JP5056413B2 - 核酸含有複合体製剤の製造方法 - Google Patents
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Description
(1)二本鎖を形成し得る2つのポリヌクレオチドを同一溶液中に一本鎖の状態で含有する溶液と、カチオン性担体又はカチオン性担体が形成される前の原料溶液とを混合し、分散処理することを特徴とする核酸含有複合体製剤の製造方法。
(2)上記(1)の製造方法により得られる核酸含有複合体製剤。
実施例1〜7及び比較例1で行われた分散処理後の0.2μmのメンブランフィルターによるろ過滅菌において、いずれもフィルターの目詰まりもなくろ過滅菌を行うことができ、またろ液中の回収率も、いずれも98〜102%の範囲内であり、ほぼ100%のろ過滅菌が可能であった。
3gの化合物A、5gの精製卵黄レシチン(キューピー社製。以下同じ。)及び50gのマルトース(林原社製。以下同じ。)に215mLの注射用水(大塚製薬社製。以下同じ。)を加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて30分間分散処理し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に高圧乳化分散機[マイクロフルイダイザー(登録商標)。以下同じ。]を用いて、処理圧108MPaで30分間分散処理し、8gのカチオン性担体の分散液を得た。次に、塩基数が約170である、250mgのポリIと、塩基数が約180である、250mgのポリCとを200mLの注射用水に加え、溶解させた。この溶液200mLをカチオン性担体の分散液全量に、攪拌しながら添加し、更に、高圧乳化分散機を用いて、処理圧108MPaで2時間分散処理した後、0.2μmのメンブランフィルターでろ過滅菌し、本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を2mLづつバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に1.8mLの注射用水を加えて再溶解した。再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置[Nicomp370(登録商標):Particle Sizing Systems,Inc.社製。以下同じ。]によって測定したところ、152nmであった。また、1μm以上の粒子は含まれなかった。
1.5gの化合物A、2.5gの精製卵黄レシチン及び50gのマルトースに221mLの注射用水を加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて30分間分散処理し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に高圧乳化分散機を用いて、処理圧108MPaで30分間分散処理し、4gのカチオン性担体の分散液を得た。次に、塩基数が約400である、125mgのポリIと、塩基数が約380である、125mgのポリCとを200mLの注射用水に加え、溶解させた。この溶液200mLをカチオン性担体の分散液全量に、攪拌しながら添加し、更に、高圧乳化分散機を用いて、処理圧108MPaで2時間分散処理した後、0.2μmのメンブランフィルターでろ過滅菌し、本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を1mLづつバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に5mLの注射用水を加えて再溶解した。再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置粒子径測定装置によって測定したところ、146nmであった。また、1μm以上の粒子は含まれなかった。
3gの化合物A、5gのパルミトイル−オレイル−ホスファチジルコリン(日本油脂社製。)及び50gのマルトースに215mLの注射用水を加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて30分間分散処理し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に高圧乳化分散機を用いて、処理圧108MPaで30分間分散処理し、8gのカチオン性担体の分散液を得た。次に、塩基数が約310である、250mgのポリIと、塩基数が約330である、250mgのポリCとを200mLの注射用水に加え、溶解させた。この溶液200mLをカチオン性担体の分散液全量に、攪拌しながら添加し、更に、高圧乳化分散機を用いて、処理圧108MPaで2時間分散処理した後、0.2μmのメンブランフィルターでろ過滅菌し、本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を2mLづつバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に1.8mLの注射用水を加えて再溶解した。再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、142nmであった。また、1μm以上の粒子は含まれなかった。
0.12gの化合物A、0.2gの精製卵黄レシチン及び2gのマルトースに注射用水を加えて10mLにした後、よく攪拌混合し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に超音波分散機を用いて、出力100Wで15分間分散処理し、0.32gのカチオン性担体の分散液を得た。次に、塩基数が約310である、10mgのポリIと、塩基数が約330である、10mgのポリCとを50mLの注射用水に加え、溶解させた。この溶液5mLをカチオン性担体の分散液5mLに、攪拌しながら添加し、更に、超音波分散機[SONIFIER(登録商標)。以下同じ。]を用いて、出力100Wで15分間分散処理した後、0.2μmのメンブランフィルターでろ過滅菌し、本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を1mLづつバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に0.87mLの注射用水を加えて再溶解した。再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、145nmであった。また、1μm以上の粒子は含まれなかった。
0.12gの化合物A、0.2gの精製卵黄レシチン及び2gのマルトースに注射用水を加えて10mLにした後、よく攪拌混合し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に超音波分散機を用いて、出力100Wで15分間分散処理し、0.32gのカチオン性担体の分散液を得た。次に、塩基数が約310である、30mgのポリIと、塩基数が約330である、30mgのポリCとを10mLの注射用水に加え、溶解させた。この溶液5mLをカチオン性担体の分散液5mLに、攪拌しながら添加し、更に、超音波分散機を用いて、出力100Wで15分間分散処理した後、0.2μmのメンブランフィルターでろ過滅菌し、本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を1mLづつバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に0.87mLの注射用水を加えて再溶解した。再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、163nmであった。また、1μm以上の粒子は含まれなかった。
0.16gのN−[1−(2,3−ジオレイロキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(東京化成工業社製。)、0.16gのジオレイルホスファチジルエタノールアミン(日本油脂社製。)及び2gのマルトースに注射用水を加えて10mLにした後、よく攪拌混合し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に超音波分散機を用いて、出力100Wで15分間分散処理し、0.32gのカチオン性担体の分散液を得た。次に、塩基数が約310である、10mgのポリIと、塩基数が約330である、10mgのポリCとを10mLの注射用水に加え、溶解させた。この溶液5mLをカチオン性担体の分散液5mLに、攪拌しながら添加し、更に、超音波分散機を用いて、出力100Wで15分間分散処理した後、0.2μmのメンブランフィルターでろ過滅菌し、本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を1mLづつバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に0.87mLの注射用水を加えて再溶解した。再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、151nmであった。また、1μm以上の粒子は含まれなかった。
0.6gの化合物A、1gの精製卵黄レシチン及び10gのマルトースに注射用水を加えて50mLにした後、よく攪拌混合し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に高圧乳化分散機を用いて処理圧135MPaで90分間分散処理し、1.6gのカチオン性担体の分散液を得た。次に、5gのマルトースに注射用水を加え25mLにした溶液に、塩基数が共に21である、互いに相補的な配列を有する2つのオリゴリボヌクレオチドを、それぞれ25mg溶解させた。この溶液25mLをカチオン性担体の分散液25mLに、攪拌しながら添加し、更に、高圧乳化分散機を用いて、処理圧135MPaで40分間分散処理した後、0.2μmのメンブランフィルターでろ過滅菌し、本発明製剤を得た。
その後、この本発明製剤を1mLづつバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に0.87mLの注射用水を加えて再溶解した。再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、147nmであった。また、1μm以上の粒子は含まれなかった。
3gの化合物A、5gの精製卵黄レシチン及び50gのマルトースに215mLの注射用水を加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて30分間分散処理し、カチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を、更に高圧乳化分散機を用いて、処理圧108MPaで30分間分散処理し、8gのカチオン性担体の分散液を得た。この分散液全量に塩基数が約180である、250mgのポリIを含む100mLの水溶液と塩基数が約200である、250mgのポリCを含む100mLの水溶液を同時に攪拌しながら添加し、更に、高圧乳化分散機を用いて、処理圧108MPaで2時間分散処理した後、0.2μmのメンブランフィルターでろ過滅菌し、比較製剤を得た。
その後、この比較製剤を2mLづつバイアルに分注し、常法に従って、凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に1.8mLの注射用水を加えて再溶解した。再溶解後の比較製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、149nmであった。また、1μm以上の粒子は含まれなかった。
実施例1で得られた本発明製剤と比較例1で得られた比較製剤に含有されているポリIとポリCの温度に対する安定性を、ポリIとポリCのそれぞれの塩基数の変化から評価した。
実験は、各製剤を、温度40℃、相対湿度75%の条件下で、2週間保存した後、ジエチルエーテル(ナカライテスク社製。以下同じ。)を用いて脱脂を行った。その後、TSK−Gel G5000PWXLカラム(東ソー社製。以下同じ。)を用い、サイズ排除クロマトグラフィーの一種であるゲルろ過クロマトグラフィーを行い、250nmと260nmの吸光度を測定し、ポリIとポリCのそれぞれの塩基数を算出した。
その結果を表1に示す。
表1から明らかな通り、比較例1で得られた比較製剤中のポリI及びポリCは、保存中に、その塩基数は減少したのに対して、実施例1で得られた本発明製剤中のポリI及びポリCは、保存前後で、その塩基数は変動せず、比較製剤より温度に対して安定であった。
実施例2及び実施例3で得られた本発明製剤に含有されているポリIとポリCの温度に対する安定性を、ポリIとポリCのそれぞれの塩基数の変化から評価した。
実験は、各製剤を、温度40℃、相対湿度75%の条件下で、6ヶ月保存した後、ジエチルエーテルを用いて脱脂を行った。その後、TSK−Gel G5000PWXLカラムを用い、ゲルろ過クロマトグラフィーを行い、250nmと260nmの吸光度を測定し、ポリIとポリCのそれぞれの塩基数を算出した。
その結果を表2に示す。
表2から明らかな通り、実施例2及び実施例3で得られた本発明製剤中のポリI及びポリCは、保存前後で、その塩基数は変動せず、共に温度に対して安定であった。
実施例7で得られた本発明製剤に含有されているオリゴリボヌクレオチドの温度に対する安定性を、オリゴリボヌクレオチドの塩基数の変化から評価した。
実験は、各製剤を、温度40℃、相対湿度75%の条件下で、6ヶ月保存した後、ジエチルエーテルを用いて脱脂を行った。その後、DNAPac PA−100カラム(DIONEX社製。)を用い、陰イオン交換クロマトグラフィーにより、オリゴリボヌクレオチドの塩基数を算出した。
その結果を表3に示す。
表3から明らかな通り、実施例7で得られた本発明製剤中のオリゴリボヌクレオチドは、保存前後で、その塩基数は変動せず、温度に対して安定であった。
実施例2で得られた本発明製剤を、温度40℃、相対湿度75%の条件下で、6ヶ月保存した後の薬理活性の変動を、ヒト扁平上皮がん由来の細胞株であるA431細胞に対する増殖抑制作用から評価した。
1)実験方法
細胞濃度を105個/mLに調整したA431細胞の細胞浮遊液を、96穴ウエルプレートに90μLずつ分注した後、4〜6時間静置し、A431細胞をプレート底面に接着させた。その後、種々の濃度の本発明製剤を添加し、その3日後に、MTT法により呈色反応を行った後に、マイクロプレートリーダーを用いて、各ウエルの570nmにおける吸光度を測定した。なお、本発明製剤の代わりに、生理食塩水を添加し、同様に培養した細胞を陰性対照細胞とした。
2)評価方法
評価は、次式より算出した細胞増殖阻害率(%)に基づき、IC50(ng/mL)を算出することにより行った。なお、IC50は、ポリIとポリCとを合わせた濃度である。
細胞増殖阻害率(%)=(1−[薬剤処理細胞の吸光度/陰性対照細胞の吸光度])×100
3)試験結果
その結果を表4に示す。
表4から明らかな通り、実施例2で得られた本発明製剤は、保存前後で、そのIC50に変動はなく、薬理活性は保持されていた。
核酸含有複合体製剤中の2つのポリヌクレオチドの存在形態を、蛍光共鳴エネルギー移動[Fluorescence Resonance Energy Transfer(以下、「FRET」という)]法を用い、2つのポリヌクレオチド間の距離を測定することにより評価した。
FRET法とは、当業者に既知の方法であり、具体的には、光吸収により発生する励起エネルギー供与体蛍光分子と励起エネルギー受容体蛍光分子の相対的位置関係を蛍光のシグナルとして測定する方法である。
1)試験用試料の調製
i)蛍光標識したポリI及びポリCの調製
当業者に既知の方法により、塩基数が約170であるポリIにAlexa Fluor568(Molecular Probe社製。)を導入し、蛍光標識したポリI(以下、「蛍光化ポリI」という)を調製した。同様に、塩基数が約180であるポリCにAlexa Fluor546(Molecular Probe社製。)を導入し、蛍光標識したポリC(以下、「蛍光化ポリC」という)を調製した。
ii)本発明製剤及びその比較対照用試料の調製
上記i)で得られた蛍光化ポリIと蛍光化ポリCとを用いて、実施例1と同様の条件下で、蛍光化ポリIと蛍光化ポリCとを共に含有する本発明製剤と、蛍光化ポリCのみを含有する本発明製剤の比較対照試料を調製した。
iii)比較製剤及びその比較対照用試料の調製
上記i)で得られた蛍光化ポリIと蛍光化ポリCとを用いて、比較例1と同様の条件下で、蛍光化ポリIと蛍光化ポリCとを共に含有する比較製剤と、蛍光化ポリCのみを含有する比較製剤の比較対照試料を調製した。
iv)陽性対照試料及びその比較対照用試料の調製
上記i)で得られた蛍光化ポリIと蛍光化ポリCとを用いて、同一の生理食塩水中に、蛍光化ポリIと蛍光化ポリCとを共に溶解させた陽性対照試料と、蛍光化ポリCのみを溶解させた陽性対照試料の比較対照試料を調製した。
2)評価方法
評価は、上記1)で調製した本発明製剤、比較製剤、陽性対照試料及びそれぞれの比較対照試料の蛍光強度を測定し、その値よりFRET効率を算出することにより行った。なお、FRET効率とは、蛍光化ポリIと蛍光化ポリCとを共に含有する試験用試料の蛍光強度を、蛍光化ポリCのみを含有する当該試験用試料の比較対照試料の蛍光強度で除した値を、1より引いた値である。
FRET効率が高くなるほど、試験試料中のポリIとポリCの間の距離は近いと判断される。
3)試験結果
試験結果を表5に示す。
表5から明らかな通り、本発明製剤中のポリIとポリCの間の距離は、比較製剤中のポリIとポリCの間の距離よりも短く、陽性対照試料中のポリIとポリCの間の距離と同等であった。即ち、本発明製剤中のポリIとポリCは、二本鎖を形成しているポリIとポリCの距離と同等であることが示された。
Claims (8)
- 二本鎖を形成し得る2つの一本鎖ポリヌクレオチドを同一溶液中に溶解させた後に、かかる2つのポリヌクレオチドが一本鎖の状態で含有する当該溶液と、カチオン性担体又はカチオン性担体が形成される前の原料溶液とを混合し、分散処理することを特徴とする核酸含有複合体製剤の製造方法。
- ポリヌクレオチドが、ポリデオキシリボヌクレオチド又はポリリボヌクレオチドである、請求項1に記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
- ポリヌクレオチドが、オリゴデオキシリボヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチドである、請求項1に記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
- ポリヌクレオチドが、ポリイノシン酸、ポリシチジル酸、ポリアデニル酸、ポリウリジル酸、ポリ(シチジル酸、ウリジン酸)、ポリ(シチジル酸、4−チオウリジン酸)、ポリシチジル酸・ポリ−L−リジン、ポリ(1−ビニルシチジル酸)、アンチセンスDNA、アンチセンスRNA、DNAエンザイム、リボザイム、デコイ、アプタマー又はRNA干渉を発揮し得る二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖若しくはアンチセンス鎖である、請求項1に記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
- ポリヌクレオチドが、ポリイノシン酸、ポリシチジル酸又はRNA干渉を発揮し得る二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖若しくはアンチセンス鎖である、請求項1に記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
- カチオン性担体が、2−O−(2−ジエチルアミノエチル)カルバモイル−1,3−O−ジオレオイルグリセロールとリン脂質とを必須の構成成分とするカチオン性担体である、請求項1〜5のいずれかに記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
- リン脂質が、レシチンである、請求項6に記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の製造方法により得られる核酸含有複合体製剤。
Priority Applications (1)
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