CN113272429A

CN113272429A - 肌抑素信号抑制剂

Info

Publication number: CN113272429A
Application number: CN201980085589.0A
Authority: CN
Inventors: 中川慎一郎
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2021-08-17
Also published as: CO2021008091A2; SG11202106511UA; CL2021001712A1; KR20210110593A; PE20211732A1; WO2020138509A1; CA3122475A1; JP2022516207A; CL2023001902A1; PH12021551187A1; MX2021007740A; ECSP21046159A; IL284342A; US20220119818A1; CL2023001901A1; BR112021012488A2; TW202039848A; GB201821269D0; AU2019415399A1; EP3902916A1

Abstract

本发明提供了用于通过在mRNA水平上靶向ACVR2B来抑制肌肉生长抑制素信号传导的新方法。

Description

肌抑素信号抑制剂

背景技术

肌抑素(Myostain，也称为GDF8)是1997年发现的一种新型细胞因子，属于TGF-β超家族。肌抑素的组织表达在骨骼肌中具有特异性，骨骼肌是负责运动和代谢活动的主要组织。含有肌抑素缺陷突变的动物表现出显著的肌肉肥大，其中骨骼肌的量增加到其野生型对应品种的两倍大小(McPherron等人，Nature.387(6628)：83-90，1997)。基于这种观察，肌抑素被认为充当控制骨骼肌体积中的重要因素。

当肌抑素将其信号传导至细胞内部时，其会经历与其他TGF-β类似的过程，其中，其先与II型受体结合，随后与I型受体结合，形成配体-受体复合物。通过该过程，受体中的每一种均在其细胞内结构域上经历磷酸化，这导致通过Smad依赖性或非Smad依赖性途径的信号转导(Chang等人，Endocrine Reviews.23(6)：787-823，2002)。I型和II型受体二者均分别由多种基因编码。属于TGF-β超家族的每一种分子均与受体的特定组合结合。肌抑素与I型受体的ALK4或ALK5以及II型受体的ACVR2B的组合结合。然而，此类组合并不是肌抑素所独有的，也被一些其他TGF-β超家族分子(包括GDF11、激活素A等)所使用(Wakefield andHill.Nat Rev Cancer.13(5)：328-41，2013，doi：10.1038/nrc3500)。因此，非肌抑素的配体与ACVR2B/ALK4或ACVR2B/ALK5的结合与肌抑素结合一样，可以触发对肌肉量抑制信号的传导。事实上，有报道称，对缺乏肌抑素基因的小鼠施用针对ACVR2B或可溶性ACVR2B(其中，其跨膜结构域和下游区域被抗体-Fc结构区替换)的中性抗体，在因肌抑素缺乏导致的肌肉量增加之外，进一步增加了肌肉量(参见Lach-Trifilieff等人，Mol Cell Biol.34(4)：606-18，2014.doi：10.1128/MCB.01307-13；Lee等人，Proc NatlAcad SciUSA.102(50)：18117-22，2005)。这种进一步增加暗示，存在肌抑素之外的通过与ACVR2B结合抑制肌肉量的因素。

减少肌抑素信号传导的措施可以用于治疗或预防特定的肌消耗病和其他肌肉相关疾病。本发明提供了通过在mRNA水平上靶向ACVR2B来抑制肌抑素信号传导的新方法。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了能够允许靶细胞产生突变型激活素受体2B(ACVR2B)mRNA的化合物，其中mRNA编码野生型ACVR2B部分或全部细胞内区域的部分序列缺失。

根据本发明的第一方面的变体，提供了能够导致激活素受体2B型(ACVR2B)蛋白作为截短形式产生的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，所述截短形式缺失野生型ACVR2B的胞内区的一部分。

在特定实施方式中，化合物是能够实现ACVR2B的外显子5，6，7，8，9和10中的一个或多个的外显子跳过的寡核苷酸。

根据本发明的第二方面，提供了药物组合物，其包含本发明的第一方面的化合物或其药学上可接受的盐或水合物。

根据本发明的第三方面，提供了本发明的第一方面的化合物或其药学上可接受的盐或水合物或本发明的第二方面的药物组合物，其用于治疗。

在特定实施方式中，治疗是预防或治疗肌消耗病，肌肉减少病或肌萎缩病，例如杜氏肌营养不良症。

根据本发明的第四方面，提供了基因操作的动物，其表达缺失ACVR2B的胞内区的一部分的突变ACVR2B mRNA。

本发明的特定方面和实施方式包括：

[1]化合物或其药学上可接受的盐或水合物，所述化合物能够允许靶细胞产生突变型激活素受体2B(ACVR2B)mRNA，其中序列中编码野生型ACVR2B的胞内区的一些或全部的序列的一部分不存在。

[2]根据[1]的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其中所述野生型ACVR2B的胞内区由野生型ACVR2B的外显子5-11编码。

[3]根据[1]或[2]的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其能够使得所述靶细胞产生缺失部分野生型ACVR2B胞内区的截短ACVR2B蛋白。

[4]根据[3]的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其中所述截短的ACVR2B蛋白缺失通过至少一个外显子编码的胞内区的全部或一部分，所述至少一个外显子选自下组：ACVR2B的外显子5、6、7、8、9和10。

[5]根据[1]-[3]中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，所述化合物为能够诱导编码ACVR2B部分细胞内区域的外显子跳跃的反义寡聚物。

[6]根据[5]的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其中要被跳过的所述外显子选自下组：ACVR2B的外显子5，6，7，8，9和10。

[7]根据[5]或[6]的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，所述化合物包含10-50个核碱基。

[8]根据[5]-[7]中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，所述化合物包含与选自ACVR2B外显子5，6，7，8，9和10的10至50个连续核苷酸互补的序列。

[9]根据求[5]-[8]中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其中所述外显子包含选自SEQ ID NOs：1至6的序列。

[10]根据[5]-[9]中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，所述化合物包含选自SEQ ID NOs：12至36和43至111的核苷酸序列。

[11]根据求[5]-[10]中任何一项的化合物，所述化合物由选自SEQ ID NOs：12至36和43至111的核苷酸序列组成。

[12]根据[5]-[11]中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其中所述反义寡聚物是寡核苷酸。

[13]根据[12]的化合物或其药学上可接受的盐或水合物]，其中所述寡核苷酸中的至少一个糖部分和/或至少一个磷酸键部分是经修饰的。

[14]根据[13]的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其中所述经修饰的糖部分是其中2′-位处的-OH基团被选自下组的任何基团取代的核糖：OR，R，R′OR，SH，SR，NH₂，NHR，NR₂，N₃，CN，F，Cl，Br和I(其中R代表烷基或芳基，R′代表亚烷基)。

[15]根据[13]或[14]的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其中所述经修饰的磷酸键部分是选自下组的一种：硫代磷酸键，二硫代磷酸键，烷基膦酸键，氨基磷酸酯键和硼烷膦酸键。

[16]根据[5]-[11]中任何一项化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其中所述反义寡聚物包括至少一个吗啉环。

[17]根据[16]的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，所述化合物是吗啉代寡聚物或磷酸二酰胺吗啉代寡聚物。

[18]根据[16]或[17]的化合物或其药学上可接受的盐或水合物]，所述化合物在其5’-末端具有下示化学式(1)至(3)所示基团中的任何一个。

[19]化合物或其药学上可接受的盐或水合物结合]，其是如下的缀合物：其中细胞穿透肽与根据[1]-[18]中任何一项的化合物结合。

[20]药物组合物，包含根据[1]-[19]中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物。

[21]根据[20]的药物组合物，其还包含至少一种药学上可接受的载剂或添加剂。

[22]根据[20]或[21]的药物组合物，其是冻干的。

[23]根据[1]-[19]中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物或根据[20]-[22]中任何一项的药物组合物，其用于治疗受试者。

[24]根据[23]的供使用的化合物或其药学上可接受的盐或水合物或供使用的药物组合物，其中所述治疗是预防或治疗受试者的肌萎缩病，肌消耗病或肌肉减少病。

[25]根据[24]的供使用的化合物或药学上可接受的盐或水合物或供使用的药物组合物，其中所述肌萎缩病是杜氏肌营养不良症。

[26]根据[23]-[25]中任何一项的供使用的化合物或其药学上可接受的盐或水合物或供使用的药物组合物，其中所述受试者是人。

[27]治疗受试者的肌萎缩病，肌消耗病或肌肉减少病的方法，其包括对所述受试者施用治疗有效量的根据[1]-[19]中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物或根据[20]-[22]中任何一项的药物组合物]。

[28]根据[27]的方法，其中所述肌萎缩病是杜氏肌营养不良症。

[29]根据[27]或[28]的方法，其中所述受试者是人。

[30]根据[1]-[19]中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物在制备预防或治疗受试者的肌萎缩病，肌消耗病或肌肉减少病的药物中的用途。

[31]根据[30]的方法，其中所述肌萎缩病是杜氏肌营养不良症。

[32]根据[30]或[31]的方法，其中所述受试者是人。

[33]基因操作的动物，其表达突变型激活素受体2B(ACVR2B)mRNA，其中编码野生型ACVR2B部分或全部细胞内区域的部分序列缺失。

附图说明

图1显示了通过所示的磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(PMOs)(a和b)，硫代磷酸酯(PS)寡核苷酸(c)或PMO-肽缀合物(d)的每一个外显子的跳过效率(％)。

图2显示了截短的ACVR2B蛋白的表达对肌抑素信号传导的抑制，所述截短的ACVR2B相对于内源性野生型ACVR2B显性表达。

图3显示了对SMAD7 mRNA表达的抑制，该表达用作肌抑素信号强度的指标。

具体实施方式

在下文中将更详细地描述本发明。以下实施方式仅旨在通过示例的方式描述本发明，其并非旨在将本发明仅限制于这些实施方式。可以以各种方式实施本发明而不会背离本发明的精神。核苷酸序列以如下方式呈现：其中5′端置于左端，3′端置于右端。氨基酸序列以如下方式呈现：其中N末端置于左端，C末端置于右端。

化合物

本发明提供了化合物或其药学上可接受的盐或水合物，所述化合物能够允许靶细胞产生突变型激活素受体2B(ACVR2B)mRNA，其中序列中编码野生型ACVR2B的胞内区的一些或全部的序列的一部分不存在。

ACVR2B蛋白也称为ActRIIB，并且由512个氨基酸组成。ACVR2B的细胞地图定位为3p22-p21.3。ACVR2B由三个主要结构域组成，即胞外配体结构域，跨膜结构域，和胞内丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。Ishikawa等人(Journal妒Human Genetics volume 43，pages 132-134(1998))报道了ACVR2B基因包含11个外显子，并且横跨约30kb。野生型人ACVR2B(在下文中称为“野生型ACVR2B”)的mRNA序列在NCBI参考序列：Nm_001106.4中公开，并且本文中在SEQ ID NO：8中公开。

人ACVR2B的代表性编码序列(CDS)在SEQ ID NO：10中显示。ACVR2B CDS的核苷酸序列不限于SEQ ID NO：10中所示者，并且包括如下的变体序列：该变体序列具有SEQ IDNO：10的长度的90％或更多，91％或更多，92％或更多，93％或更多，94％或更多，95％或更多，96％或更多，97％或更多，98％或更多，99％或更多，或100％，并且与SEQ ID NO：10具有90％或更多，91％或更多，92％或更多，93％或更多，94％或更多，95％或更多，96％或更多，97％或更多，98％或更多，99％或更多，或100％的序列同一性。

人ACVR2B蛋白的代表性氨基酸序列在SEQ ID NO：11中显示。ACVR2B蛋白的氨基酸序列不限于SEQ ID NO：11中所示者，并且包括如下的变体序列：该变体序列具有SEQ IDNO：11的长度的90％或更多，91％或更多，92％或更多，93％或更多，94％或更多，95％或更多，96％或更多，97％或更多，98％或更多，99％或更多，或100％，并且与SEQ ID NO：11具有90％或更多，91％或更多，92％或更多，93％或更多，94％或更多，95％或更多，96％或更多，97％或更多，98％或更多，99％或更多，或100％的序列同一性。

当本发明的化合物被提供给表达ACVR2B的细胞时，其导致细胞产生突变的ACVR2BmRNA，其中mRNA序列的编码野生型ACVR2B的胞内区的一些或全部的一部分不存在。“突变的ACVR2B mRNA，其中mRNA序列的一部分不存在，所述部分编码野生型ACVR2B的胞内区的一些或全部”(在下文中称为“本发明的突变ACVR2B mRNA”)表示突变的/变体ACVR2BmRNA，其缺乏在野生型ACVR2B mRNA中发现的序列的一部分，并且其中相对于野生型ACVR2B不存在的所述序列编码野生型ACVR2B的胞内区的一些或全部；或突变的ACVR2B mRNA，其缺乏在野生型ACVR2B mRNA中发现的编码野生型ACVR2B的胞内区的一些或全部的序列的一部分。

人ACVR2B的胞内区由从N-末端侧的第159个至第512个氨基酸(含)组成。编码代表性的野生型ACVR2B的胞内区的一些或全部的mRNA序列在SEQ ID NO：9中显示。

本发明的突变ACVR2B mRNA可以缺失SEQ ID NO：9中的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426，427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439，440，441，442，443，444，445，446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465，466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496，497，498，499，500，501，502，503，504，505，506，507，508，509，510，511，512，513，514，515，516，517，518，519，520，521，522，523，524，525，526，527，528，529，530，531，532，533，534，535，536，537，538，539，540，541，542，543，544，545，546，547，548，549，550，551，552，553，554，555，556，557，558，559，560，561，562，563，564，565，566，567，568，569，570，571，572，573，574，575，576，577，578，579，580，581，582，583，584，585，586，587，588，589，590，591，592，593，594，595，596，597，598，599，600，601，602，603，604，605，606，607，608，609，610，611，612，613，614，615，616，617，618，619，620，621，622，623，624，625，626，627，628，629，630，631，632，633，634，635，636，637，638，639，640，641，642，643，644，645，646，647，648，649，650，651，652，653，654，655，656，657，658，659，660，661，662，663，664，665，666，667，668，669，670，671，672，673，674，675，676，677，678，679，680，681，682，683，684，685，686，687，688，689，690，691，692，693，694，695，696，697，698，699，700，701，702，703，704，705，706，707，708，709，710，711，712，713，714，715，716，717，718，719，720，721，722，723，724，725，726，727，728，729，730，731，732，733，734，735，736，737，738，739，740，741，742，743，744，745，746，747，748，749，750，751，752，753，754，755，756，757，758，759，760，761，762，763，764，765，766，767，768，769，770，771，772，773，774，775，776，777，778，779，780，781，782，783，784，785，786，787，788，789，790，791，792，793，794，795，796，797，798，799，800，801，802，803，804，805，806，807，808，809，810，811，812，813，814，815，816，817，818，819，820，821，822，823，824，825，826，827，828，829，830，831，832，833，834，835，836，837，838，839，840，841，842，843，844，845，846，847，848，849，850，851，852，853，854，855，856，857，858，859，860，861，862，863，864，865，866，867，868，869，870，871，872，873，874，875，876，877，878，879，880，881，882，883，884，885，886，887，888，889，890，891，892，893，894，895，896，897，898，899，900，901，902，903，904，905，906，907，908，909，910，911，912，913，914，915，916，917，918，919，920，921，922，923，924，925，926，927，928，929，930，931，932，933，934，935，936，937，938，939，940，941，942，943，944，945，946，947，948，949，950，951，952，953，954，955，956，957，958，959，960，961，962，963，964，965，966，967，968，969，970，971，972，973，974，975，976，977，978，979，980，981，982，983，984，985，986，987，988，989，990，991，992，993，994，995，996，997，998，999，1000，1001，1002，1003，1004，1005，1006，1007，1008，1009，1010，1011，1012，1013，1014，1015，1016，1017，1018，1019，1020，1021，1022，1023，1024，1025，1026，1027，1028，1029，1030，1031，1032，1033，1034，1035，1036，1037，1038，1039，1040，1041，1042，1043，1044，1045，1046，1047，1048，1049，1050，1051，1052，1053，1054，1055，1056，1057，1058，1059，1060，1061，1062，1063，1064或1065个核苷酸。

如本文的实施例部分中所证实的，在mRNA水平上破坏人ACVR2B的胞内区有效地降低肌抑素信号传导。因此，ACVR2B的胞内区是破坏肌抑素信号的良好靶点。

在一个实施方式中，本发明的化合物能够导致靶细胞产生缺少了野生型ACVR2B的胞内区蛋白的一部分的截短的ACVR2B蛋白，例如具有SEQ ID NO：11中所示序列者。

如本文所用，“缺少了野生型ACVR2B的胞内区蛋白的一部分的截短的ACVR2B蛋白”(在下文中可互换地称为“ACVR2B蛋白质的截短形式”或“截短的ACVR2B蛋白质”)是指缺失所述野生型ACVR2B的胞内区中的至少一个氨基酸的任何截短形式的ACVR2B蛋白。ACVR2B的胞内区中相对于野生型ACVR2B不存在的部分是指存在于野生型ACVR2B中单不存在于截短的ACVR2B中的一个或多个氨基酸。例如，ACVR2B蛋白的截短形式可以缺失在野生型ACVR2B蛋白质中发现的胞内区的1个氨基酸，或2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，11 0，11 1，112，11 3，114，11 5，116，117，11 8，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，或354个氨基酸，例如SEQ IDNO：11中所述者。显而易见，截短形式/变体不仅涵盖从蛋白质的羧基或氨基末端去除一个或多个氨基酸的形式，而且还包括缺乏来自ACVR2B蛋白质内部的一个或多个氨基酸的变体。

截短形式中不存在或缺失的ACVR2B胞内区的部分由选自野生型ACVR2B的外显子5，6，7，8，9，10和11中的至少一个外显子的全部或一部分编码。

如本文所用的“能够导致所产生的ACVR2B蛋白为截短的形式”表示本发明的化合物允许向其中添加化合物的细胞合成或产生截短的ACVR2B，如本文中更详细解释的。

由于ACVR2B的胞外区和跨膜区仍然存在，本发明的截短形式的ACVR2B可能仍然能够与其天然配体结合，但是关于肌抑素配体的结合，与野生型ACVR2B相比，肌抑素信号的转导效率可能降低。能与ACVR2B结合的天然配体的示例包括激活素-A，激活素-B，GDF1，GDF3，NODAL，GDF11，肌抑素(其也称为GDF8)，BMP2，BMP5，GDF5(其也称为BMP14)，GDF6，GDF7，BMP5，BMP6，BMP7和BMP8。配体的优选示例是肌抑素，其也称为GDF8。

如本文所用的信号的“转导”旨在表示通过激活与信号相关的下游因子或通过失活与信号相关的下游因子来转送信号。

在特定实施方式中，本发明的ACVR2B蛋白的截短形式能与肌抑素结合。

当配体与ACVR2B但强度低于野生型ACVR2B时，本发明的截短的ACVR2B蛋白转导信号。在一个实施方式中，当肌抑素与其结合时，截短的ACVR2B蛋白以低于野生型ACVR2B的强度转导肌抑素信号。如本文所用，术语“低于野生型ACVR2B的强度”是指与同一配体与野生型ACVR2B结合所转导的信号强度相比，信号强度(信号传导的能力)减少1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％。信号强度可以通过量化一个或多个通过转导的信号触发器表达的基因的mRNA表达水平来间接确定。例如，肌抑素触发的信号传导的信号强度可以通过测量SMAD7的mRNA表达水平来测量。在这种情况下，相比于野生型ACVR2B的肌抑素信号传导所导致的肌抑素信号强度降低，本发明的化合物能够将肌抑素信号的强度降低至如下水平：该水平与SMAD7的mRNA表达水平的如下降低有关：1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％。

在另一个实施方式中，本发明的突变ACVR2B mRNA可以因为移码突变而缺失编码野生型ACVR2B的胞内区的一些或全部的序列的一部分。此类移码突变可以生成与野生型mRNA不同的下游阅读框。因此，在这种情况下，本发明的突变ACVR2B mRNA缺失编码野生型ACVR2B的胞内区的一些或全部的序列的一部分。

此类移码也可以导致本发明的突变ACVR2B mRNA通过ACVR2B的无义介导的mRNA衰变(NMD)。NMD是用于控制所有真核生物mRNAs质量的机制，其破坏在初始终止密码子上游(朝向5’端)位置处具有终止密码子的异常mRNAs(通常通过突变引起)。当一些外显子，特别是序列长度非三个核苷酸的倍数(即，非3N，其中N是指定整数)的外显子，变为被跳过时，三重体(triplets)的翻译框变得偏移，这可以在初始终止密码子上游产生新的终止密码子。例如，当ACVR2B的外显子8被跳过时，外显子7和9变为直接结合。外显子7和9连接处的阅读框“AG/GTAG”由外显子7最靠3′端的2个核苷酸(即“AG”)和外显子9最靠5′端的4个核苷酸(即“GTAG”)组成。AGG TAG编码精氨酸(Arg)和终止密码子，生成无义突变样mRNA。随后可以通过NMD破坏此类突变mRNA。

另一方面，在野生型ACVR2B中，位于外显子7和8连接处的阅读框“AG/GGAU”由外显子7最靠3′端的2个核苷酸(即“AG”)和外显子8最靠5′端的4个核苷酸(即“GGAU”)组成。AGGGAU编码精氨酸(Arg)和天冬氨酸(Asp)。

在因移码生成新的终止密码子的情况下，产生本发明的突变ACVR2BmRNA，但随后通常通过NMD降解或衰变。

如本文所用的“靶细胞”是将本发明的化合物导入其中的细胞，其可以为表达ACVR2B(例如野生型ACVR2B)的任何细胞。靶细胞的示例包括肌细胞，成肌细胞，或肌管细胞。在一个实施方式中，靶细胞是动物细胞。在另一个实施方式中，靶细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方式中，靶细胞是人细胞。

本发明的化合物是能够导致ACVR2B mRNA和/或蛋白质作为缺失野生型ACVR2B的胞内区的一部分的截短形式产生的任何化合物。本发明的合适化合物的示例包括：CRISPR-CAS9向导RNA序列，其具有适当的核酸内切酶能够切割/去除ACVR2B基因中编码其胞内区的一部分的一部分，用于跳过编码ACVR2B胞内区的一部分的至少一个外显子的反义寡聚物，以及用于敲除编码其胞内区的一部分的ACVR2B基因的一部分的loxP系统化合物。

如本领域技术人员所理解的，诸如TALENs或锌指(ZFN)等其它众所周知的基因编辑技术也可用于生成本发明的ACVR2B的截短形式。

当使用CRISPR-CAS9抑制肌抑素信号时，将具有与编码ACVR2B或ACVR2B的一部分(例如野生型ACVR2B的胞内区)的基因组DNA的靶序列互补的序列的引导RNA导入靶细胞，由此识别要切割的靶序列。导入靶细胞的Cas9蛋白可切割由基因组DNA和向导RNA组成的双链部分。通过修复切割位点的过程，因核苷酸的缺失和/或插入而导致突变，从而导致全部或部分ACVR2B的敲除。基因组DNA的靶序列的靶序列包含外显子的任何序列，例如ACVR2B的外显子1至11。合适地，基因组DNA的靶序列包括选自下组：ACVR2B的外显子7，8，9和10，或下组：ACVR2B的外显子5，6，7，8，9和10的的至少一个外显子的任何序列。在一个实施方式中，基因组DNA的靶序列包括选自下组的至少一个外显子的任何序列：ACVR2B的外显子5，6，7，9和10。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列包括选自下组的至少一个外显子的任何序列：ACVR2B的外显子5，6，9和10。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列包括选自下组的至少一个外显子的任何序列：ACVR2B的外显子5，6和10。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列包括选自下组的至少一个外显子的任何序列：ACVR2B的外显子5和6。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列包括选自下组的至少一个外显子的任何序列：ACVR2B的外显子7，8和9。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列包括选自下组的至少一个外显子的任何序列：ACVR2B的外显子7和8。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列是ACVR2B的外显子5。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列是ACVR2B的外显子6。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列是ACVR2B的外显子7。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列是ACVR2B的外显子8。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列是ACVR2B的外显子9。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列是ACVR2B的外显子10。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列是ACVR2B的外显子11。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列包括选自下组：ACVR2B的外显子7，8，9和10，或下组：ACVR2B的外显子5，6，7，8，9和10的的至少一个外显子的任何序列。可替代地，可以通过CRISPR-CAS9靶向内含子。例如，可以切割将外显子8夹在中间的内含子7和8。当切割部位被修复时，外显子8可以变为不存在以生成外显子8-缺失的突变mRNA。类似地，内含子4和5，或内含子5和6，或内含子6和7，或内含子8和9，或内含子9和10，或内含子10和11可以被靶向切割。因此，本发明的化合物可以是如上素数的用于CRISPR-CAS9的向导RNA，或提供向导RNA作为其转录物的DNA(例如表达质粒)，或CAS9(或Cas9样)蛋白质，或编码和提供CAS9(或Cas9样)蛋白质的DNA(例如表达质粒)，或其组合。

当使用siRNA抑制肌抑素信号时，将设计用于靶向ACVR2B mRNA的序列的siRNA导入靶细胞中。当由此导入的siRNA的引导链与靶序列杂交时，靶细胞中的内源性RISC蛋白识别由引导链和靶向mRNA链组成的双链部分，并切割mRNA的靶序列。通过这样做，降低了ACVR2B蛋白水平。因此，在另一个实施方式中，本发明的化合物可以是siRNA或提供siRNA作为其转录物的DNA(例如表达质粒)。

反义寡聚物

也可以通过将细胞与反义寡核苷酸(AON)接触来在细胞内产生突变的ACVR2BmRNA，该反义寡核苷酸能够在细胞中诱导编码蛋白质的胞内区的一个或多个ACVR2B外显子的外显子跳过。

在一个实施方式中，本发明的化合物是能够诱导跳过编码ACVR2B的胞内区的一部分的外显子的反义寡聚物(在下文中称为“本发明的反义寡聚物”或“反义寡聚物”)。合适地，要被跳过的外显子是选自下组：ACVR2B的外显子5，6，7，8，9，10和11，或下组：ACVR2B的外显子5，6，7，8，9和10中一个。在一个实施方式中，要被跳过的外显子是选自下组者：外显子5，6，7，9和10。在另一个实施方式中，要被跳过的外显子是外显子5。仍然在另一个实施方式中，要被跳过的外显子是外显子6。仍然在另一个实施方式中，要被跳过的外显子是外显子7。仍然在另一个实施方式中，要被跳过的外显子是外显子8。仍然在另一个实施方式中，要被跳过的外显子是外显子9。仍然在另一个实施方式中，要被跳过的外显子是外显子10。仍然在另一个实施方式中，要被跳过的外显子是外显子11。仍然在另一个实施方式中，要被跳过的外显子是选自下组：ACVR2B的外显子7，8，9和10，或下组：ACVR2B的外显子5，6，7，8，9和10中的一个。

代表性的外显子5，6，7，8，9，10和11的核苷酸序列分别是SEQ ID NOs∶1，2，3，4，5，6和7中所示的那些。外显子5，6，7，8，9，10和11的核苷酸序列不受限于SEQ ID NOs∶1，2，3，4，5，6和7中所示的那些，并且包括如下的变体序列：该变体序列分别具有SEQ ID NOs：1，2，3，4，5，6和7的长度的90％或更多，91％或更多，92％或更多，93％或更多，94％或更多，95％或更多，96％或更多，97％或更多，98％或更多，99％或更多，或100％，并且分别与SEQ IDNOs：1，2，3，4，5，6和7具有90％或更多，91％或更多，92％或更多，93％或更多，94％或更多，95％或更多，96％或更多，97％或更多，98％或更多，99％或更多，或100％的序列同一性。

术语“能够诱导编码ACVR2B的胞内区的一部分的外显子的跳过”表示在本发明的反义寡聚物与编码ACVR2B基因(例如，人ACVR2B基因)的转录物(例如，前-mRNA)的胞内区的一部分的外显子的靶位点结合之后，所述外显子被剪接去掉了。例如，如果本发明的反义寡聚物与ACVR2B前-mRNA的外显子6的一部分结合，则对应于外显子6下游的外显子(即，外显子7)的5′端的核苷酸序列在对应于外显子6上游的外显子(即，外显子5)的3’端的核苷酸序列的3’侧拼接。这是因在本发明的反义寡聚物结合之后破坏了正常的拼接机制所导致的。随后，通过mRNA编码的ACVR2B多肽将包含通过与至外显子7接合的外显子5编码的氨基酸，由外显子6编码的那些将从截短的ACVR2B变体中省略(不存在)。

在本文中，术语“结合”表示当使本发明的反义寡聚物与ACVR2B基因(例如，人ACVR2B基因)的转录物的拷贝接触(例如，混合)时，互补序列在生理条件下杂交以形成双链核酸。术语“在生理条件下”是指在pH、盐组成和温度方面模拟体内环境的条件。合适的条件可以是以下温度、pH和盐浓度的任何组合：

温度：25℃至40℃，35℃至38℃，36℃至38℃，或37℃；

pH：pH 5至8，pH 6至8，pH 7至8，或pH 7.4；和

盐浓度：100至200mM，130至170mM，140至160mM，或150mM的氯化钠浓度。

如本文所用，关于核苷酸序列的“序列同一性”和“同源性”是指在序列比对并且在必要的情况下引入间隙以实现最大百分比序列同一性之后，并且不考虑任何保守替代作为序列同一性的一部分，候选靶序列中核苷酸残基与主体核苷酸序列中核苷酸残基相同的百分比。为确定核苷酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术人员技能中的各种方式进行，例如，使用公众可得的计算机软件，如BLAST，BLAST-2，ClustalW2，ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员能确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列全长上实现最大比对的任何算法。例如，两个或更多个核苷酸序列的序列同一性可以通过使用如下算法确定：Karlin和Altschul，BLAST(Basic Local Alignment SearchTool)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990；Proc Natl Acad Sci USA 90：5873，1993)。根据BLAST的算法，已经开发了名为BLASTN和BLASTX的程序(Altschul SF，et al：JMol Biol 215：403，1990)。如果BLASTN用于核苷酸序列分析，参数可以设为，例如，分数＝100，字长＝12。如果使用BLAST和Gapped BLAST程序，可以使用每个程序的默认参数。

本发明的反义寡聚物是寡核苷酸或修饰的寡核苷酸。如本文所用，“寡核苷酸”是具有如下定义的长度的连接的核苷酸的序列，其可以有或没有修饰。修饰的寡核苷酸在其他地方详细描述。

本发明的反义寡聚物从其5’端到3’端的长度可以为10至70个核苷酸，例如：11至70，12至70，13至70，14至70，15至70，16至70，17至70，18至70，19至70，20至70，21至70，22至70，23至70，24至70，25至70，10至65，11至65，12至65，13至65，14至65，15至65，16至65，17至65，18至65，19至65，20至65，21至65，22至65，23至65，24至65，25至65，10至60，11至60，12至60，13至60，14至60，15至60，16至60，17至60，18至60，19至60，20至60，21至60，22至60，23至60，24至60，25至60，10至55，11至55，12至55，13至55，14至55，15至55，16至55，17至55，18至55，19至55，20至55，21至55，22至55，23至55，24至55，25至55，10至50，11至50，12至50，13至50，14至50，15至50，16至50，17至50，18至50，19至50，20至50，21至50，22至50，23至50，24至50，25至50，10至45，11至45，12至45，13至45，14至45，15至45，16至45，17至45，18至45，19至45，20至45，21至45，22至45，23至45，24至45，25至45，10至40，11至40，12至40，13至40，14至40，15至40，16至40，17至40，18至40，19至40，20至40，21至40，22至40，23至40，24至40，25至40，10至38，11至38，12至38，13至38，14至38，15至38，16至38，17至38，18至38，19至38，20至38，21至38，22至38，23至38，24至38，25至38，10至36，11至36，12至36，13至36，14至36，15至36，16至36，17至36，18至36，19至36，20至36，21至36，22至36，23至36，24至36，25至36，10至35，11至35，12至35，13至35，14至35，15至35，16至35，17至35，18至35，19至35，20至35，21至35，22至35，23至35，24至35，25至35，10至34，11至34，12至34，13至34，14至34，15至34，16至34，17至34，18至34，19至34，20至34，21至34，22至34，23至34，24至34，25至34，10至33，11至33，12至33，13至33，14至33，15至33，16至33，17至33，18至33，19至33，20至33，21至33，22至33，23至33，24至33，25至33，10至32，11至32，12至32，13至32，14至32，15至32，16至32，17至32，18至32，19至32，20至32，21至32，22至32，23至32，24至32，25至32，10至30，11至30，12至30，13至30，14至30，15至30，16至30，17至30，18至30，19至30，20至30，21至30，22至30，23至30，24至30，25至30，10至29，11至29，12至29，13至29，14至29，15至29，16至29，17至29，18至29，19至29，20至29，21至29，22至29，23至29，24至29，25至29，10至28，11至28，12至28，13至28，14至28，15至28，16至28，17至28，18至28，19至28，20至28，21至28，22至28，23至28，24至28，25至28，10至27，11至27，12至27，13至27，14至27，15至27，16至27，17至27，18至27，19至27，20至27，21至27，22至27，23至27，24至27，25至27，10至26，11至26，12至26，13至26，14至26，15至26，16至26，17至26，18至26，19至26，20至26，21至26，22至26，23至26，24至26，25至26，10至25，11至25，12至25，13至25，14至25，15至25，16至25，17至25，18至25，19至25，20至25，21至25，22至25，23至25，24至25，10至24，11至24，12至24，13至24，14至24，15至24，16至24，17至24，18至24，19至24，20至24，21至24，22至24，23至24，10至23，11至23，12至23，13至23，14至23，15至23，16至23，17至23，18至23，19至23，20至23，21至23，22至23，10至22，11至22，12至22，13至22，14至22，15至22，16至22，17至22，18至22，19至22，20至22，21至22，10至21，11至21，12至21，13至21，14至21，15至21，16至21，17至21，18至21，19至21，20至21，10至20，11至20，12至20，13至20，14至20，15至20，16至20，17至20，18至20，19至20，10至19，11至19，12至19，13至19，14至19，15至19，16至19，17至19，18至19，10至18，11至18，12至18，13至18，14至18，15至18，16至18，17至18，10至17，11至17，12至17，13至17，14至17，15至17，16至17，10至16，11至16，12至16，13至16，14至16，15至16，10至15，11至15，12至15，13至15和14至15个核苷酸(在下文中称为“本发明的反义寡聚物的示例性长度范围”)。本发明的反义寡聚物从其5’端到3’端的长度可以为10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，33，32，33，34，35，36，37，38，39，40，44，42，43，44，45，46，47，48，49，50，55，52，53，54，55，56，57，58，59，60，66，62，63，64，65，66，67，68，69，或70个核苷酸(在下文中称为“本发明的反义寡聚物的示例性长度”)。本发明的寡聚物的特别合适的长度范围包括：从其5’端到3’端有15至45，17至35，15至24，15至26，和20至40个核苷酸。

本发明的反义寡聚物包含与选自下组：ACVR2B的外显子5，6，7，8，9，10和11，或下组：ACVR2B的外显子5，6，7，8，9和10的外显子的核苷酸序列的一部分互补的核苷酸序列。选自下组：ACVR2B的外显子5，6，7，8，9，10和11，或下组：ACVR2B的外显子5，6，7，8，9和10的外显子的核苷酸序列的一部分在本文中也称为“靶序列”。代表性的外显子5，6，7，8，9，10和11的核苷酸序列分别是SEQ ID NOs：1，2，3，4，5，6和7中所示的那些。外显子5，6，7，8，9，10和11的核苷酸序列不受限于SEQ ID NOs：1，2，3，4，5，6和7中所示的那些，并且包括如下的变体序列：其分别与SEQ ID NOs：1，2，3，4，5，6和7中任何一项中公开的序列具有90％或更多，91％或更多，92％或更多，93％或更多，94％或更多，95％或更多，96％或更多，97％或更多，98％或更多，99％或更多，或100％的序列同一性。因此，根据本发明的特定实施方式，本发明的寡聚物包含与如下序列互补的核苷酸序列：该序列分别与SEQ ID NOs：1，2，3，4，5，6和7中任何一个所公开的序列具有90％或更多，91％或更多，92％或更多，93％或更多，94％或更多，95％或更多，96％或更多，97％或更多，98％或更多，99％或更多，或100％的序列同一性。

靶序列可以具有任何长度，只要其与本发明反义寡聚物的长度相同或更短即可。例如，靶序列从其5’端到3’端的长度可以为10至70个核苷酸，例如：11至70，12至70，13至70，14至70，15至70，16至70，17至70，18至70，19至70，20至70，21至70，22至70，23至70，24至70，25至70，10至65，11至65，12至65，13至65，14至65，15至65，16至65，17至65，18至65，19至65，20至65，21至65，22至65，23至65，24至65，25至65，10至60，11至60，12至60，13至60，14至60，1 5至60，16至60，17至60，18至60，19至60，20至60，21至60，22至60，23至60，24至60，25至60，10至55，11至55，12至55，13至55，14至55，15至55，16至55，17至55，18至55，19至55，20至55，21至55，22至55，23至55，24至55，25至55，10至50，11至50，12至50，13至50，14至50，15至50，16至50，17至50，18至50，19至50，20至50，21至50，22至50，23至50，24至50，25至50，10至45，11至45，12至45，13至45，14至45，15至45，16至45，17至45，18至45，19至45，20至45，21至45，22至45，23至45，24至45，25至45，10至40，11至40，12至40，13至40，14至40，15至40，16至40，17至40，18至40，19至40，20至40，21至40，22至40，23至40，24至40，25至40，10至38，11至38，12至38，13至38，14至38，15至38，16至38，17至38，18至38，19至38，20至38，21至38，22至38，23至38，24至38，25至38，10至36，11至36，12至36，13至36，14至36，15至36，16至36，17至36，18至36，19至36，20至36，21至36，22至36，23至36，24至36，25至36，10至35，11至35，12至35，13至35，14至35，15至35，16至35，17至35，18至35，19至35，20至35，21至35，22至35，23至35，24至35，25至35，10至34，11至34，12至34，13至34，14至34，15至34，16至34，17至34，18至34，19至34，20至34，21至34，22至34，23至34，24至34，25至34，10至33，11至33，12至33，13至33，14至33，15至33，16至33，17至33，18至33，19至33，20至33，21至33，22至33，23至33，24至33，25至33，10至32，11至32，12至32，13至32，14至32，15至32，16至32，17至32，18至32，19至32，20至32，21至32，22至32，23至32，24至32，25至32，10至30，11至30，12至30，13至30，14至30，15至30，16至30，17至30，18至30，19至30，20至30，21至30，22至30，23至30，24至30，25至30，10至29，11至29，12至29，13至29，14至29，15至29，16至29，17至29，18至29，19至29，20至29，21至29，22至29，23至29，24至29，25至29，10至28，11至28，12至28，13至28，14至28，15至28，16至28，17至28，18至28，19至28，20至28，21至28，22至28，23至28，24至28，25至28，10至27，11至27，12至27，13至27，14至27，15至27，16至27，17至27，18至27，19至27，20至27，21至27，22至27，23至27，24至27，25至27，10至26，11至26，12至26，13至26，14至26，15至26，16至26，17至26，18至26，19至26，20至26，21至26，22至26，23至26，24至26，25至26，10至25，11至25，12至25，13至25，14至25，15至25，16至25，17至25，18至25，19至25，20至25，21至25，22至25，23至25，24至25，10至24，11至24，12至24，13至24，14至24，15至24，16至24，17至24，18至24，19至24，20至24，21至24，22至24，23至24，10至23，11至23，12至23，13至23，14至23，15至23，16至23，17至23，18至23，19至23，20至23，21至23，22至23，10至22，11至22，12至22，13至22，14至22，15至22，16至22，17至22，18至22，19至22，20至22，21至22，10至21，11至21，12至21，13至21，14至21，15至21，16至21，17至21，18至21，19至21，20至21，10至20，11至20，12至20，13至20，14至20，15至20，16至20，17至20，18至20，19至20，10至19，11至19，12至19，13至19，14至19，15至19，16至19，17至19，18至19，10至18，11至18，12至18，13至18，14至18，15至18，16至18，17至18，10至17，11至17，12至17，13至17，14至17，15至17，16至17，10至16，11至16，12至16，13至16，14至16，15至16，10至15，11至15，12至15，13至15，和14至15个核苷酸。靶序列从其5′端至3’端的长度可以为10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，33，32，33，34，35，36，37，38，39，40，44，42，43，44，45，46，47，48，49，50，55，52，53，54，55，56，57，58，59，60，66，62，63，64，65，66，67，68，69，或70个核苷酸。

与靶序列互补的核苷酸序列(在下文中称为“杂交序列”)应当与靶序列具有相同长度。因此，示例性的杂交序列从5’端到3’端的长度包括：10至70个核苷酸，例如11至70，12至70，13至70，14至70，15至70，16至70，17至70，18至70，19至70，20至70，21至70，22至70，23至70，24至70，25至70，10至65，11至65，12至65，13至65，14至65，15至65，16至65，17至65，18至65，19至65，20至65，21至65，22至65，23至65，24至65，25至65，10至60，11至60，12至60，13至60，14至60，15至60，16至60，17至60，18至60，19至60，20至60，21至60，22至60，23至60，24至60，25至60，10至55，11至55，12至55，13至55，14至55，15至55，16至55，17至55，18至55，19至55，20至55，21至55，22至55，23至55，24至55，25至55，10至50，11至50，12至50，13至50，14至50，15至50，16至50，17至50，18至50，19至50，20至50，21至50，22至50，23至50，24至50，25至50，10至45，11至45，12至45，13至45，14至45，15至45，16至45，17至45，18至45，19至45，20至45，21至45，22至45，23至45，24至45，25至45，10至40，11至40，12至40，13至40，14至40，15至40，16至40，17至40，18至40，19至40，20至40，21至40，22至40，23至40，24至40，25至40，10至38，11至38，12至38，13至38，14至38，15至38，16至38，17至38，1 8至38，19至38，20至38，21至38，22至38，23至38，24至38，25至38，10至36，11至36，12至36，13至36，14至36，15至36，16至36，17至36，18至36，19至36，20至36，21至36，22至36，23至36，24至36，25至36，10至35，11至35，12至35，13至35，14至35，15至35，16至35，17至35，18至35，19至35，20至35，21至35，22至35，23至35，24至35，25至35，10至34，11至34，12至34，13至34，14至34，15至34，16至34，17至34，18至34，19至34，20至34，21至34，22至34，23至34，24至34，25至34，10至33，11至33，12至33，13至33，14至33，15至33，16至33，17至33，18至33，19至33，20至33，21至33，22至33，23至33，24至33，25至33，10至32，11至32，12至32，13至32，14至32，15至32，16至32，17至32，18至32，19至32，20至32，21至32，22至32，23至32，24至32，25至32，10至30，11至30，12至30，13至30，14至30，15至30，16至30，17至30，18至30，19至30，20至30，21至30，22至30，23至30，24至30，25至30，10至29，11至29，12至29，13至29，14至29，15至29，16至29，17至29，18至29，19至29，20至29，21至29，22至29，23至29，24至29，25至29，10至28，11至28，12至28，13至28，14至28，15至28，16至28，17至28，18至28，19至28，20至28，21至28，22至28，23至28，24至28，25至28，10至27，11至27，12至27，13至27，14至27，15至27，16至27，17至27，18至27，19至27，20至27，21至27，22至27，23至27，24至27，25至27，10至26，11至26，12至26，13至26，14至26，15至26，16至26，17至26，18至26，19至26，20至26，21至26，22至26，23至26，24至26，25至26，10至25，11至25，12至25，13至25，14至25，15至25，16至25，17至25，18至25，19至25，20至25，21至25，22至25，23至25，24至25，10至24，11至24，12至24，13至24，14至24，15至24，16至24，17至24，18至24，19至24，20至24，21至24，22至24，23至24，10至23，11至23，12至23，13至23，14至23，15至23，16至23，17至23，18至23，19至23，20至23，21至23，22至23，10至22，11至22，12至22，13至22，14至22，15至22，16至22，17至22，18至22，19至22，20至22，21至22，10至21，11至21，12至21，13至21，14至21，15至21，16至21，17至21，18至21，19至21，20至21，10至20，11至20，12至20，13至20，14至20，15至20，16至20，17至20，1 8至20，19至20，10至19，11至19，12至19，13至19，14至19，15至19，16至19，17至19，18至19，10至18，11至18，12至18，13至18，14至18，15至18，16至18，17至18，10至17，11至17，12至17，13至17，14至17，15至17，16至17，10至16，11至16，12至16，13至16，14至16，15至16，10至15，11至15，12至15，13至15和14至15个核苷酸。杂交序列的长度从其5’端到3’端可以为10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，33，32，33，34，35，36，37，38，39，40，44，42，43，44，45，46，47，48，49，50，55，52，53，54，55，56，57，58，59，60，66，62，63，64，65，66，67，68，69，或70个核苷酸。

合适的杂交序列的示例包括SEQ ID NOs：12至36和43至111任何一种。本发明的反义寡聚物可以包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NOs：12至36和43至111中的任何一种(在下文中称为“合适的杂交序列”或“合适的杂交序列”)。

本发明的反义寡聚物可以不必仅包含杂交序列。只要本发明的反义寡聚物保持了对选自下组：ACVR2B的外显子5，6，7，8，9，10和11，或下组：ACVR2B的外显子5，6，7，8，9，和10的至少一个外显子的跳过活性，则本发明的反义寡聚物可以包含上述合适的杂交序列的部分序列。在一些实施方式中，本发明的反义寡聚物可以包含以下中公开的序列中任何一个的10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24个连续核苷酸：SEQ ID NOs：12至36和43至111。在另一个实施方式中，本发明的反义寡聚物可以包含以下中公开的序列中任何一个中的至少10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24个连续核苷酸：SEQ IDNOs：12至36和43至111。

本发明的反义寡聚物可以不必仅包含杂交序列。只要本发明的反义寡聚物保持了对选自下组：ACVR2B的外显子5，6，7，8，9，10和11，或下组：ACVR2B的外显子5，6，7，8，9，和10的至少一个外显子的跳过活性，则本发明的反义寡聚物可以包含不与靶区域互补的其他序列(碱基)。

本发明的反义寡聚物所靶向的序列的示例包括ACVR2B前-mRNA的外显子的任何序列，例如外显子1至11。合适地，靶序列包括选自下组：ACVR2B前-mRNA的外显子7，8，9，10和11，或下组：ACVR2B前-mRNA的外显子5，6，7，8，9和10的至少一个外显子的任何序列。在一个实施方式中，ACVR2B前-mRNA的靶序列包括选自下组的至少一个外显子的任何序列：外显子5，6，7，9和10。在另一个实施方式中，ACVR2B前-mRNA的靶序列包括选自下组的至少一个外显子的任何序列：外显子5，6，9和10。在另一个实施方式中，ACVR2B前-mRNA的靶序列包括选自下组的至少一个外显子的任何序列：外显子5，6和10。在另一个实施方式中，ACVR2B前-mRNA的靶序列包括选自下组的至少一个外显子的任何序列：外显子5和6。在另一个实施方式中，ACVR2B前-mRNA的靶序列包括选自下组的至少一个外显子的任何序列：外显子7，8和9。在另一个实施方式中，ACVR2B前-mRNA的靶序列包括选自下组的至少一个外显子的任何序列：外显子7和8。在另一个实施方式中，ACVR2B前-mRNA的靶序列是外显子5。在另一个实施方式中，ACVR2B前-mRNA的靶序列是外显子6。在另一个实施方式中，ACVR2B前-mRNA的靶序列是外显子7。在另一个实施方式中，ACVR2B前-mRNA的靶序列是外显子8。在另一个实施方式中，ACVR2B前-mRNA的靶序列是外显子9。在另一个实施方式中，ACVR2B前-mRNA的靶序列是外显子10。在另一个实施方式中，ACVR2B前-mRNA的靶序列is外显子11。在另一个实施方式中，ACVR2B前-mRNA的靶序列包括选自下组：外显子7，8，9和10，或下组：外显子5，6，7，8，9和10的至少一个外显子的任何序列。

在特定实施方式中，本发明的寡聚物具有杂交序列，该杂交序列的长度与寡聚物的长度相同或者比寡聚物短1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个核苷酸。例如，寡聚物的长度可以是24个核苷酸，并且可以具有相同长度的杂交序列，即寡聚物中的所有24核苷酸均与靶区域互补，或者其可以具有长度为20个核苷酸的杂交序列(比寡聚物长度短4个)，因此寡聚物也具有4个不与靶区域互补(因此也不是杂交序列的一部分)的核苷酸。此类寡聚物可以，例如，在杂交序列的每一侧上具有不与靶区域互补的两个核苷酸，或者在一侧上有3个并且在另一侧上有一个，或者在一侧上有4个。

除了杂交序列或部分杂交序列之外，本发明的反义寡聚物可以包含其他序列，所述其他序列可以有助于或不会有助于与靶序列杂交。此类其他序列可以附接到杂交序列或部分杂交序列的5′端，3′端或两端。在这种情况下，本发明的反义寡聚物的总长度落入本发明的反义寡聚物的示例性长度范围内或符合本发明的反义寡聚物的示例性长度。

在另一个实施方式中，本发明的反义寡聚物可以有如下由如下中任何一个所示的核苷酸序列组成：SEQ ID NOs：12至36和43至111。在一些实施方式中，本发明的反义寡聚物可以有如下中任何一个所示的序列的5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24个连续核苷酸组成：SEQ ID NOs：12至36和43至111。

在另一个实施方式中，本发明提供了缀合物，其中功能肽(例如细胞穿透肽(CPP))与本发明的反义寡聚物结合。公众已知的功能肽或可商业获得的功能肽可以用于本发明中。可以用于本发明的功能肽包括，例如，WO2008/036127中公开的富含精氨酸的肽；或WO2009/005793中公开的靶向器官的肽，例如RXR，RBR等；或WO2012/150960公开的包含氨基酸亚单位的肽。细胞穿透肽(CPPs)表示10至约30个氨基酸的短肽序列，其可穿过哺乳动物的细胞膜，因此可以改善细胞药物递送(参见，例如，Hum Mol Genet.2011 Aug15；20(16)：3151-3160；Pharmacology＆Therapeutics154(2015)78-86)。公众已知的CPPs或可商业获得的CPPs可以用于本发明中。可以用于本发明中的CPPs包括，例如；Pharmacology＆Therapeutics154(2015)78-86中第80页上的表1中所列出的CPPs，例如TAT(48-60)，penetratin，聚精氨酸(polyarginine)，Oct4，WT1-pTj，DPV3，Transportan，MAP，VP22，Repl，KW，KFGF，FGF12，Intefrinβ3肽，C105Y，TP2；JP-A-2017-500856(WO2015/089487)第[0085]段，表1中列出的CPPs，例如DPV10/6，DPV15b，YM-3，Tat，LR11，C45D18，Lyp-1，Lyp-2，BMVGAG，hLF1-22，C45D18，LR20等。CPPs可从例如Funakoshi，Co.，Ltd.商业获得。可商业获得的CPPs(例如TAT(Funakoshi，Co.，Ltd.)，penetratin(Funakoshi，Co.，Ltd.)等)，或者公众已知的CPPs(例如R8等)可以用于本发明中。可以用于本发明中的优选的CPPs包括，例如，hLIMK，TAT，penetratin，R8等(参见WO2016/187425，WO2018/118662，WO2018/118599，WO2018/118627，EBioMedicine45(2019)630-645等)。CPP可以与本发明的反义寡聚物直接结合，或者可以通过能将CPP与反义寡聚物结合的连接子来结合。公众已知的连接子可以用于本发明中。此类连接子包括，例如，以下中所述的那些：JP-A-2017-500856(WO2015/089487)，WO2015/089487，WO2009/073809，WO2013/075035，WO2015/105083，WO2014/179620，WO2015/006740，WO2017/010575等。可用于本发明中的优选的连接子包括，例如，4-马来酰亚胺基丁酸，能经由二硫键附接到功能肽或本发明的反义寡聚物等的连接子。本发明的缀合物可以通过本领域普通技术人员公知的方法制备。

跳过效率：

通过如下方式可以评估或确认特定寡聚物是否能够影响ACVR2B基因中的一个或多个外显子的跳过：将本发明的反义寡聚物引入表达ACVR2B的细胞(例如，人横纹肉瘤细胞)中，通过RT-PCR或对PCR扩增产物进行序列分析，从ACVR2B表达细胞的总RNA中扩增编码ACVR2B胞内区的ACVR2B mRNA区域。

可以如下测定跳过效率：测定RT-PCR反应溶液中有外显子跳过的PCR扩增产物中的多核苷酸水平“A”(例如，截短的ACVR2B的mRNA量)和无外显子跳过的PCR扩增产物中的多核苷酸水平“B”(如全长ACVR2B的mRNA量)，然后根据这些测量值“A”和“B”根据以下等式进行计算。

跳过效率(％)＝{A/(A+B)}×100

在一个优选实施方式中，本发明的反义寡聚物导致外显子跳过的效率为10％或更多，15％或更多，20％或更多，25％或更多，30％或更多，35％或更多，40％或更多，45％或更多，50％或更多，55％或更多，60％或更多，62.5％或更多，65％或更多，67.5％或更多，70％或更多，72.5％或更多，75％或更多，77.5％或更多，80％或更多，82.5％或更多，85％或更多，87.5％或更多，90％或更多，92.5％或更多，95％或更多，97.5％或更多，98％或更多，或者99％或更多。

一旦识别出有效的反义寡聚物，技术人员可以通过设计具有与有效的反义寡聚物的序列重叠的序列的各种反义寡聚物并使用如本文所述的程序测试它们来寻求识别更优化的序列。

寡核苷酸，吗啉代寡聚物或肽核酸寡聚物：

本发明的反义寡聚物可以是寡核苷酸，吗啉代寡聚物或肽核酸(PNA)寡聚物，以上每一种均在本发明的反义寡聚物的示例性长度范围内或具有本发明的反义寡聚物的示例性长度。

以上寡核苷酸(在下文中称为“本发明的寡核苷酸”)是本发明的反义寡聚物，其构成单元是核苷酸，此类核苷酸可以是核糖核苷酸，脱氧核糖核酸或修饰的核苷酸中的任何一种。

反义寡核苷酸通常是单链的。

修饰的核苷酸是指其核碱基、糖部分和磷酸键部分全部或部分地被修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。

在本发明中，核碱基的示例包括腺嘌呤，鸟嘌呤，次黄嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，尿嘧啶，或其修饰碱基。此类修饰的碱基可以如以下所例示：假尿嘧啶，3-甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，5-烷基胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶)，5-烷基尿嘧啶(例如，5-乙基尿嘧啶)，5-卤代尿嘧啶(例如，5-溴代尿嘧啶)，6-氮杂嘧啶，6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿嘧啶)，2-硫代尿嘧啶，4-硫代尿嘧啶，4-乙酰基胞嘧啶，5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶，5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶，5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶，1-甲基腺嘌呤，1-甲基次黄嘌呤，2，2-二甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，N6-甲基腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲基羰基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，5-甲基-2-硫代尿嘧啶，2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧基乙酸，2-硫代胞嘧啶，嘌呤，2，6-二氨基嘌呤，2-氨基嘌呤，异鸟嘌呤，吲哚，咪唑，黄嘌呤等，但不限于此。

对糖部分的修饰可以如以下所例示：在核糖2’-位置处的修饰和在糖的其他位置处的修饰。在核糖的2’-位置处的修饰的示例包括旨在用以下基团替代核糖的2’-位置处的-OH基团的修饰：OR，R，R′OR，SH，SR，NH₂，NHR，NR₂，N₃，CN，F，Cl，Br或I，其中R代表烷基或芳基，R′代表亚烷基。

在糖的其他位置处的修饰的示例包括在核糖或脱氧核糖的4’-位置处用S替换氧，以及在糖的2’-和4’-位置之间的桥接，如LNAs(锁核酸)或ENAs(2′-O，4′-C-亚乙基-桥接的核酸)所例示的，但不限于此。

对磷酸键部分的修饰可以如旨在用以下代替磷酸二酯键的修饰所例示：硫代磷酸键，二硫代磷酸键，烷基膦酸键，氨基磷酸酯键或硼烷膦酸键(Enya等人：Bioorganic＆Medicinal Chemistry，2008，18，9154-9160)(参见，例如，JP WO2006/129594和JP WO2006/038608)。

在本发明中，烷基优选是包含1至6个碳原子的直链或支链的烷基。更具体而言，示例包括甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，正戊基，异戊基，新戊基，叔戊基，正己基和异己基。此类烷基可以被包括卤素，烷氧基，氰基，硝基等的1-3个取代基取代。

在本发明中，环烷基优选是包含5至12个碳原子的环烷基。更具体而言，示例包括环戊基，环己基，环庚基，环辛基，环癸基和环十二烷基。

在本发明中，卤素包括氟，氯，溴和碘。

烷氧基可以是包含1至6个碳原子的直链或支链的烷氧基，如以下所例示的：甲氧基，乙氧基，正丙氧基，异丙氧基，正丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，正戊氧基，异戊氧基，正己氧基，异己氧基等。特别优选的是包含1至3个碳原子的烷氧基。

在本发明中，芳基优选是包含6至10个碳原子的芳基。更具体而言，示例包括苯基，α-萘基和β-萘基。特别优选的是苯基。此类芳基可以被1至3个取代基取代，包括烷基，卤素，烷氧基，氰基，硝基等的1至3个取代基取代。

在本发明中，亚烷基优选是包含1至6个碳原子的直链或支链亚烷基。更具体而言，示例包括亚甲基，亚乙基，亚丙基，亚丁基，亚戊基，亚己基，2-(乙基)亚丙基和1-(甲基)亚丁基。

在本发明中，酰基可以是直链或支链的烷酰基或芳酰基。此类烷酰基的示例包括甲酰基，乙酰基，2-甲基乙酰基，2，2-二甲基乙酰基，丙酰基，丁酰基，异丁酰基，戊酰基，2，2-二甲基丙酰基，己酰基等。芳酰基的示例包括苯甲酰基，甲苯酰基和萘酰基。此类芳酰基可以在任何一个可取代位置上被取代，并且可以被烷基取代。

本发明的寡核苷酸优选地为组成单元是以下通式所示基团的根据本发明的反义寡聚物，其中核糖的2’-位置处的-OH基团被甲氧基取代，并且磷酸键部分是硫代磷酸键：

(其中Base代表核碱基)。

本发明的寡核苷酸可以用各种自动合成仪(例如，FOCUS(Aapptec)，AKTAoligopilot plus 10/100(GE Healthcare))容易地合成，或者可替代地，其合成可以被委托给第三方(例如，Promega，Takara，或Japan Bio Services)等。

本发明的吗啉代寡聚物是组成单元是以下通式所示基团的根据本发明的反义寡聚物：

(其中Base与以上定义相同；W代表下式中任何一个所示的基团：

(其中X代表-CH₂R¹，-O-CH₂R¹，-S-CH₂R¹，-NR²R³或F；

R¹代表H或烷基；

R²和R³可以相同或不同，各自代表H，烷基，环烷基或芳基；

Y₁代表0，S，CH₂或NR¹；

Y₂代表0，S或NR¹；和

Z代表0或S))。

吗啉代寡聚物优选是其组成单元是下式所示基团的寡聚物(即，磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(在下文中称为”PMO”))：

(其中Base，R²和R³与以上定义相同)。

例如，吗啉代寡聚物可以根据WO1991/009033或WO2009/064471制备。特别是，PMO可以根据WO2009/064471中所述程序制备，或者可以根据以下所示程序制备。

[PMO制备方法]

作为PMO的一个实施方式，下式(I)所示化合物(在下文中称为PMO(I))可以通过举例的方式给出：

[其中每个Base，R²和R³与以上定义相同；n是1至99范围内的任何整数，合适地为13至29，14至28或15至27，16至26，17至25范围内的任何整数]。

PMO(I)可以根据已知程序制备，例如，通过如下步骤中所示地进行操作。

以下步骤中所用的化合物和试剂不以任何方式受限制，只要它们常用于PMO制备即可。此外，所有以下步骤可以通过液相方法或固相方法实施(根据工艺规范或使用可商业获得的固相自动合成仪)。当通过固相方法制备PMO时，理想的是使用自动合成仪以简化操作和精确合成。

(1)步骤A：

此步骤为将以下通式(II)所示的化合物(在下文中称为化合物(II))用酸处理以制备以下通式(III)所示的化合物(在下文中称为化合物(III))：

[其中n，R²和R³与以上定义相同；

每个B^P独立地代表可以被保护的核碱基；

T代表三苯甲基基团，单甲氧基三苯甲基基团或二甲氧基三苯甲基基团；和

L代表氢，酰基或以下通式(IV)所示基团(在下文中称为基团(IV))]：

可用于B^P的“核碱基”可如针对Base列举的相同“核碱基”所例示，条件是这些用于B^P的核碱基中的氨基基团或羟基基团可以被保护。

这些氨基基团的保护基团不以任何方式受限制，只要它们用作用于核酸的保护基团即可。更具体而言，示例包括苯甲酰基，4-甲氧基苯甲酰基，乙酰基，丙酰基，丁酰基，异丁酰基，苯乙酰基，苯氧基乙酰基，4-叔丁基苯氧基乙酰基，4-异丙基苯氧基乙酰基，和(二甲基氨基)亚甲基。用于羟基基团的保护基团包括，例如，2-氰基乙基，4-硝基苯乙基，苯基磺酰基乙基，甲基磺酰基乙基，三甲基甲硅烷基乙基，可以在任何可取代位置处被1至5个吸电子基团取代的苯基，二苯基氨基甲酰基，二甲基氨基甲酰基，二乙基氨基甲酰基，甲基苯基氨基甲酰基，1-吡咯烷基氨基甲酰基，吗啉基氨基甲酰基，4-(叔丁基羧基)苄基，4-[(二甲基氨基)羧基]苄基，和4-(苯基羧基)苄基(参见，例如，WO2009/064471)。

“固体载剂”不以任何方式受限制，只要其是可用于核酸的固相反应的载剂即可，但理想的是使用例如如下的载剂：其(i)可用于合成吗啉代核酸衍生物的试剂(例如，二氯甲烷，乙腈，四唑，N-甲基咪唑，吡啶，乙酸酐，二甲基吡啶，三氟乙酸)中难溶，(ii)相对于可用于合成吗啉代核酸衍生物的试剂化学稳定，(iii)可以是经化学修饰的，(iv)可以载有所需的吗啉代核酸衍生物，(v)具有足以耐受处理期间的高压的强度，和(vi)具有一定范围内的粒径和分布。更具体而言，示例包括溶胀型聚苯乙烯(例如，用二乙烯苯交联的氨基甲基聚苯乙烯树脂(200至400目)(2.4至3.0mmol/g)(Tokyo Chemical Industry Co.，Ltd.，Japan)，氨基甲基化聚苯乙烯树脂HCl[二乙烯苯1％，100至200目](Peptide Institute，Inc.，Japan))，非溶胀型苯乙烯(例如，Primer Support(GE Healthcare))，PEG链样苯乙烯(例如，NH₂-PEG树脂(Watanabe Chemical Industries，Ltd.，Japan)，TentaGel树脂)，可控孔度玻璃(CPG)(例如，CPG Inc.的产品)，草酰化可控孔度玻璃(参见，例如，Alul等人，核酸Research，Vol.19，1527(1991))，TentaGel载体(TentaGel support)-氨基聚乙二醇-衍生的载体(support)(参见，例如，Wright等人，Tetrahedron Letters，Vol.34，3373(1993))，和Poros-聚苯乙烯/二乙烯苯共聚物。

作为“连接子”，可以使用通常用于连接核酸或吗啉代核酸衍生物的已知连接子。合适的示例包括3-氨基丙基，琥珀酰基，2，2′-二乙醇磺酰基，和长链烷基氨基(LCAA)。

可用于该步骤的“酸”的示例包括三氟乙酸，二氯乙酸或三氯乙酸。所用的酸的量为，例如，相对于1摩尔的化合物(II)，在0.1摩尔当量至1000摩尔当量范围内，例如在1摩尔当量至100摩尔当量范围内。

此外，可以将有机胺与上述酸共同使用。任何有机胺可以用于该目的，示例包括三乙胺。所用的有机胺的量为，例如，相对于1摩尔酸，合理地在0.01摩尔当量至10摩尔当量范围内，例如在0.1摩尔当量至2摩尔当量范围内。

在酸和有机胺在该步骤中作为盐或混合物使用的情况下，示例包括三氟乙酸和三乙胺的盐或混合物，更具体为包含2当量的三氟乙酸和1当量的三乙胺的混合物。

可用于该步骤中的酸可以通过如下方式使用：用合适的溶剂稀释以得到0.1％至30％范围内的浓度。任何溶剂可用于此目的，只要其对反应是惰性的即可，示例包括二氯甲烷，乙腈，醇(例如，乙醇，异丙醇，三氟乙醇)，水，或其混合物。

以上反应中的反应温度在10℃至50℃范围内，例如在20℃至40℃范围内或在25℃至35℃范围内。

反应时间将可变，取决于所用的酸的类型和/或反应温度，但通常在0.1分钟至24小时范围内，合适地在1分钟至5小时范围内。

此外，在该步骤完成之后，可以任选地添加碱以中和系统中剩余的酸。任何“碱”可用于此目的，示例包括二异丙基乙胺。此类碱可以通过如下方式使用：用合适的溶剂稀释以得到0.1％(v/v)至30％(v/v)范围内的浓度。

任何溶剂可用于该步骤中，只要其对反应是惰性的即可，示例包括二氯甲烷，乙腈，醇(例如，乙醇，异丙醇，三氟乙醇)，水，或其混合物。反应温度在例如10℃至50℃范围内，例如在20℃至40℃范围内，和合适地在25℃至35℃范围内。

反应时间将可变，取决于所用的碱的类型和/或反应温度，但通常在0.1分钟至24小时范围内，合适地在1分钟至5小时范围内。

应注意，其中n＝1和L为基团(IV)的化合物(II)，即，以下通式(IIa)所示的化合物(在下文中称为化合物(IIa))可以根据以下程序制备：

[其中B^P，T，连接子和固体载剂与以上定义相同]。

步骤1：

此步骤为用酰化剂处理以下通式(V)所示的化合物以制备以下通式(VI)所示的化合物(在下文中称为化合物(VI))：

[其中B^P，T和连接子与以上定义相同；和

R⁴代表羟基基团，卤素，羧基基团或氨基]。

可以通过用于连接子导入的任何已知反应从化合物(V)开始实施此步骤。

特别是，以下通式(VIa)的所示的化合物可以通过已知为酯化反应的任何方法使用化合物(V)和琥珀酸酐来制备：

[其中B^P和T与以上定义相同]。

步骤2：

此步骤为通过用缩合剂或类似试剂处理而使化合物(VI)与固体载剂反应以制备化合物(IIa)：

[其中B^P，R⁴，T，连接子和固体载剂与以上定义相同]。

此步骤可以通过已知为缩合反应的任何方法使用化合物(VI)和固体载剂来实施。

可以通过将本文中所述用于PMO制备的方法的步骤A和B重复所需次数，从化合物(IIa)开始制备其中n＝2至99(合适地，13至29，14至28，15至27，16至26，或17至25范围内的任何整数)和L是基团(IV)的化合物(II)，即，以下通式(IIa2)所示的化合物：

[其中B^P，R²，R³，T，连接子和固体载剂与以上定义相同；和

n′代表1至98(在特定实施方式中，n′代表1至28，1至27，1至26，1至25，或1至24)]。

(2)步骤B：

此步骤为在碱的存在下用吗啉代单体化合物处理化合物(III)以制备以下通式(VII)所示的化合物(在下文中称为化合物(VII))：

[其中每个B^P，L，n，R²，R³和T与以上定义相同]。

此步骤可以通过在碱的存在下用吗啉代单体化合物处理化合物(III)来实施：

此类吗啉代单体化合物可由以下通式(VIII)所示的化合物来例示：

[其中B^P，R²，R³和T与以上定义相同]。

可用于该步骤中的“碱”的示例包括二异丙基乙胺，三乙胺或N-乙基吗啉。相对于1摩尔化合物(III)，所用的碱的量在例如1摩尔当量至1000摩尔当量范围内，合适地，在10摩尔当量至100摩尔当量范围内。

此类吗啉代单体化合物和可用于此步骤中的碱可以通过如下方式使用：用合适的溶剂稀释以得到0.1％至30％的浓度。任何溶剂可用于此目的，只要其对反应是惰性的即可，示例包括N，N-二甲基咪唑烷酮，N-甲基哌啶酮，DMF，二氯甲烷，乙腈，四氢呋喃，或其混合物。

反应温度在例如0℃至100℃范围内，合适地，在10℃至50℃范围内。

反应时间将可变，取决于所用的碱的类型和/或反应温度，但通常在1分钟至48小时范围内，合适地，在30分钟至24小时范围内。

此外，在此步骤完成之后，可以任选地添加酰化剂。“酰化剂”包括乙酸酐，乙酰氯和苯氧基乙酸酐。此类酰化剂可以通过如下方式使用：用合适的溶剂稀释以得到0.1％至30％范围内的浓度，举例来说。任何溶剂可用于此目的，只要其对反应是惰性的即可，示例包括二氯甲烷，乙腈，四氢呋喃，醇(例如，乙醇，异丙醇，三氟乙醇)，水，或其混合物。

如果必要，可以使用将碱(例如，吡啶，二甲基吡啶，三甲基吡啶，三乙胺，二异丙基乙胺，N-乙基吗啉)与酰化剂共同使用。所用的酰化剂的量合适地在0.1摩尔当量至10000摩尔当量范围内，更合适地在1摩尔当量至1000摩尔当量范围内。相对于1摩尔酰化剂，所用的碱的量在例如0.1摩尔当量至100摩尔当量范围内，合适地在1摩尔当量至10摩尔当量范围内。

该反应中的反应温度合适地在10℃至50℃范围内，例如在20℃至40℃范围内，合适地，在25℃至35℃范围内。反应时间将可变，例如，取决于所用的酰化剂的类型和/或反应温度，但通常在0.1分钟至24小时范围内，合适地在1分钟至5小时范围内。

(3)步骤C：

此步骤为使用去保护剂从步骤B中制备的化合物(VII)去除保护基团，从而制备通式(IX)所示的化合物：

[其中Base，B^P，L，n，R²，R³和T与以上定义相同]。

此步骤可以通过用去保护剂处理化合物(VII)来实现。

“去保护剂”的示例包括浓氨水和甲胺。可用于此步骤中的此类“去保护剂”可以通过如下方式使用：用水，甲醇，乙醇，异丙醇，乙腈，四氢呋喃，DMF，N，N-二甲基咪唑烷酮，N-甲基哌啶酮，或其混合溶剂稀释。其中，优选的是乙醇。相对于1摩尔化合物(VII)，所用的去保护剂的量在例如1摩尔当量至100000摩尔当量范围内，合适地，在10摩尔当量至1000摩尔当量范围内。

反应温度在例如15℃至75℃范围内，合适地在40℃至60℃范围内，或者在50℃至60℃范围内。用于去保护的反应时间将可变，取决于化合物(VII)的类型和/或反应温度等，但合理地在10分钟至30小时范围内，合适地30分钟至24小时在范围内，更合适地在5小时至20小时范围内。

(4)步骤D：

此步骤为用酸处理步骤C中制备的化合物(IX)以制备PMO(I)：

[其中Base，n，R²，R³和T与以上定义相同]。

此步骤可以通过将酸添加到化合物(IX)来实施。

可用于此步骤的“酸”的示例包括三氯乙酸，二氯乙酸，乙酸，磷酸和盐酸等。关于所用的酸的量，合理的是使用一定量的酸以得到一定的溶液pH，例如，在0.1至4.0范围内，合适地在1.0至3.0范围内。任何溶剂可用于该步骤中，只要其对反应是惰性的即可，示例包括乙腈，水，或其混合溶剂。

反应温度合适地在10℃至50℃范围内，例如在20℃至40℃范围内或在25℃至35℃范围内。用于去保护的反应时间将可变，取决于化合物(IX)的类型和/或反应温度等，但合适地在0.1分钟至5小时范围内，例如在1分钟至1小时范围内，更合适地在1分钟至30分钟范围内。

可以通过常用的分离和纯化措辞从此步骤中得到的反应混合物得到PMO(I)：包括萃取，浓缩，中和，过滤，离心，重结晶，C₈至C₁₈反相柱色谱，阳离子交换柱色谱，阴离子交换柱色谱，凝胶过滤柱色谱，高效液相色谱，渗析，超滤和其他措施，以上可以单独施用或组合使用，其中所需的PMO(I)可以被分离和纯化(参见，例如，WO1991/09033)。

在使用反相色谱用于纯化PMO(I)的情况下，可以使用20mM三乙胺/乙酸盐缓冲液和乙腈的混合溶液作为洗脱溶剂，举例来说。

同样，在使用离子交换色谱用于纯化PMO(I)的情况中，可以使用1M氯化钠水溶液和10mM氢氧化钠水溶液的混合溶液，举例来说。

肽核酸寡聚物是组成单元是以下通式所示基团的根据本发明的反义寡聚物：

(其中Base与以上定义相同)。

可以根据例如以下列出的文献制备肽核酸。

1)P.E.Nielsen，M.Egholm，R.H.Berg，O.Buchardt，Science，254，1497(1991)

2)M.Egholm，O.Buchardt，P.E.Nielsen，R.H.Berg，Jacs.，114，1895(1992)

3)K.L.Dueholm，M.Egholm，C.Behrens，L.Christensen，H.F.Hansen，T.Vulpius，K.H.Petersen，R.H.Berg，P.E.Nielsen，O.Buchardt，J.Org.Chem.，59，5767(1994)

4)L.Christensen，R.Fitzpatrick，B.Gildea，K.H.Petersen，H.F.Hansen，T.Koch，M.Egholm，O.Buchardt，P.E.Nielsen，J.Coull，R.H.Berg，J.Pept.Sci.，1，175(1995)

5)T.Koch，H.F.Hansen，P.Andersen，T.Larsen，H.G.Batz，K.Otteson，H.Orum，J.Pept.Res.，49，80(1997)

本发明的反义寡聚物可以配置为使其5′-末端为以下所示化学式(1)至(3)所示基团中的任何一个，(3)-OH是优选的。

如上所述，功能肽(例如，CPP(细胞穿透肽))可以不使用连接子或通过连接子结合到反义寡聚物。当功能肽通过连接子结合到反义寡聚物时，额外的氨基酸可以附接到功能肽。在一个优选实施方式中，功能肽可以在5′-末端或3′-末端结合到磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(“PMO”)，结合到3′-末端是优选的。另外，在一个优选实施方式中，功能肽的C-末端可以结合到PMO。

药学上可接受的盐和水合物

本发明的化合物(例如反义寡聚物)的药学上可接受的盐的示例包括碱金属盐(例如，钠盐，钾盐，锂盐)；碱土金属盐(例如，钙盐，镁盐)；金属盐(例如，铝盐，铁盐，锌盐，铜盐，镍盐，钴盐)；铵盐；有机胺盐(例如，叔辛基胺盐，二苄基胺盐，吗啉盐，葡糖胺盐，苯基甘氨酸烷基酯盐，乙二胺盐，N-甲基葡糖胺盐，胍盐，二乙胺盐，三乙胺盐，二环己胺盐，N，N′-二苄基乙二胺盐，氯普鲁卡因盐，普鲁卡因盐，二乙醇胺盐，N-苄基-苯乙胺盐，哌嗪盐，四甲基铵盐盐，三(羟甲基)氨基甲烷盐)；卤化氢酸(halogenated hydroacid)盐(例如，氢氟酸盐，盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐)；无机酸盐(即，硝酸盐，高氯酸盐，硫酸盐，磷酸盐)；低级烷磺酸盐(例如，甲烷磺酸盐，三氟甲烷磺酸盐，乙烷磺酸盐)；芳基磺酸盐(例如，苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐)：有机酸盐(例如，乙酸盐，苹果酸盐，富马酸盐，琥珀酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，草酸盐，马来酸盐)；氨基酸盐(例如，甘氨酸盐，赖氨酸盐，精氨酸盐，鸟氨酸盐，谷氨酸盐，天冬氨酸盐)等，这些盐可以以任何已知方式制备。

本发明的化合物(例如反义寡聚物)的水合物可以以任何已知方式制备。

具体实施方式

本发明的反义寡聚物包括例如具有本发明的反义寡聚物的示例性长度范围的长度或具有本发明的反义寡聚物的示例性长度的寡核苷酸，吗啉代寡聚物或PNA。在特定实施方式中，寡核苷酸是其中寡核苷酸中的至少一个糖部分和/或至少一个磷酸键部分被修饰的反义寡聚物。

在特定实施方式中，本发明的反义寡核苷酸包含至少一个修饰的糖部分，该修饰的糖部分是其中2′-位置处的-OH基团被选自下组的任何基团取代的核糖：OR，R，R′OR，SH，SR，NH₂，NHR，NR₂，N₃，CN，F，Cl，Br和I(其中R代表烷基或芳基，R′代表亚烷基)。

在特定实施方式中，寡核苷酸包含选自下组的至少一个修饰的磷酸键部分：硫代磷酸酯键，二硫代磷酸键，烷基膦酸键，氨基磷酸酯键和硼烷膦酸键。

在特定实施方式中，寡核苷酸是包含至少一个吗啉环的反义寡聚物。在特定实施方式中，反义是吗啉代寡聚物或磷酸二酰胺吗啉代寡聚物。

在其他实施方式中，反义寡聚物在其5’-末端具有以下化学式(1)至(3)所示基团中的任何一个。

实施例部分中所测试的所有反义寡聚物可以采用如上所述的任何化学修饰。

如上所述，功能肽(例如，CPP(细胞穿透肽))可以不使用连接子或通过连接子结合到反义寡聚物。当功能肽通过连接子结合到反义寡聚物时，额外的氨基酸可以附接到功能肽。在一个优选实施方式中，功能肽可以在5′-末端或3′-末端结合到磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(“PMO”)。

药物组合物

根据本发明的第二方面，提供了药物组合物，其包含本发明的化合物(例如本发明的反义寡聚物)或其药学上可接受的盐或水合物作为活性成分(在下文中称为“本发明的药物组合物”)。

在特定实施方式中，药物组合物包含上述寡聚物或寡核苷酸中的任何一种，或其药物盐或水合物，和至少一个药学上可接受的添加剂和/或载剂。

用于本发明的合适的制剂Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Philadelphia，Pa.，17th ed.，1985中发现。为简要地回顾药物递送方法，参见，例如，Langer(Science 249：1527-1533，1990)。

载剂可以用于促进寡聚物到肌肉组织的递送。此类载剂不以任何方式受限制，只要其药学上可接受的即可。合适的示例包括阳离子载剂(例如，阳离子脂质体，阳离子聚合物)或基于病毒包膜的载剂。阳离子脂质体的示例包括由2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油和磷脂作为基本构成部件形成的脂质体(在下文中称为“脂质体A”)，Oligofectamine(Invitrogen)，

(Invitrogen)，Lipofectamine(Invitrogen)，Lipofectamine

(Invitrogen)，

(Invitrogen)，

(Gene Therapy Systems)，

(QIAGEN)，TransIT

(Mirus)和Nucleofector II(Lonza)。其中，优选的是脂质体A。阳离子聚合物的示例包括

(Qbiogene)和

(聚乙烯亚胺，Qbiogene)。基于病毒包膜的载剂的示例包括

(HVJ-E脂质体，Ishihara Sangyo Kaisha，Ltd.，Japan)。可替代地，还可以使用日本专利第2924179号中所示的药用器件或JP WO2006/129594和JP WO2008/096690中所示的阳离子载剂。

对于更多细节，可以参见美国专利第4,235,871和4,737,323号，WO96/14057，“NewRRC，Liposomes：A practical approach，IRL Press，Oxford(1990)pages 33-104，”等。

除了本发明的反义寡聚物或其药学上可接受的盐或水合物和/或如上所述的载剂之外，本发明的药物组合物还可以任选地包含药学上可接受的添加剂。此类添加剂的示例包括乳化助剂(例如，包含6至22个碳原子的脂肪酸或其药学上可接受的盐，白蛋白，葡聚糖)，稳定剂(例如，多个层，磷脂酸)，等渗剂(例如，氯化钠，葡萄糖，麦芽糖，乳糖，蔗糖，海藻糖)，和pH调节剂(例如，盐酸，硫酸，磷酸，乙酸，氢氧化钠，氢氧化钾，三乙醇胺)。这些添加剂可以单独或组合使用。本发明的药物组合物中的添加剂含量合理地为90wt％或更少，例如60wt％或更少，合适地为50wt％或更少。

本发明的药物组合物可以通过将本发明的化合物(例如反义寡聚物)或其药学上可接受的盐或水合物添加到载剂的分散体中，然后充分搅拌来制备。可以在任何合适的阶段添加添加剂，无论是在添加本发明的化合物或其药学上可接受的盐或水合物之前或之后均可。可以使用任何水性溶剂来添加本发明的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，只要其药学上可接受的即可，示例包括可注射的水，可注射的蒸馏水，电解质溶液(例如，生理盐水)，和糖溶液(例如，葡萄糖溶液，麦芽糖溶液)。此外，在这种情况下，可以由本领域技术人员根据需要选择包括pH和温度在内的条件。

本发明的药物组合物可以被配制为溶液或其冻干制剂。可以以标准方式通过将溶液形式的本发明的药物组合物冻干来制备此类冻干制剂。例如，溶液形式的本发明的药物组合物可以根据需要进行灭菌，随后以指定量分配到药瓶(vial bottles)中，然后在约-40℃至-20℃条件下预冷冻约2小时，在约0℃至10℃在减压下初步感知，随后在约15℃至25℃在减压下二次干燥。此外，在大多数情况下，可以用氮气净化药瓶，随后加盖，从而得到本发明的药物组合物的冻干制剂。

此类本发明的药物组合物的冻干制剂通常可以在通过添加任何合适的溶液(即复原溶液(reconstituting solution))复原后使用。此类复原溶液的示例包括可注射的水，生理盐水，和其他常用的输注溶液。此类复原溶液的体积将可变，例如，取决于预期用途，并且不以任何方式受限制，但合理地比冻干之前的溶液体积大0.5至2倍，或为500mL或更少。

本发明的药物组合物中所含的本发明的化合物(例如反义寡聚物)或其药学上可接受的盐或水合物可以为其水合物的形式。此类水合物可以以任何已知方式制备。

药物组合物的组成和配制方法取决于多种条件，包括但不限于，施用途径，疾病程度，或施用剂量。

这些组合物可以通过常规灭菌技术灭菌，或者可以进行灭菌过滤。所得的水溶液被原样包装，或者被冻干，冻干制品在施用前与灭菌的水性载剂组合。制品的pH通常将在3和11之间，合适地在5和9之间或在6和8之间，最合适地在7和8之间，例如7至7.5。所得的固体形式的组合物可以被包装在多个单剂量单位中，所述单剂量单位各自包含固定量的上述试剂或多种试剂，例如，在密封包装的片剂或胶囊剂中。固体形式的组合物也可以被包装在用于灵活量的容器中，例如在设计用于可局部应用的乳膏或软膏的挤压管中。

本发明的药物组合物可以以任何药学上可接受的方式施用，其可以根据需要选择用于与其的治疗方法。然而，在容易递送到肌肉组织方面，优选的是静脉内施用，动脉内施用，肌肉内施用，皮下施用，口服施用，间隙内施用，经皮施用等。此外，本发明的组合物可以为任何剂型，示例包括各种类型的注射剂，口服制剂，滴剂，吸入剂，软膏，乳液等。

本发明的药物组合物中所含的本发明的化合物(例如反义寡聚物)或其药学上可接受的盐或水合物的浓度可变，例如，取决于载剂的类型，但其合理地在0.1nM至100μM范围内，并且合理地在100nM至10μM范围内。类似地，本发明的药物组合物中所含的载剂与本发明的反义寡聚物或其药学上可接受的盐或水合物的重量比(即，载剂/反义寡聚物或其药学上可接受的盐或水合物之比)将可变，例如，取决于寡聚物的性质和载剂的类型，但是其合理地在0.1至100范围内，并且合适地在0.1至10范围内。

本发明的化合物，其药学上可接受的盐或水合物可以被包含在单位制剂中，例如在药学上可接受的载剂或稀释中，其量足以向受试者递送治疗可接受的量而不会在受试者中导致严重的副作用。

本发明的药物组合物的施用量可以根据其中所含的本发明的反义寡聚物或其药学上可接受的盐或水合物的类型，预期剂型，受试者的条件(如年龄和体重)，施用途径，以及疾病的特性和严重程度来根据需要调节。如果受试者是人受试者，则成人的每日剂量通常在0.1mg至10g/kg体重范围内，例如在1mg至1g/kg体重，20mg至120mg/kg体重，30mg至100mg/kg体重，或40mg至80mg/kg体重范围内，计算为本发明的反义寡聚物或其药学上可接受的盐或水合物的量。该数值范围可以取决于所靶向的疾病的类型，施用模式，和/或靶分子的类类型而变。因此，在一些情况中，低于此范围的剂量可能是足够的，或者相反地，在一些情况中，应当需要高于此范围的剂量。此外，本发明的药物组合物可以每天一次到数次地施用，或者可以间隔一天到数天地施用。

在另一个实施方式中，本发明的药物组合物可以是包含能够表达本发明的化合物(例如本发明的反义寡核苷酸)的载体和如上所述的载剂的药物组合物。此类表达能表达根据本发明的多种反义寡核苷酸。此类药物组合物可以任选地包含如上所述的药学上可接受的添加剂。该药物组合物中所含的表达载体的浓度将可变，例如，取决于载剂的类型，但其合理地在0.1nM至100μM范围内，并且合适地在100nM至10μM范围内。该药物组合物中载剂与表达载体的重量比(即，载剂/表达载体之比)将可变，例如，取决于表达载体的性质和载剂的类型，但其合理地在0.1至100范围内，并且合适地在0.1至10范围内。此外，此药物组合物中所含的载剂的含量与上文所述相同，制备程序也与上文所述相同。

治疗用途

本发明的化合物，或其药学上可接受的盐或水合物或者包含这些的本发明的药物组合物(在下文中称为“本发明的治疗剂”)可以用于治疗，例如用于人类的治疗。

本发明的治疗剂可以提供用于预防或治疗代谢失调(例如，肥胖症，代谢综合征，糖尿病)，肌萎缩病，或肌消耗病或肌肉减少病。肌萎缩病或肌消耗病的示例包括肌源性肌萎缩(例如，肌肉萎缩症(例如，杜氏肌营养不良症，福山型肌营养不良症，强直性肌营养不良)，先天性肌病，包涵体肌炎)，神经源性肌萎缩(例如，肌萎缩性脊髓侧索硬化症，脊索性肌萎缩病，脊髓和延髓性肌萎缩)，废用肌萎缩(例如，中风-诱导的废用综合征)，肌消耗病(例如，癌症恶病质，败血症-相关的肌萎缩)和包括年龄相关的骨骼肌流失(年龄相关的肌少症)在内的各种类型的肌肉减少病，特别优选肌肉萎缩症。

在本发明的一些实施方式中，提供了用于预防或治疗肌萎缩病，肌消耗病或肌肉减少病的方法，其包括对需要预防或治疗肌萎缩病或肌消耗病的受试者施用治疗有效量的本发明的治疗剂。在特定实施方式中，本发明的化合物(例如反义寡聚物)或其药学上可接受的盐或水合物可以以本发明的药物组合物的形式施用给受试者。

在本发明的上下文中，术语“受试者”旨在表示人类受试者或非人温血动物，如鸟类和非人哺乳动物(例如，牛，猴子，猫，小鼠，大鼠，豚鼠，仓鼠，猪，狗，兔子，绵羊，马)所例示的。“受试者”优选是人类受试者。

在本发明的特定实施方式中，提供了本发明的治疗剂在制备用于预防或治疗肌萎缩病或肌消耗病的治疗剂中的用途。

在本发明的特定实施方式中，提供了本发明的化合物(例如反义寡聚物)或其药学上可接受的盐或水合物在制备用于预防或治疗肌萎缩病或肌消耗病的药物组合物中的用途。

在本发明的其他实施方式中，提供了本发明的治疗剂，其用于肌萎缩病或肌消耗病。

如上所述，本发明的化合物允许通过例如诱导外显子跳过或mRNA降解而在mRNA水平上抑制肌抑素信号转导。在一个实施方式中，本发明的化合物可以是本发明的反义寡聚物。

在肌肉组织中抑制肌抑素信号可以应用于预防或治疗肌萎缩病，肌消耗病或肌肉减少病。骨骼肌的肌萎缩不仅降低受试者的生活质量，而且还会带来严重的全身性并发症(包括营养不良和呼吸衰竭)，因此需要能够解决此医学需求的药剂和治疗。

因此，当对需要预防或治疗肌萎缩病，肌消耗病或肌肉减少病的受试者施用本发明的治疗剂时，能够预防或治疗肌萎缩病，肌消耗病或肌肉减少病。

本发明还提供了本发明的治疗剂，其用于治疗受试者。

所述治疗可以是预防或治疗上面列出的疾病。

在一个实施方式中，治疗可以是在受试者中预防或治疗肌萎缩病，肌消耗病或肌肉减少病。在一个实施方式中，肌萎缩病可以是杜氏肌营养不良症。受试者可以是人受试者。

本发明还提供了本发明的化合物或其药学上可接受的盐或水合物在制备用于在受试者中用于预防或治疗肌萎缩病，肌消耗病或肌肉减少病的药物(如药物组合物)中的用途。在一个实施方式中，肌萎缩病是杜氏肌营养不良症。在一个实施方式中，受试者是人。

剂量和施用途径可以与针对本发明的药物组合物列出的那些相同。

本发明还提供了用于在受试者中治疗疾病的方法，其包括对所述受试者施用治疗有效量的本发明的治疗剂。疾病可以是代谢失调(例如，肥胖症，代谢综合征，糖尿病)，肌萎缩病，肌消耗病或肌肉减少病。肌萎缩病或肌消耗病的示例包括肌源性肌萎缩(例如，肌肉萎缩症(例如，杜氏肌营养不良症，福山型肌营养不良症，强直性肌营养不良)，先天性肌病，包涵体肌炎)，神经源性肌萎缩(例如，肌萎缩性脊髓侧索硬化症，脊索性肌萎缩病，脊髓和延髓性肌萎缩)，废用肌萎缩(例如，中风-诱导的废用综合征)，肌消耗病(例如，癌症恶病质，败血症-相关的肌萎缩)和包括年龄相关的骨骼肌流失(年龄相关的肌少症)在内的各种类型的肌肉减少病，特别优选肌肉萎缩症。在一个实施方式中，治疗可以是在受试者中预防或治疗肌萎缩病，肌消耗病或肌肉减少病。

在一个实施方式中，肌萎缩病可以是杜氏肌营养不良症。受试者可以是人受试者。剂量和施用途径可以与针对本发明的药物组合物列出的那些相同。

动物

本发明还提供了产生缺少ACVR2B的胞内区的一部分的截短形式的ACVR2B蛋白的基因操作的动物(在下文中称为“本发明的GM动物”)。如本文所用，动物可以是除了人类之外的任何种类。特别合适的动物是驯养动物，例如鱼类(例如鲔鱼)，牛，绵羊，山羊或猪。

本领域技术人员能使用标准技术生产此类基因操作的动物。例如，可以通过施用本发明的化合物或本发明的药物组合物来产生本发明的GM动物。例如，可以通过CRISPR-CAS9，siRNA，loxP敲除系统，TALENs，锌指(ZFN)或反义寡聚物来产生本发明的GM动物。

当使用CRISPR-CAS9时，将具有与编码ACVR2B或ACVR2B的一部分(例如，野生型ACVR2B的胞内区)的基因组DNA的靶序列互补的序列的向导RNA导入靶细胞或宿主动物中，由此识别出要被切割的靶序列。被导入到靶细胞的Cas9 (或Cas9样)蛋白切割由基因组DNA和向导RNA组成的双链部分。通过修复切割部位的过程，由核苷酸的缺失和/或插入导致突变，从而导致ACVR2B的敲除。基因组DNA的靶序列的靶序列包含外显子的任何序列，例如ACVR2B的外显子1至11。合适地，基因组DNA的靶序列包括选自下组：ACVR2B的外显子7，8，9和10，或下组：ACVR2B的外显子5，6，7，8，9和10的的至少一个外显子的任何序列。在一个实施方式中，基因组DNA的靶序列包括选自下组的至少一个外显子的任何序列：ACVR2B的外显子5，5，6，9和10。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列包括选自下组的至少一个外显子的任何序列：ACVR2B的外显子5，6，9和10。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列包括选自下组的至少一个外显子的任何序列：ACVR2B的外显子5，6和10。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列包括选自下组的至少一个外显子的任何序列：ACVR2B的外显子5和6。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列包括选自下组的至少一个外显子的任何序列：ACVR2B的外显子7，8和9。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列包括选自下组的至少一个外显子的任何序列：ACVR2B的外显子7和8。在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列是ACVR2B的外显子5。仍然在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列是ACVR2B的外显子6。仍然在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列是ACVR2B的外显子7。仍然在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列是ACVR2B的外显子8。仍然在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列是ACVR2B的外显子9。仍然在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列是ACVR2B的外显子10。仍然在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列是ACVR2B的外显子11。仍然在另一个实施方式中，基因组DNA的靶序列包括从由外显子7，8，9和10组成的组或由ACVR2B的外显子5，6，7，8，9和10组成的组中选择的至少一个外显子的任何序列。

可替代地，可以通过CRISPR-CAS9靶向内含子。例如，可以切割将外显子8夹在中间的内含子7和8。当切割部位被修复时，外显子8可以变为不存在以生成外显子8-缺陷型突变mRNA。类似地，内含子4和5，或内含子5和6，或内含子6和7，或内含子8和9，或内含子9和10，或内含子10和11可以被靶向切割。

当使用siRNA抑制肌抑素信号时，将设计用于靶向ACVR2B mRNA的序列的siRNA导入靶细胞中。当由此导入的siRNA的向导链与靶向的序列杂交时，靶细胞中的内源性RISC蛋白随后识别由向导链和靶向的mRNA链组成的双链部分，并且切割mRNA的靶向序列。通过这样做，降低了本发明的GM动物中的ACVR2B蛋白水平。

应注意，本文中引用的所有公开出版物，包括现有技术文献，专利公报和其他专利文献，均通过引用并入本文。在下文中将通过以下说明性实施例更详细地描述本发明，尽管本发明不限于此。

实施例

[参考例1]

负载在氨基聚苯乙烯树脂上的4-{[(2S，6R)-6-(5-甲基-2，4-二氧代嘧啶-1-基)- 4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸

步骤1：制备4-{[(2S，6R)-6-(5-甲基-2，4-二氧代嘧啶-1-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸

在氩气气氛下，将1-[(2R，6S)-6-(羟基甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]-5-甲基嘧啶-2，4-二酮(41.11g)和4-二甲基氨基吡啶(4-DMAP)(15.58g)悬浮在二氯甲烷(850mL)中，随后向其中添加琥珀酸酐(12.76g)，然后于室温搅拌3.5小时。将反应溶液用二氯甲烷和1M磷酸二氢钠水溶液萃取。所得的有机层依次用1M磷酸二氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤。所得的有机层经硫酸钠干燥，并且减压浓缩。向所得的固体中添加二氯甲烷(600mL)以进行结晶，然后过滤。在添加了额外的二氯甲烷(300mL)之后，将晶体搅拌5分钟，随后过滤并且减压干燥过夜以获得所需的产物(50.2g)。

步骤2：制备在氨基聚苯乙烯树脂上的4-{[(2S，6R)-6-(5-甲基-2，4-二氧代嘧啶-1-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸

将4-{[(2S，6R)-6-(5-甲基-2，4-二氧代嘧啶-1-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸(50.2g)溶解在吡啶(脱水)(600mL)中，然后添加4-DMAP(12.4g)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(77.6g)。随后将氨基聚苯乙烯树脂氨基甲基树脂(日本Watanabe Chemical Industries，Ltd.的产品，A00673，200-400目，1mmol/g，1％DVB)(40.5g)和三乙胺(69.6mL)添加到该混合物中，然后于室温摇动4天。在反应之后，通过过滤收集树脂。所得的树脂依次用吡啶、甲醇和二氯甲烷洗涤，随后减压干燥。向所得的树脂中添加四氢呋喃(脱水)(500mL)，乙酸酐(104mL)和2，6-二甲基吡啶(128mL)，于室温摇动4小时。通过过滤收集树脂，依次用吡啶、甲醇和二氯甲烷洗涤，随后减压干燥以获得59.0g所需的产物。

为测定所述产物的负载量，以409nm处的UV吸光度的已知方式测量每克树脂的三苯甲基的量。测得树脂上的负载量为467.83μmol/g。

UV测量条件

仪器：U-2910(Hitachi，Ltd.，Japan)

溶剂：甲烷磺酸

波长：409nm

ε值：45000

[参考例2]

负载在氨基聚苯乙烯树脂上的4-{[(2S，6R)-6-(4-苯甲酰胺基-2-氧代嘧啶-1- 基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸

重复参考例1中所示的相同程序制备标题化合物，不同之处在于在该步骤中将参考例1的步骤1中所用的1-[(2R，6S)-6-(羟基甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]-5-甲基嘧啶-2，4-二酮替换为N-{1-[(2R，6S)-6-(羟基甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]-2-氧代-1，2-二氢嘧啶-4-基}苯甲酰胺。

为测定所述产物的负载量，以409nm处的UV吸光度的已知方式测量每克树脂的三苯甲基的量。测得树脂上的负载量为460.28μmol/g。

[参考例3]

负载在氨基聚苯乙烯树脂上的4-{[(2S，6R)-6-(6-苯甲酰胺基嘌呤-9-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸

重复参考例1中所示的相同程序制备标题化合物，不同之处在于在该步骤中将参考例1的步骤1中所用的1-[(2R，6S)-6-(羟基甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]-5-甲基嘧啶-2，4-二酮替换为N-{9-[(2R，6S)-6-(羟基甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]嘌呤-6-基}苯甲酰胺。

为测定所述产物的负载量，以409nm处的UV吸光度的已知方式测量每克树脂的三苯甲基的量。测得树脂上的负载量为425.13μmol/g。

[参考例4]

在氨基聚苯乙烯树脂上的4-{{(2S，6R)-6-{6-(2-氰基乙氧基)-2-[(2-苯氧基乙酰基)氨基]嘌呤-9-基}-4-三苯甲基吗啉-2-基}甲氧基}-4-氧代丁酸

重复参考例1中所示的相同程序制备标题化合物，不同之处在于在该步骤中将参考例1的步骤1中所用的1-[(2R，6S)-6-(羟基甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]-5-甲基嘧啶-2，4-二酮替换为N-{6-(2-氰基乙氧基)-9-[(2R，6S)-6-(羟基甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]嘌呤-6-基}苯甲酰胺。

为测定所述产物的负载量，以409nm处的UV吸光度的已知方式测量每克树脂的三苯甲基的量。测得树脂上的负载量为341.09μmol/g。

根据下文所示实施例1中的描述，或者根据PCT/JP2015/57180中所述的程序，使用核酸合成仪(AKTA Oligopilot 10plus)，合成PMOs(5′-末端是基团(3))。在合成的PMOs中，显示跳过活性的那些在表1中列出。

[实施例1]

将各自对应于5′-末端碱基的以下物质：负载在氨基聚苯乙烯树脂上的4-{[(2S，6R)-6-(5-甲基-2，4-二氧代嘧啶-1-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸(参考例1)，或负载在氨基聚苯乙烯树脂上的4-{[(2S，6R)-6-(4-苯甲酰胺基-2-氧代嘧啶-1-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸(参考例2)，或负载在氨基聚苯乙烯树脂上的4-{[(2S，6R)-6-(6-苯甲酰胺基嘌呤-9-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸(参考例3)，或负载在氨基聚苯乙烯树脂上的4-{{(2S，6R)-6-{6-(2-氰基乙氧基)-2-[(2-苯氧基乙酰基)氨基]嘌呤-9-基}-4-三苯甲基吗啉-2-基}甲氧基}-4-氧代丁酸(参考例4)，以0.1g的量装入配备有过滤器的反应容器中，以启动如下的使用肽合成仪(FOCUS)的合成循环。为得到表1中所述的每一种化合物的核苷酸序列，将所需的吗啉代单体化合物添加到每一个偶联循环中(见下表2)。

[表2]

应注意所用的解封溶液通过将三氟乙酸(2当量)和三乙胺(1当量)的混合物以3％(w/v)的浓度溶解在包含1％(v/v)乙醇和10％(v/v)2，2，2-三氟乙醇的二氯甲烷溶液中制备。所用的中和溶液通过将N，N-二异丙基乙胺以5％(v/v)的浓度溶解在包含25％(v/v)2-丙醇的二氯甲烷溶液中制备。所用的激活剂溶液是包含20％(v/v)N，N-二异丙基乙胺的1，3-二甲基-2-咪唑烷酮溶液。所用的单体溶液通过将吗啉代单体化合物以0.20M的浓度溶剂溶解在四氢呋喃中制备。所用的封端溶液通过将乙酸酐以10％(v/v)和2，6-二甲基吡啶以10％(v/v)溶解在二氯甲烷中制备。

从反应容器中收集如上所述合成的负载有PMO的氨基聚苯乙烯树脂，并于30℃减压干燥2小时或更久。将干燥的负载在氨基聚苯乙烯树脂上的PMO装入反应容器中，向其中添加5mL 28％氨-乙醇(1/3)水溶液，然后于55℃静置16小时。通过过滤分离氨基聚苯乙烯树脂，并且用3mL水-乙腈(1/1)洗涤。在将所得的滤液与乙醇(3mL)和乙醚(35mL)混合之后，将混合物离心，随后倾注去除上清液，并且将残余物减压干燥。将所得的残余物溶解在10mL包含20mM醋酸铵水溶液和乙腈(4/1)的混合溶剂中，随后通过反相HPLC纯化。所用的条件如下表3中所示。

[表3]

CV：柱体积

将级份各自分析以收集所需的产物。将所得的溶液与0.1M盐酸水溶液(4mL)混合，并且使其静置2小时。在反应之后，添加1M氢氧化钠水溶液(0.4mL)以中和混合物，随后将通过其膜过滤器(0.22μm)过滤。

用1M氢氧化钠水溶液(0.4mL)使包含所需产物的所得的水溶液为碱性，并且通过阴离子交换树脂柱纯化。所用的条件如下表4中所示4。

[表4]

将级份各自分析(通过HPLC)以获得所需的产物，其为水溶液。所得的水溶液用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中和，随后通过反相HPLC在下表5中所示的条件下脱盐。

[表5]

收集所需的产物，并且减压浓缩。将所得的残余物溶解在水中并且冷冻干燥以获得所需的化合物，其为白色絮状固体。ESI-TOF-MS的计算值和测量值在表1中显示。

[实施例2]

合成反义寡聚物-肽缀合物(PMO-肽缀合物)

将PMO(PMO No.15，18.1mg，1.0当量)溶解在DMSO(284.0μL)和DMF(17.5μL)中。向溶液中添加4-马来酰亚胺丁酸(1.7mg，4.0当量)和WSCI·HCl(2.2mg，5.O当量)在DMSO(23.2μL)和DMF(22.2μL)中的混合物。将反应混合物在45℃搅拌6h。在反应几乎达到完成之后，将CH₂Cl₂(13.2mL)添加到混合物中以得到沉淀物。离心收集沉淀物，然后真空干燥。将干燥的沉淀物重新溶解在DMSO(175.0μL)和H₂O(52.7μL)中。向所得的溶液中添加hLIMK(Ac-KKRTLRKNDRKKRC-CONH₂，5.1mg，1.2当量)(SEQ ID NO：112)，并且将混合物于45℃搅拌30min。在通过HPLC分析确认反应完成之后，通过添加乙腈溶液(10％，在H₂O中，400μL)终止反应。将溶液用水(约40mL)稀释，通过阳离子交换色谱纯化所需的产物。所用的条件如下表6中所示。

表6

CV：柱体积

通过HPLC分析级份，并且收集合适的级份。将水溶液用水稀释七倍，随后通过反相HPLC在下表7中所示的条件下脱盐。

表7

收集所需的产物，并且减压浓缩。将所得的残余物溶解在水中，并冷冻干燥以得到所需的化合物(称为第1号PPMO)，其为白色絮状固体(7.7mg，34.0％产率)。

通过使用ESI-TOF-MS测定得到的化合物(第1号PPMO)的分子量(计算值：9973.92，测得值：9973.54)。

[实施例3]

评价反义寡聚物的跳过活性

将PMO转染到细胞中

使用核转染仪(Nucleofetor)II(Lonza)和Amaxa细胞系核转染试剂盒，将表1中所述的反义寡聚物各自以10或30μM转染到3×10⁵个RD细胞(人横纹肉瘤细胞系)中。所用的脉冲程序为T-030。

在转染之后，在6孔板的孔中在5％CO₂下在包含10％胎牛血清(FBS)(Sigma-Aldrich)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)(Sigma-Aldrich)中培养细胞。在转染后三天，将培养基更换为包含0.4ng/mL重组肌抑素(R＆D Systems)的无血清DMEM，并且将细胞在37℃在5％CO₂下再培养2小时。

将硫代磷酸酯(PS)寡核苷酸转染到细胞中

在转染后当天，将RD细胞以3×10⁴细胞/孔的密度接种在24-孔板中，并且在5％CO₂下在包含10％FBS(Sigma-Aldrich)的DMEM(Sigma-Aldrich)中培养。第二天，使用Lipofect胺3000转染试剂(Thermo Scientific)，将表8中所示的2′-O-甲基硫代磷酸酯(PS)寡核苷酸(JbioS)的反义寡聚物各自以10或30nM转染。在转染之后，将细胞培养三天。

将PMO-肽缀合物裸式(gymnotic)递送到细胞中

在转染后当天，将RD细胞以4×10⁴细胞/孔的密度接种在24-孔板中，并且在5％CO₂下在包含10％FBS(Sigma-Aldrich)的DMEM(Sigma-Aldrich)中培养。第二天，将实施例2中合成的反义寡聚物-肽缀合物(PMO-肽缀合物)添加到培养基中。在添加PMO-肽缀合物之后，将细胞培养三天。

RNA提取

将细胞用PBS(Nissui Pharmaceutical)洗涤一次，随后将包含1％2-巯基乙醇(Nacalai Tesque)的350μL缓冲液RLT(Qiagen)添加到细胞中，并且通过使细胞于室温静置数分钟来溶解细胞。将细胞溶解物收集到QIAshredder匀浆器(Qiagen)中，并且在20，400×g下离心2分钟以制备匀浆。根据RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)的厂商说明书来提取总RNA。用NanoDrop ND-1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测量提取的总RNA的浓度。

测量跳过效率

将提取的总RNA(150ng)用作模板，用QIAGEN一步法RT-PCR试剂盒(Qiagen)执行一步法RT-PCR。根据试剂盒所附的方案制备反应溶液.所用的热循环仪为TaKaRa PCRThermal Cycler Dice Touch(Takara Bio)。所用的RT-PCR程序如下所示。

50℃保持30min：逆转录反应

95℃保持15min：聚合酶激活，逆转录酶失活

[94℃保持30秒；62℃保持30秒；72℃保持50秒]×32个循环：PCR

72℃保持7min：最终延长反应

用于RT-PCR的正向和反向引物的核苷酸序列如下所示。

用于检测外显子5跳过：

正向引物：5′-TGCTACGATAGGCAGGAGTG-3′(SEQ ID NO：37)

反向引物：5′-AGCAGGTTCTCGTGCTTCAT-3′(SEQ ID NO：38)

用于检测外显子6，7，或8跳过：

正向引物：5′-CATGTGGACATCCATGAGGA-3′(SEQ ID NO：39)

反向引物：5′-GAGACACAAGCTCCCACAGC-3′(SEQ ID NO：40)

用于检测外显子9或10跳过：

正向引物：5′-TCTATTGCCCACAGGGACTT-3′(SEQ ID NO：41)

反向引物：5′-GAGCCTCTGCATCATGGTC-3′(SEQ ID NO：42)

以上PCR反应溶液(1μL)使用生物分析仪(Agilent)分析。测量具有外显子跳过的PCR扩增子(即截短的ACVR2B cDNA)的多核苷酸摩尔浓度“A”和野生型PCR扩增子(即野生型A℃VR2B cDNA)的多核苷酸摩尔浓度“B”。基于“A”和“B)的这些测量值，根据以下方程测定跳过效率。

跳过效率(％)＝A/(A+B)×100

得到的结果在图1a-d中显示。

图1a-d显示，本发明的反义寡聚物和反义寡聚物-肽缀合物导致外显子跳过。

[实施例4]

测量显性-阴性活性

将8×10³个HEK-293细胞(人胚胎肾细胞系)接种在96-孔白板(Thermo FisherScientific)上，于37℃在5％CO₂下在包含10％FBS的最低必需培养基伊格尔(Sigma-Aldrich)中培养。第二天，将10ng的含有编码每个外显子(外显子5，6，7，8，9或10)跳过产物的DNA(Eurofins Genomics)的pBApo-CMV(Takara Bio)和14ng的荧光素酶报告基因DNA(Cignal SMAD报告基因检测试剂盒，Qiagen)使用Lipofect胺LTX(Thermo FisherScientific)共转染到细胞中。在转染之后两天，将在无血清最低必须培养基伊格尔中稀释的重组肌抑素(R＆D Systems)添加到培养基中，最终浓度为10ng/mL.在额外培养24小时之后，使用Dual-Glo荧光素酶检测系统(Promega)根据厂商说明书进行荧光素酶报告基因检测。使用光度计Tecan infinite F200 PRO(Tecan)测量荧光素酶活性。

得到的结果在图2中显示。

如图2中所示，添加肌抑素诱导的荧光素酶活性在用编码每一个外显子跳过产物的DNA转染的细胞中都几乎被完全抑制。图2显示任何一种外显子跳过(外显子5，6，7，8，9和10)能有效地抑制肌抑素信号.

[实施例5]

测量肌抑素信号

使用提取的总RNA(360ng)作为模板以用大容量cDNA逆转录试剂盒(ThermoFisher Scientific)执行RT反应。反应溶液的制备和热条件遵循试剂盒的厂商说明书。所用的热循环仪为TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch(Takara Bio)。

使用RT反应的溶液(0.6μL)作为模板以用TaqMan基因表达反应混合物(ThermoFisher Scientific)和用于SMAD7和PPIB的TaqMan基因表达检验(Thermo FisherScientific)执行qPCR。用于qPCR的仪器是QuantStudio 6Flex Systems(Thermo FisherScientific)。

得到的结果在图3中显示。

如图3中所示，通过用肌抑素刺激使SMAD7基因的表达增加了6倍。本发明的反义寡聚物抑制了SMAD7基因的表达增加。

这些反义寡聚物与BLAST分析中的SMAD7基因没有同源性。因此，这些SMAD7基因表达抑制活性对肌抑素信号抑制活性有特异性。

序列标识：

SEQ ID NO：1

SEQ ID NO：2

SEQ ID NO：3

SEQ ID NO：4

SEQ ID NO：5

SEQ ID NO：6

SEQ ID NO：7(包含末端UAA终止密码子的外显子11)

SEQ ID NO：8：

SEQ ID NO：9：

SEQ ID NO：10.

SEQ ID NO：11.

序列表

<110> 日本新药株式会社

<120> 肌肉生长抑制素信号抑制剂

<130> G2319WO

<150> GB 1821269.6

<151> 2018-12-28

<160> 112

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 144

<212> RNA

<213> 智人

<400> 1

gacccugggc cuccaccacc auccccucug gugggccuga agccacugca gcugcuggag 60

aucaaggcuc gggggcgcuu uggcuguguc uggaaggccc agcucaugaa ugacuuugua 120

gcugucaaga ucuucccacu ccag 144

<210> 2

<211> 144

<212> RNA

<213> 智人

<400> 2

gacaagcagu cguggcagag ugaacgggag aucuucagca caccuggcau gaagcacgag 60

aaccugcuac aguucauugc ugccgagaag cgaggcucca accucgaagu agagcugugg 120

cucaucacgg ccuuccauga caag 144

<210> 3

<211> 149

<212> RNA

<213> 智人

<400> 3

ggcucccuca cggauuaccu caaggggaac aucaucacau ggaacgaacu gugucaugua 60

gcagagacga ugucacgagg ccucucauac cugcaugagg augugcccug gugccguggc 120

gagggccaca agccgucuau ugcccacag 149

<210> 4

<211> 115

<212> RNA

<213> 智人

<400> 4

ggacuuuaaa aguaagaaug uauugcugaa gagcgaccuc acagccgugc uggcugacuu 60

uggcuuggcu guucgauuug agccagggaa accuccaggg gacacccacg gacag 115

<210> 5

<211> 139

<212> RNA

<213> 智人

<400> 5

guaggcacga gacgguacau ggcuccugag gugcucgagg gagccaucaa cuuccagaga 60

gaugccuucc ugcgcauuga cauguaugcc augggguugg ugcuguggga gcuugugucu 120

cgcugcaagg cugcagacg 139

<210> 6

<211> 131

<212> RNA

<213> 智人

<400> 6

gacccgugga ugaguacaug cugcccuuug aggaagagau uggccagcac ccuucguugg 60

aggagcugca ggagguggug gugcacaaga agaugaggcc caccauuaaa gaucacuggu 120

ugaaacaccc g 131

<210> 7

<211> 195

<212> RNA

<213> 智人

<400> 7

ggccuggccc agcuuugugu gaccaucgag gagugcuggg accaugaugc agaggcucgc 60

uuguccgcgg gcugugugga ggagcgggug ucccugauuc ggaggucggu caacggcacu 120

accucggacu gucucguuuc ccuggugacc ucugucacca auguggaccu gcccccuaaa 180

gagucaagca ucuaa 195

<210> 8

<211> 11782

<212> RNA

<213> 智人

<400> 8

ggcucggcuc cguggccgcc gcucaggagc cauuuuggac ucgguucagc uccccucccc 60

cccaccccuc cccccguuca uggccccucc ggacucggcc ccugcgcccg gggcccgggc 120

ccagccccgc cgcgcuaugc cugagucggg cgcgccccgg cccgugcccc gccgccgccc 180

cccggccccc gcgucgcccc ggagcccggg ccgcagccug cgccgcccgc agcggcccug 240

agcccggccc cgccgaccgg cccuuggagc ccgaacgcug cucggggacg aaggcgcagg 300

aagcgcgcag ggaacgagac cgaaggaagg agcgggaagg agagcgcagc cgccgccugg 360

cccugcgcgc cccgggagcg ccgugcggcc cugcccgcgg gcuccgggug ugcgcggggc 420

ggcgccgcgg aacaugacgg cgcccugggu ggcccucgcc cuccucuggg gaucgcugug 480

cgccggcucu gggcgugggg aggcugagac acgggagugc aucuacuaca acgccaacug 540

ggagcuggag cgcaccaacc agagcggccu ggagcgcugc gaaggcgagc aggacaagcg 600

gcugcacugc uacgccuccu ggcgcaacag cucuggcacc aucgagcucg ugaagaaggg 660

cugcuggcua gaugacuuca acugcuacga uaggcaggag uguguggcca cugaggagaa 720

cccccaggug uacuucugcu gcugugaagg caacuucugc aacgaacgcu ucacucauuu 780

gccagaggcu gggggcccgg aagucacgua cgagccaccc ccgacagccc ccacccugcu 840

cacggugcug gccuacucac ugcugcccau cgggggccuu ucccucaucg uccugcuggc 900

cuuuuggaug uaccggcauc gcaagccccc cuacggucau guggacaucc augaggaccc 960

ugggccucca ccaccauccc cucugguggg ccugaagcca cugcagcugc uggagaucaa 1020

ggcucggggg cgcuuuggcu gugucuggaa ggcccagcuc augaaugacu uuguagcugu 1080

caagaucuuc ccacuccagg acaagcaguc guggcagagu gaacgggaga ucuucagcac 1140

accuggcaug aagcacgaga accugcuaca guucauugcu gccgagaagc gaggcuccaa 1200

ccucgaagua gagcuguggc ucaucacggc cuuccaugac aagggcuccc ucacggauua 1260

ccucaagggg aacaucauca cauggaacga acugugucau guagcagaga cgaugucacg 1320

aggccucuca uaccugcaug aggaugugcc cuggugccgu ggcgagggcc acaagccguc 1380

uauugcccac agggacuuua aaaguaagaa uguauugcug aagagcgacc ucacagccgu 1440

gcuggcugac uuuggcuugg cuguucgauu ugagccaggg aaaccuccag gggacaccca 1500

cggacaggua ggcacgagac gguacauggc uccugaggug cucgagggag ccaucaacuu 1560

ccagagagau gccuuccugc gcauugacau guaugccaug ggguuggugc ugugggagcu 1620

ugugucucgc ugcaaggcug cagacggacc cguggaugag uacaugcugc ccuuugagga 1680

agagauuggc cagcacccuu cguuggagga gcugcaggag gugguggugc acaagaagau 1740

gaggcccacc auuaaagauc acugguugaa acacccgggc cuggcccagc uuugugugac 1800

caucgaggag ugcugggacc augaugcaga ggcucgcuug uccgcgggcu guguggagga 1860

gcgggugucc cugauucgga ggucggucaa cggcacuacc ucggacuguc ucguuucccu 1920

ggugaccucu gucaccaaug uggaccugcc cccuaaagag ucaagcaucu aagcccagga 1980

caugaguguc uguccagacu caguggaucu gaagaaaaaa ggaaaaaaag uuguguuuug 2040

uuuuggaaau cccauaaaac caacaaacac auaaaaugca gcugcuauuu uaccuugacu 2100

uuuuauuauu auuauuauaa uuauuauaau uauuauuauu aauauuauuu uuuggauugg 2160

aucaguuuuu accagcauau ugcucuacug uaucacaaac agcggacacg ucagcaggcg 2220

uugaggugcu gagcugugga ugcagaacca gcgccaugcu gaagagccuc agccaccucc 2280

uguccuuugg gauucguuuu ucccgcuuuc ucuuuguuug ucgucucaga aucugugaca 2340

caaagaaacc caucuccugu cuuaggaaac cuaaugcugc aaacucuacc uagaggaacc 2400

uuugaagacu guuacauaag aacauaccuu ccucagaaga ggaguuuccu cugcccucug 2460

cccuucuccc cugccucccu cccuccccuc cuuuuauuuu guuuuaguga gcuuaagaaa 2520

cagcagaugu gucuuucacg gaucuaacgg guguuguccu gaucgagaaa aaaacuggga 2580

ugagaauggu uuggacugga guuggaaggg gaggacggua cuggggguag gguuuggaac 2640

agagcuacac uggacucggg cacauucgga gcagcauccu uuaguaugga ggcuacuucu 2700

cagguaacca ggaauugagg ggaaggaccu uguggaggcc gagcauuaac agcaagagcg 2760

ggguuuggag aaagucugag auugggugca gcccugacuu accugcuggc ccugaccagu 2820

uucuuuucac uaacuuggcc uugggcauag gaugaaacau uuuuucugcc cuaauuuuaa 2880

aacuagguga ggguagaauc aucacagguu aggaauacau ucuucauaag acacgaugcu 2940

guaaauaccc uuaauggacg aaaaguugaa auacuuuugu uuccucuugg agcaguucag 3000

ggaaaugccc acaggggauu guccugcaca gauagggcaa gaggauuucc uggguggagu 3060

cugccaaggc cugccucgcu ggggacccca gaguccugca ccucugguuc cgccccaggu 3120

ggugacauua cuguccccgu ucuguggcuc guggacaaga cuuucuccag accccuuaaa 3180

gugguacaua uucuaaaaaa cuguuuuucu auuaugccau aaccuugcuc uagucaguga 3240

auguuccuaa ugcugcuguu ucaacauuug aauucuuuuu aauuuaugaa acaugcuaaa 3300

uuuuuuuuuu caaacaaaac acacacaucc acauauacac augcuucgcu auguggcuuc 3360

caagguuuaa auuuugaaaa guaaaagaau uaaaacuuca cgaccacaga ucaccucaaa 3420

ccagaaauac cucagaauuu ucuacuuaug uaagguuuau uauauauuuu guuaguugug 3480

uugucuugua guaaguauau uuuaauguaa guuggcuuuu gugacaagga aguuuaaaag 3540

aaauagagaa aaagaaaaaa guuugcaucu ucuagggagu gcuaccauuu uuguuugaua 3600

acgcccccuu guaaauaauu gucaucaacu guagguuggc ugucugggcc aagucugggc 3660

auuuaucagu cuuguuugug aaggcuuuuc cuucugguuu cuuuagauca uuuuauuuaa 3720

aaacagugca ucucuucauc gugaggguag gcaaggcggg ggccgugggg agagguugac 3780

cugggugaga acugaagagg ccgccuccuc uuggguuguu uggagcuuca cauguaauuc 3840

acauguaaca uguaacuuga ucggucagug uucagaauga caaguaaccc cgcuuaaacu 3900

ugguagaagg auggcccuua gaccugaaug gggugauuuu acuugggauu uaacuucuuc 3960

agcaaauuaa cagcaacguu ggaagagauc uguggcgccu cugugaagca caccgugacu 4020

caggccaguc uuuuagugca gcgugucugg gagugaaggg uuuugcccuu gcuggucuug 4080

gaguccacag ugugaggggc acugcacaug ccugggcauc uaccuagugu gcuauguuca 4140

gugucugggg cuuacugccc cgggguccuu uccucugggu guuggggcac agggugcuau 4200

gggaggccca uuugcuuccc ucucggagcu caguuuuugc uucauggguc aaaauguggg 4260

cuggccaagu gguuacagga acaggguuuc gguaagcuau guugucuuuu uuuuuuuuuu 4320

uuuuuuuuuu uuuaaugguu ugauuuugug cugugguauu uuuuuucccu uagaauaauu 4380

uuuaauggca aaacaggccu uacagcaguu gcuuuucuuu accauuuauu ucuuuaagaa 4440

gcuuuaaaau auuuauugaa aagugccaua ucuaauuucu uuagcuuucg ccucaggcag 4500

ugcaggcauc uuuacuuuuc auccucagaa gaaacaaacg acuaacaaau guagcaaauu 4560

uacugcagga auaguuaggu caugauacua ccugaacacu aaaccccagc cucuuuguuu 4620

gguuuuaguu ccucugggug guuuuucuuu ugugugcugg cuugauucuu gugagaaguu 4680

uugaccuggc caagggaggg uugagccaug guucuggugu gggacuuugc ggucaagaca 4740

caguacagac aggucaggcc ugcgugccuu uucucugggu ggccuccccg uuaggcccac 4800

cguacgcuca gccacuauag ugucccugug gggccuugcc aucagauugu gugucaggag 4860

augguaccuu uuuggugugg cuggggagga guguggucca ugccaguucu uugggcuuca 4920

ggccacucuu ccccucaugc ugugguguaa agugcaccca ucagguggua uaucugguuc 4980

ugauggcaag aagaaggugg gggaucuccu uauagggcau gggucuagga gcacagaugg 5040

gccuuuugcc ccggguaaau gcuugucugu uugcugucau guguucuuug aggagugagc 5100

caucucgagc ccugcuuuga auuuacuggg ucauagagcc ucugccugug cucuuuucca 5160

uaaugacuuc augugacaug cacuuuuggu gggcucagau aauugguuuc uuuuuguuuu 5220

ugaccucagg cucuguggca gacuggggaa aauggggccu ggcaucauuu ucccugucaa 5280

ugggaggggc uguuccaugc agggugggag gggaccaagu uagcagagag uagccaagga 5340

uccuugcuuc uuccuuucua gugugcuguc auccaagcag gcuccuggcu guagggaugg 5400

gccuugggga agaaucuucu uugaaagcau cuaugauaac ugagaaguca ucccuaguug 5460

gagaaaucca guaaugagca gaaggaggaa gcaagugagg acagaggcca uuguauuaca 5520

gugucacgca gagggcccuc aaugaugggg cauuggggaa ggcuguagac auagucauca 5580

gaacauccug gccuggcaua agcuggguuu ucuccuggga ccauuggucc ucagcaggag 5640

uucuuugcau gaguugcuca ggggcaaggg cugcaagugg gcugugcuua ggagaaagug 5700

acaccuggca gugagggaag auggugagca uuauuagccu uuguugucca gcauggccuu 5760

cuuguccugu cugcucugga gaggagccug ugggaccagu ccugccuggg gagggcauac 5820

ccacacgugc cagcugauuc ugacucugaa uacaucaugu ccggacuugg ggguguuucu 5880

gcagaaaaag gagguuguuu uucagccuug aacaucuuca ggaggauaga gacucuugcu 5940

cacauauucu uagcaaaggg aagggucucu caucuccagg ccacagagau aguucuucca 6000

uugcccuaag aggcuaggcu aacccucuug acauaacuua gacagcaaag cacuucaucc 6060

uguaguuggg cucugucacc uuucucuuca guuggccaca uucucguuuc cuccauccug 6120

cuaugcuuug ugugcucggg cugugugugg gguuuuuccc ugguggaagg aagcccagcu 6180

guguauugaa uguccuucau guguugugug uggcucagaa agccugucac uuggccccug 6240

ugcucugagc cgugagggug gggagguggc uguuccauua aagugggagu auuggauggc 6300

ccucuugaaa cuagaauuuu gccuuuuuua guaugcagua uaaaguuucc agcaucuauu 6360

gguaacacaa agauuugcug guuuuuaaaa uaauacagua agcauaagua uguaaguuuu 6420

uagaauuggu acuagaaguu ggacagcuag uuauucucga gaacuuuauu ucacuagaaa 6480

aauauacuaa uuggaaagca guuuccagga guuaacucag uuuaauuuuc agucucaguu 6540

auuuuagccu guugaguuuu ugauggcaca ccuuuggaga gauggccacg ccugauuccc 6600

auuucagggg caucagacca uaccuuuuua agaagcuccg ugaaucuagu caucuacccu 6660

ucauccuggg cgaacagcca aaaagagaag gggacaaggu gucuuuuucu ccuucucacu 6720

ggggugacau gaauucuuuu aguuaauggc uguuugcaaa uucuaaacua augaaauacu 6780

uagcagcuaa cauguucaau cuaguaauga ugaguuuaaa ucucaauuga caguaauguu 6840

uuagauaaac aggcccagua auucaguuga ugaacuguau aucuucucag ucuagauuug 6900

uaaauguuua augaauucag gguuauaagc auaguucuuu aaguaagauu ccagauaguu 6960

gauuugcaac cagcagucua ccuaugaaug uaucccaaac cuuuagaaga uuggaaaaga 7020

uuuuugaaau aaugauuuag uuuuguagga aaaacacccc cuugaaaauu aauucgguug 7080

acccaguaac auuuuuuaaa acaauuggug gcuccaaaag gccugccaac aaagaaaagu 7140

ccaaauuauc uagugggaca uuuugaaugu uuuauguuua uuuugggucc acuguaaacu 7200

uugguucaaa aaagaauuug aauuuaaaga auuuaccauu auuuaaauua uuaccaaguu 7260

uuuacauuuu caugauggua uuuuccaggu augaaugaaa caugacuuuu ugauuguggu 7320

acuuccugua uccccuguag ugccaaaacc agugauacuu uauuugcucc uauggcagcu 7380

cauagaggua accgaaguga uuuuuccuca guaauugaaa cacauauucu cuaaaugcca 7440

auguguggug augggcccug cacugccuuc auuucucuag ggcagugucu uuggauuguc 7500

uagggccuag guaauucuga gaacuacugu aaaccaacca cagggcacua aagcaaugua 7560

cacaccacuc uuugugugua uggaaggggu uauauaaacc ugggcuaugc uggacaucua 7620

cagaagagua uuacauucac uugcaaaguu uacauuuuug agcucacagu uaugaaaaau 7680

augacccaca aguuuuucag gcaggugagg augggucuuc uugcaaaugc augaguucug 7740

ucuugagucc ugggaacuuc ucuguugguu gagugugggc ucauucccug acucuccuaa 7800

ucauguuugc gucagaaugu uagcauugua aauaaaagaa uagguuguau aauagauaca 7860

caacacuuga aacuuuacuu uaaaaaaauc gauaguucua cauauauauu uaguuauauc 7920

acuugacaga uuucuucuac acagugugga gauuguuuua uaccacagau uauuuuuaua 7980

aaguuaguga auuugaauga uuuuguaauc agagcuaaug agcuuuaccu uucaagagaa 8040

acguacacug gagcaugagu gguguggaac uuuuacuuag uguuuauaug gauucuugug 8100

auacacuggc agacuggagu caauuugcgg gucuuuuuug gccaaaacuc cacuuguggu 8160

uguguaggac agugauauuc agcucagcuu cuuguggauu gggaggagag agggccugca 8220

auguguuuua cauuggugcu uccuccugag auuucuguug aacaaagggu ucugagguca 8280

aaaauuaguu uguaagccuu ugccauagga cauagucaug ugagaguguu ugggggaaca 8340

gaaauuguau aggggugccu auuggggugg gaugggacuc gaauaagauu cagguacaaa 8400

aacuuugaaa ugagaaucug gugguuugag uaauccacca gacugaauua ucuaagauca 8460

cauuauccag guuggggggc agaauuaccc aguuaaguaa uuguucagaa aaguggggag 8520

gguggcaugu ggaugcagug auccaauuaa auggagagcu gccaggcaca uuuuguccuc 8580

ucuggucagu gagaaugguu ggguuggcuc gcugcuucaa ucuguggaau cagccaggag 8640

cccagugagg aagcucagaa ccccaguaac agcagagcau cuuucagaua gcuccagagu 8700

uuuccugcuu uucugaggaa gcucagcauc acugccacaa uacggaaagu ggucuucauu 8760

uuagccuauu uauuuuuagg cagagagugg augguuauuu gugugggacu uuugguggcg 8820

auauauaaug aauaauuaag uuaauuucug guaugcauaa uggccagucc ugaggcccag 8880

cugaagaccu gucccccaga cccugcccgc uggcuucagg cugcugcuuc uagacagagg 8940

ugcacuggac gggauaguuu uaucaagaga aucccuaaug ugucauuuua aaccagcugu 9000

gcuuuuuauu cauucugguu gagcguauag guuuacacuu uacccuuuuu auacuuggaa 9060

uaaauuuagu uccagcagau cuaguagcac uccagaaacc aaccccaucu guuccccaua 9120

aaaagaacau uuucucugcu cuccagccac gugucuugga auguaauucu guugugccuu 9180

uguuuuuauc acucucuucg ccccaaaagc aacugcugua agcuuuuuuc uacuugucuu 9240

uucuaguccc caaccucuac cuuuuuccuu uuucccagcc cuaauuucug gaugcacuuc 9300

ugugauccag guauuuuaag aaccaguuac cucagaccuc auguugaaca gugucgccau 9360

cuggguccuc uugauacugc agacuuuuaa cguacacaug caggaacccu gcugagcgug 9420

ggcacuuguu uuaaagcaaa acucuuccca aggacugaag aaagggcuuc uggcaagcuc 9480

gucauggcau ugugguggga ugggucuaga gugucaucug aauggugcuu ccuguguucc 9540

ucuuugaauu cugccauuuu caguauucuu gugugucuga auaggcaaag cgauuuaauu 9600

ggcuggucuu gcacgcaaau uaguuccaaa gauaagcucu uuguaacaca uuuccagucg 9660

cuaaugcuca aauguagaac auuccuuuaa auggcaggau aaaaaaccca cuauccacca 9720

uagugcauuu ugggaagaug ucuguagcau auguugcugu gaaauuaggc cuugugggau 9780

auggcuguuu gucauuuuga uguauuuuaa auaaauauau auauuuuuua aagagccuuu 9840

uuuaccaguu caaaaaguuu aauuaaccag cagucaccgc aucugaauuu uugucucugg 9900

ggcauagaug gcagaccaag auuaaaagug guaacucagc uauacgagca ugggcuaccu 9960

uccugggcuc uccugcaguc cuguagaccu gcuguuccgc agaccauggg acacaagguc 10020

aguguguucc cagugagggu cccaagucag ucaucuuaag uguuuguucu cugccccauu 10080

caguggacug uugacuucag ucccugcaag ugcuuuagcc cgaguggggu uuucucagag 10140

cacugccacg aguuaagugu guguuuagcc aaauaauuuc uccguaaggg aaaaaugcag 10200

ucacccaaau uuuaccaaca augacagaga ugagaguaga aaagauuagg caacaucuga 10260

guuuuaacuu gaaaaguguc caagucauca ugaaaggccg acugggagca agugauuauu 10320

agagauucuu caggagaccu caucugaaaa uguuaagacu gccagugagg gaaggaauug 10380

uuaaaaugcc agcggcuuuu uuuuccucuu uuuuucugua auucuguaaa aaugcagaga 10440

aaguugagug guacuucaga auugagggag aggguuaccg cagaguagaa auauauuucu 10500

agauuucagu uccacaccac aaauccacaa caaugccauu uuucaacugu acaaaaaucu 10560

gcuuaugaac uggacaugau cuuaauggua gugucaaagg ccaaguuuuu caccuguuaa 10620

uauuuuucca cauuuguccu ugaaucugaa uaacuuuaua caguacugua aauuuaacuu 10680

acaucgaguu uguugucaau ucuuaugaaa agagcuuucu gcauguaaca cauacgguua 10740

aagaacacag caaaggacaa aauuugcagg aacaguuuug gaaccaacag aaaaugucac 10800

cuuuuauuug ccaucuuaua uauaucuauc aguuuuacca gcuacuucua aauuuguaca 10860

uuauuuguaa gggaaagaag gaaaacccua agacuugucu aacuuagugg agaaugugug 10920

uguugggcuu aggauggaua gcuaagucuu auugagcugu guuaccuaac uuguauauaa 10980

aaauuguaau uaaaaguuug gguucaccug uuucucacag uuuaaaauga ugaguaauug 11040

caaacucugg aaaugugacu aguauaugau uuaaggcugu agaagcaagg aagcucuuuc 11100

aagugcuaaa acuaaagacu ucuaguuuuu ggcucaaaua aguacuguuu guauaccagg 11160

auaugugaga uguaaaugua guaggucacu uuucacccuu guagcuauaa aauaaaaauu 11220

uuguagaaca gaaauagcuu guacuacuga auuaacaaaa guuauacuaa aguaucaugu 11280

uuaaaaaaaa uauauauaua uauacagagu uaagcuuguu gcuguuaccc ugucuggauu 11340

ugaaaagugu gcugauuuau auauauauau uacacacaca cacacacaca cacacacaca 11400

cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacauacacc uaaaauggcc 11460

uaaagcagac auccauguaa uuacaguugc aaaaugaaaa cauuuuggaa agaacauugu 11520

aucauaguuc auucauuugc aguggaucuu uguuccuuuu uacuguggua auuuuagaaa 11580

ugagugucaa guuugaaauu agaucugcua aguugggguu uugcugcuug aacucugcac 11640

uggguccuca aauaaaccga ugugaaugua guuuuuuccc ccugugugaa gaagcaguua 11700

caccccaaca auaggaggaa aaaucuagaa cuauuucaag uuuuaucuuu uuguauauga 11760

aaauaaaaua auaauaaaac aa 11782

<210> 9

<211> 1065

<212> RNA

<213> 智人

<400> 9

auguaccggc aucgcaagcc ccccuacggu cauguggaca uccaugagga cccugggccu 60

ccaccaccau ccccucuggu gggccugaag ccacugcagc ugcuggagau caaggcucgg 120

gggcgcuuug gcugugucug gaaggcccag cucaugaaug acuuuguagc ugucaagauc 180

uucccacucc aggacaagca gucguggcag agugaacggg agaucuucag cacaccuggc 240

augaagcacg agaaccugcu acaguucauu gcugccgaga agcgaggcuc caaccucgaa 300

guagagcugu ggcucaucac ggccuuccau gacaagggcu cccucacgga uuaccucaag 360

gggaacauca ucacauggaa cgaacugugu cauguagcag agacgauguc acgaggccuc 420

ucauaccugc augaggaugu gcccuggugc cguggcgagg gccacaagcc gucuauugcc 480

cacagggacu uuaaaaguaa gaauguauug cugaagagcg accucacagc cgugcuggcu 540

gacuuuggcu uggcuguucg auuugagcca gggaaaccuc caggggacac ccacggacag 600

guaggcacga gacgguacau ggcuccugag gugcucgagg gagccaucaa cuuccagaga 660

gaugccuucc ugcgcauuga cauguaugcc augggguugg ugcuguggga gcuugugucu 720

cgcugcaagg cugcagacgg acccguggau gaguacaugc ugcccuuuga ggaagagauu 780

ggccagcacc cuucguugga ggagcugcag gagguggugg ugcacaagaa gaugaggccc 840

accauuaaag aucacugguu gaaacacccg ggccuggccc agcuuugugu gaccaucgag 900

gagugcuggg accaugaugc agaggcucgc uuguccgcgg gcugugugga ggagcgggug 960

ucccugauuc ggaggucggu caacggcacu accucggacu gucucguuuc ccuggugacc 1020

ucugucacca auguggaccu gcccccuaaa gagucaagca ucuaa 1065

<210> 10

<211> 1539

<212> DNA

<213> 智人

<400> 10

atgacggcgc cctgggtggc cctcgccctc ctctggggat cgctgtgcgc cggctctggg 60

cgtggggagg ctgagacacg ggagtgcatc tactacaacg ccaactggga gctggagcgc 120

accaaccaga gcggcctgga gcgctgcgaa ggcgagcagg acaagcggct gcactgctac 180

gcctcctggc gcaacagctc tggcaccatc gagctcgtga agaagggctg ctggctagat 240

gacttcaact gctacgatag gcaggagtgt gtggccactg aggagaaccc ccaggtgtac 300

ttctgctgct gtgaaggcaa cttctgcaac gaacgcttca ctcatttgcc agaggctggg 360

ggcccggaag tcacgtacga gccacccccg acagccccca ccctgctcac ggtgctggcc 420

tactcactgc tgcccatcgg gggcctttcc ctcatcgtcc tgctggcctt ttggatgtac 480

cggcatcgca agccccccta cggtcatgtg gacatccatg aggaccctgg gcctccacca 540

ccatcccctc tggtgggcct gaagccactg cagctgctgg agatcaaggc tcgggggcgc 600

tttggctgtg tctggaaggc ccagctcatg aatgactttg tagctgtcaa gatcttccca 660

ctccaggaca agcagtcgtg gcagagtgaa cgggagatct tcagcacacc tggcatgaag 720

cacgagaacc tgctacagtt cattgctgcc gagaagcgag gctccaacct cgaagtagag 780

ctgtggctca tcacggcctt ccatgacaag ggctccctca cggattacct caaggggaac 840

atcatcacat ggaacgaact gtgtcatgta gcagagacga tgtcacgagg cctctcatac 900

ctgcatgagg atgtgccctg gtgccgtggc gagggccaca agccgtctat tgcccacagg 960

gactttaaaa gtaagaatgt attgctgaag agcgacctca cagccgtgct ggctgacttt 1020

ggcttggctg ttcgatttga gccagggaaa cctccagggg acacccacgg acaggtaggc 1080

acgagacggt acatggctcc tgaggtgctc gagggagcca tcaacttcca gagagatgcc 1140

ttcctgcgca ttgacatgta tgccatgggg ttggtgctgt gggagcttgt gtctcgctgc 1200

aaggctgcag acggacccgt ggatgagtac atgctgccct ttgaggaaga gattggccag 1260

cacccttcgt tggaggagct gcaggaggtg gtggtgcaca agaagatgag gcccaccatt 1320

aaagatcact ggttgaaaca cccgggcctg gcccagcttt gtgtgaccat cgaggagtgc 1380

tgggaccatg atgcagaggc tcgcttgtcc gcgggctgtg tggaggagcg ggtgtccctg 1440

attcggaggt cggtcaacgg cactacctcg gactgtctcg tttccctggt gacctctgtc 1500

accaatgtgg acctgccccc taaagagtca agcatctaa 1539

<210> 11

<211> 512

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys

1 5 10 15

Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr

20 25 30

Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg

35 40 45

Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg

50 55 60

Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp

65 70 75 80

Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn

85 90 95

Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg

100 105 110

Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro

115 120 125

Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu

130 135 140

Pro Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ile Val Leu Leu Ala Phe Trp Met Tyr

145 150 155 160

Arg His Arg Lys Pro Pro Tyr Gly His Val Asp Ile His Glu Asp Pro

165 170 175

Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Gln Leu

180 185 190

Leu Glu Ile Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln

195 200 205

Leu Met Asn Asp Phe Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys

210 215 220

Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys

225 230 235 240

His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn

245 250 255

Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser

260 265 270

Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys

275 280 285

His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp

290 295 300

Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg

305 310 315 320

Asp Phe Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val

325 330 335

Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro

340 345 350

Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu

355 360 365

Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile

370 375 380

Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys

385 390 395 400

Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu

405 410 415

Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val

420 425 430

His Lys Lys Met Arg Pro Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro

435 440 445

Gly Leu Ala Gln Leu Cys Val Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp

450 455 460

Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu

465 470 475 480

Ile Arg Arg Ser Val Asn Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu

485 490 495

Val Thr Ser Val Thr Asn Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile

500 505 510

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

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cgagccttga tctccagcag ctgc 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 13

ccccgagcct tgatctccag cagc 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 14

tcatgagctg ggccttccag acac 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 15

ggagtgggaa gatcttgaca gcta 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 16

ctggagtggg aagatcttga cagc 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

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acctggagtg ggaagatctt gaca 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

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ctcaccttgt catggaaggc cgtg 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

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gatgttcccc ttgaggtaat ccgt 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 20

cagttcgttc catgtgatga tgtt 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

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ctacatgaca cagttcgttc catg 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 22

tatgagaggc ctcgtgacat cgtc 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

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ctcatgcagg tatgagaggc ctcg 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 24

agggcacatc ctcatgcagg tatg 24

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<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

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gtgaggtcgc tcttcagcaa taca 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

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ctgtgaggtc gctcttcagc aata 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

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cacggctgtg aggtcgctct tcag 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

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ccaagccaaa gtcagccagc acgg 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 29

ggaggtttcc ctggctcaaa tcga 24

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 30

cccctggagg tttccctggc tcaa 24

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 31

cgtgggtgtc ccctggaggt ttcc 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 32

cctgtccgtg ggtgtcccct ggag 24

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 33

caatgcgcag gaaggcatct ctct 24

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

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gcatacatgt caatgcgcag gaag 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 35

cagcatgtac tcatccacgg gtcc 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

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cctgcagctc ctccaacgaa gggt 24

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 37

tgctacgata ggcaggagtg 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 38

agcaggttct cgtgcttcat 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 39

catgtggaca tccatgagga 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 40

gagacacaag ctcccacagc 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 41

tctattgccc acagggactt 20

<210> 42

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 42

gagcctctgc atcatggtc 19

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 43

gctgaagatc tcccgttcac tctg 24

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 44

tagcaggttc tcgtgcttca tgcc 24

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 45

ccacggcacc agggcacatc ctca 24

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 46

tcagccagca cggctgtgag gtcg 24

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 47

aaagtcagcc agcacggctg tgag 24

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 48

ccagcacggc tgtgaggtcg ctct 24

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 49

gtttccctgg ctcaaatcga acag 24

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 50

cgctcttcag caatacattc ttac 24

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 51

aggtcgctct tcagcaatac attc 24

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 52

agccaaagtc agccagcacg gctg 24

<210> 53

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 53

cggctgtgag gtcgctcttc agca 24

<210> 54

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 54

gccaagccaa agtcagccag cacg 24

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 55

tcgaacagcc aagccaaagt cagc 24

<210> 56

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 56

gtgtcccctg gaggtttccc tggc 24

<210> 57

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 57

caagccaaag tcagccagca cgg 23

<210> 58

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 58

gttacctgtc cgtgggtgtc ccct 24

<210> 59

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 59

ggctcaaatc gaacagccaa gcca 24

<210> 60

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 60

tccgtgggtg tcccctggag gttt 24

<210> 61

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 61

ggtcgctctt cagcaataca ttct 24

<210> 62

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 62

attcttactt ttaaagtccc tgtg 24

<210> 63

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 63

tacattctta cttttaaagt ccct 24

<210> 64

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 64

tgaggtcgct cttcagcaat acat 24

<210> 65

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 65

gtcgctcttc agcaatacat tctt 24

<210> 66

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 66

gctgtgaggt cgctcttcag caat 24

<210> 67

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 67

ggctgtgagg tcgctcttca gcaa 24

<210> 68

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 68

tcgctcttca gcaatacatt ctta 24

<210> 69

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 69

tgtgaggtcg ctcttcagca atac 24

<210> 70

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 70

gaggtcgctc ttcagcaata catt 24

<210> 71

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 71

cagcugcagu ggcuucaggc ccac 24

<210> 72

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 72

ugaucuccag cagcugcagu ggcu 24

<210> 73

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 73

ccccgagccu ugaucuccag cagc 24

<210> 74

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 74

gucauucaug agcugggccu ucca 24

<210> 75

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 75

cagcuacaaa gucauucaug agcu 24

<210> 76

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 76

aagaucuuga cagcuacaaa guca 24

<210> 77

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 77

cuggaguggg aagaucuuga cagc 24

<210> 78

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 78

aacuguagca gguucucgug cuuc 24

<210> 79

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 79

cuugagguaa uccgugaggg agcc 24

<210> 80

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 80

gauguucccc uugagguaau ccgu 24

<210> 81

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 81

ccaugugaug auguuccccu ugag 24

<210> 82

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 82

caguucguuc caugugauga uguu 24

<210> 83

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 83

uacaugacac aguucguucc augu 24

<210> 84

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 84

cgucucugcu acaugacaca guuc 24

<210> 85

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 85

cucgugacau cgucucugcu acau 24

<210> 86

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 86

uaugagaggc cucgugacau cguc 24

<210> 87

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 87

cucaugcagg uaugagaggc cucg 24

<210> 88

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 88

agggcacauc cucaugcagg uaug 24

<210> 89

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 89

ccacggcacc agggcacauc cuca 24

<210> 90

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 90

gugaggucgc ucuucagcaa uaca 24

<210> 91

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 91

agcacggcug ugaggucgcu cuuc 24

<210> 92

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 92

aagucagcca gcacggcugu gagg 24

<210> 93

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 93

gccaagccaa agucagccag cacg 24

<210> 94

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 94

aaucgaacag ccaagccaaa guca 24

<210> 95

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 95

ccuggcucaa aucgaacagc caag 24

<210> 96

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 96

ggagguuucc cuggcucaaa ucga 24

<210> 97

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 97

guguccccug gagguuuccc uggc 24

<210> 98

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 98

cuguccgugg guguccccug gagg 24

<210> 99

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 99

agccauguac cgucucgugc cuac 24

<210> 100

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 100

caccucagga gccauguacc gucu 24

<210> 101

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 101

ucucuggaag uugauggcuc ccuc 24

<210> 102

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 102

gaaggcaucu cucuggaagu ugau 24

<210> 103

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 103

caaugcgcag gaaggcaucu cucu 24

<210> 104

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 104

gcauacaugu caaugcgcag gaag 24

<210> 105

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 105

cccacagcac caaccccaug gcau 24

<210> 106

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 106

gacacaagcu cccacagcac caac 24

<210> 107

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 107

cuugcagcga gacacaagcu ccca 24

<210> 108

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 108

cgucugcagc cuugcagcga gaca 24

<210> 109

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 109

gcagcaugua cucauccacg gguc 24

<210> 110

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 110

uccaacgaag ggugcuggcc aauc 24

<210> 111

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成核酸

<400> 111

cugcagcucc uccaacgaag ggug 24

<210> 112

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成肽

<400> 112

Lys Lys Arg Thr Leu Arg Lys Asn Asp Arg Lys Lys Arg Cys

1 5 10

Claims

1.化合物或其药学上可接受的盐或水合物，所述化合物能够允许靶细胞产生突变型激活素受体2B型(ACVR2B)mRNA，其中编码野生型ACVR2B的某个或整个胞内区的序列的部分是缺失的。

2.根据权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其中所述野生型ACVR2B的胞内区由野生型ACVR2B的外显子5-11编码。

3.根据权利要求1或2的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其能够使得所述靶细胞产生缺失部分野生型ACVR2B胞内区的截短ACVR2B蛋白。

4.根据权利要求3的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其中所述截短的ACVR2B蛋白缺失由至少一个外显子编码的胞内区的全部或部分，所述至少一个外显子选自：ACVR2B的外显子5、6、7、8、9和10。

5.根据权利要求1-3中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，所述化合物为能够诱导编码ACVR2B胞内区的部分的外显子跳过的反义寡聚物。

6.根据权利要求5的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其中所被跳过的外显子选自下组：ACVR2B的外显子5，6，7，8，9和10。

7.根据权利要求5或6的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，所述化合物包含10-50个核碱基。

8.根据权利要求5-7中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，所述化合物包含与选自ACVR2B的外显子5，6，7，8，9和10的外显子的10至50个连续核苷酸互补的序列。

9.根据权利要求5-8中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其中所述外显子包含选自SEQ ID NOs:1至6的序列。

10.根据权利要求5-9中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，所述化合物包含选自SEQ ID NOs:12至36和43至111的核苷酸序列。

11.根据权利要求5-10中任何一项的化合物，所述化合物由选自SEQ ID NOs:12至36和43至111的核苷酸序列组成。

12.根据权利要求5-11中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其中所述反义寡聚物是寡核苷酸。

13.根据权利要求12的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其中所述寡核苷酸中的至少一个糖部分和/或至少一个磷酸酯键部分是经修饰的。

14.根据权利要求13的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其中所述经修饰的糖部分是其中2'-位置处的-OH基团被选自下组的任何基团取代的核糖：OR，R，R′OR，SH，SR，NH₂，NHR，NR₂，N₃，CN，F，Cl，Br和I(其中R代表烷基或芳基，R′代表亚烷基)。

15.根据权利要求13或14的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其中所述经修饰的磷酸酯键部分是选自下组的的一种：硫代磷酸酯键，二硫代磷酸酯键，烷基膦酸酯键，氨基磷酸酯键和硼烷膦酸酯键。

16.根据权利要求5-11中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，其中所述反义寡聚物包含至少一个吗啉环。

17.根据权利要求16的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，所述化合物是吗啉代寡聚物或磷酸二酰胺吗啉代寡聚物。

18.根据权利要求16或17的化合物或其药学上可接受的盐或水合物，所述化合物在其5’-末端具有下示化学式(1)至(3)所示基团中的任何一个：

19.化合物或其药学上可接受的盐或水合物结合，其是如下的缀合物：其中细胞穿透肽与根据权利要求1-18中任何一项的化合物键合。

20.药物组合物，包含根据权利要求1-19中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物。

21.根据权利要求20的药物药物组合物，其还包含至少一种药学上可接受的载剂或添加剂。

22.根据权利要求20或21的药物组合物，其是冻干的。

23.根据权利要求1-19中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物或根据权利要求20-22中任何一项的药物组合物，其用于治疗受试者。

24.根据权利要求23的供使用的化合物或其药学上可接受的盐或水合物或供使用的药物组合物，其中所述治疗是预防或治疗受试者的肌萎缩病，肌消耗病或肌肉减少病。

25.根据权利要求24的供使用的化合物或其药学上可接受的盐或水合物或供使用的药物组合物，其中所述肌萎缩病是杜氏肌营养不良症。

26.根据权利要求23-25中任何一项的供使用的化合物或其药学上可接受的盐或水合物或供使用的药物组合物，其中所述受试者是人。

27.治疗受试者的肌萎缩病，肌消耗病或肌肉减少病的方法，其包括对所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-19中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物或根据权利要求20-22中任何一项的药物组合物。

28.根据权利要求27的方法，其中所述肌萎缩病是杜氏肌营养不良症。

29.根据权利要求27或28的方法，其中所述受试者是人。

30.根据权利要求1-19中任何一项的化合物或其药学上可接受的盐或水合物在制备预防或治疗受试者的肌萎缩病，肌消耗病或肌肉减少病的药物中的用途。

31.根据权利要求30的用途，其中所述肌萎缩病是杜氏肌营养不良症。

32.根据权利要求30或31的用途，其中所述受试者是人。

33.基因操作的动物，其表达突变型激活素受体2B型(ACVR2B)mRNA，其中编码野生型ACVR2B的某个或整个胞内区的序列的部分是缺失的。