CN101121933A - 用于激酶基因过表达相关疾病的siRNA - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种用于激酶基因过表达相关疾病的siRNA，所述的siRNA对于相应的激酶基因的抑制效率为50－100％。所述的siRNA不仅可抑制相关激酶基因过表达所导致的疾病，而且还可用于作为基因组研究的有效工具，研究相关的激酶基因的功能。

Description

用于激酶基因过表达相关疾病的siRNA

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一组用于激酶基因过表达相关疾病的siRNA。

背景技术

近年来，研究人员已经初步绘出对调节人体细胞活动起重要作用的蛋白激酶的完整图谱。借助人类基因组草图，目前共识别出了518种人体蛋白激酶的基因，从而在本领域中引申出激酶组(Kinome)的概念。

已有的分析表明，蛋白激酶基因的数量在人类基因大家族中占据的份额约为1.7％，人体细胞中约30％蛋白质受到蛋白激酶的调控。激酶参与真核细胞中大多数信号通路，并在其中起关键的调节作用。如在Wnt信号通路中，有CK1α、CK1ε、GSK3β等多种激酶的参与；在ERK信号通路中，有Raf、MEK1、MEK2、ERK1、ERK2等激酶的参与。通过对底物活性的调节，激酶还控制了许多其它的细胞过程，包括代谢、转录、细胞周期进程、细胞骨架重排、以及细胞的迁移、凋亡和分化。蛋白质的磷酸化在发育，生理应答，神经和免疫系统的功能方面也起着决定性的作用。

激酶的过表达往往会影响到各种信号通路以及其它细胞过程中正常信号传导、底物活性调节等功能，从而导致细胞的生长、分化等机制发生异常，进而导致疾病的发生。因此找到抑制激酶过表达的物质，从而为治疗相关疾病提供有效途径是非常有意义的。

干扰激酶的过表达，从而中和掉部分或全部的激酶活性，是解决上述问题的一种有效途径。近年出现的RNAi技术可实现这一需求，但是，要找到合适的且可高效地干扰相关激酶过表达的siRNA并非是易事，也是本领域目前尚未实现的。

发明内容

本发明的目的在于提供一组用于激酶基因过表达相关疾病的siRNA，所述的siRNA对于相应的激酶基因的抑制效率为50-100％。

在本发明的第一方面，提供一种小干扰RNA(siRNA)，所述的小干扰RNA抑制激酶基因的表达，且表达抑制率为50-100％。

在本发明的另一优选例中，所述的小干扰RNA抑制激酶基因的过表达。

在本发明的另一优选例中，所述的表达抑制率为51-99.99％，如所述的表达抑制率可以是51％，52％，53％，54％，55％，……，95％，96％，97％，98％，99％，99.9％。

在本发明的另一优选例中，所述的激酶基因选自：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因、酪氨酸蛋白激酶基因、组氨酸蛋白激酶基因、色氨酸蛋白激酶基因、或天冬氨酰基/谷氨酰基蛋白激酶基因。

在本发明的另一优选例中，所述的小干扰RNA的序列选自下组：SEQ ID NO：1-463任一所示的序列。

在本发明的第二方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的小干扰RNA。

在本发明的第三方面，提供一种遗传工程化的细胞，它是选自下组的细胞：

(a)用所述的载体转化或转染的细胞；或

(b)用所述的小干扰RNA转化或转染的细胞。

在本发明的第四方面，提供所述的小干扰RNA的用途，用于制备抑制激酶基因过表达的组合物。

在本发明的另一优选例中，所述的组合物还用于预防或治疗与激酶基因过表达相关的疾病。

在本发明的另一优选例中，所述的激酶基因过表达相关疾病包括但不限于：肿瘤、炎症、神经或免疫系统紊乱。

在本发明的第五方面，提供一种抑制激酶基因过表达的组合物，含有0.0001-20wt％的所述的小干扰RNA，以及与所述小干扰RNA相容的载体。

在本发明的另一优选例中，所述的组合物为药物组合物(载体为药学上可接受的载体)。

在本发明的第六方面，提供一种试剂盒，所述的试剂盒中含有容器，以及位于容器内的至少一种所述的小干扰RNA。

在本发明的另一优选例中，所述试剂盒含有SEQ ID NO：1-463所示的序列中的一种或多种(如1，2，3，4，……，461，462，463)。

在本发明的另一优选例中，每个容器中含有一种小干扰RNA。

在本发明的另一优选例中，所述的试剂盒可用于抑制激酶基因的过表达或用于鉴定激酶基因的功能。

在本发明的第七方面，提供一种鉴定激酶基因的功能的方法，包括步骤：在体外，使用所述的一种小干扰RNA在细胞内干扰所述的激酶基因，使之降低表达，观察该激酶基因降低表达的细胞的变化，并与所述激酶基因表达正常的细胞进行比较，从而确定所述激酶基因的功能。

在本发明的另一优选例中，所述的细胞变化包括但不限于：细胞内蛋白的变化(包括但不限于蛋白的表达情况、磷酸化情况)，细胞信号通路的变化，细胞周期的变化，或细胞代谢、转录、骨架重排、迁移、凋亡、分化的变化。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了进行目的基因功能筛选的流程示意图。

图2显示了LK456-3对于LOC149420(CLIK1L)激酶基因的抑制情况。其中，Ctr表示细胞中转染不含相应的寡聚核苷酸的空载体的情况(以下各图中同)。

图3显示了LK304-1对于CAMKK2激酶基因的抑制情况。

图4显示了LK010-1对于CSNK1G3激酶基因的抑制情况。

图5显示了LK009-1、LK009-2、LK009-3、LK009-4对于CSNK1G2激酶基因的抑制效率。

图6显示了LK193-1、LK193-2、LK193-3对于STK10激酶基因激酶基因的抑制效率。

图7显示了LK475-1、LK475-2、LK475-3、LK475-4对于MGC8407激酶基因的抑制效率。

图8显示了pAS载体的结构。

图9显示了表达siRNA的质粒。

图10显示了pAPT载体的两种结构。

图11显示了pHA载体的两种结构。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究和试验，找到一些可预防或治疗相关激酶基因过表达所导致的相关疾病的小干扰RNA(siRNA)，本发明所述的siRNA对于相应的激酶基因的表达抑制效率约在50-100％之间。所述的siRNA还可用于作为基因组研究的有效工具，研究相关的激酶基因的功能。基于此完成了本发明。

如本文所用，所述的“表达抑制率”是指采用本发明的siRNA干扰以后，对激酶基因表达的抑制效率，作为本发明的的一种优选方式，所述的表达抑制率的计算公式如下：

RNA干扰和siRNA

如本文所用，“RNA干扰(RNA interference，RNAi)”是指一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，其也称为RNA干预或者干涉。RNA干扰是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默机制。

RNAi的作用过程包括两个步骤——起始步骤和效应步骤。在起始步骤中，导入的dsRNA被特异性识别dsRNA的RNaseIII家族成员Dicer消化成21～23nt大小的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，每个siRNA的3’端都有2～3个突出核苷酸，5’端带磷酸基团。在效应步骤中，siRNA与核酸酶复合物(包括核酸外切酶，核酸内切酶，解旋酶和类RecA蛋白等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silence complex，RISC)，RISC在ATP存在的情况下将siRNA解链成单链从而激活RISC，激活后的RISC通过碱基配对特异性识别目的基因的mRNA，继而将mRNA降解。

介导RNAi效应的双链RNA具有极强活性，少量的双链RNA就足以很大程度地抑制其同源基因的表达。在最近的一两年时间里，国际上有一些报道利用siRNA进行功能筛选的研究，但是这些研究大多不是以哺乳动物细胞为基础建立的；并且不能明确地鉴定出每一条siRNA是否能够有效抑制目的基因。

siRNA设计和合成

在设计siRNA时，本发明人选择人鼠同源的mRNA开放阅读框作为作用靶点，然后借鉴国际上采用的一些规则来设计约19nt大小的靶点序列。在确定前可以搜索BLAST数据库，保证无其它与靶基因同源的基因存在，避免引起对其它相似基因的沉寂作用。

在本发明的优选方式中，对于一种激酶基因，设计针对其不同靶区域的几个siRNA序列，通过转染细胞以选出效果最好的序列。

本发明对所述siRNA的合成方法没有特别的限制，比如可采用人工合成的方法。在本发明的优选方式中，采用体内DNA载体合成法。

在体内DNA载体合成法中，质粒载体设计的基本思路是：细胞内存在RNA聚合酶III，它可以识别H1启动子，从而使启动子后的基因转录成RNA，而遇到3～5个连续的“T”碱基时就终止转录。

根据上述的机制，可以设计一种能表达RNA的质粒，其组成包括四部分：①常用质粒的基本序列(如可采用pAS载体，pAS载体结构见图8)；②H1启动子，位于克隆位点的上游；③克隆位点；④siRNA模板序列(DNA)。

在本发明的优选方式中，所述的表达RNA的质粒见图9。④部分的序列包括两端的酶切位点，19nt的siRNA编码序列、9nt的间隔序列、反向的19ntsiRNA序列靶序列以及5个“T”的转录终止序列。将具有如上结构的质粒导入细胞内，体内的RNA聚合酶III就可以合成一条RNA链，这条RNA链可以通过两端的19个核苷酸反向互补特性而形成发夹样双链结构，最终被Dicer加工成3’端有2nt突出的21nt的siRNA产物，从而产生RNAi效应。

在本发明的优选方式中，可采用常规的方法，将编码siRNA的序列及其两端编码siRNA所需的功能序列克隆入pAS载体的BamHI/HindIII酶切位点内。

siRNA的有效性检测

可采用多种方法来检测本发明所获得的各siRNA的有效性。

作为本发明的一种优选方式，激酶基因的功能的检测可采用如图1所示的过程：首先将激酶基因构建入合适的基因表达质粒，将设计的RNAi序列构建入RNAi表达质粒(可表达本发明的siRNA)，两种表达质粒共转染细胞，从而检测RNAi的有效性，经检测有效的siRNA则可用于功能筛选、或用于相关激酶基因过表达所导致的疾病。

在本发明的更优选方式中，本发明人将目的激酶基因构建在pAPT载体或pHA载体上，将siRNA构建在pAS载体上，将两种载体共转染细胞，使s iRNA和目的激酶基因在所述细胞中表达，检测其中表达的siRNA对于目的激酶基因的干扰情况。

在本发明的更优选的方式中，针对pAPT载体或pHA载体，对应地有以下两种不同的检测手段：

1.pAPT载体上含有碱性磷酸酶(AP)基因，在其后面有一终止密码子，而激酶基因是插入到终止密码子之后，如果转入的siRNA可以抑制目的激酶基因，那么AP的转录后水平也会降低，这样通过检测AP的活性就可以判断RNAi的效果，这种检测方法灵敏度很高。

在本发明的优选方式中，代表性的pAPT载体可有两种，如pAPTa可用NheI/XhoI酶切以插入基因(参见图10A)，pAPTb可用EcoRI/NotI酶切以插入基因(参见图10B)。当然，根据所需抑制的激酶的特点，还可采用一些其它的酶切位点。

2.pHA载体上含有HA tag，基因插入到HA tag前面或后面，如果转入的siRNA可以抑制目的基因，那么带有HA tag的基因的表达水平会降低，这样通过Western Blot用anti-HA检测蛋白的表达量就可以判断RNAi的效果。

在本发明的优选方式中，代表性的pHA载体可有两种，如pHAc可用XbaI/XhoI酶切以插入基因(参见图11A，外源基因插在HA前面)，pHAd可用XhoI/NotI酶切以插入基因(参见图11B，外源基因插在HA后面)。当然，根据所需抑制的激酶的特点，还可采用一些其它的酶切位点。

siRNA的用途

(1)用于抑制激酶基因过表达

本发明的siRNA可用于抑制激酶基因的过表达，因而可用于预防或治疗相关激酶基因过表达所导致的疾病。

本领域人员均了解，激酶的过表达会影响到各种信号通路以及其它细胞过程中正常信号传导、底物活性调节等功能，从而导致细胞的生长、分化等机制发生异常，进而导致疾病的发生或发展。而本发明的siRNA可通过抑制相关激酶基因的活性，来治疗由于相关激酶基因过表达所导致的疾病。

这些siRNA可构成一个筛选库，以便于最终可以从中筛选出能够对于调节相应的细胞通道、调节细胞的生长、分化等机制特别有用的药物。

本发明获得的siRNA或含有siRNA的载体可集合在一起，制备成一种鉴定激酶基因的功能的检测试剂盒，便于快捷地鉴定相关的激酶活性。

(2)研究激酶基因的功能

在另一方面，本发明的siRNA可用于研究相关激酶基因的功能。

更具体的，可利用本发明的siRNA针对性地对生物基因组中相关的激酶基因进行干扰，使之降低表达或不表达，观察细胞或生物个体所出现的功能或个体表型的改变，从而鉴定出所述激酶在该生物基因组中的功能。

所述的细胞或生物个体所出现的功能或个体表型的改变包括但不限于：细胞内其它蛋白的变化(包括但不限于蛋白的表达情况、磷酸化情况)，细胞信号通路的变化，细胞周期的变化，或细胞代谢、转录、骨架重排、迁移、凋亡、分化的变化。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有有效量的所述的siRNA，以及药学上可接受的载体。

所述“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。

所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。在本发明中，所述的有效量一般为0.0001-20wt％siRNA。

所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

本发明所述的siRNA的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的siRNA的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的反义核苷酸每天以约0.0001-100mg/kg(优选的为0.001-50mg/kg)动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以2-4次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为0.001-100mg，较佳地约为0.005-50mg。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

任何适用的给药途径都是可以的，包括但不限于：口服、静脉内注射、皮下注射、肌肉给予、局部给予、植入、缓释给予、肿瘤内给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

可选择地，可将所述的siRNA克隆到合适的表达载体中，直接转染于动物体的相应细胞或组织进行给药。

本发明的主要优点在于：通过大量的研究，找到一系列可预防或治疗相关激酶基因过表达所导致的相关疾病的siRNA，所述的siRNA均可显著抑制相应的激酶基因的表达。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

以下实施例中所用到的一些培养基或缓冲液的配方如下：

(1)Luria Bertani(LB)培养基

Bacto-胰蛋白胨10g/L；Bacto-酵母抽提物5g/L；NaCl 10g/L；灭菌。

(2)RbCl化学感受态所需S.O.B培养液

Bacto-胰蛋白胨20g/L；Bacto-酵母抽提物5g/L；NaCl 0.6g/L；KCl0.5g/L；灭菌，使用前加入灭菌的MgCl₂、MgSO₄至终浓度10mM。

(3)感受态细胞缓冲液1

RbCl 12g/L；MnCl₂·4H₂O 9.9g/L；CaCl₂·2H₂O 1.5g/L；甘油150g/L；Kac 2.94g/L；由10％HAc调至pH5.8，过滤除菌，4℃保存。

(4)感受态细胞缓冲液2

0.5M pH6.8MOPS 20mL；RbCl 1.2g/L；CaCl₂·2H₂O 11g/L；甘油150g/L；过滤除菌，4℃保存。

实施例1构建RNAi表达质粒

1.寡聚核苷酸的制备

采用常规的方法，人工合成针对目的激酶基因靶点的寡聚核苷酸序列(合成的序列是如图9中所示的两条链，表1中提供的序列是激酶基因的靶点序列，也即同图9中上面那条链的正向链部分)(见表1)，并溶解(溶解于水中)至终浓度50μM。

表1

LiLABNo.	激酶基因	Unigene	GenBank登录号	ORF长度	SiRNA核苷酸序列号	序列	SEQ IDNO：	抑制效率
									LK001	MAP4K4-3	Hs.3628	NM_145687(V3)	3639	LK001-2	GTAGCACACTCCAGAAACA	1	65％～70％
LK004	NLK(LOC51701)	Hs.3532	NM_016231＊	1548	LK004-4	GAACCTCAGTTCTGTCCGA	2	85％～90％
														LK004-5	CACCATCACTGGAAGCAAT	3	70％～75％
LK006	CSNK1A1	Hs.318381	NM_001892	1014	LK006-1	AGTACAGAGACAACAGGAC	4	65％～70％
														LK006-2	TGTTAGCTGACCAGATGAT	5	65％～70％
					LK006-3	CAGGCAAGCAAACTGACAA	6	70％～75％
									LK010	CSNK1G3	Hs.129206	NM_004384	1344	LK010-1	GGCTTAAAGGCTGACACA	7	85％～90％
					LK010-2	GGTTGTAAGTTCTACAAAT	8	80％～85％
									LK011	CSNK2A1	Hs.446484	NM_001895	1176	LK011-1	GCAATTGTACCAGACGTTA	9	85％～90％
					LK011-2	CCAGACGTTAACAGACTAT	10	75％～80％
									LK012	CSNK2A2	Hs.82201	NM_001896	1053	LK012-1	AGCTCTGGATTACTGCCAC	11	65％～70％
LK016	MAP2K2	Hs.72241	NM_030662	1203	LK016-1	GAGAAGCACCAGATCATGC	12	55％～60％
														LK016-2	CTCCGAGAGAAGCACCAGA	13	55％～60％
					LK016-4	AGCGGTCCGAGGTGGAAGA	14	65％～70％
									LK017	MAP2K3(MKK3A)	Hs.180533	L36719	957	LK017-1	GTTCTACCGGAAGGTGCTG	15	70％～75％
LK018	MAP2K4	Hs.75217	NM_003010	1200	LK018-2	GCAACTGTGAAAGCACTAA	16	85％～90％
														LK018-3	CTGCAGAGGACTTGAAAGA	17	80％～85％
LK019	MAP2K5	Hs.250870	NM_145160	1347	LK019-2	GCCAAGACGTATGTTGGAA	18	80％～85％
									LK020	MAP2K6-1	Hs.118825	NM_002758(v1)	1005	LK020-2	GACGTCAAGCCTTCTAATG	19	85％～90％
					LK020-3	CGGTGGACTGTCCATTCAC	20	60％～65％
									LK023	MAP3K2	Hs.28827	NM_006609	1863	LK023-2	TGAGCGAATTGTTCAGTAT	21	80％～85％
LK024	MAP3K3	Hs.29282	NM_002401	1881	LK024-2	GCACAAATGGCGAGAACAT	22	75％～80％
														LK024-3	AGCTGCCAATCCTTGGACA	23	50％～55％
LK028	MAP3K7(TAK1)	Hs.7510	NM_003188	1740	LK028-1	TGACTCACTTGATGCGGTA	24	75％～80％
														LK028-2	TGGACATTGCTTCTACAAA	25	75％～80％
LK036	MAP4K1	Hs.95424	NM_007181	2502	LK036-2	CCAAGATGCTCAGTCATCA	26	60％～65％
									LK038	MAP4K3	Hs.399752	NM_003618	2685	LK038-2	TGAACTTCATGAAACATCA	27	70％～75％
LK040	MAPK1(ERK2)	Hs.458104	Z11694	1083	LK040-1	CGTTCTGCACCGTGACCTC	28	70％～75％
														LK040-2	TCCATTCAGCTAACGTTCT	29	75％～80％
LK042	MAPK4	Hs.269222	NM_002747	1674	LK042-5	GAAGATCCTGACCTTTAAC	30	60％～65％
														LK042-6	GCCATCGACTTTCTGGAGA	31	50％～55％
LK043	MAPK6	Hs.271980	NM_002748	2166	LK043-2	GTGCACATGAACTTGAACA	32	85％～90％
														LK043-3	TTATTCCCATAAGGGTCAT	33	50％～55％
LK044	MAPK7	Hs.3080	NM_139033	2451	LK044-1	TGAGAACTGTGAGCTCAAG	34	75％～80％
														LK044-2	AGAACTGTGAGCTCAAGAT	35	70％～75％
LK045	MAPK8(JNK1)	Hs.267445	NM_002750	1155	LK045-2	TGTCCTACCTTCTCTATCA	36	65％～70％
														LK045-3	TGGAGCTCATGGATGCAAA	37	70％～75％
LK046	MAPK9(JNK2)	Hs.246857	L31951	1275	LK046-1	TGGATGCTAACTTATGTCA	38	75％～80％
														LK046-2	GCCAGAGATCTGTTATCAA	39	85％～90％
LK047	MAPK10	Hs.151051	NM_002753	1269	LK047-1	TGTGGCCATTAAGAAGCTC	40	80％～85％
														LK047-2	TGAAGTGTGTGAACCATAA	41	90％～95％
LK048	MAPK11	Hs.57732	NM_002751(v1)	1095	LK048-2	GCCATAGACCTCCTTGGAA	42	60％～65％
														LK048-3	GCCCTGAGGTTCTGGCAAA	43	60％～65％
LK049	MAPK12	Hs.55039	NM_002969	1104	LK049-2	CCAGCTGAAGGAGATCATG	44	75％～80％
									LK051	MAPK14	Hs.79107	NM_001315	1083	LK051-1	GTTTCCTGGTACAGACCAT	45	65％～70％
LK054	CAMK2D	Hs.111460	NM_001221	1500	LK054-2	GCTGATGCCAGTCATTGTA	46	80％～85％
									LK056	STK22C	Hs.379372	NM_052841	807	LK056-1	GCATGGGTGTGGTCCTGTA	47	50％～55％
					LK056-2	TGCAGGGCTTCAACCTGAA	48	65％～70％
									LK062	STK35	Hs.100057	NM_080836	1206	LK062-3	GCTACGGCGTGGTTTATGA	49	65％～70％

LK063	MGC42105	Hs.25845	NM_153361	1311	LK063-2	CTGGATCCCAAACATTTGT	50	60％～65％
									LK067	ALK7	Hs.352338	NM_145259	1482	LK067-1	TGCTTGATGATACAATGAA	51	70％～75％
					LK067-2	TGACATGGTGCCTTCAGAT	52	70％～75％
									LK071	MAK	Hs.148496	NM_005906	1872	LK071-2	GCAGCTGCAACCATTAGAA	53	75％～80％
					LK071-3	GGAGCAATGCAGGAAATCT	54	70％～75％
									LK074	PRKCB1	Hs.349845	NM_002738	2022	LK074-3	GGAATATTGACCAATCAGA	55	80％～85％
LK077	SNF1LK	Hs.380991	NM_173354	2352	LK077-1	CATGTCTCAAGACTGTGAG	56	65％～70％
														LK077-2	GGATTTGGGAATTTCTACA	57	85％～90％
LK083	CASK	Hs.288196	NM_003688	2766	LK083-2	TGAAGTTTACAGTGATGAA	58	55％～60％
									LK085	KIAA0781	none	NM_015191	2781	LK085-2	GTTCTCCTATCAGACTTGT	59	65％～70％
					LK085-3	GATGCAGATAGCAGAGAGC	60	65％～70％
									LK088	PRP4	Hs.198891	NM_003913	3024	LK088-2	GTGGCTGTAAAGATCATCA	61	65％～70％
					LK088-3	GTTGTTCCTGGCATTGAAA	62	70％～75％
									LK089	TIF1	Hs.183858	NM_003852	3048	LK089-1	GTAGCCAATGCTGGTATAA	63	80％～85％
					LK089-2	GTAATCGAGGATAAAGAGA	64	65％～70％
									LK090	KIAA1804	Hs.50883	NM_032435	3111	LK090-1	GAGAGCTTCATAAAGCACA	65	55％～60％
					LK090-2	GATTTCCAGCACAAGATAA	66	65％～70％
									LK091	TRIM33	Hs.287414	NM_015906	3384	LK091-1	AGATGATGACCCAAATGAA	67	70％～75％
					LK091-3	GGGACAAACCACATTAGTA	68	55％～60％
									LK092	LATS1	Hs.324925	NM_004690	3393	LK092-1	GTCACTCTGCTAATTCTCA	69	80％～85％
					LK092-2	GAACTTACCTGTGCAGTTG	70	85％～90％
									LK094	PRKWNK4	Hs.105448	NM_032387	3696	LK094-1	GGTGAAGGAGATCATTGAA	71	50％～55％
LK101	MELK	Hs.184339	NM_014791	1956	LK101-1	GAGGCAGATGTTTGGAGCA	72	90％～95％
														LK101-2	AAGAAACGGATTTCTATGA	73	70％～75％
LK102	VRK2	Hs.82771	NM_006296	1527	LK102-1	CCACAAACAGTATCAGGAA	74	80％～85％
														LK102-2	GATATTGTCCCAATGGGAA	75	85％～90％
LK103	SUDD	Hs.209061	NM_003831	1560	LK103-2	GAATGTGCCATCAAGGTAT	76	70％～75％
									LK105	PINK1	Hs.6163	NM_032409＊	1746	LK105-2	GCGAGAGGCCAGCAAGAGA	77	55％～60％
					LK105-4	GAGAAGTGTTGTGTGGAAA	78	70％～75％
									LK107	PASK	Hs.79337	NM_015148＊	1989	LK107-1	GTGGTGGTGAAGTTTATTA	79	75％～80％
LK108	HSA250839	Hs.58241	NM_018401	1245	LK108-1	GAGACATCAAGCCAGACAA	80	80％～85％
														LK108-2	GAATCCAAGCCACTTCACA	81	80％～85％
					LK110-2	GACTTCTTATCTGACTGAA	82	80％～85％
														LK110-3	GAAGACTTCTTATCTGACT	83	85％～90％
LK112	KIAA0999	none	NM_025164	1518	LK112-1	GCAGCTACAGCCCTTCAAC	84	70％～75％
									LK113	RIPK1	Hs.296327	NM_003804	2016	LK113-1	GGGCAACCTGATGCACGTG	85	80％～85％
					LK113-3	GTACATGGAGAAGGGCAAC	86	80％～85％
									LK128	STK29	Hs.170819	NM_003957	2007	LK128-1	CGCTAGAGCACATTCAGAA	87	75％～80％
LK158	ULK2	Hs.151406	NM_014683	3111	LK158-1	GGAGCTTAATGCCTAGTAT	88	85％～90％
														LK158-2	GCAAGAACTCTTCTTGTGA	89	85％～90％
LK159	SNK	Hs.3838	NM_006622	2058	LK159-1	ACATTTACATTCTCTTGGA	90	65％～70％
														LK159-2	GCAGAGTAGCTAAACCTCA	91	85％～90％
LK162	HUNK	Hs.109437	NM_014586	2145	LK162-1	GCGCTATTTGTCAGGGAAA	92	60％～65％
														LK162-4	ATAGAGAATTTGCTACTAG	93	65％～70％
LK163	CLK4	Hs.406557	NM_020666	1446	LK163-1	GTCTGACTATGTAGTCAAA	94	80％～85％
														LK163-3	AAGAGCACCTGGCAATGAT	95	80％～85％
LK166	C8FW(Trb1)	Hs.444947	NM_025195	1119	LK166-1	GGAGAGAACCCAGCTTAGA	96	80％～85％
														LK166-2	CTCAGAAATAGGAACTTCA	97	70％～75％
LK169	PRKCN	Hs 434387	NM_005813	2673	LK169-2	TGTGAAGGCTGTGGATTAA	98	85％～90％
														LK169-3	TGATGCTCGCTGGGAAATA	99	75％～80％
LK170	IRAK2	Hs.249175	NM_001570	1773	LK170-2	GCAACGTCAAGAGCTCTAA	100	60％～65％
									LK171	RPS6KA5	Hs.109058	NM_004755	2430	LK171-1	GAGAGCGTTTCACAGAGCA	101	75％～80％
LK174	STK17A	Hs 9075	NM_004760	1245	LK174-2	GGAATCCATTGTAACCGAA	102	70％～75％
									LK175	ARK5	Hs.200598	NM_014840	1986	LK175-1	TCTGCAGCAAGCTCAACTA	103	65％～70％
LK177	IRAK1	Hs.182018	NM_001569	2139	LK177-1	GAGCCACCGCAGATTATCA	104	80％～85％
														LK177-2	GGTTTCGTCACCCAAACAT	105	65％～70％
					LK178-2	ACACATCCTTCATCGAGAT	106	75％～80％

					LK178-3	GTTTATCGGATTATTGAAG	107	80％～85％
									LK179	RIPK2	Hs.103755	NM_003821	1623	LK179-1	TGCCAAATGGATCATTAAA	108	90％～95％
					LK179-2	ATACATGCCAAATGGATCA	109	90％～95％
									LK183	PRKCQ	Hs.408049	NM_006257	2121	LK183-1	GGCCGAATGCTAATGAATG	110	55％～60％
					LK183-2	TGCTAATGAATGCAAGATA	111	70％～75％
														LK183-3	GAAATATGGTTAGAGCTGA	112	75％～80％
LK185	STK6	Hs.250822	NM_003600	1212	LK185-1	CATTAAGCCAGAGAACTTA	113	80％～85％
														LK185-3	GTGGAGCATCAGCTCAGAA	114	80％～85％
LK187	TESK2	Hs.8980	NM_007170	1668	LK187-1	TCATCCTCTGCGAGATCAT	115	70％～75％
														LK187-3	CTCGAAGCCAGTCAGATAT	116	70％～75％
LK189	NTRK2	Hs.47860	NM_006180＊	2517	LK189-1	CCTGCAGATACCCAATTGT	117	60％～65％
														LK189-2	CTGGTGCATTCCATTCACT	118	60％～65％
					LK189-3	GGAGAAGATCAAGATTCTG	119	75％～80％
									LK192	DYRK1B	Hs.130988	NM_004714	1890	LK192-1	TCAAGATCATCAAGAACAA	120	60％～65％
					LK192-2	GACCTACAAGCACATCAAT	121	65％～70％
									LK194	RNASEL	Hs.404277	NM_021133	2226	LK194-1	GGAGCAAATGTGAATTTGA	122	75％～80％
					LK194-2	GTCACTTGGTGACATTCTA	123	60％～65％
									LK202	PAK2	Hs.406154	NM_002577	1578	LK202-1	GTGATCCACAGAGACATCA	124	75％～80％
					LK202-3	GGAGGTTGCTATCAAACAA	125	85％～90％
									LK205	AKT3	Hs.161189	NM_005465	1440	LK205-1	GGATGAAGTGGCACACACT	126	75％～80％
					LK205-2	GATTGTGTACCGTGATCTC	127	75％～80％
									LK208	DYRK1A	Hs.75842	NM_001396	2292	LK208-1	GGATATACCAGTATATTCA	128	75％～80％
					LK208-2	GCAAGAAAGTTCTTTGAGA	129	70％～75％
									LK213	PRKY	Hs.56336	NM_002760	834	LK213-1	GGGATTTGAAGCCGGAGAA	130	80％～85％
LK216	PRKCL2	Hs.69171	NM_006256	2955	LK216-1	TGATGAATTTACCTCAGAA	131	75％～80％
														LK216-2	CAGGTCACGTGAACTGGAA	132	65％～70％
LK217	EPHA5	Hs.201920	NM_004439	3114	LK217-1	GTCGAAGATTTGAGTTTGA	133	75％～80％
														LK217-2	ACAGTAACCTTGTGTGCAA	134	80％～85％
					LK217-3	GAATTACCTGTGGCTATCA	135	90％～95％
									LK218	HIPK3	Hs.30148	NM_005734	3648	LK218-1	CAGAGCTCCAGAGATTATA	136	70％～75％
					LK218-2	CAGGAATGAAGTCTAAAGA	137	70％～75％
									LK220	PKU-β(TLK1)	Hs.18895(TLK1)	AB004885	2364	LK220-1	GAATCTTGTGAAGCAACAA	138	70％～75％
					LK220-2	CTTAGACTAGGACATCTCA	139	60％～65％
									LK222	FLT1	Hs.347713	NM_002019	4017	LK222-1	GCACGCTGTTTATTGAAAG	140	70％～75％
					LK222-2	TGAGCCTGGAAAGAATCAA	141	60％～65％
									LK226	SRPK1	Hs.75761	NM_003137	1965	LK226-1	GAAGCGCCAGGCAGAATTA	142	80％～85％
					LK226-2	AATGGTTGTTCAACTACTA	143	80％～85％
									LK230	MAPKAPK2	Hs.75074	NM_004759	1113	LK230-1	GACCAGGCATTCACAGAAA	144	70％～75％
LK231	JAK3	Hs.99877	NM_000215	3375	LK231-3	ACGAGCTCTTCACCTACTG	145	65％～70％
									LK233	TXK	Hs.29877	NM_003328	1584	LK233-1	ATGAAGGCTTAATCCCAAG	146	70％～75％
					LK233-2	GTGGTATGTGGCTGAAAGA	147	75％～80％
									LK235	NTRK3	Hs.26776	NM_002530	2478	LK235-2	GTAACCGGCTCACCACACT	148	65％～70％
LK241	PRKG1	Hs.2689	NM_006258	2061	LK241-1	GCGACCGTCAAGACTCTTG	149	60％～65％
									LK247	ITK	Hs.211576	NM_005546	1863	LK247-1	CCTATGAGTGGTACAATAA	150	75％～80％
LK249	BRAF	Hs.162967	NM_004333	2298	LK249-2	CGTGAAAGCCTTACAGAAA	151	75％～80％
									LK252	AKT1	Hs.368861	NM_005163	1443	LK252-1	CCATGAACGAGTTTGAGTA	152	65％～70％
LK253	RPS6KA1	Hs.149957	NM_002953	2208	LK253-1	TGAGGAGGGCCACATCAAA	153	80％～85％
														LK253-2	GCCTGGGCATTCTGCTGTA	154	65％～70％
					LK253-3	CTCCACCATTGACTGGAAT	155	75％～80％
									LK254	PRKACB	Hs.87773	NM_002731	1056	LK254-1	GAACCTGCTGCAGGTGGAT	156	80％～85％
					LK254-2	AATTGGAAGGTTCAGTGAG	157	65％～70％
									LK256	PRKACA	Hs.77271	NM_002730	1056	LK256-1	GTAACTTTGACGACTATGA	158	60％～65％
					LK256-3	CCAAGCGCTTTGGGAACCT	159	70％～75％
									LK257	ADRBK2	Hs.13944	NM_005160	2067	LK257-1	CTCAAAGCAAGCTGTAGAA	160	65％～70％
					LK257-3	GGAACTTCTTTCCTGTTCA	161	75％～80％
									LK259	PRKCA	Hs.169449	NM_002737	2019	LK259-2	GGAGCAAGCACAAGTTCAA	162	85％～90％
LK260	STK38	Hs.8724	NM_007271	1398	LK260-1	CAGTTTGTGGGTTGTGAAA	163	80％～85％

					LK260-2	AGCTAAACCTCTACCTAAT	164	80％～85％
									LK261	PRKCI	Hs.355476	NM_002740	1764	LK261-2	CAGACAGTAATTCCATATA	165	75％～80％
					LK261-3	TGAGCGAGGGATAATTTAT	166	85％～90％
									LK263	SGK	Hs.296323	NM_005627	1296	LK263-1	CATCGTTTATAGAGACTTA	167	75％～80％
					LK263-2	GAATGTGAAGCACCCTTTC	168	75％～80％
									LK264	PRKG2	Hs.41749	NM_006259	2289	LK264-1	CCAAATGATGACCTACAAT	169	80％～85％
					LK264-2	GAAAGGCTGGGAAATCTGA	170	80％～85％
									LK265	PDPK1	Hs.154729	NM_002613	1671	LK265-1	GCAACATAGAGCAGTACAT	171	70％～75％
					LK265-2	GGGTTTATTTGCAAGACGA	172	85％～90％
									LK266	RPS6KA2	Hs.301664	NM_021135	2202	LK266-4	GATCAAGCCACCGTTCAAA	173	60％～65％
					LK267-2	CTATGATTCTTAAAGCCAA	174	75％～80％
									LK270	STK38L(NDR2)	Hs.184523	BC028603	1395	LK270-1	GGCCATATCTATGCAATGA	175	75％～80％
					LK270-2	GAAAGTCTGATATGCTTGA	176	80％～85％
									LK271	SGK2	Hs.62863	NM_016276	1284	LK271-1	GAACTACGGGAAGGTCCTA	177	70％～75％
LK272	RPS6KL1	Hs.194286	NM_031464	1626	LK272-2	GGAGATCTTCAACTGCCAC	178	55％～60％
									LK277	PRKAA1	Hs.9247	NM_006251	1653	LK277-1	CGAAGGAAGAATCCTGTGA	179	80％～85％
					LK277-2	GCCAAATCAGGGACTGCTA	180	75％～80％
									LK278	GS3955	Hs.155418	NM_021643	1032	LK278-1	GGAAATTCTGGACCATCCT	181	70％～75％
					LK278-2	AGTGCCTCATCCGAAGCAT	182	75％～80％
									LK281	STK17B	Hs.120996	NM_004226	1119	LK281-1	GCAACAGATATGTGGAATA	183	85％～90％
					LK281-2	GATGTTATCAGACTCATTA	184	95％～100％
									LK282	CHEK1	Hs.24529	NM_001274	1431	LK282-1	TGAAAGGGATAACCTCAAA	185	70％～75％
					LK282-2	CAGGGATATTAAACCAGAA	186	90％～95％
									LK284	STK11	Hs.301772	NM_000455	1302	LK284-2	GTATATGGTGATGGAGTAC	187	75％～80％
					LK284-3	GGCCAACGTGAAGAAGGAA	188	60％～65％
									LK285	MARK1	Hs.12808	NM_018650	2388	LK285-1	GAAGTACGAATAATGAAGA	189	85％～90％
					LK285-2	GTCTGGGCGTCATTCTCTA	190	85％～90％
														LK285-3	CGAATAATGAAGATACTGA	191	85％～90％
LK286	MARKL1	Hs.118843	NM_031417	2067	LK286-1	GGTCACAAGTTGCCATCTA	192	70％～75％
														LK286-4	AGACAAATGGATCAACATC	193	60％～65％
LK287	CAMK1G	Hs.199068	NM_020439	1431	LK287-2	ATGGCATCGTCCACAGAGA	194	75％～80％
														LK287-3	TGATCACTGACTTTGGTCT	195	60％～65％
					LK287-4	AGTGGAGGCAAGCCTTCAA	196	65％～70％
														LK287-5	CCCACTACTACCTGGTCAT	197	50％～55％
LK289	RAGE	Hs.104119	NM_014226	1260	LK289-2	GGGATCAGGAATACCTCTA	198	70％～75％
														LK289-3	GTAAATGAACTGGACCAAA	199	65％～70％
LK290	MAPKAPK5	Hs.30327	NM_003668	1416	LK290-1	GAAGCAAGCCAGCCAAGTA	200	75％～80％
														LK290-3	GAGCTATTTCACAGAATCA	201	65％～70％
LK291	MKNK1	Hs.5591	NM_003684	1398	LK291-1	GCACTTCAATGAGCGAGAA	202	70％～75％
														LK291-2	GCCAGAACAAGCTGTTTGA	203	60％～65％
					LK291-3	CACTTCAATGAGCGAGAAG	204	85％～90％
									LK292	CHEK2	Hs.146329	NM_007194	1632	LK292-1	AGATGATCAGTCAGTTTAT	205	75％～80％
					LK292-2	TCAGTCAGTTTATCCTAAG	206	70％～75％
									LK293	CKLiK	Hs.130065	NM_020397	1074	LK293-1	GGACAGTTCAAATGCAAGT	207	75％～80％
					LK293-2	GAGGGCAAAGGAGATGTGA	208	55％～60％
									LK295	C20orf97(Trb3)	Hs.344378	BC027484	1077	LK295-1	GCTGTGTCGCTTTGTCTTC	209	85％～90％
					LK295-2	GCTGGTGCTAGAGAACCTG	210	65％～70％
														LK295-3	GATGATTCCCTGTGGGACA	211	70％～75％
					LK295-4	GCACTGAGTATACCTGCAA	212	75％～80％
									LK297	MYLK2	Hs.86092	NM_033118＊	1791	LK297-3	GGTCATGAACCAGCTGAAC	213	60％～65％
					LK297-5	GGAGATTGAGGTCATGAAC	214	75％～80％
														LK297-6	CGGGATCCTCTTCATGCAC	215	60％～65％
LK298	ACVR2B	Hs.23994	NM_001106	1539	LK298-1	AGGGCTCCCTCACGGATTA	216	65％～70％
														LK298-2	TGTCACGAGGCCTCTCATA	217	75％～80％
LK301	PTK6	Hs.51133	NM_005975	1356	LK301-1	TGAAGAAGCTGCGGCACAA	218	65％～70％
									LK304	CAMKK2	Hs.297343	AF140507	1767	LK304-1	CTTCCAGGATCTGATCAAA	219	65％～70％

					LK304-2	TGAGGACCATCTGTACATG	220	70％～75％
														LK304-3	AATTGGAAAGGGCTCCTAT	221	75％～80％
					LK305-2	GTTCATGCTTGTTTACAAA	222	65％～70％
									LK306	LYN	Hs.80887	NM_002350	1539	LK306-1	GTCTGGATGGGTTACTATA	223	80％～85％
					LK306-2	TCGAGCGGAAGAACTACAT	224	75％～80％
														LK306-3	CTGCCCAGATGAGCTCTAT	225	65％～70％
LK307	AMHR2	Hs.437877	NM_020547	1722	LK307-2	GAATGTGCTCATTCGGGAA	226	70％～75％
														LK307-4	CTGACTTCTGCAATGCCAA	227	65％～70％
LK308	PKMYT1	Hs.77783	NM_004203	1500	LK308-3	GAGTCCTTCTTCCAGCAGA	228	70％～75％
														LK312-3	AGTGGGTTGACTACTCCAA	229	70％～75％
LK313	TEK	Hs.89640	NM_000459	3375	LK313-1	GAAGATGCAGTGATTTACA	230	90％～95％
														LK313-2	TGATGAGGTGTATGATCTA	231	80％～85％
LK314	YES1	Hs.194148	NM_005433	1632	LK314-1	TGAAAGACCAACATTTGAA	232	75％～80％
														LK314-2	CTACACAGAACATGCTGAT	233	75％～80％
LK315	FRK	Hs.89426	NM_002031	1518	LK315-1	GATAGACCGCAACTCCATA	234	65％～70％
														LK315-2	GAGTTGATGAGACATGGAA	235	70％～75％
LK316	PTK2B	Hs.20313	NM_004103	3030	LK316-2	GCATAGAGTCAGACATCTA	236	70％～75％
														LK316-3	CTCATTCAAGGATGGAACA	237	65％～70％
LK317	OSR1	Hs.95220	NM_005109	1584	LK317-1	GCTGCTAAGTGGAGGTTCT	238	75％～80％
														LK317-2	CTGGTGTTCAAGATAAAGA	239	80％～85％
LK319	C20orf64	Hs.440263	NM_033550	762	LK319-2	CACCACCTCCAACATGCTC	240	80％～85％
														LK319-3	CCTCTATGTCCTGGAGAAG	241	75％～80％
LK320	topK	Hs.104741	NM_018492	969	LK320-2	GTGATGTAGGAGTCTCTCT	242	90％～95％
														LK320-4	GCCATGGAAACCCAAAGAA	243	85％～90％
LK322	PTK9	Hs.82643	NM_002822	1053	LK322-1	GAGAGCGGATGCTGTATTC	244	70％～75％
														LK322-3	GTGCAGTTGGAAATAGATA	245	80％～85％
LK323	BCKDK	Hs.20644	NM_005881	1239	LK323-1	GAGCCACAATGGAGAGTCA	246	75％～80％
														LK323-2	GACGCCTGTGTGAGCACAA	247	65％～70％
LK325	PDK3	Hs.193124	NM_005391	1221	LK325-1	TGAACAGTATTACCTGGTA	248	85％～90％
														LK325-2	GTATTACCTGGTAGCTCCA	249	80％～85％
					LK325-3	GTTGAAGAATTCAATGCCA	250	90％～95％
									LK326	PDK4	Hs.8364	NM_002612	1236	LK326-1	AGTCAGCCTTCAAACATTA	251	80％～85％
					LK326-2	GAGATCTGAATCTCTACT	252	80％～85％
									LK327	CABC1	Hs.273186	NM_020247	1107	LK327-2	ATCCATAGAGATGAAGTTC	253	65％～70％
					LK327-3	TGTGCCTGAGATTGTGGAT	254	55％～60％
									LK328	BRD3	Hs.86896	NM_007371	2181	LK328-1	TGCAGGACTTCAACACCAT	255	80％～85％
					LK328-3	CTGGAGAGATATGTCAAGT	256	85％～90％
									LK329	H11	Hs.111676	NM_014365	591	LK329-1	GAGGAGTTGATGGTGAAGA	257	75％～80％
					LK329-2	GGTGGATCCTGTGACAGTA	258	70％～75％
									LK331	ARAF1	Hs.423807	NM_001654	1821	LK331-1	CAAGTTCCACCAGCATTGT	259	75％～80％
					LK331-3	ACCGGGACTCAGGCTATTA	260	65％～70％
									LK332	BMPR1A	Hs.2534	NM_004329	1599	LK332-1	GGATGAAGCATTTATTCCA	261	75％～80％
					LK332-2	CTATTGCCAAACAGATTCA	262	70％～75％
									LK333	BMPR1B	Hs.87223	NM_001203	1509	LK333-3	GTGGCTTATGTCATTTACA	263	65％～70％
					LK333-4	GTTGGCACCAAACGCTATA	264	70％～75％
									LK334	BMX	Hs.27372	NM_001721	2028	LK334-4	GACTGGTGGCAAGTAAGAA	265	70％～75％
LK335	BTK	Hs.159494	NM_000061	1980	LK335-1	GAACAGGAATGGAAGCTTA	266	90％～95％
														LK335-2	TCCCTGAGCTCATTAACTA	267	60％～65％
					LK335-3	GAAGCCAAAGTCATGATGA	268	85％～90％
									LK336	BUB1	Hs.287472	NM_004336	3258	LK336-1	GAAGGCTTCCTCATTTGGA	269	75％～80％
					LK336-2	GGCTTCCTCATTTGGATAT	270	75％～80％
									LK337	CAMKK1	Hs.8417	NM_172206	1518	LK337-2	CAGACACTATGCAATGAAA	271	75％～80％
					LK337-3	GAAGTTACTGAAGCAGTAT	272	70％～75％
									LK338	CCRK	Hs.26322	NM_012119	1359	LK338-1	AGAGCTACCTGCAGATGCT	273	60％～65％
					LK338-5	GGAGAAGTGCAGAGAGTAA	274	65％～70％
									LK339	CDC2	Hs.334562	NM_001786	894	LK339-1	TTGATGACAAAGGAACAAT	275	70％～75％
					LK339-2	CAATCAGATTAAGAAGATG	276	50％～55％

					LK339-3	GGACAATCAGATTAAGAAG	277	70％～75％
									LK340	CDK2	Hs.19192	NM_001798	897	LK340-3	CGGAGCTTGTTATCGCAAA	278	80％～85％
					LK340-4	TCCCTGGAGATTCTGAGAT	279	70％～75％
									LK343	CDK5	Hs.166071	NM_004935	879	LK343-1	CCAAGCTGCCAGACTATAA	280	80％～85％
					LK343-2	AGCTGTACTCCACGTCCAT	281	80％～85％
									LK344	CDK6	Hs.38481	NM_001259	981	LK344-2	GCAAAGACCTACTTCTGAA	282	80％～85％
					LK344-3	GACCACTTACTTGGATAAA	283	55％～60％
									LK345	CDK7	Hs.184298	NM_001799	1041	LK345-1	CCTACATGTTGATGACTCT	284	65％～70％
					LK345-2	AGCCTACATGTTGATGACT	285	80％～85％
									LK347	CDKL2	Hs.143241	NM_003948	1482	LK347-2	CAGTCACAATATCATACAC	286	65％～70％
LK349	CLK3	Hs.73987	NM_003992	1473	LK349-1	ACACCTTTGAGTTCCTGAA	287	65％～70％
														LK349-2	TGATCCACCGTACCAGGAA	288	60％～65％
					LK350-2	GGAGGTGTACTTTGAGAAC	289	70％～75％
									LK351	DDR2	Hs.71891	NM_006182	2568	LK351-3	AGGTCCACTGCAACAACAT	290	70％～75％
					LK351-4	GATCATGTTTGAATTTGAC	291	75％～80％
									LK352	DYRK2	Hs.173135	NM_006482	1806	LK352-1	CAGCCTTCGAACACCATGA	292	55％～60％
LK353	DYRK3	Hs.164267	NM_003582	1662	LK353-1	GTTATTGGTGGTCCCAATA	293	75％～80％
														LK353-2	GAGACCAGTTGGCCTGCAT	294	70％～75％
LK355	EPHB1	Hs.272311	NM_004441	2955	LK355-1	AGGAGACCTTCAACTTGTA	295	85％～90％
														LK357-3	ACGGGAAGGAGTTTAAGCA	296	70％～75％
LK358	FGR	Hs.1422	NM_005248	1590	LK358-1	AGTTCCACATCCTGAACAA	297	80％～85％
														LK358-2	GGGCATGGCCTACATGGAA	298	75％～80％
LK360	HRI	Hs.258730	NM_014413	1893	LK360-2	GGATAGAACATGTTCATGT	299	70％～75％
														LK360-3	GCAAGCCAAGTATATCCAG	300	70％～75％
LK361	ICK	Hs.108850	NM_016513	1899	LK361-1	GGGACCAGAACTTGTGAAA	301	75％～80％
														LK361-2	CTGACTGGCCTGAAGGCTA	302	65％～70％
LK362	IRAK4	Hs.142295	NM_016123	1383	LK362-1	AGAAATAACACCCAAATCT	303	75％～80％
									LK363	LIMK1	Hs.36566	NM_002314	1944	LK363-2	GACCGGATCTTGGAAATCA	304	65％～70％
					LK363-4	GACCTCAACTCCCACAACT	305	65％～70％
									LK364	LIMK2a	Hs.278027	NM_005569	1917	LK364-1	GAAGGTCAGGTTTGCCAAA	306	70％～75％
					LK364-2	TCGTTCTCTGTGAGATCAT	307	70％～75％
									LK365	NEK2	Hs.153704	NM_002497	1338	LK365-1	CGAGTGATGACTCAGTTGA	308	75％～80％
					LK365-3	GGCGAATTCCATACCGTTA	309	90％～95％
									LK366	NEK6	Hs.9625	NM_014397	942	LK366-1	CTATGGAGATAAGATGAAT	310	65％～70％
					LK366-2	GATAAGATGAATCTCTTCT	311	75％～80％
									LK367	PAK1	Hs.64056	NM_002576＊	1638	LK367-1	GATGAGCTGTGGGTTGTTA	312	80％～85％
					LK367-2	GCTGTGGGTTGTTATGGAA	313	80％～85％
									LK368	PAK3	Hs.152663	NM_002578	1635	LK368-1	GAATCCTGAGAGACTGTCA	314	80％～85％
					LK368-2	GGACAGATAGCAGCTGTCT	315	80％～85％
									LK369	PAK6	Hs.21420	NM_020168	2046	LK369-2	GCAGATTGCCACTGTGTGT	316	80％～85％
					LK369-3	TCAAGGCTGCGCTCAGGAT	317	75％～80％
									LK370	PDGFRB	Hs.76144	NM_002609	3321	LK370-3	AGCTGGTCAAGATCTGTGA	318	65％～70％
LK371	PDK1	Hs.61712	NM_002610	1311	LK371-2	CATTGGAAGCATAAATCCA	319	75％～80％
														LK371-3	CAAGTGGTTTATGTACCAT	320	65％～70％
LK373	PHKG2	Hs.196177	NM_000294	1221	LK373-3	AGGAAACCAGGTCCATCAT	321	70％～75％
														LK373-5	GAGCTGTTTGACTATCTCA	322	70％～75％
					LK374-3	TGAATACAGTATTCCCAAG	323	60％～65％
									LK375	PRKR	Hs.274382	NM_002759	1656	LK375-1	ATGGAATTCTGTGATAAAG	324	80％～85％
					LK375-3	GTCCCAAAGCAACTCTTTA	325	80％～85％
									LK376	RAF1	Hs.349650	NM_002880	1947	LK376-1	TGAGCACTGTAGCACCAAA	326	80％～85％
					LK376-2	GCACCAAAGTACCTACTAT	327	85％～90％
									LK377	SLK	Hs.105751	NM_014720	3459	LK377-1	GCAGCTTAAAGATCAGTAT	328	65％～70％
					LK377-2	GTTTGCTGCACAAGAAGAA	329	70％～75％
									LK379	SRPK2	Hs.221688	NM_182691	2061	LK379-1	TCATCAAATCCAACTATCA	330	60％～65％
					LK379-2	CGTTGTGTGAAGAGTATCA	331	80％～85％
														LK381-2	GAGATTTACTATCAGTTCA	332	85％～90％
LK384	TIE	Hs.78824	NM_005424	3417	LK384-1	GGCACTTGTGACCGGTTCA	333	80％～85％

					LK384-3	ACATGTCGCTGTTTGAGAA	334	65％～70％
									LK385	TTK	Hs.169840	NM_003318	2574	LK385-1	GAATGCTAAAGCTAATTGA	335	70％～75％
					LK385-2	ACTTGTTGGTCTGAATTCT	336	65％～70％
									LK386	TYK2	Hs.75516	NM_003331	3664	LK386-1	CCACAAGCGCTATTTGAAA	337	75％～80％
LK389	VRK1	Hs.422789	NM_003384	1191	LK389-1	GCTTAAGAATTCTGGATAT	338	85％～90％
														LK389-2	AGACGTGGTGATTTGGAAA	339	95％～100％
LK391	CDC7L1	Hs.28853	NM_003503	1725	LK391-1	GTGGTCTGCAGGTGTCATA	340	90％～95％
														LK391-2	TACACAGCTCCATTTCACA	341	85％～90％
LK392	STK12	Hs.180655	NM_004217	1035	LK392-1	ACTTGGCTCGGGAGAAGAA	342	75％～80％
														LK392-3	GGAGTTGGCAGATGCTCTA	343	75％～80％
LK393	STK13	Hs.98338	NM_003160＊	828	LK393-2	GCGCACAGCCACGATAATA	344	80％～85％
														LK393-3	GGGGAGAACATATGATGAA	345	75％～80％
LK397	STK22D	Hs.333138	NM_032028＊	1104	LK397-3	GCCGTCGACTATGGAGACA	346	65％～70％
														LK397-4	GGCGTGATCCTCTACATCA	347	75％～80％
LK398	STK23	Hs.104865	NM_014370	1602	LK398-1	GGAAGAAGATGAGGCGCAA	348	60％～65％
									LK399	STK25	Hs.155206	NM_006374	1281	LK399-1	AGGAGCTCCTGAAGCACAA	349	70％～75％
					LK399-2	TTCCTGATTCCCAAGAACA	350	60％～65％
									LK400	STK4	Hs.35140	NM_006282	1464	LK400-1	GAAGATGAAATAGCTACAA	351	85％～90％
					LK400-2	GTGCCAAAGGAGTGTCAAT	352	85％～90％
									LK405	DAPK2	Hs.129208	NM_014326	1113	LK405-1	GAAGATGGAGTTGAATTTA	353	70％～75％
					LK405-2	CGACTTTGATGAGGAATTC	354	70％～75％
									LK406	CDK11	Hs.129836	NM_015076	1509	LK406-1	GACTGGGAAGATATTAGAA	355	70％～75％
					LK406-2	GGTCAAGCCTGACAGCAAA	356	80％～85％
									LK407	ADCK4(FLJ 12229)	Hs.130712	NM_024876	1635	LK407-2	GGCTTTGAAACCAAGGCAT	357	75％～80％
					LK407-3	GATGCTGAGAGTTCTTGAA	358	80％～85％
									LK409	ABL1-a	Hs.446504	NM_005157	3393	LK409-2	ATCCACCAAGCCTTTGAAA	359	60％～65％
					LK409-3	CCAGGAATCCAGTATCTCA	360	80％～85％
														LK409-5	CCTTGAAGGAGGACACCAT	361	70％～75％
LK410	STK33	Hs.148135	NM_030906	1545	LK410-1	TGTGGGACTCCTATCTATA	362	80％～85％
														LK410-2	GTAGATCCTGCTCACAGAA	363	95％～100％
LK412	CDK9	Hs.150423	NM_001261	1119	LK412-2	CGGCCTCTACTACATCCAC	364	65％～70％
									LK413	PSKH1	Hs.150601	AJ272212	1275	LK413-2	AGGACTTCATTGACCGCCT	365	70％～75％
					LK413-3	GAGCTCTTTGACCGCATCA	366	75％～80％
									LK414	LOC57143	Hs.15251	NM_020421	1368	LK414-2	GTGAGATGATCTTCGTCAA	367	85％～90％
					LK414-3	GAAGAAGAATACCTGTTCA	368	85％～90％
									LK418	PRKCD	Hs.155342	L07861	2031	LK418-3	CTGGTGAAGCAGGGATTAA	369	60％～65％
LK419	PRKACG	Hs.158029	M34182	1083	LK419-3	GCTGGATCGCCATCTATGA	370	60％～65％
														LK419-4	GCTCCGGATCTCCATCAAT	371	65％～70％
LK422	STK3	Hs.166684	NM_006281	1476	LK422-1	ACCTCCTTATGCTGATATA	372	80％～85％
														LK422-2	TGGACTACTTTGATAAGCA	373	80％～85％
LK425	DYRK4	Hs.439530	BC031244	1563	LK425-1	GGTGGCCAAGTGCTTGGAT	374	70％～75％
														LK425-2	GCTGTTATGAACACCAGAA	375	85％～90％
LK426	FLJ32685	Hs.174379	NM_152534	1455	LK426-2	GATATCAGATGTCATGATG	376	85％～90％
														LK426-3	GATGCAGACTGTGATTGAA	377	80％～85％
LK427	LCK	Hs.1765	U07236	1539	LK427-1	AACATTACAAGATCCGTAA	378	70％～75％
														LK427-2	ACGGTGGCTTCTACATCTC	379	70％～75％
LK429	KIAA1765(DCAMKL3)	Hs.207617	AB051552	1828	LK429-1	GCATGTGGTGAGACCTATA	380	70％～75％
									LK430	CLK1	Hs.433732	NM_004071	1455	LK430-2	TGTGATGTCTGGAGCATAG	381	85％～90％
					LK430-3	GTACTTACGACTTCATTAA	382	75％～80％
									LK434	NEK3	Hs.2236	NM_002498	1521	LK434-1	TTATTATGTGCCTCCAGAA	383	75％～80％
					LK434-3	AAGTGACATCTGGTCCTTG	384	65％～70％
									LK436	TR IM28	Hs.228059	NM_005762	2508	LK436-1	GATCATGAAGGAGCTGAAT	385	70％～75％
					LK436-3	AAGACATCGTGGAGAATTA	386	70％～75％
									LK437	ZAP70	Hs.234569	NM_001079	1860	LK437-1	GTGACTGCTGGATCTACAA	387	70％～75％

LK439	PACE-1	Hs.24243	NM_020423	2067	LK439-1	GGAGGAGAACGAACCAAGA	388	75％～80％
														LK439-2	GCCTACGTGGAGCACTTCA	389	70％～75％
LK440	DKFZp761P1010	Hs.24979	NM_018423	1269	LK440-3	GCTGCACACATACCATGTA	390	75％～80％
														LK440-4	GTTCTGGAGCAGATTTGCA	391	65％～70％
LK441	BC064422	none	BC064422	726	LK441-2	GTGAGCAGATCCGGAAGAA	392	65％～70％
									LK442	LOC203806	Hs.256916	XM_114973	1644	LK442-1	GATCTCACATACAGTGTAA	393	80％～85％
					LK442-2	AGTTGTGTTGCTTGATACA	394	90％～95％
									LK443	ACVR2	Hs.389846	NM_001616	1542	LK443-1	GGAAGTTGTTGTGCATAAA	395	75％～80％
					LK443-2	TGTGTAGGTGAAAGAATTA	396	70％～75％
									LK445	RIOK2	Hs.27021	NM_018343	1659	LK445-1	TCAGTATATGATGAAGCTA	397	60％～65％
					LK445-2	AGGAATTTGCCTATATGAA	398	65％～70％
									LK447	NRBP	Hs.272736	NM_013392	1608	LK447-1	CAACAGCAGTGGACATCTA	399	65％～70％
					LK447-3	GTGACCTGATGCCAAATGA	400	60％～65％
									LK449	LOC340371(NRBP2)	Hs.274401	AF318376	882	LK449-1	TCCAGCACCAGTACCTCAT	401	65％～70％
LK450	FLJ23356	Hs.277431	NM_032237	1053	LK450-1	CACTAAACCTTTCAAAGTA	402	80％～85％
														LK450-2	AAACCTTTCAAAGTACCAA	403	65％～70％
LK451	BRD4	Hs.278675	NM_014299	2169	LK451-1	TGAGCACAATCAAGTCTAA	404	80％～85％
														LK451-2	AGCTGAACCTCCCTGATTA	405	85％～90％
					LK451-3	AGGAGATGTTTGCCAAGAA	406	60％～65％
									LK462	HUMCALMODU	Hs.348	L17000	1422	LK462-1	CATGTGGTCTGTAGGAATA	407	65％～70％
					LK462-2	AACGGCTGACTACATTTCA	408	70％～75％
									LK464	MGC22688(YANK1)	Hs.352370	BC021666	501	LK464-1	TCATTCACAGGGATATGAA	409	80％～85％
					LK464-2	GTGAAGCTCTTCATCTGTG	410	85％～90％
									LK465	BUB1B	Hs.36708	NM_001211	3153	LK465-4	GGCAGGTCCTTGGAACACA	411	75％～80％
					LK465-5	GCTGAGCCCAATTATTGAA	412	70％～75％
									LK467	SGKL	Hs.380877	NM_013257	1290	LK467-1	GCTGTCAAAGTGTTACAGA	413	85％～90％
					LK467-2	CCAGATGATATCAGAAACT	414	80％～85％
									LK468	TNK1	Hs.406138	BC035782	1986	LK468-2	GAGGTATCGGTCATGATGA	415	80％～85％
					LK468-3	GAAGGCAAATCTTTGGGAT	416	60％～65％
									LK469	LOC91461	Hs.433279	XM_038576	1053	LK469-1	GGGAGGATCGATTCCGAAT	417	80％～85％
					LK469-3	GTACCGAGTACCAGTGTAT	418	85％～90％
									LK472	TLK2	Hs.57553	NM_006852	2250	LK472-2	GGTTTCAGTGAAGTTTACA	419	70％～75％
					LK472-3	TGATGATAGCTACAATTCA	420	75％～80％
									LK473	ALS2CR2	Hs.259230	NM_018571	1257	LK473-1	GGGTTATTTCTCCATTTAT	421	80％～85％
					LK473-2	GTGAAGTCAGATATTTACA	422	80％～85％
									LK474	ILK	Hs.6196	NM_004517	1359	LK474-1	TCAACCGTATTCCATACAA	423	70％～75％
					LK474-2	GCCTGAAGACACAAACAGA	424	75％～80％
									LK476	DustyPK	none	NM_015375	2790	LK476-2	TGAATATTGCCAACCGAAA	425	80％～85％
LK477	FLJ10074	Hs.71573	NM_017988	1341	LK477-1	ACTAAGGACTTGACAGACA	426	80％～85％
														LK477-3	AAAGCCAGCAGCCTCTTAA	427	70％～75％
LK480	FASTK	Hs.75087	X86779	1650	LK480-1	GTCAGCTCATCATCCGAAA	428	80％～85％
														LK480-3	GTACAGTCACAAGGACATA	429	80％～85％
LK481	WEE1	Hs.75188	NM_003390	1941	LK481-1	CTGTCAGCCTTACTATATA	430	85％～90％
														LK481-3	CATGGAAGCCAGTGATTAT	431	90％～95％
LK483	CAK(DDR1)	Hs.423573	L20817	2742	LK483-1	AGATGGAGTTTGAGTTTGA	432	75％～80％
									LK486	SNRK	Hs.79025	NM_017719	2298	LK486-1	GATAGTTCATGCTATATCT	433	90％～95％
					LK486-2	GAAGCCCTGGAAACCAACA	434	85％～90％
									LK490	PIK3R4	Hs.83050	NM_014602	4077	LK490-1	GACAAGTTGATCTTGTTAA	435	80％～85％
LK491	RPS6KB1	Hs.86858	NM_003161	1578	LK491-1	GTATCTCAGTGGAGGAGAA	436	85％～90％
									LK500	LOC51231(VRK3	Hs.98289	NM_016440	1425	LK500-2	GGACAAATTGCCTTCCCAA	437	85％～90％
					LK500-3	TGTTCATGGAAATGTGACA	438	70％～75％
									LK501	FLJ20574	Hs.123427	NM_017886	1629	LK501-1	CCTCTGGTCTTTGGGCTGT	439	70％～75％
					LK501-3	GATCTCAGTCTCAGCAGAA	440	85％～90％
									LK519	NJMU-R1	Hs.9800	NM_022344＊	1101	LK519-1	AGGGCTGGGTAATGTTGCA	441	80％～85％
					LK519-2	CCGAGTTGGTTGTTATTAC	442	60％～65％

LK520	PRKAR2A	Hs.365523	NM_004157	1215	LK520-2	TCAGGAACAGCTTTCTCAA	443	70％～75％
														LK520-3	GAACTAGCTCTGATGTACA	444	70％～75％
LK521	PHKA2	Hs.54941	NM_000292	3708	LK521-1	CATAGAAGCTGCATATAAA	445	75％～80％
									LK193	STK10	Hs.16134	NM_005990	2907	LK193-1	AGGACTACATCGTGGAGAT	446	80～85％
					LK193-2	AGAGGATCATCCACCGAGA	447	55％～60％
														LK193-3	CGCGCATGGCCATGTACAA	448	85％～90％
LK475	MGC8407	Hs.6262	NM_024046	1506	LK475-1	AGAATCTCTTCCGCAAGAT	449	70％～75％
														LK475-4	GGGAGGTGTTTGACTGGAT	450	65％～70％
LK394	STK16	Hs.153003	NM_003691	933	LK394-1	GACTTGAAGCCCACCAATA	451	65％～70％
														LK394-3	GGTACGCTGTGGAATGAGA	452	80％～85％
					LK394-5	ATGAGATAGAAAGGCTGAA	453	50％～55％
									LK452	PKE(YANK3)	Hs.27888	NM_173575	1461	LK452-1	GAGATGTCAAGCCTGACAA	454	80～85％
					LK452-2	CCTTTGAGCTGGAGGAGAT	455	80～85％
									LK456	LOC149420(CLIK1L)	Hs.29911	AF411102	1026	LK456-1	ACACCAGCTTCATGCTTCA	456	65％～70％
					LK456-2	GAAGAACCTGTCAGTGTAA	457	70％～75％
														LK456-3	TGAATGGGCGAATGAAACA	458	50％～55％
					LK456-4	GAACCTGTCAGTGTAAACA	459	90％～95％
									LK079	LTK	Hs.210	NM_002344	2412	LK079-3	GCCAATGTTACTCTGCTCA	460	60％～65％
LK275	CAMK1	Hs.434875	NM_003656	1113	LK275-1	CATCTCTGACTCTGCCAAA	461	50％～55％
														LK275-2	CCCATGGATTGCAGGAGAT	462	70％～75％
					LK275-3	AGCCCTACAGCAAGGCTGT	463	60％～65％

人工合成的一些对照序列如表2，并溶解(溶解于水中)至终浓度50μM：

表2

激酶基因	SiRNA核苷酸序列号	序列	SEQ ID NO：	抑制效率
					LOC149420(CLIK1L)	LK456-3	TGAATGGGCGAATGAAACA	464	21％
CSNK1G2	LK009-1	GACGGTGCTGATGATCGCC	465	40％
						LK009-2	TCCAGCTGATCACGCGCAT	466	13％
	LK009-3	TGATCGCCATCCAGCTGAT	467	25％
						LK009-4	CGGTGCTGATGATCGCCAT	468	13％
EEF2K	LK324-1	TCAGCCAAGACCATCTTGA	469	4％
						LK324-2	CAATCAGCCAAGACCATCT	470	-2％
	LK324-3	TGTCTCTCTGAAGGAGACA	471	-49％
						LK324-4	ATCAGCCAAGACCATCTTG	472	16％
MGC8407	LK475-2	GGCTCCACCCTCTAGTAAA	473	42％
						LK475-3	TCCTGGCTGGTGACTATGA	474	19％
STK16	LK394-2	GAGCTCTTCTCTGTGCAGA	475	28％
						LK394-4	GCTCCTGGCCAACATACTA	476	26％
	LK394-6	GAGACTTGAAGCCCACCAA	477	-5％
					LTK	LK079-1	GGCACCTCAACTGCAGTCA	478	-21％
	LK079-2	GCTTCGAACCTCTGCCATC	479	-20％

2.复性

建立10μl的复性体系，也即依次加入1μl的10×复性缓冲液(10×复性缓冲液配方：1M Kac；20mM MgAc；300mM HEPES-KOH pH7.4)，4.5μl寡聚核苷酸的正向序列，4.5μl寡聚核苷酸的反向序列，在PCR仪(Eppendorf)上按照“95℃5分钟→75℃5分钟→每30s降1℃，直到10℃→4℃保持”的程序复性。

最终获得复性产物。

3.pAS载体的限制性酶切和片段回收

使用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit(Qiagen)进行。

(1)在20μl的酶切体系中加入2μg pAS载体DNA，1μlBgl II(Biolabs)，1μl Hind III(Invitrogen)和相应的缓冲液(随同内切酶来自相应的公司)2μl，其余用水补足，37℃反应3小时。

(2)0.8％的琼脂糖(Invitrogen)凝胶电泳。

(3)用一把干净的解剖刀从琼脂糖凝胶上精确的切离DNA条带。

(4)测定DNA条带的质量，当100bp＜DNA片段＜4Kb时，加入3倍体积的Buffer QX1(Qiagen)(融解琼脂糖凝胶)。

(5)在振荡混匀器(华利达)上悬浮QIAEXII(吸附DNA的颗粒，购自Qiagen)1分钟，根据常规方法按照片段的质量加入相应量的QIAEXII。

(6)50℃温浴10分钟，融解琼脂糖凝胶并吸附DNA。期间每2分钟混匀一次，保持QIAEXII处于悬浮状态。

(7)5000rpm离心1分钟，小心吸去上清。用500μl Buffer QXI(Qiagen)洗一次。

(8)用500μl的Wash Buffer PE(Qiagen)清洗两次。

(9)室温放置10～15分钟，晾干。

(10)加入20μl TE，混匀，室温放置5分钟。

(11)5000rpm离心1分钟，小心的将上清转移至另一干净的1.5ml离心管中。

4.连接

将前述的复性产物(双链DNA)(复性产物中含有相应的Bgl II和Hind III位点)取1μl稀释1000倍。在10μl反应体系中加入合适量的经前述加工的pAS载体(20～30fmol)、复性产物(60～100fmol)以及1μlT4连接酶(Invitrogen)和2μl 5×连接缓冲液(购自Invitrogen)，25℃反应3小时。

5.RbCl感受态细胞的制备

(1)将DH5α菌种划线到LB平板，37℃培养10～12小时。

(2)挑单克隆于30ml S.O.B(用前1∶100加入1M MgCl₂，1∶100加入1M MgSO₄)中，37℃，培养过夜。

(3)1∶100接过夜菌到200ml S.O.B(用前1∶100加入1M MgCl₂，1∶100加入1M MgSO₄)中，37℃培养至OD₅₅₀＝0.35。

(4)把菌液迅速转移至冰盐浴(-3～-5℃)中，预冷15分钟。

(5)4℃4500rpm×5min离心，弃上清。加入64ml感受态细胞缓冲液1，悬浮，冰盐浴15分钟。

(6)4℃4000rpm×5min离心，弃上清。加入16ml感受态细胞缓冲液2，在冰上悬浮菌体。

(7)立即分装成200μl/管(管预冷)。

(8)液氮速冻，-70℃保存。

6.RbCl转化

(1)将5μl连接产物加入200μl RbCl感受态DH5α细胞中，弹匀后冰上放置30分钟。

(2)42℃温浴2分钟，冰上放置2分钟。加入800μl LB，37℃温浴30～45分钟。

(3)8000rpm离心1分钟，倒去上清，用管底残留的100μl左右的液体将沉淀悬浮，全部铺盘。

(4)倒置放于37℃烘箱中12～15小时。

7.质粒的小量制备(碱裂解法)

(1)取1ml过夜菌于1.5ml的离心管中，8000rpm离心1分钟，去上清。

(2)加100μl H₂O悬浮细胞。

(3)加100μl裂解液(H₂O∶10％SDS∶2M NaOH∶500mM EDTA＝7.3∶2∶0.5∶0.2)立即轻轻混匀。

(4)加入50μl 1M的MgCl₂，混匀，冰上放置2分钟，13000rpm离心2分钟。

(5)加入50μl 5M的KAc，混匀，冰上放置2分钟，13000rpm离心3分钟。

(6)将上清移至另一干净的离心管中，加入0.6ml 100％乙醇，混匀，13000rpm离心3分钟。

(7)用0.5ml 70％乙醇洗两遍，超净台内晾干。

(8)20μl TE溶解。

8.质粒的限制性酶切鉴定

1)在10μl的反应体系中加入5μl质粒DNA，0.2μl EcoR I(Biolabs)，0.2μl HindIII和相应的酶切反应缓冲液(随同内切酶来自相应的公司)3.6μl，37℃反应1小时。

2)0.8％的琼脂糖凝胶电泳。

9.转染用质粒DNA的小量制备(QIAprep Spin Miniprep Kit 250，Qiagen)

1)分次取3mL过夜菌于1.5mL的离心管中，8,000rpm离心1分钟，去上清。

2)加250μL Buffer P1(Qiagen)，振荡器充分悬浮菌块。

3)加250μL Buffer P2(Qiagen)，轻轻颠倒混匀4～6次，放置时间不要超过5分钟。

4)加350μL Buffer N3(Qiagen)，轻轻颠倒混匀4～6次，置冰上10分钟。

5)13,000rpm离心10分钟，取上清到柱中。13,000rpm离心1分钟，弃穿出液。

6)加700μL Buffer PE(Qiagen)，13,000rpm离心1分钟，弃穿出液。

7)13,000rpm离心2分钟，将柱子置于一干净离心管中，室温放置10分钟。

8)加Elution Buffer(Qiagen)50ul，放置2分钟。

9)13,000rpm离心2分钟，穿出液接在离心管中。

实施例2构建基因表达质粒

构建目的基因表达质粒的方法与实施例1类似，采用pAPT和pHA作为表达质粒。采用的基因如表1中对应的GenBank号所示。

构建基因表达质粒所用的内切酶以及鉴定时所用的内切酶视每个激酶基因的序列而定，这是本领域人员所熟知的。在得知了目的激酶基因序列后，本领域人员知道如何设计适当的内切酶位点，并考虑所用的表达质粒，从而将所述激酶基因克隆入质粒中。因此由于基因数目庞大，在此没有一一列举，表3所列是构建一些基因表达质粒时所用的内切酶的示例。

表3

LiLABno	内切酶	LiLAB no	内切酶	LiLABno	内切酶	LiLABno	内切酶
								LK008	Not I	LK128	Xho I	LK204	Xho I	LK408	Not I
LK008	EcoR I	LK128	Xba I	LK204	Xba I	LK408	EcoR I
								LK010	Not I	LK129	Xba I	LK205	Xba I	LK409	Not I.Bam H I
LK010	Nsp V	LK129	Xho I	LK205	Xho I	LK409	EcoR I
								LK010	EcoR I	LK130	Sal I	LK205	Nsp V	LK414	Xho I
LK021	Xho I	LK130	Not I	LK206	Xho I	LK414	Xba I
								LK021	EcoR I	LK131	Sal I	LK206	Xba I	LK415	Xba I
LK022	Not I	LK131	Xba I	LK207	Xho I	LK415	EcoR I
								LK022	EcoR I	LK132	Not I	LK207	Xba I	LK416	Not I
LK025	Not I	LK132	Sal I	LK208	Xba I	LK416	EcoR I
								LK025	Xho I	LK133	Not I	LK208	Xho I	LK417	Xba I
LK026	Not I	LK133	EcoR I	LK209	Sal I	LK417	Sal I
								LK026	Sal I	LK134	Xho I	LK209	Not I	LK420	Not I
LK027	Not I	LK134	Xba I	LK210	Xho I	LK420	Xho I
								LK027	EcoR I	LK135	Sal I	LK210	Xba I	LK423	Not I
LK030	Not I	LK135	Xba I	LK211	Sal I	LK423	EcoR I
								LK030	Nsp V	LK136	Xho I	LK211	Not I	LK428	Sal I
LK031	Xho I	LK136	Xba I	LK212	Sal I	LK428	Xba I
								LK031	EcoR I	LK137	Not I	LK212	Not I	LK429	Xho I
LK033	Not I	LK137	EcoR I	LK213	Xho I	LK429	Xba I
								LK033	EcoR I	LK138	Xba I	LK213	Xba I	LK430	Xho I
LK034	Not I	LK138	Not I	LK214	Sal I	LK430	Xba I
								LK034	Sal I	LK140	Not I	LK214	Not I	LK431	Xho I
LK035	Not I	LK140	EcoR I	LK215	Not I	LK431	Xba I
								LK035	EcoR I	LK141	Sal I	LK215	Xba I，Nsp V	LK432	Xho I
LK038	Not I	LK141	Xba I	LK216	EcoR I	LK432	Xba I
								LK038	Nsp V	LK142	Sal I	LK216	Not I	LK432	Xho I
LK050	Not I	LK142	Not I	LK216	Nsp V	LK432	Xba I
								LK050	EcoR I	LK143	Sal I	LK217	Sal I	LK433	Not I
LK052	Not I	LK143	Xba I	LK217	Not I	LK433	Not I
								LK052	EcoR I	LK144	Not I	LK218	Not I	LK438	Not I
LK055	Not I	LK144	Sal I	LK218	EcoR I	LK438	EcoR I
								LK055	Nsp V	LK145	Sal I	LK219	Xho I	LK438	Not I
LK058	Xho I	LK145	Xba I	LK219	Xba I	LK438	EcoR I
								LK058	Xba I	LK146	Xho I	LK220	Xho I	LK441	Xho I
LK060	Xho I	LK146	Xba I	LK220	Xba I	LK441	Xba I
								LK060	EcoR I	LK147	Sal I	LK221	Sal I	LK441	Xho I
LK062	Xho I	LK147	Not I	LK221	Not I	LK441	Xba I
								LK062	Xba I	LK147	EcoR I	LK222	EcoR I	LK442	Xho I

LK064	Xho I	LK148	Not I	LK222	Bam HI，Not I	LK442	Xba I
								LK064	Xba I	LK148	Sal I	LK223	Sal I	LK442	Xho I
LK065	Xho I	LK149	Not I	LK223	Bam HI，Not I	LK442	Xba I
								LK065	Xba I	LK149	Xho I	LK224	Not I	LK444	Xho I
LK066	Xho I	LK150	Xba I	LK224	Xho I	LK444	Xba I
								LK066	Xba I	LK150	Not I	LK225	Sal I	LK446	Xba I
LK068	Not I	LK151	Not I	LK225	Not I	LK446	Xho I
								LK068	Xho I	LK151	Xho I	LK226	Sal I	LK446	Xba I
LK069	Xho I	LK152	Not I	LK226	Xba I	LK446	Xho I
								LK069	Xba I	LK152	Xho I	LK227	Xba I	LK449	Xho I
LK070	Xho I	LK153	Xba I	LK227	Xho I	LK449	Xba I
								LK070	EcoR I	LK153	NotI	LK228	Not I，Hind III	LK449	Xho I
LK071	Xho I	LK156	Not I	LK228	Xho I	LK449	Xba I
								LK071	Xba I	LK156	Sal I	LK229	Not I	LK451	Xho I
LK072	Xba I	LK157	Xho I	LK229	Nsp V	LK451	Xba I
								LK072	Sal I	LK157	Xba I	LK229	Xho I	LK451	Xho I
LK073	Xho I	LK159	Xho I	LK230	Xho I	LK451	Xba I
								LK073	Xba I	LK159	Xba I	LK230	Xba I	LK452	Xho I
LK074	Xba I	LK160	Not I	LK231	Xho I	LK452	Xba I
								LK074	Xho I	LK160	Sal I	LK231	Xba I	LK452	Xho I
LK076	Not I	LK161	Xho I	LK232	Sal I	LK452	Xba I
								LK076	Xho I	LK161	Xba I	LK232	Not I	LK453	Sal I
LK077	Xho I	LK162	Xho I	LK232	Xba I	LK453	Xba I
								LK077	Xba I	LK162	Xba I	LK232	Sal I	LK454	Xho I
LK078	Sal I	LK163	Xho I	LK233	Xho I	LK454	Xho I
								LK078	Xba I	LK163	Xba I	LK233	Xba I	LK454	Xba I
LK079	Sal I	LK164	Not I	LK234	Sal I	LK454	Xba I
								LK079	Xba I	LK164	EcoR I	LK234	Not I	LK455	Xho I
LK081	Not I	LK165	Xho I	LK235	Xho I	LK455	Xho I
								LK081	Xho I	LK165	Xba I	LK235	Xba I	LK455	Xba I
LK082	Xho I	LK167	Not I	LK236	Xba I	LK455	Xba I
								LK082	EcoR I	LK167	Nsp V	LK236	Not I	LK458	Xho I
LK082	EcoR I	LK168	Not I	LK237	Not I，Bam H I	LK458	Xba I
								LK083	Xho I	LK168	EcoR I	LK237	Xba I，Nsp V	LK461	Not I
LK083	Xba I	LK169	Not I	LK238	Sal I	LK461	Sal I
								LK084	Sal I	LK169	Nsp V	LK238	Not I	LK463	Xba I
LK084	Xba I	LK170	Xho I	LK239	Xho I	LK463	Not I
								LK085	Not I	LK170	Xba I	LK239	Not I	LK469	Xba I
LK085	Xho I	LK172	Sal I	LK240	Sal I	LK469	Sal I
								LK086	Not I	LK172	Not I	LK240	Not I	LK470	Not I
LK086	Xho I	LK177	Xho I	LK241	Xho I	LK470	Nso V
								LK087	Sal I	LK177	Xba I	LK241	Xba I	LK470	EcoR I
LK087	Not I	LK178	Xho I	LK242	Sal I	LK471	Not I

LK088	Sal I	LK178	Xba I	LK242	Not I	LK471	EcoR I
								LK088	Xba I	LK180	Xho I	LK243	Xho I	LK476	Xho I
LK089	Xho I	LK180	Xba I	LK243	Xba I	LK476	Xba I
								LK089	Xba I	LK182	Sal I	LK244	Not I	LK478	Not I
LK090	Xho I	LK182	Not I	LK244	Xba I	LK478	Xho I
								LK090	Xba I	LK185	Xho I	LK245	Xho I	LK484	Xho I
LK091	Not I	LK185	Xba I	LK245	Not I，Kpn I	LK484	Xba I
								LK091	Xho I	LK186	Sal I	LK246	Xba I	LK485	Sal I
LK092	Xho I	LK186	Not I	LK246	Sal I	LK485	Not I
								LK092	Xba I	LK187	Xho I	LK247	Xho I	LK491	Xho I
LK093	Xho I	LK187	Xba I	LK247	Xba I	LK491	Xba I
								LK093	Xba I	LK188	Not I	LK248	Sal I	LK492	Sal I
LK094	Not I	LK188	EcoR I	LK248	Not I	LK492	Not I
								LK094	Xho I	LK189	Xho I	LK249	Not I	LK493	Not I
LK095	Not I	LK189	Xba I	LK249	Xba I	LK493	EcoR I
								LK095	Sal I	LK190	Xho I	LK250	Xho I	LK494	Sal I
LK096	Not I	LK190	Xba I	LK250	Xba I	LK494	Not I
								LK096	Sal I	LK191	Sal I	LK251	Not I	LK496	Xho I
LK097	Not I	LK191	Not I	LK251	Xba I	LK496	Xba I
								LK097	Nsp V	LK192	Xho I	LK255	Xba I	LK497	Not I
LK098	Not I	LK192	Xba I	LK255	Xho I	LK497	EcoR I
								LK098	Xho I	LK193	Not I	LK296	Not I	LK498	Xho I
LK099	Xho I	LK193	Nsp V	LK296	EcoR I	LK498	Not I
								LK099	Not I，Hind III	LK194	Not I	LK302	Xba I	LK499	Not I
LK100	Xho I	LK194	Xho I	LK302	Sal I	LK499	Sal I
								LK100	Xba I	LK195	Xho I	LK313	Kpn I	LK502	Not I
LK115	Not I	LK195	Xba I	LK313	EcoR I	LK502	Nsp V
								LK115	Xho I	LK196	Xho I	LK348	Xba I	LK508	SalI
LK116	Xho I	LK196	EcoR I	LK348	Sal I	LK508	Xba I
								LK116	Xba I	LK197	Not I	LK356	Not I	LK509	Not I
LK117	Not I	LK197	EcoR I	LK356	Xba I，Nsp V	LK509	EcoR I
								LK117	Sal I	LK198	Xho I	LK357	Xba I	LK511	Xho I
LK118	Not I	LK198	Xba I	LK357	Bam HI	LK511	Xba I
								LK118	Sal I	LK199	Not I	LK370	Not I，Kpn I	LK512	Xho I
LK119	Not I	LK199	EcoR I	LK370	EcoR I	LK512	Xba I
								LK119	Xho I	LK200	Not I	LK403	Not I	LK513	Not I
LK122	Xba I	LK200	EcoR I	LK403	Sal I	LK513	EcoR I
								LK122	Xho I	LK201	Xho I	LK404	Xho I	LK514	Xho I
LK124	Xho I	LK201	Xba I	LK404	Xba I	LK514	Xba I
								LK124	Xba I	LK202	Not I	LK405	Xho I	LK515	Xba I
LK125	Xho I	LK202	Nsp V	LK405	Xba I	LK515	Xho I
								LK125	Xba I	LK203	Xho I	LK406	Xho I	LK516	Not I
LK127	Not I	LK203	Xba I	LK406	Xba I	LK516	EcoR I

LK127	EcoR I			LK407	Sal I
												LK407	Xba I

采用常规的方法，将基因通过合适的内切酶从原载体切下来或从HEK 293T细胞的cDNA库中通过PCR获得。

pAPT和pHA载体也用相应的内切酶酶切，回收获得表达载体。

采用如前述实施例1相似的方法进行连接。

采用如前述实施例1相似的方法进行转化。

采用如前述实施例1相似的方法进行质粒的小量制备。

采用如前述实施例1相似的方法进行质粒的限制性酶切鉴定。

采用如前述实施例1相似的方法进行转染用质粒DNA的小量制备。

实施例3转染细胞用于AP Assay

1.在1.5ml离心管中加入25ul Opti-MEM培养基，10ng荧光素酶表达质粒(作为内参)，5ng前述制备的激酶基因表达质粒(构建在pAPT载体上)，85ngRNAi表达质粒或空载体，混匀。

2.在另一1.5ml离心管中加入25ul Opti-MEM培养基和0.25ulLipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)，混匀，放置5分钟。

3.将上述两者混匀，放置15分钟。

4.将混合液加到96孔盘中，再铺上HEK293T细胞(购自ATCC)100ul/孔(细胞密度220万个/盘)，最终获得共转染了激酶基因表达质粒和RNAi表达质粒的细胞。

转染细胞用于Western Assay：

1.在1.5ml离心管中加入12.5ul DMEM培养基，3ng KLC(驱动蛋白轻链，kinesin light chain)表达质粒(作为内参，见图11B)，20ng前述制备的激酶基因表达质粒，140ng RNAi表达质粒或空载体，再加入Plus0.5ul(Invitrogen)，混匀，放置15分钟。

2.在另一1.5ml离心管中加入12.5ul DMEM培养基和0.5ul Lipofectamine转染试剂(Invitrogen)，混匀。

3.将上述两者混匀，放置15分钟。

4.将混合液滴加到已铺有HEK293T细胞的48孔盘中。

实施例4通过碱性磷酸酶(AP)活性检测来测定抑制效率

碱性磷酸酶(AP)活性检测的步骤如下：

1.转染两天后取出HEK293T细胞，取上清50ul×2于黑色测活板×2中，66℃水浴中灭活30分钟。

2.余下上清用泵吸除，每孔加入100ul细胞裂解液(购自Roche)裂解细胞，稍晃动，放置5分钟。

3.白色测活板用作测荧光素酶活性。加入40ul细胞裂解液，再加入10ulLuc底物(Roche)，混匀，酶标仪(EG&G，Berthold)上读OD值。

4.测碱性磷酸酶活性。将缓冲液(配方：去离子水80ml；二乙醇胺1.1ml；调节pH至9.5；MgCl₂0.02g；加入去离子水至100ml)和底物(Tropix)1∶1混匀，加20ul混合液到黑色测活板中，充分混匀了读数。

5.使用OD值获得抑制效率。

图2-4列举了部分的OD值的结果，从而反映了寡聚核苷酸抑制目的激酶基因的情况。

其中，图2表示LK456-3对于LOC149420(CLIK1L)激酶基因的抑制情况，其抑制率仅为21％，呈现较差的抑制效果。

图3显示了LK304-1对于CAMKK2激酶基因的抑制情况，其抑制率为63％，呈现较好的抑制效果。

图4显示了LK010-1对于CSNK1G3激酶基因的抑制情况，其抑制率为89％，呈现非常好的抑制效果。

此外，还检测了表1和表2中所列的其它寡聚核苷酸抑制目的激酶基因的情况，获得的抑制率提供在表1中。

实施例5通过免疫印迹(Western Blot)检测抑制效率

采用的步骤如下：

1)转染两天后取出HEK293T细胞，吸去上清，用2×SDS上样缓冲液(配方：0.1M Tris-HCl(加10ml 1M Tris-HCl母液)；4％SDS(加40ml 10％SDS)；β-Me 2ml；甘油25ml；溴酚兰0.04～0.05g；H₂O 23ml)直接裂解细胞，收样。

2)将上述样品进行SDS-PAGE电泳。

3)转膜(湿式电转仪，Bio-Rad)：把SDS-PAGE胶浸泡在常规的电转移缓冲液中30分钟。在电转移板上依次铺两层缓冲垫片和一层滤纸，把胶铺在滤纸上，再铺上硝酸纤维素膜(膜先在双蒸水中浸润)，再铺一层滤纸和两层缓冲垫片。把电转移板夹好。接通恒流电源(250mA)，转膜60分钟。

4)将转好的膜置5％脱脂牛奶中摇晃封闭1小时。用缓冲液(10×缓冲液的配方是：Tris 24.2g；NaCl 87.74g；Tween 5g；pH 8.0；加水至1L)漂洗5分钟共3次。

5)把膜浸在抗-HA的一抗(购白Babco)溶液中摇晃1小时。用缓冲液漂洗5分钟共3次。

6)再浸在抗小鼠的二抗(购自Rockland)溶液中摇晃0.5小时，用缓冲液漂洗5分钟共3次。

7)用红外荧光成像仪(Odyssey)观察结果。

8)使用灰度值获得抑制效率。结果列于表1中。

图5-7列举了部分Western Blot图的结果。

其中，图5显示了LK009-1、LK009-2、LK009-3、LK009-4对于CSNK1G2激酶基因的抑制效率，分别是40％、13％、25％、和13％，可见LK009-1、LK009-2、LK009-3、LK009-4的抑制效率都不理想。

图6显示了LK193-1、LK193-2、LK193-3对于STK10激酶基因的抑制效率，分别是80％、57％、和86％，可见LK193-1和LK193-3具有很好的抑制效率，LK193-2具有一定的抑制效率。

图7显示了LK475-1、LK475-2、LK475-3、LK475-4对于MGC8407激酶基因的抑制效率，分别是74％、42％、19％、和69％，可见LK475-1和LK475-4具有较好的抑制效率，LK193-2具有一定的抑制效率，然而LK193-3的抑制效率较低。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种小干扰RNA，其特征在于，所述的小干扰RNA抑制激酶基因的表达，且表达抑制率为50-100％。

2.如权利要求1所述的小干扰RNA，其特征在于，所述的激酶基因选自：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因、酪氨酸蛋白激酶基因、组氨酸蛋白激酶基因、色氨酸蛋白激酶基因、或天冬氨酰基/谷氨酰基蛋白激酶基因。

3.如权利要求1所述的小干扰RNA，其特征在于，所述的小干扰RNA的序列选自下组：SEQ ID NO：1-463任一所示的序列。

4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的小干扰RNA。

5.一种遗传工程化的细胞，其特征在于，它是选自下组：

(a)用权利要求4所述的载体转化或转染的细胞；或

(b)用权利要求1所述的小干扰RNA转化或转染的细胞。

6.权利要求1所述的小干扰RNA的用途，其特征在于，用于制备抑制激酶基因表达的组合物。

7.一种抑制激酶基因表达的组合物，其特征在于，含有0.0001-20wt％的权利要求1所述的小干扰RNA，以及与所述小干扰RNA相容的载体。

8.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有容器，以及位于容器内的至少一种权利要求1所述的小干扰RNA。

9.一种鉴定激酶基因的功能的方法，其特征在于，包括步骤：在体外，使用权利要求1所述的一种小干扰RNA在细胞内干扰所述的激酶基因，使之降低表达，观察该激酶基因降低表达的细胞的变化，并与所述激酶基因表达正常的细胞进行比较，从而确定所述激酶基因的功能。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的细胞变化包括：细胞内蛋白的变化，细胞信号通路的变化，细胞周期的变化，或细胞代谢、转录、骨架重排、迁移、凋亡、分化的变化。

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