JP2022014707A - キャリアペプチドフラグメントおよびその利用 - Google Patents

キャリアペプチドフラグメントおよびその利用 Download PDF

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Abstract

Figure 2022014707000001
【課題】真核細胞の細胞質内に目的とする外来物質をより効率よく導入する技術を提供すること。
【解決手段】ここに開示される真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質をインビトロにおいて導入する方法は、（１）配列番号１から成るキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した上記目的とする外来物質と、を有する外来物質導入用構築物を用意する工程と、（２）上記外来物質導入用構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と、（３）上記外来物質導入用構築物が供給された上記試料をインキュベートして、上記試料中の真核細胞内に上記構築物を導入する工程と、を包含する。
【選択図】図１

Description

本発明は、キャリアペプチドフラグメントおよびその利用に関する。詳しくは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるキャリアペプチドフラグメントを用いて、外来物質を真核細胞に導入することに関する。
従来から、ヒトやそれ以外の哺乳動物等の細胞（真核細胞）内に、ポリペプチドや核酸等の外来物質、とりわけ生理活性物質を導入する技術が用いられている。かかる技術では、外来物質を導入した細胞（さらには該細胞から成る組織や器官）の形質が転換されたり、機能が改善・向上されたりする。
ポリペプチドや核酸等の外来物質を真核細胞内に導入する手段としては、例えば特許文献１および非特許文献１に記載されるように、細胞膜透過性ペプチドを使用することが挙げられる。特許文献１では、キャリアペプチドフラグメントと生理活性物質とを結合して外来物質導入用構築物を形成している。かかる構築物を真核細胞（幹細胞）に供給することで、生理活性物質を細胞内に導入している。そして、当該真核細胞が分化誘導され得ることが、この特許文献には記載されている。非特許文献１では、特許文献１とは異なる構成の細胞膜透過性ペプチドが開示されている。かかる細胞膜透過性ペプチドとオリゴヌクレオチドとのコンジュゲートは、筋強直性ジストロフィーの治療薬になり得る旨が記載されている。
国際公開第２０１１／０１３７００号公報
ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション(The Journal of Clinical Investigation)、１２９巻、２０１９年、ｐｐ．４７３９－４７４４ ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY)、２８１巻３５号、２００６年、ｐｐ．２５２２３－２５２３０ ＰＮＡＳ、９５巻、１９９８年、ｐｐ．１１４－１１９
近年では、膜透過性ペプチドに対する関心がますます高まってきている。そして、外来物質を目的とする細胞に導入する効率を従来よりも向上させる技術の開発が望まれている。
本発明はかかる点を鑑みて創出されたものであり、真核細胞の細胞質内に、目的とする外来物質をより効率よく導入する技術の提供を目的（課題）とする。
本発明者は、種々のアミノ酸配列を有する合成ペプチドの細胞膜透過性を評価するために、スクリーニングを行った。そして、優れた細胞膜透過性を有し、キャリアペプチド（キャリアペプチドフラグメント）として好ましく使用し得るアミノ酸配列を見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、ここで開示される技術によると、真核細胞（特に細胞壁を有しないヒトやそれ以外の哺乳動物に代表される種々の動物細胞）の外部（即ち細胞膜の外側）から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質をインビトロにおいて導入する（移送する）方法が提供される。
当該方法は、
（１）以下のアミノ酸配列：
ＴＬＫＥＲＣＬＱＶＶＲＳＬＶＫＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）
から成るキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した前記目的とする外来物質と、を有する外来物質導入用構築物を用意する工程と、
（２）前記外来物質導入用構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と、
（３）前記外来物質導入用構築物が供給された前記試料をインキュベートして、前記試料中の真核細胞内に前記構築物を導入する工程と、
を包含する。
ここで、「外来物質」とは、上記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側又はＣ末端側に直接的又は適当なリンカーを介して間接的に結合可能な無機化合物及び有機化合物であって、真核細胞内に導入可能な分子サイズ及び化学的性質を有するものをいう。
上記の構成によると、目的とする外来物質を上記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に直接的又は適当なリンカーを介して間接的に結合させて構築した外来物質導入用構築物を、目的とする真核細胞を含む試料（典型的には該細胞を含む培養物）中に供給する（即ち生存する真核細胞に添加する）ことによって、当該目的の外来物質を真核細胞の外部（細胞膜の外側）から細胞膜を通過させて細胞質内に効率よく導入することができる。
好ましい一態様では、前記外来物質は、ポリペプチド、核酸、色素及び薬剤から成る群から選択されるいずれかの有機化合物である。
ここで、「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合により結合した構造を有するポリマーをいう。ポリペプチドは、ペプチド結合の数（即ち、アミノ酸残基数）によって限定されない。即ち、ポリペプチドは、アミノ酸残基数が１０以上３００未満程度の一般にペプチドと呼ばれるものと、一般にタンパク質（典型的には３００以上のアミノ酸残基から成る高分子化合物）と呼ばれるものとを包含する。当該分野においては、ポリペプチドとタンパク質とは厳密に区分されていない。本明細書においては、複数のアミノ酸残基から成るポリマー（オリゴマーを包含する。）を、ポリペプチドと総称する。
また、「核酸」とは、ヌクレオチドの重合体をいい、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。。「核酸」は、塩基数によって限定されない。
好ましい一態様では、前記外来物質は、何れかの生物種由来の成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドであり、前記外来物質導入用構築物は、該外来物質としての成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドに対応するアミノ酸配列と前記キャリアペプチドフラグメントのアミノ酸配列とを有する合成ポリペプチドである。
かかる構成によると、上記成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列と、キャリアペプチドフラグメントのアミノ酸配列とを有する合成ペプチドを、目的とする真核細胞内に導入することができる。
好ましくは、前記外来物質としての成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドに対応するアミノ酸配列は、前記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側に配置されている。
かかる構成によると、上記成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列を、より効率よく、目的とする真核細胞内に導入することができる。
また、好ましい一態様では、前記外来物質導入用構築物を導入する対象の真核細胞がヒト又はヒト以外の哺乳動物の細胞である。
かかる構成は、外来物質をヒト又はヒト以外の哺乳動物の細胞に導入する場合に好適である。
また、ここで開示される技術によると、真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質を導入するために作製された外来物質導入用構築物が提供される。
当該外来物質導入用構築物は、
以下のアミノ酸配列：
ＴＬＫＥＲＣＬＱＶＶＲＳＬＶＫＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）
から成るキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した前記目的とする外来物質と、を有する。
かかる構成の外来物質導入用構築物を使用すると、目的とする真核細胞に、効率よく所望の外来物質を導入することができる。
実施例２において、フローサイトメータを用いた解析で得られた代表的なヒストグラムである。Ｘ軸は蛍光強度を示している。Ｙ軸は細胞数を示している。
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。本明細書において特に言及している事項（例えばキャリアペプチドフラグメントの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチドの化学合成法、細胞培養技法、ペプチドや核酸を成分として含む組成物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、アミノ酸を１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。
本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
また、本明細書において「合成ペプチド」とは、そのペプチド鎖がそれのみ独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成あるいは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の組成物中で安定して存在し得るペプチド断片をいう。ここで「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、アミノ酸残基の数によって限定されない。
また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側である。
ここで開示される外来物質導入用構築物は、
以下のアミノ酸配列：
ＴＬＫＥＲＣＬＱＶＶＲＳＬＶＫＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）
から成るキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した前記目的とする外来物質と、を有する。
「キャリアペプチドフラグメント」は、配列番号１に示すアミノ酸配列により規定（把握）される配列であって、真核細胞の細胞膜透過性を発揮させるアミノ酸配列である。
上記のとおり、本発明者はスクリーニングによって、配列番号１に示されるアミノ酸配列が優れた細胞膜透過性を有するキャリアペプチドフラグメントであることを見出した。また、本発明者は、下記実施例に示すとおり、今回の検討によって、かかるアミノ酸は、従来の膜透過性ペプチド配列（特許文献１、非特許文献１、２参照）よりも、さらに優れた細胞膜透過性を有することを見出した。
配列番号１に示すアミノ酸配列は、ＶＨＬ（フォン・ヒッペル・リンド）タンパク質のアミノ酸配列の第１５７番目～第１７１番目までの１５個の連続するアミノ酸残基から成るアミノ酸配列、および、ＬＩＭキナーゼ２（LIM Kinase 2）の第４９１番目のアミノ酸残基から第５０３番目のアミノ酸残基までの合計１３アミノ酸残基から成るアミノ酸配列が直接結合されてなるアミノ酸配列である。
なお、ＶＨＬタンパク質は、神経分化誘導性を示すことが知られている（非特許文献３）。また、ＬＩＭキナーゼ２細胞内情報伝達に関与するプロテインキナーゼの１種であり、ヒト内皮細胞に存在することが知られている。
上記ＬＩＭキナーゼ２の１３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、ＮｏＬＳであることが知られている（特許文献１、非特許文献２）。そのため、配列番号１に示されるアミノ酸配列は、外来物質を外部から少なくとも該細胞の細胞質内に導入することができる。かかるアミノ酸配列は、外来物質をさらに核内（核膜の内部）に導入することができる。
「キャリアペプチドフラグメント」は、典型的には、配列番号１に示すアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列である。「キャリアペプチドフラグメント」は、細胞膜透過性を損なわない限りは、かかるアミノ酸配列の改変配列を包含する。ここで、「改変配列」とは、１個または数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列（改変アミノ酸配列）である。そのような軽微な改変配列は、ここで開示される情報に基づいて当業者にとって容易に利用され得るため、ここで開示される技術的思想としての「キャリアペプチドフラグメント」に包含される。
本明細書における改変配列の典型例としては、例えば、１個、２個または３個のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列や、所定のアミノ酸配列について１個、２個または３個のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等が挙げられる。同類置換の典型例としては、例えば、塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列（例えばリジン残基とアルギニン残基との相互置換）や、疎水性アミノ酸残基が別の疎水性アミノ酸残基に置換した配列（例えばロイシン残基、イソロイシン残基、およびバリン残基の相互置換）等が挙げられる。
ここで開示される外来物質導入用構築物は、上述のキャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に、所望する外来物質を直接的又は適当なリンカーを介して間接的に結合（連結）することによって設計・構築され得る。
リンカーは、特に限定されるものではないが、ペプチド性リンカーであってもよく、非ペプチド性リンカーであってもよい。特に限定されるものではないが、ペプチド性リンカーを構成するアミノ酸配列は立体障害を生じさせず、かつ、柔軟なアミノ酸配列であることが好ましい。ペプチド性リンカーは、例えば、グリシン、アラニン、およびセリン等から選択されるアミノ酸残基を１種または２種以上含む、１０個以下（より好ましくは１個以上５個以下、例えば１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸残基）のアミノ酸残基からなるリンカーであり得る。また、かかるリンカーとして、βアラニンを用いてもよい。非ペプチド性リンカーとしては、特に限定されるものではないが、例えばアルキルリンカー、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）リンカー、アミノヘキサノイルスペーサ等を用いてもよい。
外来物質は、典型的にはポリペプチド、核酸、色素、薬剤等の有機化合物である。
外来物質は、例えば、ポリペプチドであり得る。外来物質がポリペプチドである場合には、該ポリペプチドを構成するアミノ酸配列と、キャリアペプチドフラグメントを構成するアミノ酸配列とを含むようにペプチド鎖を設計し、該ペプチド鎖を生合成或いは化学合成することによって、目的の外来物質導入用構築物を作製することができる。
また、外来物質は、例えば、種々のＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸、色素（例えばＦＩＴＣ等の種々の蛍光色素化合物）、あるいは薬剤（例えば５－フルオロウラシル（５ＦＵ）等の核酸系抗腫瘍剤を含む抗腫瘍剤やアジドチミジン（ＡＺＴ）等の抗ウイルス剤等）等の有機化合物であってもよい。
上記のとおり、外来物質は、導入の目的となる真核細胞において、種々の機能を有する。特に限定するものではないが、外来物質が有する機能は、例えば、幹細胞の分化誘導の促進（幹細胞分化誘導活性）、腫瘍細胞の増殖抑制（抗腫瘍活性）、ウイルス感染細胞の増殖抑制（抗ウイルス活性）等であり得る。
かかる有機化合物を従来公知の種々の化学的手法により、上述のキャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に直接的若しくは間接的に結合させて外来物質導入用構築物を構築することができる。
キャリアペプチドフラグメントと結合する外来物質の数は特に限定されない。即ち、１のキャリアペプチドフラグメントに対して１又はそれ以上の外来物質を結合させてもよい。特に限定するものではないが、例えば、１のキャリアペプチドフラグメントのＮ末端側にポリペプチド、核酸、薬剤等を結合させておき、Ｃ末端側に色素を結合させてもよい。キャリアペプチドフラグメントに色素を結合させることは、外来物質導入用構築物の導入効率を評価する観点において好ましい。
なお、外来物質がポリペプチドの場合、採用するポリペプチド（アミノ酸配列）は、特に限定されない。例えばアミノ酸残基数が１００～１０００程度のポリペプチド若しくはタンパク質のような、比較的アミノ酸残基数が多いものも外来物質として採用し得る。
典型的には、外来物質導入用構築物として作製する合成ペプチドは、総アミノ酸残基数が数個乃至数十個（例えば１０個）以上である。かかる総アミノ酸残基数は、１０００以下が適当であり、好ましくは６００以下であり、さらに好ましくは５００以下であり、特に３００以下（例えば１０～３００）が好適である。このような長さのポリペプチドは合成（生合成、化学合成）が容易であり、使用しやすい。
外来物質としては、種々の細胞や組織（器官）の発生、分化、増殖、がん化、ホメオスタシス（恒常性）、代謝の調節、等の機能にかかわるポリペプチドの成熟型或いは前駆体（プロ型、プレプロ型を包含する。）が好ましい。また、機能が従来知られていないポリペプチドを細胞内に導入して当該ポリペプチドの細胞内（生体組織内）における機能の解明に本発明を実施することもできる。
例えば、外来物質の導入する対象となる真核細胞がヒトその他哺乳動物の幹細胞である場合、当該幹細胞の分化誘導に関与する種々の生理活性を有するポリペプチドの成熟型又はその前駆体の利用が好ましい。なお、「幹細胞」は、体性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（Induced pluripotent stem cells：以下ｉＰＳ細胞という。）を包含する。また、外来物質の導入する対象となる真核細胞ががん細胞（腫瘍細胞）である場合、当該がん細胞（腫瘍細胞）のアポトーシス誘導に関与する種々のポリペプチドの利用が好ましい。あるいは、この場合においては、がん細胞（腫瘍細胞）が免疫監視機構の機能を抑制することを阻害し得るポリペプチドの利用が好ましい。さらに、導入の対象となる真核細胞が細菌感染細胞やウイルス感染細胞である場合、当該感染細胞のアポトーシス誘導に関与する種々のポリペプチドや、当該感染細胞において細菌もしくはウイルスが増殖することを抑制し得るポリペプチドや、当該感染細胞から細菌もしくはウイルスの感染が拡大することを抑制し得るポリペプチドの利用が好ましい。
なお、キャリアペプチドフラグメントと同様、外来物質としてのポリペプチドは、その機能を保持する限り、１個または数個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成される改変アミノ酸配列を含んでいてもよい。
ここで開示される外来物質導入用構築物は、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されているものが好ましい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基をアミド化すると、外来物質導入用構築物におけるペプチド部分の構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）を向上させることができる。
例えば、キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側に外来物質が結合している場合、キャリアペプチドフラグメントのＣ末端アミノ酸残基をアミド化することが好ましい。また、例えば外来物質がポリペプチドであり、かかるポリペプチドがキャリアペプチドフラグメントのＣ末端側に結合している場合は、当該ポリペプチドのＣ末端アミノ酸残基をアミド化することができる。
ここで開示される外来物質導入用構築物における、少なくともキャリアペプチドフラグメントを含むペプチド部分は、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。
市販のペプチド合成機を用いた固相合成法により、上記のペプチド部分として、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
或いは、遺伝子工学的手法に基づいてペプチド部分を生合成により作製してもよい。即ち、所望するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を合成する。そして、合成したポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチド部分を単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的のペプチド部分を得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち、外来物質導入用構築物のペプチド部分のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド部分の合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の（株）セルフリーサイエンスから入手可能）が市販されている。
ここで開示される外来物質導入用構築物のペプチド部分をコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。即ち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、かかるアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
ここで開示される外来物質導入用構築物は、外来物質の機能に基づく用途の組成物の有効成分として好適に使用し得る。なお、外来物質導入用構築物は、外来物質の機能を失わない限りにおいて塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る酸付加塩を使用することができる。従って、本明細書および特許請求の範囲に記載の「外来物質導入用構築物」は、かかる塩形態のものを包含する。
ここで開示される外来物質導入用構築物の組成物は、有効成分としての外来物質導入用構築物のほか、使用形態に応じて医薬（薬学）上許容され得る種々の担体を含み得る。
上記担体としては、例えば、希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。かかる担体としては、外来物質導入用構築物の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。また、かかる担体は、適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得、或いはリポソームであってもよい。また、医薬用組成物に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
組成物の形態は、特に限定されない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
外来物質導入用構築物（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。
上記のように提供される組成物は、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって患者(即ち生体)に所望する量だけ投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。これによって、生体内で所望の活性を得ることができる。そのため、種々の疾患において、病態を改善することができる。
ここで開示される組成物（外来物質導入用構築物）を用いて、生体内（インビボ）、または、生体外（インビトロ）において外来物質導入用構築物を導入する方法が提供される。当該方法では、おおまかにいって、以下の（１）～（３）の工程を包含する。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるキャリアペプチドフラグメントと、該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した前記目的とする外来物質と、を有する外来物質導入用構築物を用意する工程
（２）外来物質導入用構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程
（３）外来物質導入用構築物が供給された試料をインキュベートして、該試料中の真核細胞内にかかる構築物を導入する工程
上記「真核細胞」は、インビボにおいては、例えば種々の組織、臓器、器官、血液、およびリンパ液等を包含する。上記「真核細胞」は、インビトロにおいては、例えば生体から摘出された種々の細胞塊、組織、臓器、器官、血液、およびリンパ液ならびに、セルライン等を包含する。
ここで開示される組成物は、その形態および目的に応じた方法や用量で使用することができる。例えば、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって患者(即ち生体)の患部（例えば悪性腫瘍組織、ウイルス感染組織、炎症組織等）に所望する量だけ投与することができる。あるいは、錠剤等の固体形態のものや軟膏等のゲル状若しくは水性ジェリー状のものを、直接所定の組織（即ち、例えば腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、炎症細胞等を含む組織や器官等の患部）に投与することができる。あるいは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。経口投与の場合は、消化管内での消化酵素分解を抑止すべくカプセル化や保護（コーティング）材の適用が好ましい。
あるいは、生体外（インビトロ）において培養している真核細胞に対し、ここで開示される組成物の適当量（即ち、外来物質導入用構築物の適当量）を、少なくとも１回、目的とする真核細胞の培養液に供給するとよい。１回当たりの供給量および供給回数は、培養する真核細胞の種類、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。例えば、培養液中のキャリアペプチドフラグメント濃度が概ね０．０５μＭ以上１００μＭ以下の範囲内、例えば０．５μＭ以上５０μＭ以下の範囲内となるように、１回、２回またはそれ以上の複数回添加することが好ましい。
なお、インビトロにおける導入方法について、一例を下記実施例において示している。
外来物質導入用構築物の導入効率を評価する方法は、特に限定されない。かかる評価においては、例えば導入された細胞の変化（形態学的な変化や増殖率の変化等）を観察すればよい。キャリアペプチドフラグメントに色素が結合している場合には、顕微鏡観察（例えば蛍光顕微鏡観察）やフローサイトメトリー等を使用して、真核細胞への導入効率を評価することができる。
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
＜実施例１：外来物質導入用構築物の作製＞
表１に示す３種の合成ペプチド（ペプチド１～３）を用意した。具体的には次のとおりである。
ペプチド１は、ここで開示される配列番号１に示されるキャリアペプチドフラグメントからなるペプチドである。
ペプチド２は、ＬＩＭキナーゼ２のＮｏＬＳからなるペプチドである（配列番号２）。
ペプチド３は、上記非特許文献１で開示されている細胞膜透過性ペプチドＰｉｐ６ａである（配列番号３）。なお、表１の「配列」欄中、「Ｘ」はaminohexanoic acidを示している。同欄中、「Ｂ」はβ－アラニンを示している（表２についても同様である。）。
ペプチド１およびペプチド２はいずれも、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）はアミド化（－ＣＯＮＨ２）されている。ペプチド１およびペプチド２はいずれも、市販のペプチド合成機を用いてマニュアルどおりに固相合成法（Ｆｍｏｃ法）を実施することによって、合成された。ペプチド３はケンブリッジリサーチバイオケミカルズ社製の市販品（カタログ番号：ｃｒｂ１０００３５２ｈ）である。
なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
Figure 2022014707000002
ペプチド１およびペプチド２のＮ末端側のアミノ酸残基、ならびにペプチド３のＣ末端側のアミノ酸残基と、外来物質としての蛍光色素とを結合させた。このように、３つの外来物質導入用構築物を作製した。具体的には、蛍光色素として一般的なＦＡＭ（即ち、Ｃ２１Ｈ１２Ｏ７：5(6)-Carboxyfluorescein、分子量３７６．３、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を常法に基づいてペプチド１およびペプチド２のＮ末端側、ならびにペプチド３のＣ末端側に直接結合させ、ペプチド１～３に基づく外来物質導入用構築物を作製した。
ペプチド１に基づく外来物質導入用構築物の構成を表２に示す。以下、これをサンプル１と呼称する。
ペプチド２に基づく外来物質導入用構築物の構成を表２に示す。以下、これをサンプル２と呼称する。
ペプチド３に基づく外来物質導入用構築物の構成を表２に示す。以下、これをサンプル３と呼称する。
こうして得られた各サンプルをそれぞれＤＭＳＯに希釈し、サンプル濃度が２ｍＭのサンプル溶液（ストック）を計３種類作製した。
Figure 2022014707000003
＜実施例２：サンプル１～３の細胞膜透過機能評価＞
真核細胞としてＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん細胞由来の樹立細胞株）を使用し、上記実施例１で得られた３種のサンプル（外来物質導入用構築物）の細胞膜透過機能を調べた。
本実施例において、以下に示すように使用するペプチドの種類に応じて例１～３を設定した。また、例４，５として、ペプチド無添加区を設定した。以下合計５の区分の試験を以下のとおり実施した。なお、以下に記載の濃度は、下記の２０時間のインキュベートの際の最終濃度である。
例１：サンプル１ １０μＭ
例２：サンプル２ １０μＭ
例３：サンプル３ １０μＭ
例４：サンプル（ペプチド）添加なし、ＦＡＭ １０μＭ
例５：サンプル（ペプチド）添加なし
なお、いずれの例でも、下記２０時間のインキュベートの際にＤＭＳＯの濃度が０．５％となるように調製した。また、上記各例の試験ウェル数（ｎ）を、いずれも３に設定した。
－例１－
９０％イーグルＭＥＭ培地（０．１％の非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムを含む。）および１０％血清（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）の混合液を培養液として使用し、ＨｅＬａ細胞を培養した。
ＨｅＬａ細胞に対して、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液で３７℃３分間のトリプシン処理を行った。上記処理後、上記培養液を用いてトリプシンを失活させた。遠心分離を行い、その遠心上清を取り除いた。遠心分離によって得られた細胞ペレットを、フレッシュな培養液で懸濁した。当該培養液により細胞濃度が凡そ１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルとなる細胞懸濁液（外来物質導入用の試料）を調製し、市販の６ウェルプレート（Ｉｗａｋｉ社製）の各ウェルに２ｍｌずつ播種した。そして、５％ＣＯ２条件下、３７℃で４時間培養し、播種した細胞の接着を確認した。
次いで、上記４時間培養後のウェルから、培養上清を１ｍｌ取り除き、サンプル１を２０μＭの濃度で含む培養液を添加した。即ち、ウェル中の最終サンプル濃度は１０μＭであった。
そして、プレートを５％ＣＯ２条件下、３７℃で２０時間インキュベートした。
かかる２０時間のインキュベート後、細胞を１ｍｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄した。次いで、２００μＬ／ウェルの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いてウェル中の細胞を３７℃で３分間処置した。次いで、さらに４００μＬ／ウェルの培養液を添加して細胞をチューブに回収した。その後、さらに６００μＬ／ウェルのＰＢＳでウェルを洗浄して、さらにウェル中に残った細胞を上記チューブに回収した。このチューブを４℃、２１０×ｇの条件で５分間遠心分離した。遠心上清を取り除き、細胞ペレットを１ｍｌのＰＢＳで懸濁（洗浄）し、上記と同じ条件で遠心分離した。この操作を２回繰り返した。
そして、回収された細胞について、フローサイトメータを用いた解析を行った。フローサイトメータとしては、Ｏｎ－Ｃｈｉｐ Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ(On-Chip Biotechnologies Co.,LTD.）製）を使用した。
かかる解析において、上記のようにして得られた細胞を５０μｌのＰＢＳで懸濁した。この懸濁液に、さらに５０μｌの上記フローサイトメータ用の２×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加えて、解析用の細胞懸濁液を用意した。
上記のフローサイトメータを用いて前方散乱（ｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅｒ：ＦＳＣ）および側方散乱（ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳＣ）に基づくゲーティングを行い、測定対象とする細胞集団についてのゲートを設定した。次いで、かかるゲート内の細胞集団について、蛍光強度を測定した。１つの測定試料あたり１００００個の測定対象細胞の蛍光強度を測定した。測定には、フローサイトメータのレーザランプＦＬ２を使用した。かかる測定結果について、市販の解析ソフト「ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）」（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）を用いて解析を行い、測定対象細胞集団の平均蛍光強度（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＭＦＩ）を得た。
－例２，３－
サンプルの種類をサンプル２（例２）、サンプル３（例３）とした以外は例１と同じ材料およびプロセスで例２，３を行った。
－例４－
本例では、サンプルの添加を行わず、ＦＡＭを上記の濃度で添加した。それ以外は例１と同じ材料およびプロセスで例４を行った。
－例５－
本例では、サンプルおよびＦＡＭのいずれも添加しなかった。それ以外は例１と同じ材料およびプロセスで例５を行った。
例１～５について得られた結果を、図１および表３に示す。図１には、フローサイトメトリーで得られた代表的なデータ（ヒストグラム）を示す。表３には、図１のヒストグラムに対応するＭＦＩを示す。
Figure 2022014707000004
図１および表３に示されるように、蛍光色素（ＦＡＭ）添加群である例１～４について、蛍光色素を添加しなかった例５と比較すると、ヒストグラムのピークはＸ軸の右方向にシフトした（図１参照）。また、表３に示すように、例１～４のＭＦＩは、例５のＭＦＩよりも大きいことが確認された。また、例１～３と例４とを比較すると、ヒストグラムのピークシフトとＭＦＩの増大度合いとは、サンプルの添加により、さらに大きくなることがわかった。即ち、サンプル１～３の添加によって、蛍光色素（ＦＡＭ）の細胞内への導入が向上したことが確認された。ここで、サンプル１を添加した細胞試料のＭＦＩが最も高く検出されたことから、サンプル１の細胞膜透過性が最も優れていることが確認された。
上記実施例１で得られた３種のサンプル（外来物質導入用構築物）のうち、サンプル１にかかる外来物質導入用構築物は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるキャリアペプチドフラグメントを含むことによって、優れた細胞膜透過性を示すことが確認された。また、本発明者らの検討によって、外来物質が蛍光色素のみならず、ポリペプチド、核酸、および薬剤のいずれであっても、かかる外来物質は、効率よく細胞の外部から、細胞膜を通して細胞質内に導入されることが確認された。
以上のことから明らかなように、ここで開示される技術によると、外来物質導入方法の特に好適な一態様として、真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質をインビトロにおいて導入する方法であって、配列番号１から成るキャリアペプチドフラグメントを使用することを特徴とする方法が提供される。かかるキャリアペプチドフラグメントは、細胞質内に、目的とする外来物質を導入する目的に好適である。
以上、ここで開示される技術の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。
ここで開示される技術によると、真核細胞（特に細胞壁を有しないヒトやそれ以外の哺乳動物に代表される種々の動物細胞）の外部から細胞質内に目的とする外来物質を導入するために人為的に作製された構築物が提供される。かかる構築物を利用することにより、目的の細胞に目的の外来物質を効果的に導入させ、該外来物質が導入された細胞並びに該外来物質を含む細胞を含む器官その他の生体組織を得ることができる。また、かかる構築物を利用することにより、疾患に対する治療略を提供することができる。
配列番号１～３ 合成ペプチド

Claims (9)

  1. 真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質をインビトロにおいて導入する方法であって、
    （１）以下のアミノ酸配列：
    ＴＬＫＥＲＣＬＱＶＶＲＳＬＶＫＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）
    から成るキャリアペプチドフラグメントと、
    該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した前記目的とする外来物質と、
    を有する外来物質導入用構築物を用意する工程と、
    （２）前記外来物質導入用構築物を、目的とする真核細胞を含む試料中に供給する工程と、
    （３）前記外来物質導入用構築物が供給された前記試料をインキュベートして、前記試料中の真核細胞内に前記構築物を導入する工程と、
    を包含する方法。
  2. 前記外来物質は、ポリペプチド、核酸、色素及び薬剤から成る群から選択されるいずれかの有機化合物である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記外来物質は、何れかの生物種由来の成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドであり、前記外来物質導入用構築物は、該外来物質としての成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドに対応するアミノ酸配列と前記キャリアペプチドフラグメントのアミノ酸配列とを有する合成ポリペプチドである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記外来物質としての成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドに対応するアミノ酸配列は、前記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側に配置されている、請求項３に記載の方法。
  5. 前記外来物質導入用構築物を導入する対象の真核細胞がヒト又はヒト以外の哺乳動物の細胞である、請求項１～４の何れか一項に記載の方法。
  6. 真核細胞の外部から少なくとも該細胞の細胞質内に目的とする外来物質を導入するために作製された外来物質導入用構築物であって、
    以下のアミノ酸配列：
    ＴＬＫＥＲＣＬＱＶＶＲＳＬＶＫＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）
    から成るキャリアペプチドフラグメントと、
    該キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側及び／又はＣ末端側に結合した前記目的とする外来物質と、
    を有する外来物質導入用構築物。
  7. 前記外来物質は、ポリペプチド、核酸、色素及び薬剤から成る群から選択されるいずれかの有機化合物である、請求項６に記載の構築物。
  8. 前記外来物質は、何れかの生物種由来の成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドであり、該外来物質としての成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドに対応するアミノ酸配列と前記キャリアペプチドフラグメントのアミノ酸配列とを有する合成ポリペプチドである、請求項７に記載の構築物。
  9. 前記外来物質としての成熟ポリペプチド又はその前駆体ポリペプチドに対応するアミノ酸配列は、前記キャリアペプチドフラグメントのＮ末端側に配置されている、請求項８に記載の構築物。
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