exon 51
  • the antisense oligomer of the present invention comprises a base sequence selected from SEQ ID NOs: 5-8 and 106-118, or or consists of.
  • the antisense oligomer of the present invention comprises (i) a base sequence in which one or several bases are added, deleted, or substituted in a base sequence selected from SEQ ID NOs: 5 to 8 and 106 to 118; , (ii) 80%, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, A base sequence having a sequence identity of 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more, or (iii) sequence Contains or consists of the base sequence of an antisense oligomer that can hybridize under stringent conditions with an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to a base sequence selected from numbers 5 to 8 and 106 to 118.
  • the antisense oligomer of the present invention comprises or consists of the base sequence of SEQ ID NO: 228. In one embodiment, the antisense oligomer of the present invention comprises (i) a base sequence in which one or several bases are added, deleted, or substituted in the base sequence of SEQ ID NO: 228, (ii) a base sequence of SEQ ID NO: 228.
  • an oligonucleotide consisting of a complementary base sequence to the base sequence of SEQ ID NO: 228, and a stringent It contains or consists of the base sequence of an antisense oligomer that can hybridize under certain conditions, and induces exon 51 skipping.
  • the exon skipped by the antisense oligomer of the present invention is exon 52, and the antisense oligomer of the present invention comprises or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 141 to 145.
  • the antisense oligomer of the present invention comprises (i) a base sequence in which one or several bases are added, deleted, or substituted in a base sequence selected from SEQ ID NOs: 141 to 145; (ii) 80%, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, for the base sequence selected from SEQ ID NOS: 141 to 145.
  • the antisense oligomer of the present invention comprises or consists of the base sequence of SEQ ID NO: 229.
  • the antisense oligomer of the present invention comprises (i) a base sequence in which one or several bases are added, deleted, or substituted in the base sequence of SEQ ID NO: 229, (ii) a base sequence of SEQ ID NO: 229.
  • a stringent oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 229; It contains or consists of the base sequence of an antisense oligomer that can hybridize under certain conditions, and induces exon 51 skipping.
  • the exon skipped by the antisense oligomer of the present invention is exon 53
  • the antisense oligomer of the present invention comprises a base sequence selected from SEQ ID NOs: 3 and 42-51, or Become.
  • the antisense oligomer of the present invention comprises (i) a base sequence in which one or several bases are added, deleted, or substituted in the base sequence selected from SEQ ID NOs: 3 and 42 to 51; ii) 80%, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, for the base sequence selected from SEQ ID NOs: 3 and 42 to 51; A base sequence having a sequence identity of 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more, or (iii) SEQ ID NO: 3 and 42 Contains or consists of the base sequence of an antis
  • the exon skipped by the antisense oligomer of the present invention is exon 55
  • the antisense oligomer of the present invention comprises a base sequence selected from SEQ ID NOs: 13-28 and 133-140, or or consists of.
  • the antisense oligomer of the present invention comprises (i) a base sequence in which one or several bases are added, deleted, or substituted in a base sequence selected from SEQ ID NOs: 13 to 28 and 133 to 140; , (ii) 80%, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more with respect to the base sequence selected from SEQ ID NOS: 13-28, 133-140 A base sequence having a sequence identity of 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more, or (iii) sequence Contains or consists of the base sequence of an antisense oligomer that can hybridize under stringent conditions with an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to a base sequence selected from numbers 13 to 28 and 133 to 140. , and induces exon 55 skipping.
  • the nucleic acid of the present invention is siRNA or shRNA, or DNA encoding them.
  • siRNA refers to double-stranded RNA containing a sense strand and an antisense strand that can induce RNA interference in a sequence-specific manner.
  • RNA interference refers to a phenomenon in which a nucleic acid having a target sequence is degraded in a sequence-specific manner by double-stranded RNA.
  • shRNA is a hairpin-shaped RNA that includes a sense strand, an antisense strand, and a single-stranded loop sequence (hairpin sequence) that covalently binds the sense strand and the antisense strand.
  • siRNA When shRNA is introduced into cells, it is processed by Dicer to form siRNA.
  • An example of DNA encoding siRNA is tandem DNA containing two promoters (eg, U6 promoter), a base sequence encoding a sense strand, and a base sequence encoding an antisense strand.
  • the "sense strand” refers to a nucleotide strand that is complementary to at least a portion of the corresponding antisense strand.
  • the sense strand can include a nucleic acid sequence that has homology to the target sequence.
  • antisense strand refers to a nucleotide strand that is partially or fully complementary to at least a portion of a target nucleic acid sequence.
  • Each 3' end of the sense RNA and antisense RNA may have an overhang of 2 to 5 nucleotides, for example 2 nucleotides. It has been pointed out that overhangs may interact with RISC and also contribute to improving stability against degradation by nucleases, but since they do not affect specificity to the target sequence, they cannot be used with arbitrary sequences (e.g. poly T sequences). can be used.
  • the carrier peptide is linked to the 5' or 3' end of the nucleic acid of the present invention, either directly or via a linking moiety, which includes a covalent bond or a linker. If the nucleic acid of the present invention is an antisense oligomer of PMO, it is preferably linked to the 3' end directly or via a linking moiety.
  • the carrier peptide is indirectly linked to the 5' or 3' end of the nucleic acid of the present invention via a suitable linker, and even if the nucleic acid of the present invention is an antisense oligomer of PMO. It is preferably linked to the 3' end either directly or indirectly via a suitable linker.
  • a person skilled in the art can easily prepare a nucleic acid linked to a carrier peptide, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
  • it can be prepared by preparing a carrier peptide and a nucleic acid, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof, respectively, as described herein, and then linking them together via a linker.
  • a linker for example, after linking a carrier peptide and a linker, a nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof or a hydrate thereof may be linked to a linker, or a nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be linked to a linker.
  • the carrier peptide may be linked to the linker after linking the hydrate thereof to the linker.
  • a linker may be formed between the carrier peptide and the nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof or hydrate thereof.
  • the linker is not particularly limited, but may be a peptidic linker or a non-peptidic linker.
  • the amino acid sequence constituting the peptidic linker is preferably a flexible amino acid sequence that does not cause steric hindrance.
  • the peptidic linker contains, for example, one or more natural amino acid residues selected from glycine, alanine, serine, etc., and contains 10 or less (more preferably 1 to 5, for example 1, The linker may consist of 2, 3, 4, or 5 amino acid residues). Further, such a linker may contain or consist of a non-natural amino acid selected from ⁇ -alanine, aminohexanoic acid, etc., for example, a linker containing one or more non-natural amino acids.
  • the linker may consist of 10 or less amino acid residues (more preferably 1 or more and 5 or less, such as 1, 2, 3, 4, or 5 amino acid residues).
  • the non-peptidic linker is not particularly limited, but for example, an alkyl linker, a PEG (polyethylene glycol) linker, maleimide-thiol adducts, etc. may be used.
  • linkers examples include linkers represented by the chemical formula shown in square brackets below (the following schematic diagram shows a carrier peptide-linked nucleic acid or its pharmaceutically acceptable represents the structure of a salt or a hydrate thereof, where nucleic acid represents a nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof or a hydrate thereof, and peptide represents a carrier peptide):
  • nucleic acid to which the carrier peptide of the present invention is linked, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof is preferably as follows: (nucleic acid and peptide have the same meanings as above), more preferably the following: (R represents a group selected from -NH 2 and -OH.) as well as (nucleic acid and peptide have the same meanings as above), or the carrier peptide and the nucleic acid or their pharmaceutically acceptable salts or their hydrates are connected without a linker. directly connected to.
  • the linker can be prepared by methods known to those skilled in the art, such as chemical synthesis.
  • the bonding position of the carrier peptide and the nucleic acid or its pharmaceutically acceptable salt or their hydrate is not limited, but for example, the carrier peptide may be linked to the nucleic acid or its pharmaceutically acceptable salt at the N-terminus or C-terminus. ing.
  • the carrier peptide and the nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof or a hydrate thereof are linked via a linker, and the carrier peptide is linked to the linker at its C-terminus.
  • nucleic acids linked to the carrier peptide of the present invention, pharmaceutically acceptable salts thereof, or hydrates thereof include those shown in the table below.
  • Other specific examples of nucleic acids linked to the carrier peptide of the present invention, pharmaceutically acceptable salts thereof, or hydrates thereof include, for example, PPMO Nos. 13 to 44 listed in Table 8 of Examples. Any of PPMO No. 13 to 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, and 42, for example, PPMO No. 13 to 16, 18, 21, 24, 27, Any of 30, 33, 36, 39, 41, and 42, e.g., PPMO No. 13 to 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 41, and 42, e.g., PPMO Any of No.
  • the present invention provides a nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof or a hydrate thereof that modulates splicing of pre-mRNA or inhibits the function of a target region of RNA and KKRTLRKSNRKKR (SEQ ID NO: 1), or an amino acid sequence in which one or two amino acids are added, deleted, or substituted in SEQ ID NO: 1 (however, both amino acids at positions 8 and 9 from the N-terminus of SEQ ID NO: 1 are substituted) or a carrier peptide consisting of the amino acid sequence (hereinafter also referred to as "the complex of the present invention").
  • the details of the carrier peptide and the nucleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof or a hydrate thereof are as follows. As described.
  • the present invention relates to a complex in which the nucleic acid of the present invention and a carrier peptide are bound by electrostatic interaction.
  • a complex can be easily prepared when the nucleic acid of the present invention has a negative charge by mixing it with a positively charged carrier peptide (e.g., J Clin Invest. 2014;124(10) :4363-4374. doi:10.1172/JCI75673).
  • a positively charged carrier peptide e.g., J Clin Invest. 2014;124(10) :4363-4374. doi:10.1172/JCI75673
  • the invention relates to a complex in which the nucleic acid of the invention is present in a liposome and a carrier peptide is attached to the liposome.
  • a complex can be prepared by mixing a carrier peptide and a lipid to create a micelle (liposome) containing the carrier peptide in a lipid bilayer membrane, and mixing this with a nucleic acid (for example, 28: 102225. doi:10.1016/j.nano.2020.102225).
  • Liposomes include cationic liposomes, such as liposomes (hereinafter referred to as "liposomes") formed of 2-O-(2-diethylaminoethyl)carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerol and phospholipids as essential components.
  • liposomes formed of 2-O-(2-diethylaminoethyl)carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerol and phospholipids as essential components.
  • Oligofectamine registered trademark
  • Lipofectin registered trademark
  • Lipofectamine registered trademark
  • Lipofectamine 2000 registered trademark
  • DMRIE-C registered trademark
  • GeneSilencer registered trademark
  • TransMessenger registered trademark
  • TransIT TKO registered trademark
  • the carrier peptide-linked nucleic acid or complex of the present invention has high uptake efficiency into cells.
  • the nucleic acids of the invention have high efficacy (e.g., exon skipping activity), high specificity for distribution to cells or tissues (e.g., high efficacy in the heart), and/or low toxicity. could be.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising one or more carrier peptide-linked nucleic acids or complexes of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the invention may further include a carrier that facilitates delivery of the nucleic acid or complex.
  • Such carriers are not particularly limited as long as they are pharmaceutically acceptable, and examples thereof include cationic liposomes, cationic carriers such as cationic polymers, and carriers using viral envelopes. .
  • the cationic liposome the cationic liposome described for the above-mentioned complex can be used.
  • Examples of the cationic polymer include JetSI (registered trademark) (manufactured by Qbiogene) and Jet-PEI (registered trademark) (polyethyleneimine, manufactured by Qbiogene).
  • Examples of carriers using viral envelopes include GenomeOne (registered trademark) (HVJ-E liposome, manufactured by Ishihara Sangyo Co., Ltd.).
  • the pharmaceutical device described in Patent No. 2924179 and the cationic carrier described in Re-published Patent Publication No. 2006/129594 and Re-published Patent Publication No. 2008/096690 can also be used.
  • the nucleic acid of the present invention may be in the form of a conjugate with a lipid or the like in a pharmaceutical composition in order to promote delivery of the nucleic acid.
  • a conjugate with cholesterol as described in Bijsterbosch, M.K. et al. (2000) Nucleic Acid Res., 28, 2717-2725.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable additive in addition to the carrier peptide-linked nucleic acid or complex of the present invention and optionally the above carrier.
  • a pharmaceutically acceptable additive include, for example, emulsification aids (for example, fatty acids having 6 to 22 carbon atoms and pharmaceutically acceptable salts thereof, albumin, dextran), stabilizers (for example, cholesterol, phosphatidic acid, mannitol, sorbitol).
  • isotonic agents e.g., sodium chloride, glucose, maltose, lactose, sucrose, trehalose
  • pH adjusting agents e.g., hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethanolamine.
  • the content of the additive in the composition of the present invention is suitably 90% by weight or less, preferably 70% by weight or less, and more preferably 50% by weight or less.
  • the method for preparing the pharmaceutical composition of the present invention is not limited, but it can be prepared, for example, by adding the carrier peptide-linked nucleic acid or complex of the present invention to a carrier dispersion and stirring appropriately. Further, the additive can be added in an appropriate step either before or after the addition of the carrier peptide-linked nucleic acid or complex of the present invention.
  • the aqueous solvent that can be used when adding the carrier peptide-linked nucleic acid or complex of the present invention is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples include water for injection, distilled water for injection, and physiological saline. Examples include electrolyte solutions, buffer solutions, and sugar solutions such as glucose solutions and maltose solutions. Further, conditions such as pH and temperature in such a case can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be made into, for example, a liquid preparation or a lyophilized preparation thereof.
  • the freeze-dried preparation can be prepared by freeze-drying the composition of the present invention, which is in the form of a liquid, by a conventional method.
  • a predetermined amount is dispensed into vials and pre-frozen at a temperature within the range of about -40°C to -20°C. for about 2 hours, primary drying under reduced pressure within the range of about 0°C to 10°C, then secondary drying under reduced pressure within the range of about 15°C to 25°C, and freeze drying.
  • the inside of the vial is replaced with nitrogen gas and the vial is capped to obtain a lyophilized preparation of the composition of the present invention.
  • the lyophilized preparation of the pharmaceutical composition of the present invention can generally be redissolved and used by adding any suitable solution (redissolution solution).
  • redissolution solution examples include water for injection, physiological saline, and other general infusion solutions.
  • the volume of this redissolution solution varies depending on the use and is not particularly limited, but is suitably 0.5 to 2 times the volume before freeze-drying, or 500 mL or less.
  • the dosage when administering the pharmaceutical composition of the present invention depends on the type of carrier peptide-linked nucleic acid or complex of the present invention contained therein, the dosage form, the patient's condition such as age and weight, the route of administration, and the nature of the disease.
  • the amount of the carrier peptide-linked nucleic acid or complex of the present invention for adults is 0.1 mg to 1 g per kg of body weight per administration, preferably 0.1 mg per kg of body weight. 1 mg to 100 mg, more preferably 1 mg to 90 mg per kg body weight, more preferably 1 mg to 80 mg per kg body weight, even more preferably 10 mg to 60 mg/kg, even more preferably 10 mg to 50 mg/kg, even more preferably 10 mg to 90 mg/kg body weight.
  • the frequency of administration may be from once every few months to several times every month. This value may vary depending on the type of disease targeted, administration form, and target molecule. Therefore, in some cases, a lower dose or frequency of administration may be sufficient, while in other cases, a higher dose or frequency of administration is required.
  • the administration form of the composition according to the present invention is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable administration form, and can be selected depending on the treatment method, including intratracheal administration, pulmonary administration, nasal administration. , intravenous administration, intraarterial administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, oral administration, intratissue administration, transdermal administration, and the like. When delivering to muscle tissue, from the viewpoint of ease of delivery, intravenous administration, intraarterial administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, oral administration, intratissue administration, transdermal administration, etc. are preferable. Further, the dosage forms that the composition of the present invention can take are not particularly limited, but include, for example, various injections, oral preparations, drops, ointments, lotions, and the like.
  • the dosage form that the composition of the present invention can take is preferably an inhalant, and specifically, for example, an inhalation liquid (for example, administered with a nebulizer), Powder inhalants (eg administered with a DPI (Dry Powder Inhaler)), aerosols and preferably inhaled liquids.
  • an inhalation liquid for example, administered with a nebulizer
  • Powder inhalants eg administered with a DPI (Dry Powder Inhaler)
  • aerosols eg.g., aerosols and preferably inhaled liquids.
  • the carrier peptide-linked nucleic acid, complex, or pharmaceutical composition of the present invention can be administered to, for example, mammals, such as primates such as humans, laboratory animals such as rats, mice, and brown rats, pigs, cows, horses, and sheep. and the like, preferably humans.
  • mammals such as primates such as humans, laboratory animals such as rats, mice, and brown rats, pigs, cows, horses, and sheep. and the like, preferably humans.
  • the present invention relates to a method for treating muscular dystrophy, comprising the step of administering a carrier peptide-linked nucleic acid, complex, or pharmaceutical composition of the present invention to a patient with muscular dystrophy.
  • composition in this embodiment as well as the dosage and route of administration of the pharmaceutical composition, are as described herein.
  • the present invention relates to a carrier peptide-linked nucleic acid, conjugate, or pharmaceutical composition of the present invention for the treatment of muscular dystrophy.
  • the invention relates to the use of a carrier peptide-linked nucleic acid or conjugate of the invention in the manufacture of a medicament for the treatment of muscular dystrophy.
  • Example 1 Synthesis of antisense oligomer
  • antisense oligomers phosphorodiamidate morpholino oligomers (PMO) Nos. 1 to 38 (SEQ ID NOs: 2 to 39)
  • PMO phosphorodiamidate morpholino oligomers
  • Table 1 shows the theoretical molecular weight of each antisense oligomer and the actual value measured by ESI-TOF-MS.
  • sequences with the initial letter M are sequences of antisense oligomers that target the mouse dystrophin gene
  • sequences with the initial letter H are sequences of antisense oligomers that target the human dystrophin gene. It is an array.
  • the number after the initial letter represents the number of the targeted exon.
  • “H51_69-80_129-142” means that the antisense oligomer is 69 when the base at the 5' end of exon 51 of the human dystrophin gene is the first base and the bases following the 3' side are numbered in order. This indicates that the target is the sequence of bases 129 to 142 and the sequence of bases 129 to 142. Note that the sequence of the bases before the -1st base in the target base sequence is the base sequence in the intron before the exon.
  • sequence whose name begins with A is an antisense oligomer sequence targeting the insertional mutant type of fukutin gene, which is the gene responsible for Fukuyama muscular dystrophy.
  • Example 2-1 Synthesis of PMO and peptide conjugate (peptide-modified phosphorodiamidate morpholino oligomer (PPMO)) (cysteine-maleimide linker)] PMO (PMO No. 1, 198.5 mg, 1.0 eq) was dissolved in a mixed solvent of dimethyl sulfoxide (1.0 mL) and N,N-dimethylformamide (0.2 mL).
  • the obtained white solid was dissolved in a mixed solvent of dimethyl sulfoxide (1.28 mL) and N,N-dimethylformamide (0.32 mL), and the peptide (Ac-KKRTLRKSNRKKR-Cys-CONH 2.9 trifluoroacetic acid (TFA) was added to the solution. ) salt, 62 mg, 1.4 eq), dimethyl sulfoxide (0.48 mL), and N,N-dimethylformamide (0.12 mL) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The reaction was followed by HPLC analysis, and after confirming the disappearance of the raw materials, water (50 mL) was added to quench the reaction.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • HPLC measurement conditions Equipment: Nexera X3 dual injection system (Shimadzu Corporation) Column: MabPac SCX-10, 10 ⁇ m, 4 x 250 mm (Thermo Fisher) Mobile phase A: 25% acetonitrile aqueous solution, 25mM potassium dihydrogen phosphate (pH3.5) Mobile phase B: 25% acetonitrile aqueous solution, 25mM potassium dihydrogen phosphate, 1.5M potassium chloride (pH 3.33) Flow rate: 0.65mL/min Temperature: 30°C Wavelength: 215 & 254nm Gradient:
  • Example 2-2 Purification of PPMO
  • the synthesized PPMO was purified from the solution obtained in Example 2-1 by cation exchange.
  • the purification conditions are as shown in Table 2 below.
  • the target product was collected and concentrated under reduced pressure. The resulting residue was dissolved in water and lyophilized to obtain the target compound as a white flocculent solid.
  • Table 6 shows the theoretical molecular weight of the obtained PPMO and the actual molecular weight measured by ESI-TOF-MS.
  • Tetrahydrofuran (15 mL) was added to the reaction solution, and after centrifugation, the supernatant was removed by decantation, and the residue was dried under reduced pressure. . 15 mL of 28% aqueous ammonia-ethanol (1/3) was added to the obtained white solid, and the mixture was stirred at room temperature for 17 hours. After tracking the reaction by HPLC analysis and confirming the disappearance of the raw materials, the mixture was diluted with 20% acetonitrile aqueous solution (150 mL). The resulting solution was neutralized by adding 1M aqueous hydrochloric acid (131 mL), and then diluted by adding water (300 mL). Note that the HPLC measurement conditions were described in Example 2-1.
  • Example 4 Exon skipping activity test of antisense oligomer
  • Test Example 1 In vitro test of mouse dystrophin gene exon 23 skipping (Gymnosis method)
  • C2C12 cells mouse striated muscle-derived myoblast cell line, purchased from ATCC, CRL-1772
  • the cells were cultured overnight at 37° C. and 5% CO 2 in 0.5 mL of Modified Eagles Medium (DMEM) medium (Sigma).
  • DMEM Modified Eagles Medium
  • Cells were treated with antisense oligomers (morpholino nucleic acids (PMOs) or peptide-modified morpholino nucleic acids (PPMOs)) shown in Tables 1, 6, and 7 at 3, 10, 30, and 100 ⁇ M, and The cells were cultured for three nights at 5% CO2 .
  • antisense oligomers morpholino nucleic acids (PMOs) or peptide-modified morpholino nucleic acids (PPMOs)
  • Tables 1, 6, and 7 at 3, 10, 30, and 100 ⁇ M
  • RT-PCR was performed using Kit (Qiagen) and a thermal cycler.
  • a reaction solution was prepared according to the protocol attached to the above kit.
  • the thermal cycler used was Takara PCR Thermal Cycler Dice Touch (Takara Bio).
  • the RT-PCR program used is as follows. 50°C, 30 minutes: Reverse transcription reaction 95°C, 15 minutes: Polymerase activation, reverse transcriptase inactivation, cDNA heat denaturation [94°C, 30 seconds; 58°C, 1 minute; 72°C, 1 minute] x 32 cycles : PCR amplification 72°C, 10 minutes: Final extension reaction
  • the base sequences of the forward primer and reverse primer used in RT-PCR are as follows. Forward primer: 5'-TCTGGATGCAGACTTTGTGG-3' (SEQ ID NO: 40)
  • skipping efficiency A/(A+B) x 100
  • Test Example 2 In vitro test of mouse dystrophin gene exon 23 skipping (Electroporation method) (1) Test method Antisense oligomers (PMO) in Table 1 and antisense oligomers (PPMO) in Table 6 were added to 2.0 ⁇ 10 5 C2C12 cells at 0.1, 0.3, and 1 ⁇ M. SE Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (Lonza) at the following concentrations: The program used was CD-137. The cells after introduction were cultured overnight at 37° C. and 5% CO 2 in 0.5 mL of DMEM medium (Sigma, same hereinafter) containing 10% FBS.
  • DMEM medium Sigma, same hereinafter
  • Example 5 Wild type mouse drug efficacy test
  • PPMO peptide-modified morpholino nucleic acid
  • PMO No. 1 (SEQ ID NO: 2) was administered once into the tail vein of C57BL/6N male 8-week-old mice at a dose of 300 mg/kg. Also, PMO No. Each PPMO (PPMO No. 1, No. 8, No. 9) conjugated with peptide (SEQ ID NO: 1) to C57BL/6N male 8-week-old mice was administered into the tail vein of C57BL/6N male mice at doses of 6 mg/kg, 20 mg/kg, A single dose of 60 mg/kg was administered. Each PPMO was prepared by the method described above. Two days after administration, the mice were sacrificed, and the tibialis anterior muscle, quadriceps femoris, heart, and diaphragm were collected. Exon skipping efficiency was measured by RT-PCR analysis using total RNA extracted from each tissue.
  • RT-PCR analysis RNA extraction from each tissue was performed using an RNeasy Mini Kit (manufactured by QIAGEN), and RT-PCR was performed using a QIAGEN OneStep RT-PCR Kit (manufactured by QIAGEN), according to the respective attached protocols.
  • the thermal cycler used was TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the RT-PCR program is as follows.
  • forward primer 5'-TCTGGATGCAGACTTTGTGG-3' (SEQ ID NO: 40)
  • Reverse primer 5'-CAGCCATCCATTTCTGTAAGG-3' (SEQ ID NO: 41)
  • the reaction product of the above PCR was analyzed using MultiNA (manufactured by Shimadzu Corporation).
  • Example 6 Wild type mouse blood test
  • each PPMO (PPMO No. 1, No. 8, No. 9) was administered to mice, and two days after administration, whole blood was collected from the mice under isoflurane anesthesia. Serum was obtained using a coagulation promoter + serum separating agent (Terumo Corporation, catalog number: CJ-2AS) according to the attached protocol. Using the obtained serum, blood aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), urea nitrogen (BUN), and creatinine values were measured.
  • AST blood aspartate aminotransferase
  • ALT alanine aminotransferase
  • BUN urea nitrogen
  • Example 7 Wild type mouse simple toxicity test
  • Safety evaluation was conducted for each PPMO (PPMO No. 4, PPMO No. 7, PPMO No. 8, PPMO No. 9) in order to verify safety in medical use.
  • Example 8 mdx mouse drug efficacy durability test
  • the durability of the efficacy of each PPMO was verified using mdx mice, which are often used as an animal model for Duchenne muscular dystrophy (DMD).
  • mdx mice contain a mutation in exon 23 of the dystrophin gene and hardly express dystrophin.
  • PMO No. 1 SEQ ID NO: 2 is known to induce exon 23 skipping and restore functional dystrophin expression.
  • RT-PCR analysis RNA extraction from each tissue was performed using an RNeasy Mini Kit (manufactured by QIAGEN), and RT-PCR was performed using a QIAGEN OneStep RT-PCR Kit (manufactured by QIAGEN), according to the respective attached protocols.
  • the thermal cycler used was TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the RT-PCR program is as follows.
  • forward primer 5'-TCTGGATGCAGACTTTGTGG -3' (SEQ ID NO: 40)
  • Reverse primer 5'-CAGCCATCCATTTCTGTAAGG -3' (SEQ ID NO: 41)
  • the reaction product of the above PCR was analyzed using MultiNA (manufactured by Shimadzu Corporation).
  • skipping efficiency ES 100 x A/(A+B)
  • the homogenization buffer was prepared by adding cComplete TM Mini protease inhibitor cocktail (Roche, catalog number: 11836153001) to RIPA buffer (manufactured by Thermo Fisher Scientific, catalog number: 89900) at a dose according to the attached protocol. .
  • the homogenized solution was centrifuged at 15,000 xg and 4°C for 30 minutes, and the supernatant was used as a total protein solution. Quantification of the total protein solution was performed using Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Catalog Number: 23225) according to the attached protocol. For quantification, the total protein solution was diluted with a homogenization buffer to fall within the range of the BSA standard curve.
  • the gel was transferred to Immolilon-P Transfer Membrane (Merck Millipore, catalog number: IPVH00010) in EzFastBlow HMW (Atto, catalog number: WSE-7210, diluted according to the attached protocol) buffer for 30 minutes at room temperature. Transfer was performed at 0.4 A per minute. After protein transfer, the membrane was immersed in TBS-T buffer and washed at room temperature for 5 minutes with gentle shaking. TBS-T buffer was prepared by diluting 10x TBS (Bio-Rad, catalog number 170-6435) 10 times with ultrapure water, and adding 1% tween-20 (Nacalai Tesque, catalog number 356-24) ( v/v).
  • a blocking buffer was prepared by adding skim milk (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., catalog number: 198-10605) to TBS-T to a concentration of 5% (w/v).
  • DYS1 antibody Leica, catalog number NCL-DYS1 diluted 1:100 with blocking buffer or anti-GAPDH antibody (Abcam, catalog number NCL-DYS1) diluted 1:2,500 with blocking buffer was added. Catalog number: ab8245) and incubated overnight at 4°C.
  • the membrane was immersed in TBS-T and washed for 5 minutes with gentle shaking.
  • the detected images were analyzed using Image Lab software (Bio-Rad), and linear regression analysis was performed.
  • Western blot gels contained 100%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, and 3.0% total protein extracted from wild-type mouse tibialis anterior, quadriceps, heart, or diaphragm, respectively. It was diluted to 125% and applied, and used as a standard curve for the amount of dystrophin.
  • Dystrophin protein levels were determined as a percentage of wild-type dystrophin levels (%WT) by comparing the dystrophin band intensities to a standard curve.
  • PPMO No. 1 showed very high skipping activity when administered to tibialis anterior muscle, quadriceps femoris, heart, and diaphragm at 120 mg/kg, and induced very strong expression of dystrophin protein.
  • the effects were seen even 60 days after administration.
  • the effect was observed even 30 days after administration, and the expression of dystrophin protein was observed even 60 days after administration.
  • the effect was observed even 30 days after administration, and the expression of dystrophin protein was observed even 60 days after administration.
  • the effect was higher than that of PPMO linked to other peptides (data not shown).
  • Example 9 Synthesis and purification of PPMO linked with an amide linker (Ahx amide linker) or a cysteine-maleimide (Cys-Maleimide) linker] PMO No. 2, 3, 5-7, 8-10, 12, 22, 25, 29, 31-33 using the same method as described in Example 2-1, Example 2-2, and Example 3 Synthesis and purification were performed to obtain the target compounds (Table 8, PPMO Nos. 13 to 42).
  • Example 10 RD cell drug efficacy test
  • Test method Four 4.0 ⁇ 10 RD cells (human rhabdomyosarcoma cell line, purchased from Human Science Research Resource Bank, JCRB9072) were placed in Minimum Essential containing 10% fetal bovine serum (FBS) (Nichirei). The cells were cultured overnight in 0.5 mL of Media (MEM) medium (Sigma) at 37° C. and 5% CO 2 conditions.
  • FBS fetal bovine serum
  • Cells were treated with antisense oligomers (morpholino nucleic acids (PMOs) or peptide-modified morpholino nucleic acids (PPMOs)) shown in Tables 1 and 8 at 30, 50, or 100 ⁇ M, and further incubated at 37°C with 5% CO2 . The cells were cultured for two nights under these conditions.
  • antisense oligomers morpholino nucleic acids (PMOs) or peptide-modified morpholino nucleic acids (PPMOs) shown in Tables 1 and 8 at 30, 50, or 100 ⁇ M, and further incubated at 37°C with 5% CO2 . The cells were cultured for two nights under these conditions.
  • PMOs morpholino nucleic acids
  • PPMOs peptide-modified morpholino nucleic acids
  • One-Step RT-PCR was performed on 200 ng of the extracted total RNA using QIAGEN OneStep RT-PCR Kit (QIAGEN) and a thermal cycler.
  • a reaction solution was prepared according to the protocol attached to the above kit.
  • the thermal cycler used was Takara PCR Thermal Cycler Dice Touch (Takara Bio).
  • the RT-PCR program used is as follows.
  • skipping efficiency A/(A+B) x 100
  • each antisense oligomer (PMO No. 2, PMO No. 3, PMO No. 5 to PMO No. 12, PMO No. 22, PMO No. 25, PMO No. 29, PMO No. 31, PMO No. 32) It was found that each exon was skipped with high efficiency compared to the previous method. Moreover, from the results shown in FIGS. 15 to 22, each antisense oligomer (PPMO No. 13, No. 15, No. 17 to No. 19, No. 23 to No. 25, No. 29 to No. 31, No. 35 to No. 37, and No. 43) are antisense oligomers (PPMO No. 14, No. 16, No. 20 to No. 22, No. 26 to No. 28, No. 32 to No. 34, No. 38 to No. 40, No. 42), at least It was found that each exon tends to be skipped with equal or higher efficiency.

Abstract

本明細書において、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節する、又は標的となるＲＮＡ若しくはその標的領域の機能を阻害する、核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物と、前記核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物に連結された、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１）のアミノ酸配列、又は配列番号１において１又は２個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列（ただし、配列番号１のＮ末端から８位及び９位の両方のアミノ酸が置換されたものを除く）を含むキャリアペプチドと、を含み、前記核酸がアンチセンスオリゴマー、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される、キャリアペプチドが連結された核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物等が提供される。

Description

キャリアペプチドが連結された核酸
　本発明は、キャリアペプチドが連結された核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、キャリアペプチドと核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物を含む複合体、前記核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は前記複合体を含む医薬組成物、前記核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は前記医薬組成物を筋ジストロフィー患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法等に関する。
　近年、疾患を引き起こす原因となる遺伝子や病原菌等を標的とするアンチセンスオリゴマーやｓｉＲＮＡ等の核酸医薬を用いて疾患を治療する方法が注目されている。アンチセンスオリゴマーやｓｉＲＮＡ等の核酸は、細胞内への取り込みが十分でない場合があり、それに起因して効果が十分でない場合がある。また、組織によって、とくに細胞内への取り込みが不十分である場合もある。
　そのため、核酸にキャリアペプチドを連結させて細胞への取り込みを向上させることが試みられているが、細胞毒性や生物毒性があり安全性が問題となっているものもある（非特許文献１及び２）。
Bo Wu et al., The American Journal of Pathology, Vol. 181, No. 2, pp. 392-400, August 2012 Adams Amantana et al., Bioconjugate Chem. 2007, 18, 1325-1331
　上記のような状況において、細胞内への取り込み効率が高い、及び／又は安全性の高い核酸が求められていた。
　本発明は、以下のキャリアペプチドが連結された核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、キャリアペプチドと核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物の複合体、キャリアペプチドが連結された核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物又は複合体を含む医薬組成物、及びキャリアペプチドが連結された核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、複合体、あるいは上記医薬組成物を筋ジストロフィー患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法などを提供する。
（１）ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節する、又は標的となるＲＮＡ若しくはその標的領域の機能を阻害する、核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物と、
　前記核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物に連結された、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１）のアミノ酸配列、又は配列番号１において１又は２個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列（ただし、配列番号１のＮ末端から８位及び９位の両方のアミノ酸が置換されたものを除く）を含むキャリアペプチドと、
を含み、
　前記核酸がアンチセンスオリゴマー、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される、
キャリアペプチドが連結された核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
（２）前記核酸がアンチセンスオリゴマーであり、ジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡの少なくとも１つのエクソンをスキッピングさせる、（１）に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
（３－１）前記エクソンはエクソン２３、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、及び５５からなる群から選択される、（２）に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
（３－２）前記エクソンはエクソン４４、４５、５０、５１、５３、及び５５からなる群から選択される、（２）又は（３－１）に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
（４－１）前記キャリアペプチドが、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む、（１）～（３－２）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
（４－２）前記キャリアペプチドが、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１）のアミノ酸配列からなる、（４－１）に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
（５）前記キャリアペプチドが、前記核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物の３’末端に連結されている、（１）～（４－２）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
（６）前記キャリアペプチドと、前記核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物が、連結部分を介して連結されている、（１）～（５）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
（７）前記連結部分がリンカーである、（１）～（６）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
（８）前記リンカーが、ペプチド性リンカー、又は非ペプチド性リンカーである、（７）に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
（９－１）前記ペプチド性リンカーが、非天然のアミノ酸を含む、（８）に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
（９－２）前記ペプチド性リンカーが、非天然のアミノ酸からなる、（９－１）に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
（１０）前記非ペプチド性リンカーが、アルキルリンカー、ＰＥＧ、マレイミド－チオール付加体（maleimide-thiol adducts）からなる群から選択される、（８）に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
（１１－１）以下：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
からなる群から選択される構造を有し、
ここで、nucleic acidは前記核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物を表し、peptideは前記キャリアペプチドを表す、（６）～（１０）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
（１１－２）以下：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
（Rは-NH2及び-OHから選択される基を示す。）
及び
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
からなる群から選択される構造を有し、
ここで、nucleic acidは前記核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物を表し、peptideは前記キャリアペプチドを表す、（６）～（１１－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
（１２）前記キャリアペプチドが、そのＣ末端において前記リンカーに連結している、（６）～（１１－２）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
（１３）ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節する、又は標的となるＲＮＡ若しくはその標的領域の機能を阻害する、核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物と、
　ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１）のアミノ酸配列、又は配列番号１において１又は２個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列（ただし、配列番号１のＮ末端から８位及び９位の両方のアミノ酸が置換されたものを除く）を含むキャリアペプチドと、
を含み、
　前記核酸がアンチセンスオリゴマー、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される、
複合体。
（１４）前記核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物と前記キャリアペプチドが静電的相互作用により結合している、（１３）に記載の複合体。
（１５）前記核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物がリポソーム中に存在し、前記リポソーム上にキャリアペプチドが結合している、（１３）に記載の複合体。
（１６）前記核酸がアンチセンスオリゴマーであり、ジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソンをスキッピングさせる、（１３）～（１５）のいずれかに記載の複合体。
（１７－１）前記エクソンはエクソン２３、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、及び５５からなる群から選択される、（１６）に記載の複合体。
（１７－２）前記エクソンはエクソン４４、４５、５０、５１、５３、及び５５からなる群から選択される、（１６）又は（１７－１）に記載の複合体。
（１８－１）前記キャリアペプチドが、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む、（１３）～（１７－２）のいずれかに記載の複合体。
（１８－２）前記キャリアペプチドが、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１）のアミノ酸配列からなる、（１８－１）に記載の複合体。
（１９）前記核酸が、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、（１）～（１２）のいずれかのいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は（１３）～（１８－２）のいずれかのいずれかに記載の複合体。
（２０－１）前記ｐｒｅ－ｍＲＮＡが、ヒト由来のｐｒｅ－ｍＲＮＡである、（１）～（１９）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２０－２）前記エクソンはエクソン２３であり、前記核酸は、配列番号２の塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２０－３）前記エクソンはエクソン４３であり、前記核酸は、配列番号１４６又は１４７の塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２１－１）前記エクソンはエクソン４４であり、前記核酸は、配列番号４及び５２～１０５から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２１－２）前記エクソンはエクソン４４であり、前記核酸は、配列番号４、５６、及び６２から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２１－３）前記エクソンはエクソン４４であり、前記核酸は、配列番号４の塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２１－４）前記エクソンはエクソン４４であり、前記核酸は、配列番号２０３～２２７から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２２－１）前記エクソンはエクソン４５であり、前記核酸は、配列番号２９～３３、１３１、及び１３２から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２２－２）前記エクソンはエクソン４５であり、前記核酸は、配列番号２９～３３から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２２－３）前記エクソンはエクソン４５であり、前記核酸は、配列番号３０、３２、及び３３から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２３－１）前記エクソンはエクソン５０であり、前記核酸は、配列番号９～１２及び１１９～１３０から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２３－２）前記エクソンはエクソン５０であり、前記核酸は、配列番号９～１２、１１９～１２５、１２７、１２９、及び１３０から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２３－３）前記エクソンはエクソン５０であり、前記核酸は、配列番号９～１２から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２４－１）前記エクソンはエクソン５１であり、前記核酸は、配列番号５～８及び１０６～１１８から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２４－２）前記エクソンはエクソン５１であり、前記核酸は、配列番号５～８及び１０６から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２４－３）前記エクソンはエクソン５１であり、前記核酸は、配列番号５～８から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２４－４）前記エクソンはエクソン５１であり、前記核酸は、配列番号６～８から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２４－５）前記エクソンはエクソン５１であり、前記核酸は、配列番号２２８の塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２４－６）前記エクソンはエクソン５２であり、前記核酸は、配列番号１４１～１４５から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２４－７）前記エクソンはエクソン５２であり、前記核酸は、配列番号１４３又は１４４の塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２４－８）前記エクソンはエクソン５２であり、前記核酸は、配列番号２２９の塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２５－１）前記エクソンはエクソン５３であり、前記核酸は、配列番号３及び４２～５１から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２５－２）前記エクソンはエクソン５３であり、前記核酸は、配列番号３又は４２から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２５－３）前記エクソンはエクソン５３であり、前記核酸は、配列番号３の塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２６－１）前記エクソンはエクソン５５であり、前記核酸は、配列番号１３～２８及び１３３～１４０から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２６－２）前記エクソンはエクソン５５であり、前記核酸は、配列番号１３～２８及び１３３から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２６－３）前記エクソンはエクソン５５であり、前記核酸は、配列番号１３～２８から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２６－４）前記エクソンはエクソン５５であり、前記核酸は、配列番号１３、２３、及び２６から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、（１）～（２０－１）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
（２７）（１）～（２６－４）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体を含む医薬組成物。
（２８）さらに医薬的に許容可能な担体を含む、（２７）に記載の医薬組成物。
（２９）筋ジストロフィーの治療のための、（２７）又は（２８）に記載の医薬組成物。
（３０）（１）～（２６－４）のいずれかに記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体、又は（２７）～（２９）のいずれかに記載の医薬組成物を筋ジストロフィー患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法。
　本発明により細胞内への取り込み効率が高い核酸、核酸を含む複合体又はそれらを含む医薬組成物が提供され得る。一実施形態において、本発明のキャリアペプチド連結核酸、核酸を含む複合体又はそれらを含む医薬組成物は、効果が高い、細胞又は組織への分布について特異性が高い（例えば心臓において高い効果を奏する）、及び／又は毒性（細胞毒性及び生物毒性）が低く安全性が高いものであり得る。また、本発明により治療効果の高い、及び／又は安全性の高い筋ジストロフィーの治療方法が提供され得る。
アンチセンスオリゴマーのＣ２Ｃ１２細胞（マウス横紋筋由来筋芽細胞株）におけるマウスジストロフィン遺伝子のエクソン２３のスキッピング効率を示す（Ｇｙｍｎｏｓｉｓ法）。 図１と同様である。 図１と同様である。 図１と同様である。 図１と同様である。 アンチセンスオリゴマーのＣ２Ｃ１２細胞におけるマウスジストロフィン遺伝子のエクソン２３のスキッピング効率を示す（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ法）。 野生型マウスの前脛骨筋、大腿四頭筋、心臓、横隔膜における、アンチセンスオリゴマーによるジストロフィン遺伝子のエクソン２３のスキッピング効率を示す。 野生型マウスの前脛骨筋、大腿四頭筋、心臓、横隔膜における、ペプチドが連結されたアンチセンスオリゴマーによるジストロフィン遺伝子のエクソン２３のスキッピング効率を示す。 ＰＰＭＯを投与した野生型マウスにおける血液検査結果を示す。 ＰＰＭＯを投与した野生型マウスにおける簡易毒性試験結果を示す。 ｍｄｘマウスの前脛骨筋、大腿四頭筋、心臓、横隔膜における、ＰＰＭＯ投与後の経過日数によるジストロフィン遺伝子のエクソン２３のスキッピング効率（％）およびジストロフィンタンパク質の発現量（野生型％）を示す。 図１１の続きである。 図１１の続きである。 図１１の続きである。 アンチセンスオリゴマーのＲＤ細胞（ヒト横紋筋肉腫細胞株）におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピング効率を示す（Ｇｙｍｎｏｓｉｓ法）。アンチセンスオリゴマーはそれぞれ１００μＭで処置した。 アンチセンスオリゴマーのＲＤ細胞におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン４４のスキッピング効率を示す（Ｇｙｍｎｏｓｉｓ法）。アンチセンスオリゴマーはそれぞれ１００μＭで処置した。 アンチセンスオリゴマーのＲＤ細胞におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１のスキッピング効率を示す（Ｇｙｍｎｏｓｉｓ法）。アンチセンスオリゴマーはそれぞれ１００μＭで処置した。 アンチセンスオリゴマーのＲＤ細胞におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１のスキッピング効率を示す（Ｇｙｍｎｏｓｉｓ法）。アンチセンスオリゴマーはＰＭＯ　Ｎｏ．７については１００μＭ、ＰＰＭＯ　Ｎｏ．１９、ＰＰＭＯ　Ｎｏ．２２についてはいずれも３０μＭで処置した。 アンチセンスオリゴマーのＲＤ細胞におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピング効率を示す（Ｇｙｍｎｏｓｉｓ法）。アンチセンスオリゴマーはそれぞれ５０μＭで処置した。 アンチセンスオリゴマーのＲＤ細胞におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５０のスキッピング効率を示す（Ｇｙｍｎｏｓｉｓ法）。アンチセンスオリゴマーはそれぞれ５０μＭで処置した。 アンチセンスオリゴマーのＲＤ細胞におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５５のスキッピング効率を示す（Ｇｙｍｎｏｓｉｓ法）。アンチセンスオリゴマーはそれぞれ１００μＭで処置した。 アンチセンスオリゴマーのＲＤ細胞におけるヒトジストロフィン遺伝子のエクソン４５のスキッピング効率を示す（Ｇｙｍｎｏｓｉｓ法）。アンチセンスオリゴマーはそれぞれ１００μＭで処置した。
　一実施形態において、本発明は、核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物（以下、本明細書において、「本発明の核酸」とも記載する）と、前記核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物に連結された、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１）のアミノ酸配列、又は配列番号１において１又は２個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列（ただし、配列番号１のＮ末端から８位及び９位の両方のアミノ酸が置換されたものを除く）を含む、又は当該アミノ酸配列からなるキャリアペプチドと、を含み、核酸がアンチセンスオリゴマー、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される、キャリアペプチドが連結された核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物に関する。
　本明細書に記載される「キャリアペプチド」とは、細胞膜透過性を有し、本発明の核酸に連結され、あるいは本発明の核酸と共に複合体に含まれ、本発明の核酸の細胞内への取り込みを向上させるペプチドを意味する（以下、キャリアペプチドが連結された本発明の核酸を「本発明のキャリアペプチド連結核酸」とも記載し、本発明の核酸とキャリアペプチドを含む複合体を「本発明の複合体」とも記載する）。典型的には、キャリアペプチドは、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１）のアミノ酸配列、又はキャリアペプチドの細胞膜透過性を損なわない限りは、配列番号１のアミノ酸配列の改変アミノ酸配列を含む、又はこれらのアミノ酸配列からなる。ここで、配列番号１の「改変アミノ酸配列」とは、（i）配列番号１のアミノ酸配列において、１又は２個、好ましくは１個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列（ただし、配列番号１のＮ末端から８位及び９位の両方のアミノ酸が置換されたものを除く、好ましくは、８位及び９位の両方又はいずれかのアミノ酸が置換されたものを除く）、又は（ii）配列番号１と比較して７０％以上、８０％以上、又は９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（ただし、配列番号１のＮ末端から８位及び９位の両方のアミノ酸が置換されたものを除く、好ましくは、８位及び９位の両方又はいずれかのアミノ酸が置換されたものを除く）を意味する。好ましくは、配列番号１の「改変アミノ酸配列」配列番号１のＮ末端から８位及び９位のいずれにもアミノ酸の付加、欠失、及び置換を含まない。（i）のアミノ酸配列の例として、配列番号１の８位及び９位以外の位置において、１個のアミノ酸が付加され１個のアミノ酸が欠失したもの、１個のアミノ酸が付加され１個のアミノ酸が置換されたもの、１個のアミノ酸が置換されて１個のアミノ酸が欠失したもの、１個のアミノ酸が付加されたもの、１個のアミノ酸が置換されたもの、１個のアミノ酸が欠失したものが挙げられる。
　配列番号１において１個のアミノ酸が欠失した配列として、ＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１５７）、ＫＫＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１５８）、ＫＫＲＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１５９）、ＫＫＲＴＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１６０）、ＫＫＲＴＬＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１６１）、ＫＫＲＴＬＲＳＮＲＫＫＲ（配列番号１６２）、ＫＫＲＴＬＲＫＮＲＫＫＲ（配列番号１６３）、ＫＫＲＴＬＲＫＳＲＫＫＲ（配列番号１６４）、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＫＫＲ（配列番号１６５）、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＲ（配列番号１６６）、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫ（配列番号１６７）が挙げられる。配列番号１において１個のアミノ酸が置換した配列として、例えばＸＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１６８）、ＫＸＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１６９）、ＫＫＸＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１７０）、ＫＫＲＸＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１７１）、ＫＫＲＴＸＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１７２）、ＫＫＲＴＬＸＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１７３）、ＫＫＲＴＬＲＸＳＮＲＫＫＲ（配列番号１７４）、ＫＫＲＴＬＲＫＸＮＲＫＫＲ（配列番号１７５）、ＫＫＲＴＬＲＫＳＸＲＫＫＲ（配列番号１７６）、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＸＫＫＲ（配列番号１７７）、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＸＫＲ（配列番号１７８）、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＸＲ（配列番号１７９）、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＸ（配列番号１８０）が挙げられる。配列番号１において１個のアミノ酸が付加した配列として、例えばＸＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１８１）、ＫＸＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１８２）、ＫＫＸＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１８３）、ＫＫＲＸＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１８４）、ＫＫＲＴＸＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１８５）、ＫＫＲＴＬＸＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１８６）、ＫＫＲＴＬＲＸＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１８７）、ＫＫＲＴＬＲＫＸＳＮＲＫＫＲ（配列番号１８８）、ＫＫＲＴＬＲＫＳＸＮＲＫＫＲ（配列番号１８９）、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＸＲＫＫＲ（配列番号１９０）、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＸＫＫＲ（配列番号１９１）、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＸＫＲ（配列番号１９２）、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＸＲ（配列番号１９３）、及びＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲＸ（配列番号１９４）が挙げられる。
　キャリアペプチドが細胞膜透過性を有するか否かは、例えば本願明細書の実施例に記載するとおりに、キャリアペプチドと核酸を連結することによって、核酸の細胞内への取り込みが増加するか否かを例えば本願明細書の実施例に記載するとおりに調べることによって確かめることができる。
　本明細書における改変配列の典型例としては、例えば、１個又は２個、好ましくは１個のアミノ酸残基が同様の生物学的活性を有するアミノ酸残基に置換したいわゆる保存的アミノ酸置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列や、所定のアミノ酸配列について１個又は２個のアミノ酸残基が付加（挿入）又は欠失した配列等が挙げられる。保存的アミノ酸置換の典型例としては、例えば、塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列（例えばリジン残基とアルギニン残基との相互置換）や、疎水性アミノ酸残基が別の疎水性アミノ酸残基に置換した配列（例えばロイシン残基、イソロイシン残基、およびバリン残基の相互置換）等が挙げられる。
　本明細書において、塩基配列又はアミノ酸配列の「配列同一性」とは、2つの塩基配列又はアミノ酸配列を、必要に応じてギャップを導入して、両者の一致度が最も高くなるように整列（アラインメント）したときの、2つの配列間での同一塩基配列又はアミノ酸の割合（%）をいう。塩基配列又はアミノ酸配列の配列同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）（Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて、例えばデフォルトのパラメーターを用いて決定することができる。
　キャリアペプチドは、当業者に公知の方法、例えば一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）あるいはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。すなわち、市販のペプチド合成機を用いた固相合成法により、所望のアミノ酸配列を有する上記ペプチドを合成することができる。
　なお、上記方法でキャリアペプチドのみを合成してもよく、キャリアペプチドとリンカー部分（例えば、ペプチド性リンカー）とを含むペプチド鎖、又はキャリアペプチドがリンカーを介して連結された本発明の核酸を合成してもよい。
　キャリアペプチドは、遺伝子工学的手法に基づいて生合成により調製してもよい。すなわち、所望のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を合成し、合成したポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とを含む発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築することができる。一般的な技法によって、この組換えベクターを宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、適切な条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチド部分を単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的のペプチドを得ることができる。
　なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよい。
　例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的のキャリアペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズおよびアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出及び精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（すなわち設計した人工ポリペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、目的の外来物質導入用構築物（人工ポリペプチド）を製造することができる。
　あるいは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（すなわち、キャリアペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド部分の合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))を参照することができる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の（株）セルフリーサイエンスから入手可能）が市販されている。
　キャリアペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。すなわち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、かかるアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望のヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
　こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
　本発明の核酸の塩基長は限定されないが、例えば15塩基長以上、16塩基長以上、17塩基長以上、18塩基長以上、19塩基長以上、20塩基長以上、21塩基長以上、22塩基長以上、23塩基長以上、24塩基長以上、25塩基長以上、26塩基長以上、27塩基長以上、28塩基長以上、29塩基長以上、又は30塩基長であってよく、30塩基長以下、29塩基長以下、28塩基長以下、27塩基長以下、26塩基長以下、25塩基長以下、24塩基長以下、23塩基長以下、22塩基長以下、21塩基長以下、20塩基長以下、19塩基長以下、18塩基長以下、17塩基長以下、16塩基長以下、又は15塩基長であってよい。本発明の核酸は、例えば15～30塩基、15～25塩基、16～24塩基、17～23塩基、18～22塩基、19～21塩基、例えば20塩基からなってもよい。
　核酸の医薬的に許容可能な塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩；ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機アミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩；酢酸塩、りんご酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩などが挙げられる。これらの塩は、公知の方法で製造することができる。あるいは、本発明の核酸は、その水和物の形態にあってもよい。
　本発明の核酸は、アンチセンスオリゴマー、例えばオリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴマー、又はペプチド核酸（Peptide Nucleic Acid：ＰＮＡ）オリゴマーであってもよい（以下、それぞれを、「本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド」、「本発明のアンチセンスモルホリノオリゴマー」、又は「本発明のアンチセンスペプチド核酸オリゴマー」ともいう。）。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドを構成単位とするアンチセンスオリゴマーであり、かかるヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又は修飾ヌクレオチドのいずれであってもよい。
　修飾ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを構成する核酸塩基、糖部分、及びリン酸結合部分の全部又は一部が修飾されているものをいう。
　核酸塩基としては、例えば、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、チミン、ウラシル、又はそれらの修飾塩基を挙げることができる。かかる修飾塩基としては、例えば、シュードウラシル、３－メチルウラシル，ジヒドロウラシル、５－アルキルシトシン（例えば、５－メチルシトシン）、５－アルキルウラシル（例えば、５－エチルウラシル）、５－ハロウラシル（例えば、５－ブロモウラシル）、６－アザピリミジン、６－アルキルピリミジン（例えば、６－メチルウラシル）、２－チオウラシル、４－チオウラシル、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、１－メチルアデニン、１－メチルヒポキサンチン、２，２－ジメチルグアニン、３－メチルシトシン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メチルカルボニルメチルウラシル、５－メチルオキシウラシル、５－メチル－２－チオウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸、２－チオシトシン、プリン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノプリン、イソグアニン、インドール、イミダゾール、キサンチン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　本明細書において、チミン「Ｔ」とウラシル「Ｕ」は相互に交換可能であり、「Ｔ」であっても「Ｕ」であっても本発明の核酸の活性に本質的に影響は生じないので、本明細書で示される塩基配列においては「Ｔ」が「Ｕ」である場合も含み、同一の配列番号で示すこととする。また、本明細書において、修飾塩基を含む配列は修飾塩基を含まない配列と同一の配列番号で表され、例えば「シトシン」と「メチルシトシン」は相互に交換可能であり、「シトシン」が「メチルシトシン」である場合も、同一の配列番号で示すこととする。
　糖部分の修飾としては、例えば、リボースの２’位の修飾及び糖のその他の部分の修飾を挙げることができる。リボースの２’位の修飾としては、例えば、リボースの２’位の－ＯＨ基を－ＯＲ、－ＯＲＯＲ、－Ｒ、－Ｒ’ＯＲ、－ＳＨ、－ＳＲ、－ＮＨ２、－ＮＨＲ、－ＮＲ２、－Ｎ３、－ＣＮ、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、例えば－ＯＭｅ（－Ｏ－ＣＨ３）又は－Ｏメトキシエチル（－Ｏ－ＭＯＥ：－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）に置換する修飾を挙げることができる。ここで、Ｒはアルキル又はアリールを表す。Ｒ’はアルキレンを表す。
　糖のその他の部分の修飾としては、例えば、リボース又はデオキシリボースの４’位のＯをＳに置換したもの、糖の２’位と４’位を架橋したもの、例えば、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）又はＥＮＡ（2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　リン酸結合部分の修飾としては、例えば、ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ボラノホスフェート結合（例えば、Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008, 18, 9154-9160を参照）に置換する修飾を挙げることができる（例えば、再公表特許公報第２００６／１２９５９４号及び再公表特許公報第２００６／０３８６０８号を参照）。
　本明細書において、アルキルとしては、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１～６のアルキルが好ましい。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシルが挙げられる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらで１～３個置換されていてもよい。
　本明細書において、シクロアルキルとしては、炭素数３～１２のシクロアルキルが好ましい。具体的には、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシル、シクロドデシルが挙げられる。
　本明細書において、ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
　本明細書において、アルコキシとしては、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１～６のアルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ｎ－ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ－ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ等を挙げることができる。とりわけ、炭素数１～３のアルコキシが好ましい。
　本明細書において、アリールとしては、炭素数６～１０のアリールが好ましい。具体的には、例えば、フェニル、α－ナフチル、β－ナフチルを挙げることができる。とりわけフェニルが好ましい。当該アリールは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、アルキル、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１～３個置換されていてもよい。
　本明細書において、アルキレンとしては、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１～６のアルキレンが好ましい。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、２－（エチル）トリメチレン、１－（メチル）テトラメチレンを挙げることができる。
　本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、各種自動合成装置（例えば、AKTA oligopilot plus 10 / 100（GE Healthcare））を用いて容易に合成することが可能であり、あるいは、第三者機関（例えば、Promega社又はTakara社）等に委託して作製することもできる。
　本発明のアンチセンスモルホリノオリゴマーは、下記一般式で表される基を構成単位とするアンチセンスオリゴマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、Baseは、は、核酸塩基を表し；
　Ｗは、以下のいずれかの式で表わされる基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、Ｘは、－ＣＨ２Ｒ１、－Ｏ－ＣＨ２Ｒ１、－Ｓ－ＣＨ２Ｒ１、－ＮＲ２Ｒ３、又はＦを表し；
　Ｒ１は、Ｈ、アルキルを表し；
　Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、又はアリールを表し；
　Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、又はＮＲ１を表し；
　Ｙ２は、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ１を表し；
　Ｚは、Ｏ又はＳを表す。））
　本発明のアンチセンスモルホリノオリゴマーを合成するのに用いるモルホリノモノマー化合物の例としては、表１に示すモルホリノモノマー化合物（Ａ）、モルホリノモノマー化合物（Ｃ）、モルホリノモノマー化合物（Ｔ）、及びモルホリノモノマー化合物（Ｇ）が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　本発明において、モルホリノオリゴマーは、好ましくは、以下の式で表わされる基を構成単位とするオリゴマー（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（以下、「ＰＭＯ」という））である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、Base、Ｒ２、Ｒ３は、前記と同義である。）
　モルホリノオリゴマーは、例えば、国際公開公報第１９９１／００９０３３号、又は国際公開公報第２００９／０６４４７１号に記載の方法に従って製造することができる。特に、ＰＭＯは、国際公開公報第２００９／０６４４７１号、又は国際公開公報第２０１３／１００１９０号に記載の方法に従って製造することができる。
　また、本発明のアンチセンスオリゴマーは、５’末端に、下記化学式（１）～（２）のいずれかの基を有してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　本発明のアンチセンスペプチド核酸オリゴマーは、下記一般式で表される基を構成単位とするアンチセンスオリゴマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中、Baseは、前記と同義である。）
　ペプチド核酸オリゴマーは、例えば、以下の文献に従って製造することができる。
１）P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt，Science, 254, 1497 (1991)２）M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg，JACS, 114, 1895 (1992)３）K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt，J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)４）L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm，O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)5）T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)。
　一実施形態において、本発明の核酸はアンチセンスオリゴマー（「本発明のアンチセンスオリゴマー」とも記載する）であり、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節するか、又は標的となるＲＮＡ若しくはその標的領域の機能を阻害する。
　本明細書において、「ｐｒｅ－ｍＲＮＡ」とは、ゲノム上の標的遺伝子から転写されたエクソン及びイントロンを含むＲＮＡ分子であり、ｍＲＮＡ前駆体である。本明細書において、「ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節する」とは、例えばエクソンのスキッピング（ｐｒｅ－ｍＲＮＡからスプライシングによりｍＲＮＡが生ずる場合に特定のエクソンが含まれないようにすること）及び／又はエクソンインクルージョン（ｐｒｅ－ｍＲＮＡからスプライシングによりｍＲＮＡが生ずる場合に誤って排除されてしまうエクソンをｍＲＮＡに組み込まれるようにすること）を促すことを意味する。
　本明細書において、「標的となるＲＮＡ」としてはウイルスのゲノムＲＮＡ、ヒトのｐｒｅ－ｍＲＮＡやｍＲＮＡ等が挙げられる。本明細書において、「標的となるＲＮＡ若しくはその標的領域の機能を阻害する」とは、標的領域に結合してアンチンセンスオリゴマーと二本鎖を形成した標的領域を含む核酸（例えばウイルスのゲノムＲＮＡ、ヒトのｐｒｅ－ｍＲＮＡやｍＲＮＡ等）がＲＮａｓｅＨに切断されること、標的領域を含む核酸（例えばウイルスのゲノムＲＮＡ、ヒトのｐｒｅ－ｍＲＮＡやｍＲＮＡ等）の複製を阻害すること、標的領域が翻訳される場合にはその翻訳を阻害すること、標的領域を含む核酸（例えばウイルスのゲノムＲＮＡ、ヒトのｐｒｅ－ｍＲＮＡやｍＲＮＡ等）の転写を阻害すること、及びＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれて標的領域に結合して標的領域を含む核酸（例えばウイルスのゲノムＲＮＡ、ヒトのｐｒｅ－ｍＲＮＡやｍＲＮＡ等）の切断を促進すること（核酸がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである場合）の一つ以上を含む。本明細書において、ウイルスのゲノムＲＮＡはサブゲノムＲＮＡを含み、「サブゲノムＲＮＡ」とは、（＋）鎖のゲノムＲＮＡを鋳型としてＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより合成される（－）鎖のＲＮＡの一部分を鋳型としてＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで合成されるゲノムＲＮＡより短いＲＮＡであって、ウイルスタンパク質合成（翻訳）のためのｍＲＮＡとして働くＲＮＡを意味する。
　一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、ジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡ、好ましくはヒトジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡの少なくとも１つのエクソンをスキッピングさせる。
　ジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡは、ゲノム上のジストロフィン遺伝子から転写されたエクソン及びイントロンを含むＲＮＡ分子であり、ｍＲＮＡ前駆体である。当業者は、ジストロフィン、例えばヒトジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡの塩基配列の情報を、ジストロフィン、例えばヒトジストロフィン遺伝子のゲノム配列（GenBank Accession No. NG_012232.1）からの類推により入手可能である。
　ヒトゲノムにおいて、ヒトジストロフィン遺伝子は遺伝子座Ｘｐ２１．２に存在する。ヒトジストロフィン遺伝子は、約３．０Ｍｂｐのサイズを有しており、既知のヒト遺伝子としては最大の遺伝子である。但し、ヒトジストロフィン遺伝子のコード領域はわずか約１４ｋｂに過ぎず、該コード領域は７９個のエクソンとしてジストロフィン遺伝子内に分散している（Roberts, RG., et al., Genomics, 16: 536-538 (1993)）。ヒトジストロフィン遺伝子の転写物であるｐｒｅ－ｍＲＮＡは、スプライシングを受けて約１４ｋｂの成熟ｍＲＮＡを生成する。ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子成熟ｍＲＮＡの塩基配列は公知である（GenBank Accession No. NM_004006）。
　本明細書において「スキッピングさせる活性」（スキッピング活性）とは、ヒトジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡを例に挙げると、ヒトジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡにおける少なくとも１つ、例えば１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ、好ましくは１つのエクソンが欠失したヒトジストロフィンｍＲＮＡを生じさせる活性を意味する。この活性は、言い換えれば、ヒトジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡ上の標的部位に本明細書に記載のアンチセンスオリゴマーが結合することにより、該ｐｒｅ－ｍＲＮＡがスプライシングを受けた際に、欠失するエクソンのすぐ上流のエクソンの３’末端のヌクレオチドに、欠失するエクソンのすぐ下流のエクソンの５’末端のヌクレオチドが連結し、コドンのフレームシフトが起こっていない成熟ｍＲＮＡ（すなわち、フレームシフトを起こさずにエクソンが欠失した成熟ｍＲＮＡ）が形成されることを意味する。
　スキッピングが生じたか否かは、例えばジストロフィン発現細胞（例えば、ヒト横紋筋肉腫細胞）に本発明のアンチセンスオリゴマーを導入し、前記ジストロフィン発現細胞の全ＲＮＡから、ヒトジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡの標的エクソンの周辺領域をＲＴ－ＰＣＲ増幅し、該ＰＣＲ増幅産物に対してｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ又はシークエンス解析を行うことにより確認することができる。スキッピング効率は、ヒトジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡを被検細胞から回収し、該ｍＲＮＡのうち、標的エクソンがスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、スキッピングが生じていないバンドのポリオリゴヌクレオチド量「Ｂ」とを測定し、これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、以下の式に従って計算することができる。
　スキッピング効率（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）×１００
　本発明の核酸の具体的な配列は限定しないが、本発明の核酸は、例えば標的領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む、又は相補的な塩基配列からなるものであってよい。標的領域の塩基配列の長さは例えば１０～６０塩基長、１０～５５塩基長、１０～５０塩基長、１０～４５塩基長、１０～４０塩基長、１０～３５塩基長、１０～３０塩基長、１０～２５塩基長、１５～６０塩基長、１５～５５塩基長、１５～５０塩基長、１５～４５塩基長、１５～４０塩基長、１５～３５塩基長、１５～３０塩基長、１５～２５塩基長、１６～６０塩基長、１６～５５塩基長、１６～５０塩基長、１６～４５塩基長、１６～４０塩基長、１６～３５塩基長、１６～３０塩基長、１６～２５塩基長、１７～６０塩基長、１７～５５塩基長、１７～５０塩基長、１７～４５塩基長、１７～４０塩基長、１７～３５塩基長、１７～３０塩基長、１７～２５塩基長、１８～６０塩基長、１８～５５塩基長、１８～５０塩基長、１８～４５塩基長、１８～４０塩基長、１８～３５塩基長、１８～３０塩基長、１８～２５塩基長、１９～６０塩基長、１９～５５塩基長、１９～５０塩基長、１９～４５塩基長、１９～４０塩基長、１９～３５塩基長、１９～３０塩基長、１９～２５塩基長、２０～６０塩基長、２０～５５塩基長、２０～５０塩基長、２０～４５塩基長、２０～４０塩基長、２０～３５塩基長、２０～３０塩基長、２０～２５塩基長、１５～３０塩基長、１５～２９塩基長、１５～２８塩基長、１５～２７塩基長、１５～２６塩基長、１５～２５塩基長、１５～２４塩基長、１５～２３塩基長、１５～２２塩基長、１５～２１塩基長、１５～２０塩基長、１５～１９塩基長、１５～１８塩基長、１６～３０塩基長、１６～２９塩基長、１６～２８塩基長、１６～２７塩基長、１６～２６塩基長、１６～２５塩基長、１６～２４塩基長、１６～２３塩基長、１６～２２塩基長、１６～２１塩基長、１６～２０塩基長、１６～１９塩基長、１６～１８塩基長、１７～３０塩基長、１７～２９塩基長、１７～２８塩基長、１７～２７塩基長、１７～２６塩基長、１７～２５塩基長、１７～２４塩基長、１７～２３塩基長、１７～２２塩基長、１７～２１塩基長、１７～２０塩基長、１７～１９塩基長、１７～１８塩基長、１８～３０塩基長、１８～２９塩基長、１８～２８塩基長、１８～２７塩基長、１８～２６塩基長、１８～２５塩基長、１８～２４塩基長、１８～２３塩基長、１８～２２塩基長、１８～２１塩基長、１８～２０塩基長、１８～１９塩基長、１９～３０塩基長、１９～２９塩基長、１９～２８塩基長、１９～２７塩基長、１９～２６塩基長、１９～２５塩基長、１９～２４塩基長、１９～２３塩基長、１９～２２塩基長、１９～２１塩基長、１９～２０塩基長、２０～３０塩基長、２０～２９塩基長、２０～２８塩基長、２０～２７塩基長、２０～２６塩基長、２０～２５塩基長、２０～２４塩基長、２０～２３塩基長、２０～２２塩基長、２０～２１塩基長、５～２５塩基長、５～２４塩基長、５～２３塩基長、５～２２塩基長、５～２１塩基長、５～２０塩基長、５～１９塩基長、５～１８塩基長、５～１７塩基長、５～１６塩基長、５～１５塩基長、５～１４塩基長、５～１３塩基長、５～１２塩基長、７～２５塩基長、７～２４塩基長、７～２３塩基長、７～２２塩基長、７～２１塩基長、７～２０塩基長、７～１９塩基長、７～１８塩基長、７～１７塩基長、７～１６塩基長、７～１５塩基長、７～１４塩基長、７～１３塩基長、７～１２塩基長、９～２５塩基長、９～２４塩基長、９～２３塩基長、９～２２塩基長、９～２１塩基長、９～２０塩基長、９～１９塩基長、９～１８塩基長、９～１７塩基長、９～１６塩基長、９～１５塩基長、９～１４塩基長、９～１３塩基長、９～１２塩基長、１０～２５塩基長、１０～２４塩基長、１０～２３塩基長、１０～２２塩基長、１０～２１塩基長、１０～２０塩基長、１０～１９塩基長、１０～１８塩基長、１０～１７塩基長、１０～１６塩基長、１０～１５塩基長、１０～１４塩基長、１０～１３塩基長、１０～１２塩基長、６０塩基長、５９塩基長、５８塩基長、５７塩基長、５６塩基長、５５塩基長、５４塩基長、５３塩基長、５２塩基長、５１塩基長、５０塩基長、４９塩基長、４８塩基長、４７塩基長、４６塩基長、４５塩基長、４４塩基長、４３塩基長、４２塩基長、４１塩基長、４０塩基長、３９塩基長、３８塩基長、３７塩基長、３６塩基長、３５塩基長、３４塩基長、３３塩基長、３２塩基長、３１塩基長、３０塩基長、２９塩基長、２８塩基長、２７塩基長、２６塩基長、２５塩基長、２４塩基長、２３塩基長、２２塩基長、２１塩基長、２０塩基長、１９塩基長、１８塩基長、１７塩基長、１６塩基長、１５塩基長、１４塩基長、１３塩基長、１２塩基長、１１塩基長、１０塩基長、９塩基長、８塩基長、７塩基長、６塩基長、又は５塩基長であってもよいが、これらに限定されるものではなく、上記の長さに１、２、又は３塩基長が加えられても減らされてもよい。
　また、「相補的配列」又は「相補的な塩基配列」とは、対象となる塩基配列と１００％の相補性を有していなくてもよく、例えば、対象となる塩基配列に対して、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、又は５塩基の非相補的塩基が含まれていてもよく、また、対象となる塩基配列に対して、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、又は５塩基短い塩基配列であってもよい。一実施形態において、ある塩基配列に「相補的」な塩基配列は、その塩基配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％、より好ましくは１００％の相補性を有する。相補性は当業者であれば容易に決定することができ、例えば２つの配列をアライメントし、配列間でワトソン・クリック型塩基対又は揺らぎ塩基対を形成する塩基の数をカウントし、塩基対を形成した塩基の数を配列中の塩基の総数により除し、これに１００を乗じることにより算出することができる。
　ある塩基配列に「相補的」な塩基配列の例として、その塩基配列を含む核酸に、例えばストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な核酸の塩基配列が挙げられる。本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃又は５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃又は０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有する塩基配列が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkPhos Direct Labelling and Detection System（ＧＥヘルスケア社）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイゼーションを検出することができる。あるいは、標的配列に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、ＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティックス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルした場合には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社）等を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
　一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーによりスキッピングされるエクソンは、エクソン２３、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、及び５５からなる群から選択される少なくとも１つ、例えば１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ、好ましくは１つである。
　ジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡ中のエクソン及びイントロンの配列は公知である。本明細書において、エクソンの配列及び標的配列は、エクソンａにおける「ｂ－ｃ」のようにも記載される。ここで、「ｂ」は標的塩基配列の５’末端の塩基を表し、「ｃ」は標的塩基配列の３’末端の塩基を表す。「ｂ」、「ｃ」が正の整数の場合、「ｂ」、「ｃ」はそれぞれ、第ａ番目のエクソンの５’末端塩基を１番目の塩基としたときに、３’末端方向の何番目の塩基なのかを表す。一方、「ｂ」、「ｃ」が負の整数である場合、「ｂ」、「ｃ」はそれぞれ、第（ａ－１）番目のイントロンの３’末端の塩基を－１番目としたときに、５’末端方向の何番目の塩基なのかを表す。例えばエクソン２３（＋１＋２４３）は配列番号１４８の塩基配列を含み（＋２１４～＋２４３はイントロン２３の配列である）、エクソン４３（＋１＋１７３）は配列番号１４９の塩基配列を含み、エクソン４４（－３０＋１４８）は配列番号１５０の塩基配列を含み（－３０～－１はイントロン４３の配列である）、エクソン４５（－１０＋１７６）は配列番号１５１の塩基配列を含み（－１０～－１はイントロン４４の配列である）、エクソン５０（＋１＋１３９）は配列番号１５２の塩基配列を含み（＋１１０～＋１３９はイントロン５０の配列である）、エクソン５１（＋１＋２３３）は配列番号１５３の塩基配列を含み、エクソン５２（＋１＋１１８）は配列番号１５４の塩基配列を含み、エクソン５３（＋１＋２１２）は配列番号１５５の塩基配列を含み、及びエクソン５５（－３０＋１９０）は配列番号１５６の塩基配列を含む（－３０～－１はイントロン５４の配列である）。
　一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、ヒトジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソン４３（配列番号１４９）の５’末端からｎ番目～（ｎ＋ｍ）番目の領域Ｘｎのいずれかに相補的である（ここで、ｎ＝１～１４３、ｍ＝１７～３０である（ｎ、ｍは自然数））。アンチセンスオリゴマーは、ｎ＝６０～１２０を満たす領域Ｘｎのいずれかに相補的であることが好ましく、ｎ＝７０～１００を満たす領域Ｘｎのいずれかに相補的であるとより好ましく、配列番号１４６又は１４７の塩基配列を含むアンチセンスオリゴマーであるとより一層好ましい。
　一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、ヒトジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソン４４の５’末端（配列番号１５０の５’末端から３１位）からｎ番目～（ｎ＋ｍ）番目の領域Ｘｎのいずれかに相補的である（ここで、ｎ＝－３０～－１、１～１１８、ｍ＝１１～３０である（ｎは整数、ｍは自然数））。アンチセンスオリゴマーは、ｎ＝－２０～１１０を満たす領域Ｘｎのいずれかに相補的であることが好ましく、ｎ＝－１０～１０５を満たす領域Ｘｎに相補的であるとより好ましく、具体的には、配列番号４及び５２～１０５から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなることが好ましく、配列番号４、５６、及び６２から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなることがより好ましく、配列番号４の塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなるアンチセンスオリゴマーであるとより一層好ましい。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号２０３～２２７から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる。
　一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、ヒトジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソン４５の５’末端（配列番号１５１の５’末端から１１位）からｎ番目～（ｎ＋ｍ）番目の領域Ｘｎのいずれかに相補的である（ここで、ｎ＝－１０～－１、１～１４６、ｍ＝９～３０である（ｎは整数、ｍは自然数））。アンチセンスオリゴマーは、ｎ＝－１０～６０を満たす領域Ｘｎのいずれかに相補的であることが好ましく、ｎ＝－５～４０を満たす領域Ｘｎのいずれかに相補的であるとより好ましく、具体的には、配列番号２９～３３、１３１（Ｃａｓｉｍｅｒｓｅｎの配列）、及び１３２（Ｒｅｎａｄｉｒｓｅｎの配列）から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなることが好ましく、配列番号２９～３３から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなることがより好ましく、配列番号３０、３２、及び３３から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなるアンチセンスオリゴマーであるとより一層好ましい。
　一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、ヒトジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソン５０の５’末端（配列番号１５２の５’末端から１位）からｎ番目～（ｎ＋ｍ）番目の領域Ｘｎのいずれかに相補的である（ここで、ｎ＝１～１０９、ｍ＝１７～３０である（ｎ、ｍは自然数））。アンチセンスオリゴマーは、ｎ＝８０～１０５を満たす領域Ｘｎのいずれかに相補的であることが好ましく、ｎ＝９０～１００を満たす領域Ｘｎのいずれかに相補的であるとより好ましく、具体的には、配列番号９～１２及び１１９～１３０から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなることが好ましく、配列番号９～１２、１１９～１２５、１２７、１２９、及び１３０から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなることがより好ましく、配列番号９～１２から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなるアンチセンスオリゴマーであるとより一層好ましい。
　一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、ヒトジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソン５１（配列番号１５３）の５’末端からｎ番目～（ｎ＋ｍ）番目の領域Ｘｎのいずれかに相補的である（ここで、ｎ＝１～２０３、ｍ＝１１～３０である（ｎ、ｍは自然数））。アンチセンスオリゴマーは、ｎ＝５０～１６０を満たす領域Ｘｎのいずれかに相補的であることが好ましく、ｎ＝６０～１２０を満たす領域Ｘｎのいずれかに相補的であるとより好ましく、具体的には、配列番号５～８及び１０６～１１８から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなることが好ましく、配列番号５～８、及び１０６（Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎの配列）から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなることがより好ましく、配列番号５～８から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなることがさらに好ましく、配列番号６～８から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなるアンチセンスオリゴマーであるとより一層好ましい。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号２２８の塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる。
　一実施形態において、本発明は、アンチセンスオリゴマーは、ヒトジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソン５２（配列番号１５４）の５’末端からｎ番目～（ｎ＋ｍ）番目の領域Ｘｎのいずれかに相補的である（ここで、ｎ＝１～８８、ｍ＝１７～３０である（ｎ、ｍは自然数））。アンチセンスオリゴマーは、ｎ＝１～４０を満たす領域Ｘｎのいずれかに相補的であることが好ましく、ｎ＝１５～２５を満たす領域Ｘｎのいずれかに相補的であるとより好ましく、具体的には、配列番号１４１～１４５から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなることが好ましく、配列番号１４３又は１４４の塩基配列を含むアンチセンスオリゴマーであるとより一層好ましい。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号２２９の塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる。
　一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、ヒトジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソン５３（配列番号１５５）の５’末端からｎ番目～（ｎ＋ｍ）番目の領域Ｘｎのいずれかに相補的である（ここで、ｎ＝１～１８２、ｍ＝１７～３０である（ｎ、ｍは自然数））。アンチセンスオリゴマーは、ｎ＝３０～５０を満たす領域Ｘｎのいずれかに相補的であることが好ましく、ｎ＝３５～４５を満たす領域Ｘｎのいずれかに相補的であるとより好ましく、具体的には、配列番号３及び４２～５１から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなることが好ましく、配列番号３（Ｖｉｌｔｏｌａｒｓｅｎの配列）又は４２（Ｇｏｌｏｄｉｒｓｅｎの配列）の塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなることがより好ましく、配列番号３の塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなるアンチセンスオリゴマーであるとより一層好ましい。
　一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、ヒトジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソン５５の５’末端（配列番号１５６の５’末端から３１位）からｎ番目～（ｎ＋ｍ）番目の領域Xｎのいずれかに相補的である（ここで、ｎ＝－３０～－１、１～１６０、ｍ＝１７～３０である（ｎは整数、ｍは自然数））。アンチセンスオリゴマーは、ｎ＝－５～６０を満たす領域Ｘｎのいずれかに相補的であることが好ましく、ｎ＝１～５０を満たす領域Ｘｎのいずれかに相補的であるとより好ましく、具体的には、配列番号１３～２８及び１３３～１４０から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなることが好ましく、配列番号１３～２８及び１３３から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなることがより好ましく、配列番号１３～２８から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなることがさらに好ましく、配列番号１３、２３、及び２６から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなるアンチセンスオリゴマーであるとより一層好ましい。
　ジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソンをスキッピングさせるアンチセンスオリゴマーの非限定的な例を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
　アンチセンスオリゴマーの例としては、配列番号２～３３及び４２～１４７からなる群から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなるものが挙げられる。アンチセンスオリゴマーのさらなる例としては、（i）配列番号２～３３及び４２～１４７からなる群から選択される塩基配列において、１又は数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列、（ii）配列番号４２～１４２からなる群から選択される塩基配列に対して、８０％、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は（iii）配列番号２～３３及び４２～１４２のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴマーの塩基配列を含む、又はこれらの塩基配列からなるものであって、標的エクソン（例えば、エクソン２３、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、及び５５）のスキッピングを誘導するものが挙げられる（ストリンジェントな条件については本明細書に記載するとおりである）。
　本明細書において、１又は数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列における数個は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個を意味する。
　一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーによりスキッピングされるエクソンは、エクソン２３であり、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号２の塩基配列を含むか、又はからなる。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、（i）配列番号２の塩基配列において１又は数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列、（ii）配列番号２の塩基配列に対して、８０％、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は（iii）配列番号２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴマーの塩基配列を含むか、又は当該塩基配列からなり、かつエクソン２３のスキッピングを誘導する。
　一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーによりスキッピングされるエクソンは、エクソン４３であり、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号１４６又は１４７の塩基配列を含むか、又はからなる。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、（i）配列番号１４６又は１４７の塩基配列において１又は数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列、（ii）配列番号１４６又は１４７の塩基配列に対して、８０％、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は（iii）配列番号１４６又は１４７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴマーの塩基配列を含むか、又は当該塩基配列からなり、かつエクソン４３のスキッピングを誘導する。
　一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーによりスキッピングされるエクソンは、エクソン４４であり、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号４及び５２～１０５から選択される塩基配列を含むか、又はからなる。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、（i）配列番号４及び５２～１０５から選択される塩基配列において１又は数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列、（ii）配列番号４及び５２～１０５から選択される塩基配列に対して、８０％、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は（iii）配列番号４及び５２～１０５から選択される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴマーの塩基配列を含むか、又は当該塩基配列からなり、かつエクソン４４のスキッピングを誘導する。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号２０３～２２７から選択される塩基配列を含むか、又はからなる。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、（i）配列番号４及び２０３～２２７から選択される塩基配列において１又は数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列、（ii）配列番号２０３～２２７から選択される塩基配列に対して、８０％、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は（iii）配列番号２０３～２２７から選択される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴマーの塩基配列を含むか、又は当該塩基配列からなり、かつエクソン４４のスキッピングを誘導する。
　一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーによりスキッピングされるエクソンは、エクソン４５であり、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号２９～３３、１３１、及び１３２から選択される塩基配列を含むか、又はからなる。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、（i）配列番号２９～３３、１３１、及び１３２から選択される塩基配列において１又は数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列、（ii）配列番号２９～３３及び１３１～１３２から選択される塩基配列に対して、８０％、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は（iii）配列番号２９～３３、１３１、及び１３２から選択される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴマーの塩基配列を含むか、又は当該塩基配列からなり、かつエクソン４５のスキッピングを誘導する。
　一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーによりスキッピングされるエクソンは、エクソン５０であり、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号９～１２及び１１９～１３０から選択される塩基配列を含むか、又はからなる。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、（i）配列番号９～１２及び１１９～１３０から選択される塩基配列において１又は数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列、（ii）配列番号９～１２及び１１９～１３０から選択される塩基配列に対して、８０％、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は（iii）配列番号９～１２及び１１９～１３０から選択される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴマーの塩基配列を含むか、又は当該塩基配列からなり、かつエクソン５０のスキッピングを誘導する。
　一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーによりスキッピングされるエクソンは、エクソン５１であり、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号５～８及び１０６～１１８から選択される塩基配列を含むか、又はからなる。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、（i）配列番号５～８及び１０６～１１８から選択される塩基配列において１又は数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列、（ii）配列番号５～８及び１０６～１１８から選択される塩基配列に対して、８０％、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は（iii）配列番号５～８及び１０６～１１８から選択される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴマーの塩基配列を含むか、又は当該塩基配列からなり、かつエクソン５１のスキッピングを誘導する。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号２２８の塩基配列を含むか、又はからなる。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、（i）配列番号２２８の塩基配列において１又は数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列、（ii）配列番号２２８の塩基配列に対して、８０％、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は（iii）配列番号２２８の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴマーの塩基配列を含むか、又は当該塩基配列からなり、かつエクソン５１のスキッピングを誘導する。
　一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーによりスキッピングされるエクソンは、エクソン５２であり、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号１４１～１４５から選択される塩基配列を含むか、又はからなる。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、（i）配列番号１４１～１４５から選択される塩基配列において１又は数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列、（ii）配列番号１４１～１４５から選択される塩基配列に対して、８０％、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は（iii）配列番号１４１～１４５から選択される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴマーの塩基配列を含むか、又は当該塩基配列からなり、かつエクソン５２のスキッピングを誘導する。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号２２９の塩基配列を含むか、又はからなる。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、（i）配列番号２２９の塩基配列において１又は数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列、（ii）配列番号２２９の塩基配列に対して、８０％、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は（iii）配列番号２２９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴマーの塩基配列を含むか、又は当該塩基配列からなり、かつエクソン５１のスキッピングを誘導する。
　一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーによりスキッピングされるエクソンは、エクソン５３であり、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号３及び４２～５１から選択される塩基配列を含むか、又はからなる。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、（i）配列番号３及び４２～５１から選択される塩基配列において１又は数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列、（ii）配列番号３及び４２～５１から選択される塩基配列に対して、８０％、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は（iii）配列番号３及び４２～５１から選択される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴマーの塩基配列を含むか、又は当該塩基配列からなり、かつエクソン５３のスキッピングを誘導する。
　一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーによりスキッピングされるエクソンは、エクソン５５であり、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号１３～２８及び１３３～１４０から選択される塩基配列を含むか、又はからなる。一実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、（i）配列番号１３～２８及び１３３～１４０から選択される塩基配列において１又は数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列、（ii）配列番号１３～２８、１３３～１４０から選択される塩基配列に対して、８０％、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は（iii）配列番号１３～２８及び１３３～１４０から選択される塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴマーの塩基配列を含むか、又は当該塩基配列からなり、かつエクソン５５のスキッピングを誘導する。
　一実施形態において、本発明の核酸はｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ、又はこれらをコードするＤＮＡである。ｓｉＲＮＡは、配列特異的にＲＮＡ干渉を誘導することができる、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡを指す。本明細書において、ＲＮＡ干渉とは、二本鎖ＲＮＡにより、配列特異的に標的配列を有する核酸が分解される現象を指す。ｓｈＲＮＡは、センス鎖、アンチセンス鎖、及び前記センス鎖と前記アンチセンス鎖を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列（ヘアピン配列）を含むヘアピン型のＲＮＡである。ｓｈＲＮＡが細胞内に導入されると、ＤｉｃｅｒによってプロセシングされてｓｉＲＮＡが形成される。ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡの例として、2つのプロモーター（例えばＵ６プロモーター）、センス鎖をコードする塩基配列及びアンチセンスをコードする塩基配列を含むタンデム型ＤＮＡが挙げられる。
　本明細書において、「センス鎖」とは、対応するアンチセンス鎖の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド鎖を指す。センス鎖は、標的配列と相同性を有する核酸配列を含むことができる。本明細書において、「アンチセンス鎖」とは、標的核酸配列の少なくとも一部に部分的又は完全に相補的なヌクレオチド鎖を指す。
　センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの各3'末端は、２～５ヌクレオチド、例えば２ヌクレオチドのオーバーハングを有していてもよい。オーバーハングは、ＲＩＳＣと相互作用する可能性が指摘されており、またヌクレアーゼによる分解に対する安定性の向上に寄与するが、標的配列への特異性に影響しないため任意の配列（例えばポリＴ配列）を用いることができる。
　一実施形態において、キャリアペプチドは、本発明の核酸の５’末端又は３’末端に直接的に又は連結部分を介して連結されており、連結部分としては共有結合又はリンカーが含まれる。本発明の核酸がＰＭＯのアンチセンスオリゴマーであれば好ましくは３’末端に直接的に又は連結部分を介して連結されている。
　すなわち、一実施形態において、キャリアペプチドは、本発明の核酸の５’末端又は３’末端に適当なリンカーを介して間接的に連結されており、本発明の核酸がＰＭＯのアンチセンスオリゴマーであれば好ましくは３’末端に直接的に又は適当なリンカーを介して間接的に連結されている。
　キャリアペプチドが連結された核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物は、当業者であれば容易に調製することができる。例えばキャリアペプチドと核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物をそれぞれ本明細書に記載されるとおりに調製し、これらをリンカーを介して連結することにより調製することができる。具体的には、例えばキャリアペプチドとリンカーを連結した後に核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物をリンカーに連結させてもよいし、核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物とリンカーを連結した後にキャリアペプチドをリンカーに連結させてもよい。また、例えば、キャリアペプチドとリンカーの一部を連結させたものと核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物にリンカーの一部を連結させたものとを反応させることにより、キャリアペプチドと核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物との間にリンカーを形成させてもよい。
　リンカーは、特に限定されるものではないが、ペプチド性リンカーであってもよく、非ペプチド性リンカーであってもよい。特に限定されるものではないが、ペプチド性リンカーを構成するアミノ酸配列は立体障害を生じさせず、かつ、柔軟なアミノ酸配列であることが好ましい。ペプチド性リンカーは、例えば、グリシン、アラニン、およびセリン等から選択される天然のアミノ酸残基を１種または２種以上含む、１０個以下（より好ましくは１個以上５個以下、例えば１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸残基）のアミノ酸残基からなるリンカーであり得る。また、かかるリンカーは、βアラニン、アミノヘキサン酸等から選択される非天然のアミノ酸を含むか、又はからなるものであってもよく、例えば、非天然のアミノ酸を１種または２種以上含む、１０個以下（より好ましくは１個以上５個以下、例えば１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸残基）のアミノ酸残基からなるリンカーであり得る。非ペプチド性リンカーとしては、特に限定されるものではないが、例えばアルキルリンカー、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）リンカー、マレイミド－チオール付加体（maleimide-thiol adducts）等を用いてもよい。
　本明細書において、用いられ得るリンカーとして、以下の［］内に示される化学式で表されるリンカーが挙げられる（以下の模式図は、キャリアペプチドが連結された核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物の構造を表し、ここで、nucleic acidは核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物を表し、peptideはキャリアペプチドを意味する）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
　本発明のキャリアペプチドが連結された核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物は、好ましくは以下：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
からなる群から選択される構造を有するか（nucleic acid及びpeptideは上記と同じ意味を有する）、より好ましくは以下：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
（Rは-NH2及び-OHから選択される基を示す。）
及び
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
からなる群から選択される構造を有するか（nucleic acid及びpeptideは上記と同じ意味を有する）、又はキャリアペプチドと核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物はリンカーを介さずに直接連結される。
　リンカーは、当業者に公知の方法、例えば化学合成により調製することができる。
　キャリアペプチドと核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物の結合位置は限定しないが、例えばキャリアペプチドのN末端又はＣ末端において核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩と連結している。好ましくは、キャリアペプチドと核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物はリンカーを介して連結され、キャリアペプチドはそのＣ末端においてリンカーに連結している。
　本発明のキャリアペプチドが連結された核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物の具体例としては、例えば以下の表に示すものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035
　本発明のキャリアペプチドが連結された核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物の別の具体例としては、例えば実施例の表8中に記載されたPPMO No.13～44のいずれか、例えばPPMO No.13～17、20、23、26、29、32、35、38、41、及び42のいずれか、例えばPPMO No.13～16、18、21、24、27、30、33、36、39、41、及び42のいずれか、例えばPPMO No.13～16、19、22、25、28、31、34、37、40、41、及び42のいずれか、例えばPPMO No.13～16、23、26、29、32、35、38、41、42、43、及び44のいずれか、例えばPPMO No.13～16、24、27、30、33、36、39、41、42、43、及び44のいずれか、例えばPPMO No.13～16、25、28、31、34、37、40、41、42、43、及び44のいずれか、例えばPPMO No.13～17、20、23、26、29、32、35、及び38のいずれか、例えばPPMO No.13～16、18、21、24、27、30、33、36、及び39のいずれか、例えばPPMO No.13～16、19、22、25、28、31、34、37、及び40のいずれか、例えばPPMO No.13～16、23、26、29、32、35、38、43、及び44のいずれか、例えばPPMO No.13～16、24、27、30、33、36、39、43、及び44のいずれか、例えばPPMO No.13～16、25、28、31、34、37、40、43、及び44のいずれかが挙げられる。
　一実施形態において、本発明は、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節する、又はＲＮＡの標的領域の機能を阻害する核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物と、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１）のアミノ酸配列、又は配列番号１において１又は２個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列（ただし、配列番号１のＮ末端から８位及び９位の両方のアミノ酸が置換されたものを除く）を含む、又は当該アミノ酸配列からなるキャリアペプチドと、を含む、複合体（以下、「本発明の複合体」とも記載する）に関する。複合体において、キャリアペプチドと核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物の詳細は、キャリアペプチドが連結された核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物において記載したとおりである。
　一実施形態において、本発明は、本発明の核酸とキャリアペプチドが静電的相互作用により結合している、複合体に関する。このような複合体は、本発明の核酸が負電荷を有する場合、正電荷を有するキャリアペプチドと混合することによって、容易に調製することができる（例えば、J Clin Invest. 2014;124(10):4363-4374. doi:10.1172/JCI75673を参照されたい）。この場合、本発明の核酸がキャリアペプチドの正電荷で覆われるため，細胞膜との相互作用および細胞内への侵入が促進されると考えられる。
　一実施形態において、本発明は、本発明の核酸がリポソーム中に存在し、リポソーム上にキャリアペプチドが結合している、複合体に関する。このような複合体は、キャリアペプチドと脂質を混合して、脂質二重膜にキャリアペプチドが入ったミセル（リポソーム）を作製し、これを核酸と混合することによって調製することができる（例えば、International Journal of Pharmaceutics 483 (2015) 26-37及びNanomedicine. 2020 August ; 28: 102225. doi:10.1016/j.nano.2020.102225を参照されたい）。リポソームとしては、カチオン性リポソーム、例えば、２－Ｏ－（２－ジエチルアミノエチル）カルバモイル－１，３－Ｏ－ジオレオイルグリセロールとリン脂質とを必須構成成分として形成されるリポソーム（以下、「リポソームＡ」という）、オリゴフェクトアミン（登録商標）（Invitrogen社製）、リポフェクチン（登録商標）（Invitrogen社製）、リポフェクトアミン（登録商標）（Invitrogen社製）、Lipofectamine 2000（登録商標）（Invitrogen社製）、DMRIE-C（登録商標）（Invitrogen社製）、GeneSilencer（登録商標）（Gene Therapy Systems社製）、TransMessenger（登録商標）（QIAGEN社製）、TransIT TKO（登録商標）（Mirus社製）、Nucleofector II（Lonza）を挙げることができる。
　一実施形態において、本発明のキャリアペプチド連結核酸又は複合体は、細胞内への取り込み効率が高い。一実施形態において、本発明の核酸は、効果（例えばエクソンスキッピング活性）が高い、細胞又は組織への分布について特異性が高い（例えば心臓において高い効果を奏する）、及び／又は毒性が低いものであり得る。
　一実施形態において、本発明は、本発明のキャリアペプチド連結核酸又は複合体を１つ又は２つ以上含む、医薬組成物に関する。本発明の核酸又は複合体を対象に投与する場合、本発明の医薬組成物は、核酸又は複合体の送達を促進する担体をさらに含んでもよい。このような担体は、医薬的に許容可能なものであれば特に制限されず、その例として、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー等のカチオン性担体、又はウイルスエンベロープを利用した担体を挙げることができる。カチオン性リポソームとしては、上記の複合体について記載したカチオン性リポソームを用いることができる。カチオン性ポリマーとしては、例えば、JetSI（登録商標）（Qbiogene社製）、Jet-PEI（登録商標）（ポリエチレンイミン、Qbiogene社製）を挙げることができる。ウイルスエンベロープを利用した担体としては、例えば、GenomeOne（登録商標）（HVJ-Eリポソーム、石原産業社製）を挙げることができる。あるいは、特許２９２４１７９号に記載の医薬デバイス、再公表特許公報第２００６／１２９５９４号及び再公表特許公報第２００８／０９６６９０号に記載のカチオン性担体を用いることもできる。
　一実施形態において、本発明の核酸は、核酸の送達を促進するために、医薬組成物中で脂質等との複合体（コンジュゲート）となっていてもよい。例えば、Bijsterbosch, M.K. et al. (2000) Nucleic Acid Res., 28, 2717-2725に記載されているように、コレステロールとのコンジュゲートとすることができる。
　本発明の医薬組成物は、本発明のキャリアペプチド連結核酸又は複合体及び任意に上記担体に加えて、医薬的に許容可能な添加剤を含んでもよい。かかる添加剤として、例えば、乳化補助剤（例えば、炭素数６～２２の脂肪酸やその医薬的に許容可能な塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸、マンニトール、ソルビトール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。本発明の組成物中の当該添加剤の含有量は、９０重量％以下が適当であり、７０重量％以下が好ましく、５０重量％以下がより好ましい。
　本発明の医薬組成物の調製法は限定しないが、例えば担体の分散液に本発明のキャリアペプチド連結核酸又は複合体を加え、適当に攪拌することにより調製することができる。また、添加剤は、本発明のキャリアペプチド連結核酸又は複合体の添加前でも添加後でも適当な工程で添加することができる。本発明のキャリアペプチド連結核酸又は複合体を添加する際に用い得る水性溶媒としては、医薬的に許容可能なものであれば特に制限されず、例えば、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、緩衝液、ブドウ糖液、マルトース液等の糖液を挙げることができる。また、かかる場合のｐＨ及び温度等の条件は、当業者が適宜選択することができる。
　本発明の医薬組成物は、例えば、液剤やその凍結乾燥製剤とすることができる。当該凍結乾燥製剤は、常法により、液剤の形態を有している本発明の組成物を凍結乾燥処理することにより調製することができる。例えば、液剤の形態を有している本発明の組成物を適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約－４０℃～－２０℃の範囲内の条件で予備凍結を２時間程度行い、約０℃～１０℃の範囲内で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５℃～２５℃の範囲内で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明の組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。
　本発明の医薬組成物の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５倍量～２倍量又は５００ｍＬ以下が適当である。
　本発明の医薬組成物を投与する際の用量としては、含有される本発明のキャリアペプチド連結核酸又は複合体の種類、剤形、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度を考慮した上で調節することが望ましいが、成人に対して本発明のキャリアペプチド連結核酸又は複合体の量として、１回の投与に体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ～１ｇ、好ましくは体重１ｋｇあたり１ｍｇ～１００ｍｇ、さらに好ましくは体重１ｋｇあたり１ｍｇ～９０ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇあたり１ｍｇ～８０ｍｇ、さらにより好ましくは１０ｍｇ～６０ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは１０ｍｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは１０ｍｇ～４０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。投与頻度は、数か月に１回～１月に数回であってもよい。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。したがって、場合によってはこれ以下の用量又は投与頻度でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量又は投与頻度を必要とするときもある。
　本発明に係る組成物の投与形態は、医薬的に許容可能な投与形態であれば特に制限されず、治療方法に応じて選択することができるが、気管内投与、経肺投与、経鼻投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、組織内投与、経皮投与等が挙げられる。筋組織への送達を行う場合、送達容易性の観点から、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、組織内投与、経皮投与等が好ましい。また、本発明の組成物が取り得る剤型としては、特に制限されないが、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、軟膏剤、ローション剤等を挙げることができる。
　本発明に係る医薬組成物の気管内投与を行う場合、本発明の組成物が取り得る剤形としては、好ましくは吸入剤であり、具体的には、例えば吸入液剤（例えばネブライザで投与）、粉末吸入剤（例えばDPI（ドライパウダー吸入器）で投与）、エアゾール剤であり、好ましくは吸入液剤である。
　本発明のキャリアペプチド連結核酸、複合体、又は医薬組成物の投与対象は、例えば哺乳動物、例えばヒト等の霊長類、ラット、マウス、及びドブネズミ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、及びヒツジ等の家畜動物等が挙げられ、好ましくはヒトである。
　一実施形態において、本発明は、本発明のキャリアペプチド連結核酸、複合体、又は医薬組成物を、筋ジストロフィー患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法に関する。
　本実施形態における医薬組成物、並びに医薬組成物の投与量及び投与経路等は、本明細書に記載するとおりである。
　一実施形態において、本発明は、筋ジストロフィーの治療のための、本発明のキャリアペプチド連結核酸、複合体、又は医薬組成物に関する。一実施形態において、本発明は、筋ジストロフィーの治療ための医薬の製造における、本発明のキャリアペプチド連結核酸又は複合体の使用に関する。
［実施例１：アンチセンスオリゴマーの合成］
　国際公開第２０１５／１３７４０９号に記載の方法に従い、表１に示すアンチセンスオリゴマー（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）　Ｎｏ．1～３８（配列番号２～３９））を合成した。表中には、各アンチセンスオリゴマーの分子量の理論値およびＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる実測値も示す。
　表１中において、配列名の頭文字がＭの配列はマウスのジストロフィン遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴマーの配列であり、頭文字がＨの配列はヒトのジストロフィン遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴマーの配列である。頭文字の後の数字は標的となるエクソンの番号を表す。例えば「H51_69-80_129-142」は、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１の５’末端の塩基を１番目の塩基とし、３’側に続く塩基に順番に番号を付した場合に、アンチセンスオリゴマーが６９番目～８０番目の塩基の配列および１２９番目～１４２番目の塩基の配列を標的とするものであることを示す。なお、標的塩基配列中の－１番目以前の塩基の配列は、当該エクソンの前のイントロン中の塩基配列である。
　また、配列名の頭文字がＡの配列は福山型筋ジストロフィーの原因遺伝子である挿入変異型のフクチン遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴマーの配列である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037
［実施例２－１：ＰＭＯとペプチドのコンジュゲート（ペプチド修飾型ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ））（システイン－マレイミドリンカー）の合成］
　ＰＭＯ(ＰＭＯ No.1, 198.5 mg, 1.0eq)をジメチルスルホキシド(1.0mL)とN,N-ジメチルホルムアミド(0.2mL)の混合溶媒に溶解させた。その溶液に4-マレイミド酪酸(17.7mg,4.0eq)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(WSCI・HCl, 18.5mg,4.0eq)、ジメチルスルホキシド(0.4mL)、N,N-ジメチルホルムアミド(0.2mL)の混合液を加えて、45℃で攪拌した。HPLC分析によって反応を追跡し、４時間後、原料の消失を確認した後、反応液にジクロロメタン（300 mL）を加えて沈殿させた。0℃で10分間攪拌した後、沈殿物をろ取し、減圧乾燥した。得られた白色固体をジメチルスルホキシド(1.28mL)とN,N-ジメチルホルムアミド(0.32mL)の混合溶媒に溶解させ、その溶液にペプチド(Ac-KKRTLRKSNRKKR-Cys-CONH2・9トリフルオロ酢酸(TFA)塩, 62mg, 1.4 eq)、ジメチルスルホキシド(0.48mL)、N,N-ジメチルホルムアミド(0.12mL)の混合液を加えて、室温で１時間攪拌した。HPLC分析によって、反応を追跡し、原料の消失を確認したのち、水(50mL)を加えてクエンチした。
　なお、HPLCの測定条件は以下のとおりである。
HPLC測定条件：
装置：Nexera X3 dual injection system（島津製作所）
カラム：MabPac SCX-10 ,10μm, 4 x 250 mm（サーモフィッシャー）
移動相A：25%アセトニトリル水溶液, 25mM リン酸二水素カリウム (pH3.5)
移動相B：25%アセトニトリル水溶液, 25mM リン酸二水素カリウム, 1.5 M 塩化カリウム (pH 3.33)
流速：0.65mL/min
温度：30℃
波長：215 & 254nm
グラジエント：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000038
　上記反応の模式図を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039
［実施例２－２：ＰＰＭＯの精製］
実施例２－１で得られた溶液から、合成されたＰＰＭＯを陽イオン交換により精製した。精製条件は、以下の表２に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
　各フラクションを分析して、目的物を回収した。得られた溶液を下記表４に示す条件で逆相カラムクロマトグラフィーによる脱塩を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
　目的物を回収し、減圧濃縮した。得られた残渣を水に溶かし、凍結乾燥して、白色綿状固体として目的化合物を得た。得られたＰＰＭＯの分子量の理論値、ESI-TOF-MSでの分子量の実測値を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
［実施例３：アミドリンカーで連結されたＰＰＭＯの合成および精製］
　ＰＭＯ　Ｎｏ．１(150.0 mg, 1.0eq)をジメチルスルホキシド(1.5mL)とN,N-ジメチルホルムアミド(0.2mL)の混合溶媒に溶解させた。その溶液にペプチド(Ac-K(Tfa)K(Tfa)RTLRK(Tfa)SNRK(Tfa)K(Tfa)R-β-Ala-COOH・4トリフルオロ酢酸(TFA)塩, 95.0mg, 1.9 eq)、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート(HATU, 11.8mg, 1.7eq)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.014mL,4.25eq)、N,N-ジメチルホルムアミド(0.43mL)の混合液を加えて、35℃で攪拌した。HPLC分析によって反応を追跡し、3時間後、原料の消失を確認し、反応液にテトラヒドロフラン（15 mL）を加え、遠心分離した後、デカンテーションで上澄液を除去し、残渣を減圧乾燥した。得られた白色個体に28％アンモニア水―エタノール（1/3）15mLを加え、室温で17時間攪拌した。HPLC分析によって、反応を追跡し、原料の消失を確認した後、20% アセトニトリル水溶液（150mL）を加えて希釈した。得られた溶液に1Mの塩酸水溶液（131mL）を加えて中和した後、水（300mL）を加えて希釈した。尚、HPLC測定条件は実施例２－１に記載した。実施例２－２に記載した手法と同様の手法で精製を行い、目的化合物を得た（表７、ＰＰＭＯ No.4）。表７中で示すその他の誘導体は、対応するアミノ酸をC末端に持つペプチドを合成し、上記と同様の方法でＰＭＯとコンジュゲートして得た。
　上記反応の模式図を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000045
　得られたＰＰＭＯの分子量の理論値、ESI-TOF-MSでの分子量の実測値を表中に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000047
［実施例４：アンチセンスオリゴマーのエクソンスキッピング活性試験］
試験例１：マウスジストロフィン遺伝子エクソン２３スキッピングのＩｎ　ｖｉｔｒｏ試験（Ｇｙｍｎｏｓｉｓ法）
（１）試験方法
　Ｃ２Ｃ１２細胞（マウス横紋筋由来筋芽細胞株、ＡＴＣＣより購入、ＣＲＬ－１７７２）　８．０×１０３個を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ニチレイ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　（ＤＭＥＭ）培地（シグマ）０．５ｍＬ中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。
　細胞に対して、表１、表６、及び表７に示すアンチセンスオリゴマー（モルフォリノ核酸（ＰＭＯ）またはペプチド修飾型モルフォリノ核酸（ＰＰＭＯ））を３、１０、３０、および１００μＭで処置し、さらに３７℃、５％ＣＯ２条件下で三晩培養した。
　細胞をＰＢＳ（ナカライテスク）で２回洗浄した後、２％ウマ血清（ＨＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）を含むＤＭＥＭ培地　０．５ｍＬ中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で二晩培養した。
　培養後の細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、１％の２－メルカプトエタノール（ナカライテスク）を含むＢｕｆｆｅｒ　ＲＡ１（タカラバイオ）３５０μＬを細胞に添加し、数分間室温に放置して細胞を溶解させ、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）　Ｆｉｌｔｅｒ（タカラバイオ）上に回収した。１１，０００×ｇで１分間遠心し、ホモジネートを作製した。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ（タカラバイオ）に添付のプロトコルに従って全ＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡの濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ　Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて測定した。
　抽出した全ＲＮＡ　２５０ｎｇに対し、ＱＩＡＧＥＮ　ＯｎｅＳｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ
　Ｋｉｔ（キアゲン）およびサーマルサイクラーを用いてＯｎｅ－Ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲを行った。上記キットに添付のプロトコルに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはＴａｋａｒａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｔｏｕｃｈ（タカラバイオ）を用いた。用いたＲＴ－ＰＣＲのプログラムは、以下のとおりである。
　　５０℃、３０分間：逆転写反応
　　９５℃、１５分間：ポリメラーゼ活性化、逆転写酵素不活化、ｃＤＮＡ熱変性
　　［９４℃、３０秒間；５８℃、１分間；７２℃、１分間］×３２サイクル：ＰＣＲ増幅
　　７２℃、１０分間：最終伸長反応
　ＲＴ－ＰＣＲに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下のとおりである。
　フォワードプライマー：５’－ＴＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＡＣＴＴＴＧＴＧＧ－３’（配列番号４０）
　リバースプライマー：５’－ＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＴＴＴＣＴＧＴＡＡＧＧ－３’（配列番号４１）
　上記ＰＣＲの反応産物５μＬをＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所）を用いて解析した。
　エクソン２３がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、野生型のバンドのポリヌクレオチド量「Ｂ」をバンドのシグナル強度として測定した。これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。
　　スキッピング効率（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）×１００
（２）試験結果
　各アンチセンスオリゴマー（ＰＭＯまたはＰＰＭＯ）で処置した細胞について、得られたエクソン２３スキッピング効率の結果を図１～５に示す。図１に示される結果から、表６のペプチドが連結されたアンチセンスオリゴマー（ＰＰＭＯ　Ｎｏ．１）は、ＰＭＯが同一でペプチドが連結されていない表１のアンチセンスオリゴマー（ＰＭＯ　Ｎｏ．１）と比較して、高い効率でエクソン２３をスキッピングさせることが判明した。また、図２～５に示される結果から、表７のアミドリンカーを介してペプチドが連結されたアンチセンスオリゴマー（ＰＰＭＯ　Ｎｏ．２～ＰＰＭＯ　Ｎｏ．１２）は、ＰＭＯが同一でＣｙｓ－Ｍａｌｅｉｍｉｄｅリンカーを介してペプチドが連結されたＰＰＭＯ　Ｎｏ．１と比較して、さらに高い効率でエクソン２３をスキッピングさせることが判明した。
試験例２：マウスジストロフィン遺伝子エクソン２３スキッピングのＩｎ　ｖｉｔｒｏ試験（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ法）
（１）試験方法
　Ｃ２Ｃ１２細胞　２．０×１０５個に対して、表１のアンチセンスオリゴマー（ＰＭＯ）及び表６のアンチセンスオリゴマー（ＰＰＭＯ）を、０．１、０．３、および１μＭの濃度でＳＥ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ　４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　Ｘ　Ｋｉｔ　Ｓ（Ｌｏｎｚａ）により導入した。プログラムはＣＤ－１３７を用いた。
　導入後の細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（シグマ、以下同じ）０．５ｍＬ中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。
　細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、２％ＨＳを含むＤＭＥＭ培地　０．５ｍＬ中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で二晩培養した。
　培養後の細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、１％の２－メルカプトエタノールを含むＢｕｆｆｅｒ　ＲＡ１　３５０μＬを細胞に添加し、数分間室温に放置して細胞を溶解させ、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ　Ｆｉｌｔｅｒ上に回収した。
　以降は試験例１と同様の方法で実験を行った（ただし、ＭｕｌｔｉＮＡの解析には、ＰＣＲ反応産物を６μＬ使用した）。
（２）試験結果
　各アンチセンスオリゴマーについて、得られたエクソン２３スキッピング効率の結果を図６に示す。図６に示される結果から、表６のペプチドが連結されたアンチセンスオリゴマー（ＰＰＭＯ　Ｎｏ．１）は、ＰＭＯが同一でペプチドが連結されていない表１のアンチセンスオリゴマー（ＰＭＯ　Ｎｏ．１）と比較して、高い効率でエクソン２３をスキッピングさせることが判明した。本実施例は、エレクトロポレーション法で細胞内にアンチセンスオリゴマーを送達しているため、この結果は、アンチセンスオリゴマーにペプチドを連結させることにより、細胞へのアンチセンスオリゴマーの送達効率を高めるだけでなく、細胞内でのアンチセンスオリゴマーのエクソンスキッピング活性自体も向上させ得ることを示唆している。
［実施例５：野生型マウス薬効試験］
　ペプチドが連結されたアンチセンスオリゴマーであるペプチド修飾型モルフォリノ核酸（ＰＰＭＯ）の薬効を、野生型マウスにおけるジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡスキッピング効率で評価した。
（１）評価方法
　ＰＭＯ　Ｎｏ．１（配列番号２）をＣ５７ＢＬ／６Ｎ雄性８週齢マウスの尾静脈に用量３００ｍｇ／ｋｇで単回投与した。また、ＰＭＯ　Ｎｏ．１にペプチド（配列番号１）をコンジュゲートした各ＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ　Ｎｏ．１、Ｎｏ．８、Ｎｏ．９）をＣ５７ＢＬ／６Ｎ雄性８週齢マウスの尾静脈に用量６ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇで単回投与した。各ＰＰＭＯはそれぞれ上記の方法により調製した。投与から２日後にマウスを屠殺し、前脛骨筋、大腿四頭筋、心臓、横隔膜を採取した。各組織から抽出した全　ＲＮＡを用いてＲＴ－ＰＣＲ解析によるエクソンスキッピング効率の測定を実施した。
ＲＴ－ＰＣＲ解析
　各組織からのＲＮＡ抽出はＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）、ＲＴ－ＰＣＲはＱＩＡＧＥＮ　ＯｎｅＳｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、それぞれ添付のプロトコルに従って実施した。サーマルサイクラーはＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｔｏｕｃｈ（タカラバイオ社製）を用いた。ＲＴ－ＰＣＲのプログラムは、以下のとおりである。
　　５０℃、３０分間：逆転写反応
　　９５℃、１５分間：ポリメラーゼ活性化、逆転写酵素不活性化、ｃＤＮＡ熱変性
　　［９４℃、３０秒間；５８℃、１分間；７２℃、１分間］×２８サイクル：ＰＣＲ増幅
　　７２℃、１０分間：最終伸長反応
　ＲＴ－ＰＣＲに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下のとおりである。
　フォワードプライマー：５’－ＴＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＡＣＴＴＴＧＴＧＧ－３’（配列番号４０）
　リバースプライマー：５’－ＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＴＴＴＣＴＧＴＡＡＧＧ－３’（配列番号４１）
　上記ＰＣＲの反応産物はＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所製）を用いて解析した。
　エクソン２３がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、エクソン２３がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「Ｂ」を、バンドのシグナル強度として測定した。これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、下記の式（１）に従って、スキッピング効率を求めた。
　スキッピング効率ＥＳ（単位：％）＝１００×Ａ／（Ａ＋Ｂ）
（２）評価結果
　前脛骨筋、大腿四頭筋、心臓、横隔膜の４組織いずれにおいても、ＰＭＯ　Ｎｏ．１は３００ｍｇ／ｋｇ投与で１０％以下の低い活性しか示さなかった（図７）のに対して、ペプチドを連結したＰＰＭＯ　Ｎｏ．１は前脛骨筋、大腿四頭筋、心臓、横隔膜において高い活性を示した（図８）。なお、心臓においては、他のペプチドを連結したＰＰＭＯと比較して活性が高い傾向が見られた（データ示さず）。
　ペプチドとＰＭＯを連結する際のリンカーが異なるＰＰＭＯについて活性評価を行った。前脛骨筋、大腿四頭筋、心臓、横隔膜の４組織いずれにおいても、ＰＰＭＯ　Ｎｏ．１＜ＰＰＭＯ　Ｎｏ．８＜ＰＰＭＯ　Ｎｏ．９の順で高活性であった。（図８）。
［実施例６：野生型マウス血液検査］
　上記の野生型マウス薬効試験と同一の試験において血液検査を実施し、各ＰＰＭＯの安全性を評価した。
（１）評価方法
　上記のとおり各ＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ　Ｎｏ．１、Ｎｏ．８、Ｎｏ．９）をマウスに投与し、投与から２日後にイソフルラン麻酔下のマウスより全採血を行い、キャピジェクトII（凝固促進剤+血清分離剤）（テルモ社、カタログ番号：ＣＪ－２ＡＳ）を用いて添付のプロトコルとおりの方法で血清を得た。得られた血清を用いて、血中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）値、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）値、尿素窒素量（ＢＵＮ）値およびクレアチニン値を測定した。
（２）評価結果
　ＰＰＭＯ　Ｎｏ．１、ＰＰＭＯ　Ｎｏ．８、ＰＰＭＯ　Ｎｏ．９は６０ｍｇ／ｋｇまでの投与量で肝障害マーカー（ＡＳＴ、ＡＬＴ）、腎障害マーカー（ＢＵＮ、クレアチニン）いずれにおいても顕著な値の上昇は見られなかった（図９）。
［実施例７：野生型マウス簡易毒性試験］
　各ＰＰＭＯ（ＰＰＭＯ　Ｎｏ．４、ＰＰＭＯ　Ｎｏ．７、ＰＰＭＯ　Ｎｏ．８、ＰＰＭＯ　Ｎｏ．９）について、医薬用途での安全性を検証するため、安全性評価を行った。
（１）評価方法
　上記の方法により調製した各ＰＰＭＯを生理食塩水に溶解し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雄性８週齢マウスの尾静脈内へ２００　ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。翌日、イソフルラン麻酔下のマウスより全採血を行い、キャピジェクトII（凝固促進剤＋血清分離剤）（テルモ社、カタログ番号：ＣＪ－２ＡＳ）を用いて添付のプロトコルとおりの方法で血清を得た。得られた血清を用いて、血中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）値、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）値、尿素窒素量（ＢＵＮ）値およびクレアチニン値を測定した。
（２）評価結果
　ＰＰＭＯ　Ｎｏ．４、ＰＰＭＯ　Ｎｏ．７については、ＡＳＴ値、ＡＬＴ値に異常値が見られなかったが、ＢＵＮ値およびクレアチニン値についてはわずかに上昇した個体も生じた。ＰＰＭＯ　Ｎｏ．８、ＰＰＭＯ　Ｎｏ．９については、ＡＳＴ値、ＡＬＴ値、ＢＵＮ値およびクレアチニン値のいずれも上昇した（図１０）。
　以上の結果より、ＰＰＭＯ　Ｎｏ．４やＰＰＭＯ　Ｎｏ．７はＰＰＭＯ　Ｎｏ．８、ＰＰＭＯ　Ｎｏ．９より高い安全性を有することが示唆された。
［実施例８：ｍｄｘマウス薬効持続性試験］
　各ＰＰＭＯの薬効持続性をデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の動物モデルとしてよく用いられているｍｄｘマウスを用いて検証した。ｍｄｘマウスはジストロフィン遺伝子のエクソン２３に変異を含み、ジストロフィンをほとんど発現しない。ＰＭＯ　Ｎｏ．１（配列番号２）は、エクソン２３スキッピングを誘導し機能性ジストロフィンの発現を回復することが知られている。
（１）評価方法
　ＰＭＯ　Ｎｏ．１にペプチドを連結した各ＰＰＭＯを６週齢のｍｄｘマウスの尾静脈に用量４０ｍｇ／ｋｇあるいは１２０ｍｇ／ｋｇで単回投与した。ＰＰＭＯは上記の方法により調製した。投与から７日後、１４日後、３０日後および６０日後にマウスを屠殺し、前脛骨筋、大腿四頭筋、心臓、横隔膜を採取した。各組織から抽出した全ＲＮＡおよび全タンパク質を用いてＲＴ－ＰＣＲ解析によるエクソンスキッピング効率の測定およびウエスタンブロット解析によるジストロフィンタンパク質の発現量測定を実施した。
ＲＴ－ＰＣＲ解析
　各組織からのＲＮＡ抽出はＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）、ＲＴ－ＰＣＲはＱＩＡＧＥＮ　ＯｎｅＳｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、それぞれ添付のプロトコルに従って実施した。サーマルサイクラーはＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｔｏｕｃｈ（タカラバイオ社製）を用いた。ＲＴ－ＰＣＲのプログラムは、以下のとおりである。
　　５０℃、３０分間：逆転写反応
　　９５℃、１５分間：ポリメラーゼ活性化、逆転写酵素不活性化、ｃＤＮＡ熱変性
　　［９４℃、３０秒間；５８℃、１分間；７２℃、１分間］×３４サイクル：ＰＣＲ増幅
　　７２℃、１０分間：最終伸長反応
　ＲＴ－ＰＣＲに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下のとおりである。
　フォワードプライマー：５’－ＴＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＡＣＴＴＴＧＴＧＧ　－３’（配列番号４０）
　リバースプライマー：５’－ＣＡＧＣＣＡＴＣＣＡＴＴＴＣＴＧＴＡＡＧＧ　－３’（配列番号４１）
　上記ＰＣＲの反応産物はＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所製）を用いて解析した。
　エクソン２３がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、エクソン２３がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「Ｂ」を、バンドのシグナル強度として測定した。これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、下記の式（１）に従って、スキッピング効率を求めた。
　スキッピング効率ＥＳ（単位：％）＝１００×Ａ／（Ａ＋Ｂ）
ウエスタンブロッティング解析
　マウスから採取した各組織をホモジナイズ緩衝液中でＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ　ＩＩ（キアゲン社、カタログ番号：８５３００）を用いてホモジナイズした。ホモジナイズ緩衝液はＲＩＰＡバッファー（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製、カタログ番号：８９９００）にｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ　Ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ社、カタログ番号：１１８３６１５３００１）を添付のプロトコルとおりの用量で添加し調製した。ホモジナイズ後の溶液を１５，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上清を全タンパク質溶液とした。全タンパク質溶液の定量はＰｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、カタログ番号：２３２２５）を用いて添付のプロトコルに従って実施した。定量に際しては全タンパク質溶液をホモジナイズ緩衝液を用いてＢＳＡ標準曲線の範囲内に収まるように希釈した。
　定量値に従って３．０８ｍｇ／ｍＬに濃度調製したタンパク質溶液３９μｌ、ＮｕＰＡＧＥ　ＬＤＳ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、カタログ番号：ＮＰ０００７）１５μｌ、およびＮｕＰＡＧＥ　Ｒｅｄｕｃｉｎｇ
　Ａｇｅｎｔ（１０倍）（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、カタログ番号ＮＰ０００９）６μｌを混合し、全タンパク質の終濃度が２ｍｇ／ｍＬになるようにサンプルを調製した。調製したサンプルを７０°Ｃで１０分間加熱した後、ＮｕＰＡＧＥ　３
　ｔｏ　８％，　Ｔｒｉｓ－Ａｃｅｔａｔｅ，１．０　ｍｍ，　Ｍｉｄｉ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇｅｌ，２６－ｗｅｌｌ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、カタログ番号：ＷＧ１６０３ＢＯＸ）上に１レーン当たり１２．５μＬずつアプライした。ゲルを室温にて、ローディングダイフロントがゲルからはみ出るまで１５０ボルトで泳動した。
　泳動後のゲルはＥｚＦａｓｔＢｌｏｗ　ＨＭＷ（アトー社、カタログ番号：ＷＳＥ－７２１０、添付のプロトコルとおりに希釈して使用）バッファー中でＩｍｍｏｌｉｌｏｎ－Ｐ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ（メルクミリポア社、カタログ番号：ＩＰＶＨ０００１０）に室温で３０分間０．４Ａで転写した。タンパク質転写後のメンブレンをＴＢＳ－Ｔ緩衝液に浸して室温で５分間穏やかに振とうしながら洗浄した。ＴＢＳ－Ｔ緩衝液は１０×ＴＢＳ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、カタログ番号１７０－６４３５）を超純水で１０倍希釈し、ｔｗｅｅｎ－２０（ナカライテスク社、カタログ番号：３５６－２４）を１％（ｖ／ｖ）になるように添加して調製した。メンブレンをブロッキング緩衝液に移し、室温で１時間、穏やかに振とうしながら浸漬した。ブロッキング緩衝液はＴＢＳ－Ｔにスキムミルク（富士フイルム和光純薬社、カタログ番号：１９８－１０６０５）を５％（ｗ／ｖ）になるように添加し調製した。ブロッキング後、ブロッキング緩衝液を用いて１：１００に希釈したＤＹＳ１抗体（Ｌｅｉｃａ社、カタログ番号ＮＣＬ－ＤＹＳ１）、またはブロッキング緩衝液を用いて１：２，５００に希釈した抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ａｂｃａｍ社、カタログ番号：ａｂ８２４５）に浸漬し、４℃で一晩、メンブレンをインキュベートした。メンブレンをＴＢＳ－Ｔに浸漬して５分間穏やかに振とうしながら洗浄した。洗浄操作を３回繰り返した後、ブロッキング緩衝液を用いてヤギ抗マウスＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）－Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ複合体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、カタログ番号：１７０－６５１６）を１：２，５００（ＤＹＳ１）あるいは１：１０，０００（ＧＡＰＤＨ）に希釈し、メンブレンに６０分間浸漬した後、再びＴＢＳ－Ｔを用いて３回洗浄した。ＥＣＬ　Ｐｒｉｍｅ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、カタログ番号ＲＰＮ２２３２）を用いて、検出液を添付のプロトコルとおりに調製し、メンブレン上に滴下した。室温で９０秒インキュベートした後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ　Ｔｏｕｃｈ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ　社、カタログ番号：１７０８３７０）を用いて発行を検出した。
　検出画像をＩｍａｇｅ　Ｌａｂ　ソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて解析し、直線回帰分析を実施した。ウエスタンブロットゲルにはそれぞれ、野生型マウスの前脛骨筋、大腿四頭筋、心臓または横隔膜から抽出した全タンパク質を１００％、５０％、２５％、１２．５％、６．２５％および３．１２５％に希釈してアプライし、ジストロフィン量の標準曲線として用いた。ジストロフィンのバンド強度と標準曲線とを比較することにより、ジストロフィンタンパク質レベルを野生型ジストロフィンレベルに対するパーセント（％ＷＴ）として求めた。
（２）評価結果
　それぞれ上記のとおりに、エクソン２３スキッピングの割合をＲＴ－ＰＣＲにより測定し、ジストロフィンタンパク質の発現をウエスタンブロットにより定量化した（図１１～１４）。
　ＰＰＭＯ　Ｎｏ．１は、前脛骨筋、大腿四頭筋、心臓、横隔膜の１２０ｍｇ／ｋｇ投与において非常に高いスキッピング活性を示し、非常に強いジストロフィンタンパク質の発現を誘導した。前脛骨筋、大腿四頭筋、横隔膜の１２０ｍｇ／ｋｇ投与においては、投与から６０日後においてもその効果が見られた。また、心臓の１２０ｍｇ／ｋｇ投与においては、投与から３０日後においてもその効果が見られ、投与から６０日後においてもジストロフィンタンパク質の発現が見られた。なお、心臓においては、他のペプチドを連結したＰＰＭＯと比較して効果が高い傾向が見られた（データ示さず）。
［実施例９：アミドリンカー（Ａｈｘアミドリンカー）またはシステイン－マレイミド（Ｃｙｓ－Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）リンカーで連結されたＰＰＭＯの合成および精製］
　ＰＭＯ　Ｎｏ．２、３、５～７、８～１０、１２、２２、２５、２９、３１～３３を用いて、実施例２－１、実施例２－２および実施例３に記載した手法と同様の手法で合成および精製を行い、目的化合物を得た（表８、ＰＰＭＯ　Ｎｏ．１３～４２）。
　得られたＰＰＭＯの分子量の理論値、ESI-TOF-MSでの分子量の実測値を表中に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000049
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000050
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000051
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000052
［実施例１０：ＲＤ細胞薬効試験］
（１）試験方法
　ＲＤ細胞（ヒト横紋筋肉腫細胞株、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入、ＪＣＲＢ９０７２）　４．０×１０４個を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ニチレイ）を含むＭｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉａ（ＭＥＭ）培地（シグマ）０．５ｍＬ中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。
　細胞に対して、表１、表８に示すアンチセンスオリゴマー（モルフォリノ核酸（ＰＭＯ）またはペプチド修飾型モルフォリノ核酸（ＰＰＭＯ））を３０、５０、または１００μＭで処置し、さらに３７℃、５％ＣＯ２条件下で二晩培養した。
培養後の細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、１％の２－メルカプトエタノール（シグマアルドリッチジャパン）を含むＢｕｆｆｅｒ　ＲＡ１（タカラバイオ）３５０μＬを細胞に添加し、数分間室温に放置して細胞を溶解させ、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）　Ｆｉｌｔｅｒ（タカラバイオ）上に回収した。１１，０００×ｇで１分間遠心し、ホモジネートを作製した。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ（タカラバイオ）に添付のプロトコルに従って全ＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡの濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ　Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて測定した。
　抽出した全ＲＮＡ　２００ｎｇに対し、ＱＩＡＧＥＮ　ＯｎｅＳｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔ（キアゲン）およびサーマルサイクラーを用いてＯｎｅ－Ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲを行った。上記キットに添付のプロトコルに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはＴａｋａｒａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｔｏｕｃｈ（タカラバイオ）を用いた。用いたＲＴ－ＰＣＲのプログラムは、以下のとおりである。
　　５０℃、３０分間：逆転写反応
　　９５℃、１５分間：ポリメラーゼ活性化、逆転写酵素不活化、ｃＤＮＡ熱変性
　　［９４℃、３０秒間；６０℃、３０秒間；７２℃、１分間］×３５サイクル：ＰＣＲ増幅
　　７２℃、１０分間：最終伸長反応
　各エクソンスキッピング評価のＲＴ－ＰＣＲに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下のとおりである。
エクソン４４、エクソン４５
　フォワードプライマー：５’－ＧＣＴＣＡＧＧＴＣＧＧＡＴＴＧＡＣＡＴＴ－３’（配列番号１９５）
　リバースプライマー：５’－ＧＧＧＣＡＡＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＡＧＴＡ－３’（配列番号１９６）
エクソン５０
フォワードプライマー：５’－ＡＡＣＡＡＣＣＧＧＡＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧ－３’（配列番号１９７）
　リバースプライマー：５’－ＴＴＧＧＡＧＡＴＧＧＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴ－３’（配列番号１９８）
エクソン５１、エクソン５３
フォワードプライマー：５’－ＣＴＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＡＣ－３’（配列番号１９９）
　リバースプライマー：５’－ＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＧＴＣＡ－３’（配列番号２００）
エクソン５５
フォワードプライマー：５’－ＣＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＡＴ－３’（配列番号２０１）
　リバースプライマー：５’－ＣＴＧＣＣＧＧＣＴＴＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴ－３’（配列番号２０２）
　上記ＰＣＲの反応産物２μＬを、ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所）を用いて解析した。
　それぞれの対象エクソンがスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、野生型のバンドのポリヌクレオチド量「Ｂ」をバンドのシグナル強度として測定した。これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。
　　スキッピング効率（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）×１００
（２）試験結果
　各アンチセンスオリゴマー（ＰＭＯまたはＰＰＭＯ）で処置した細胞について、得られた各エクソンスキッピング効率の結果を図１５～２２に示す。図１５～２２に示される結果から、表８のＡｈｘアミドリンカーを介してペプチドが連結された各アンチセンスオリゴマー（ＰＰＭＯ　Ｎｏ．１３、Ｎｏ．１５、Ｎｏ．１７～Ｎｏ．１９、Ｎｏ．２３～Ｎｏ．２５、Ｎｏ．２９～Ｎｏ．３１、Ｎｏ．３５～Ｎｏ．３７、Ｎｏ．４３）及びＣｙｓ－Ｍａｌｅｉｍｉｄｅリンカーを介して連結された各アンチセンスオリゴマー（ＰＰＭＯ　Ｎｏ．１４、Ｎｏ．１６、Ｎｏ．２０～Ｎｏ．２２、Ｎｏ．２６～Ｎｏ．２８、Ｎｏ．３２～Ｎｏ．３４、Ｎｏ．３８～Ｎｏ．４０、Ｎｏ．４４）は、ＰＭＯが同一でペプチドが連結されていない表１の各アンチセンスオリゴマー（ＰＭＯ　Ｎｏ．２、ＰＭＯ　Ｎｏ．３、ＰＭＯ　Ｎｏ．５～ＰＭＯ　Ｎｏ．１２、ＰＭＯ　Ｎｏ．２２、ＰＭＯ　Ｎｏ．２５、ＰＭＯ　Ｎｏ．２９、ＰＭＯ　Ｎｏ．３１、ＰＭＯ　Ｎｏ．３２）と比較して、高い効率で各エクソンをスキッピングさせることが判明した。また、図１５～２２に示される結果から、表８のＡｈｘアミドリンカーを介してペプチドが連結された各アンチセンスオリゴマー（ＰＰＭＯ　Ｎｏ．１３、Ｎｏ．１５、Ｎｏ．１７～Ｎｏ．１９、Ｎｏ．２３～Ｎｏ．２５、Ｎｏ．２９～Ｎｏ．３１、Ｎｏ．３５～Ｎｏ．３７、Ｎｏ．４３）は、ＰＭＯが同一でＣｙｓ－Ｍａｌｅｉｍｉｄｅリンカーを介してペプチドが連結された各アンチセンスオリゴマー（ＰＰＭＯ　Ｎｏ．１４、Ｎｏ．１６、Ｎｏ．２０～Ｎｏ．２２、Ｎｏ．２６～Ｎｏ．２８、Ｎｏ．３２～Ｎｏ．３４、Ｎｏ．３８～Ｎｏ．４０、Ｎｏ．４２）と比較して、少なくとも同等の、あるいはより高い効率で各エクソンをスキッピングさせる傾向があることが判明した。

Claims (33)

  1. 　ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節する、又は標的となるＲＮＡ若しくはその標的領域の機能を阻害する、核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物と、
    　前記核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物に連結された、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１）のアミノ酸配列、又は配列番号１において１又は２個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列（ただし、配列番号１のＮ末端から８位及び９位の両方のアミノ酸が置換されたものを除く）を含むキャリアペプチドと、
    を含み、
    　前記核酸がアンチセンスオリゴマー、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される、
    キャリアペプチドが連結された核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
  2. 　前記核酸がアンチセンスオリゴマーであり、ジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡの少なくとも１つのエクソンをスキッピングさせる、請求項１に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
  3. 　前記エクソンはエクソン２３、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、及び５５からなる群から選択される、請求項２に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
  4. 　前記キャリアペプチドが、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
  5. 　前記キャリアペプチドが、前記核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物の３’末端に連結されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
  6. 　前記キャリアペプチドと、前記核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物が、連結部分を介して連結されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
  7. 　前記連結部分がリンカーである、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
  8. 　前記リンカーが、ペプチド性リンカー、又は非ペプチド性リンカーである、請求項７に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
  9. 　前記ペプチド性リンカーが、非天然のアミノ酸を含む、請求項８に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
  10. 　前記非ペプチド性リンカーが、アルキルリンカー、ＰＥＧ、マレイミド－チオール付加体（maleimide-thiol adducts）からなる群から選択される、請求項８に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
  11. 　以下：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    からなる群から選択される構造を有し、
    ここで、nucleic acidは前記核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物を表し、peptideは前記キャリアペプチドを表す、請求項６～１０のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
  12. 　前記キャリアペプチドが、そのＣ末端において前記リンカーに連結している、請求項６～１１のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物。
  13. 　ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを調節する、又は標的となるＲＮＡ若しくはその標的領域の機能を阻害する、核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物と、
    ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１）のアミノ酸配列、又は配列番号１において１又は２個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列を含むキャリアペプチド（ただし、配列番号１のＮ末端から８位及び９位の両方のアミノ酸が置換されたものを除く）と、
    を含み、
    　前記核酸がアンチセンスオリゴマー、ｓｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される、
    複合体。
  14. 　前記核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物と前記キャリアペプチドが静電的相互作用により結合している、請求項１３に記載の複合体。
  15. 　前記核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物がリポソーム中に存在し、前記リポソーム上にキャリアペプチドが結合している、請求項１３に記載の複合体。
  16. 　前記核酸がアンチセンスオリゴマーであり、ジストロフィンｐｒｅ－ｍＲＮＡのエクソンをスキッピングさせる、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の複合体。
  17. 　前記エクソンはエクソン２３、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、及び５５からなる群から選択される、請求項１６に記載の複合体。
  18. 　前記キャリアペプチドが、ＫＫＲＴＬＲＫＳＮＲＫＫＲ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の複合体。
  19. 　前記核酸が、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は請求項１３～１８のいずれか一項に記載の複合体。
  20. 　前記ｐｒｅ－ｍＲＮＡが、ヒト由来のｐｒｅ－ｍＲＮＡである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
  21. 　前記エクソンはエクソン４４であり、前記核酸は、配列番号４の塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
  22. 　前記エクソンはエクソン４５であり、前記核酸は、配列番号２９～３３から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
  23. 　前記エクソンはエクソン４５であり、前記核酸は、配列番号３０、３２、及び３３から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
  24. 　前記エクソンはエクソン５０であり、前記核酸は、配列番号９～１２から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
  25. 　前記エクソンはエクソン５１であり、前記核酸は、配列番号５～８から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
  26. 　前記エクソンはエクソン５１であり、前記核酸は、配列番号６～８から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
  27. 　前記エクソンはエクソン５３であり、前記核酸は、配列番号３の塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
  28. 　前記エクソンはエクソン５５であり、前記核酸は、配列番号１３～２８から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
  29. 　前記エクソンはエクソン５５であり、前記核酸は、配列番号１３、２３、及び２６から選択される塩基配列を含む、又は当該塩基配列からなる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体。
  30. 　請求項１～２９のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体を含む医薬組成物。
  31. 　さらに医薬的に許容可能な担体を含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
  32. 　筋ジストロフィーの治療のための、請求項３０又は３１に記載の医薬組成物。
  33. 　請求項１～２９のいずれか一項に記載の核酸若しくはその医薬的に許容可能な塩又はそれらの水和物、又は複合体、又は請求項３０～３２のいずれか一項に記載の医薬組成物を筋ジストロフィー患者に投与する工程を含む、筋ジストロフィーの治療方法。
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