BR112016029369B1

BR112016029369B1 - oligômero antissentido, composição farmacêutica uso de um oligômero antissentido ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo, e, métodos para fabricação e para triagem de um oligômero antissentido

Info

Publication number: BR112016029369B1
Application number: BR112016029369-0A
Authority: BR
Inventors: Naoki Watanabe; Yuuichirou TONE; Shin'ichi Takeda; Tetsuya Nagata
Original assignee: Nippon Shinyaku Co., Ltd.; National Center Of Neurology And Psychiatry
Priority date: 2014-06-17
Filing date: 2015-06-16
Publication date: 2020-12-08
Also published as: EP3159409A1; EP3159409B1; UA121117C2; TWI721461B; US11193125B2; ZA201700142B; JP6208349B2; TW201625274A; CN111575282B; RS59764B1; HUE047502T2; CN106661577B; JP6701139B2; KR102335810B1; MX2020004417A; IL249574B; SG11201610130VA; JP7041879B2; RU2017101172A3; PH12016502501A1

Abstract

OLIGÔMERO ANTISSENTIDO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UM OLIGÔMERO ANTISSENTIDO OU UM SAL OU HIDRATO FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEL DO MESMO, E, MÉTODOS PARA FABRICAÇÃO E PARA TRIAGEM DE UM OLIGÔMERO ANTISSENTIDO. É provida uma droga que provê salto do éxon altamente eficiente. A presente invenção provê um oligômero antissentido tendo pelo menos dois oligômeros unitários que alvejam redes que não são nem contínuos nem se sobrepõem no mesmo éxon.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção se refere a um oligômero antissentido para saltar o éxon, compreendendo uma sequência de nucleotídeos complementar a duas ou mais diferentes sequências em um éxon alvo. Mais especificamente, a presente invenção se refere a um oligômero antissentido que provoca salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano, e uma composição farmacêutica compreendendo o oligômero.

[002] Distrofia muscular de Duchenne (DMD) é a forma mais frequente de distrofia muscular progressiva hereditária que afeta um em cerca de 3.500 garotos recém-nascidos. Embora as funções motoras sejam raramente diferentes de humanos saudáveis na primeira infância e infância, fraqueza muscular é observada em crianças em torno de 4 a 5 anos de idade. Então, fraqueza muscular progride para a perda de ambulação em cerca de 12 anos de idade e morte devido à insuficiência cardíaca ou respiratória aos vinte e poucos anos. DMD é um distúrbio severo como este. Atualmente, não há terapia efetiva para DMD disponível e é fortemente desejado desenvolver um agente terapêutico inédito.

[003] DMD é conhecida como causada por uma mutação no gene da distrofina. O gene da distrofina é localizado no cromossomo X e é um gene enorme que consiste em 2,2 milhões de pares de nucleotídeo de DNA. DNA é transcrito nos precursores de RNAm e íntrons são removidos por processamento de RNA para sintetizar RNAm de 13.993 bases, no qual 79 éxons são unidos. Este RNAm é traduzido em 3.685 aminoácidos para produzir a proteína distrofina. A proteína distrofina é associada com a manutenção da estabilidade da membrana em células musculares e necessária para tornar as células musculares menos frágeis. O gene da distrofina de pacientes com DMD contém uma mutação e, assim, a proteína distrofina, que é funcional em células musculares, é raramente expressa. Desta forma, a estrutura das células musculares não pode ser mantida no corpo dos pacientes com DMD, levando a um grande influxo de íons cálcio nas células musculares. Consequentemente, uma resposta tipo inflamação ocorre para promover fibrose, de maneira tal que células musculares possam ser regeneradas somente com dificuldade.

[004] Distrofia muscular de Becker (BMD) também é causada por uma mutação no gene da distrofina. Os sintomas envolvem fraqueza muscular, mas são tipicamente brandos e lentos no progresso da fraqueza muscular, quando comparada à DMD. Em muitos casos, seu início de ação é na idade adulta. Considera-se que diferenças nos sintomas clínicos entre DMD e BMD residem em se o quadro de leitura para aminoácidos na tradução de RNAm de distrofina na proteína distrofina é interrompido pela mutação ou não (Documento Não Patente 1). Mais especificamente, em DMD, a presença de mutação desloca o quadro de leitura do aminoácido, de maneira tal que a expressão da proteína distrofina funcional seja abolida, enquanto que em BMD a proteína distrofina que funciona, apesar de imperfeitamente, é produzida em virtude de o quadro de leitura do aminoácido ser preservado, embora uma parte dos éxons seja removida pela mutação.

[005] Espera-se que o salto de éxon sirva como um método para tratar DMD. Este método envolve modificar a processamento de RNA para restaurar o quadro de leitura do aminoácido do RNAm de distrofina e induzir a expressão da proteína distrofina tendo a função parcialmente restaurada (Documento Não Patente 2). A parte da sequência de aminoácidos, que é um alvo para saltar o éxon, será perdida. Por esta razão, a proteína distrofina expressa por este tratamento fica menor que a normal, mas, uma vez que o quadro de leitura do aminoácido é mantido, a função para estabilizar células musculares é parcialmente retida. Consequentemente, espera-se que salto do éxon leve DMD aos sintomas similares aos da BMD, que são mais brandos. A abordagem do salto do éxon passou nos testes em animal usando camundongos ou cães e, agora, é atualmente avaliada em experimentos clínicos em pacientes com DMD humanos.

[006] O salto de um éxon pode ser induzido ligando ácidos nucleicos antissentido que direcionam tanto sítio de processamento de RNA 5’ quanto 3’ ou ambos os sítios, ou sítios internos de éxon. Um éxon somente será incluído no RNAm quando ambos os sítios de processamento de RNA do mesmo forem reconhecidos pelo complexo spliceossoma. Assim, salto do éxon pode ser induzido direcionando os sítios de processamento de RNA com ácidos nucleicos antissentido. Além do mais, a ligação de uma proteína SR, que é rica em serina e arginina, a um melhorador do processamento de RNA exônico (ESE) é considerada necessária para um éxon ser reconhecido pelo mecanismo de processamento de RNA. Desta maneira, salto do éxon também pode ser induzido pelo ESE de direcionamento.

[007] Uma vez que uma mutação do gene da distrofina pode variar dependendo dos pacientes com DMD, ácidos nucleicos antissentido precisam ser projetados com base no sítio ou tipo da respectiva mutação genética. Existem muitos relatos de ácidos nucleicos antissentido que induzem salto do éxon com uma sequência consecutiva como um alvo para um único éxon no gene da distrofina (Documentos Patentes 1 a 6 e Documentos Não Patentes 1 e 2). Também, foi reportado que quando dois tipos de ácidos nucleicos antissentido que direcionam o mesmo éxon no gene da distrofina são misturados e agem naturalmente (direcionamento duplo), a atividade de saltar pode ser melhorada, comparada com o uso de cada ácido nucleico antissentido sozinho (Documento Patente 7).

[008] Entretanto, nenhum dos relatos anteriores mostra que um ácido nucleico antissentido de fita simples conectado (tipo conectado) que direciona dois ou mais sítios no mesmo éxon apresenta atividade de salto (Documento Patente 1). DOCUMENTO DA TÉCNICA ANTERIOR Documento Patente Documento Patente 1: Pedido de patente internacional WO 2004/048570 Documento Patente 2: Pedido de patente internacional WO 2009/139630 Documento Patente 3: Pedido de patente internacional WO 2010/048586 Documento Patente 4: US 2010/0168212 Documento Patente 5: Pedido de patente internacional WO 2011/057350 Documento Patente 6: Pedido de patente internacional WO 2006/000057 Documento Patente 7: Pedido de patente internacional WO 2007/135105 Documento Não Patente Documento Não Patente 1: Annemieke Aartsma-Rus et al., (2002) Neuromuscular Disorders 12: S71-S77 Documento Não Patente 2: Wilton S. D., e t al., Molecular Therapy 2007: 15: p. 1288-96

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO PROBLEMAS A SER RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO

[009] Netas circunstâncias, um objetivo principal da presente invenção é prover um oligômero antissentido tipo conectado inédito que induz salto do éxon direcionando duas sequências de nucleotídeos diferentes no mesmo éxon no gene da distrofina, e um agente terapêutico para distrofia muscular compreendendo o oligômero.

MEIOS PARA RESOLVER O PROBLEMA

[0010] Os presentes inventores conduziram estudos abrangentes dos conteúdos das técnicas descritas nos documentos descritos anteriormente e a estrutura do gene da distrofina, etc. e, consequentemente, descobriram que um oligômero antissentido obtido conectando oligômeros que direcionam dois diferentes sítios no éxon 44 no gene da distrofina de humano pode induzir o salto deste éxon. Com base nesta descoberta, os presentes inventores concluíram a presente invenção.

[0011] Isto é, a presente invenção é como se segue. [1] Um oligômero antissentido tendo um comprimento de 15 a 30 bases em que (a) um primeiro oligômero unitário compreendendo uma sequência de nucleotídeos complementar a uma primeira sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas em um éxon alvo; e (b) um segundo oligômero unitário compreendendo uma sequência de nucleotídeos complementar a uma segunda sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas no éxon alvo são conectados, em que a primeira sequência de nucleotídeos e a segunda sequência de nucleotídeos não são nem consecutivas nem se sobrepõe uma à outra, e o oligômero antissentido induz salto do éxon alvo, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo. [2] O oligômero antissentido de acordo com [1], em que o primeiro e/ou segundo oligômero unitário compreende uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos parcial de um íntron adjacente ao éxon alvo, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo. [3] O oligômero antissentido de acordo com [1] ou [2], em que o éxon alvo é um éxon em gene da distrofina de humano, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo. [4] O oligômero antissentido de acordo com [1] ou [2], em que a primeira sequência de nucleotídeos é uma sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas selecionada da sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo. [5] O oligômero antissentido de acordo com qualquer um de [1] a [3], em que a segunda sequência de nucleotídeos é uma sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas selecionada da sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 2, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo. [6] O oligômero antissentido de acordo com [1] ou [2], em que dois oligômeros unitários selecionados do grupo que consiste no seguinte (c) a (e) são conectados: (c) um oligômero unitário que consiste em uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas selecionada da sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 3; (d) um oligômero unitário que consiste em uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas selecionada da sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 4; e (e) um oligômero unitário que consiste em uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas selecionada da sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 5, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo. [7] O oligômero antissentido de acordo com [1] ou [2], que consiste em uma sequência de nucleotídeos selecionada de um grupo que consiste em SEQ ID Nos: 6 a 9, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo. [8] O oligômero antissentido de acordo com qualquer um de [1] a [7], que é um oligonucleotídeo, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo. [9] O oligômero antissentido de acordo com [8], em que a fração de açúcar e/ou a região de ligação do fosfato de pelo menos um nucleotídeo que constitui o oligonucleotídeo é modificado, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo. [10] O oligômero antissentido de acordo com [8] ou [9], em que a fração de açúcar de pelo menos um nucleotídeo que constitui o oligonucleotídeo é uma ribose na qual o grupo 2’-OH é substituído por qualquer um selecionado do grupo que consiste em OR, R, R’OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br e I (em que R é um alquila ou um arila e R’ é um alquileno), ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo. [11] O oligômero antissentido de acordo com qualquer um de [8] a [10], em que a região de ligação do fosfato de pelo menos um nucleotídeo que constitui o oligonucleotídeo é qualquer uma selecionada do grupo que consiste em uma ligação de fosforotioato, uma ligação de fosforoditioato, uma ligação de alquilfosfonato, uma ligação de fosforamidato e uma ligação de boranofosfato, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo. [12] O oligômero antissentido de acordo com qualquer um de [1] a [7], que é um oligômero de morfolino, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo. [13] O oligômero antissentido de acordo com a reivindicação [12], que é um oligômero de morfolino, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo. [14] O oligômero antissentido de acordo com [12] ou [13], em que a extremidade 5’ é qualquer uma das fórmulas químicas (1) a (3) a seguir, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo. [Fórmula 1]

[15] Uma composição farmacêutica para o tratamento de distrofia muscular, compreendendo como um ingrediente ativo o oligômero antissentido de acordo com qualquer um de [1] a [14], ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo. [16] A composição farmacêutica de acordo com [15], compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável. [17] Um método para o tratamento de distrofia muscular, que compreende prover a um paciente com distrofia muscular o oligômero antissentido ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com qualquer um de [1] a [12] ou a composição farmacêutica de acordo com [1] ou [16]. [18] O método para tratamento de acordo com [17], em que o paciente com distrofia muscular tem uma mutação(ões) que é para ser direcionada para o éxon 44 que salta no gene gistrofina. [19] O método para tratamento de acordo com [17] ou [18], em que o paciente é um humano. [20] O uso do oligômero antissentido ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com qualquer um de [1] a [14] na fabricação da composição farmacêutica para o tratamento de distrofia muscular. [21] O oligômero antissentido, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com qualquer um de [1] a [14], que é aplicado para o tratamento de distrofia muscular. [22] O oligômero antissentido, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo de acordo com [21] em que o paciente com distrofia muscular no dito tratamento tem uma mutação(ões) que é para ser direcionada para éxon 44 que salta no gene gistrofina. [23] O oligômero antissentido de acordo com [21] ou [22], ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o paciente é um humano. [24] Um método para fabricação do oligômero antissentido de acordo com [1], que compreende conectar (a) um primeiro oligômero unitário compreendendo uma sequência de nucleotídeos complementar a uma primeira sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas em um éxon alvo; e (b) um segundo oligômero unitário compreendendo uma sequência de nucleotídeos complementar a uma segunda sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas no éxon alvo para produzir um oligômero antissentido tendo um comprimento de 15 a 30 bases, em que a primeira sequência de nucleotídeos e a segunda sequência de nucleotídeos não são nem consecutivas nem se sobrepõe uma à outra. [25] O método de acordo com [24], que adicionalmente compreende: medir a eficiência do salto pelo oligômero antissentido obtido; e selecionar um oligômero antissentido tendo a eficiência do salto que excede um valor de referência. [26] Um método para triagem de um oligômero antissentido, que compreende: (a) selecionar (i) um primeiro oligômero unitário compreendendo uma sequência de nucleotídeos complementar a uma primeira sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas em um éxon alvo; e (ii) um segundo oligômero unitário compreendendo uma sequência de nucleotídeos complementar a uma segunda sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas no éxon alvo, em que a primeira sequência de nucleotídeos e a segunda sequência de nucleotídeos não são nem consecutivas nem se sobrepõe uma à outra; (b) conectar o primeiro e segundo oligômeros unitários para produzir um oligômero antissentido tendo um comprimento de 15 a 30 bases; (c) medir a eficiência do salto pelo oligômero antissentido obtido na etapa (b); e (d) selecionar um oligômero antissentido tendo a eficiência do salto que excede um valor de referência.

EFEITOS DA INVENÇÃO

[0012] O oligômero antissentido da presente invenção pode induzir o salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano com uma alta eficiência. Também, os sintomas da distrofia muscular de Duchenne podem ser efetivamente aliviados administrando a composição farmacêutica da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0013] FIGURA 1 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em linha celular de rabdomiossarcoma humano (células RD).

[0014] FIGURA 2 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0015] FIGURA 3 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0016] FIGURA 4 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0017] FIGURA 5 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0018] FIGURA 6 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0019] FIGURA 7 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0020] FIGURA 8 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0021] FIGURA 9 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0022] FIGURA 10 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0023] FIGURA 11 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0024] FIGURA 12 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0025] FIGURA 13 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0026] FIGURA 14 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0027] FIGURA 15 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0028] FIGURA 16 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0029] FIGURA 17 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0030] FIGURA 18 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0031] FIGURA 19 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0032] FIGURA 20 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0033] FIGURA 21 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0034] FIGURA 22 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0035] FIGURA 23 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0036] FIGURA 24 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0037] FIGURA 25 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0038] FIGURA 26 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) nas respectivas concentrações dos oligômeros.

[0039] FIGURA 27 mostra uma comparação da eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) entre uma forma conectada e uma mistura de dois oligômeros unitários que direcionam diferentes sítios.

[0040] FIGURA 28 mostra uma comparação da eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) entre uma forma conectada e uma mistura de dois oligômeros unitários que direcionam diferentes sítios.

[0041] FIGURA 29 mostra uma comparação da eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) entre uma forma conectada e uma mistura de dois oligômeros unitários que direcionam diferentes sítios.

[0042] FIGURA 30 mostra uma comparação da eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) entre cada uma sozinha, uma forma conectada e uma mistura de dois oligômeros unitários que direcionam diferentes sítios.

[0043] FIGURA 31 mostra uma comparação da eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano em células de rabdomiossarcoma humano (células RD) entre cada uma sozinha, uma forma conectada e uma mistura de dois oligômeros unitários que direcionam diferentes sítios.

[0044] FIGURA 32 mostra a eficiência do salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano nos fibroblastos do paciente com DMD humano com deleção do éxon 45.

MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO

[0045] A seguir, a presente invenção é descrita em detalhes. As modalidades descritas a seguir devem ser apresentadas a título de exemplo meramente para descrever a invenção, mas não limitadas somente às seguintes modalidades. A presente invenção pode ser implementada de várias maneiras sem fugir da essência da invenção.

[0046] Todas as publicações, pedidos de patente publicados, patentes e outros documentos citados no pedido de patente estão aqui incorporados pela referência na íntegra. O relatório descritivo, pelo presente, incorpora pela referência os conteúdos do relatório descritivo e desenhos no pedido de patente japonês (No. 2014-124157) depositado em 17 de junho de 2014, do qual prioridade foi reivindicada.

1. Oligômero antissentido

[0047] A presente invenção provê um oligômero antissentido tendo um comprimento de 15 a 30 bases em que (a) um primeiro oligômero unitário compreendendo uma sequência de nucleotídeos complementar a uma primeira sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas em um éxon alvo; e (b) um segundo oligômero unitário compreendendo uma sequência de nucleotídeos complementar a uma segunda sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas no éxon alvo são conectados, em que a primeira sequência de nucleotídeos e a segunda sequência de nucleotídeos não são nem consecutivas nem se sobrepõe uma à outra, e o oligômero antissentido induz salto do éxon alvo, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo. A seguir, “um oligômero antissentido, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo” pode ser genericamente chamado “um oligômero antissentido” coletivamente.

[0048] O oligômero antissentido descrito anteriormente pode ser fabricado por um método para fabricação que compreende conectar (a) um primeiro oligômero unitário compreendendo uma sequência de nucleotídeos complementar a uma primeira sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas em um éxon alvo; e (b) um segundo oligômero unitário compreendendo uma sequência de nucleotídeos complementar a uma segunda sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas no éxon alvo para produzir um oligômero antissentido tendo um comprimento de 15 a 30 bases, em que a primeira sequência de nucleotídeos e a segunda sequência de nucleotídeos não são nem consecutivas nem se sobrepõem uma à outra.

[0049] O método para fabricação pode adicionalmente compreender a etapa de medir a eficiência do salto pelo oligômero antissentido obtido, e uma etapa secundária de selecionar um oligômero antissentido tendo a eficiência do salto que excede um valor de referência.

[0050] Na etapa secundária do método de fabricação descrito anteriormente, a eficiência do salto pode ser determinada como se segue. O RNAm para o gene compreendendo o éxon direcionado é coletado das células de teste; no RNAm, o nível do polinucleotídeo “A” da banda onde o éxon direcionado é saltado e o nível do polinucleotídeo “B” da banda onde o éxon direcionado não é saltado são medidos. Usando estes valores de medição de “A” e “B,” a eficiência é calculada pela seguinte equação: Eficiência do salto (%) = A/(A + B) x 100

[0051] Alternativamente, para o cálculo da eficiência do salto, o pedido de patente internacional WO2012/029986 pode ser referido.

[0052] Na etapa secundária, a eficiência do salto usada como o valor de referência é 10% ou mais, 20% ou mais, 30% ou mais, 40% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais ou 90% ou mais.

[0053] Conectando uma pluralidade de oligômeros unitários, conforme mencionado anteriormente, um oligômero antissentido tendo melhor atividade de salto pode ser obtido mesmo se cada dos oligômeros unitários tiver baixa atividade de salto (ou nenhuma atividade de salto).

[0054] A presente invenção também provê um método para triagem de um oligômero antissentido, que compreende: (a) selecionar (i) um primeiro oligômero unitário compreendendo uma sequência de nucleotídeos complementar a uma primeira sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas em um éxon alvo; e (ii) um segundo oligômero unitário compreendendo uma sequência de nucleotídeos complementar a uma segunda sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas no éxon alvo, em que a primeira sequência de nucleotídeos e a segunda sequência de nucleotídeos não são nem consecutivas nem se sobrepõe uma à outra; (b) conectar o primeiro e segundo oligômeros unitários para produzir um oligômero antissentido tendo um comprimento de 15 a 30 bases; (c) medir a eficiência do salto pelo oligômero antissentido obtido na etapa (b); e (d) selecionar um oligômero antissentido tendo a eficiência do salto que excede um valor de referência.

[0055] No oligômero antissentido descrito anteriormente, o primeiro e segundo oligômeros unitários podem ser conectados de uma maneira onde qualquer um do primeiro e segundo oligômeros unitários é posicionado no lado 5’ ou 3’ do outro. Em uma modalidade, o primeiro oligômero unitário é posicionado no lado 5’, e o segundo oligômero unitário é posicionado no lado 3’ para a conexão.

[0056] Também, o oligômero antissentido pode compreender um terceiro oligômero unitário compreendendo uma sequência de nucleotídeos complementar a uma terceira sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas no éxon alvo.

[0057] Da forma aqui usada, o termo “conectar” se refere a um onde os dois oligômeros unitários são diretamente ligados um ao outro ou um onde os dois oligômeros unitários são ligados um ao outro por meio de um ligante. Quando os dois oligômeros unitários são diretamente ligados um ao outro, então a extremidade 3’ do oligômero unitário posicionado no lado 5’ e a extremidade 5’ do outro oligômero unitário posicionado no lado 3’ formam uma ligação de fosfato ou um grupo mostrado a seguir. Exemplo do ligante inclui um ácido nucleico (cadeia) de 1 a 5 resíduos, bem como um ligante conhecido normalmente usado para conectar ácidos nucleicos ou derivados de ácido morfolino nucleico, tais como 3-aminopropila, succinila, 2,2’- dietanolsulfonila e alquilamino de cadeia longa (LCAA). [Fórmula 2]

em que X representa -OH, -CH2R1, -O-CH2R1, -S-CH2R1, -NR2R3 ou F; R1 representa H ou um alquila; R2 e R3, que podem ser os mesmos ou diferentes, cada representa H, um alquila, um cicloalquila ou um arila; Y1 representa O, S, CH2 ou NR1; Y2 representa O, S ou NR1; Z representa O ou S.

[0058] O primeiro e/ou segundo oligômero unitário pode compreender uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos parcial de um íntron adjacente ao éxon alvo. Em uma modalidade na qual, por exemplo, o primeiro e segundo oligômeros unitários são conectados um com o outro em uma maneira onde o primeiro oligômero unitário é posicionado no lado 5’ e o segundo oligômero unitário são posicionados no lado 3’, o lado 5’ do primeiro oligômero unitário pode compreender uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos que reside na proximidade da extremidade 3’ de um íntron adjacente no lado 5’ do éxon alvo, e/ou o lado 3’ do segundo oligômero unitário pode compreender uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos que reside na proximidade da extremidade 5’ de um íntron adjacente no lado 3’ do éxon alvo.

[0059] O primeiro e/ou segundo oligômero unitário pode compreender uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos parcial de um melhorador do processamento de RNA exônico (ESE) do éxon alvo.

[0060] O éxon alvo não é particularmente limitado. Em uma modalidade, o éxon alvo é um éxon em um gene humano e é adicionalmente um éxon no gene da distrofina de humano.

[0061] Mais especificamente, o éxon alvo é o éxon 44 no gene da distrofina de humano.

[0062] Assim, em uma modalidade, a presente invenção provê um oligômero antissentido que provoca o salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano (a seguir referido como “o oligômero da presente invenção”). A seguir, a estrutura do oligômero antissentido da presente invenção será descrita em detalhes. [Éxon 44 no gene da distrofina de humano]

[0063] Na presente invenção, o termo “gene” deve significar um gene genômico e também inclui DNAc, precursor de RNAm e RNAm. Preferivelmente, o gene é precursor de RNAm, isto é, pré-RNAm.

[0064] No genoma humano, o gene da distrofina de humano se localiza no local Xp21.2. O gene da distrofina de humano tem um tamanho de 3.0 Mbp e é o maior gene entre os genes humanos conhecidos. Entretanto, as regiões de codificação do gene da distrofina de humano são somente 14kb, distribuídas como 79 éxons em todo o gene da distrofina de humano (Roberts, RG, et al., Genomics, 16: 536-538 (1993)). O pré-RNAm, que é a transcrição do gene da distrofina de humano, se submete a processamento de RNA para gerar RNAm maduro de 14 kb. O gene da distrofina tipo selvagem da sequência de nucleotídeos de humano é conhecido (No. de acesso ao GenBank NM_004006).

[0065] A sequência de nucleotídeos de éxon 44 no gene da distrofina tipo selvagem humano é representado por SEQ ID NO: 10.

[0066] Em uma modalidade, o oligômero da presente invenção é projetado para provocar o salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano, modificando assim a proteína codificada pelo tipo DMD do gene da distrofina no tipo BMD da proteína distrofina. Desta maneira, o éxon 44 no gene da distrofina, que é o alvo do salto do éxon pelo oligômero antissentido da presente invenção, includes tipos tanto selvagem quanto mutante.

[0067] Especificamente, mutantes do éxon 44 do gene da distrofina de humano incluem os polinucleotídeos definidos em (I) ou (II) a seguir. (I) Um polinucleotídeo que hibridiza em condições severas para um polinucleotídeo que consiste em uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 10; e, (II) Um polinucleotídeo que consiste em uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 10.

[0068] Da forma aqui usada, a expressão “polinucleotídeo” deve significar DNA ou RNA.

[0069] Da forma aqui usada, a expressão “polinucleotídeo que hibridiza em condições severas” se refere, por exemplo, a um polinucleotídeo obtido por hibridização de colônia, hibridização de placa, hibridização Southern ou similares, usando como uma sonda todo ou parte de um polinucleotídeo que consiste em uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos de, por exemplo, SEQ ID NO: 10. O método de hibridização que pode ser usado inclui métodos descritos, por exemplo, em “Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001,” “Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997,” etc.

[0070] Da forma aqui usada, a expressão “sequência de nucleotídeos complementar” não é limitada somente às sequências de nucleotídeos que formam pares Watson-Crick com sequências de nucleotídeo salvas, mas deve incluir sequências de nucleotídeos que formam pares de base de Wobble. Da forma aqui usada, o termo par Watson-Crick se refere a um par de nucleobases nas quais ligações de hidrogênio são formadas entre adenina- timina, adenina-uracila ou aguanina-citosina, e o termo par de base de Wobbe se refere a um par de nucleobases no qual ligações de hidrogênio são formadas entre aguanina-uracila, inosina-uracila, inosina-adenina ou inosina- citosina. Da forma aqui usada, o termo “sequência de nucleotídeos complementar” não se refere somente a uma sequência de nucleotídeos 100% complementar à sequência de nucleotídeos alvo, mas também se refere a uma sequência de nucleotídeos complementar que pode conter, por exemplo, 1 a 3, 1 ou 2, ou um nucleotídeo não complementar à sequência de nucleotídeos alvo.

[0071] Da forma aqui usada, a expressão “condições severas” pode ser qualquer de condições severas baixas, condições severas moderadas ou condições severas altas. O termo “condições severas baixas” são, por exemplo, 5x SSC, 5x solução de Denhardt, 0,5% de SDS, 50% de formamida a 32°C. O termo “condições severas moderadas” é, por exemplo, 5x SSC, 5x solução de Denhardt, 0,5% de SDS, 50% de formamida a 42°C, ou 5x SSC, 1% de SDS, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), 50% de formamida a 42°C. O termo “condições severas altas” é, por exemplo, 5x SSC, 5x solução de Denhardt, 0,5% de SDS, 50% de formamida a 50°C ou 0.2 x SSC, 0,1% de SDS a 65°C. Nestas condições, se espera que polinucleotídeos com homologia superior sejam obtidos eficientemente em temperaturas superiores, embora múltiplos fatores estejam envolvidos na severidade da hibridização, incluindo temperatura, concentração da sonda, comprimento da sonda, força iônica, tempo, concentração de sal e outros, e versados na técnica podem apropriadamente selecionar estes fatores para alcançar severidade similar.

[0072] Quando kits comercialmente disponíveis são usados para hibridização, por exemplo, um Alkphos Direct Labeling and Detection System (GE Healthcare) pode ser usado. Neste caso, de acordo com o protocolo anexado, depois do cultivo com uma sonda marcada durante toda a noite, a membrana é lavada com um tampão de lavagem primário contendo 0,1% (p/v) SDS a 55°C, detectando assim polinucleotídeos hibridizados. Alternativamente, na produção de uma sonda com base em toda ou parte da sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 10, hibridização pode ser detectada com um Nucleic Acid Detection Kit DIG (Roche Diagnostics) quando a sonda é marcada com digoxigenina (DIG) usando um reagente comercialmente disponível (por exemplo, um PCR Labeling Mix (Roche Diagnostics), etc.).

[0073] Além dos polinucleotídeos descritos anteriormente, outros polinucleotídeos que podem ser hibridizados incluem polinucleotídeos tendo 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais, 99,1% ou mais, 99,2% ou mais, 99,3% ou mais, 99,4% ou mais, 99,5% ou mais, 99,6% ou mais, 99,7% ou mais, 99,8% ou mais ou 99,9% ou mais de identidade com o polinucleotídeo de SEQ ID NO: 10, calculado por software de pesquisa de homologia BLAST usando os parâmetros predefinidos.

[0074] A identidade entre sequências de nucleotídeos pode ser determinada usando algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) de Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873, 1993). Programas chamados BLASTN e BLASTX, com base no algoritmo BLAST, foram desenvolvidos (Altschul SF, et al: J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). Quando uma sequência de nucleotídeos é sequenciada usando BLASTN, os parâmetros são, por exemplo, pontuação = 100 e tamanho da palavra = 12. Quando programas BLAST e Gapped BLAST são usados, os parâmetros predefinidos para cada programa são empregados.

[0075] O oligômero da presente invenção é especificamente um oligômero antissentido tendo um comprimento de 15 a 30 bases em que dois oligômeros unitários selecionados do grupo que consiste no seguinte (a) e (b) são conectados: (a) um oligômero unitário que consiste em uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas selecionada da sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1; e (b) um oligômero unitário que consiste em uma sequência de nucleotídeos complementar a uma sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas selecionada da sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 2.

[0076] Por exemplo, a primeira sequência de nucleotídeos pode ser uma sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas selecionada da sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 1, e/ou a segunda sequência de nucleotídeos pode ser uma sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas selecionada da sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 2.

[0077] Preferivelmente, o oligômero da presente invenção é um oligômero antissentido tendo um comprimento de 15 a 30 bases no qual dois oligômeros unitários selecionados do grupo que consiste no seguinte (c) a (e) são conectados: (c) um oligômero unitário que consiste em uma sequência complementar a uma sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas selecionada da sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 3; (d) um oligômero unitário que consiste em uma sequência complementar a uma sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas selecionada da sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 4; e (e) um oligômero unitário que consiste em uma sequência complementar a uma sequência de nucleotídeos de 7 a 15 bases consecutivas selecionada da sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 5.

[0078] Aqui, as sequências de nucleotídeos representadas por SEQ ID NOs: 1 e 2 são as sequências que consistem nas 1a a 44a bases e na 58a a 115a a bases, respectivamente, da extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos de éxon 44 (SEQ ID NO: 10) no gene da distrofina tipo selvagem humano.

[0079] A sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 3 é a sequência que consiste nas 18a a 34a bases da extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos de éxon 44 (SEQ ID NO: 10) no gene da distrofina tipo selvagem humano. Similarmente, as sequências de nucleotídeos representadas por SEQ ID NOs: 4 e 5 são as sequências que consistem na 61a a 77a bases e na 88a a 104a bases, respectivamente.

[0080] O tamanho de cada dos oligômeros unitários (a) a (e) (a seguir, também simplesmente referido como “as unidades”) é um comprimento de 7 a 15 bases e é preferivelmente um comprimento de 8 a 15 bases, um comprimento de 9 a 15 bases, um comprimento de 10 a 15 bases, um comprimento de 10 a 14 bases, um comprimento de 10 a 13 bases ou um comprimento de 11 a 13 bases. As unidades (a) a (e) podem ter o mesmo tamanho ou podem ter tamanhos diferentes.

[0081] Para selecionar dois oligômeros unitários do grupo que consiste em (a) e (b), os dois oligômeros unitários podem ser uma combinação dos mesmos oligômeros unitários ou podem ser uma combinação de diferentes oligômeros unitários. Especificamente, os dois oligômeros unitários podem ser uma combinação de (a) e (a) ou uma combinação de (b) e (b) ou podem ser uma combinação de (a) e (b).

[0082] Para selecionar dois oligômeros unitários do grupo que consiste em (c) a (e), os dois oligômeros unitários podem ser uma combinação dos mesmos oligômeros unitários ou podem ser uma combinação de diferentes oligômeros unitários. Preferivelmente, as duas unidades são respectivamente selecionadas de diferentes tipos. Quando, por exemplo, (c) é selecionado como uma unidade, a outra unidade é preferivelmente (d) ou (e). Da mesma maneira, quando (d) é selecionado como uma unidade, a outra unidade é preferivelmente (c) ou (e). Também, quando (e) é selecionado como uma unidade, a outra unidade é preferivelmente (c) ou (d).

[0083] Quando as unidades (a) e (b) são selecionadas, qualquer uma das duas unidades selecionadas pode ser localizada no lado 5’. Quando as unidades (a) e (b) são selecionadas, a unidade (a) é preferivelmente conectada no lado 3’.

[0084] Quando duas unidades são selecionadas de (c) a (e), qualquer uma das duas unidades selecionadas pode ser localizada no lado 5’. Quando as unidades (c) e (d) são selecionadas, a unidade (c) é preferivelmente conectada no lado 3’. Quando as unidades (d) e (e) são selecionadas, a unidade (d) é preferivelmente conectada no lado 3’. Quando as unidades (c) e (e) são selecionadas, a unidade (c) é preferivelmente conectada no lado 3’.

[0085] Da forma aqui usada, o termo “conectar” se refere à ligação direta das duas unidades selecionadas de (a) e (b) ou duas unidades selecionadas de (c) a (e). Especificamente, o termo “quando duas unidades são conectadas” significa que a extremidade 3’ da unidade posicionada no lado 5’ e a extremidade 5’ da unidade posicionado no lado 3’ formam uma ligação de fosfato ou um grupo mostrado a seguir. [Fórmula 3]

[0086] A expressão “provoca salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano” deve significar que, pela ligação do oligômero da presente invenção ao sítio que corresponde ao éxon 44 da transcrição (por exemplo, pré-RNAm) do gene da distrofina de humano, por exemplo, assim resultando na formação de RNAm maduro, que é livre de deslocamento do quadro do códon, a sequência de nucleotídeos que corresponde à extremidade 5’ do éxon 46 é cortada e emendada na sequência de nucleotídeos que corresponde à extremidade 3’ do éxon 43 em pacientes DMD com deleção do éxon 45 quando a transcrição se submete ao processamento de RNA.

[0087] Aqui, o termo “ligação” descrito anteriormente deve significar que, quando o oligômero da presente invenção é misturado com a transcrição do gene da distrofina de humano, ambos são hibridizados em condições fisiológicas para formar um ácido nucleico de fita dupla. O termo “em condições fisiológicas” se refere ao conjunto de condições que imita o ambiente IN VIVO em termos de pH, composição do sal e temperatura. As condições são, por exemplo, 25 a 40°C, preferivelmente 37°C, pH 5 a 8, preferivelmente pH 7,4 e 150 mM de concentração de cloreto de sódio.

[0088] Se o salto do éxon 44 no gene da distrofina de humano é ou não provocado, isto pode ser confirmado introduzindo o oligômero da presente invenção em uma célula de expressão de distrofina (por exemplo, células de rabdomiossarcoma humano), amplificando a região que circunda o éxon 44 do RNAm do gene da distrofina de humano do RNA total da célula de expressão de distrofina por RT-PCR e realizando PCR agrupado ou análise da sequência no produto amplificado de PCR.

[0089] A eficiência do salto pode ser determinada como se segue. O RNAm para o gene da distrofina de humano é coletado das células de teste; no RNAm, o nível do polinucleotídeo “A” da banda onde éxon 44 é saltado e o nível do polinucleotídeo “B” da banda onde éxon 44 não é saltado são medidos. Usando estes valores de medição de “A” e “B,” a eficiência é calculada pela seguinte equação: Eficiência do salto (%) = A/(A + B) x 100

[0090] Alternativamente, para o cálculo da eficiência do salto, o pedido de patente internacional WO2012/029986 pode ser referido.

[0091] Preferivelmente, o oligômero antissentido da presente invenção provoca o salto do éxon direcionado (por exemplo, éxon 44) com a eficiência de 10% ou mais, 20% ou mais, 30% ou mais, 40% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, ou 90% ou mais.

[0092] O oligômero antissentido da presente invenção inclui, por exemplo, um oligonucleotídeo, oligômero de morfolino ou oligômero de ácido nucleico de peptídeo (PNA), tendo um comprimento de 15 a 30 bases. O comprimento é preferivelmente de 16 a 30, de 17 a 30, de 18 a 30, de 19 a 30, de 20 a 30, de 20 a 29, de 20 a 28, de 20 a 27, de 20 a 26, de 21 a 26, ou de 22 a 26 bases e oligômeros de morfolino são preferidos.

[0093] O oligonucleotídeo descrito anteriormente (a seguir referido como “o oligonucleotídeo da presente invenção”) é o oligômero da presente invenção composto de nucleotídeos como unidades constituintes. Tais nucleotídeos podem ser quaisquer de ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos e nucleotídeos modificados.

[0094] O nucleotídeo modificado se refere a um tendo nucleobases completa ou parcialmente modificadas, frações de açúcar e/ou região de ligação dos fosfatos, que constituem no ribonucleotídeo ou desoxirribonucleotídeo.

[0095] A nucleobase inclui, por exemplo, adenina, aguanina, hipoxantina, citosina, timina, uracila, e bases modificadas das mesmas. Exemplos de tais bases modificadas incluem, mas sem limitações, pseudouracila, 3-metiluracila, di-hidrouracila, 5-alquilcitosinas (por exemplo, 5-metilcitosina), 5-alquiluracilas (por exemplo, 5-etiluracila), 5-halouracilas (5-bromouracila), 6-azapirimidina, 6-alquilpirimidinas (6-metiluracila), 2- tiouracila, 4-tiouracila, 4-acetilcitosina, 5-(carbóxi-hidroximetil) uracila, 5’- carboximetilaminometil-2-tiouracila, 5-carboximetilaminometiluracila, 1- metiladenina, 1-metil-hipoxantina, 2,2-dimetilaguanina, 3-metilcitosina, 2- metiladenina, 2-metilaguanina, N6-metiladenina, 7-metilaguanina, 5- metoxiaminometil-2-tiouracila, 5-metilaminometiluracila, 5- metilcarbonilmetiluracila, 5-metiloxiuracila, 5-metil-2-tiouracila, 2-metiltio- N6-isopenteniladenina, ácido uracila-5-oxiacético, 2-tiocitosina, purina, 2,6- diaminopurina, 2-aminopurina, isoaguanina, indol, imidazol, xantina, etc.

[0096] Modificação da fração de açúcar pode incluir, por exemplo, modificações na posição 2’ da ribose e modificações das outras posições do açúcar. A modificação na posição 2’ da ribose inclui substituição do 2’-OH da ribose por OR, R, R’OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br ou I, em que R representa um alquila ou um arila e R’ representa um alquileno.

[0097] A modificação para as outras posições do açúcar inclui, por exemplo, substituição de O na posição 4’ da ribose ou desoxirribose por S, ligando entre as posições 2’ e 4’ do açúcar, por exemplo, LNA (Ácido Nucleico Bloqueado) ou ENA (Ácidos Nucleicos ligados a 2’-O,4’-C-Etileno, mas não é limitada a estas.

[0098] Uma modificação da região de ligação do fosfato inclui, por exemplo, uma modificação de substituição da ligação de fosfodiéster por ligação de fosforotioato, ligação de fosforoditioato, ligação de alquil fosfonato, ligação de fosforoamidato ou ligação de boranofosfato (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008, 18, 9154-9160) (cf., por exemplo, novos pedidos de patente domésticas japonesas dos pedidos de patente PCT Nos. 2006/129594 e 2006/038608).

[0099] O alquila é preferivelmente um alquila reto ou ramificado tendo 1 a 6 átomos de carbono. Exemplos específicos incluem metila, etila, N- propila, isopropila, N-butila, isobutila, SEC-butila, TERC-butila, N-pentila, isopentila, neopentila, TERC-pentila, N-hexila e iso-hexila. O alquila pode, opcionalmente, ser substituído. Exemplos de tais substituintes são um halogênio, um alcóxi, ciano e nitro. O alquila pode ser substituído por um a três de tais substituintes.

[00100] O cicloalquila é preferivelmente um cicloalquila tendo 5 a 12 átomos de carbono. Exemplos específicos incluem ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-heptila, ciclo-octila, ciclodecila e ciclododecila.

[00101] O halogênio inclui flúor, cloro, bromo e iodo.

[00102] O alcóxi é um alcóxi reto ou ramificado tendo 1 a 6 átomos de carbono, tais como metóxi, etóxi, N-propóxi, isopropóxi, N-butóxi, isobutóxi, SEC-butóxi, TERC-butóxi, N-pentilóxi, isopentilóxi, N-hexilóxi, isso-hexilóxi, etc. Entre outros, um alcóxi tendo 1 a 3 átomos de carbono é preferido.

[00103] O arila é preferivelmente um arila tendo 6 a 10 átomos de carbono. Exemplos específicos incluem fenila, α-naftila e β-naftila. Entre outros, fenila é preferido. O arila pode, opcionalmente, ser substituído. Exemplos de tais substituintes são um alquila, um halogênio, um alcóxi, ciano e nitro. O arila pode ser substituído por um a três de tais substituintes.

[00104] Nesta invenção, o alquileno é preferivelmente um alquileno reto ou ramificado tendo 1 a 6 átomos de carbono. Exemplos específicos incluem metileno, etileno, trimetileno, tetrametileno, pentametileno, hexametileno, 2-(etil) trimetileno e 1-(metil) tetrametileno.

[00105] O acila inclui um alcanoíla ou aroíla reto ou ramificado. Exemplos do alcanoíla incluem formila, acetila, 2-metilacetila, 2,2- dimetilacetila, propionila, butirila, isobutirila, pentanoíla, 2,2- dimetilpropionila, hexanoíla, etc. Exemplos do aroíla incluem benzoíla, toluoíla e naftoíla. O aroíla pode, opcionalmente, ser substituído em posições substituíveis e pode ser substituído por um alquil(s).

[00106] Preferivelmente, o oligonucleotídeo da presente invenção é o oligômero da presente invenção contendo uma unidade constituinte representada pela fórmula geral a seguir em que o grupo -OH na posição 2’ da ribose é substituído por metóxi e a região de ligação do fosfato é uma ligação de fosforotioato: [Fórmula 4]

em que a base representa uma nucleobase.

[00107] O oligonucleotídeo da presente invenção pode ser facilmente sintetizado usando vários sintetizadores automatizados (por exemplo, AKTA oligopilot mais 10/100 (GE Healthcare)). Alternativamente, a síntese também pode ser confiada a uma organização de terceiros (por exemplo, Promega Inc. ou Takara Co.), etc.

[00108] O oligômero de morfolino descrito anteriormente é o oligômero da presente invenção compreendendo a unidade constituinte representada pela fórmula geral a seguir: [Fórmula 5]

em que Base tem a mesma significância definida anteriormente, e, W representa um grupo mostrado por qualquer um dos seguintes grupos: [Fórmula 6]

em que X representa -CH2R1, -O-CH2R1, -S-CH2R1, -NR2R3 ou F; R1 representa H ou um alquila; R2 e R3, que podem ser os mesmos ou diferentes, cada representa H, um alquila, um cicloalquila ou um arila; Y1 representa O, S, CH2 ou NR1; Y2 representa O, S ou NR1; Z representa O ou S.

[00109] Preferivelmente, o oligômero de morfolino é um oligômero compreendendo uma unidade constituinte representada pela fórmula geral a seguir (oligômero fosforodiamidato morfolino (a seguir referido como “PMO”)). [Fórmula 7]

em que Base, R2 e R3 têm a mesma significância definida anteriormente.

[00110] O oligômero de morfolino pode ser produzido de acordo com, por exemplo, WO 1991/009033 ou WO 2009/064471. Em particular, PMO pode ser produzido pelo procedimento descrito em WO 2009/064471 ou WO2013/100190.

Método para produzir PMO]

[00111] Uma modalidade de PMO é, por exemplo, o composto representado pela fórmula geral (I) a seguir (a seguir PMO (I)). [Fórmula 8]

em que Base, R2 e R3 têm a mesma significância definida anteriormente; e, n é um dado número inteiro de 1 a 99, preferivelmente um dado número inteiro de 18 a 28.

[00112] PMO (I) pode ser produzido de acordo com um método conhecido, por exemplo, pode ser produzido realizando os procedimentos nas seguintes etapas.

[00113] Os compostos e reagentes usados nas etapas a seguir não são particularmente limitados, desde que eles sejam comumente usados para preparar PMO.

[00114] Também, as seguintes etapas podem todas ser realizadas pelo método de fase líquida ou o método de fase sólida (usando sintetizadores automatizados de fase sólida manuais ou comercialmente disponíveis). Na produção de PMO pelo método de fase sólida, é desejado usar sintetizadores automatizados em vista dos procedimentos de operação simples e síntese exata. (1) Etapa A:

[00115] O composto representado pela fórmula geral (II) a seguir (a seguir referido como composto (II)) reage com um ácido para preparar o composto representado pela fórmula geral (III) a seguir (a seguir referido como Composto (III)): [Fórmula 9]

independentemente representa uma nucleobase que pode, opcionalmente, ser protegido; T representa tritila, monometoxitritila ou dimetoxitritila; e, L representa hidrogênio, um acila ou um grupo representado pela fórmula geral (IV) a seguir (a seguir referido como grupo (IV)). [Fórmula 10]

A “nucleobase” para BP inclui a mesma “nucleobase” que na Base, desde que o grupo amino ou hidróxi na nucleobase mostrada por BP possa ser protegido.

[00116] Tal grupo protetor para amino não é particularmente limitado, desde que ele seja usado como um grupo protetor para ácidos nucleicos. Exemplos específicos incluem benzoíla, 4-metoxibenzoíla, acetila, propionila, butirila, isobutirila, fenilacetila, fenoxiacetila, 4-terc-butilfenoxiacetila, 4- isopropilfenoxiacetila e (dimetilamino)metileno. Exemplos específicos do grupo protetor para o grupo hidróxi incluem 2-cianoetila, 4-nitrofenetila, fenilsulfoniletila, metilsulfoniletila e trimetilsililetila, e fenila, que pode ser substituído por 1 a 5 grupos que retiram elétron em posições substituíveis opcionais, difenilcarbamoíla, dimetilcarbamoíla, dietilcarbamoíla, metilfenilcarbamoíla, 1-pirolidinilcarbamoíla, morfolinocarbamoíla, 4-(terc- butilcarbóxi) benzila, 4-[(dimetilamino)carbóxi]benzila e 4- (fenilcarbóxi)benzila, (cf., por exemplo, WO 2009/064471).

[00117] O “carreador sólido” não é particularmente limitado, desde que ele seja um carreador útil para a reação de fase sólida de ácidos nucleicos. É desejado que o carreador sólido tenha as seguintes propriedades: por exemplo, (i) ele seja ligeiramente solúvel em reagentes que podem ser usados para a síntese de derivados de ácido morfolino nucleico (por exemplo, diclorometano, acetonitrila, tetrazol, N-metilimidazol, piridina, anidrido acético, lutidina, ácido trifluoracético); (ii) ele seja quimicamente estável aos reagentes úteis para a síntese de derivados de ácido morfolino nucleico; (iii) ele possa ser quimicamente modificado; (iv) ele possa ser carregado com derivados de ácido morfolino nucleico desejados; (v) ele tenha uma resistência suficiente para retirar alta pressão por meio de tratamentos; e (vi) ele tenha uma faixa e distribuição do diâmetro de partícula uniforme. Especificamente, poliestireno intumescível (por exemplo, resina aminometil poliestireno 1% de dibenzilbenzeno reticulado (malha 200-400) (2,4 a 3,0 mmol/g) (fabricado por Tokyo Chemical Industry), Resina de Poliestireno Aminometilado^HCl [dibenzilbenzeno 1%, malha 100-200] (fabricado por Peptide Institute, Inc.)), poliestireno não intumescível (por exemplo, Primer Support (fabricado por GE Healthcare)), poliestireno anexado à cadeia de PEG (por exemplo, resina NH2-PEG (fabricado por Watanabe Chemical Co.), resina TentaGel), vidro de poro controlado (vidro de poro controlado; CPG) (fabricado por, por exemplo, CPG), vidro de poro controlado-oxalila (cf., por exemplo, Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19, 1527 (1991)), suporte derivatizado de aminopolietileno glicol-suporte TentaGel (por exemplo, Wright et al., cf., Tetrahedron Letters, Vol. 34, 3373 (1993)), e um copolímero de poros-poliestireno/divinilbenzeno.

[00118] Um “ligante” que pode ser usado é um ligante conhecido geralmente usado para conectar ácidos nucleicos ou derivados de ácido morfolino nucleico. Exemplos incluem 3-aminopropila, succinila, 2,2’- dietanolsulfonila e um alquil amino de cadeia longa (LCAA).

[00119] Esta etapa pode ser realizada reagindo o composto (II) com um ácido.

[00120] O “ácido” que pode ser usado nesta etapa inclui, por exemplo, ácido trifluoracético, ácido dicloroacético e ácido tricloroacético. O ácido usado é apropriadamente em uma faixa de, por exemplo, 0,1 mol equivalente a 1.000 mol equivalentes, com base em 1 mol do composto (II), preferivelmente em uma faixa de 1 mol equivalente a 100 mol equivalentes, com base em 1 mol do composto (II).

[00121] Uma amina orgânica pode ser usada em combinação com o ácido descrito anteriormente. A amina orgânica não é particularmente limitada e inclui, por exemplo, trietilamina. A quantidade da amina orgânica usada é apropriadamente em uma faixa de, por exemplo, 0,01 mol equivalente a 10 mol equivalentes, e preferivelmente em uma faixa de 0,1 mol equivalente a 2 mol equivalentes, com base em 1 mol do ácido.

[00122] Quando um sal ou mistura do ácido e da amina orgânica é usado nesta etapa, o sal ou mistura inclui, por exemplo, um sal ou mistura de ácido trifluoracético e trietilamina, e mais especificamente, uma mistura de 1 equivalente de trietilamina e 2 equivalentes de ácido trifluoracético.

[00123] O ácido que pode ser usado nesta etapa também pode ser usado na forma de uma diluição com um solvente apropriado em uma concentração de 0,1% a 30%. O solvente não é particularmente limitado, na medida em que ele é inerte à reação e inclui, por exemplo, diclorometano, acetonitrila, um álcool (etanol, isopropanol, trifluoroetanol, etc.), água ou uma mistura dos mesmos.

[00124] A temperatura de reação na reação descrita anteriormente é preferivelmente em uma faixa de, por exemplo, 10°C a 50°C, mais preferivelmente, em uma faixa de 20°C a 40°C, e mais preferivelmente, em uma faixa de 25°C a 35°C.

[00125] O tempo de reação pode variar dependendo do tipo do ácido usado e temperatura de reação e é apropriadamente em uma faixa de 0,1 minuto a 24 horas, no geral, e preferivelmente em uma faixa de 1 minuto a 5 horas.

[00126] Depois da finalização desta etapa, uma base pode ser adicionada, se necessário, para neutralizar o ácido que permaneceu no sistema. A “base” não é particularmente limitada e inclui, por exemplo, di- isopropilamina. A base também pode ser usada na forma de uma diluição com um solvente apropriado em uma concentração de 0,1% (v/v) a 30% (v/v).

[00127] O solvente usado nesta etapa não é particularmente limitado, desde que ele seja inerte à reação e inclua diclorometano, acetonitrila, um álcool (etanol, isopropanol, trifluoroetanol, etc.), água e uma mistura dos mesmos. A temperatura de reação é preferivelmente em uma faixa de, por exemplo, 10°C a 50°C, mais preferivelmente, em uma faixa de 20°C a 40°C, e mais preferivelmente, em uma faixa de 25°C a 35°C.

[00128] O tempo de reação pode variar dependendo do tipo do base usado e temperatura de reação e é apropriadamente em uma faixa de 0,1 minuto a 24 horas, no geral, e preferivelmente em uma faixa de 1 minuto a 5 horas.

[00129] No composto (II), o composto da fórmula geral (IIa) a seguir (a seguir Composto (IIa)), em que n é 1 e L é um grupo (IV), pode ser produzido pelo seguinte procedimento. [Fórmula 11]

em que BP, T, ligante e carreador sólido têm a mesma significância definida anteriormente.

[00130] Etapa 1:

[00131] O composto representado pela fórmula geral (V) a seguir reage com um agente de acilação para preparar o composto representado pela fórmula geral (VI) a seguir (a seguir referido como Composto (VI)). [Fórmula 12]

em que BP, T e ligante têm a mesma significância definida anteriormente; e, R4 representa hidróxi, um halogênio, grupo carboxila ou amino.

[00132] Esta etapa pode ser realizada por procedimentos conhecidos introduzindo ligantes, usando Composto (V) como o material de partida.

[00133] Em particular, o composto representado pela fórmula geral (VIa) a seguir pode ser produzido realizando o método conhecido como esterificação, usando Composto (V) e anidrido succínico. [Fórmula 13]

em que BP e T têm a mesma significância definida anteriormente. Etapa 2:

[00134] Composto (VI) reagiu com um carreador sólido por um agente de condensação para preparar o composto (IIa). [Fórmula 14]

em que BP, R4, T, ligante e carreador sólido têm a mesma significância definida anteriormente.

[00135] Esta etapa pode ser realizada usando Composto (VI) e um carreador sólido de acordo com um processo conhecido como reação de condensação.

[00136] No composto (II), o composto representado pela fórmula geral (IIa2) a seguir em que n é 2 a 99 e L é um grupo representado pela fórmula geral (IV) pode ser produzido usando Composto (IIa) como o material de partida e repetindo a etapa A e etapa B do método de produção de PMO descrito no pedido de patente por um número desejado de vezes. [Fórmula 15]

em que BP, R , R , T, ligante e carreador sólido têm a mesma significância definida anteriormente; e, n’ representa 1 a 98.

[00137] No composto (II), o composto da fórmula geral (IIb) a seguir em que n é 1 e L é hidrogênio pode ser produzido pelo procedimento descrito em, por exemplo, WO 1991/009033. [Fórmula 16]

em que BP, n’, R2, R3 e T têm a mesma significância definida anteriormente.

[00138] No composto (II), o composto representado pela fórmula geral (IIb2) a seguir em que n é 2 a 99 e L é hidrogênio pode ser produzido usando Composto (IIb) como o material de partida e repetindo a etapa A e etapa B do método de produção de PMO descrito no pedido de patente por um número desejado de vezes. [Fórmula 17]

em que BP, n’, R2, R3 e T têm a mesma significância definida anteriormente.

[00139] No composto (II), o composto representado pela fórmula geral (IIc) a seguir em que n é 1 e L é um acila pode ser produzido realizando o procedimento conhecido como reação de acilação, usando o composto (IIb). [Fórmula 18]

em que BP e T têm a mesma significância definida anteriormente; e, R5 representa um acila.

[00140] No composto (II), o composto representado pela fórmula geral (IIc2) a seguir em que n é 2 a 99 e L é um acila pode ser produzido usando Composto (IIc) como o material de partida e repetindo a etapa A e etapa B do método de produção de PMO descrito no pedido de patente por um número desejado de vezes. [Fórmula 19]

em que BP, n’, R2, R3, R5 e T têm a mesma significância definida anteriormente. (2) Etapa B

[00141] Composto (III) reagiu com um composto de monômero de morfolino na presença de uma base para preparar o composto representado pela fórmula geral (VII) a seguir (a seguir referido como Composto (VII)): [Fórmula 20]

em que BP, L, n, R2, R3 e T têm a mesma significância definida anteriormente.

[00142] Esta etapa pode ser realizada reagindo o composto (III) com um composto de monômero de morfolino na presença de uma base.

[00143] O composto de monômero de morfolino inclui, por exemplo, compostos representados pela fórmula geral (VIII) a seguir: [Fórmula 21]

em que BP, R2, R3 e T têm a mesma significância definida anteriormente.

[00144] A “base” que pode ser usado nesta etapa inclui, por exemplo, di-isopropilamina, trietilamina e N-etilmorfolina. A quantidade da base usada é apropriadamente em uma faixa de 1 mol equivalente a 1.000 mol equivalentes, com base em 1 mol do composto (III), preferivelmente, 10 mol equivalentes a 100 mol equivalentes, com base em 1 mol do composto (III).

[00145] O composto de monômero de morfolino e base que pode ser usado nesta etapa também pode ser usado como uma diluição com um solvente apropriado em uma concentração de 0,1% a 30%. O solvente não é particularmente limitado, desde que ele seja inerte à reação, e inclui, por exemplo, N,N-dimetilimidazolidona, N-metilpiperidona, DMF, diclorometano, acetonitrila, tetra-hidrofurano, ou uma mistura dos mesmos.

[00146] A temperatura de reação é preferivelmente em uma faixa de, por exemplo, 0°C a 100°C, e mais preferivelmente, em uma faixa de 10°C a 50°C.

[00147] O tempo de reação pode variar dependendo do tipo do base usado e temperatura de reação e é apropriadamente em uma faixa de 1 minuto a 48 horas, no geral, e preferivelmente em uma faixa de 30 minutos a 24 horas.

[00148] Além do mais, depois da finalização desta etapa, um agente de acilação pode ser adicionado, se necessário. O “agente de acilação” inclui, por exemplo, anidrido acético, cloreto de acetila e anidrido fenoxiacético. O agente de acilação também pode ser usado como uma diluição com um solvente apropriado em uma concentração de 0,1% a 30%. O solvente não é particularmente limitado, desde que ele seja inerte à reação, e inclui, por exemplo, diclorometano, acetonitrila, um álcool(is) (etanol, isopropanol, trifluoroetanol, etc.), água, ou uma mistura dos mesmos.

[00149] Se necessário, uma base, tais como piridina, lutidina, colina, trietilamina, di-isopropiletilamina, N-etilmorfolina, etc. também pode ser usada em combinação com o agente de acilação. A quantidade do agente de acilação é apropriadamente em uma faixa de 0,1 mol equivalente a 10.000 mol equivalentes, e preferivelmente em uma faixa de 1 mol equivalente a 1.000 mol equivalentes. A quantidade da base é apropriadamente em uma faixa de, por exemplo, 0,1 mol equivalente a 100 mol equivalentes, e preferivelmente em uma faixa de 1 mol equivalente a 10 mol equivalentes, com base em 1 mol do agente de acilação.

[00150] A temperatura de reação nesta reação é preferivelmente em uma faixa de 10°C a 50°C, mais preferivelmente, em uma faixa de 10°C a 50°C, muito mais preferivelmente, em uma faixa de 20°C a 40°C, e mais preferivelmente, em uma faixa de 25°C a 35°C. O tempo de reação pode variar dependendo do tipo do agente de acilação usado e temperatura de reação, e é apropriadamente em uma faixa de 0,1 minuto a 24 horas, no geral, e preferivelmente em uma faixa de 1 minuto a 5 horas. (3) Etapa C:

[00151] No composto (VII) produzido na etapa B, o grupo protetor é removido usando um agente de desproteção para preparar o composto representado pela fórmula geral (IX). [Fórmula 22]

em que Base, BP, L, n, R2, R3 e T têm a mesma significância definida anteriormente.

[00152] Esta etapa pode ser realizada reagindo o composto (VII) com um agente de desproteção.

[00153] O “agente de desproteção” inclui, por exemplo, amônia concentrada, água e metilamina. O “agente de desproteção” usado nesta etapa também pode ser usado como uma diluição com, por exemplo, água, metanol, etanol, isopropil álcool, acetonitrila, tetra-hidrofurano, DMF, N,N- dimetilimidazolidona, N-metilpiperidona, ou uma mistura destes solventes. Entre estes, etanol é preferido. A quantidade do agente de desproteção usado é apropriadamente em uma faixa de, 1 mol equivalente a 100.000 mol equivalentes, e preferivelmente em uma faixa de 10 mol equivalentes a 1.000 mol equivalentes, com base em 1 mol do composto (VII).

[00154] A temperatura de reação é apropriadamente em uma faixa de 15°C a 75°C, preferivelmente, em uma faixa de 40°C a 70°C, e mais preferivelmente, em uma faixa de 50°C a 60°C. O tempo de reação para desproteção pode variar dependendo do tipo de composto (VII), temperatura de reação, etc., e é apropriadamente em uma faixa de 10 minutos a 30 horas, preferivelmente 30 minutos a 24 horas, e mais preferivelmente em uma faixa de 5 horas a 20 horas. (4) Etapa D:

[00155] PMO (I) é produzido reagindo o composto (IX) produzido na etapa C com um ácido: [Fórmula 23]

em que Base, n, R2, R3 e T têm a mesma significância definida anteriormente.

[00156] Esta etapa pode ser realizada adicionando um ácido ao composto (IX).

[00157] O “ácido” que pode ser usado nesta etapa inclui, por exemplo, ácido tricloroacético, ácido dicloroacético, ácido acético, ácido fosfórico, ácido clorídrico, etc. O ácido usado é apropriadamente usado para permitir que a solução tenha uma faixa de pH de 0,1 a 4,0, e mais preferivelmente, em uma faixa de pH 1,0 a 3,0. O solvente não é particularmente limitado, desde que ele seja inerte à reação, e inclui, por exemplo, acetonitrila, água, ou uma mistura destes solventes dos mesmos.

[00158] A temperatura de reação é apropriadamente em uma faixa de 10°C a 50°C, preferivelmente, em uma faixa de 20°C a 40°C, e mais preferivelmente, em uma faixa de 25°C a 35°C. O tempo de reação para desproteção pode variar dependendo do tipo do composto (IX), temperatura de reação, etc., e é apropriadamente em uma faixa de 0,1 minuto a 5 horas, preferivelmente 1 minuto a 1 hora, e mais preferivelmente em uma faixa de 1 minuto a 30 minutos.

[00159] PMO (I) pode ser obtido submetendo a mistura de reação obtida nesta etapa a meios convencionais de operação de separação e purificação, tais como extração, concentração, neutralização, filtração, separação centrífuga, recristalização, cromatografia em coluna de fase reversa C8 a C18, cromatografia em coluna de troca de cátion, cromatografia em coluna de troca de ânion, cromatografia em coluna de filtração em gel, cromatografia líquida de alto desempenho, diálise, ultrafiltração, etc., sozinho ou em combinação dos mesmos. Assim, o PMO (I) desejado pode ser isolado e purificado (cf., por exemplo, WO 1991/09033).

[00160] Na purificação de PMO (I) usando cromatografia de fase reversa, por exemplo, uma mistura de solução de 20 mM trietilamina/tampão de acetato e acetonitrila pode ser usada como um solvente de eluição.

[00161] Na purificação de PMO (I) usando cromatografia de troca iônica, por exemplo, uma mistura de solução de solução salina 1 M e solução aquosa de hidróxido de sódio 10 mM pode ser usada como um solvente de eluição.

[00162] O ácido nucleico de peptídeo descrito anteriormente é o oligômero da presente invenção tendo um grupo representado pela seguinte fórmula geral como a unidade constituinte: [Fórmula 24]

em que Base tem a mesma significância definida anteriormente.

[00163] Ácidos nucleicos de peptídeo podem ser preparados referindo- se, por exemplo, às seguintes literaturas. 1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991) 2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, Jacs., 114, 1895 (1992) 3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994) 4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995) 5)T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)

[00164] No oligômero da presente invenção, a extremidade 5’ pode ser qualquer das estruturas químicas (1) a (3) a seguir, e preferivelmente é (3)- OH. [Fórmula 25]

[00165] A seguir, os grupos mostrados por (1), (2) e (3) anteriormente são referidos como “Grupo (1),” “Grupo (2)” e “Grupo (3),” respectivamente. 2. Composição farmacêutica

[00166] O oligômero da presente invenção provoca o salto do éxon 44 no gene da distrofina. Assim, se espera que condições de distrofia muscular podem ser aliciadas administrando a composição farmacêutica compreendendo o oligômero da presente invenção aos pacientes com DMD, que têm mutação alvo do salto do éxon 44, que é mutação que o converte no- quadro pelo salto do éxon 44. Também, o processo de fabricação do oligômero da presente invenção, cujo comprimento da cadeia é curto, é simples e o custo de fabricação do oligômero da presente invenção pode ser reduzido.

[00167] Em uma outra modalidade, a presente invenção provê a composição farmacêutica para o tratamento de distrofia muscular, compreendendo, como um ingrediente ativo, o oligômero da presente invenção, um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo (a seguir referido como “a composição da presente invenção”)

[00168] Exemplos do sal do oligômero farmaceuticamente aceitável da presente invenção contido na composição da presente invenção são sais de metal alcalino, tais como sais de sódio, potássio e lítio; sais de metal alcalino terroso, tais como sais de cálcio e magnésio; sais de metal, tais como sais de alumínio, ferro, zinco, cobre, níquel, cobalto, etc.; sais de amônio; sais de amina orgânica, tais como sais de t-octilamina, dibenzilamina, morfolina, glucosamina, fenilglicina alquil éster, etilenodiamina, N-metilglucamina, guanidina, dietilamina, trietilamina, diciclo-hexilamina, N, N’ - dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, procaína, dietanolamina, N- benzilfenetilamina, piperazina, tetrametilamônio, tris(hidroximetil)aminometano; sais de hidro-haleto, tais como sais de fluoridratos, cloridratos, bromidratos e iodidratos; sais de ácido inorgânico, tais como nitratos, percloratos, sulfatos, fosfatos, etc.; sulfonatos de alcano inferior, tais como metanossulfonatos, trifluorometanossulfonatos e etanossulfonatos; arilsulfonatos, tais como benzenossulfonatos e p- toluenossulfonatoss; sais de ácido orgânico, tais como acetatos, malatos, fumaratos, succinatos, citratos, tartaratos, oxalatos, maleatos, etc.; e, sais de aminoácido, tais como sais de glicina, lisina, arginina, ornitina, ácido glutâmico e ácido aspártico. Estes sais podem ser produzidos por métodos conhecidos. Alternativamente, o oligômero da presente invenção contido na composição da presente invenção pode ser na forma de um hidrato do mesmo.

[00169] A via de administração para a composição da presente invenção não é particularmente limitada, desde que ela seja via de administração farmaceuticamente aceitável, e possa ser escolhida dependendo do método de tratamento. Em vista da facilidade na dispensação aos tecidos musculares, preferidas são administração intravenosa, administração intraarterial, administração intramuscular, administração subcutânea, administração oral, administração no tecido, administração transdérmica, etc. Também, formas de dosagem que são disponíveis para a composição da presente invenção não são particularmente limitadas e incluem, por exemplo, várias injeções, agentes orais, gotejamentos, inalações, unguentos, loções, etc.

[00170] Na administração do oligômero da presente invenção aos pacientes com distrofia muscular, a composição da presente invenção preferivelmente contém um carreador para promover dispensação do oligômero aos tecidos musculares. Um carreador como este não é particularmente limitado, na medida em que ele é farmaceuticamente aceitável e exemplos incluem carreadores catiônicos, tais como lipossomas catiônicos, polímeros catiônicos, etc., ou carreadores usando envelope viral. Os lipossomas catiônicos são, por exemplo, lipossomas compostos de 2-O-(2- dietilaminoetil)carabamoil-1,3-O-dioleoilglicerol e fosfolipídeos como os constituintes essenciais (a seguir referido como “lipossoma A”), Oligofectamina (nome comercial registrado) (fabricado por Invitrogen Corp.), Lipofectin (nome comercial registrado) (fabricado por Invitrogen Corp.), Lipofectamina (nome comercial registrado) (fabricado por Invitrogen Corp.), Lipofectamina 2000 (nome comercial registrado) (fabricado por Invitrogen Corp.), DMRIE-C (nome comercial registrado) (fabricado por Invitrogen Corp.), GeneSilencer (nome comercial registrado) (fabricado por Gene Therapy Sistemas), TransMessenger (nome comercial registrado) (fabricado por QIAGEN, Inc.), TransIT TKO (nome comercial registrado) (fabricado por Mirus) e Nucleofector II (Lonza). Entre outros, lipossoma A é preferido. Exemplos de polímeros catiônicos são JetSI (nome comercial registrado) (fabricado por Qbiogeno, Inc.) e Jet-PEI (nome comercial registrado) (polietilenimina, fabricado por Qbiogeno, Inc.). Um exemplo de carreadores usando envelope viral é GenomeOne (nome comercial registrado) (HVJ-E lipossoma, fabricado por Ishihara Sangyo). Alternativamente, os dispositivos médicos descritos na patente japonesa No. 2924179 e os carreadores catiônicos descritos nos novos pedidos de patente doméstico japonês PCT Nos. 2006/129594 e 2008/096690 podem ser igualmente usados.

[00171] Uma concentração do oligômero da presente invenção contido na composição da presente invenção pode variar dependendo do tipo de carreador, etc., e é apropriadamente em uma faixa de 0,1 nM a 100 μM, preferivelmente em uma faixa de 1 nM a 10 μM, e mais preferivelmente em uma faixa de 10 nM a 1 μM. Uma razão em peso do oligômero da presente invenção contido na composição da presente invenção e o carreador (carreador/oligômero da presente invenção) pode variar dependendo da propriedade do oligômero, do tipo do carreador, etc., e é apropriadamente em uma faixa de 0,1 a 100, preferivelmente em uma faixa de 1 a 50, e mais preferivelmente em uma faixa de 10 a 20.

[00172] Além do oligômero da presente invenção e do carreador descrito anteriormente, aditivos farmaceuticamente aceitáveis também podem ser opcionalmente formulados na composição da presente invenção. Exemplos de tais aditivos são auxiliares de emulsificação (por exemplo, ácidos graxos tendo 6 a 22 átomos de carbono e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, albumina e dextrana), estabilizantes (por exemplo, colesterol e ácido fosfatídico), agentes isotonizantes (por exemplo, cloreto de sódio, glicose, maltose, lactose, sacarose, trealose), e agentes que controlam o pH (por exemplo, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio e trietanolamina). Um ou mais destes aditivos pode ser usado. O teor do aditivo na composição da presente invenção é apropriadamente 90% em peso ou menos, preferivelmente 70% em peso ou menos e mais preferivelmente, 50% em peso ou menos.

[00173] A composição da presente invenção pode ser preparada adicionando o oligômero da presente invenção a uma dispersão do carreador e adequadamente agitando a mistura. Aditivos podem ser adicionados em uma etapa apropriada tanto antes quanto depois da adição do oligômero da presente invenção. Um solvente aquoso que pode ser usado na adição do oligômero da presente invenção não é particularmente limitado, desde que ele seja farmaceuticamente aceitável, e exemplos são água injetável ou água destilada injetável, fluido de eletrólito, tal como salina fisiológica, etc., e fluido de açúcar, tais como fluido de glicose, fluido de maltose, etc. Um versado na técnica pode apropriadamente escolher condições para pH e temperatura para tal assunto.

[00174] A composição da presente invenção pode ser preparada, por exemplo, em uma forma líquida e sua preparação liofilizada. A preparação liofilizada pode ser preparada liofilizando a composição da presente invenção em uma forma líquida de uma maneira convencional. A liofilização pode ser realizada, por exemplo, apropriadamente esterilizando a composição da presente invenção em uma forma líquida, dispensando uma alíquota em um recipiente de frasco, realizando congelamento preliminar por 2 horas em condições de cerca de -40 a -20°C, realizando uma secagem primária a cerca de 0 a 10°C em pressão reduzida, e então realizando uma secagem secundária a cerca de 15 a 25°C em pressão reduzida. No geral, a preparação liofilizada da composição da presente invenção pode ser obtida substituindo o conteúdo do frasco por gás nitrogênio e tampando.

[00175] A preparação liofilizada da composição da presente invenção pode ser usada, no geral, mediante reconstituição adicionando uma solução adequada opcional (líquido de reconstituição) e redissolvendo a preparação. Um líquido de reconstituição como este inclui água injetável, salina fisiológica e outros fluidos de infusão. Um volume do líquido de reconstituição pode variar dependendo do uso pretendido, etc., não é particularmente limitado e é adequadamente 0,5 a 2 vezes maior que o volume antes da liofilização ou não mais que 500 mL.

[00176] É desejado controlar uma dose da composição da presente invenção a ser administrada, levando os seguintes fatores em consideração: o tipo e forma de dosagem do oligômero contido da presente invenção; condições dos pacientes incluindo idade, peso corporal, etc.; via de administração; e as características da extensão da doença. Uma dose diária, calculada como a quantidade do oligômero antissentido da presente invenção, é geralmente em uma faixa de 0,1 mg a 10 g/humano, e preferivelmente 1 mg a 1 g/humano. Esta faixa numérica pode variar ocasionalmente dependendo do tipo e da doença alvo, via de administração e molécula alvo. Desta forma, uma dose menor que a faixa pode ser suficiente em alguma ocasião e, ao contrário, uma dose maior que a faixa pode ser ocasionalmente exigida. A composição pode ser administrada de uma a várias vezes ao dia ou em intervalos de um dia a vários dias.

[00177] Ainda em uma outra modalidade da composição da presente invenção é provida uma composição farmacêutica compreendendo um vetor capaz de expressar o oligonucleotídeo da presente invenção e o carreador descrito anteriormente. Um vetor de expressão como este pode ser um vetor capaz de expressar uma pluralidade dos oligonucleotídeos da presente invenção. A composição pode ser formulada com aditivos farmaceuticamente aceitáveis, como no caso com a composição da presente invenção contendo o oligômero da presente invenção. Uma concentração do vetor de expressão contido na composição pode variar dependendo do tipo do carreador, etc., e é apropriadamente em uma faixa de 0,1 nM a 100 μM, preferivelmente em uma faixa de 1 nM a 10 μM, e mais preferivelmente em uma faixa de 10 nM a 1 μM. Uma razão em peso do vetor de expressão contido na composição e o carreador (carreador/ vetor de expressão) pode variar dependendo da propriedade do vetor de expressão, tipo do carreador, etc., e é apropriadamente em uma faixa de 0,1 a 100, preferivelmente em uma faixa de 1 a 50, e mais preferivelmente em uma faixa de 10 a 20. O teor do carreador contido na composição é o mesmo que no caso com a composição da presente invenção contendo o oligômero da presente invenção, e um método para produzir o mesmo também é o mesmo que no caso com a composição da presente invenção.

[00178] A seguir, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos EXEMPLOS e EXEMPLOS DE TESTE a seguir, mas não é considerada limitada a eles. [EXEMPLOS] [EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1] Ácido 4-{[(2S, 6R)-6-(4-benzamido-2-oxopirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il1 metóxi}-4-oxobutanoico carregado em resina de amino poliestireno Etapa 1: Produção de ácido 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oxopirimidin- 1(2H)-il)- 4-tritilmorfolin-2-il1metóxi}-4-oxobutanoico

[00179] Em atmosfera de argônio, 3,44 g de N-{1-[(2R, 6S)-6- (hidroximetil)- 4-tritilmorfolin-2-il1-2-oxo-1,2-di-hidropirimidin-4- il}benzamida e 1,1 g de 4-dimetilaminopiridina (4-DMAP) foram suspensos em 50 mL de diclorometano, e 0,90 g de anidrido succínico foi adicionado à suspensão, seguido por agitação a temperatura ambiente por 3 horas. À mistura de reação, foram adicionados 10 mL de metanol, e a mistura foi concentrada em pressão reduzida. O resíduo foi extraído usando acetato de etila e solução de di-hidrogenofosfato de potássio aquoso 0,5 M. A camada orgânica resultante foi lavada sequencialmente com solução de di- hidrogenofosfato de potássio aquoso 0,5M, água e salmoura na ordem mencionada. A camada orgânica resultante foi seca sobre sulfato de sódio e concentrada em pressão reduzida para dar 4,0 g do produto. Etapa 2; Produção de ácido 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oxopirimidin-1- il)-4- tritilmorfolin-2-il1metóxi}-4-oxobutanoico carregado em resina de amino poliestireno

[00180] Depois que 4,0 g de ácido 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2- oxopirimidin-1(2H)-il)-4- tritilmorfolin-2-il]metóxi}-4-oxobutanoico foram dissolvidos em 200 mL de piridina (desidratado), 0,73 g de 4-DMAP e 11,5 g de cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodi-imida foram adicionados à solução. Então, 25,0 g de suporte de resina de amino poliestireno Primer 200 amino (fabricado por GE Healthcare Japan Co., Ltd., 17-5214-97) e 8,5 mL de trietilamina foram adicionados à mistura, seguido por agitação da temperatura ambiente por 4 dias. Depois de finalizar a reação, a resina foi retirada por filtração. A resina resultante foi lavada sequencialmente com piridina, metanol e diclorometano na ordem mencionada, e seca em pressão reduzida. À resina resultante foram adicionados 200 mL de tetra-hidrofurano (desidratado), 15 mL de anidrido acético e 15 mL de 2,6-lutidina, e a mistura foi agitada a temperatura ambiente por 2 horas. A resina foi retirada por filtração, lavada sequencialmente com piridina, metanol e diclorometano na ordem mencionada e seca em pressão reduzida para dar 26,7 g do produto.

[00181] A quantidade de carga do produto foi determinada a partir da quantidade molar do tritila por g de resina medindo absorbância em UV a 409 nm usando um método conhecido. A quantidade de carga da resina foi 192,2 μmol/g. Condições da medição por UV Aparelho: U-2910 (Hitachi, Ltd.) Solvente: ácido metanossulfônico Comprimento de onda: 265 nm Valor ε: 45.000 [EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2] Ácido 4-{[(2S, 6R)-6-(5-metil-2,4-dioxopirimidina-1-il)-4- tritílmorfolin-2-il] metóxi}-4-oxobutanoico carregado em resina de amino poliestireno

[00182] O composto título foi produzido de uma maneira similar ao EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1, exceto que 1-[(2R,6S)-6-(hidroximetil)-4- tritilmorfolin-2-il]-5-metilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona foi usado nesta etapa, em vez de N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-oxo-1,2-di- hidropirimidin-4-il}benzamida usado na etapa 1 do EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1.

[00183] A quantidade de carga do produto foi determinada a partir da quantidade molar do tritila por g de resina medindo absorbância em UV a 409 nm usando um método conhecido. A quantidade de carga da resina foi 164,0 μmol/g. [EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3] Ácido 4-{[(2S, 6R)-6-(6-benzamido purina-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il] metóxi}-4-oxobutanoico carregado em resina de amino poliestireno

[00184] O composto título foi produzido de uma maneira similar ao EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1, exceto que N-{9-[(2R,6S)-6- (hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il] purina-6-il} benzamido foi usado nesta etapa, em vez de N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-oxo- 1,2-di-hidropirimidin-4-il}benzamida usado na etapa 1 do EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1.

[00185] A quantidade de carga do produto foi determinada a partir da quantidade molar do tritila por g de resina medindo absorbância em UV a 409 nm usando um método conhecido. A quantidade de carga da resina foi 185,7 μmol/g. [EXEMPLO DE REFERÊNCIA 4] Ácido 4-{{(2S, 6R)-6-{6-2-cianoetóxi}-2-[(2-fenoxiacetil) amino] purina-9- il}-4-tritilmorfolin-2-il}metóxi}-4-oxobutanoico carregado em resina de amino poliestireno

[00186] O composto título foi produzido de uma maneira similar ao EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1, exceto que N-{6-(2-cianoetóxi)-9- [(2R,6S)-6-(hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il] purina-2-il} -2- fenoxiacetoamido foi usado nesta etapa, em vez de N-{1-[(2R,6S)-6- (hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-oxo-1,2-di-hidropirimidin-4-il} benzamida usado na etapa 1 do EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1.

[00187] A quantidade de carga do produto foi determinada a partir da quantidade molar do tritila por g de resina medindo absorbância em UV a 409 nm usando um método conhecido. A quantidade de carga da resina foi 164,8 μmol/g.

[00188] De acordo com as descrições no EXEMPLOS 1 a seguir, PMO mostrado pelo PMO Nos. 1-118 na TABELA 1 foram sintetizados. PMO Nos. 119 e 120 foram comprados de Gene Tools, LLC. O PMO sintetizado foi dissolvido em água para injeção (fabricado por Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.). [Tabela 1-1] [TABELA 1]

[EXEMPLO 1]

[00189] Como uma base no 5’-terminal, 0,2 g de ácido 4-{[(2S, 6R)-6- (4-benzamida-2-oxopirimidin-1(2H)-il)-4- tritilmorfolin-2-il]metóxi} 4- oxobutanoico suportado em uma resina de aminopoliestireno (Exemplo de referência 1), ácido 4-{[(2S, 6R)-6-(5-metil-2,4-dioxopirimidina-1-il)-4- tritilmorfolin-2-il] metóxi}-4-oxobutanoico suportado em uma resina de aminopoliestireno (Exemplo de referência 2), ácido 4-{[(2S, 6R)-6-(6- benzamido purin-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il] metóxi}-4-oxobutanoico suportado em uma resina de aminopoliestireno (Exemplo de referência 3), ou ácido 4-{{(2S, 6R)-6-{6-(2-cianoetóxi)-2-[(2-fenoxiacetil) amino] purin-9- il}-4-tritilmorfolin-2-il}metóxi}-4-oxobutanoico suportado em uma resina de aminopoliestireno (Exemplo de referência 4), foi preenchido em uma coluna com um filtro. Então, o ciclo sintético mostrado foi iniciado usando um sintetizador de oligonucleotídeo (AKTA Oligopilot 10 plus). O composto de monômero de morfolino desejado foi adicionado em cada ciclo de acoplamento para dar a sequência de bases descrita na Tabela 1 (ver a Tabela 2 a seguir). [TABELA 2]

Observação: As etapas 1, 2, 7 e 8 foram realizadas novamente depois do ciclo final somente no caso de acetilação de 3’-terminal.

[00190] A solução de desbloqueio usada foi solução de diclorometano contendo 3% (p/v) de ácido trifluoracético. A solução de neutralização e lavagem usada foi uma solução obtida dissolvendo N,N-di-isopropiletilamina para ser 10% (v/v) e tetra-hidrofurano para ser 5% (v/v) em diclorometano contendo 35% (v/v) acetonitrila. A solução de acoplamento A usada foi uma solução obtida dissolvendo o composto de monômero de morfolino em tetra- hidrofurano para ser 0,10 M. A solução de acoplamento B usada foi uma solução obtida dissolvendo N,N- di-isopropiletilamina para ser 20% (v/v) e tetra-hidrofurano para ser 10% (v/v) em acetonitrila. A solução de nivelamento usada foi uma solução obtida dissolvendo 20% (v/v) de anidrido acético e 30% (v/v) de 2,6-lutidina em acetonitrila.

[00191] A resina de aminopoliestireno carregada com o PMO sintetizado anteriormente foi recuperada do vaso de reação e seca a temperatura ambiente por pelo menos 2 horas em pressão reduzida. O PMO seco carregado em resina de aminopoliestireno foi carregado em um vaso de reação, e 5 mL de 28% de amônia água-etanol (1/4) foram adicionado a ele. A mistura foi agitada a 55°C por 15 horas. A resina de aminopoliestireno foi separada por filtração e lavada com 1 mL de água-etanol (1/4). O filtrado resultante foi concentrado em pressão reduzida. O resíduo resultante foi dissolvido em 10 mL de uma mistura de solventes de 20 mM de acético ácido - tampão de trietilamina (tampão TEAA) e acetonitrila (4/1) e filtrado através de um filtro de membrana. O filtrado obtido foi purificado por HPLC de fase reversa. As condições usadas são conforme mostradas na Tabela 3 a seguir. [TABELA 3]

[00192] Cada fração foi analisada, e o produto alvo foi recuperado e concentrado em pressão reduzida. Ao resíduo concentrado foi adicionado 0,5 mL de solução aquosa de ácido fosfórico 2 M, e a mistura foi agitada por 15 minutos. Além do mais, 2 mL de solução aquosa de hidróxido de sódio 2 M foram adicionados para preparar a mistura alcalina, seguido por filtração através de um filtro da membrana (0,45 μm).

[00193] A solução aquosa resultante contendo o produto alvo foi purificado por uma coluna de resina de troca aniônica. As condições usadas são conforme mostradas na Tabela 4 a seguir. [TABELA 4]

[00194] Cada fração foi analisada (em HPLC) e o produto alvo foi obtido como uma solução aquosa. À solução aquosa resultante foi adicionado tampão de fosfato 0,1 M (pH 6,0) para neutralização. Em seguida, a mistura obtida foi dessalinizada por HPLC de fase reversa nas condições descritas na Tabela 5 a seguir. [TABELA 5]

[00195] O produto alvo foi recuperado e a mistura foi concentrada em pressão reduzida. O resíduo resultante foi dissolvido em água. A solução aquosa obtida foi seca por congelamento para dar o composto alvo na forma de um sólido tipo algodão branco.

[00196] Os valores calculados e os valores encontrados de ESI-TOF- MS são representados na Tabela 6 a seguir. [TABELA 6]

[1] EXEMPLO DE TESTE Ensaio in vitro

[00197] Usando um Kit L Amaxa Cell Line Nucleofector em Nucleofector II (Lonza), 0,1 a 30 μM dos oligômeros antissentido na Tabela 1 foram transfectados com 3,5x 105 das células RD (linha celular de rabdomiossarcoma humano). O Programa T-030 foi usado.

[00198] Depois da transfecção, as células foram cultivadas por três noites em 2 mL de meio essencial mínimo de Eagle (EMEM) (fabricado por Sigma, a seguir o mesmo) contendo 10% de soro bovino fetal (FCS) (fabricado por Invitrogen) em condições de 37°C e 5% CO2.

[00199] As células foram lavadas uma vez com PBS (fabricado por Nissui, a seguir o mesmo) e 350 μL de tampão RLT (fabricado por Qiagen) contendo 1% de 2-mercaptoetanol (fabricado por Nacalai Tesque) foi adicionado às células. Depois que as células foram deixadas em repouso a temperatura ambiente por poucos minutos para lisar as células, o lisato foi coletado em um homogeneizador QIAshredder (fabricado por Qiagen). Então, o lisato foi centrifugado a 15.000 rpm por 2 minutos para preparar o homogenato. O RNA total foi extraído de acordo com o protocolo anexado ao Mini Kit RNeasy (fabricado por Qiagen). A concentração do RNA total extraído foi determinada usando um NanoDrop ND-1,000 (fabricado por LMS).

[00200] RT-PCR em uma etapa foi realizado com 400 ng do RNA total extraído usando um QIAGEN OneStep RT-PCR Kit (fabricado por Qiagen). Uma solução de reação foi preparada de acordo com o protocolo anexado ao kit. PTC-100 (fabricado por MJ Research) ou TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch (fabricado por Takara Bio) foi usado como um circulador térmico. O programa de RT-PCR usado é como se segue. 50°C, 30 mins: reação de transcrição reversa 95°C, 15 mins: ativação de polimerase, inativação de transcriptase reversa, desnaturação térmica de DNAc 94°C, 30 segundos; 60°C, 30 segundos; 72 °C, 1 min] x 35 ciclos: amplificação por PCR 72°C, 10 mins: extensão final

[00201] As sequências de bases do iniciador dianteiro e iniciador reverso usadas para RT-PCR são dadas a seguir. Iniciador dianteiro: 5’- GCTCAGGTCGGATTGACATT -3’ (SEQ ID NO: 125) Iniciador reverso: 5’- GGGCAACTCTTCCACCAGTA -3’ (SEQ ID NO: 126)

[00202] O produto de reação, 1 μL do PCR anterior foi analisado usando um Bioanalisador (fabricado por Agilent Technologies, Inc.).

[00203] O nível do polinucleotídeo “A” da banda com salto do éxon 44 e o nível do polinucleotídeo “B” da banda sem salto do éxon 44 foram medidos. Com base nestes valores de medição de “A” e “B”, a eficiência do salto foi determinada pela seguinte equação: Eficiência do salto (%)=A/( A + B ) x 100

Resultados experimentais

[00204] Os resultados são mostrados nas figuras 1 a 26. Este experimento revelou que, o oligômero da presente invenção obtido conectando oligômeros unitários curtos selecionados das -1a a 44a bases (SEQ ID NO: 1) e a 58a a 115a bases (SEQ ID NO: 2), respectivamente, da extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos de éxon 44 (SEQ ID NO: 10) no gene da distrofina tipo selvagem humano efetivamente provoca salto do éxon 44.

[EXEMPLO DE TESTE 2] Ensaio in vitro

[00205] O experimento foi realizado como no EXEMPLO DE TESTE 1, exceto que 3,5x 105 das células RD (linha celular de rabdomiossarcoma humano) foram transfectadas com os oligômeros da presente invenção do PMO Nos. 34, 100, 45, 73, 49 e 47, cada um sendo sozinho ou na forma onde dois oligômeros unitários que constituem cada oligômero está contido sozinho ou em mistura, a uma concentração de 1, 3 ou 10 μM, usando um Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L on Nucleofector II (Lonza). O Programa T-030 foi usado. As combinações das sequências para a transfecção são como se segue. [TABELA 7] Combinação das sequências transfectadas

Resultados experimentais

[00206] Os resultados são mostrados nas figuras 27 a 31. Este experimento revelou que cada dos PMO Nos. 110 a 115, PMO No. 117 e PMO No. 118 que direcionam um sítio no éxon 44 não poderia provocar salto do éxon 44 em si. Este experimento também revelou que, comparado com misturas de dois ácidos nucleicos antissentido que direcionam diferentes sítios em éxon 44 (a mistura de PMO No. 114 e PMO No. 115; a mistura de PMO No. 109 e PMO No. 114; a mistura de PMO No. 110 e PMO No. 111; a mistura de PMO No. 112 e PMO No. 113; a mistura de PMO No. 117 e PMO No. 118; e a mistura de PMO No. 119 e PMO No. 120), os oligômeros da presente invenção de PMO No. 34, PMO No. 100, PMO No. 45, PMO No. 73, PMO No. 49 e PMO No. 47, onde cada dos oligômeros unitários correspondentes são conectados um com o outro, provocam salto do éxon 44 com altas eficiências.

[EXEMPLO DE TESTE 3] Ensaio in vitro usando fibroblastos humanos

[00207] A atividade de salto do éxon 44 foi determinada usando células GM05112 (paciente com fibroblastos derivados de DMD humano com deleção do éxon 45, Coriell Institute for Medical Research). Como um meio de crescimento foi usado meio Eagle modificado de Dulbecco: Mistura de NUtrientes F-12 (DMEM/F-12) (Life Technologies) contendo 10% de FCS (HyClone Laboratories, Inc.) e 1% de Penicilina/estreptamicina (P/S) (Sigma- Aldrich, Inc.) e as células foram cultivadas em condições de 37°C e 5% CO2.

[00208] As células foram cultivadas em frasco T225 e os 2,5 mL de retrovírus (coexpressão ZsGreen1) que expressa myoD derivado de humano (SEQ ID NO: 127) e uma concentração final de 8 μg/mL de polibreno (Sigma-Aldrich, Inc.) foram adicionados a 30 mL do meio de crescimento. Depois da incubação a 32°C por 2 dias, o meio foi trocado por um meio de crescimento recém preparado e incubação adicionalmente continuou a 37°C por 3 dias. Fibroblastos transformados por MyoD positivo para ZsGreen1 foram coletados por BD FACSAria Cell Sorter (BD Bioscience). As células coletadas foram suspensas em um meio de diferenciação (DMEM/F-12 contendo 2% de soro equino (LifeTechnologies), 1% de P/S e suplemento de meio líquido ITS (Sigma-Aldrich, Inc.)) e plaqueadas a 9,4 x 104 células/poço em uma placa de 24 poços revestida com colágeno. O meio foi trocado a cada 2 a 3 dias e incubação continuou para diferenciar em miotubos.

[00209] No 7° dia depois do plaqueamento em uma placa de 24 poços, o meio foi substituído por um meio de diferenciação e 10 μM dos oligômeros PMO No. 34, 45, 49 e 73 foram adicionados a ele a uma concentração final. Depois que as células foram incubadas por 2 dias, o meio foi substituído por um meio de diferenciação sem PMO, e as células foram incubadas por mais cinco dias. Então, as células foram coletadas para extrair RNA total usando Mini Kit RNeasy (QIAGEN). RT-PCR foi realizado com 50 ng do RNA total extraído usando um Kit de RT-PCR QIAGEN OneStep. Uma solução de reação foi preparada de acordo com o protocolo anexado ao kit. Um iCycler (fabricado por Bio-Rad Laboratories) foi usado como um circulador térmico. O programa de RT-PCR usado é como se segue. 50°C, 30 mins: reação de transcrição reversa 95°C, 15 mins: ativação de polimerase, inativação de transcriptase reversa, desnaturação térmica de DNAc 94°C, 1 min; 60°C, 1 min; 72 °C, 1 min] x 35 ciclos: amplificação por PCR 72°C, 7 mins: extensão final

[00210] As sequências de bases do iniciador dianteiro e iniciador reverso usadas para RT-PCR são dadas a seguir. Iniciador dianteiro: 5’- GCTCAGGTCGGATTGACATT -3’ (SEQ ID NO: 125) Iniciador reverso: 5’- GGGCAACTCTTCCACCAGTA -3’ (SEQ ID NO: 126)

[00211] 1 μL de produto de PCR foi analisado por Kits de análise de Experion DNA 1K (Bio-Rad Laboratories) usando Experion Electrophoresis Station (Bio-Rad Laboratories). Ensaio DNA 1K foi selecionado na versão 3.2 do Software Experion (Bio-Rad Laboratories) e medido. O nível (a) da banda em torno de 317 bp e o nível (B) da banda em torno de 465 bp foram determinados (unidade: nmol/L). A eficiência do salto (%) foi determinada pela seguinte equação usando Excel 2007 SP3 (Microsoft). Eficiência do salto (%) = A/(A + B) x 100 Resultados experimentais

[00212] Os resultados são mostrados na FIGURA 32. Este experimento revelou que os oligômeros antissentido da presente invenção de PMO Nos.34, 45, 49 e 73 poderiam provocar o salto do éxon 44 com uma alta eficiência em células de um paciente com DMD com deleção do éxon 45.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[00213] Resultados experimentais nos EXEMPLOS DE TESTE demonstram que os oligômeros da presente invenção, nos quais oligômeros curtos são conectados, provocaram o salto do éxon 44 em células RD. Desta forma, os oligômeros da presente invenção são extremamente úteis para o tratamento de DMD.

[00214] Texto livre da listagem de sequência

Claims

1. Oligômero antissentido, caracterizado pelo fato de ser uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 6 a 9, e induzir salto do éxon 44 no gene da distrofina humana, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. Oligômero antissentido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser um oligonucleotídeo ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo.

3. Oligômero antissentido de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a fração de açúcar e/ou a região de ligação do fosfato de pelo menos um nucleotídeo que constitui o oligonucleotídeo é modificado, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo.

4. Oligômero antissentido de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a fração de açúcar de pelo menos um nucleotídeo que constitui o oligonucleotídeo é uma ribose na qual o grupo 2’- OH é substituído por qualquer um selecionado do grupo que consiste em OR, R, R’OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br e I (em que R é um alquila ou um arila e R’ é um alquileno), ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo.

5. Oligômero antissentido de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que a região de ligação do fosfato de pelo menos um nucleotídeo que constitui o oligonucleotídeo é qualquer uma selecionada do grupo que consiste em uma ligação de fosforotioato, uma ligação de fosforoditioato, uma ligação de alquilfosfonato, uma ligação de fosforamidato e uma ligação de boranofosfato, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo.

6. Oligômero antissentido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser um oligômero de morfolino, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo.

7. Oligômero antissentido de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é um oligômero de morfolino de fosforoamidato, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo.

8. Oligômero antissentido de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a extremidade 5’ é qualquer uma das fórmulas químicas (1) a (3) a seguir, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo. [Fórmula 26]

9. Composição farmacêutica para tratamento de distrofia muscular através do salto do éxon 44 no gene da distrofina humana, caracterizada pelo fato de que compreende, como um ingrediente ativo, o oligômero antissentido como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo.

10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que compreende um carreador farmaceuticamente aceitável.

11. Uso de um oligômero antissentido ou um sal ou hidrato farmaceuticamente aceitável do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser para manufatura de uma composição farmacêutica para tratamento de distrofia muscular.