JP2002010790A - デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤 - Google Patents

デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤

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JP2002010790A
JP2002010790A JP2000348957A JP2000348957A JP2002010790A JP 2002010790 A JP2002010790 A JP 2002010790A JP 2000348957 A JP2000348957 A JP 2000348957A JP 2000348957 A JP2000348957 A JP 2000348957A JP 2002010790 A JP2002010790 A JP 2002010790A
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Masafumi Matsuo
Yasuhiro Takeshima
雅文 松尾
泰弘 竹島
Original Assignee
Jcr Pharmaceuticals Co Ltd
Masafumi Matsuo
日本ケミカルリサーチ株式会社
雅文 松尾
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Abstract

(57)【要約】 (修正有) 【課題】 ジストロフィンエキソン内の新規のSES
(Splicing Enhancer Sequen
ce:スプライシング促進配列)を発見しそれに基づい
た新規のDMD(Duchenne Muscular
Dystrophy:デュシェンヌ型筋ジストロフィ
ー)の治療剤の提供。 【解決手段】 agcaagaaga cagcag
cauu gcaaag 又は ggaagcuaag
gaagaagcug agcaggの塩基配列に対
して相補的な塩基配列を含んでなるアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【0001】

【発明の属する技術分野】本発明は、ジストロフィン遺
伝子に生じた異常に起因する、アミノ酸読みとり枠(リ
ーディングフレーム)のずれた前駆体mRNAに対し
て、所定のエクソンスキッピングを誘導してリーディン
グフレームのずれを解消するための、デュシェンヌ(Du
chenne)型筋ジストロフィー治療薬に関する。更に具体
的には、本発明は、特定のタイプのデュシェンヌ型筋ジ
ストロフィーの治療剤の製造のために用いることのでき
る、ジストロフィン遺伝子のスプライシング促進配列
(SES)、並びに、該スプライシング促進配列に対す
るアンチセンスオリゴヌクレオチド及びこれを含んだ治
療剤に関する。

【0002】

【従来の技術】今日、前駆体mRNA分子の異常スプラ
イシングによる遺伝子疾患が診断可能となり、特に、難
病である筋ジストロフィーが注目されている。筋ジスト
ロフィーはデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD:
Duchenne Muscular Dystrophy)とベッカー型筋ジスト
ロフィー(BMD:Becker Muscular Dystrophy)とに
大別される。DMDは、最も頻度の高い遺伝子性筋疾患
であり、出生男子3,500人に1人の割合で発症する。本
症の患者は、幼児期に筋力低下症状を現し、その後一貫
して筋萎縮が進行して、20歳前後で死に至る。現在、D
MDに対する有効な治療薬はなく、全世界の患者から治
療薬の開発が強く求められている。1987年にDMDの原
因遺伝子であるジストロフィン遺伝子が、逆行遺伝学の
手法により発見され、またBMBも同じジストロフィン
遺伝子の異常から発症することが明らかにされた[Koen
ig, M. et al., Cell, 50: 509-517 (1987)]。BMD
では、その発症年齢は成人期と比較的遅く、発症後に軽
度の筋力低下は見られるものの、ほぼ正常な生存が可能
である。

【0003】ジストロフィン遺伝子はX染色体短腕21領
域に存在し、その遺伝子サイズは3.0 メガ塩基であり、
ヒトの最大の既知遺伝子である。このように大きなサイ
ズであるが、ジストロフィン遺伝子中でジストロフィン
タンパク質をコードしている領域はわずか14kbに過ぎ
ず、しかもそのコード領域は79ものエクソンに分かれて
遺伝子内に分散して存在している[Roberts, RG., et a
l., Genomics, 16: 536-538 (1993)]。ジストロフィン
遺伝子の転写物であるmRNA前駆体は、スプライシン
グを受けて14kbの成熟mRNAとなる。更に、この遺
伝子には8種の異なるプロモーター領域が遺伝子内にや
はり分散して存在し、それぞれが異なったmRNAを産
生している[Nishio, H., et al., J. Clin. Invest.,
94: 1073-1042 (1994), Ann, AH. and Kunkel, LM., Na
ture Genet., 3: 283-291 (1993), D'Souza, VN. et a
l., Hum. Mol. Genet., 4: 837-842 (1995)]。これら
のことから、ジストロフィン遺伝子及びその転写物は、
非常に複雑な構成になっている。

【0004】DMD及びBMDの遺伝子診断は、初期に
はジストロフィンの遺伝子断片を用い、次いで、cDN
Aをプローブとして用いたサザンブロット法により行わ
れ、約6割のDMD/BMD患者でジストロフィン遺伝
子に大きな欠失あるいは重複という異常の存在すること
が明らかにされた[Hoffman, EP. and Kunkel, LM.,Neu
ron, 2: 1019-1029 (1989)]。これらDMD/BMDで
発見される遺伝子異常の殆どは遺伝子欠失であり、しか
もそのサイズは数kbと大きなものであった。遺伝子診
断に関しては、サザンブロット法で発見されたジストロ
フィン遺伝子の異常が、遺伝子の2カ所のホットスポッ
トに集中していることから、このホットスポットの19個
のエクソンに的を絞り、2つのPCR(Polymerase Cha
in Reaction)反応系を用いて簡易に欠失を発見する、
重複PCR法が考案された[Chamberlain JS., et al.,
Nucleic Acids Res., 16: 11141-11156 (1988), Beggs
AH., et al., Hum. Genet., 86: 45-48 (1990)]。この
重複PCR法は、短時間で結果を得ることができ、サザ
ンブロット法で検出できる遺伝子異常の98%がこの方法
で検出できることから、今日では最もポピュラーな遺伝
子診断法となっている。

【0005】DMDの動物モデルとしては、mdx(X chr
omosome-linked muscular dystrophy)マウスがある[Bu
lfield, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
81:1189-1192 (1984)]。

【0006】マウスのジストロフィン遺伝子のエクソン
23内のナンセンス変異により、mdxマウスのこの遺伝
子が不活性化され、結果としてエクソン23内で翻訳が
終止することとなる。mdxマウスでは、如何なる機能的
なジストロフィンも発現されないが、免疫化学的にはジ
ストロフィン陽性筋繊維が微量に検出される。

【0007】ジストロフィン遺伝子という同一遺伝子
の、しかも同じ様な遺伝子異常から発症する2種の疾病
であるDMDとBMDの臨床的な病態における大きな相
違は謎とされていたが、いわゆるフレームシフト説[Mo
naco, AP., et al., Genomics,2: 90-95 (1988)]で説
明されるようになっている。すなわち、「DMDでは、
遺伝子内の部分的な欠失によりジストロフィンmRNA
にコードされるアミノ酸読みとり枠(リーディングフレ
ーム)にずれが生じ(アウトフレーム:out-of-fram
e)、結果的にストップコドンが出現しジストロフィン
の合成が途中で停止してしまう。これに対し、BMDで
は、遺伝子に部分欠失が存在してもリーディングフレー
ムが維持され(インフレーム:in-frame)て、本来のジ
ストロフィンとはサイズが異なるものの、ジストロフィ
ンタンパク質が生成できる」とするものである。実際、
患者の筋肉中のジストロフィンを調べると、DMDでは
ジストロフィンが消失しているのに対して、BMDでは
染色性を正常とは異にしたジストロフィンが存在してい
る。またDMD/BMD患者でジストロフィン遺伝子異
常から計算されたリーディングフレームの型と患者の表
現型とを比較すると、90%以上の患者でこのフレームシ
フト説が当てはまっている。

【0008】筋ジストロフィーに対する試験的治療法と
しては、筋芽細胞の移植等やプラスミド又はウイルスベ
クターを用いることによる機能的ジストロフィン遺伝子
の導入等が試みられている [Morgan, J., Hum. Gene. T
her. 5:195-173(1994)]。

【0009】ジストロフィン陽性筋繊維は、多くのDM
D患者にも見出されている [Nicholson, L. et al., J.
Neurol. Sci., 94:137-146(1989)]。DMD患者に見ら
れるジストロフィン陽性筋繊維は、エクソンスキッピン
グ機構により生じることが提唱されており [Klein, C.
et al., Am. J. Hum. Genet., 50:950-959(1992)]、実
際、mdxマウスの例で、主要なナンセンス変異を含有す
るエクソンをスキップしているリーディングフレームの
維持されたジストロフィン遺伝子転写物が同定された
[Wilton, S. et al., Muscle Nerve, 20:728-734(199
7)]。

【0010】遺伝子から転写された遺伝情報は、スプラ
イシングによりイントロン配列が除去される等の修飾を
受け、エクソン配列のみからなる成熟mRNAとなる。
更に、この成熟mRNAがそのリーディングフレームに
従って翻訳され、遺伝子にコードされた遺伝情報に忠実
に従ったタンパク質の合成が可能となる。mRNA前駆
体のスプライシング時には、mRNA前駆体の塩基配列
のうちでイントロン配列とエクソン配列を正確に決定す
る機構がある。そのためにイントロン・エクソン境界部
の配列は一定のルールで全ての遺伝子で保存されてお
り、コンセンサス配列として知られている。

【0011】このコンセンサス配列として、イントロン
の5’末端のスプライスドナーサイトと呼ばれるエクソ
ンからイントロンへまたがる部位、イントロンの3’末
端のスプライスアクセプターサイトと呼ばれる部位、そ
して、ブランチングポイントと呼ばれる部位の、3カ所
の配列が知られている。

【0012】これらのコンセンサス配列の中で、わずか
1塩基の置換でも発生すると、スプライシングの異常を
起こすことが各種の疾病で報告されているように[Saku
raba, H. et al., Genomics, 12: 643-650 (1992)]、
コンセンサス配列は、スプライシングを進行させる鍵と
なっている。

【0013】先に、本発明者等は、DMD/BMD患者
を対象としたジストロフィン遺伝子異常の診断を日本で
初めてPCR法を用いて実施した。そして、ジストロフ
ィン遺伝子の異常型が欧米人と日本人とで大きな差がな
いこと、すなわち大きな人種差のないことを明らかにし
た。こうした遺伝子診断で見出された遺伝子異常は、塩
基数において数kbから数百kbの巨大なものばかりで
あったが、更に詳細な分析を重ねることにより、あるジ
ストロフィン遺伝子の欠失部位の塩基配列を決定するこ
とに世界で初めて成功し、「ジストロフィン神戸」と命
名して報告した[Matsuo, M, et al., Biochem. Biophy
s. Res. Commun., 170: 963-967 (1990)]。

【0014】「ジストロフィン神戸」と命名した遺伝子
異常を有する症例は、DMDであり、重複PCR分析の
結果によれば、エクソン19に相当するゲノムDNAの
増幅産物のバンドが、本来存在すべき位置に認められ
ず、一見、エクソン19の欠失と考えられた。しかしな
がら、ゲノムDNAについてエクソン19領域の単独増
幅を試みたところ、エクソン19が正常より小さいサイ
ズの増幅産物として検出され、ジストロフィン遺伝子に
よく見られる単純なエクソン欠失ではないことが判明し
た。この患者の家系の構成員のジストロフィンのエクソ
ン19領域をPCR法で増幅することにより、母親と妹
のDNAから正常な増幅産物と共に患者と同じサイズの
増幅産物が得られ、両者がこの遺伝子異常の保因者であ
ることが判明した。

【0015】次いで、患者から得られた異常な増幅産物
の塩基配列を決定すると、88塩基からなるエクソン19
の配列のうち52塩基が欠失していることが判明した。こ
の52塩基の欠失がエクソン配列内に存在することは、こ
の患者のジストロフィンmRNAではリーディングフレ
ームにずれを生じて(アウトフレーム)、エクソン20
内でストップコドンが出現することになる。この遺伝子
診断の結果は、DMDという臨床診断と一致するもので
あった。

【0016】ジストロフィン神戸で発見されたエクソン
19の欠失部分がスプライシングに及ぼす影響を調べる
ために、患者のジストロフィンmRNAを分析した[Ma
tsuo, M., et al., J. Clin. Invest., 87: 2127-2131
(1991)]。

【0017】まず、患者白血球のmRNAを逆転写酵素
によりcDNAに変換し、これを入れ子型PCR(nest
ed-PCR)法を用いて増幅した。エクソン18から20に
わたる領域を増幅したところ、ゲノムで発見された異常
を基に計算されたサイズより更に短くなった増幅断片が
得られた。これはmRNAにゲノムDNAの異常とは異
なった異常が存在する可能性あるいは白血球と筋肉でm
RNAが異なる可能性を示唆した。そこで、このmRN
A異常が疾病と関連する筋肉のmRNAにも存在するこ
とを確認するため、筋肉のmRNAから合成したcDN
Aを鋳型としてPCR法でエクソン18からエクソン2
0の領域を増幅した。その結果得られた増幅産のサイズ
は、白血球のエクソン18から20の増幅産物と全く同
じであった。

【0018】次に、得られた小さな異常増幅産物の塩基
配列決定により、ジストロフィン神戸の患者のジストロ
フィンcDNAではエクソン18の配列が直接エクソン
20の配列につながっており、エクソン19の配列が完
全に消失していることが判明した。この結果は、ゲノム
では、エクソン19内の52塩基のみが欠失し36塩基がエ
クソンとして残存していたことと矛盾している。これら
のことから、ジストロフィン神戸では、前駆体mRNA
の成熟過程で36塩基のエクソン19がスプライスアウト
され、エクソンのスキッピングが起こったことが示され
た。

【0019】遺伝子の異常からエクソンのスキッピング
が生ずる例は少なからず報告されている。既に、本発明
者等はジストロフィン遺伝子の点突然変異例でエクソン
のスキッピングが生じることを世界で初めて発見してい
る[Hagiwara, Y., Am. J. Hum. Genet., 54: 53-61 (1
994)]。これらのエクソンのスキッピングを生じる生じ
る遺伝子変異は、いずれも、先に述べたスプライシング
部位を決定するコンセンサス配列内に生じた異常に起因
している。

【0020】これに対し、ジストロフィン神戸では、エ
クソン「内」に52塩基の欠失を認めたのみで、コンセン
サス配列には異常がなく、この例でエクソンのスキッピ
ングが生じる原因は不明であった。

【0021】ジストロフィン神戸に見られたエクソンの
スキッピングの原因がDNA及びmRNA前駆体の一次
構造の異常には求められないことから、mRNA前駆体
の2次構造にエクソンスキッピングの原因が存在するも
のと推察され、その2次構造を解析した。解析は、2次
構造でエネルギー的に最も安定した塩基結合を算出する
Zuker等のアルゴリズムを用い、コンピュータを用いて
行った[Matsuo, M. etal., Biochem. Biophys. Res. C
ommun., 182: 495-500 (1992)]。野生型のジストロフ
ィンのエクソン19及びその両側のイントロンの塩基配
列を含む617塩基を対象にした解析結果では、mRNA
前駆体は比較的単純なステムループ構造を呈した。特徴
的な構造として、エクソン19の配列それ自体が塩基対
をなすイントラエクソンヘアピン構造が確認された。こ
れに対し、52塩基のエクソン内欠失を有するジストロフ
ィン神戸のエクソンとその近傍のイントロンの塩基配列
からmRNA前駆体の2次構造を演繹すると、野生型と
大きく異なっており、ジストロフィン神戸における最大
の特徴は、エクソンの配列がイントロンの配列のみと塩
基対をなす単純なステム構造を形成することであった。
この結果は野生株で見られたイントラエクソンヘアピン
構造が、ジストロフィン遺伝子のエクソン構造を特徴づ
ける要素である可能性を示唆した。

【0022】そこで、ジストロフィン遺伝子の79個のエ
クソンのうちから、近傍のイントロンの塩基配列の明ら
かにされている22個のエクソンを選び、そのmRNA前
駆体の2次構造を解析した。解析した全てのエクソン
は、イントラエクソンヘアピン構造を形成する結果とな
り、このイントラエクソンヘアピン構造が、エクソンの
機能の必須な要素と考えられた。これらのことは、ジス
トロフィン神戸に見出されたエクソンのスキッピングが
mRNA前駆体のイントラエクソンヘアピン構造の消失
により発生したことを強く示唆した。これはまた、エク
ソン自体の配列がスプライシング時のエクソン認識に重
要な役割を果たしていることをも示唆した。

【0023】最近、コンセンサス配列以外に、エクソン
内の配列の異常によってもエクソンのスキッピングが生
じ得ることが報告され[Dietz, HC., et al., Science,
259: 680-683 (1993)]、コンセンサス配列に加えてエ
クソンの配列もスプライシング部位決定要因として機能
しているとして注目を集めている。これらのことは、従
来の分子生物学のスプライシングに関する概念を崩すも
のとなっている。

【0024】エクソン19内の配列がスプライス部位の
決定に重要なことが示唆されたので、in vitro のスプ
ライシング反応系を構築し、このことを実験的に明らか
にする試みを行った[Takeshima, Y., et al., J. Cli
n. Invest., 95: 515-520 (1995)] [特願平11-140930
号]。まず、ジストロフィン遺伝子のエクソン18と1
9並びにイントロン18からなるミニジーンを作成し、
このミニジーンからラジオアイソトープでラベルしたm
RNA前駆体を合成した。得られたmRNA前駆体をHe
La細胞の核抽出液と混合しスプライシング反応を試験管
内で進行させ、産生された成熟mRNAを電気泳動によ
り分離した。この反応系で正常のエクソン19塩基配列
を有するmRNA前駆体を用いるとスプライシングは正
常に進行し、エクソン18と19が連続した成熟mRN
Aを得ることができた。しかしエクソン19の塩基配列
をジストロフィンのそれと置換すると、成熟mRNAは
産生されなくなった。これは、ジストロフィン神戸でエ
クソン19から欠失した52塩基がスプライシングに重要
な役割を果たしていることを示すものであった。

【0025】しかしこのスプライシング異常が、エクソ
ン19の「サイズ」が36塩基と短くなった結果による可
能性もあるため、ジストロフィン神戸のエクソン19の
欠失部を補うものとして、欠失した遺伝子を逆方向に挿
入し、同様の実験を行った。このmRNA前駆体では、
スプライシングは進行するものの、その効率は低かっ
た。この結果は、たとえエクソンが正常な長さを有して
も、エクソン内の塩基配列が異なるとスプライシング効
率は低下することを示し、エクソンの(サイズでなく)
エクソン内の塩基配列自体が重要であることを示すもの
であった。

【0026】 そこで、エクソン内の塩基配列自体のス
プライシングへの影響を更に解析するため、52塩基の欠
失配列に代わって、2種の異なる配列を挿入したmRN
A前駆体を作成し、そのスプライシング効率を調べた。
β−グロビン遺伝子の一部あるいはアンピシリン耐性遺
伝子の一部をそれぞれ挿入した2種のmRNA前駆体に
おいて、いずれもスプライシングは進行したが、ともに
極めて低い効率であった。しかし、β−グロビン遺伝子
を挿入した方が、アンピシリン耐性遺伝子を挿入した方
よりも相対的に高いスプライシング効率を示した。前者
の塩基配列には多くのプリン基が含まれており、エクソ
ン内のプリン配列がエクソン認識に関与していると考え
られている[Watanabe, A., et al., Genes Dev., 7:40
7-418 (1993)]。

【0027】これらの実験結果は、スプライシングに
は、コンセンサス配列のみならずその下流のエクソンの
配列が関与していることを実験的に明らかにしたもの
で、遺伝情報処理プロセスに新しい概念を導入するもの
であった。

【0028】<アンチセンスオリゴヌクレオチドによる
スプライシング制御>ジストロフィン遺伝子のエクソン
19内の配列がスプライシングの進行に極めて重要であ
るという上記発見から、この配列を破壊することにより
スプライシングの異常が人為的に誘導できるのではない
かという可能性に着目し、本発明者等は続けて検討を行
った。すなわち、ジストロフィン神戸で欠失した52塩基
のうち配列表の配列番号5に示した塩基配列部分を含ん
だ配列表の配列番号6に示した31塩基に対し、これに相
補的な2’−O−メチルオリゴRNAを合成し、これ
が、エクソン18−イントロン18−エクソン19より
なるmRNA前駆体のスプライシングに及ぼす影響を、
前述の試験管内スプライシング反応系で調べた。その結
果、スプライシング反応はアンチセンスオリゴヌクレオ
チドの添加量に、またその反応時間に依存して阻害され
た。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドによりジ
ストロフィンのイントロンのスプライシングが阻止でき
ることを実験的に初めて証明したものであった。そし
て、このことは、核内でおこるスプライシング反応が人
為的な手段により制御できる可能性を示した[Takeshim
a, Y. etal., J. Clin. Invest., 95: 515-520 (199
5)]。

【0029】<細胞核内でのスプライシング制御>生き
た細胞の核内でもアンチセンスオリゴヌクレオチドによ
りジストロフィンmRNA前駆体のスプライシングが制
御できることを明らかにするため、本発明者等は、正常
なヒトリンパ芽球細胞を用い、配列表の配列番号5に示
した塩基配列部分を含んだ配列表の配列番号6に示され
た塩基配列に対し、これに相補的な塩基配列を有するア
ンチセンスオリゴDNAの導入を行って、その存在下に
産生されるジストロフィン成熟mRNAについて解析を
行った[Zacharias A. DP. et al., B.B.R.C., 226: 44
5-449 (1996)]。すなわち、アンチセンスオリゴDNA
の核内への導入は、リポフェクタミンと混合後、これを
リンパ芽球培養液に加えることにより行った。その結
果、先に試験管内スプライシング反応系で得られた結果
とは異なって、ジストロフィンのエクソン19の塩基配
列に対するアンチセンスオリゴDNAはヒトリンパ芽球
細胞においてエクソン19のスキッピングを誘導し、m
RNAにおいてエクソン18がエクソン20に直接つな
がったものが得られることが確認された。また培養時間
を延長することにより、このエクソンスキッピング誘導
効果は完全なものとなり、全てのmRNAがエクソン1
9を欠失したものとして認められるようになった。更
に、用いたアンチセンスオリゴDNAは、他のエクソン
のスプライシングには問題を起こさなかったことも確認
された。

【0030】今日、アンチセンスオリゴヌクレオチド
(AOs: Antisense oligonucleotides)は、タンパク質の
翻訳阻害のために遺伝子発現を抑制するために適用され
てきた。AOsはまた、RNAポリメラーゼIIによる転写を阻
害するためにDNAの特異的な領域を標的とするために
も用いられてきた。また、別のアプローチとして、アン
チセンスオリゴヌクレオチドを用いて前駆体mRNA分
子の異常スプライシングを阻害する方法も報告されてい
る[特表平8-510130号]。また、ホスホロチオエート−
2−O−メチルオリゴヌクレオチドは、リボヌクレアー
ゼ−H活性を誘導しないため、サラセミア症貧血患者に
おいて、前駆体mRNA中ずれたスプライシング部位を
阻害することにより正しいスプライシングを回復する目
的で、用いられてきた。

【0031】<人為的エクソンスキッピングの治療への
応用>先述のように、DMDでは、ジストロフィンmR
NAのリーディングフレームがずれてアウトフレームと
なるような遺伝子異常を有している。もしこのリーディ
ングフレームの異常をインフレームに転換できるとすれ
ば、それによりDMDはBMDとなり、症状の改善が期
待できる筈である。例えば、仮に、エクソン20のみが
単独で欠失している患者を想定すると、エクソン20は
242塩基からなっており、当然ながらその単独欠失はフ
レームシフトを起こして翻訳途中で停止コドンが出現し
てジストロフィン合成が途中で停止し、その結果DMD
の表現型となる。しかしながら、この症例に対し、前記
の実験で用いたようなエクソン19に対するアンチセン
スオリゴヌクレオチドを投与してエクソン19のスキッ
ピングを人為的に誘発できたとすると、エクソン20の
242塩基に加えエクソン19の88塩基が前駆体mRNA
から欠失することとなり、合計330塩基の欠失となっ
て、リーディングフレームは一転してインフレームとな
る可能性が、すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチド
の使用によりDMDの表現型をBMDに転換できる可能
性が、理論上はある。

【0032】しかしながら、ジストロフィン遺伝子は前
述の通り非常に複雑な構造をしており、そのmRNA前
駆体も、スプライスアウトされるべき多数の長いイント
ロンを含んだ複雑な2次構造をなしておりそれがスプラ
イシングの正常な進行を制御している。従って、正常な
ヒトのリンパ球芽細胞でなく、エクソン20の単独欠失
を有する患者の筋芽細胞においても、エクソン19に対
するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって期待通り
エクソン19のスキッピングを起こすことができるか否
か、またエクソン19のスキッピングにうまく成功した
としても、元々エクソン20のスプライスアウトを引き
起こす異常を有するmRNA前駆体において、エクソン
20のスプライスアウトや他の部位のスプライシングに
対して影響を及ぼすことなくmRNAのリーディングフ
レームをアウトフレームからインフレームへと転換する
ことができるか否か、そして更には、インフレームへと
転換できたとしてもそのmRNAがジストロフィンに近
似のタンパク質を有効に産生できるか否か、という現実
の可能性は不明であった。

【0033】このような背景のもと、本発明者の一人
は、ジストロフィン成熟mRNAにおいてエクソン20
の完全欠失を有するDMD患者の細胞で、エクソン19
に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてその
スプライスアウトを誘導できること、そしてそれにより
ジストロフィン成熟mRNAのリーディングフレームの
ずれを修正でき、ジストロフィン陰性細胞を陽性細胞に
転換できることを明らかにし、その結果に基づきDMD
に対する治療薬を先に開示した(特開平11-140930
号)。

【0034】すなわち、ジストロフィンのエクソン19
に対するアンチセンスオリゴリボヌクレオチドをエクソ
ン20の単独欠失を有するDMD患者の筋芽細胞の培養
液中に投与することにより、これが筋芽細胞内へ、次い
で核内へと取り込まれ、その結果、エクソン19とエク
ソン20とを完全欠失はするもののアミノ酸読み取り枠
はアウトフレームからインフレームになるよう回復され
て、エクソン19とエクソン20がコードする部分以外
は完全長のジストロフィンを産生できるようになること
が確認された。このことは、エクソン20の単独欠失に
基づくDMD患者に対して、エクソン19に対するアン
チセンスオリゴヌクレオチドを投与することにより、極
めて重篤な疾患であるDMDを比較的軽い疾患であるB
MDへと転換させ得るという可能性を強く支持してい
る。

【0035】このように、ゲノムより転写されたmRN
A前駆体がスプライシングを受けて成熟mRNAとなる
ときに、スプライシングの部位決定に、従来より知られ
ているエクソン・イントロン境界部に存在するコンセン
サス配列に加えて、エクソン内に存在するスプライシン
グ促進配列(Splicing Enhancer Sequence: SES)が
重要な役割を果たしている。また本発明の一人は、上記
の通り、ジストロフィン遺伝子エクソン19内にSES
が存在することを示し、更にそのSESに対するアンチ
センスオリゴヌクレオチドによりエクソン19のスキッ
ピングを導入し得ることを明らかにした。

【0036】

【発明が解決しようとする課題】DMDに対して、ジス
トロフィンの前駆体mRNAのスプライシングに際しエ
クソンスキッピングを誘導することによりリーディング
フレームのずれを修復すると、部分的に機能回復したジ
ストロフィンタンパク質が産生されることになり、それ
によりDMDをBMDへと変化させることが可能であ
る。しかしながら、DMDにおけるジストロフィン遺伝
子の変異部位は多種存在すると考えられている。従っ
て、そのような種々の変異部位に対して治療の可能性を
考える上において、エクソン19のみでは不十分であ
り、ジストロフィン遺伝子の欠失好発部位の周辺に存在
するSESを同定することが重要である。すなわち、本
発明は、ジストロフィンエキソン内の新規のSESを発
見しそれに基づき新規のDMDの治療剤を提供すること
を目的とする。

【0037】

【課題を解決するための手段】上記背景の下で、本発明
者らは、in vitroのスプライシング系を用いて、ジスト
ロフィン遺伝子のエキソン43及び53内に新たなSE
Sをそれぞれ同定することに成功し、それに基づきデュ
シェンヌ型筋ジストロフィーに対する新たな治療手段を
創り出した。

【0038】すなわち本発明は、配列表において配列番
号1又は2で示された塩基配列を有するRNA及び該塩
基配列に対する相補的塩基配列に対して相補的である塩
基配列を有するDNAよりなる群より選ばれるオリゴヌ
クレオチドを提供する。

【0039】これらのオリゴヌクレオチドのうちのRN
Aは、ヒトジストロフィンのmRNA前駆体のエクソン
43内のSES部分(配列表において配列番号1で示
す)又はエクソン53内のSES部分(配列表において
配列番号2で示す)である。これらのRNA及びDNA
は、後述のデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療剤と
してのアンチセンスの製造のための鋳型として使用され
る。

【0040】また本発明は、配列表において配列番号1
又は2で示された塩基配列に対して相補的な塩基配列を
含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチドをも提供す
る。

【0041】該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、そ
れぞれヒトジストロフィンmRNAエクソン43内のS
ES(配列表において配列番号1で、同等のDNA配列
として示した)及びエクソン53内のSES(配列表に
おいて配列番号2で、同等のDNA配列として示した)
と相補的であるため、それらの投与により、ヒトジスト
ロフィンmRNAのスプライシングに際してそれぞれエ
クソン43及びエクソン53のスキッピングを誘導する
ことができる。このため、これらアンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、特定のデュシェンヌ型筋ジストロフィー
において、リーディングフレームのずれを修復すること
に基づく治療剤として用いることができる。

【0042】上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
配列表においてそれぞれ配列番号3又は4で示された塩
基配列を有するDNA及びこれらと同一の塩基配列を有
するホスホロチオエートDNAよりなる群より選ばれる
ものであってよい。これらの配列は、それぞれ、エクソ
ン43又は53のSES及びそれらの両端の隣接塩基配
列をも含んだ配列に対して相補的な配列であり、従っ
て、これらの配列を有するDNAは、それぞれmRNA
前駆体のエクソン43又は53のSESに、一層強力に
ハイブリダイズしてその機能をブロックできる。

【0043】更に本発明は、ヒトジストロフィンmRN
Aにおけるエクソン43に隣接するエクソンを構成する
塩基配列において正常な塩基配列からの塩基の欠失によ
る塩基数の変化に起因するデュシェンヌ型筋ジストロフ
ィーであって、該塩基数の正味の変化が(3×N+1)
個(Nはゼロ又は自然数)の塩基の減少として表される
ものであるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療剤の
製造のための、配列表において配列番号1で示された塩
基配列に対して相補的である塩基配列を有するアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの使用をも提供する。ここにお
いて、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列表に
おいて配列番号3で示された塩基配列を有するDNA及
びこれと同一の塩基配列を有するホスホロチオエートD
NAよりなる群より選ばれるものであってよい。

【0044】更に本発明は、薬剤学的に許容し得る注射
可能な媒質中に、エクソン43のSESに対するこれら
のアンチセンスオリゴヌクレオチドの何れかを含有する
ことを特徴とする、ヒトジストロフィンmRNAにおけ
るエクソン43に隣接するエクソンを構成する塩基配列
において正常な塩基配列からの塩基の欠失による塩基数
の変化に起因するデュシェンヌ型筋ジストロフィーであ
って、該塩基数の正味の変化が(3×N+1)個(Nは
ゼロ又は自然数)の塩基の減少として表されるものであ
るデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療剤をも提供す
る。

【0045】更に本発明は、ヒトジストロフィンmRN
Aにおけるエクソン53に隣接するエクソンを構成する
塩基配列において正常な塩基配列からの塩基の欠失によ
る塩基数の変化に起因するデュシェンヌ型筋ジストロフ
ィーであって、該塩基数の正味の変化が(3×N+1)
個(Nはゼロ又は自然数)の塩基の減少として表される
ものであるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療剤の
製造のための、配列表において配列番号2で示された塩
基配列に対して相補的である塩基配列を有するアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの使用をも提供する。ここにお
いて、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列表に
おいて配列番号4で示された塩基配列を有するDNA及
びこれと同一の塩基配列を有するホスホロチオエートD
NAよりなる群より選ばれるものであってよい。

【0046】更に本発明は、薬剤学的に許容し得る注射
可能な媒質中に、エクソン53のSESに対するこれら
のアンチセンスオリゴヌクレオチドの何れかを含有する
ことを特徴とする、ヒトジストロフィンmRNAにおけ
るエクソン53に隣接するエクソンを構成する塩基配列
において正常な塩基配列からの塩基の欠失よる塩基数の
変化に起因するデュシェンヌ型筋ジストロフィーであっ
て、該塩基数の正味の変化が(3×N+1)個(Nはゼ
ロ又は自然数)の塩基の減少として表されるものである
デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療剤をも提供す
る。

【0047】本発明において、「オリゴヌクレオチド」
は、オリゴDNA、オリゴRNAのみならず、ホスホロ
チオエートオリゴDNA等のホスホロチオエート類似体
をも包含する。ホスホロチオエートDNAは、リン酸基
の酸素原子がイオウ原子で置換されたヌクレオチドであ
り、各種の核酸分解酵素に対して耐性があること等か
ら、部位特異的な遺伝子の置換その他で遺伝子工学の分
野において汎用されているヌクレオチド類似体であり、
その製法及び性質、及び種々の用途は当業者に周知であ
る。ホスホロチオエートDNAは、通常のDNAと同様
に塩基対を形成するが、各種分解酵素に対して抵抗性が
大きく本発明において用いるのに特に有利である。ここ
に、「ホスホロチオエート類似体」は、通常のDNAの
ヌクレオチド間のホスホロジエステル基の1個以上がホ
スホロチオエート基に置き換えられている構造のもので
ある。

【0048】本発明の治療剤は、好ましくは、0.05〜5
μmoles/mlの該アンチセンスオリゴヌクレオチド、
0.02〜10%w/vの炭水化物又は多価アルコール及び0.
01〜0.4%w/vの薬剤学的に許容し得る界面活性剤を
含有する、該アンチセンスオリゴヌクレオチドの更に好
ましい範囲は、0.1〜1μmoles/mlである。

【0049】該炭水化物としては、単糖類及び/又は2
糖類が特に好ましい。これら炭水化物及び多価アルコー
ルの例としては、グルコース、ガラクトース、マンノー
ス、ラクトース、マルトース、マンニトール及びソルビ
トールが挙げられる。これらは、単独で用いても、併用
してもよい。

【0050】また、界面活性剤の好ましい例としては、
ポリオキシエチレンソルビタンモノ〜トリ−エステル、
アルキルフェニルポリオキシエチレン、ナトリウムタウ
ロコラート、ナトリウムコラート、及び多価アルコール
エステルが挙げられる。このうち特に好ましいのは、ポ
リオキシエチレンソルビタンモノ〜トリ−エステルであ
り、ここにおいてエステルとして特に好ましいのは、オ
レエート、ラウレート、ステアレート及びパルミテート
である。これらは単独で用いても、併用してもよい。

【0051】また本発明の治療剤は、更に好ましくは、
0.03〜0.09Mの薬剤学的に許容し得る中性塩、例えば、
塩化ナトリウム、塩化カリウム及び/又は塩化カルシウ
ムを、含有する。

【0052】また本発明の治療剤は、更に好ましくは、
0.002〜0.05Mの薬剤学的に許容し得る緩衝剤を含有す
ることができる。好ましい緩衝剤の例としては、クエン
酸ナトリウム、ナトリウムグリシネート、リン酸ナトリ
ウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンが挙げ
られる。これらの緩衝剤は、単独で用いても、併用して
もよい。

【0053】更に、上記の治療剤は、溶液状態で供給し
てもよい。しかし、ある期間保存する必要がある場合等
のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを安定化し
て治療効果の低下を防止する目的で通常は凍結乾燥して
おくことが好ましく、その場合は用時に溶解液(注射用
蒸留水など)で再構成(reconstruction)して、即ち投
与される液体状態にして用いればよい。従って、本発明
の治療剤は、各成分が所定の濃度範囲になるよう溶解液
で再構成して使用するための、凍結乾燥された状態のも
のも包含する。凍結乾燥物の溶解性を促進する目的で、
アルブミン、グリシン等のアミノ酸を更に含有させてお
いてもよい。

【0054】

【発明の実施の形態】以下、各種の試験に基づいて本発
明を更に詳細に説明する。

【0055】1. 患者由来のリンパ芽球細胞における
エクソンスキッピングの誘導 前述の通り、正常のジストロフィン遺伝子構造を持つ遺
伝子から転写されたmRNA前駆体のスプライシング反
応において、本発明者等のデザインしたアンチセンスオ
リゴヌクレオチドがエクソン19のスキッピングを有効
に誘導することが確認された。一方、エクソン20を欠
失したDMD患者では、正常とは遺伝子構造を異にする
ため、ジストロフィンのmRNA前駆体の2次構造ある
いは3次構造が正常とは異なると予想される。そのよう
なエクソン20を欠失したDMD患者でも、前記31塩基
のアンチセンスオリゴヌクレオチドが有効か否かを検討
した。すなわち、以下に詳述するように、ジストロフィ
ンのエクソン20を欠失したDMD患者2名からEBウ
イルスでトランスフォームしたリンパ芽球細胞株を樹立
し、これを用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドによ
りエクソンスキッピングを誘導できること確認した。

【0056】(a) DMD患者由来リンパ球芽細胞株
の樹立 ジストロフィンのエクソン20を欠失したDMD患者2
名から、EBウイルスで形質転換したリンパ芽球細胞株
を次のようにして樹立した。すなわち、患者より採取し
た2mlの全血を2mlのRPMI1640培地(10%FBSを補
充)と混和し、3mlのFicoll Paque(Pharmacia社)
上に重層し、濃度勾配遠心した。その後、リンパ球層の
みを回収し、RPMI1640培地(10%FBSを補充)にて2回
洗浄し、最後に0.5mlのRPMI1640培地(10%FBSを補
充)に浮遊させ、リンパ浮遊液とした。この液と、予め
用意しておいたEBウイルス液0.5mlを混和し、混和
液を37℃にて1週間培養した。1週間後にEBウイルス
を除くためRPMI1640培地(10%FBSを補充)にて洗浄
し、その後同じ培養液を使用して培養を継続した。こう
して、EBウイルスが患者リンパ球に感染し、形態的に
大きな、リンパ芽球となった細胞を得た。

【0057】(b) アンチセンスオリゴDNAの導入 上記により得られたリンパ芽球細胞株の細胞培養液を遠
心し、細胞成分のみに分離した。そして、配列表におい
て配列番号2で示した塩基配列に相補的な配列よりなる
31塩基のアンチセンスオリゴDNAを約200nM(200pm
oles/ml)と2%胎仔牛血清(FBS)を含む維持培地
で、この細胞を36℃にて5時間培養した。次いで血清培
地に交換した後に、引き続き12時間培養した。培養終了
後に、常法により細胞を集めて全RNAを抽出した。

【0058】(c) ジストロフィンcDNAの解析 得られた全RNAを基質とし、ヘキサオリゴヌクレオチ
ドからなるランダムオリゴヌクレオチドをプライマーと
して、常法に従い逆転写酵素の作用によりcDNAを合
成した。合成したcDNAよりジストロフィンのエクソ
ン18から21にわたる領域をnested PCR法を用い
て増幅した。まず、プライマーをエクソン18と21に
デザインしたもので1回増幅した。この増幅産物をテン
プレートとして、1回目に用いたプライマーの内側に位
置する領域にマッチするプライマーをデザインして2回
目のPCR増幅を行った。この増幅は、アニーリング温
度を60℃に設定して行った。

【0059】(d) エクソン19のスキッピングの確
認 こうして、ジストロフィンcDNAのエクソン18〜2
1の領域を増幅したところ、アンチセンスの無添加では
384塩基対のきれいなバンドが得られた。この増幅産物
の塩基配列を常法により決定したところ、これがエクソ
ン18、19、21からなることが示された。これは患
者の遺伝子解析結果とよく一致していた。

【0060】一方、アンチセンスオリゴDNA添加細胞
のcDNAでは、アンチセンスオリゴDNAを導入しな
い細胞から得られた産物と同じサイズの増幅産物が得ら
れたのみならず、培養4日目から小さなサイズの、リー
ディングフレームの維持された産物が得られた。また、
症例2より確立したリンパ芽球細胞でも、同様の処理に
より2種類のバンドが得られた。これらのうち小さなサ
イズの増幅産物の塩基配列を決定したところ、エクソン
18の配列が直接エクソン21の配列につながってお
り、エクソン19と20とは欠失していることが判明し
た。このことは、アンチセンス処理によりエクソン19
がスキッピングしたことを示している。一方、正常者か
ら確立したリンパ芽球細胞では、この条件で小さなサイ
ズの転写物、すなわちエクソン19のスキッピングを有
するもののみが得られた。また、ジストロフィンcDN
Aの全領域を10抗体に分けて増幅して調べたが、スプラ
イシングの異常を示す断片は得られなかった。

【0061】(e) 考 察 このアンチセンスオリゴヌクレオチドのエクソンスキッ
ピング誘導効果が正常とDMD患者で異なっている原因
は、エクソン19近辺のmRNA前駆体の2次構造ある
いは3次構造の差に由来するものと考えられた。アンチ
センスオリゴヌクレオチドの濃度を変えることにより、
更にDMD患者におけるエクソンスキッピング誘導効率
を調べた。しかし、正常患者由来細胞で見られたよう
な、全ての転写産物がエクソンスキッピングを示すよう
な条件は得られなかった。なお、このアンチセンス誘導
は、センスオリゴヌクレオチドでも、また他の領域に対
するアンチセンスオリゴヌクレオチドでも、見られなか
った。

【0062】これらの結果は、ジストロフィンmRNA
前駆体のスプライシングを制御することによりエクソン
のスキッピングを誘導し、その結果リーディングフレー
ムの修正ができることを示している。しかし、筋細胞に
おいてもこうしたmRNAの修正でアミノ酸読み取り枠
が維持できるようになったmRNAが有効にタンパク質
を合成できるか否かは依然として不明であった。

【0063】2. DMD患者由来筋細胞におけるジス
トロフィン近似タンパク質の発現 そこで、次に、エクソン20の欠失したDMD患者の筋
芽細胞を用いて、ジストロフィン近似のタンパク質が発
現するか否かにつき検討した。

【0064】(a)DMD患者由来筋細胞株の樹立 ジストロフィン遺伝子のエクソン20を欠失した患者よ
り、無菌的に筋組織を取り出し、細切した後、トリプシ
ンにて遊離細胞を得た。これを洗浄した後、生育培地
(Growth medium: 20% FCS、0.5% chicken胚抽出物を
補充したHam-F10)中にて培養した。継代に際し細胞培
養用のシャーレの中にカバーグラスをおき、その上で筋
細胞の培養を行った。筋芽細胞の割合が80%程度になる
まで増殖したとき、培養液をFusion培地(2%HSを補
充したDMEM)に交換して分化を誘導し、筋細胞とした。

【0065】(b)アンチセンスオリゴDNAの導入 分化誘導して4日目に、アンチセンスオリゴDNA(20
0 pmol)をリポフェクタミン(6μl)によって細胞内
に導入し、更に3、7、及び10日間培養した。

【0066】(c)ジストロフィン免疫染色 上記培養後のそれぞれの細胞につき、ジストロフィンの
C末端に対する抗体を用いたジストロフィン免疫染色を
行った。その結果、当初全くジストロフィンの染色のな
かった細胞で、ジストロフィンが染色されるようになっ
た。何れにおいても、ジストロフィン陽性細胞が確認さ
れた。また、ジストロフィンのN末端領域を認識する抗
体を用いてもC末端領域の染色と同様な染色結果が得ら
れ、この産生されたジストロフィンがN末端からC末端
に及ぶものであることが確認された。

【0067】このように、アンチセンスオリゴDNAを
添加した筋芽細胞には、ジストロフィンの染色が認めら
れたのに対し、同様の方法でアンチセンスオリゴDNA
無添加の筋芽細胞を検討したところでは、ジストロフィ
ンの染色は全く認められていない。

【0068】(d)ジストロフィンcDNAの解析 続いて、上記アンチセンスオリゴDNA添加培養筋芽細
胞から、常法によりRNAを抽出した。得られたRNA
よりcDNAを合成し、リンパ芽球細胞からのRNAに
ついて上記したのと同様にして、ジストロフィンのエク
ソン18〜21の領域を増幅した。

【0069】得られた増幅産物につき、常法により塩基
配列決定した。その結果、培養4日目から、エクソン1
8の塩基配列がエクソン21の塩基配列に直接つながっ
てアミノ酸読み取り枠がインフレームとなった増幅産物
が得られた。

【0070】次いで、アンチセンスオリゴDNA添加培
養筋芽細胞から作成したcDNAにつき、その全領域を
10個の部分に分けてPCR法により増幅し、増幅産物
として得られた各断片のサイズを常法により電気泳動し
て検討した。その結果、エクソン19及び20のスキッ
ピング以外、スプライシングの異常を示唆するような断
片は認めらなかった。これらの結果は、得られたジスト
ロフィン成熟mRNAが、エクソン19とエクソン20
とを完全欠失していること以外は、リーディングフレー
ムの維持された完全長のmRNAであることを示すもの
である。

【0071】3. アンチセンスオリゴDNAの核内へ
の移行 次いで、アンチセンスオリゴDNAが実際に核内に移行
して作用していることの裏付けを得るために、蛍光標識
したアンチセンスオリゴDNAを用いて、その核内への
移行の様子を観察した。

【0072】上で用いたアンチセンスオリゴDNAを常
法によりFITC(フルオレセインイソチオシアネー
ト)標識して、アンチセンスオリゴDNAの核内への移
行について検討した。すなわち、DMD患者から採取し
た筋細胞を生育培地(Growth medium: 20% FCS、0.5%
chicken胚抽出物を補充したHam-F10)中にて培養し
た。培養は、細胞培養用のシャーレ内においたカバーグ
ラス上で行い、細胞がセミコンフルエントになったとき
Fusion培地(2%HSを補充したDMEM)に置換して分化
を誘導し、筋細胞とした。分化誘導して4日目にFIT
C標識したアンチセンスオリゴDNA(200 pmol)をリ
ポフェクタン(6μl)によって細胞内に導入し、1、
2、3、7及び10日後に蛍光顕微鏡にてFITCの局在
を確認した。

【0073】その結果、核に一致して蛍光シグナルが検
出された。このことは、アンチセンスオリゴDNAが実
際に核内に移行してエクソン19のスプライシングをス
キップさせたことを裏付けるものである。

【0074】以上の試験結果が示すように、DMD患者
の筋芽細胞において、アミノ酸読み取り枠をインフレー
ムへと転換させることによって、ジストロフィンに対応
するタンパク質を合成させることができる。これは、従
来極めて重篤な不治の疾患であったDMDにおいて、特
にエクソン20の単独欠失を有する患者を、比較的穏や
かなBMDへと転換させる可能性を示すものである。

【0075】4.他のエクソン内のSES配列の検索 上記の結果を基に、更に本発明等は、ジストロフィン遺
伝子における欠失好発部位であるエクソン45〜55周
辺の、リーディングフレームに関して端数の塩基よりな
るエクソン(即ち、その欠失が起こると、アミノ酸読み
取りに関しアウトフレームとなる)内より、SESを転
写物として与える配列の存在につき調べた。上記のよう
に、in vitroの系における解析よって、SESはプリン
残基(特にaagの繰り返し配列)に富んでいる。これに
基づき、本発明者等は、ヒトジストロフィン遺伝子のエ
キソン内にある、比較的プリン残基に富んだ転写物を与
える鋳型となりうる(1) エクソン43内の26塩基よりな
る塩基配列(配列表の配列番号1に示した塩基配列に相
補的な塩基配列)、(2) エクソン46内の28塩基よりな
る塩基配列(配列表の配列番号2に示した塩基配列に相
補的な塩基配列)、及び(3) エクソン53内の26塩基、
の3箇所を候補として選択し、それらの配列がSES活
性を有する転写物を与えるか否かを検討した。

【0076】SES活性評価のためのmRNA前駆体の
作製及び評価には、ショウジョウバエのdoublesex (ds
x)遺伝子のエクソン3、イントロン3、及びエクソン4
の5'末端部分を含んだ、Watakabe, A., et al., Genes
& Development, 7:407-418(1993)に記載のプラスミドを
基本プラスミドとして用いた。このプラスミドは、ショ
ウジョウバエのdoublesex (dsx)遺伝子のエクソン3か
ら雌性特異的アクセプター部位(female-specific acce
ptor site)の1128塩基下流までを含んだdsxのゲノム断
片をpSP73(Promega)にサブクローンして得られるプラ
スミドであるpSPdsxE34f〔Inoue et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89:8092-8096(1992)〕のBglII-HincII
断片を、プラスミドpSP72のBglII-SmaI部位に挿入する
ことにより得られたものである。このBglII-HincII断片
は、その転写物において、雌性特異的エクソンであるエ
クソン4の5末端部分のすぐ下流にSESが付加されな
いとイントロン3を挟むエクソン間のスプライシングが
見られないが、当該部分にSESが付加されるとスプラ
イシングが見られるようになる系を提供する。他方、解
析対象である塩基配列については、正逆両方向の一本鎖
DNAを各々合成した。このとき、正方向のDNAの5
末端には制限酵素BamHI切断部位を付加し、逆方向のD
NAの5末端には制限酵素XhoI切断部位を付加した。合
成した正逆両一本鎖DNAを混合し、熱処理(94℃、2
分間)後、室温に戻して両鎖をアニールさせて二本鎖と
した。この二本鎖DNAを、前記試験用の基本プラスミ
ド中のdsxエクソン4の5末端部分のすぐ下流にあるBamH
I-Xhol部位に挿入した。こうして、dsxのエクソン3か
らエクソン4の5末端部分までの塩基配列とその下流に
挿入された解析対象塩基配列とからなるミニジーンを含
んだプラスミドが得られた。これらのプラスミドを鋳型
として、常法によりRNAポリメラーゼによりラジオア
イソトープによって標識されたmRNA前駆体を合成し
た。このmRNA前駆体を前述の方法と同様にしてHeLa
細胞核抽出液と1時間反応させ、スプライシング反応を
進行させた後、常法によりゲル電気泳動で解析した。

【0077】その結果、エクソン43及び53のSES
候補を組み込んだmRNA前駆体を用いたスプライシン
グ反応では、何れもイントロン3のスプライシングを受
けたmRNAの生成が明らかに認められた。このこと
は、これら2種の候補配列がSES活性を有することを
示している。また両者の対比では、SES活性は、エク
ソン43の方が上回っていた。一方、エクソン46のS
ES候補を組み込んだmRNA前駆体を用いたスプライ
シング反応では、スプライシング反応を受けたmRNA
は認められるものの、活性は非常に弱かった。

【0078】こうして、本発明者等は、ヒトジストロフ
ィンmRNAのエクソン43及び53内にSESが存在
することを見出した。mRNA中におけるそれらのSE
Sは、それぞれ、配列表の配列番号1及び2に示したリ
ボヌクレオチド配列である。

【0079】既に本発明者等は、ジストロフィン遺伝子
の転写物である前駆体mRNAのエクソン19内にSE
Sが存在し、更にそのSESに対するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドによりエクソン19のスキッピングを誘
導でき、それによりリーディングフレームの回復が可能
となることを見出している。上記で更に同定したエクソ
ン43及びエクソン53内にそれぞれ存在するSESに
ついても、それらに対するアンチセンスオリゴヌクレオ
チドを用いることにより、それぞれエクソン43(173
塩基、即ち3×57+2塩基)及び53(212塩基、即ち
3×70+2塩基)のスキッピングを誘導できる筈であ
る。

【0080】従って、ジストロフィンの前駆体mRNA
のエクソン43に隣接するエクソン内の塩基配列の欠失
により塩基数が(3×N+1)個(Nはゼロ又は自然
数)減少しているタイプのDMD症例に対しては、エク
ソン43のSESに対するアンチセンスオリゴヌクレオ
チドの投与により、スプライシングに際したエクソン4
3のスキッピングの誘導が行われる。これにより、スプ
ライシングに際してエクソン43を構成する173個の塩
基が更に欠失するため、スプライシング後におけるmR
NA中の欠失塩基個数を3の倍数にしてアウトフレーム
であった変異をインフレームに戻すことが可能である。
このため、スキッピングされた塩基配列に対応するアミ
ノ酸は欠落するもののその下流側のアミノ酸配列は遺伝
子異常の影響を受けずにジストロフィンタンパク質が合
成されることとなり、重症のDMDが比較的軽いBMD
へと転換される。そのようなDMD例としてはエクソン
44(148塩基、即ち3×49+1塩基)の欠失したもの、エ
クソン44から46まで(148+176+148=472塩基、即ち3
×157+1塩基)が欠失したもの、エクソン44から47
まで(148+176+148+150=622塩基、即ち3×207+1塩基)
が欠失したもの、エクソン44から48まで(148+176+
148+150+186=808塩基、即ち3×269+1塩基)が欠失した
もの、及びエクソン44から49まで(148+176+148+15
0+186+102=910塩基、即ち3×303+1塩基)が欠失したも
のが挙げられる。

【0081】同様に例えば、DMD患者のジストロフィ
ンの前駆体mRNAのエクソン53に隣接するエクソン
内の塩基配列の欠失により塩基数が(3×N+1)個
(Nはゼロ又は自然数)減少しているタイプのDMD症
例に対しては、エクソン53のSESに対するアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの投与により、スプライシング
に際したエクソン53のスキッピングの誘導が行われ
る。該当する例としては、エクソン52(118塩基、即
ち3×39+1塩基)を欠失、又はエクソン50・エクソ
ン51・エクソン52を欠失(109+233+118=460塩基、
即ち3×153+1塩基)を欠失したDMD症例が挙げられ
る。これらに対し、エクソン53のSESに対するアン
チセンスオリゴヌクレオチドを導入してスプライシング
に際したエクソン53のスキッピングを誘導することに
より、スプライシング後におけるmRNA中の欠失の長
さをそれぞれ330塩基及び672塩基とすることが可能であ
る。そうすることにより、スプライシング後のmRNA
中の欠失塩基の個数が3の倍数となるため、元の欠失に
より起こっていたリーディングフレームのずれが正常に
復帰する。

【0082】適合するDMD患者への本発明の何れかの
アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、例えば次の
通りに行うことができる。すなわち、症例に応じ配列表
において配列番号1又は2に示された塩基配列に対して
相補的な塩基配列を含んでなる、例えば配列表において
それぞれ配列番号3又は4に示されたアンチセンスオリ
ゴDNA又は同じ塩基配列のアンチセンスホスホロチオ
エートオリゴDNAを当業者に周知の方法で製造し、こ
れを常法により滅菌処理し、例えば1200μg/mlの注
射用溶液を調製する。この溶液を、患者静脈内にアンチ
センスオリゴヌクレオチドの投与量が体重1kg当たり
例えば20mgとなるように、例えば輸液の形で点滴投与
する。投与は、例えば2週間の間隔で4回繰り返し、そ
の後も、筋生検組織におけるジストロフィンタンパク質
の発現、血清クレアチンキナーゼ値、臨床症状を指標と
した治療効果の確認をしながら、適宜この治療を繰り返
す。治療効果があり明らかな副作用が見られない限り、
治療を継続し、原則として生涯投与が行われる。

【0083】以下、代表的な実施例を挙げて本発明を更
に具体的に説明するが、本発明が該実施例に限定される
ことは意図しない。

【0084】

【実施例】1. アンチセンスオリゴDNA及びホスホ
ロチオエートオリゴDNAの調製 配列表において配列番号2で示されたヌクレオチド配列
に相補的なヌクレオチド配列を有するDNA及びホスホ
ロチオエートオリゴDNAの製造は、AppliedBiosystem
s Model 1380B等のような市販のDNA合成装置を用い
て、また、Zonet al., 「Oligonucleotides and Analog
ues」:A Practical Approach, F. Eckstein, Ed., p.
87-108, Oxford University Press, Oxford, England、
米国特許第5,151,510号に記載された方法を用いて、行
うことができる。

【0085】<製剤実施例1>下記の処方に従って必要
量の基剤成分を混合して溶解し、これにアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを溶解させ、所定液量とし、ポアサイ
ズ0.22μmのメンブランフィルターにより濾過して、静
脈内投与用製剤とする。 アンチセンスオリゴヌクレオチド(注1)・・・500mg 塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・8.6g 塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・・・・0.3g 塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・・・・0.33g 注射用蒸留水・・・・・・・・・・・・・全量 1000ml 注1: 配列表の配列番号3に示された塩基配列よりなるホスホロチオエートオ リゴDNA

【0086】<製剤実施例2>下記の処方に従って必要
量の基剤成分を混合して溶解し、これにアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを溶解させ、所定液量とし、ポアサイ
ズ15nmのフィルター(PLANOVE 15:旭化成)により濾
過して、静脈内投与用製剤とする。 アンチセンスオリゴヌクレオチド(注2)・・・100mg 塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・8.3g 塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・・・・0.3g 塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・・・・0.33g リン酸水素ナトリウム・12水塩・・・・・・・・1.8g 1N塩酸・・・・・・・・・・・・・適量(pH7.4) 注射用蒸留水・・・・・・・・・・・・・全量 1000ml 注2: 配列表の配列番号4に示された塩基配列よりなるホスホロチオエートオ リゴDNA

【0087】<製剤実施例3>下記の処方に従って必要
量の基剤成分を混合して溶解し、これにアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを溶解させ、所定液量とし、ポアサイ
ズ35nmのフィルター(PLANOVE 35:旭化成)により濾
過して、静脈内投与用製剤とする。 アンチセンスオリゴヌクレオチド(注3)・・・100mg 塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・8.3g 塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・・・・0.3g 塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・・・・0.33g グルコース・・・・・・・・・・・・・・・・・0.4g リン酸水素ナトリウム・12水塩・・・・・・・・1.8g 1N塩酸・・・・・・・・・・・・・適量(pH7.4) 注射用蒸留水・・・・・・・・・・・・・全量 1000ml 注3: 配列表の配列番号3に示された塩基配列よりなるホスホロチオエートオ リゴDNA

【0088】

【配列表】 Sequence Listing <110> JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. <120> Pharmaceutical Composition for Treatment of Duchenne Muscular Dyst rophy <130> P88-00 <160> 6 <210> 1 <211> 26 <212> RNA <213> Homo sapience <400> 1 agcaagaaga cagcagcauu gcaaag 26 <210> 2 <211> 26 <212> RNA <213> Homo sapience <400> 2 ggaagcuaag gaagaagcug agcagg 26 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapience <400> 3 gcactttgca atgctgctgt cttcttgcta t 31 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapience <400> 4 gacctgctca gcttcttcct tagcttccag c 31 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapience <400> 5 gcaagatgcc agcaga 16 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapience <400> 6 aactgcaaga tgccagcaga tcagctcagg c 31

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 47/10 A61K 47/12 47/12 47/14 47/14 47/16 47/16 47/18 47/18 47/26 47/26 47/28 47/28 48/00 48/00 A61P 21/00 A61P 21/00 C12N 15/00 ZNAA Fターム(参考) 4B024 AA01 CA04 CA12 DA02 GA13 GA18 HA12 HA17 4C076 AA29 CC09 DD01 DD03 DD08 DD09 DD22 DD23 DD26 DD38 DD43 DD50 DD51 DD66 DD67 FF16 FF17 FF61 GG06 4C084 AA13 MA05 MA44 NA14 ZA941 ZA942 ZC541 ZC542 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 NA14 ZA94 ZC54

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】配列表において配列番号1で示された塩基
    配列を有するRNA及び該塩基配列に対する相補的塩基
    配列に対して相補的である塩基配列を有するDNAより
    なる群より選ばれるオリゴヌクレオチド。
  2. 【請求項2】配列表において配列番号2で示された塩基
    配列を有するRNA及び該塩基配列に対する相補的塩基
    配列に対して相補的である塩基配列を有するDNAより
    なる群より選ばれるオリゴヌクレオチド。
  3. 【請求項3】配列表において配列番号1で示された塩基
    配列に対して相補的な塩基配列を含んでなるアンチセン
    スオリゴヌクレオチド。
  4. 【請求項4】配列表において配列番号2で示された塩基
    配列に対して相補的な塩基配列を含んでなるアンチセン
    スオリゴヌクレオチド。
  5. 【請求項5】配列表において配列番号3で示された塩基
    配列を有するDNA及びこれと同一の塩基配列を有する
    ホスホロチオエートDNAよりなる群より選ばれるもの
    である、請求項3のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  6. 【請求項6】配列表において配列番号4で示された塩基
    配列を有するDNA及びこれと同一の塩基配列を有する
    ホスホロチオエートDNAよりなる群より選ばれるもの
    である、請求項4のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  7. 【請求項7】ヒトジストロフィンmRNAにおけるエク
    ソン43に隣接するエクソンを構成する塩基配列におい
    て正常な塩基配列からの塩基の欠失による塩基数の変化
    に起因するデュシェンヌ型筋ジストロフィーであって、
    該塩基数の正味の変化が(3×N+1)個(Nはゼロ又
    は自然数)の塩基の減少として表されるものであるデュ
    シェンヌ型筋ジストロフィーの治療剤の製造のための、
    請求項3又は5のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使
    用。
  8. 【請求項8】ヒトジストロフィンmRNAにおけるエク
    ソン53に隣接するエクソンを構成する塩基配列におい
    て正常な塩基配列からの塩基の欠失による塩基数の変化
    に起因するデュシェンヌ型筋ジストロフィーであって、
    該塩基数の正味の変化が(3×N+1)個(Nはゼロ又
    は自然数)の塩基の減少として表されるものであるデュ
    シェンヌ型筋ジストロフィーの治療剤の製造のための、
    請求項4又は6のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使
    用。
  9. 【請求項9】薬剤学的に許容し得る注射可能な媒質中
    に、請求項3又は5のアンチセンスオリゴヌクレオチド
    を含有することを特徴とする、ヒトジストロフィンmR
    NAにおけるエクソン43に隣接するエクソンを構成す
    る塩基配列において正常な塩基配列からの塩基の欠失に
    よる塩基数の変化に起因するデュシェンヌ型筋ジストロ
    フィーであって、該塩基数の正味の変化が(3×N+
    1)個(Nはゼロ又は自然数)の塩基の減少として表さ
    れるものであるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療
    剤。
  10. 【請求項10】薬剤学的に許容し得る注射可能な媒質中
    に、請求項4又は6のアンチセンスオリゴヌクレオチド
    を含有することを特徴とする、ヒトジストロフィンmR
    NAにおけるエクソン53に隣接するエクソンを構成す
    る塩基配列において正常な塩基配列からの塩基の欠失に
    よる塩基数の変化に起因するデュシェンヌ型筋ジストロ
    フィーであって、該塩基数の正味の変化が(3×N+
    1)個(Nはゼロ又は自然数)の塩基の減少として表さ
    れるものであるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療
    剤。
  11. 【請求項11】0.05〜5μmoles/mlの該アンチセン
    スオリゴヌクレオチド、0.02〜10%w/vの炭水化物又
    は多価アルコール及び0.01〜0.4%w/vの薬剤学的に
    許容し得る界面活性剤を含有する、請求項9又は10の
    治療剤。
  12. 【請求項12】0.03〜0.09Mの薬剤学的に許容し得る中
    性塩を含有する、請求項11の治療剤。
  13. 【請求項13】該中性塩が塩化ナトリウム、塩化カリウ
    ム、及び塩化カルシウムよりなる群より選ばれるもので
    ある、請求項12の治療剤。
  14. 【請求項14】0.002〜0.05Mの薬剤学的に許容し得る
    緩衝剤を含有する、請求項9ないし13の何れかの治療
    剤。
  15. 【請求項15】該緩衝剤が、クエン酸ナトリウム、ナト
    リウムグリシネート、リン酸ナトリウム、トリス(ヒド
    ロキシメチル)アミノメタンよりなる群より選ばれるも
    のである、請求項14の治療剤。
  16. 【請求項16】該炭水化物が単糖類及び2糖類よりなる
    群より選ばれるものである、請求項11ないし15の何
    れかの治療剤。
  17. 【請求項17】該炭水化物又は多価アルコールが、グル
    コース、ガラクトース、マンノース、ラクトース、マル
    トース、マンニトール及びソルビトールよりなる群より
    選ばれるものである、請求項11ないし16の何れかの
    治療剤。
  18. 【請求項18】該界面活性剤が、ポリオキシエチレンソ
    ルビタンモノ〜トリ−エステル、アルキルフェニルポリ
    オキシエチレン、ナトリウムタウロコラート、ナトリウ
    ムコラート及び多価アルコールエステルよりなる群より
    選ばれるものである、請求項11ないし17の治療剤。
  19. 【請求項19】該ポリオキシエチレンソルビタンエステ
    ルが、オレエート、ラウレート、ステアレート及びパル
    ミテートよりなる群より選ばれるエステルである、請求
    項18の治療剤。
  20. 【請求項20】凍結乾燥された状態の、請求項9ないし
    19の何れかの治療剤。
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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1160318A2 (en) * 2000-04-26 2001-12-05 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Medicament for treatment of Duchenne muscular dystrophy
EP2135948A2 (en) 2002-11-25 2009-12-23 Masafumi Matsuo ENA nucleic acid drugs modifying splicing in mRNA precursor
WO2012029986A1 (ja) * 2010-09-01 2012-03-08 日本新薬株式会社 アンチセンス核酸
JP2013536195A (ja) * 2010-08-20 2013-09-19 レプリコール インコーポレーティッド オリゴヌクレオチドキレート錯体
JP2014507143A (ja) * 2011-02-08 2014-03-27 ザ シャーロット−メクレンバーグ ホスピタル オーソリティ ドゥーイング/ビジネス/アズ キャロライナズ ヘルスケア システム アンチセンスオリゴヌクレオチド
US8871918B2 (en) 2008-10-24 2014-10-28 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for DMD
US9018368B2 (en) 2004-06-28 2015-04-28 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9217148B2 (en) 2013-03-14 2015-12-22 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy
US9228187B2 (en) 2009-11-12 2016-01-05 The University Of Western Australia Antisense molecules and methods for treating pathologies
JP2016104795A (ja) * 2000-09-21 2016-06-09 アカデミス ツィーケンホイス ライデン 真核細胞におけるエキソンスキッピングの誘導
US9506058B2 (en) 2013-03-15 2016-11-29 Sarepta Therapeutics, Inc. Compositions for treating muscular dystrophy

Cited By (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1160318A2 (en) * 2000-04-26 2001-12-05 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Medicament for treatment of Duchenne muscular dystrophy
EP1160318A3 (en) * 2000-04-26 2004-06-23 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Medicament for treatment of Duchenne muscular dystrophy
EP1544297A3 (en) * 2000-04-26 2005-07-06 JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. Medicament for treatment of Duchenne muscular dystrophy
JP2016104795A (ja) * 2000-09-21 2016-06-09 アカデミス ツィーケンホイス ライデン 真核細胞におけるエキソンスキッピングの誘導
JP2016182122A (ja) * 2002-11-25 2016-10-20 雅文 松尾 mRNA前駆体のスプライシングを修飾するENA核酸医薬
US7902160B2 (en) 2002-11-25 2011-03-08 Masafumi Matsuo ENA nucleic acid drugs modifying splicing in mRNA precursor
JP2010229132A (ja) * 2002-11-25 2010-10-14 Masafumi Matsuo mRNA前駆体のスプライシングを修飾するENA核酸医薬
EP2374885A2 (en) 2002-11-25 2011-10-12 Masafumi Matsuo ENA nucleic acid drugs modifying splicing in mRNA precursor
EP2386636A2 (en) 2002-11-25 2011-11-16 Masafumi Matsuo ENA nucleic acid drugs modifying splicing in mRNA precursor
EP2392660A2 (en) 2002-11-25 2011-12-07 Masafumi Matsuo ENA Nucleic Acid Drugs Modifying Splicing in mRNA Precursor
US9657050B2 (en) 2002-11-25 2017-05-23 Masafumi Matsuo ENA nucleic acid pharmaceuticals capable of modifying splicing of mRNA precursors
JP2012135314A (ja) * 2002-11-25 2012-07-19 Kobe Tennenbutsu Kagaku Kk mRNA前駆体のスプライシングを修飾するENA核酸医薬
EP2530155A1 (en) 2002-11-25 2012-12-05 Masafumi Matsuo ENA nucleic acid drugs modifying splicing in mRNA precursor
EP2530153A1 (en) 2002-11-25 2012-12-05 Masafumi Matsuo ENA nucleic acid drugs modifying splicing in mRNA precursor
EP2530154A1 (en) 2002-11-25 2012-12-05 Masafumi Matsuo ENA nucleic acid drugs modifying splicing in mRNA precursor
EP2530156A1 (en) 2002-11-25 2012-12-05 Masafumi Matsuo ENA nucleic acid drugs modifying splicing in mRNA precursor
US9657049B2 (en) 2002-11-25 2017-05-23 Masafumi Matsuo ENA nucleic acid pharmaceuticals capable of modifying splicing of mRNA precursors
EP2135948A2 (en) 2002-11-25 2009-12-23 Masafumi Matsuo ENA nucleic acid drugs modifying splicing in mRNA precursor
US8624019B2 (en) 2002-11-25 2014-01-07 Masafumi Matsuo ENA nucleic acid drugs modifying splicing in mRNA precursor
JP2015180208A (ja) * 2002-11-25 2015-10-15 雅文 松尾 mRNA前駆体のスプライシングを修飾するENA核酸医薬
JP4777777B2 (ja) * 2002-11-25 2011-09-21 雅文 松尾 mRNA前駆体のスプライシングを修飾するENA核酸医薬
JP2014110798A (ja) * 2002-11-25 2014-06-19 Masafumi Matsuo mRNA前駆体のスプライシングを修飾するENA核酸医薬
US9243026B2 (en) 2002-11-25 2016-01-26 Daiichi Sankyo Company, Limited ENA nucleic acid pharmaceuticals capable of modifying splicing of mRNA precursors
US9018368B2 (en) 2004-06-28 2015-04-28 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9024007B2 (en) 2004-06-28 2015-05-05 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9994851B2 (en) 2004-06-28 2018-06-12 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9447415B2 (en) 2004-06-28 2016-09-20 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9035040B2 (en) 2004-06-28 2015-05-19 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9175286B2 (en) 2004-06-28 2015-11-03 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9422555B2 (en) 2004-06-28 2016-08-23 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9605262B2 (en) 2004-06-28 2017-03-28 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9249416B2 (en) 2004-06-28 2016-02-02 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9441229B2 (en) 2004-06-28 2016-09-13 The University Of Western Australia Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
US9447417B2 (en) 2008-10-24 2016-09-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for DMD
US8871918B2 (en) 2008-10-24 2014-10-28 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for DMD
US9453225B2 (en) 2008-10-24 2016-09-27 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for DMD
US9447416B2 (en) 2008-10-24 2016-09-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for DMD
US9434948B2 (en) 2008-10-24 2016-09-06 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for DMD
US9234198B1 (en) 2008-10-24 2016-01-12 Sarepta Therapeutics, Inc. Multiple exon skipping compositions for DMD
US9228187B2 (en) 2009-11-12 2016-01-05 The University Of Western Australia Antisense molecules and methods for treating pathologies
US9758783B2 (en) 2009-11-12 2017-09-12 The University Of Western Australia Antisense molecules and methods for treating pathologies
JP2013536195A (ja) * 2010-08-20 2013-09-19 レプリコール インコーポレーティッド オリゴヌクレオチドキレート錯体
US9079934B2 (en) 2010-09-01 2015-07-14 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antisense nucleic acids
WO2012029986A1 (ja) * 2010-09-01 2012-03-08 日本新薬株式会社 アンチセンス核酸
JP2016104021A (ja) * 2010-09-01 2016-06-09 日本新薬株式会社 アンチセンス核酸
JP2014054250A (ja) * 2010-09-01 2014-03-27 Nippon Shinyaku Co Ltd アンチセンス核酸
JP5363655B2 (ja) * 2010-09-01 2013-12-11 日本新薬株式会社 アンチセンス核酸
US9708361B2 (en) 2010-09-01 2017-07-18 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antisense nucleic acids
JP2014507143A (ja) * 2011-02-08 2014-03-27 ザ シャーロット−メクレンバーグ ホスピタル オーソリティ ドゥーイング/ビジネス/アズ キャロライナズ ヘルスケア システム アンチセンスオリゴヌクレオチド
US9217148B2 (en) 2013-03-14 2015-12-22 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy
US9506058B2 (en) 2013-03-15 2016-11-29 Sarepta Therapeutics, Inc. Compositions for treating muscular dystrophy

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