ES2614115T3 - Sistema de micelas inversas que comprenden ácidos nucleicos y su uso - Google Patents

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Abstract

Un sistema de micelas inversas que comprende al menos un ácido nucleico, un esterol, un acilglicerol, un fosfolípido o un esfingolípido, un alcohol y agua, en donde la relación en peso fosfolípido o esfingolípido/acilglicerol es de 0,05 a 0,40.

Description

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DESCRIPCION
Sistema de micelas inversas que comprenden acidos nucleicos y su uso Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un sistema de micelas inversas basado en esteroles, acilgliceroles, fosfcdpidos o esfingoUpidos y acidos nucleicos. El sistema de micelas inversas de la invencion es capaz de atravesar las membranas mucosas y celulares. Por tanto, permite la vectorizacion de acidos nucleicos a sitios diana. Es ventajosamente util en los campos farmaceutico y dietetico.
Antecedentes de la invencion
Las estrategias de RNAi (interferencia por RNA) y antisentido (AS) consisten en silenciar la expresion de un gen diana por el uso de acidos nucleicos que permiten la degradacion o la detencion de la traduccion del mRNA diana. Las nuevas aplicaciones antisentido (salto de exon, correccion alternativa de corte y empalme), enmascarando la mutacion responsable de un defecto alternativo de corte y empalme, han permitido la smtesis de una protema funcional. Los aptameros son acidos nucleicos capaces de interaccionar con una protema diana y sub-regular su smtesis. El descubrimiento de todos estos acidos nucleicos y mas recientemente siRNA, miRNA y RNAa ha abierto amplias perspectivas en terapeutica para el tratamiento de enfermedades como enfermedades geneticas, canceres, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades infecciosas e inflamatorias o el bloqueo de la proliferacion celular y de enfermedades causadas por ella.
Sin embargo, estas moleculas son inestables en los fluidos biologicos, in vitro e in vivo, presentan una mala penetracion intracelular y baja biodisponibilidad. Estos inconvenientes cnticos han limitado su uso en terapeutica. Como resultado, las aplicaciones clmicas de dichos acidos nucleicos han requerido modificaciones qmmicas con el fin de retener su capacidad para inactivar la expresion de las protemas aumentando mientras la estabilidad y penetracion celular. Los grupos de investigacion han aplicado tambien metodos nanotecnologicos para mejorar su suministro, para superar la mayona de las barreras que dificultaban el desarrollo de terapias basadas en el suministro de acidos nucleicos. Para mejorar la biodisponibilidad, muchos investigadores han intentado tambien utilizar vfas de administracion alternativas: ocular, dermica, oral, intramuscular. Estos intentos no han sido hasta ahora totalmente satisfactorios. Por ejemplo, algunos de estos intentos, mas espedficamente ensayos con acidos nucleicos en veldculos de liposomas han estimulado la respuesta inmunitaria.
Los inventores habfan descubierto previamente que podfan obtenerse complejos a partir de dos compuestos organicos aislados de extractos de plantas y constituidos respectivamente de sitosterol y acilgliceroles y agentes terapeuticos hidrosolubles (WO2006/048772), siendo estos complejos agentes particularmente eficaces como vectores de dichos agentes terapeuticos que atraviesan las mucosas. Dicha vectorizacion de agentes terapeuticos hidrosolubles produce una importante disminucion de las cantidades administradas en comparacion con su administracion en ausencia de micelas como se ha descrito anteriormente.
Dichos complejos se han mostrado eficaces para vectorizar agentes terapeuticos hidrosolubles por administracion inmediata a las mucosas. Sin embargo la estabilidad de microemulsiones que contienen agentes terapeuticos no es siempre satisfactoria para permitir su desarrollo como sistemas de suministro de, por ejemplo, farmacos y/o compuestos dieteticos. Dicho desarrollo requiere formulaciones que sean estables durante penodos de tiempo mas largos, por ejemplo durante varias semanas o meses, a temperatura ambiente.
Un objeto de la presente invencion es superar las desventajas de la tecnica anterior. Existe una necesidad evidente de una estrategia terapeutica de acidos nucleicos segura y eficaz y en particular de nuevas herramientas que sean capaces de lograr una terapia basada en la modulacion eficaz de la expresion genica. Mas particularmente, un objeto de la invencion es proporcionar un sistema de suministro de farmacos que comprende un acido nucleico, en particular un oligonucleotido, que puede ser, por ejemplo, administrado a traves de las mucosas, dando lugar a una biodisponibilidad satisfactoria del farmaco en una forma activa.
La incorporacion de un fosfolfpido o un esfingolfpido, en particular en cantidades espedficas, en la formulacion de microemulsiones que comprenden altas dosis de acido nucleico provoco sorprendentemente un aumento importante de su estabilidad.
La presente invencion describe nuevas formulaciones en microemulsiones capaces de vectorizar altas cantidades de acidos nucleicos, su proceso de preparacion y su uso como sistemas de suministro de farmacos y/o compuestos dieteticos. Cantidades "altas" se refieren en la presente memoria a cantidades suficientes para obtener una actividad terapeutica a escala humana, pero que permanecen muy inferiores a las cantidades de acido nucleico suministradas en ausencia de complejos.
Esta formulacion hace ventajosamente posible el control y la optimizacion de la composicion que comprende micelas para su uso en los campos farmaceutico y dietetico.
Sumario de la invencion
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La presente invencion se refiere a un sistema de suministro para la liberacion de un acido nucleico, aplicado preferiblemente a traves de las mucosas, asf como a las composiciones y metodos para preparar el sistema de suministro. En la presente memoria se describen sistemas de micelas inversas disenados para alcanzar este objetivo de una manera segura y controlada. Los sistemas de micelas inversas son capaces de ser absorbidos por las mucosas y vectorizar los acidos nucleicos bajo una forma protegida a cualquier tejido del organismo.
Mas particularmente, la presente invencion proporciona un sistema de transporte de micelas inversas para la dispensacion de un acido nucleico, en particular un oligonucleotido, capaz de interaccion con pre-mRNA, mRNA o una protema, y la modulacion de la expresion genica. Mas espedficamente, las micelas inversas de acuerdo con la invencion promueven la absorcion del acido nucleico a traves de las barreras epiteliales de las mucosas y permiten que el acido nucleico se internalice en las celulas diana. Las micelas inversas de la invencion comprenden mas espedficamente al menos un acido nucleico, en particular un oligonucleotido, capaz de modular la expresion genica, un esterol, un acilglicerol, un fosfolfpido o un esfingolfpido, un alcohol y agua.
Las micelas inversas se pueden preparar de acuerdo con un metodo descrito a continuacion utilizando al menos un esterol, un acilglicerol, un fosfolfpido o un esfingolfpido, un alcohol y agua.
Dichas micelas son mas particularmente obtenibles por el metodo siguiente:
(a) poner en contacto (i) esterol, preferiblemente sitosterol o colesterol, (ii) acilglicerol, preferiblemente diacilglicerol, (iii) fosfolfpidos, preferiblemente fosfatidilcolina, o esfingolfpidos, (iv) alcohol, (v) agua, preferiblemente agua purificada y (vi) al menos un acido nucleico, en particular un oligonucleotido, capaz de modular la expresion genica,
(b) agitar la mezcla obtenida en la etapa (a) a 40°C o menos, y durante un tiempo suficiente para obtener la formacion de micelas inversas.
Los parametros de agitacion, por ejemplo la duracion y la velocidad de agitacion mecanica, pueden ser determinados facilmente por cualquiera experto en la tecnica y dependen de las condiciones experimentales. En la practica, estos parametros son tales que se obtenga una microemulsion; la velocidad se determina con el fin de permitir la formacion de una formulacion visualmente lfmpida, y la duracion de la agitacion es tal que la agitacion se pueda detener unos minutos despues de la obtencion de la formulacion visualmente lfmpida.
La presente invencion se refiere ademas a una composicion que comprende las micelas inversas de la invencion y un vedculo, excipiente o soporte farmaceuticamente aceptable.
Descripcion detallada de la invencion
La siguiente descripcion se refiere a realizaciones preferidas solamente como ejemplos y sin limitacion a la combinacion de las caractensticas necesarias para implementar la invencion.
Micelas inversas
El sistema de micelas inversas de acuerdo con la invencion se caracteriza como una microemulsion que comprende una dispersion de nanogotitas de agua en aceite. La dispersion es estabilizada por dos tensioactivos (un acilglicerol, mas preferiblemente un diacilglicerol, y un fosfolfpido, mas preferiblemente fosfatidilcolina, o un esfingolfpido) y un co-tensioactivo (alcohol) que estan mas probablemente en la interfase agua/aceite. Las micelas inversas se pueden definir como un sistema en el que el agua forma la fase interna y las colas hidrofobas de los lfpidos forman la fase continua. Las micelas inversas que contienen aceite(s), tensioactivo(s), co-tensioactivo(s) y una fase acuosa tambien se caracterizan como microemulsiones de agua en aceite. Estas microemulsiones son termodinamicamente estables y visualmente lfmpidas.
Generalmente, el tamano de las micelas de acuerdo con la invencion es muy pequeno, mas particularmente, es menor que 10 nm; mas espedficamente, es menor que 8 nm y mas preferiblemente menor que 6 nm. El tamano puede variar con la cantidad de agua y fosfolfpidos o esfingolfpidos anadidos. La presente invencion se refiere mas particularmente a micelas inversas con un nucleo acuoso de 4 nm, preferiblemente de 3 a 5 nm, mas preferiblemente de 3,5 a 5 nm, en particular de 3,7 a 4,5 nm.
Las micelas inversas y el tamano de su nucleo acuoso se pueden caracterizar por varios metodos, que incluyen:
- Dispersion de rayos X en angulos pequenos (abreviadamente SAXS, por sus siglas en ingles Small Angle X-Ray Scattering)
- Dispersion de neutrones
- Microscopfa electronica de transmision (abreviadamente TEM, por sus siglas en ingles Transmission Electron Microscopy)
- Dispersion dinamica de luz (abreviadamente DLS, por sus siglas en ingles Dynamic Light Scattering)
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Las relaciones de los constituyentes lipfdicos (que incluyen esterol, acilglicerol y fosfoffpido o esfingoffpido) en el sistema de micelas inversas de acuerdo con la invencion pueden variar. Por ejemplo, la relacion en peso esterol/acilglicerol puede variar desde 0,015 hasta 0,05, mas en particular desde 0,03 hasta 0,04.
La relacion en peso fosfoffpido o esfingoffpido/acilglicerol puede variar desde 0,05 hasta 0,40, en particular desde 0,06 hasta 0,25. El peso de fosfoffpido o esfingoffpido corresponde respectivamente al peso total de la mezcla de fosfoffpidos o esfingoffpidos, por ejemplo, el peso de lecitina, utilizado en la formulacion. Similarmente, el peso de acilglicerol corresponde al peso total de la mezcla que contiene generalmente un acilglicerol, o una mezcla de acilgliceroles, con glicerol y acidos grasos derivados de dicho(s) acilglicerol(es).
Los compuestos del sistema de micelas inversas pueden ser analizados por medios adecuados. Mas espedficamente, los esteroles se pueden identificar por analisis cromatografico de gases y el acilglicerol por cromatograffa de ffquidos de alta resolucion (HPLC), en particular con un detector de dispersion de la luz, en una columna de sflice, en presencia de un eluyente, por ejemplo, acetonitrilo isocratico. La cromatograffa de gases tambien se puede utilizar para analizar diacilgliceroles. Los fosfoffpidos y esfingoffpidos pueden ser analizados por cromatograffa de ffquidos de alta resolucion (HPLC), con una columna de diol con un detector de dispersion de la luz.
Las micelas inversas son sistemas dinamicos. El movimiento browniano provoca colisiones perpetuas de las micelas, lo que conduce a la coalescencia de las micelas y al intercambio de los nucleos acuosos. Se produce la separacion y regeneracion de las micelas lo que permite las reacciones qmmicas entre diferentes soluciones. La velocidad de intercambio entre las micelas aumenta en particular con la temperatura, la longitud de las cadenas hidrocarbonadas del tensioactivo y la relacion agua/tensioactivo. En el contexto de la invencion, los nucleos acuosos de las micelas deben tener un tamano espedfico que permita que una o mas moleculas de acido nucleico, en particular el oligonucleotido, capaces de modular la expresion genica, sean estabilizadas en las micelas preparadas. Como se ha mencionado anteriormente, el tamano del nucleo acuoso es preferiblemente alrededor de 4 nm, mas preferiblemente de 3 a 5 nm, mas espedficamente de 3,5 a 5 nm, en particular de 3,7 a 4,5 nm.
Las micelas inversas pueden existir en el sistema de la invencion como diferentes organizaciones estructurales, tales como por ejemplo esferas, cilindros o cilindros ramificados.
Sin estar vinculado a ninguna teoffa, parece que la inclusion de un fosfoffpido o un esfingoffpido en el sistema de micelas inversas permite la formacion de micelas estables con mayor diametro y volumen, lo que permite la vectorizacion de mayores cantidades de acido nucleico. Este aumento en las cantidades de acido nucleico vectorizado proporciona vectorizacion de cantidades suficientes para obtener una actividad terapeutica. La incorporacion del fosfoffpido o esfingoffpido en el sistema de micelas inversas confiere ademas una mayor estabilidad a las microemulsiones, en particular a las microemulsiones que contienen altas cantidades de acido nucleico.
El sistema de micelas inversas de la invencion asegura la absorcion de los compuestos que son suministrados a traves de las mucosas, preferiblemente a traves de las mucosas bucal, nasal y/o rectal, mas preferiblemente a traves de la mucosa bucal. Tambien, las micelas inversas de la presente invencion proporcionan una biodisponibilidad importante con baja variabilidad de la absorcion.
Metodo para preparar micelas inversas
En una realizacion particular, la invencion se refiere a un metodo para preparar micelas inversas que presentan un nucleo acuoso de alrededor de 4 nm, preferiblemente de 3 a 5 nm, mas preferiblemente de 3,5 a 5 nm, en particular de 3,7 a 4,5 nm y que implican al menos un acido nucleico, en particular un oligonucleotido, capaz de modular la expresion genica, un esterol, un acilglicerol, un fosfoffpido o un esfingoffpido, un alcohol y agua, en el que dicho metodo comprende las siguientes etapas:
(a) poner en contacto (i) esterol, (ii) acilglicerol, preferiblemente diacilglicerol, (iii) fosfoffpido, preferiblemente fosfatidilcolina, o esfingoffpido, (iv) alcohol, (v) agua, preferiblemente agua purificada, y (vi) al menos un acido nucleico, en particular un oligonucleotido, capaz de modular la expresion genica,
(b) agitar la mezcla obtenida en la etapa (a), a 40°C o menos, y durante un tiempo suficiente para obtener la formacion de micelas inversas.
Las micelas inversas obtenidas y recuperadas son entonces particularmente utiles como un sistema de suministro de acidos nucleicos. La etapa (b) del procedimiento es de particular importancia ya que permite obtener micelas inversas, siendo entonces dichas micelas inversas utiles como un sistema de transporte para suministrar el acido nucleico a los sitios diana. Los sitios diana pueden ser, por ejemplo, celulas de un tejido espedfico.
En una realizacion particular, el acido nucleico se solubiliza en primer lugar en agua (preferiblemente agua purificada) para formar una mezcla acuosa. Dicha mezcla acuosa se introduce luego en la mezcla oleosa (etapa (a)). La mezcla oleosa comprende preferiblemente al menos un esterol, un acilglicerol, un fosfoffpido o un esfingoffpido, y un alcohol.
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Los compuestos implicados en la etapa (a) se describiran con mas detalles a continuacion.
La agitacion de la mezcla obtenida en la etapa (a) se realiza a una temperatura menor o igual a 40°C, variando espedficamente de 15°C a 40°C, o mas preferiblemente de 25°C a 40°C, o mas espedficamente de 30°C a 37°C. El tiempo suficiente puede variar en particular segun la tecnica de agitacion utilizada. El tiempo de agitacion es en cualquier caso el tiempo necesario para convertir la mezcla inicial en una solucion de micelas inversas visualmente limpida.
Un experto en la tecnica sabe como seleccionar excipientes o componentes que se puedan utilizar junto con la composicion de acuerdo con la presente invencion, con el fin de mantener sus propiedades beneficiosas. En particular, la presencia de glicerol puede, cuando se introduce en gran cantidad, evitar la formacion de micelas inversas o romper el sistema de micelas inversas. Mas espedficamente, no mas de 2,5% (porcentaje expresado en peso de glicerol/peso de acilglicerol) se utiliza para la preparacion de las micelas inversas de la presente invencion.
En la etapa (a) se pueden introducir otros compuestos. Se pueden citar por ejemplo, agentes colorantes y/o sustancias aromatizantes.
De manera ventajosa, los compuestos antes citados o las mezclas comercialmente disponibles que los contienen son los unicos ingredientes introducidos para preparar el sistema de micelas y por consiguiente los unicos presentes en el sistema de micelas de la invencion.
La agitacion de la etapa (b) puede ser realizada, por ejemplo, por agitacion mecanica.
Los aparatos usuales pueden ser helices cuyos movimientos rapidos generan turbulencias y remolinos que permiten la interpenetracion de las particulas y la formacion de micelas inversas dentro de la mezcla.
La velocidad de agitacion mecanica varia preferiblemente de 100 a 2000 r/minuto, mas preferiblemente de 300 a 700 r/minuto. Los volumenes, dispositivo y velocidad de agitacion implementados dependen y deben adaptarse a los reaccionantes y sus cantidades.
La temperatura varia mas espedficamente de 15°C a 40°C, o de 25°C a 40°C, o incluso mas espedficamente de 30°C a 37°C.
Compuestos de micelas inversas Acilglicerol
Los acilgliceroles utiles para la preparacion del sistema de micelas inversas de acuerdo con la invencion se pueden aislar de la mayoria de animales y mas preferiblemente de las plantas.
Los acilgliceroles incluyen mono-, di- y tri-acilgliceroles. En una realizacion particular, los acilgliceroles utilizados preferiblemente en la presente invencion tienen la formula (I) siguiente:
CH2OR1
chor2
CHo0R,
en la cual:
- Ri es un residuo acilo de un acido graso saturado o insaturado, lineal o ramificado, que tiene entre 14 y 24 atomos de carbono, un atomo de hidrogeno, o una mono-, di- o tri-galactosa o glucosa;
- R2 es un residuo acilo de un acido graso saturado o insaturado, lineal o ramificado, que tiene entre 2 y 18 atomos de carbono;
- R3 es un residuo acilo de un acido graso saturado o insaturado, lineal o ramificado, que tiene entre 14 y 24 atomos de carbono, o un atomo de hidrogeno.
De acuerdo con una realizacion particular, R1 o R3, preferiblemente solo uno de R1 y R3, en particular solo R1, representa un residuo acilo de acido oleico (C18: 1[cis]-9).
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De acuerdo con un aspecto particular, R2 tiene un enlace insaturado (por ejemplo, enlace etilenico) y tiene ventajosamente 18 atomos de carbono, preferiblemente R2 es un residuo de acido oleico (grupo oleoilo), uno de sus isomeros posicionales respecto al doble enlace (cis-6,7,9,11 y 13) o uno de sus isomeros iso-ramificados.
De acuerdo con otro aspecto particular, R1 representa un grupo oleoilo.
De acuerdo con otro aspecto particular, R2 representa un grupo acetilo.
De acuerdo con otro aspecto particular, R3 es un atomo de hidrogeno.
Como regla general, se elegira un aceite que contenga una alta concentracion de acido oleico como una fuente util de acilgliceroles de acuerdo con la invencion. Dicho aceite contiene generalmente una alta proporcion de acilgliceroles utiles de acuerdo con la invencion.
De acuerdo con un aspecto particular de la invencion, los diacilgliceroles preferidos se seleccionan del grupo que consiste en 1,2-dioleoilglicerol (o tambien denominado en la presente memoria 1,2-dioleina) y 1 -oleoil-2-acetil- glicerol.
Tambien estan disponibles comercialmente cierto numero de ellos, y mas particularmente los que se cree que son los mas activos en las aplicaciones deseadas. Este es el caso particularmente de 1 -oleoil-2-acetilglicerol y 1,2- dioleoilglicerol. El monooleato de glicerol 40 contiene aproximadamente 33% de dioleoilglicerol y alrededor del 11% de 1,2-dioleina y es aceptado farmaceuticamente (Farmacopea Europea (4a edicion), USP 25/NF20 y Norma Japonesa de Aditivos Alimentarios). Dicho producto esta comercialmente disponible, por ejemplo, por Gattefosse Company con el nombre PECEOL®.
Los acilgliceroles se incorporan preferiblemente o estan comprendidos en la composicion o en el sistema de micelas inversas en una cantidad en peso que vana de 50 g a 90 g respecto a 100 g del peso total de la composicion o sistema de micelas inversas de acuerdo con la invencion. Las cantidades especificadas en la presente memoria se adaptaran respecto a los otros compuestos de modo que correspondan mas espedficamente a las relaciones en peso identificadas mas adelante.
Esteroles
Los esteroles utiles para la preparacion del sistema de micelas inversas de acuerdo con la invencion son preferiblemente esteroles naturales, tal como colesterol, o fitosteroles (esteroles vegetales). El sitosterol y el colesterol son los esteroles preferidos utiles para el sistema de micelas inversas de acuerdo con la invencion.
El sitosterol y el colesterol estan disponibles comercialmente. Mas particularmente, se puede utilizar el sitosterol comercial que se extrae de la soja. En dicho producto, el sitosterol representa generalmente de 50 a 80% en peso del producto y se encuentra generalmente en una mezcla con campesterol y sitostanol en las proporciones respectivas del orden de 15% cada uno. Tambien se puede utilizar el sitosterol comercial que se extrae de una variedad de aceite de pino denominado taloil. En general, sera posible usar sitosterol en mezcla con sitostanol. Preferiblemente, dicha mezcla comprende al menos 50% de sitosterol en peso de la mezcla.
Como se ha mencionado anteriormente, las relaciones de los constituyentes lipfdicos (esteroles, acilglicerol y fosfolfpidos o esfingolfpidos) en el sistema de micelas inversas de acuerdo con la invencion puede variar. Preferiblemente, la relacion en peso esterol/acilglicerol puede variar de 0,015 a 0,05, mas particularmente de 0,03 a 0,04. El peso de esterol corresponde en la presente invencion al peso total de los esteroles utilizados en la formulacion, por ejemplo, el peso de fitosterol.
Los esteroles se incorporan o estan comprendidos preferiblemente en la composicion o en el sistema de micelas inversas en una cantidad en peso que vana de 0,825 g a 4,5 g respecto a 100 g del peso total de la composicion o sistema de micelas inversas de acuerdo con la invencion. Las cantidades especificadas en la presente memoria se adaptaran respecto a los otros compuestos de forma que se correspondan mas espedficamente a las relaciones en peso identificadas anteriormente y/o mas adelante.
Fosfolipidos y esfingolipidos
Los fosfolfpidos estan formados por un glicerol unido a 2 acidos grasos y a un grupo fosfato. La variabilidad de fosfolfpidos depende de los acidos grasos que estan unidos al glicerol y de los grupos qmmicos que son susceptibles de unirse con el grupo fosfato. Los fosfolfpidos son, con los esfingolipidos, los principales constituyentes lipfdicos de las membranas biologicas.
Entre los fosfolfpidos utiles en la presente invencion se pueden citar fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, difosfatidilglicerol, fosfatidilinositol y fosfatidilcolina.
En una realizacion particular, el fosfolfpido es fosfatidilcolina. La fosfatidilcolina es tambien conocida como 1,2-diacil- glicero-3-fosfocolina o PtdCho.
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La fosfatidilcolina se forma a partir de una colina, un grupo fosfato, un glicerol y dos acidos grasos. Realmente, es un grupo de moleculas, en el que las composiciones de acidos grasos vanan de una molecula a otra. La fosfatidilcolina se puede obtener a partir de lecitina comercial que contiene fosfatidilcolina en concentraciones en peso de 20 a 98%. La lecitina usada preferiblemente para la preparacion de las micelas inversas de acuerdo con la invencion es Epikuron 200® y contiene fosfatidilcolina a una concentracion mayor del 90%.
Los esfingolfpidos son una clase de lfpidos derivados del aminoalcohol alifatico esfingosina. Entre los esfingolfpidos que se pueden utilizar en la presente invencion se pueden citar acilesfingosina, esfingomielinas, glicoesfingolfpidos y gangliosidos.
El sistema de micelas inversas de la invencion puede comprender fosfolfpidos, esfingolfpidos, o una mezcla de ambos tipos de compuestos, preferiblemente fosfolfpidos.
De acuerdo con una realizacion espedfica, el sistema de micelas inversas de la invencion comprende fosfolfpidos.
La relacion en peso fosfolfpido y/o esfingolfpido/acilglicerol en las composiciones o sistemas de micelas inversas de acuerdo con la invencion es de 0,05 a 0,40, preferiblemente de 0,06 a 0,25.
Los fosfolfpidos o esfingolfpidos se incorporan o estan comprendidos preferiblemente en la composicion o en el sistema de micelas inversas en una cantidad en peso que vana de 1 g a 30 g, preferiblemente de 5 g a 20 g, respecto a 100 g del peso total de la composicion o sistema de micelas inversas de acuerdo con la invencion. Las cantidades especificadas en la presente memoria se adaptaran respecto a los otros compuestos de modo que se correspondan mas espedficamente a las relaciones en peso antes identificadas.
Alcoholes
Los alcoholes utiles para la preparacion del sistema de micelas inversas de acuerdo con la invencion son preferiblemente monoalcoholes lineales o ramificados de C2 a C6. Ejemplos de alcoholes son etanol, 1-butanol, 2- butanol, 3-metil-1-butanol, 2-metil-1-propanol, 1-pentanol, 1-propanol, 2-propanol y cualquiera de sus mezclas. En una realizacion particular de la invencion, el alcohol es etanol.
El alcohol se incorpora o esta comprendido preferiblemente en la composicion o en el sistema de micelas inversas en una cantidad en peso que vana de 5 g a 12 g respecto a 100 g del peso total de la composicion o sistema de micelas inversas de acuerdo con la invencion.
Agua
El agua util para la preparacion del sistema de micelas inversas de acuerdo con la invencion es preferiblemente agua purificada, mas preferiblemente agua exenta de RNAsa o DNAsa.
El agua se incorpora o esta comprendida preferiblemente en la composicion o en el sistema de micelas inversas en una cantidad en peso que vana de 1 g a 15 g, preferiblemente de 5 g a 15 g, respecto a 100 mL del volumen total de la composicion o sistema de micelas inversas de acuerdo con la invencion.
Un experto en la tecnica adaptara la cantidad de fosfolfpido o esfingolfpido en los sistemas a la cantidad deseada de agua. Por ejemplo, el aumento de cantidad de agua debe implicar el aumento de cantidad de fosfolfpido o esfingolfpido en los sistemas.
Acidos nucleicos
En la presente invencion, el termino "acido nucleico" se refiere a cualquier acido nucleico capaz de interaccionar con mRNA, pre-mRNA o una protema y capaz de modular la expresion genica. Los acidos nucleicos preferidos son capaces de sobre-regular o sub-regular la expresion de la(s) protema(s) diana.
El termino "acido nucleico" incluye cualquier DNA (acido desoxirribonucleico) y RNA (acido ribonucleico). Los terminos incluyen RNA monocatenario, DNA monocatenario, RNA bicatenario, DNA bicatenario, DNA plasmfdico, RNA aislado, tal como RNA parcialmente purificado, RNA esencialmente puro, RNA sintetico, RNA producido de forma recombinante, aptameros, asf como acidos nucleicos que comprenden nucleotidos no estandares, tales como nucleotidos de origen no natural o nucleotidos o desoxinucleotidos sintetizados qmmicamente. Se pueden citar por ejemplo gapmeros.
Por "oligonucleotido" se entiende un acido nucleico que comprende de 5 a 100 nucleotidos, preferiblemente de 10 a 90 nucleotidos, mas preferiblemente de 13 a 80 nucleotidos, mas particularmente de 13 a 25 nucleotidos.
Los terminos "oligonucleotidos antisentido", "acido nucleico interferente pequeno" (siNA), "RNA interferente pequeno" (siRNA), "molecula de acido nucleico interferente pequena", "molecula de oligonucleotido interferente pequena", "miRNA", "micro RNA", "activacion de RNA" (RNAa), "RNA pequeno en horquilla" (shRNA) y "aptameros", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier molecula de acido nucleico capaz de modular la expresion genica por sobre-regulacion o sub-regulacion (por ejemplo, silenciamiento de genes) de la expresion de la
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protema diana de una manera espedfica de la secuencia. Las diversas estrategias de acido nucleico para modular la expresion genica se describen a continuacion.
1. Estrategia de la interferencia por RNA
La interferencia por RNA (RNAi) describe un procedimiento en el que el RNA bicatenario (dsRNA), cuando esta presente dentro de una celula, inhibe la expresion de un gen endogeno que tenga una secuencia identica o casi identica a la del dsRNA (RNA bicatenario). La inhibicion es producida por la degradacion espedfica del RNA mensajero (mRNA) transcrito a partir del gen diana. Con mayor detalle, la interferencia por RNA describe un procedimiento de silenciamiento genico post-transcripcional espedfico de una secuencia en animales mediado por la expresion de los "RNA interferentes pequenos" (siRNA) despues de una escision in situ (Brummelkamp T.R., et al.,
2002) . El proceso basico inicial implica el/los dsRNA que es/son procesados por escision en unidades mas pequenas (las llamada siRNA) que grnan el reconocimiento y la escision dirigida del RNA mensajero homologo diana (mRNA).
Por consiguiente, el metodo no requiere manipulaciones geneticas que consumen tiempo, como las necesarias para las estrategias clasicas de inactivacion de genes, y por lo tanto han surgido como una herramienta valiosa en la genetica molecular, que tambien se puede aplicar a la terapia humana.
El mecanismo conocido actualmente de RNAi se puede describir como sigue:
El procesamiento de dsRNA para convertirlo en siRNA, que a su vez induce la degradacion del mRNA diana deseado, es un proceso de degradacion de RNA en dos etapas. La primera etapa implica una actividad de endonucleasa de dsRNA (similar a ribonucleasa III; similar a RNasa III) que procesa el dsRNA en RNA mas pequenos sentido y antisentido, que mas frecuentemente tienen una longitud en el intervalo de 19 a 25 nucleotidos (nt), dando lugar a los llamados RNA interferentes pequenos (siRNA). Esta protema del tipo RNasa III se denomina "Dicer". En una segunda etapa, los siRNA antisentido producidos se combinan, y sirven como grnas, con un complejo de ribonucleasa diferente denominado complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC), que permite la reasociacion del siRNA y el mRNA monocatenario homologo diana, y la escision de los mRNA monocatenarios homologos diana. Se ha observado que la escision del mRNA diana tiene lugar en el centro de la region duplex complementaria con la cadena antisentido del duplex de siRNA y el mRNA diana deseado (Dykxhoorn D. M. et al.,
2003) .
Una alternativa al siRNA es un plasmido que codifica el siRNA en horquilla, que se denomina estrategia de shRNA (RNA pequeno en horquilla). En la celula, se genera RNA en horquilla e interacciona con la protema Dicer, dando como resultado un siRNA funcional que sera incorporado en el complejo RISC y actuara como un siRNA clasico (Wacheck V. and Zangemeister-Wittke U., 2006). La transfeccion con dichos plasmidos permite numerosas copias de shRNA y de moleculas de siRNA endogenas (McCaffrey A. P., et al., 2002).
Los micro RNA (miRNA) son RNA no codificadores de 21 a 25 nucleotidos, que controlan la expresion genica a nivel pos-transcripcional. Los miRNA se sintetizan a partir de RNA polimerasa II o RNA polimerasa III en un pre-miRNA de 125 nucleotidos. Los pre-miRNA son escindidos en el nucleo por la enzima Drosha, dando lugar a un precursor denominado RNA en horquilla duplex imperfecto (o RNA en horquilla a base de miRNA). Estos RNA en horquilla duplex imperfectos son exportados desde el nucleo al citoplasma por la protema exportina-5, donde son escindidos por la enzima Dicer, dando lugar a miRNA maduros. Los miRNA se combinan con el complejo RISC que permite la reasociacion total o parcial con el mRNA monocatenario homologo diana. La reasociacion parcial con el mRNA conduce a la represion de la traduccion de protemas, mientras que la reasociacion total conduce a la escision del mRNA monocatenario (Dykxhoorn D. M., et al., 2003 para revision).
Por "cadena antisentido" se entiende una secuencia de nucleotidos de una molecula de siRNA que tiene complementariedad con una region sentido de la molecula de siRNA. Ademas, la cadena antisentido de una molecula de siRNA comprende una secuencia de acidos nucleicos que tiene homologfa con una secuencia de acidos nucleicos diana.
Por "cadena sentido" se entiende una secuencia de nucleotidos de una molecula de siRNA que tiene complementariedad con una region antisentido de la molecula de siRNA.
Por "modular" y "modulacion" se entiende que la expresion genica, o el nivel de molecula de RNA o moleculas de RNA equivalentes que codifican una o mas protemas o subunidades de protemas, o la actividad de una o mas protemas o subunidades de protemas es sobre-regulada o sub-regulada, de tal forma que la expresion, nivel o actividad sea mayor o menor que la observada en ausencia del modulador. Dentro del alcance de la invencion, la forma preferida de modulacion es la inhibicion, pero el uso de la palabra "modular" no se limita a esta definicion.
Por "inhibir", "silenciar" o "sub-regular" se entiende que los niveles del producto de expresion o el nivel de los RNA o RNA equivalentes que codifican uno o mas productos genicos se reducen por debajo de los observados en ausencia de la molecula de acido nucleico de la invencion. En una realizacion, la inhibicion con una molecula de acido nucleico capaz de mediar la interferencia por RNA (siRNA, shRNA, miRNA) esta preferiblemente por debajo del nivel observado en presencia de una molecula inactiva o atenuada que no es capaz de mediar una respuesta de RNAi.
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Por "protema diana" se entiende cualquier protema cuya expresion o actividad se ha de modular.
Por "acido nucleico diana" o "gen diana" se entiende cualquier secuencia de acidos nucleicos cuya expresion o actividad se ha de modular. El acido nucleico diana puede ser, por ejemplo DNA o RNA.
El acido nucleico capaz de modular la expresion genica incluye, aunque sin limitacion, "acido nucleico interferente pequeno" (siNA), "rNa interferente pequeno" (siRNA), "molecula de acido nucleico interferente pequena", "molecula de oligonucleotido interferente pequena", "miRNA", "micro RNA" y "RNA pequeno en horquilla" (shRNA), como se ha definido antes.
2. Estrategia antisentido.
a. Estrategia antisentido clasica.
La estrategia antisentido es una estrategia especial y racional basada en la modificacion qmmica con oligonucleotidos y cuya finalidad es la de inhibir espedficamente la expresion genica, con oligonucleotidos antisentido (ASON) complementarios de la secuencia de RNA diana, dando como resultado una inhibicion de la expresion protemica. Los ASON son considerados desde 1978 como una nueva clase de farmacos capaces de silenciar espedficamente los genes implicados en enfermedades (Gallo M., et al., 2003, Chan J. H., et al., 2006).
El ASON es un desoxirribonucleotido (DNA) o ribonucleotido (RNA) monocatenario, de 13 a 25, preferiblemente de 15 a 21 bases. La hibridacion del ASON en el mRNA diana conduce a la parada de la traduccion por bloqueo esterico, a su destruccion por captacion de la RNasa H intracelular, cuyo papel es escindir el duplex DNA/RNA o desestabilizar el pre-mRNA, dando como resultado una inhibicion del corte y empalme (Kurreck J., 2003; Chan J.H,. et al., 2006).
b. Nuevas aplicaciones de los oligonucleotidos antisentido.
En varias aplicaciones recientes, no se utiliza ASON para inhibir una expresion genica, sino por el contrario para restaurar una smtesis normal de protemas. En los modelos alternativos de correccion del corte y empalme y de salto de exon, el corte y empalme alternativo es anomalo. En general, una mutacion atfpica situada en un locus del intron (correccion de corte y empalme) o del exon (salto del exon), es el origen de un corte y empalme anomalo, dando como resultado una protema no funcional responsable de los smtomas de la enfermedad (Kang S.H., et al., 1998; Sazani P. and Kole R., 2003).
El ASON es capaz de hibridarse espedficamente en el locus de mutacion, de una manera dependiente de la secuencia, enmascarar la mutacion y reorientar la maquinaria hacia un corte y empalme normal alternativo con la expresion de la protema funcional.
Estas aplicaciones tienen un enorme interes en el tratamiento de varios tipos de cancer, enfermedades neurologicas, tales como la enfermedad de Huntington, la enfermedad macular relacionada con la edad y las enfermedades geneticas, tales como p-talasemia, distrofia muscular de Duchenne (DMD), smdrome de progeria de Hutchinson Gilford (HGPS) o fibrosis qmstica (CF) para la mutacion del CFTR (Mercatante D.R., et al., 2001; Srebrow A and Kornblihtt A.R. 2006; Brinkman B.M., 2004, and Venables J.P., 2006).
c. Modificaciones qmmicas y nuevas generaciones de oligonucleotidos antisentido.
Se han realizado esfuerzos para modificar la estructura qmmica del ASON, de modo que la RNasa H no pudiera degradar los duplex de acidos nucleicos durante la hibridacion del ASON en la cadena de RNA: modificaciones estructurales a nivel de la ribosa (2'-fluoro, 2'-metilo, 2'-metoxi), a nivel de las bases y a nivel de la cadena principal (fosfodiester, fosforotioato).
Se prefieren los ASON con estructura de la modificacion qmmica de la segunda (2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo o MOE) y la tercera (acido nucleico bloqueado o LNA, acido peptidonucleico o PNA, fosforodiamidato morfolino o PMO) generacion, sin activador de la enzima RNasa H (Altmann K.H., et al., 1996, Egholm M., et al., 1993; Singh S.K., et al., 1998, Summerton J. and Weller D., 1997).
Los gapmeros son oligomeros antisentido quimericos (mezcla de nucleotidos de RNA y DNA) con un tramo pequeno de DNA de fosforotioato (5-12 nucleotidos). Se han utilizado para obtener la escision mediada por RNasa H de RNA diana y la degradacion del mRNA. Ademas de la alta potencia de los ASON, mejoran la accesibilidad a las dianas y la resistencia a las nucleasas (Kurreck J., 2003).
Por "oligonucleotido antisentido" se entiende un oligonucleotido monocatenario capaz de hibridacion espedfica con el mRNA (en el citoplasma de la celula) o el pre-mRNA (en el nucleo de la celula).
El acido nucleico capaz de mediar el mecanismo antisentido incluye, aunque sin limitacion, oligonucleotidos de DNA monocatenario, oligonucleotidos de RNA monocatenario, oligonucleotidos no modificados y modificados qmmicamente.
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3. Aptameros.
Los aptameros son acidos nucleicos de 20 a 80 nucleotidos, compuestos de DNA, RNA o nucleotidos modificados qmmicamente (2'-fluoro, 2'-O-metilo o fosforotioato) (Chan J. H., et al., 2006). Gracias a su estructura en 3D, los aptameros son capaces de unirse a diversas moleculas y protemas con una alta afinidad, por enlaces de Van der Walls, de hidrogeno y electrostaticos (Pendergrast P. S., et al., 2005).
La aplicacion mas interesante de los aptameros parece ser la regulacion de la expresion genica por inhibicion de la actividad prc^nica.
Los aptameros de alta afinidad se pueden obtener por tecnologfa de evolucion sistematica de ligandos por enriquecimiento exponencial (abreviadamente SELEX, por sus siglas en ingles Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), desarrollada en 1990. Un grupo de oligonucleotidos (1013 a 1015 secuencias diferentes) se mezcla con la diana y solo se seleccionan los unidos a la diana. Estos aptameros se amplifican a continuacion y se utilizan en el siguiente ciclo. Despues de 5 a 15 etapas de amplificacion, se obtienen aptameros de alta afinidad (Rimmelle M., 2003; Chauveau F., et al., 2006). Esta tecnica esta ahora automatizada.
Debido a su falta de inmunogenicidad, parece que los aptameros son buenos candidatos para aplicaciones terapeuticas en enfermedades autoinmunitarias (White R.R., et al., 2000; Kim Y.M., et al., 2003; Drolet D.W., et al., 2000 and Rhodes A., et al., 2000).
Dichos agentes incorporados en el sistema de micelas inversas de acuerdo con la invencion pueden atravesar las barreras epiteliales de las mucosas y realizar de este modo su efecto terapeutico en los sitios diana.
Los acidos nucleicos capaces de modular la expresion genica estan presentes en el nucleo acuoso de las micelas inversas.
La estabilidad y actividad del agente terapeutico se pueden controlar esencialmente por la concentracion de agua en la mezcla.
La cantidad de acido nucleico capaz de modular la expresion genica incorporada en el sistema de micelas inversas se determina por su solubilidad en la fase hidrofila (nucleo acuoso). Preferiblemente, la cantidad de agente terapeutico incluido en el sistema de micelas inversas depende del tamano del acido nucleico capaz de modular la expresion genica.
En la presente invencion, la concentracion en peso del acido nucleico en la microemulsion se calcula mas espedficamente con una densidad 0,94 ± 0,03 para la microemulsion.
La densidad se mide generalmente a temperatura ambiente y presion atmosferica.
Sistema de micelas inversas y su uso
Las micelas inversas de la invencion permiten que el acido nucleico incluido en ellas sea administrado y transportado a las celulas con un alto grado de proteccion, en particular, sin afectar su estabilidad.
Actualmente se sabe que un sistema de micelas inversas se puede utilizar para la preparacion de los nanomateriales, que actuan como micro-reactores. La actividad y la estabilidad de las biomoleculas se pueden controlar, principalmente por la concentracion de agua en el sistema de micelas inversas.
Un objeto de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende micelas inversas como se han definido anteriormente y al menos un vehfculo, excipiente o soporte farmaceuticamente aceptable.
De acuerdo con una realizacion espedfica, la composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion comprende de 5 a 20 g de fosfolfpido o esfingolfpido respecto a 100 g de la composicion, y de 5 a 15 g de agua respecto a 100 mL de la composicion.
De acuerdo con una realizacion particular, la composicion farmaceutica esta en forma de una capsula, un comprimido oblongo, un aerosol, una pulverizacion, una solucion o una capsula de gelatina elastica blanda. Un objeto adicional de la invencion se refiere al uso de micelas inversas como se han definido anteriormente para la preparacion de una composicion farmaceutica destinada al suministro, mas espedficamente al suministro a traves de las mucosas, de uno o mas acidos nucleicos. La composicion farmaceutica esta destinada mas particularmente a prevenir, tratar y/o mejorar los smtomas de enfermedades geneticas, canceres, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades infecciosas y/o inflamatorias, enfermedades o trastornos debidos a la proliferacion celular.
Otro objeto de la invencion se refiere a un metodo para el suministro de uno o mas acidos nucleicos a un mairnfero (en particular un ser humano), comprendiendo dicho metodo administrar al marnffero la composicion de micelas inversas que se han definido anteriormente. En una realizacion espedfica, la presente invencion proporciona un metodo para el suministro a traves de las mucosas de uno o mas acidos nucleicos, comprendiendo dicho metodo
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administrar a traves de las mucosas a dicho mairnfero (en particular un ser humano) una composicion de micelas inversas que se han definido anteriormente.
La presente invencion proporciona un metodo para la prevencion, tratamiento y/o mejora de los smtomas de una enfermedad genetica, cancer, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad infecciosa e inflamatoria o una enfermedad debida a la proliferacion celular, comprendiendo dicho metodo administrar a dicho a dicho ser humano que lo necesite una cantidad eficaz de una composicion de micelas inversas como se han definido anteriormente y que comprende uno o mas acidos nucleicos utiles en la prevencion, tratamiento o mejora de los smtomas de la enfermedad genetica, cancer, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad infecciosa e inflamatoria o enfermedad debida a la proliferacion celular. En una realizacion espedfica, la presente invencion proporciona un metodo para la prevencion, tratamiento o mejora de uno o mas smtomas asociados a una enfermedad o trastorno que se ha definido anteriormente, comprendiendo dicho metodo administrar a traves de las mucosas a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composicion de micelas inversas que se ha definido anteriormente y que comprende uno o mas acidos nucleicos utiles en la prevencion, tratamiento o mejora de uno o mas smtomas asociados con dicha enfermedad o trastorno.
Como excipiente, vehmulo o portador farmaceuticamente aceptable se puede utilizar cualquier excipiente, vehmulo o portador muy conocido por los expertos en la tecnica. Tambien se pueden utilizar otros aditivos muy conocidos por los expertos en la tecnica, tales como estabilizadores, agentes colorantes, aglutinantes o tampones de pH. Los excipientes preferidos de acuerdo con la invencion promueven la adherencia del producto acabado a las mucosas.
La presente invencion se refiere al uso de una composicion farmaceutica que se ha descrito anteriormente para el suministro de al menos un acido nucleico a un mamffero, comprendiendo dicho suministro la administracion a traves de las mucosas de la composicion farmaceutica.
En una realizacion espedfica, la composicion farmaceutica de la invencion se usa para el suministro, mas espedficamente el suministro a traves de las mucosas, de al menos un acido nucleico.
Los acidos nucleicos en el sistema de micelas inversas formulado de acuerdo con la invencion son preferiblemente capaces de atravesar la barrera hematoencefalica. En consecuencia, pueden ser utiles en el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central (SNC), en particular de enfermedades geneticas, tumorales, virales y/o degenerativas del SNC.
Las composiciones de la invencion se pueden administrar de diferentes modos, en particular por absorcion de tejido mucoso, con una absorcion bucal, nasal, vaginal o digestiva.
El termino "sujeto" se refiere a un organismo al que se puede administrar el acido nucleico de la invencion. El sujeto puede ser un animal no humano, preferiblemente un mamffero. El sujeto preferido es un sujeto humano.
Como se utiliza en la presente memoria, los terminos "mucosa" y "de la mucosa" se refieren a un tejido mucoso tal como un tejido respiratorio, digestivo o genital. "Suministro a traves de las mucosas", "administracion a traves de las mucosas" y terminos analogos como se usan en la presente memoria se refieren a la administracion de una composicion a traves de un tejido mucoso. "Suministro a traves de las mucosas", "administracion a traves de las mucosas" y terminos analogos incluyen, aunque sin limitacion, el suministro de una composicion a traves del tejido mucoso bronquial, gingival, lingual, nasal, oral, vaginal, rectal y gastrointestinal.
En una realizacion preferida de la invencion, la composicion de micelas inversas de la invencion se administra a traves de la mucosa en forma de una capsula, un comprimido oblongo, un aerosol, una pulverizacion, una solucion o una capsula de gelatina elastica blanda. Las composiciones de la invencion se pueden introducir, por ejemplo, en forma lfquida en capsulas que liberen su contenido en la boca o en cualquier tejido mucoso. Preferiblemente, las composiciones de micelas inversas de la invencion se administran a un mamffero, mas preferiblemente a un ser humano, para tratar una enfermedad o trastorno, tal como una enfermedad genetica, cancer, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad infecciosa e inflamatoria o una enfermedad debida a la proliferacion celular.
Los siguientes ejemplos estan destinados a ilustrar la realizacion de la presente invencion, pero no a limitar su alcance.
Descripcion de las figuras
Figura 1: Evaluacion del impacto de la proporcion de agua incorporada en ausencia de lecitina sobre las
curvas de difraccion (fig. 1a) y tamano (fig. 1b) de micelas inversas.
Figura 2: Evaluacion del impacto de la proporcion de agua incorporada en presencia de lecitina sobre las
curvas de difraccion (fig. 2a) y tamano (fig. 2b) de micelas inversas.
Figura 3: Evaluacion del impacto del contenido del siRNA de GAPDH incorporado sobre las curvas de
difraccion de micelas inversas.
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Figura 4: Biodistribucion in vivo de siRNA de Alexa 700-CIB1 desnudo (fig. 4a) y siRNA de Alexa 700-CIB1
formulado en micelas inversas (fig. 4b).
Figura 5: Evaluacion in vivo de la inhibicion del gen GAPDH del dgado.
Figura 6: Evaluacion in vivo de la inhibicion del gen MAFbx del musculo.
Figura 7: Evaluacion in vivo de la inhibicion de la protema PCSK9 del dgado.
Figura 8: Evaluacion in vivo de la inhibicion de la protema PrP(C) del cerebro.
Ejemplos
Los ejemplos 1 y 2 no forman parte de la invencion reivindicada, puesto que las micelas inversas ilustradas no comprenden ningun acido nucleico. Los ejemplos 1 y 2 son utiles para una mejor comprension de la invencion. La muestra 13 del ejemplo 3, la muestra F del ejemplo 5, la muestra I del ejemplo 6 y la muestra 15 del ejemplo 7 no forman parte de la invencion reivindicada, son utiles para una mejor comprension de la invencion reivindicada.
Ejemplo 1: Evaluacion del impacto de la incorporacion de agua sobre la formacion y el tamano de las micelas inversas en ausencia de lecitina
El objeto de este estudio fue evaluar por el metodo de difraccion de rayos X y determinacion visual el impacto del contenido de agua sobre la formacion de microemulsiones termodinamicamente estables y el tamano de las micelas inversas dispersadas en ellas.
Se prepararon 10 formulaciones de micelas inversas con diferentes porcentajes de agua de acuerdo con el procedimiento siguiente.
Se disolvieron 0,7 g de fitosterol en 1,4 g de etanol absoluto con agitacion magnetica a 300 r/min durante 15 minutos a 37°C. Se anadio monooleato de glicerol y se realizo una agitacion magnetica a 500 r/min durante 45 minutos a 37°C. A esta mezcla oleosa se anadio agua purificada y se agito entre 300 y 500 r/min durante 60 minutos a 37°C para formar micelas inversas "vadas".
Las diferentes formulaciones se resumen en la siguiente tabla:
Muestra
Contenido de agua (%) Monooleato de glicerol Agua
1
1
25,8 g 0,3 g
2
2
25,5 g 0,6 g
3
3
25,2 g 0,9 g
4
4
24,9 g 1,2 g
5
5
24,6 g 1,5 g
6
6
24,3 g 1,8 g
7
7
24,0 g 2,1 g
8
8
23,7 g 2,4 g
9
9
23,4 g 2,7 g
10
10
23,1 g 3,0 g
Se prepararon micelas inversas "vadas" aumentando la cantidad de agua de 1% a 10%, con incrementos del 1% (el porcentaje de agua se expresa en peso de agua/volumen total de la composicion, densidad 0,94). Para todos estos productos se mantuvieron sin cambios los porcentajes de etanol absoluto (5%) y de fitosterol (2,5%) (peso/peso total de la composicion).
La formacion de microemulsiones termodinamicamente estables se evaluo por la determinacion visual de su limpidez.
Los parametros del retmulo se obtienen por difraccion de rayos X y se supone que corresponden al tamano de las micelas inversas de la invencion. Las muestras se introdujeron en capilares de vidrio de 1,5 mm de diametro y se utilizo una configuracion de transmision. Se empleo una fuente de rayos X con anodo giratorio de cobre (que funcionaba a 4 kW) con un monocromador "Osmic" de enfoque de multiples capas que proporcionaba un flujo alto (108 fotones/segundo) y colimacion puntual. Se utilizo un detector 2D de "placas de imagen". Se obtuvieron curvas de difraccion que daban la intensidad difractada en funcion del vector de onda q. La intensidad difractada fue
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10
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corregida por los valores del tiempo de exposicion, de la transmision y de la intensidad procedentes de la difusion por un capilar vado. Los tamanos de las micelas inversas se calcularon con la formula: d = 2 n/qmax (q max es el vector de onda correspondiente a la intensidad difractada maxima).
En la figura 1a se muestran las curvas de difraccion de 10 muestras preparadas de acuerdo con el procedimiento anterior, demostrando claramente que entre 1% y 6% de agua incorporada, el valor de qmax disminuye cuando aumenta el porcentaje de agua. La figura 1b muestra que entre el 1% y el 6% de agua incorporada el tamano de las micelas inversas aumenta de 3,1 a 3,7 nm cuando aumenta el porcentaje de agua. Por el contrario, a partir del 7% de agua incorporada deja de aumentar el tamano de las micelas inversas.
Ademas, el analisis visual muestra que de 1 a 5% de agua incorporada, los productos son lfmpidos. Desde el 6% de agua, los productos se vuelven cada vez mas turbios.
Estos resultados muestran claramente que las formulaciones formadas en ausencia de lecitina son inestables por encima de una cierta cantidad de agua (6%). Muestran ademas que las micelas formuladas sin lecitina no pueden exceder de un tamano dado, incluso cuando se aumenta la cantidad de agua en la formulacion.
Ejemplo 2: Evaluacion del impacto de la incorporacion de agua sobre la formacion y el tamano de las micelas inversas en presencia de lecitina
El objeto de este estudio fue evaluar por el metodo de difraccion de rayos X y determinacion visual el impacto del contenido de agua sobre la formacion de microemulsiones termodinamicamente estables y el tamano de micelas inversas dispersadas en ellas en presencia de una cantidad creciente de lecitina.
Se prepararon 3 formulaciones de micelas inversas con diferentes porcentajes de agua y lecitina de acuerdo con el procedimiento siguiente.
Se disolvio lecitina comercialmente disponible en 8,5 g de etanol absoluto con agitacion magnetica a 300 r/min durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se anadieron a la mezcla 2,3 g de fitosterol y se agito en las mismas condiciones. Se anadio monooleato de glicerol y se realizo una agitacion magnetica a 500 r/min durante 45 minutos a 37°C para formar una mezcla oleosa. Se anadio agua purificada a la mezcla oleosa y se agito a temperatura ambiente con agitacion magnetica entre 300 y 500 r/min durante 30 minutos para formar micelas inversas "vadas".
Las diferentes formulaciones se resumen en la tabla siguiente:
Muestra
Lecitina Monooleato de glicerol Agua Mezcla oleosa
11
0 g (0%) 79,3 g 20,4 mg (4%) 453,9 mg
12
9,4 g (10%) 64,8 g 45,0 mg (9%) 433,8 mg
13
14,1 g (15%) 57,0 g 60,0 mg (12%) 423,3 mg
Se prepararon micelas inversas "vadas" variando la cantidad de agua desde 4% (muestra 11) hasta 12% (muestra 13) y de lecitina desde 0% (muestra 11) hasta 15% (muestra 13). El contenido de lecitina se calcula a partir del peso de lecitina/peso total de la composicion y el contenido de agua a partir del peso de agua/volumen total de la composicion (densidad 0,94). Para todas estas muestras el porcentaje de fitosterol era 2,5% (peso de fitosterol/peso total de la composicion) y el del etanol absoluto era 9% (peso de etanol absoluto/peso total de la composicion).
La formacion de microemulsiones termodinamicamente estables se evaluo por determinacion visual de su limpidez.
El tamano de las micelas inversas de estas formulaciones se evaluo por experimentos de difraccion de rayos X como se describe en el ejemplo 1.
En la figura 2a se muestran las curvas de difraccion de las muestras 11, 12 y 13, que demuestran claramente que aumenta la intensidad difractada y disminuye el valor de qmax cuando aumenta el porcentaje de lecitina de 0 a 15%. La figura 2b muestra que el tamano de las micelas inversas aumenta desde 3,1 hasta 4,5 nm cuando aumenta el porcentaje de lecitina de 0 a 15%. El analisis visual muestra que estas formulaciones son lfmpidas.
En consecuencia, estos experimentos muestran que la adicion de 15% de lecitina permite la formacion de microemulsiones termodinamicamente estables con un tamano de micelas inversas de 4,5 nm y altos porcentajes de agua (12%). Por tanto la adicion de lecitina soluciona los inconvenientes de las micelas inversas formuladas en ausencia de lecitina descritos en el ejemplo 1.
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Ejemplo 3: Evaluacion del impacto de la incorporacion del siRNA de GAPDH sobre la formacion y tamano de las micelas inversas
El objeto de este estudio fue evaluar por el metodo de difraccion de rayos X y determinacion visual el impacto del contenido del siRNA de GAPDH sobre la formacion de microemulsiones termodinamicamente estables y el tamano de micelas inversas dispersadas en ellas en presencia de lecitina.
El siRNA de GAPDH es un siRNA bicatenario que comprende 21 nucleotidos y esta disenado para permitir el silenciamiento del gen GAPDH.
Se prepararon 4 formulaciones de micelas inversas con diferentes concentraciones del siRNA de GAPDH de acuerdo con el procedimiento siguiente.
Se anadio una solucion de siRNA que contema siRNA de GAPDH a la mezcla oleosa preparada de acuerdo con la muestra 13 y se agito a temperatura ambiente con agitacion magnetica entre 300 y 500 r/min durante 30 minutos para formar micelas inversas que conteman siRNA de GAPDH.
Las diferentes formulaciones se resumen en la tabla siguiente:
Muestra
Solucion de siRNA o agua siRNA de GAPDH Mezcla oleosa Concentracion de GADPH
A
59,6 mg 150 jg 411,3 mg 300 jg/mL
B
60,9 mg 228 jg 414,8 mg 450 jg/mL
C
61,1 mg 303 jg 414,5 mg 600 jg/mL
D
59,9 mg 479 jg 413,2 mg 950 jg/mL
13
60,0 mg 0 jg 423,3 mg 0 jg/mL
Se prepararon micelas inversas aumentando las concentraciones del siRNA de GAPDH desde 0 (muestra 13) hasta 950 |jg/mL (muestra D). Para todas estas muestras el porcentaje de fitosterol era 2,5% (peso de fitosterol/peso total de la composicion), el de etanol absoluto era 9% (peso de etanol absoluto/peso total de la composicion), el de agua era 12% (peso de agua/volumen total de la composicion, densidad 0,94) y el de lecitina era 15% (peso de lecitina/peso total de la composicion).
La formacion de microemulsiones termodinamicamente estables se evaluo por determinacion visual de su limpidez.
El tamano de las micelas inversas de estas formulaciones se evaluo por experimentos de difraccion de rayos X como se describe en el ejemplo 1.
La figura 3 muestra las curvas de difraccion de las muestras 13, A, B, C y D. El valor de qmax es el mismo para todas las muestras, a pesar de un aumento de la concentracion del siRNA de GAPDH. El tamano de las micelas inversas se calcula en 4,5 nm para todas estas muestras. El analisis visual muestra que estas formulaciones son lfmpidas.
Estos experimentos muestran que la adicion del siRNA de GAPDH no perturba la formacion de microemulsiones termodinamicamente estables ni cambia el tamano de las micelas inversas dispersadas en ellas.
Ejemplo 4: Evaluacion de la biodistribucion in vivo de siRNA de Alexa 700-ciclina B1 (ClB1) fluorescente formulado en micelas inversas
El objeto de este estudio fue evaluar portecnica de formacion de imagenes de animales la biodistribucion de siRNA de Alexa 700-ClB1 formulado en micelas inversas de acuerdo con el siguiente procedimiento (muestra E) cuando se suministra por via rectal en comparacion con la misma dosis de dicho siRNA no formulado en solucion suministrado por via intravenosa.
El siRNA de Alexa 700-ClB1 es un siRNA bicatenario que comprende 21 nucleotidos y esta disenado para ser fluorescente.
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50
Muestra E: se disolvieron 14,1 g de lecitina en 8,5 g de etanol absoluto con agitacion magnetica a 300 r/min durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se anadieron a la mezcla 2,3 g de fitosterol y se agito en las mismas condiciones. Se anadieron 57,0 g de monooleato de glicerol y se realizo una agitacion magnetica a 500 r/min durante 45 minutos a 37°C. Se anadieron 48 mg de una solucion de siRNA que contema 100 |jg de siRNA de Alexa 700- ClB1 a 328,7 mg de la mezcla oleosa y se agito a temperatura ambiente con agitacion magnetica a 700 r/min durante 45 minutos para formar micelas inversas que conteman 250 jg de siRNA de Alexa 700- ClB1/mL (densidad 0,94).
Productos administrados:
- Muestra E: micelas inversas preparadas de acuerdo con el procedimiento anterior con 250 jg de siRNA de Alexa 700-ClB1/mL, suministradas a 2 mL/kg por via rectal.
- siRNA de Alexa 700-ClB1 no formulado: siRNA desnudo en solucion con 50 jg de siRNA de Alexa 700-ClB1/mL, suministrado a 10 mL/kg por via intravenosa.
siRNA de Alexa 700-ClB1 desnudo no formulado o micelas inversas formuladas con dicho siRNA se administraron una vez a 500 jg/kg (10 jg) a ratones atfmicos anestesiados. La solucion de siRNA de Alexa 700-ClB1 desnudo se administro por via intravenosa en la vena de la cola y las micelas inversas formuladas con siRNA se administraron lentamente con una pipeta al recto inferior, inmediatamente despues del esfmter anal.
Los ratones se colocaron bajo la camara a 660 nm y se tomaron imagenes laterales ventrales a 0, 15 min, 1 h, 2 h, 4 h, 5 h y 24 h para visualizar la biodistribucion de la intensidad de fluorescencia.
Los resultados se muestran en las figuras 4a y 4b. La figura 4a muestra una rapida absorcion de siRNA desnudo despues de inyeccion intravenosa. La maxima intensidad de fluorescencia se observo 15 minutos despues de la administracion y disminuyo rapidamente.
Por el contrario, la figura 4b muestra que siRNA formulado en micelas inversas y administrado por via rectal, se distribuye ampliamente en todo el cuerpo del animal con un pico de fluorescencia alrededor de 4 horas y una eliminacion muy lenta.
El experimento anterior demuestra que siRNA formulado en micelas inversas se puede suministrar in vivo y que la formulacion en micelas inversas aumenta mucho la proteccion del siRNA y la vida util.
Ejemplo 5: Evaluacion de la eficacia in vivo del siRNA de GAPDH formulado en formulaciones de micelas inversas para inhibir la expresion del gen GAPDH
El objeto de este estudio fue evaluar la eficacia del silenciamiento del gen GAPDH en el Imgado del siRNA de GAPDH formulado en micelas inversas preparadas de acuerdo con los procedimientos indicados a continuacion (muestras F y G) cuando se suministran por via rectal a ratones C57B1/6J.
El siRNA de GAPDH es un siRNA bicatenario que comprende 21 nucleotidos y esta disenado para permitir el silenciamiento del gen GAPDH.
Muestra F: se disolvieron 2,3 g de colesterol en 8,5 g de etanol absoluto con agitacion magnetica a 300 r/min durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se anadieron 79,2 g de monooleato de glicerol y se realizo una agitacion magnetica a 500 r/min durante 45 minutos a 37°C para formar una mezcla oleosa. Se anadieron 40,0 mg de una solucion de siRNA que contema 301 jg de siRNA de GAPDH a 904,0 mg de la mezcla oleosa y se agito a temperatura ambiente con agitacion magnetica entre 300 y 500 r/min durante 30 minutos para formar micelas inversas que conteman 300 jg de siRNA de GAPDH/mL (densidad 0,94).
Muestra G: se disolvieron 6,6 g de lecitina en 8,5 g de etanol absoluto con agitacion magnetica a 300 r/min durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se anadieron a la mezcla 2,3 g de colesterol y se agito en las mismas condiciones. Se anadieron 67,7 g de monooleato de glicerol y se realizo una agitacion magnetica a 500 r/min durante 45 minutos a 37°C. Se anadieron 45,2 mg de una solucion de siRNA que contema 286 jg del siRNA de GAPDH a 852,7 mg de la mezcla oleosa y se agito a temperatura ambiente con agitacion magnetica entre 300 y 500 r/min durante 30 minutos para formar micelas inversas que conteman 300 jg del siRNA de GAPDH/mL (densidad 0,94).
Muestra 14: se anadieron 40,5 mg de agua purificada a 900,6 mg de la mezcla oleosa preparada de acuerdo con la muestra F y se agito a temperatura ambiente con agitacion magnetica entre 300 y 500 r/min durante 30 minutos para formar micelas inversas "vadas".
Productos administrados:
- Muestra F: micelas inversas preparadas de acuerdo con el procedimiento anterior con 300 jg del siRNA de GAPDH/mL, suministradas a 1 mL/kg por via rectal durante 3 dfas
- Muestra G: micelas inversas preparadas de acuerdo con el procedimiento anterior con 300 |jg del siRNA de GAPDH/mL, suministradas a 1 mL/kg por via rectal durante 3 dfas
- Muestra 14: micelas inversas "vadas" preparadas de acuerdo con el procedimiento anterior, suministradas a 1 mL/kg por via rectal durante 3 dfas
5 Como se describe en la tabla siguiente, ambas formulaciones de micelas inversas que contienen siRNA de GAPDH se suministraron a 600 jg/kg (300 jg/kg dos veces al dfa) durante 3 dfas a ratones C57B1/6J (grupos 2 y 3, de 3 ratones por grupo). Estos productos se suministraron lentamente con una pipeta en el recto inferior, inmediatamente despues del esfmter anal. Los ratones no tratados o tratados con micelas inversas "vadas" se utilizaron como controles (grupos 1 y 4) (muestra 14).
10 Los ratones se sacrificaron 24 horas despues de la ultima administracion. A continuacion se extrajeron los Imgados y se congelaron. El RNA total se extrajo por el metodo de TRIzol®/cloroformo y la expresion del mRNA de GAPDH se evaluo por RT-PCR cuantitativa, con relacion a un gen normalizador (ubiquitina).
Los resultados se muestran en la figura 5 que demuestra la eficacia in vivo del siRNA de GAPDH formulado en micelas inversas que contienen colesterol (muestra F) para reducir la expresion del gen GAPDH del Imgado. La
15 adicion de lecitina en la muestra G muestra una eficacia similar para reducir la expresion del gen GAPDH. Por el contrario, las micelas inversas "vadas" (muestra 14) son ineficaces en la disminucion de la expresion del gen GAPDH. Las micelas inversas de acuerdo con la invencion son por lo tanto tan eficaces como las que no contienen lecitina para el suministro de dichas cantidades de acidos nucleicos. Ademas, permiten el suministro de mayores cantidades de acidos nucleicos que las micelas inversas sin lecitina.
Grupos
Numero de animales Tratamiento Dosis suministrada (pg/kg/d) Volumen suministrado (mL/kg/d)
1
3 Sin tratamiento 0 -
2
3 Muestra F 600 2x 1
3
3
Muestra G 600 2x 1
4
3 Muestra 14 0 2x 1
20
Ejemplo 6: Evaluacion de la eficacia in vivo del siRNA de la ubiquitina ligasa atrogina 1/secuencia de la atrofia muscular F-box (abreviadamente MAFbx, por la expresion inglesa Muscle Atrophy F-box) formulado en micelas inversas para inhibir la expresion del gen MAFbx
El objeto de este estudio fue evaluar la eficacia del silenciamiento del gen MAFbx del siRNA si1 o si2 de MAFbx 25 formulado en micelas inversas de acuerdo con los siguientes procedimientos (muestras H e I) cuando se suministran por via rectal en comparacion con la misma dosificacion del siRNA si1 de MAFbx no formulado suministrado por via intravenosa, en un modelo de ratones inducidos de sobreexpresion de MAFbx.
Los siRNA si 1 y si2 de MAFbx son siRNA bicatenarios que comprenden, respectivamente, 19 y 21 nucleotidos y estan disenado para permitir el silenciamiento del gen MAFbx.
30 Muestra H: se disolvieron 14,1 g de lecitina en 8,5 g de etanol absoluto con agitacion magnetica a 300 r/min durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se anadieron a la mezcla 2,3 g de fitosterol y se agito en las mismas condiciones. Se anadieron 57,0 g de monooleato de glicerol y se realizo una agitacion magnetica a 500 r/min durante 45 minutos a 37°C. Se anadieron 117,3 mg de una solucion de siRNA que contema 303 jg del siRNA s1 de MAFbx a 833,8 mg de la mezcla oleosa y se agito a temperatura ambiente con agitacion magnetica entre 300 y 500 r/min 35 durante 30 minutos para formar micelas inversas que conteman 300 jg del siRNA si1 de MAFbx/mL (densidad 0,94).
Muestra I: se disolvieron 2,3 g de fitosterol en 8,5 g de etanol absoluto con agitacion magnetica a 300 r/min durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se anadieron 79,2 g de monooleato de glicerol y se realizo una agitacion magnetica a 500 r/min durante 45 minutos a 37°C para formar una mezcla oleosa. Se anadieron 39,5 mg de una solucion de siRNA que contema 302 jg del siRNA si2 de MAFbx a 905,4 mg de la mezcla oleosa y se agito a 40 temperatura ambiente con agitacion magnetica entre 300 y 500 r/min durante 30 minutos para formar micelas inversas que conteman 300 jg del siRNA si2 de MAFbx/mL (densidad 0,94).
Productos administrados:
5
10
15
20
25
30
- Muestra H: micelas inversas preparadas de acuerdo con el procedimiento anterior con 300 |jg de siRNA si1 de MAFbx/mL, suministradas a 1 mL/kg por via rectal los dfas 1 y 2
- Muestra I: micelas inversas preparadas de acuerdo con el procedimiento anterior con 300 jg de siRNA si2 de MAFbx/mL, suministradas a 1 mL/kg por via rectal los dfas 1 y 2
- siRNA si1 de MAFbx no formulado: siRNA desnudo en solucion a 300 jg/mL, suministrado a 1 mL/kg por via intravenosa el dfa 1 y a 150 jg/mL suministrado a 1 mL/kg el segundo dfa.
Se trataron ratones B6CBA F1 como se describe en la tabla siguiente. Se suministraron micelas inversas formuladas con siRNA si1 o 2 de MAFbx (muestras H e I) a 300 jg/kg por via rectal una vez al dfa durante 2 dfas. Estos productos se suministraron lentamente con una pipeta en el recto inferior, inmediatamente despues del esfmter anal. Despues de este tratamiento, se les privo de alimento durante 2 dfas para inducir la atrofia muscular esqueletica y la sobreexpresion de MAFbx (grupos 5 y 7, de 8 ratones por grupo). A los ratones se les administro el mismo tratamiento (muestras H e I) pero a los que no se les privo de alimento se utilizaron como controles (grupos 4 y 6, de 4 ratones por grupo). Otro grupo de 8 ratones (grupo 3) se trato con siRNA si1 de MAFbx desnudo no formulado por via intravenosa en la vena de la cola a 300 jg/kg el primer dfa y a 150 jg/kg el segundo dfa seguido de una privacion de alimento durante 2 dfas. Se utilizaron como controles (grupos 1 y 2, de 8 ratones por grupo) ratones no tratados privados o no de alimento.
Todos los ratones se sacrificaron el dfa 5 y los musculos Tibialis anterior (TA) se extrajeron y congelaron. El RNA total se extrajo por el metodo TRIzol®/cloroformo y se evaluo la expresion del mRNA de MAFbx con relacion al gen ribosomal normalizador (RPS9) por RT-PCR cuantitativa usando el sistema mini Opticon Real Time PCR (BioRad).
Los resultados de la PCR cuantitativa se muestran en la figura 6, que demuestra claramente la eficacia de las micelas inversas formuladas con siRNA de MAFbx para reducir la sobreexpresion del gen MAFbx. Se observa una reduccion de alrededor del 90% en los niveles del mRNA de MAFbx en los animales tratados con las muestras H e I en comparacion con los animales sin tratar. Por tanto las micelas inversas de acuerdo con la invencion son tan eficaces como las que no contienen lecitina para el suministro de dichas cantidades de acidos nucleicos. Adicionalmente permiten el suministro de mayores cantidades de acidos nucleicos que las micelas inversas sin lecitina.
Grupos
Numero de animales Tipo de animal Tratamiento Compuestos activos Dosis suministrada (pg/kg/d) Volumen suministrado (mL/kg/d)
1
8 Sin privacion de alimento Sin tratamiento - 0 -
2
8 Privacion de alimento Sin tratamiento - 0 -
3
8 Privacion de alimento siRNA desnudo siRNA si1 de MAFbx 300 y150 1
4
4
Sin privacion de alimento Muestra H siRNA si1 de MAFbx 300 1
5
8 Privacion de alimento Muestra H siRNA si1 de MAFbx 300 1
6
4 Sin privacion de alimento Muestra I siRNA si2 de MAFbx 300 1
7
8 Privacion de alimento Muestra I siRNA si2 de MAFbx 300 1
Ejemplo 7: Evaluacion de la eficacia in vivo del siRNA dirigido al siRNA de la proproteina convertasa- subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9) formulado en micelas inversas para inhibir la expresion de la protema PCSK9
5
10
15
20
25
30
35
40
El objeto de este estudio fue evaluar la eficacia del siRNA de PCSK9 formulado en micelas inversas de acuerdo con el procedimiento siguiente (muestra J) para disminuir la expresion de la protema PCSK9 cuando se suministra por v^a rectal en comparacion con la misma dosificacion del siRNA de PCSK9 no formulado suministrado por via intravenosa a ratones C57B1/6J.
El siRNA de PCSK-9 es un siRNA bicatenario que comprende 21 nucleotidos y esta disenado para permitir la inhibicion de la expresion de la protema PCSK9.
Muestra J: se disolvieron 14,3 g de lecitina en 8,6 g de etanol absoluto con agitacion magnetica a 300 r/min durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se anadieron a la mezcla 2,4 g de fitosterol y se agito en las mismas condiciones. Se anadieron 57,8 g de monooleato de glicerol y se realizo una agitacion magnetica a 500 r/min durante 60 minutos a 37°C. Se anadieron 694,8 mg de una solucion de siRNA que contema 5797 |jg de siRNA de PCSK9 a 4819,4 mg de la mezcla oleosa y se agito a temperatura ambiente con agitacion magnetica entre 300 y 500 r/min durante 30 minutos para formar micelas inversas que conteman 1000 jg de siRNA de PCSK9/mL (densidad 0,95).
Muestra 15: se anadio 2,4 g de agua purificada a 16,6 g de la mezcla oleosa preparada de acuerdo con la muestra J y se agito a temperatura ambiente con agitacion magnetica entre 300 y 500 r/min durante 30 minutos para formar micelas inversas "vadas".
Productos administrados:
- Muestra J: micelas inversas preparadas de acuerdo con el procedimiento anterior en 1000 jg de siRNA de PCSK9/mL, suministradas a 1 mL/kg por via rectal durante 10 dfas
- Muestra 15: micelas inversas "vadas", suministradas a 1 mL/kg por via rectal durante 10 dfas
- siRNA de PCSK9: siRNA desnudo en solucion a 1000 jg/mL de siRNA de PCSK9, suministrado a 1 mL/kg por via intravenosa durante 10 dfas
-tampon de solucion salina suministrado a 1 mL/kg por via intravenosa durante 10 dfas
Ratones C57B1/6J (7 u 8 ratones por grupo) se trataron como se describe en la tabla siguiente. El siRNA de PCSK9 formulado en la muestra J suministrado a 1000 jg/kg (grupo 1) y micelas inversas "vadas" (muestra 15), utilizado como control (grupo 2), se administraron por via rectal una vez al dfa durante 10 dfas. Estos productos se suministraron lentamente con una pipeta en el recto inferior, inmediatamente despues del esfmter anal. Tambien se utilizaron como controles animales tratados por via intravenosa durante 10 dfas con siRNA de PCSK9 desnudo sin formular (grupo 3) o tampon de solucion salina (grupo 4).
Todos los ratones se sacrificaron el dfa 11. Los dgados se extrajeron y congelaron. La expresion de la protema PCSK9 se determino por un metodo ELISA (R & D Systems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los resultados se muestran en la figura 7 y demuestran claramente la eficacia del tratamiento con micelas inversas formuladas con siRNA de PCSK9 (muestra J) para reducir la expresion de la protema PCSK9 en el dgado en comparacion con micelas inversas vadas (muestra 15). Ademas, la formulacion del siRNA de PCSK9 en micelas inversas de acuerdo con la invencion permite una mejor eficacia de dicho siRNA para reducir la expresion de la protema PCSK9 en el Idgado en comparacion con el siRNA de PCSK9 desnudo.
Grupos
Numero de animales Tratamiento Dosis suministrada (pg/kg/d) Volumen suministrado (mL/kg/d)
1
8 Muestra J 1000
1
2
8 Muestra 15 0 1
3
7 siRNA desnudo 1000 1
4
7 Tampon de solucion salina 0 1
Ejemplo 8: Evaluacion de la eficacia in vivo del siRNA de PrP(C) formulado en micelas inversas para inhibir la expresion de la protema PrP(C)
El objeto de este estudio fue evaluar la eficacia del siRNA de la protema prionica normal, PrP(C), formulado en micelas inversas de acuerdo con el siguiente procedimiento (muestra K) cuando se suministra por via rectal para inhibir la expresion de la protema PrP(C) en el cerebro de ratones C57B1/6J.
5
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El siRNA de PrP(C) es un siRNA bicatenario que comprende 21 nucleotidos y esta disenado para permitir la inhibicion de la expresion de la protema PrP(C).
Muestra K: se disolvieron 14,1 g de lecitina en 8,5 g de etanol absoluto con agitacion magnetica a 300 r/min durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se anadieron a la mezcla 2,3 g de fitosterol y se agito en las mismas condiciones. Se anadieron 57,1 g de monooleato de glicerol y se realizo una agitacion magnetica a 500 r/min durante 45 minutos a 37°C. Se anadieron 184,0 mg de una solucion de siRNA que contema 932 |jg del siRNA de PrP(C) a 1233,6 mg de la mezcla oleosa y se agito a temperatura ambiente con agitacion magnetica entre 300 y 500 r/min durante 60 minutos para formar micelas inversas que conteman 618 jg de siRNA de PrP(C)/mL (densidad 0,94).
El siRNA desordenado (abreviadamente SC, por la palabra inglesa scrambled) es un siRNA bicatenario que comprende 21 nucleotidos y esta disenado para no permitir ninguna modulacion de la expresion de la protema PrP(C).
Muestra L: se anadieron 184,2 mg de una solucion de siRNA que contema 933 jg de siRNA SC a 1233,8 mg de la mezcla oleosa preparada de acuerdo con la muestra K y se agito a temperatura ambiente con agitacion magnetica entre 300 y 500 r/min durante 60 minutos para formar micelas inversas que conteman 618 jg de siRNA SC/mL (densidad 0,94).
Productos administrados:
- Muestra K: micelas inversas preparadas de acuerdo con el procedimiento anterior con 618 jg de siRNA de PrP(C)/mL, suministradas a 1 mL/kg por via rectal durante 12 dfas
- Muestra L: micelas inversas preparadas de acuerdo con el procedimiento anterior con 618 jg de siRNA SC/mL, suministradas a 1 mL/kg por via rectal durante 12 dfas
Ratones C57B1/6J se trataron como se describe en la siguiente tabla. Los siRNA de PrP(C) y SC formulados en micelas inversas (muestras K y L) se suministraron a 618 jg/kg (grupos 2 y 3, de 10 ratones por grupo). Ambos productos se suministraron lentamente con una pipeta en el recto inferior, inmediatamente despues del esfmter anal una vez al dfa durante 12 dfas (fines de semana excluidos). Los animales no tratados tambien se utilizaron como controles (grupo 1, de 10 ratones por grupo).
Todos los ratones se sacrificaron el dfa 13. Los cerebros se extrajeron y congelaron. Los niveles de la protema PrP(C) se determinaron por un metodo ELISA (SPI BIO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los resultados se muestran en la figura 8 que demuestra claramente la eficacia del siRNA de PrP(C) formulado en micelas inversas (muestra K) para atravesar la barrera hematoencefalica y reducir la expresion de la protema del cerebro PrP(C). En contraste, las micelas inversas formuladas con un siRNA desordenado no espedfico (muestra L) no tienen ningun efecto sobre la expresion en el cerebro de PrP(C).
Grupos
Numero de animales Tratamiento Compuestos activos Dosis suministrada (pg/kg/d) Volumen suministrado (mL/kg/d)
1
10 Sin tratamiento - 0 -
2
10 Muestra L siRNA desordenado 618 1
3
10 Muestra K siRNA de PrP(C) 618 1
Ejemplo 9: Formulacion de micelas inversas de acuerdo con la invencion con oligonucleotidos antisentido
El objeto de este estudio fue formular oligonucleotidos antisentido (ASON) qmmicamente modificados en micelas inversas de acuerdo con la invencion.
DMPK2467U es un ASON gapmero que comprende 20 nucleotidos.
Muestra M: se disolvieron 14,3 g de lecitina en 8,6 g de etanol absoluto con agitacion magnetica a 300 r/min durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se anadieron a la mezcla 2,4 g de fitosterol y se agito en las mismas condiciones. Se anadieron 57,8 g de monooleato de glicerol y se realizo una agitacion magnetica a 500 r/min durante 60 minutos a 37°C. Se anadieron 724,6 mg de una solucion de ASON que contema 5973 jg del ASON DMPK2467U
a 4984,0 mg de la mezcla oleosa y se agito a temperatura ambiente con agitacion magnetica entre 300 y 500 r/min durante 30 minutos para formar micelas inversas que conteman 994 pg del ASON DMPK2467U/mL (densidad 0,95).
DMPKGD65 es un ASON gapmero que comprende 20 nucleotidos.
Muestra N: se anadieron 715,6 mg de una solucion de ASON que contema 5933 pg del ASON DMPKGD65 a 5 4986,2 mg de la mezcla oleosa preparada de acuerdo con la muestra M y se agito a temperatura ambiente con
agitacion magnetica entre 300 y 500 r/min durante 30 minutos para formar micelas inversas que conteman 988 pg del ASON DMPKGD65/mL (densidad 0,95).
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Claims (15)

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    10
    15
    20
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    REIVINDICACIONES
    1. Un sistema de micelas inversas que comprende al menos un acido nucleico, un esterol, un acilglicerol, un fosfoKpido o un esfingoKpido, un alcohol y agua, en donde la relacion en peso fosfoKpido o esfingoKpido/acilglicerol es de 0,05 a 0,40.
  2. 2. El sistema de micelas inversas de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde las micelas presentan nucleos acuosos de 4 nm, preferiblemente de 3 a 5 nm, mas preferiblemente de 3,5 a 5 nm, en particular de 3,7 a 4,5 nm.
  3. 3. El sistema de micelas inversas de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, obtenible por el metodo siguiente:
    (a) poner en contacto (i) esterol, (ii) acilglicerol, (iii) fosfolipido o esfingolipido, (iv) alcohol, (v) agua y (vi) al menos un acido nucleico,
    (b) agitar la mezcla obtenida en la etapa (a), a 40°C o menos, y durante un tiempo suficiente para obtener la formation de micelas inversas.
  4. 4. El sistema de micelas inversas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la relacion en peso esterol/acilglicerol varia de 0,015 a 0,05, mas particularmente de 0,03 a 0,04.
  5. 5. El sistema de micelas inversas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-4, en donde la agitation de la etapa (b) se realiza a una temperatura que varia de 15°C a 40°C, o de 25°C a 40°C, o mas espetificamente de 30°C a 37°C.
  6. 6. El sistema de micelas inversas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el fosfolipido es fosfatidilcolina.
  7. 7. El sistema de micelas inversas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el acilglicerol presenta la siguiente formula (I):
    CH2OR1
    chor2
    ChLOR,
    2 3 (I)
    en donde:
    - R1 es un residuo acilo de un acido graso saturado o insaturado, lineal o ramificado, que tiene entre 14 y 24 atomos de carbono, un atomo de hidrogeno, o una mono-, di- o tri-galactosa o glucosa;
    - R2 es un residuo acilo de un acido graso saturado o insaturado, lineal o ramificado, que tiene entre 2 y 18 atomos de carbono;
    - R3 es un residuo acilo de un acido graso saturado o insaturado, lineal o ramificado, que tiene entre 14 y 24 atomos de carbono, o un atomo de hidrogeno.
  8. 8. El sistema de micelas inversas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el acilglicerol se selecciona del grupo que consiste en 1,2-dioleina y 1 -oleoil-2-acetil-glicerol.
  9. 9. El sistema de micelas inversas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el esterol es sitosterol o colesterol.
  10. 10. El sistema de micelas inversas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el acido nucleico es un oligonucleotido capaz de interaccionar con mRNA, pre-mRNA o una protema y capaz de modular la expresion genica.
  11. 11. El sistema de micelas inversas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el acido nucleico es un oligonucleotido capaz de sobre-regular o sub-regular la expresion de la(s) protema(s) diana.
  12. 12. Una composition farmaceutica que comprende un sistema de micelas inversas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y al menos un vehiculo, excipiente o soporte farmaceuticamente aceptable.
  13. 13. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion anterior, para el suministro a un mairnfero de al menos un acido nucleico, comprendiendo dicho suministro la administracion a traves de las mucosas de la composicion farmaceutica.
  14. 14. La composicion farmaceutica de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 o 13 anteriores para la 5 prevencion, tratamiento y/o mejora de los smtomas de enfermedades geneticas, canceres, enfermedades
    neurodegenerativas, enfermedades infecciosas y/o inflamatorias, o enfermedades o trastornos debidos a la proliferacion celular.
  15. 15. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 13 o 14, en donde los acidos nucleicos de el sistema de micelas inversas atraviesan la barrera hematoencefalica, y en donde la enfermedad o trastorno se
    10 selecciona mas particularmente de enfermedades geneticas, tumorales, virales y degenerativas del sistema nervioso central.
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