WO2006090906A1 - RNAi耐性ウイルス株を克服する新手法 - Google Patents

RNAi耐性ウイルス株を克服する新手法 Download PDF

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WO2006090906A1
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Hiroshi Takaku
Naoko Kurosaki
Jacob Samson Barnor
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Haplopharma Inc.
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    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus

Definitions

  • the present invention relates to suppression of virus infection and treatment of viral infection using RNAi, decoy RNA and Z or antisense RNA.
  • RNA interference is a powerful tool for inhibiting various gene functions
  • RNAi is caused by siRNA (small interfering RNA) or miRNA (micro RNA) (Lidardi, C. et al., Cell 107, 297-307 (2001); Sijen, T. et al., Cell 107, 465-476 (2001)).
  • dsRNA larger than 30 bp
  • Dicer RNaselll-like enzyme
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • RISC is reused to separate the cleaved RNA and catalyze re-cleavage. This role of RISC is essential for the silencing effect.
  • SiRNA expressed by DNA si has been shown to suppress gene expression as efficiently as exogenously introduced siRNA (Bru ⁇ elkamp, T. R. et al.
  • RNAi effectively suppresses the replication of several different pathogenic viruses in cultured cells.
  • These viruses include gray encephalomyelitis virus (Pol iomyel it is virus)
  • RNAi can effectively target not only viral RNA but also genomic RNA before and after the integration phase of the viral infection cycle (Bitko, V. et al., BMC Microbiology 2001,
  • decoy-type nucleic acid drug molecules has been studied for the suppression of virus growth.
  • decoy is a short nucleic acid containing the same sequence as the transcription factor binding site on the viral genome. When administered to the body, it inhibits the transcription factor from binding to the genome and suppresses the function of the gene. It is possible to suppress viral growth in the body by decoy for viral transcription factors.
  • decoy RNA that binds to Tat transcription growth factor of HIV R. Yamamoto et al., Genes Cells 5, 371-388 (2000)
  • decoy RNA that suppresses NS3 protease of HCV K. Fukuda et al. , Eur. J. Biochem 267, 3685-3694 (2000). Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a chimeric RNA comprising a plurality of functional RNA moieties capable of exerting an action as at least one pharmaceutical of an RNA pharmaceutical such as an RNAi pharmaceutical or a decoy RNA pharmaceutical, and a pharmaceutical comprising the chimeric RNA.
  • the present inventor examined the phenomenon in which the HIV-1 replication inhibitory effect of siRNA targeting HIV-1 RNA was lost due to mutations in the HIV-1 gene. After siRNA application,
  • HIV-1 RNA Mutation occurs in HIV-1 RNA, siRNA cannot recognize HIV-1 RNA, and after a while, siRNA cannot cleave HIV-1 RNA, but before mutation occurs in HIV-1 RNA Significantly suppresses HIV-1 replication and produces some HIV-1 replication suppression effect. In light of this, even when mutations occur in HIV-I RNA, it is possible to target other RNA regions that are not mutated to suppress replication of HIV-1 RNA over a long period of time. We found that HIV-1 replication can be suppressed. In other words, various HIV-1 infection therapies targeting various HIV-1 genes have been studied, but they all target a single target sequence and attack one target molecule. In contrast, the use of multiple attack molecules targeting multiple target sequences, it has been found that HIV-1 proliferation can be reliably suppressed even if mutations occur in HIV-1. It was. .
  • a second-generation anti-HIV shRNA encoding a splittable HIV-1 vif shRNA expressed as a chimeric RNA portion and a decoy TAR RNA has a remarkable HIV-1 replication inhibitory effect. It was. Decoy TAR RNA competitively interacts with HIV-1 Tat protein (protein-RNA interaction) and causes downregulation of transactivation from the 5 'LTR promoter of HIV-1 transcription, Acts as a complementary inhibitor (CIF). On the other hand, HIV-1 vif-shRNA is expressed in stably transfected Jurkat cells and acts on the post-transcriptional inhibition of HIV-1 genes by RNA-RNA interaction.
  • Target virus genotyping revealed mutations in the vif shRNA target site of HIV-1 virus RNA in transgenic Jurkat cells that express vif shRNA and decoy TAR chimeric RNA and shRNA alone . Moreover, the mutations increased with time, and virus mutants were generated one after another. On the other hand, no mutation occurred in the decoy RNA target site of HIV-1 virus RNA. Interestingly, resistance gains due to mutations involving siRNA were observed only in cultures expressing control vif shRNA alone and random V shRNA mutant decoy TAR chimeric RNA (vif shRNA Ran-mTAR).
  • a new strategy that combines and expresses double HIV-1 antigene molecules, splits them into single RNA molecules in cells, and utilizes both RNA-RNA and protein-RNA interactions is HIV-1. Useful for gene therapy.
  • shRNA short hairpin RNA
  • miRNA miRNA part
  • at least one decoy RNA moiety that can bind to a protein involved in the viral life cycle and suppress the virus
  • at least one antisense RNA moiety that can hybridize to a gene involved in the viral life cycle and suppress the virus RNA that consists of at least one ribozyme that can suppress the expression of proteins involved in the viral life cycle, and that consists of at least one tRNase ZL-EGS that can suppress the expression of proteins that are involved in the viral life cycle
  • Two or more of the above-mentioned RNA comprising at least one RNA selected from the group consisting of an RNA portion and an RNA portion consisting of at least one RNase P-EGS capable of suppressing the expression of a protein involved in the viral life cycle
  • At least one shRNA or miRNA that can form a siRNA capable of suppressing a virus using a viral RNA as a target sequence and at least one capable of suppressing a virus by binding to a protein involved in the life cycle of the virus A chimeric RNA molecule in which two decoy RNA moieties are cleavably linked.
  • [4] The chimeric RNA molecule according to any one of [1] to [3], wherein the virus is selected from the group consisting of HIV-1, HIV-2, HCV, cancer, and influenza virus.
  • shRNA part, miRNA part, antisense RNA part, RNA part consisting of ribozyme, RNA part consisting of tRNase ZL-EGS or RNA part consisting of RNase P-EGS is HIV-1 gag, pol, env, tat, rev, nef, vif, vpr ⁇ vpu, vpx, or 7 is a chimeric RNA molecule that suppresses HIV-1 targeting a partial sequence selected from the group consisting of the LTR region [1].
  • [6] Target a partial sequence of a region selected from the group consisting of HIV-1 gag, pol, env, tat ⁇ rev, nef, vif, vpr, vpu, vpx, or LTR region of HIV-1
  • [1 1] [1 :! A preventive or therapeutic agent for viral infections and cancers comprising the chimeric RNA molecule according to any one of [8] and cleaved into each RNA moiety in vivo.
  • a prophylactic or therapeutic agent for a viral infection comprising the vector of [9] or [10], wherein the respective RNA moiety is produced in vivo.
  • [1 3] The prophylactic or therapeutic agent for opi cancer of viral infections according to [1 1] or [1 2], which can block viral RNAi resistance based on viral mutations.
  • [14] Contains at least one shRNA or miRNA capable of suppressing the virus with the target sequence of viral RNA and at least one decoy RNA capable of suppressing the virus by binding to a protein involved in the life cycle of the virus A preventive or therapeutic agent for viral infections.
  • Viral RNA can be used as a target sequence to suppress viral shRNA or miRNA ability S HIV-1 ag, pol, env, tat, rev, nef, vif, vpr, vpu, vpx, or [14] A prophylactic or therapeutic agent for viral infections, which targets a partial sequence of a region selected from the group consisting of LTR regions.
  • the decoy RNA portion has a sequence homologous to the TAR region of HIV-1 and the Tat protein [14] or [15], a prophylactic or therapeutic agent for viral infections, which can be combined with quality.
  • FIG. 1A is a diagram showing the construction of a second generation shRNA expression vector.
  • Figure 1B shows the construction of a lentivirus-based betater.
  • Figure 2A shows the secondary of vif-TAR chimeric RNA analyzed by GENETYX software.
  • RNA Structure showing v: if shRNA has a UU single-strand cleavage site between the 3 'end and the 5' end of TAR RNA.
  • FIG. 2B is a photograph showing the results of RT-PCR analysis of HeLa CD4 + cells.
  • FIG. 2C is a photograph showing a Northern plot analysis of expression vector mRNA in HeLa CD4 + cells.
  • FIG. 2D is a photograph showing Dicer present in HeLa CD4 + cells.
  • FIG. 2E shows the in vivo cleavage of the chimeric RNA.
  • Figure 2F is a photograph showing in vitro cleavage of the chimeric RNA.
  • FIG. 3A shows the HIV-1 antiviral effect.
  • Figure 3B is a photograph showing down-modulation of HIV-1 reporter gene expression.
  • FIG. 3C shows long-term suppression of HIV-1 replication in Jurkat by CS-vif shRNA-TAR.
  • FIG. 3D shows long-term suppression of HIV-1 replication in RBMCs by CS-vif shRNA-TAR.
  • FIG. 3E shows long-term suppression of HIV-1 replication in H9 cells by CS-vif shRNA-TAR.
  • FIG. 3F shows the results of genotype analysis in Jurkat cells.
  • FIG. 3G shows the results of genotype analysis in PBMCs.
  • FIG. 4 is a diagram showing the action of the chimeric RNA of the present invention on HIV-1.
  • the chimeric RNA of the present invention comprises at least two functional RNA parts, and the RNA part acts as an RNAi drug via the RNAi mechanism, acts as a decoy-type nucleic acid (RNA) drug via the decoy mechanism, antisense RNA It acts as a drug, acts as a ribozyme RNA drug, acts as a tRNase ZL-EGS drug, and acts as an RNase P-EGS drug.
  • RNAi drug acts as a drug
  • ribozyme RNA drug acts as a tRNase ZL-EGS drug
  • acts as an RNase P-EGS drug RNA
  • one of the two or more RNA moieties exhibits an RNAi drug action via an RNAi mechanism
  • the other RNA moiety is a decoy-type nucleic acid (RNA) drug via a decoy mechanism.
  • the chimeric RNA of the present invention can be used for virus suppression.
  • virus suppression refers to the suppression of virus replication and proliferation, making the virus unable to survive.
  • siRNA antisense nucleic acids and ribozymes targeting genes involved in the viral replication mechanism
  • mutations can occur frequently in viral genes. Therefore, the virus suppression effect of siRNA or antisense nucleic acid targeting a specific gene sequence disappears due to the virus mutation. For example, when siRNA targeting the vif gene of HIV-1 is administered, mutations occur in the HIV-1 gene in a few weeks, and the mutations gradually increase, decreasing the siRNA gene expression-suppressing effect.
  • the chimeric RNA of the present invention can attack the virus by attacking the unmutated gene at the same time, even if a mutation occurs in the gene involved in the life cycle of the virus that attacks to suppress the virus. Can be prevented from escaping, and the virus can be controlled efficiently and reliably.
  • the genes involved in the life cycle of the virus are It refers to genes that are necessary for the virus to replicate or propagate, and includes the viral structural genes, accessory genes, and genes that encode transcriptional regulatory factors.
  • a mutation in the viral siRNA target sequence that escapes siRNA attack is said to acquire siRNA resistance, and a mutation occurs in the antisense nucleic acid target sequence that escapes antisense nucleic acid attack.
  • the chimeric RNA of the present invention can prevent the virus from acquiring resistance to a nucleic acid drug even if a mutation occurs in the virus.
  • the virus that suppresses replication by the chimeric RNA of the present invention is not limited, and may be a DNA virus or an RNA virus, but RNA such as a single-stranded RNA virus or a double-stranded RNA virus that acquires resistance to a nucleic acid drug by mutation. Virus is desirable.
  • viruses include: retrowinoles, togaviridae, flaviviridae, coronaviruses, tetrawinoles, nodawinoles, astrowinores, force ricinoviridae, picornaviridae, arenaviridae, bunyaviridae, Examples include viruses belonging to each family such as Honoretomixoviridae, Filouinores, Rapdoviridae, Noramixoviruses, Birnaviridae, and Reoviridae.
  • the chimeric RNA of the present invention can also be used for the prevention and treatment of cancer caused by virus infection by suppressing the virus.
  • cancers caused by viral infection include the following cancers. Cervical cancer (Hitopapillomavirus type 16, 18 (HPV-16, 18)), Burkitt lymphoma (EB virus (EBV)), adult T cell leukemia (Hit T lymphocyte apophilic virus), liver Cancer (hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV)), force positive sarcoma (Kaposi sarcoma-associated herpes virus (KSHV)).
  • the chimeric RNA of the present invention must have at least one From the shRNA (short hairpin RNA) or miRNA part, at least one decoy RNA part, at least one antisense RNA part, at least one ribozyme RNA part, at least one tRNase ZL-EGS And at least one RNA portion selected from the group consisting of an RNA portion consisting of at least one RNase P-EGS.
  • the chimeric RNA of the invention comprises at least one shRNA (short hairpin RNA) portion or miRNA portion, and at least one decoy RNA portion, at least one antisense RNA portion, at least one.
  • RNA portion consisting of one ribozyme at least one RNA portion selected from the group consisting of an RNA portion consisting of at least one tRNase ZL-EGS and an RNA portion consisting of at least one RNase P-EGS.
  • RNA consists of two types of RNA, it is sometimes called dual-type RNA,
  • RNA portion refers to RNA having a sequence that is substantially identical to a gene involved in viral replication or a sequence that is highly complementary to a gene involved in viral replication and can be highly replicated.
  • a chimeric RNA has a specific sequence and has at least two RNA sequences that function as RNAi drugs, decoy drugs, antisense RNA drugs, ribozyme drugs, tRNase ZL-EGS or RNase P-EGS drugs. It has a structure in which RNA sequences are linked.
  • the linked RNA sequences are different RNA sequences, but the combination of the functions of the linked RNA sequences as a drug may be any combination.
  • RNAi and RNAi decoy RNA and decoy RNA, antisense RNA and antisense RNA, ribozyme and ribozyme, tRNase ZL-EGS and tRNase ZL-EGS, RNase P—EGS and RNase P-EGS, RNAi and decoy RNA, RNAi and antisense RNA, RNAi and Ribozyme, RNAi and tRNase ZL-EGS, RNAi and RNase P—EGS, Decoy RNA and Antisense RNA, Decoy RNA and Ribozyme, Decoy RNA and tRNase ZL-EGS, RNAi and RNase P—EGS, Decoy RNA and Antisense RNA, Decoy RNA and Ribozyme, Decoy RNA and tRNase
  • RNA sequences may be linked, and three RNA sequences May be any combination of RNA moieties that exert the above RNA pharmaceuticals.
  • an RNA portion that acts as an RNAi drug is always included.
  • the shRNA or miRNA part, decoy RNA part, antisense RNA, RNA part consisting of ribozyme, RNA part consisting of tRNase ZL-EGS and RNA part consisting of RNase P-EGS contained in the chimeric RNA of the present invention are in vivo. And can be cleaved by a cutting means such as enzyme.
  • the chimeric RNA of the present invention comprises an shRNA part or miRNA part, a decoy RNA part, an antisense RNA part, an RNA part consisting of a ribozyme, an RNA part consisting of tRNase ZL EGS, and an RNA part consisting of Z or RNase P-EGS. It is a chimeric RNA linked in a cleavable manner.
  • a combination of RNAi and other RNA moieties, particularly RNAi and decoy RNA is preferred. This is because, when trying to suppress the virus by the RNAi mechanism, the virus is mutated and the virus acquires RNAi resistance. decoy
  • the RNAi mechanism Since the RNA mechanism does not lose its effect even when a virus mutation occurs, the RNAi mechanism can first attack many viruses, and if a mutation occurs, the decoy RNA mechanism can further attack the mutated virus. The above combination is preferred.
  • RNAi drug is a drug that can cleave a target mRNA having a specific sequence by RNAi (RNA interference) and suppress the expression of a gene corresponding to the mRNA.
  • siRNA short interfering RNA
  • siRNA consisting of a sense strand having substantially the same sequence as a specific target mRNA and an antisense strand complementary to the sense strand recognizes the target sequence as a guide RNA.
  • siRNA is formed from double-stranded RNA (dsRNA) by being processed by Dicer in cells or in vivo.
  • the chimeric RNA of the present invention is a chimeric RNA that can form siRNA targeting a specific mRNA.
  • the portion of a chimeric RNA that can generate siRNA targeting a specific mRNA is an RNA (shRNA) having a short hairpin structure.
  • the shRNA has a stem-loop structure that includes a double-stranded part and in which a sense strand and an antisense strand are linked via a loop sequence.
  • the double-stranded structure is formed by a self-complementary RNA strand that contains a sense strand and an antisense strand as reverse sequences in one RNA strand.
  • Short hairpin RNA is processed in cells or in vivo to produce siRNA.
  • triphosphate may be bound.
  • the type and number of bases of the overhang are not limited, and examples include a sequence consisting of 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2 bases, For example, UU.
  • the overhang refers to a base added to the end of one strand of shRNA and having no base capable of complementary binding to the corresponding position of the other strand.
  • the double-stranded portion is composed of an RNA strand (sense strand) having a sequence that can be hybridized to the target gene sequence to be knocked down by RNA interference or a specific target sequence contained in the non-coding region, and complementary to the sequence.
  • RNA strand (antisense strand) has a complementary structure.
  • the sense strand 3, end and the antisense strand 5, end are linked via a loop (hairpin loop sequence).
  • the hairpin loop sequence is not limited, but includes a sequence beginning with UU consisting of 5 to 12 bases, such as UUCAAGAGA (SEQ ID NO: 19).
  • Other loop sequences include Lee NS. Et al. (2002) Nat. Biotech. 20, 500-505, Paddison PJ. Et al. (2002) Genes and Dev. 16, 948-958, Sui G. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 5515-5520, Paul CP. Et al. (2002) Nat. Biotech. 20, 505-508, Kawasaki H. et al. (2003) Nucleic Acids Res It is possible to employ a loop consisting of the sequences described in 31, 700-707, etc.
  • the target sequence of the shRNA part of the chimeric RNA of the present invention is a partial sequence of a gene involved in virus replication.
  • the number of bases of the target gene of the shRNA of the present invention or the specific target sequence of the non-coding region is not limited and is selected in the range of 15 to 500 bases. Preferably 15 to 50, 15 to 45, 15 to 40, 15 to 35 or 15 to 30 bases, more preferably 20 to 35 bases, more preferably 19 to 30 bases, particularly preferably 19 to 29 bases or 28 bases It is.
  • a part having a large expression suppression effect may be selected depending on the target gene.
  • the shRNA of the present invention and the target sequence are preferably the same, but may be substantially the same, that is, a homologous sequence. That is, as long as the sense strand sequence and the target sequence of the shRNA of the present invention are hybridized, one or more, that is, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, 2 or 1 This mismatch may be present, but the gene repression effect is reduced by the mismatch. Hive in this case
  • the conditions for lysation are in vivo conditions when the shRNA of the present invention is administered in vivo and used as a pharmaceutical, and moderate stringent when the shRNA of the present invention is used as a reagent in vitro.
  • the sense strand sequence and the target sequence of the shRNA of the present invention have a sequence homology of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably%, 96, 97, 98 or 99% or more.
  • the viral gene targeted by the shRNA portion of the chimeric RNA of the present invention is not limited as long as it is a gene related to viral replication, and a partial sequence of the gene can be targeted.
  • a partial sequence of the gene can be targeted.
  • shRNA may be designed using a part of the sequence of these regions as a sense strand.
  • RNAi The sequence is known, and a partial sequence may be selected as appropriate from known sequence information
  • a structural protein core protein; C, coat protein; El, E2
  • a non-structural protein NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B
  • shRNA can be designed using a part of the sequence of each region as the sense strand.
  • miRNA micro RNA 18-25
  • a single-stranded RNA which is processed by a dicer from a miRNA precursor containing a double-stranded RNA region of around 70 bases miRNA, like siRNA, also expresses a gene containing a target sequence by RNAi.
  • miRNA may be contained as a single-stranded RNA of 18 to 25 bases, or may be contained as a double-stranded RNA (miRNA precursor) of around 70 bases.
  • miRNA precursor double-stranded RNA
  • the miRNA portion is referred to.
  • a double-stranded RNA raiRNA precursor
  • a single strand of 18-25 bases is obtained by Dicer. Suppresses the expression of the gene containing RNA and the target sequence
  • the target sequence included in the miRNA part is the same as in siRNA.
  • a decoy nucleic acid type (RNA) drug is a drug that can bind to a target gene of interest and block the expression of the target gene.
  • the transcription factor of interest Can bind and inhibit gene transcription.
  • the decoy RNA portion of the chimeric RNA of the present invention binds to a protein involved in the life cycle of the virus and inhibits the expression of the gene.
  • proteins involved in the viral life cycle include viral transcriptional regulator proteins and enzymes necessary for viral replication and growth.
  • the decoy RNA portion of the chimeric RNA of the present invention has a primary structure and a secondary structure similar to the region where a transcriptional regulatory factor recognizes and binds.
  • HIV-1 gene expression is regulated by the interaction of cellular factors with the viral transactivator protein Tat, which has specific regulatory elements in the HIV-1 LTR.
  • the HIV-1 regulatory protein Tat binds to one of the regulatory elements of the 59 nucleotide LTR region, called the transactivation response region (TAR).
  • TAR forms a stable hairpin structure and allows Tat binding.
  • Rev and Nef act as transcriptional regulators on HIV-1, and Rev protein binds to the PRE region.
  • Rev decoys see, for example, Ding SF et al., Front Biosci. 2002 Feb 01; 7: al5-28, Kohn DB et al.,
  • the decoy RNA portion of the chimeric RNA of the present invention has a three-dimensional structure similar to that of the TAR region or PRE region, and therefore the primary and secondary structures are also similar. Specifically, it is RNA having a sequence that is substantially the same as, or similar to, the sequence of the TAR region or the PRE region. In other words, as long as the decoy RNA portion of the chimeric RNA of the present invention and the TAR region or PRE region are hyper-hybridized, that is, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 ⁇ 3, 2 or 1 mismatches.
  • the conditions for hybridization in this case are in vivo conditions.
  • the sequence of the decoy RNA portion of the chimeric RNA of the present invention and the TAR region or PRE region is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 95, 96, 97,
  • the chimeric RNA portion of the present invention desirably has a loop-stem structure, and the loop-stem structure refers to a structure in which a single-stranded RNA forms a loop and a stem.
  • CAC CAG AUC UGA GCC UGG GAG CUC UCU as a sequence of the decoy RNA portion of the present invention having a structure similar to the TAR region
  • RNA with several mismatches can be used as long as it binds to the Tat protein.
  • examples of the decoy RNA portion of the chimeric RNA of the present invention for inhibiting HCV replication include NS3 protease and RNA that binds to NS3 helicase.
  • the design can be made with reference to Japanese Unexamined Patent Publication No. 2002-345475.
  • the decoy RNA portion of the present invention is an RNA that can bind to a specific protein, and is also referred to as an abtaminal RNA portion.
  • Antisense drugs are DNA or RNA that is complementary to the target gene of interest and that has a sequence to be hyper-lysed, and that suppresses the expression of that gene.
  • the antisense RNA portion of the chimeric RNA of the present invention is a sequence complementary to the target sequence of the target gene of interest, and is a sequence complementary to the sequence of the gene region involved in virus replication.
  • the antisense RNA portion complementarily binds to the mRNA of a gene involved in virus replication, inhibits translation, and suppresses gene expression.
  • LTR long terminal repeats
  • splice donor-accepting site for example, 5 'untranslated region
  • primer binding site for example, 5 'untranslated region
  • gag for example, gag, po protease, integra 1 ⁇ " ⁇ env ⁇ tat ⁇ selected from the group power consisting of rev, nef, vif vpr ⁇ vpu or vpx region
  • Antisense RNA complementary to a part of the sequence of these regions may be designed.
  • antisense RNA complementary to part of the sequence of structural proteins (core proteins; coat proteins; El, E2) and nonstructural proteins (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)
  • the RNA is 10 to 400 nucleotides in length, preferably no more than 250 nucleotides, more preferably no more than 100 nucleotides, and even more preferably 50 nucleotides in length.
  • the following nucleotides, especially preferred Properly is nucleotides between the length 12 to 28.
  • Antisense RNA site may have an appropriate loop structure.
  • Ribozyme refers to RNA having an activity of cleaving nucleic acids. Ribozymes include hammerhead-type ribozymes, hairpin-type ribozymes, and ribozymes derived from human delta hepatitis virus. In the present invention, any ribozyme is used.
  • the RNA portion can be included in the chimeric RNA.
  • the ribozyme also has a target sequence, and the ribozyme RNA portion can be designed by a known method.
  • Ribozy The RNA part (ribozyme RNA part) consisting of a gene recognizes and cleaves the raRNA of a gene involved in virus replication and suppresses gene expression. For example, HIV- 1 virus cases, LTR (long terminal repeats), 5 ' untranslated region, splice donor - acceptor sites, primer binding sites, 3, untranslated region, ga g, pol, Purotease, integrase Ze, env , Tat, rev, nef, v, vpr, vpu or vpx region.
  • tRNase ZL-EGS and RNase P-EGS are RNAs that have the activity of cleaving nucleic acids in the same way as ribozymes. Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 1 235-243 and Bioorg. Med, Chem. Lett. 14 (2004) 4941-4944 can be designed based on the description. Like ribozymes, tRNase ZL-EGS and RNase P-EGS recognize and cleave mRNAs of genes involved in virus replication and suppress gene expression.
  • RNAi medicines, decoy medicines, antisense medicines, ribozyme medicines, tRNase ZL-EGS medicines, and RNase P-EGS medicines all suppress gene expression.
  • the chimeric RNA of the present invention contains a plurality of antigenes and can act as an antigene medicine. Also, since it is an unprecedented gene drug, it is called a second generation anti-gene drug.
  • the shRNA part or miRNA part, decoy RNA part, antisense RNA part, RNA part consisting of ribozyme, RNA part consisting of tRNase ZL-EGS and RNA part consisting of RNase P-EGS are: It can be synthesized in vitro in a coupled form or by a transcription system using a promoter and RNA polymerase. At this time, the DNA sequence appropriately includes a terminator and the like. For example, a TTTTT sequence or the like may be used as a terminator sequence. As the promoter, T3 promoter, T7 promoter, etc. are used for in vitro production.
  • the chimeric DNA template DNA of the present invention is introduced into a vector, and the vector is administered in vivo to form a chimera in vivo.
  • U6 promoter, PolIII promoter such as HI promoter, tRNA promoter, etc. are used.
  • a plasmid vector, a virus vector, or the like can be used as the vector.
  • the plasmid vector is a pBAsi vector. Kuta, pSUPER vectors, etc. may be used.
  • virus vectors adeno-winores vectors, lentivirus vectors, retro-wiles / less vectors, etc. can be used.
  • Integration of the vector ⁇ ⁇ ⁇ in a state where the chimeric RNA of the present invention can be expressed can be carried out by a known method.
  • the shRNA part and other RNA parts are cleaved by the action of a dicer in vivo.
  • the sequence that is recognized and cleaved by Dicer is the UU present at the 3 'overhang site of the shRNA portion, so it is sufficient to include a metasequence between the shRNA portion and other RNA portions.
  • the chimeric RNA containing each RNA part is expressed as a single molecule from the vector, and is cleaved into the part written by the in vivo dicer etc.
  • siRNA or miRNA is formed from the shRNA part or miRNA part.
  • the decoy RNA part Antisense RNA part from the RNA part, the ribozyme part from the RNA part composed of ribozyme, the RNA part part composed of tRNase ZL-EGS, tRNase ZL-EGS, RNase RNase P-EGS is produced from the RNA part consisting of P-EGS and performs its function.
  • the chimeric RNA of the present invention can be used as a drug for gene suppression, and particularly suppresses viral replication, and thus causes viral inhibitors, prevention of viral infections, therapeutic drugs, and viral infections. It can be used as a preventive or therapeutic agent for cancer.
  • the chimeric RNA when the subject is a cell or tissue, the chimeric RNA can be introduced by culturing simultaneously with the cell or tissue.
  • a method using calcium ion there are a method using calcium ion, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, a calcium phosphate method, a lipofussion method, a microinjection method and the like.
  • the subject is an animal individual, it can be administered by the oral route and by intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal injection or parenteral route.
  • RNA delivery systems There are various known methods for drug delivery systems, and an appropriate method can be adopted depending on the administration site.
  • the drug delivery system include known methods using ribosome, emulsion, polylactic acid or the like as a carrier.
  • Administration is pharmaceutically acceptable It may be desirable to mix with diluents or carriers that can be prepared. Suitable carriers include, but are not limited to, physiological saline, phosphate buffered saline, phosphate buffered saline glucose solution, and buffered saline.
  • the amount of chimeric RNA to be introduced can be determined appropriately depending on the type, severity, subject age, weight, etc.
  • RNA amount may be about 0.1 / ig to 100 mg once to several times a day.
  • a viral vector such as a lentiviral vector
  • 0.1 l A g to about 100 mg may be administered as the amount of vector DNA, and it may be administered once to several times a day.
  • siRNA or miRNA and decoy RNA are generated in vivo when a vector containing the chimeric RNA or DNA encoding the chimeric RNA is administered.
  • siRNA or miRNA suppresses viral gene expression and viral replication.
  • mutations occur in the siRNA or miRNA target sequence of the viral gene, the mutation increases with time, the siRNA or miRNA cannot recognize the target sequence, and the effect of siRNA or miRNA is lost.
  • the decoy RNA can suppress viral replication by binding to the transcriptional regulator of the virus, regardless of the mutation of the virus, so even after siRNA loses its effect, the action of the decoy RNA Can suppress virus replication.
  • the chimeric RNA when a vector containing DNA encoding the chimeric RNA of the present invention is administered, the chimeric RNA is produced in the nucleus of the cell and then transferred to the cytoplasm by the action of exportin. It has the effect of being sent and performing well in the cytoplasm.
  • the present invention also includes a method for administering or treating a viral infection by administering the chimeric RNA to a subject, suppressing viral replication in the subject, and preventing a viral infection. Furthermore, the present invention includes use of the above chimeric RNA for production of a viral replication inhibitor, a virus infection preventive agent or a virus infection treatment agent.
  • FIG. 2A shows an example of the chimeric RNA of the present invention.
  • the example shown in FIG. 2A is a chimeric RNA consisting of an shRNA part and a decoy RNA part that act as RNAi drugs that suppress HIV-1 replication and act as decoy RNAs.
  • the sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the shRNA part represses HIV-1 vif gene expression, and the decoy RNA part binds to HIV-1 Tat protein and represses transcription of the TAR region.
  • the vif gene part is likely to be mutated, and the RNAi drug alone targeting the vif gene loses its effect over time.
  • the chimeric drug of the present invention also contains decoy RNA, even after the vif gene has been mutated and the shRNA part cannot suppress the expression of the vif gene, the transcription of the TAR region is suppressed. It can suppress HIV-1 replication. Therefore, since HIV-1 replication can be suppressed over a long period of time, it can be used as an effective and reliable preventive or therapeutic agent for HIV-1 infection.
  • the chimeric RNA of the present invention can be produced as a chimeric RNA using a chemically synthesized or in vitro transcription system, and can be administered to a subject in need of prevention or treatment, or can be used as a viral vector such as a lentivirus.
  • FIG. 4 shows how the chimeric RNA of FIG. 2A of the present invention suppresses HIV-1 replication.
  • the hybridizing conditions are in vivo conditions.
  • the chimeric RNA of the present invention is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 95, 96, 97,
  • RNA with 98 or 99% sequence homology is also included.
  • the present invention relates to shRNA or miRNA that acts as an RNAi pharmaceutical and decoy RNA
  • pharmaceutical compositions comprising separately decoy RNA acting as a medicament.
  • the shRNA or miRNA and the decoy RNA are not linked to form a chimeric RNA, and each exists alone.
  • the pharmaceutical composition can be used as a virus replication inhibitor, a virus infection preventive agent or a virus infection therapeutic agent.
  • the present invention provides a method or treatment for inhibiting viral replication in a subject, including administering the above-mentioned shRNA or miRNA and decoy RNA to the subject at the same time, or before and after the subject, and preventing viral infectious diseases. The method of carrying out is also included.
  • shRNA or miRNA can be administered first, and decoy RNA can be administered several days to several weeks later.
  • the present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • HeLa 293T, Jurkat, H9 and MT-4 cells are 10% (v / v) heat-immobilized urine fetal serum (FBS), L-glutamine (2 mM), penicillin (lOOU / mL) and streptomycin ( The cells were cultured in a complete medium consisting of RPMI IMO medium (Sigma Chemical) supplemented with lOO ⁇ ag / mL) or DMEM (Gibco). All cultures were carried out under 37 ° C, 5% C0 2 atmosphere.
  • PBMCs Human peripheral blood lymphocytes
  • Fresh blood 1: 3. Centrifugation at 1500rpm for 15 minutes L, Red blood cells and white blood cells were separated. The portion of the white blood cells were centrifuged 5 min at 1500r P ra put volumes of PBS was transferred to a 50ml centrifuge tube. This operation was repeated once more and 10% RPMI was added to 1.0 ⁇ 10 6 / ml
  • the expression plasmid was constructed by a known method. Hairpin siRNA sequences chemically synthesized as two complementary DNA oligonucleotides are mixed in equimolar amounts at 95 ° C. The mixture was heat-treated for 5 minutes and gradually cooled in an annealing buffer (10 mM Tris-HCl / 100 mM NaCl). The resulting duplex was ethanol precipitated and ligated to the Kpnl and BamHI cloning sites upstream of the U6 promoter (Lee NS et al., At Biotechnol 2002, 20, 500-5) to prepare the following vectors.
  • U6-vif shRNA TAR vector HIV- 1 both vif shRNA and decoy TAR, K P nI, dsRNA sense sequence containing EcoRI and BamHI cloning sites (5, - CCA GAT GGC AGG TGA TGA TTG TCC ACA CCA CAA TCA TCA CCT GCC ATC TTG TTA CCA GAT CTG AGC CTG GGA GCT CTC TGG CTT CCT TTT TGA ATT CG-3, SEQ ID NO: 3) and antisense sequence (5 '-GAT CCG ATA TCA A AA A AG GAA G CC AGA GAG CTC CCA GGC TCA GAT CTG GTA ACA GAT GGC AGG TGA TGA TTG TGG TGT GGA CAA TCA TCA CCT GCC ATC TGG GTA C-3 ′, SEQ ID NO: 4)
  • U6- vif shRNA vector HIV-1 vif sense fragment sequence (5,-CCA GAT GGC AGG TGA TGA TTG TCC ACA CCA CAA TCA TCA CCT GCC ATC TGT TCC TTT TTG AAT TCG-3) and antisense The sequence (5, -GAT CCG ATT CAA AAA GGA ACA GAT GGC AGG TGA TGA TTG TGG TGT GGA CAA TCA TCA CCT GCC ATC TGG GTA C-3, SEQ ID NO: 6) is encoded.
  • U6-vif shRNA-Ran RNA vector random v: if sense sequence (5, -CGG ACG TTG ATT AGT ATG CGG ACC ACA CCT CCG CAT ACT AAT CAA CGT CCT TCC TTT TTG AAT TCG-3 ', SEQ ID NO: 7) and An antisense sequence (5'-GAT CCG AAT TCA AAA AGG AAG GAC GTT GAT TAG TAT GCG GAG GTG TGG TCC GCA TAG TAA TCA ACG T-3, SEQ ID NO: 8) is encoded.
  • U6-TAR RNA vector HIV— 1 TAR sense sequence (5, — CAC CAG ATC TGA GCC TGG GAG CTC TCT GGC TTC CTT TTT GAA TTC G-3 ′, SEQ ID NO: 9) and antisense sequence (5′-GAT CCG AAT TCA AAA GGA AGC CAG AGA GCT CCC AGG CTC AGA TCT GGT GGT AC-3 ′, SEQ ID NO: 1 O) is encoded.
  • U6- mTAR31-34 RNA vector Mutant TAR loop sense sequence (5'-CAC CAG AGA GCC TGG
  • U6-vif shRNA-Ran-mTAR vector random vif and mutant TAR sense sequences (5,-CGG ACG TTG ATT AGT ATG CGG ACC ACA CCT CCG CAT ACT AAT CAA CGT CCT TCC ACC AGA GAG CCT GGG AGC TCT CTG GCT TCC TTT TTG AA T TCG-3, SEQ ID NO: 13) and antisense sequence (5, -GAT CCG AAT TTC AAA AAG GAA GCC AGA GAG CTC-3 ', SEQ ID NO: 14) are encoded.
  • the lentiviral vector was constructed as follows. The EcoRI site upstream of the U6 promoter and the EcoRI cloning site downstream of the insert fragment are digested and cloned into the EcoRI site of the lentiviral vector (CS-CDF-CG-PRE). CS-vif shRNA-TAR, CS -TAR, CS-vif shRNA, CS-vif Ran-MTAR and control transfer vectors were constructed. RT-PCR analysis of mRNA expression
  • HeLa CD4 + cells (5 ⁇ 10 5 cells) were seeded in a 60 mm dish. After 24 hours, replace the medium with fresh antibiotic-free medium and transfer with 3 ⁇ g of vector DNA using Lipofectamine 2000 transfection reagent optimized by Opti-MEM according to the manufacturer's protocol. I did. After 72 hours, total RNA from cells transfected with the vector and non-transfected HeLa CD4 + cells was extracted using Trizol reagent (Invitrogen).
  • RNA PCR high-plus kit (Toyobo Co., Ltd.) was used to detect the presence of endogenous dicer in HeLa CD4 + cells (upstream primer of dicer 1 (nucleotide 1-24, forward primer F- (5, -CCA GAT GGC AGG TGA TGA TTG TCC -3 ', SEQ ID NO: 15)) and downstream (nucleotide 435-459, reverse primer R- (5,-GGA AGC CAG AGA GCT CCC AGG CTC-3', SEQ ID NO: RT-PCR was performed using 1 6)).
  • upstream primer of dicer 1 nucleotide 1-24, forward primer F- (5, -CCA GAT GGC AGG TGA TGA TTG TCC -3 ', SEQ ID NO: 15)
  • downstream nucleotide 435-459, reverse primer R- (5,-GGA AGC CAG AGA GCT CCC AGG CTC-3', SEQ ID NO: RT-PCR was performed using
  • GADPH-F human control gene
  • GADPH-R nucleotides 422-466
  • All extracted RNA products were treated with 2 ⁇ g DNase I without RNase at 37 ° C for 30 minutes.
  • non-RT-PCR using extracted vif-TAR RNA was also performed to check for DNA contamination.
  • the resulting RT-PCR product was fractionated and analyzed by electrophoresis using a 2% agarose gel.
  • RNA was extracted from transiently transfected HeLa CD4 + cells 5 x 10 5 cells 24 hours later, and RNA per lane was electrophoresed on 20% polyacrylamide / 8 M urea gel. It was. After electrophoresis, RNA bands were transferred to Hybond-N TM nylon membrane (Amersham). Pand was detected using a synthetic oligonucleotide complementary to the antisense strand of Vif-shRNA-TAR RNA as a probe. Hybridization was performed at 37 ° C, washed with 2X SSPE, washed at 39 ° C, and then washed once at 41 ° C with 1X SSPE prior to exposure to autoradiography. Dicer cutting assembly in vitro and in vivo
  • RNA substrate was really cleaved in the cells
  • HeLaCD4 + cells were transfected with 3 / g of vector DNA, and total RNA was extracted 24 hours after transfection with Trizol reagent.
  • vif shRNA-TAR DNA was transcribed into RNA using T7 polymerase. Transferring those Toransufueku preparative and both transcribed RNA by T7 fractionated Hybond- N ni nylon film on 20% poly acrylamide / 8 M urea gel was performed Northern blot analysis. Downregulation of target mRNA and suppression of HIV-1 replication in cells
  • RNA content was examined using a primer set capable of detecting HIV-1 vif virus mRNA and TAR mRNA. HIV-1 in culture supernatant without collected cells
  • the gag 24 antigen production level was measured by a fully automated ELISA system (CLEIA) (Lee. NS et al., at Biotechnol 2002, 20, 500-5 ⁇ ).
  • HeLa CD4 + cells 3 X 10 5 cells were cotransfected with 0.1, 1, and vector DNA and HIV lpNLE DNA 0.2 ⁇ g. I did. The cell-free culture supernatant was collected, and the extracellular HIV-1 gag p24 antigen production level was measured as an infectivity of virus replication.
  • Jurkat cells Twenty-four hours after gene transfer, 1 ⁇ 10 6 Jurkat cells were infected with 0.01 MOI of HIV-1 3 . After incubation with overnight, the cells were washed three times with serum-free medium and cultured with R10 (RPMI1640 + 10% FBS). Half of the culture volume was collected at the same interval and replaced with the same volume of culture medium. The collected culture was centrifuged, the cell-free medium was used for HIV-1 gag p24 antigen analysis, and the cell pellet was used for cell viability test and GFP-expressing RNA extraction.
  • R10 RPMI1640 + 10% FBS
  • Viral RNA was isolated from the cell-free culture supernatant using the QIAamp virus RNA kit (Qiagen) according to the manufacturer's protocol. 5 // L viral RNA, Powerscrip reverse transcriptase (Clontech), ImM deoxynucleotide triphosphate, IX first strand buffer (Clontech), 200 ng random hexamer (Promega) And 10U RNasin (Promega's) were mixed and used for reverse transcriptase reaction. Reverse transcription was performed at 42 ° C for 1 hour, followed by heat inactivation of reverse transcriptase at 70 ° C for 15 minutes. Next, 2 ⁇ 1 of cDN A was added to 1 X Qiagen Taq PCR, 1.5 mM MgCl 2 , 20 pmol sense primer vif F: (5,-ATG GAA AAC AGA
  • PCR products were fractionated, analyzed on a 1% seakem gel, and purified using the QIAEX II gel extraction kit (Qiagen). Nucleotide cycle sequencing was performed using Dye-labeled compounds. According to this example, the following results were obtained.
  • Figures 1A and B show the vector design, target site and structure for U6 plasmid and CS lentiviral vector.
  • Figure 1A shows the structure of the second generation shRNA expression vector.
  • Figure 5 shows an enlarged view of the 5 'LTR representing the HIV-1 genome and representing the decoy TAR RNA target and V shRNA target location for the tat protein.
  • FIG. 1B shows a control expression cassette with vif shRNA-TAR and terminator single sequence transcribed with the human U6 promoter.
  • FIG. 2B shows the subcellular localization of second generation HIV-1 vif shRNA (vif shRNA-TAR chimeric RNA). Cells were transfected with the vif shRNA-TAR construct.
  • FIG. 2C shows a Northern blot analysis of expression vector mRNA in HeLa CD4 + cells. Cells were transfected with various vector constructs, and the mRNA expression efficiency in the cells was examined.
  • the vif shRNA-TAR molecule was localized more strongly in the cytoplasm than the nucleus. This makes it possible to determine where the biological function is to be exerted.
  • RNAi mechanism is strongly related to the activity of an endogenous RNAase III-like enzyme called dicer in the cell, so the expression of the endogenous dicer in the transfected HeLa CD4 + cells.
  • RT-PCR using sand This was done to establish evidence that vif shRNA-TAR RNA molecules were processed into siRNA and exerted both RNAi and decoy RNA TAR effects in cells.
  • high level expression of Dicer was observed in the cells (Figure 2D).
  • FIG. 2D shows Dicer present in HeLa CD4 + cells. Total RNA in the cells was recovered from HeLa CD4 + cells and amplified using specific Dicer detection primers. This causes a dual type of anti-HIV-1 effect that works against both transiently transfected and infected stable expressing cells.
  • Lane 1 vif shRNA-TAR DNA I transcribed into T7 RNA polymerase in the absence of endonuclease and Dicer effects
  • Lanes 2 and 3 V shRNA-TAR and TAR RNA expressed in HeLa CD4 + cells .
  • the human control gene G3PDH was run simultaneously for standardization of input RNA. Detection of both vif shRNA-TAR and TAR RNA bands in lane 2 indicates in vivo cleavage of the chimeric RNA in the cells.
  • 'Lane 3 TAR RNA is a control to check the migration of the cleaved TAR RNA component of the vif shRNA-TAR substrate.
  • Lane 1 is a control synthetic oligonucleotide transcribed by T7 RNA polymerase and no endogenous dicer is present.
  • Lane 2 shows vif shRNA-TAR substrate extracted 24 hours after transfection from transfected cells expressing endogenous dicer. TAR RNA components were detected simultaneously with the remaining uncut vif shRNA-TAR mRNA. This indicates in vivo cleavage within the cell.
  • Lane 3 is the truncated TAR RNA component of the vif shRNA-TAR chimeric RNA The expressed TAR mRNA extracted from transfected HeLa CD4 + cells as an internal control marker.
  • Lane 1 Dicer and reaction mixture without sample (negative control)
  • Lane 2 Reaction mixture with vif shRNA-TAR RNA but without Dicer
  • Lane 3 Dither with vif shRNA-TAR RNA Reaction mixture.
  • HeLa CD4 + cells are 0.2 ju at various DNA concentrations (0.1, 1.0, and 3.0 g) of U6-vif shRNA—TAR, vif shRNA, shRNA Random, Decoy TAR, Decoy M—TAR and Control U6 vectors. co-transfected with HIV-l pNLE. The culture supernatant was collected 72 hours after transfection, and HIV-1 p24 assay was performed using an automated ELISA system. HIV-1 mRNA analysis from co-transfected cells showed down-regulation of viral mRNA expression.
  • HIV-1 pNLE As shown in the panel showing vif shRNA-TAR chimeric RNA, vif shRNA and decoy TAR RNA, There was a significant decrease in HIV-1 reporter gene expression (EGFP) compared to the panel showing vif shRNA Ran and M-TAR ( Figure 3B).
  • Figure 3B shows suppression of HIV-1 reporter gene expression. Simultaneous transfection into cells 72 hours later, cells were transferred to a microscope slide and examined for EGFP expression. Panel shows suppression of HIV-1 reporter gene mediated by vif-TAR, vif shRNA and TAR decoy. The panel shows that vif shRNA random and mutant TAR maintain the same level of expression compared to the panel showing HIV-lpNLE.
  • vif shRNA-TAR construct construct a lentiviral vector and create a chimeric RNA (CS-vif shRNA-TAR), CS-vif shRNA, CS-TAR and control expression. Increased cassette delivery.
  • HIV-1 gag p24 antigen analysis of culture supernatants without sampled cells was performed to assess inhibition of HIV-1 replication (measured as the change in gag p24 antigen in viral replication assays) and against HIV-1 replication The anti-HIV-1 effect of antigene was evaluated.
  • FIGs. 3C, D and E show long-term suppression of HIV-1 replication by CS-vif shRNA-TAR.
  • Transgenic Jurkat, H9 cells and PBMCs in infection of a HIV- l 3 were cultured for more than 9 weeks.
  • a significant decrease in HIV-1 p24 levels was observed in vif shRNA-TAR expressing cells.
  • the HIV-1 p24 antigen production level of vif shRNA gradually increased from week 4 in Jurkat cells and reached the same level as that of control HIV-1 NL4-3 and vif shRNA Ran-M-TAR ( Figure 3C). ).
  • PBMCs gradually increased from the second week and reached the same level as controls HIV-1 NL4-3 and vif shRNA Ran-M-TAR (Fig. 3D).
  • H9 cells gradually increased from the 3rd week, reaching the same level as the control HIV-1 NL4-3 and vif shRNA Ran-M-TAR (Fig. 3E).
  • CS-vif-shRNA Lf shRNA- infected with TAR or CS- vif shRNA
  • Viral RNA is isolated from cells on days 28, 35 and 48, vif-vif and Tat genes of HIV- 1-3 caused by shRNA and TAR target sites Mutations and defects in were analyzed. Sequencing revealed mutations and deletions in the CS-vif shRNA target site in both CS-vif shRNA-TAR and CS-vif shRNA (alone). However, no mutations or defects were found in the Tat target region of HIV-1 viral RNA.
  • CS-vif-shRNA has a faster mutation and deletion rate compared to a slower mutation and deletion rate in cultures expressing CS-vif shRNA-TAR
  • Figure 3 F and G show the results of gene analysis in Jurkat cells and PBMCs, respectively.
  • Viral RNA was extracted from CS-V shRNA and CS vif shRNA-TAR culture supernatants, and sequenced for siRNA mutations in Jurkat cells at 2, 3, 4, 5 and 6 weeks.
  • PBMCs were sequenced for siRNA-mediated mutant opi deficiency at 2, 3, 4, 5, 6 and 8 weeks. Mutational opi-deficiency at the vif shRNA target site of HIV-1NL4-3 was detected in all cultured cells expressing either vif shRNA or vif shRNA-TAR.
  • Tat RNA and TAR RNA-specific interactions are important for combined gene therapy strategies with siRNA to assist in the high antiviral activity observed in long-term assays under RNAi-resistant strains. is there.
  • expression of a dual or multi-HIV-1 anti-gene expressed through a single RNA molecule that can be cleaved in cells enhances the suppression efficiency of HIV-1 replication over a long period of time. be able to.
  • the competitive interactive role of HIV-1 decoy TAR RNA enhances the inhibitory effect of V siRNA on HIV-1 replication
  • the chimeric RNA of the present invention acts as a decoy with a shRNA (short hairpin RNA) part or miRNA part capable of forming siRNA that suppresses gene expression, and causes gene transcription.
  • a decoy RNA part that suppresses the action of a child an antisense RNA part that suppresses gene expression, an RNA part composed of a ribozyme, an RNA part composed of tRNase ZL-EGS, and an RNA part composed of RNase P-EGS It contains an RNA moiety, and acts as at least one of RNAi drugs and decoy nucleic acid (RNA) drugs, antisense RNA drugs, ribozyme drugs, tRNase ZL-EGS drugs and RNase P-EGS drugs.
  • RNAi drugs and decoy nucleic acid (RNA) drugs antisense RNA drugs, ribozyme drugs, tRNase ZL-EGS drugs and RNase P-EGS drugs.
  • the chimeric RNA of the present invention is effective for virus suppression such as prevention of virus replication that can cause mutation and acquire RNAi resistance, and can be used as a preventive or therapeutic agent for viral infections. Even if the RNAi drug loses its effect due to the mutation of the virus, the virus is mutated due to the effect of the nucleic acid drug that exerts other actions or the effect of the nucleic acid drug that exerts the same action directed to other target sequences By suppressing the virus, it is possible to suppress the virus efficiently and reliably.

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Abstract

ウイルスRNAを標的配列としウイルスを抑制し得るsiRNAを形成し得る少なくとも１つのshRNA（ショートヘアピンRNA）部分もしくはウイルスRNAを標的配列としウイルスのライフサイクルに関与するタンパク質の発現を抑制し得る少なくともひとつのmiRNA部分を含み、さらにウイルスのライフサイクルに関与するタンパク質と結合しウイルスを抑制し得る少なくとも１つのデコイRNA部分、ウイルスのライフサイクルに関与する遺伝子にハイブリダイズしウイルスを抑制し得る少なくとも一つのアンチセンスRNA部分、ウイルスのライフサイクルに関与するタンパク質の発現を抑制し得る少なくとも１つのリボザイムからなるRNA部分、ウイルスのライフサイクルに関与するタンパク質の発現を抑制し得る少なくとも１つのtRNase ZL-EGSからなるRNA部分およびウイルスのライフサイクルに関与するタンパク質の発現を抑制し得る少なくとも１つのRNase P-EGSからなるRNA部分からなる群から選択される少なくとも１つのRNA部分を含み、２つ以上の上記RNA部分が切断可能に連結したキメラRNA分子。

Description

RNAi耐性ゥィルス株を克服する新手法
技術分野
本発明は、 RNAi、 デコイ RNAおよび Zまたはアンチセンス RNAを利用したウイ ルス感染の抑制、 ウィルス感染症の治療方法に関する。 明
背景技術
RNA 干渉（RNAi)は種々の遺伝子機能を阻害するための強力なツールであること 書
わ力 つてレヽる (Cogoni, C. et al. , Antonie Van Leeuwenhoek Int J 1994，
65:205-2092-14; Baucombe, D. C. Plant Mol Biol 1996, 32 :79 - 88; Kennerdell,
J. R. et al, Cell 1998, 95:1017—1026; Ngo, H. et al, Proc Natl Acad. Sci. USA
1998, 95:14687-14692; Timmons, L et al, Nature 1998， 395, 854； Waterhouse,
P.M. et al, Proc Natl Acad Sci USA 1998， 95， 13959 - 13964; Lohmann, J. U. et al. , Dev Biol. 1999， 214:21ト 214; Sanchez-Alvarado, A. et al. , Proc Natl Acad
Sci USA 1999, 96, 5049-5054; Smith, N. A. Singh et al. , Nature 2000， 407：
319-320； Wianny, F. et al. , Nat Cell Biol 2000， 2, 70 - 75; Chuang, C. F. et al, Proc Natl Acad Sci USA 2000， 97, 4985 - 4990; Yang, S. et al. , Mol Cell
Biol 2000， 21， 7807 - 7816; Svoboda, P.， Stein, P.， Hayashi, H. , and Schultz,
R. M. Selective reduction of dominant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA intereference. 2000， 127, 4147-4156)。 RNAiの使用は分化型の培養細胞にも拡 がっている （Elbashir, S. M. et al. , Nature 2001, 411, 494-498； Rosel, K. F. et al. , Nucleic Acid Res. 2003， 31 (15), 4417—4425)。 RNAiは siRNA (small interfering RNA) または miRNA (micro RNA)により引き起こされる （Lidardi, C. et al. , Cell 107， 297-307 (2001)； Sijen, T. et al. , Cell 107, 465 - 476 (2001))。
RNAi が関与する機構のステップには 5つのステップがあることがわかっている。 最初のステップでは、 dsRNA (30bpより大きレ、） がダイサ一と呼ばれる RNaselll 様酵素により切断されて 19〜23 ヌク レオチドのフラグメン トを生成する (Berstein, E. et al, Nature 2001， 409， 363 - 6 ; Kett ing, R. F. et al.， Genes and Development 2001, 15, 2654-9； Knight, S. W. et al. , Science . 2001， 293，
2269 - 71)。 これらの短い 2重鎖 s iRNAは、 2ヌクレオチドの 3， オーバーハング という機能に不可欠な特殊な特性を有している（Ebashir, S. M. et al, Gene and
Development 2001, 15， 188-200)。 その結果、 ATP依存性 RNAヘリカーゼがこれ らの短い 2重鎖を認識し s iRNA 2重鎖を 2つの 1重鎖 RNAにすると推測されてい る（Nykanen, A. et al . , Cel l 2001, 107， 309-21)。 次いで、 1重鎖の一つは
RISC (RNA- induced s ilencing complex) と呼ばれる高分子タンパク質複合体
(Ebashir, S. M. et al, Gene and Development 2001, 15, 188 - 200)に取り込まれ、
RISC 中のいまだ同定されていないェンドヌクレアーゼ活性を有するコンポーネ ントによる相同的な RNA配列の切断を導くガイドとして働く（Ebashir, S. M. et al
Gene and Development 2001, 15, 188 - 200 ; Hammond, S. M. et al. , Nature 2001,
404, 293-6) o 最後に、 RISCは切断された RNAから離れ再ぴ切断を触媒するため に再利用される。 この RISCの役割はサイレンシング効果にとって不可欠である。
DNA铸型により発現された siRNAも外来的に遺伝子導入された s iRNAと同じくら い効率的に遺伝子発現を抑制することが示されている（Bru讓 elkamp, T. R. et al.
Science 2002, 296， 550-3 ; Paddison, P. J. et al, Gene and Development 2002，
16, 948-58； Paul, C. P. et al, Nature Biotechnology 2002, 20, 505 - 8 ; Zeng
Y. et al, Mol ecular Cell 2002, 9， 1327—33)。 RNAiは培養細胞において、 いく つかの異なる病原性ウィルスの複製を効果的に抑制する。（非特許文献 1から 5を 参照）。 これらのウィルスとしては灰白髄炎ウィルス（Pol iomyel it i s virus)、
RSV (respiratory syncytical virus)および HIVが挙げられる。 HIVに関する報告 において、特異的な mRNAが標的となり s iRNAによるサイレンシングが達成されて いる。 標的 RNAとしては、 Gag - Pol、 Env、 Vif ならびに小さい制御性タンパク質 である Tatおよび Revが挙げられる。これらの報告は RNAiがウィルス RNAだけで はなく、 ウィルス感染サイクルのインテグレーション段階の前後でゲノム RNAを も効率的に標的とし得ることを示した（Bitko, V. et al. , BMC Microbiology 2001,
1， 34-46 ： Gitin, L. et al. ， Nature 2002, 418, 430-434 ： Coburn, G. A. et al . , Journal of Virology 2002, 76, 9225-31 ： Jacque, J. M. et al. , ature 2002, 418, 435-8： Novina, C. D. et al. , Nat Med 2002, 8， 681—6)。 動物モ デルおよびヒ トへの実際の応用において、 siRNA を効率的にデリバリーするため に、 レトロウイノレス (Brummelkamp, ΐ. R. et al. , Cancer Cell 2002, 2, 243—7)、 アデノウイノレス（Xia， H. et al. , Nat Biotechnol 2002, 20， 1006 - 10)およびレ ンチウィルス（Qin， X. et al. , Proc. Natl Acad of Sci USA 2003. 100， 183 - 8) ベースの遺伝子治療用ベクターが構築され、 種々の細胞や組織において、 安定に 実質的に s iRNAを発現することができた。 しかしながら、 最近長期間の培養にお いて siRNAにより誘導される変異による耐性ウィルス株の出現が報告されている (Atze T. Das et al. , J. viol. 78： 2601-2605 (2004) ： Daniel Boden et al. , J. viol. 77： 11531-11535 (2003) )。 この現象は、 HIV-1治療応用への siRNAの 使用を踏みとどまらせると思われる。
一方、 ウィルス増殖の抑制のために、 デコイ型核酸医薬分子を用いることが研 究されている。 デコイは、 その一例として、 ウィルスゲノム上の転写因子結合部 位と同じ配列を含む短い核酸であり、 体内に投与すると転写因子がゲノムに結合 することを阻害して遺伝子の働きを抑える。 ウィルスの転写因子に対するデコイ により体内でのウィルス増殖を抑えることが可能である。 例えば、 HIVの Tat転 写増殖因子と結合するデコイ RNA (R. Yamamoto et al. , Genes Cells 5, 371-388 (2000) ) や HCVの NS3 プロテアーゼを抑制するデコイ RNA (K. Fukuda et al. , Eur. J. Biochem 267, 3685-3694 (2000) ) 等について報告されている。 発明の開示
本発明は、 RNAi医薬、 デコイ RNA医薬等の RNA医薬の少なくとも 1つの医薬と しての作用を発揮し得る複数の機能的 RNA部分を含むキメラ RNAならびに該キメ ラ RNAを含む医薬の提供を目的とする。
本発明者は、 HIV- 1の遺伝子の変異により、 HIV- 1 RNAを標的とした siRNAによ る HIV-1の複製抑制効果が失われる現象について検討を行った。 siRNA適用後、
HIV-1 RNAに変異が生じ、 siRNAが HIV- 1 RNAを認識できなくなり、 時間が経過す ると siRNAにより HIV- 1 RNAを切断できなくなるものの、 HIV- 1 RNAに変異が生 じる前には、 HIV- 1の複製をかなり抑制し、 ある程度の HIV- 1複製抑制効果を発 揮していることに鑑み、 HIV-I RNA に変異が生じた場合にも、 変異の生じていな い他の RNA領域を標的にして HIV - 1 RNAの複製を抑制することにより、 長期間に わたって HIV- 1 の複製を抑制し得ることを見出した。 すなわち、 従来から種々 HIV-1 の遺伝子を標的した種々の HIV-1感染治療法が研究されていたが、 それら がすべて一箇所の標的配列をターゲットとして、 該標的配列を攻撃する 1種類の 分子を用いていたのに対して、 複数の標的配列をターゲットとして、 複数の攻撃 分子を用いることにより、 HIV- 1に変異が生じても、 確実に HIV- 1 の増殖を抑制 し得ることを見出した。 .
本発明者は、 一例として、 キメラ RNA部分として発現される分割可能な HIV - 1 vif shRNAとデコイ TAR RNAをコードする第二世代のアンチ HIV shRNAが著しく HIV-1複製抑制効果を有することを見出した。デコイ TAR RNAは競合的に HIV- 1 Tat タ^パク質と相互作用 （タンパク質- RNA相互作用） し、 HIV- 1転写の 5 ' LTRプロ モーターからのトランス活性化現象のダウンレギュレートを引き起こし、 相補的 な阻害因子 （CIF) として働く。 一方、 HIV - 1 vif - shRNAは安定に遺伝子導入され た Jurkat細胞中で発現され、 RNA- RNA相互作用により HIV- 1起源の遺伝子の転写 後阻害に働く。 標的ウィルスの遺伝子型分析により、 vif shRNA とデコイ TARの キメラ RNAならびに shRNA単独を発現する遺伝子導入 Jurkat細胞中で、 HIV - 1ゥ ィルス RNAの vif shRNA標的部位において変異が生じていることがわかった。 し かも、 該変異は時間とともに多くなつていき、 次々にウィルス変異株が生じてい た。 一方、 HIV- 1 ウィルス RNAのデコイ RNA標的部位においては変異は生じてい なかった。 興味深いことに、 siRNA が関与する変異による耐性の獲得は対照 vif shRNA 単独およびランダム V shRNA 変異デコイ TAR キメラ RNA (vif shRNA Ran- mTAR)を発現する培養中でのみ観察された。 2重 HIV- 1アンチジーン分子を複 合させて発現させ、 細胞中で単一 RNA分子に分割させ、 RNA - RNA相互作用および タンパク質- RNA相互作用の両方を利用する新しいス トラテジーは HIV- 1遺伝子治 療に有用である。
すなわち、 本発明の態様は、 以下のとおりである。
[ 1 ] ウィルス RNAを標的配列としウィルスを抑制し得る siRNAを形成し得る少 なぐとも 1つの shRNA (ショートヘアピン RNA) 部分もしくは miRNA部分を含み、 さらにウィルスのライフサイクルに関与するタンパク質と結合しウィルスを抑制 し得る少なく とも 1つのデコイ RNA部分、 ウィルスのライフサイクルに関与する 遺伝子にハイブリダイズしウィルスを抑制し得る少なく とも一つのアンチセンス RNA部分、 ウィルスのライフサイクルに関与するタンパク質の発現を抑制し得る 少なく とも 1つのリボザィムからなる RNA部分、 ウィルスのライフサイクルに関 与するタンパク質の発現を抑制し得る少なく とも 1つの tRNase ZL - EGSからなる RNA 部分ならびにウィルスのライフサイクルに関与するタンパク質の発現を抑制 し得る少なく とも 1つの RNase P-EGSからなる RNA部分からなる群から選択され る少なく とも 1つの RNA部分を含み、 2つ以上の上記 RNA部分が切断可能に連結 したキメラ RNA分子。
[2] ウィルス RNAを標的配列としウィルスを抑制し得る siRNAを形成し得る少 なく とも 1つの shRNA部分もしくは miRNA部分ならびにウィルスのライフサイク ルに関与するタンパク質と結合しウィルスを抑制し得る少なく とも 1つのデコイ RNA部分が切断可能に連結したキメラ RNA分子。
[ 3 ] shRNA部分または miRNA部分と他の RNA部分との間に UU配列が存在する [1 ]または [2]のキメラ RNA分子。
[4] ウィルスが HIV - 1、 HI V - 2、 HCV、 ガンおよびィンフルェンザウィルスから なる群から選択される [1]〜[3]のいずれかのキメラ RNA分子。
[5] shRNA部分、 miRNA部分、 アンチセンス RNA部分、 リボザィムからなる RNA 部分、 tRNase ZL - EGSからなる RNA部分または RNase P - EGSからなる RNA部分が HIV—1の gag、 pol、 env、 tat、 rev、 nef、 vif、 vpr\ vpu、 vpx、 ま 7こは LTR領域 からなる群から選択される領域の一部配列を標的とする、 HIV - 1 を抑制する [1] のキメラ RNA分子。
[6] shRNA部分または miRNA部分が HIV-1の gag、 pol、 env、 tatヽ rev, nef、 vif、 vpr、 vpu、 vpx、 または LTR領域からなる群から選択される領域の一部配列 を標的とする、 HIV - 1を抑制する [2]のキメラ RNA分子。
[7] デコイ RNA部分が、 HIV- 1の TAR領域と相同な配列を有し Tatタンパク質 と結合し得る、 [5]または [6]のキメラ RNA分子。
[8] 下記の 2次構造を有する [7]のキメラ RNA分子。
Figure imgf000007_0001
[9] [1 ]〜[8]のいずれかのキメラ RNA分子の铸型 DNAを含みキメラ RNAを発 現するベクター。
[ 1 0] ウィルスベクターである [ 9 ]のベクター。
[1 1] [ 1：！〜 [8]のいずれかのキメラ RNA分子を含み、生体内で各 RNA部分に 切断されるウィルス感染症およびガンの予防または治療剤。
[1 2] [9]または [1 0]のベクターを含むウィルス感染症の予防または治療剤 であって、 生体内で各 RNA部分が生成するウィルス感染症の予防または治療剤。
[1 3] ウィルスの変異に基づくウィルスの RNAi 耐性を阻止することができる [1 1]または [1 2]のウィルス感染症おょぴガンの予防または治療剤。
[14] ウィルス RNAを標的配列としウィルスを抑制し得る siRNAを形成し得る 少なくとも 1つの shRNAもしくは miRNAならびにウィルスのライフサイクルに関 与するタンパク質と結合しウィルスを抑制し得る少なくとも 1つのデコイ RNAを 含むウィルス感染症の予防または治療剤。
[1 5] ウィルス RNAを標的配列としウィルスを抑制し得る siRNAを形成し得る shRNAもしくは miRNA力 S HIV-1の ag, pol、 env、 tat、 rev, nef、 vif、 vpr、 vpu、 vpx、 または LTR領域からなる群から選択される領域の一部配列を標的とする [ 1 4 ]のウィルス感染症の予防または治療剤。
[1 6] デコイ RNA部分が、 HIV- 1の TAR領域と相同な配列を有し Tatタンパク 質と結合し得る、 [ 1 4 ]または [ 1 5 ]のウィルス感染症の予防または治療剤。
[ 1 7 ] ウィルスの変異に基づくウィルスの RNAi 耐性を阻止することができる [ 1 5 ]または [ 1 6 ]のウィルス感染症およびガンの予防または治療剤。 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005- 051602号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1 Aは、 第二世代 shRNA発現ベクターの構築を示す図である。
図 1 Bは、 レンチウィルスベースのベタターの構築を示す図である。
図 2 Aは、 GENETYX ソフ トゥヱァにより分析された vif-TARキメラ RNAの 2次
RNA.構造を示す図であり、 v:if shRNA の 3 ' 末端と TAR RNA の 5 ' 末端の間に UU 単一鎖切断部位がある。
図 2 Bは、 HeLa CD4+細胞の RT- PCR分析の結果を示す写真である。
図 2 Cは、 HeLa CD4+細胞中の発現ベクター mRNAのノーザンプロット分析を示す 写真である。
図 2 Dは、 HeLa CD4+細胞中に存在するダイサーを示す写真である。
図 2 Eは、 キメラ RNAの in vivoでの切断を示す図である。
図 2 Fは、 キメラ RNAの in vitro での切断を示す写真である。
図 3 Aは、 HIV - 1抗ウィルス効果を示す図である。
図 3 Bは、 HIV-1 レポーター遺伝子発現のダウンモジュレーションを示す写真 である。
図 3 Cは、 CS-vif shRNA - TARによる Jurkatにおける HIV- 1複製の長期抑制を 示す図である。
図 3 Dは、 CS- vif shRNA- TARによる RBMCsにおける HIV- 1複製の長期抑制を示 す図である。
図 3 Eは、 CS-vif shRNA- TARによる H9細胞における HIV- 1複製の長期抑制を 示す図である。
図 3 Fは、 Jurkat細胞における遺伝子型分析の結果を示す図である。 図 3 Gは、 PBMCsにおける遺伝子型分析の結果を示す図である。
図 4は、 本発明のキメラ RNAの HIV-1への作用を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について詳細に説明する。
本発明のキメラ RNAは、 少なくとも 2つの機能的 RNA部分を含み、 RNA部分は RNAi 機構を介した RNAi 医薬としての作用、 デコイ機構を介したデコイ型核酸 (RNA) 医薬としての作用、 アンチセンス RNA医薬としての作用、 リボザィム RNA 医薬としての作用、 tRNase ZL- EGS医薬としての作用おょぴ RNase P - EGS医薬と しての作用の少なくとも 1つの医薬としての作用を発揮する。 好ましくは、 2つ 以上の RNA部分のうちの一つの RNA部分は RNAi機構を介した RNAi医薬としての 作用を発揮し、他の RNA部分はデコイ機構を介したデコイ型核酸 （RNA) 医薬、 了 ンチセンス RNA医薬、リボザィム RNAi医薬、t腿 ase ZL- EGS医薬おょぴ RNase P- EGS 医薬の少なくとも 1つの医薬としての作用を発揮する。
本発明のキメラ RNAは、 ウィルスの抑制に用いることができる。 ここで、 ウイ ルスの抑制とはウィルスの複製、 増殖を抑制し、 ウィルスが生存できなくするこ とをいう。 ウィルス感染症の治療のために、 従来からウィルス複製を抑制するた めに、 ウィルスの複製機構に関与する遺伝子を標的にした siRNA、 アンチセンス 核酸やリボザィムを用いることが研究されていた。 しかしながら、 HIV 等の RNA ウィルスにおいて、 ウィルス遺伝子に高頻度で変異が生じ得る。 従って、 ウィル スの変異により、 特定の遺伝子配列を標的とする siRNA、 アンチセンス核酸ゃリ ボザィムのウィルス抑制効果が消失してしまう。 例えば、 HIV- 1 の vif 遺伝子を 標的とする siRNAを投与した場合、 数週間で HIV- 1遺伝子に変異が生じ、 徐々に 変異が増大し、 siRNAの遺伝子発現抑制効果は減少していく。本発明のキメラ RNA は、 ウィルスを抑制するために攻撃するウィルスのライフサイクルに関与した遺 伝子に変異が生じたとしても、 変異していない遺伝子を同時に攻撃することによ り、 ウィルスが攻撃からエスケープするのを阻止し、 効率よく確実にウィルスを 抑制することができる。ここでウィルスのライフサイクルに関与した遺伝子とは、 ウィルスが複製あるいは増殖するのに必要な遺伝子をいい、 ウィルスの構造遺伝 子、アクセサリー遺伝子、転写調節因子をコードする遺伝子等が含まれる。なお、 本発明において、 ウィルスの siRNA標的配列に変異が生じて siRNAの攻撃を逃れ ることを s iRNA耐性を獲得するといい、 アンチセンス核酸標的配列に変異が生じ てアンチセンス核酸の攻撃を逃れることをアンチセンス核酸耐性を獲得する変異 という。 他の核酸医薬に対しても同様である。 本発明のキメラ RNAは、 ウィルス に変異が生じたとしても、 ウィルスの核酸医薬に対する耐性獲得を阻止すること ができる。
本発明のキメラ RNAによる複製を抑制するウィルスは限定されず DNAウィルス も RNA ウィルスも対象となり得るが、 変異により核酸医薬に対する耐性を獲得す る 1本鎖 RNAウィルス、 2本鎖 RNAウィルス等の RNAウィルスが望ましい。 この ようなウィルスとして、 レトロウイノレス科、 トガウィルス科、フラビウィルス科、 コロナウィルス科、 テトラウイノレス科、 ノダウイノレス科、 ァス トロウイノレス科、 力リシウィルス科、 ピコルナウィルス科、ァレナウィルス科、ブニヤウィルス科、 ォノレ ト ミクソウィルス科、 フィロウイノレス科、 ラプドウィルス科、 ノ ラミクソゥ ィルス科、 ビルナウィルス科、 レオウィルス科等の各科に属するウィルスが挙げ られる。 具体的には、 HIV- 1、 HIV - 2、 C型肝炎ウィルス、 HTLV- 1、 HTLV- 2、 A型ィ
Figure imgf000010_0001
B 型インフルエンザウイルス、 ヒ トスプマウィルス、 風 疹ウィルス、 シンドビスウィルス、 黄熱ウィルス、 A 型肝炎ウィルス、 ポリオゥ イノレス、 ラッサゥイノレス、 SARS ゥイノレス、 コロナゥイノレス、 ムンプスゥイノレス、 RS ゥイノレス、 コクサツキ一ウイノレス、 エコーウイノレス、 マーノレブルグゥイノレス、 エボラウィルス、 テング熱ウィルス、 G型肝炎ウィルス等が挙げられる。
また、 本発明のキメラ RNAは、 ウィルスを抑制することによりウィルス感染が 原因となるがんの予防、 治療にも用いることができる。 ウィルス感染が原因とな るがんとして、 以下のがんが例示できる。 子宮頸がん （ヒ トパピローマウィルス 16型、 18型 （HPV- 16， 18) )、 バーキットリ ンパ腫 （EB ウィルス （EBV) )、 成人 T 細胞白血病 （ヒ ト T リンパ球好性ウィルス）、 肝がん （B型肝炎ウィルス（HBV)、 C 型肝炎ウィルス（HCV) )、 力ポジ肉腫 （カポシ肉腫関連へルぺスウィルス（KSHV) )。 このような作用を発揮するために本発明のキメラ RNA は、 少なく とも 1つの shRNA (ショートヘアピン RNA) 部分もしくは miRNA部分、 少なく とも 1つのデコ ィ RNA部分、 少なく とも 1つのアンチセンス RNA部分、 少なく とも 1つのリボザ ィムからなる RNA部分、 少なく とも 1つの tRNase ZL- EGSからなる RNA部分およ び少なく とも 1つの RNase P-EGSからなる RNA部分からなる群から選択される少 なくとも 1つの RNA部分を含む。 好ましくは、 本発明のキメラ RNAは、 少なく と も 1つの shRNA (ショートヘアピン RNA) 部分もしくは miRNA部分を含み、 さらに 少なく とも 1つのデコイ RNA部分、 少なく とも 1つのアンチセンス RNA部分、 少 なく とも 1つのリボザィムからなる RNA部分、 少なく とも 1つの tRNase ZL - EGS からなる RNA部分およぴ少なくとも 1つの RNase P - EGSからなる RNA部分からな る群から選択される少なく とも 1つの RNA部分を含む。 本発明において、 キメラ
RNAが 2種類の RNA部分からなる場合、 デュアルタイプ RNA と呼ぶこともあり、
3種類以上の RNA部分からなる場合、マルチタイプ RNAと呼ぶことがある。また、 本発明のキメラ RANを含む医薬をキメラ RNA医薬またはデュアルタイプ RNA医薬 という。 本発明において、 RNA部分は、 ウィルスの複製に関与する遺伝子と実質 的に同一な配列またはウィルス複製に関与する遺伝子との相補性が高くハイプリ ダイズし得る配列を有する RNAをいう。 キメラ RNAは、 特定の配列を有し、 RNAi 医薬、 デコイ医薬、 アンチセンス RNA医薬、 リボザィム医薬、 tRNase ZL-EGSま たは RNase P- EGS医薬としての機能を発揮する RNA配列の少なく とも 2つの RNA 配列が連結した構造を有する。 連結した RNA配列は異なる RNA配列であるが、 連 結した RNA配列の医薬としての機能の組合せは、 任意の組合せでよく、 例えば連 結する RNA部分が 2種類の場合は、 RNAi と RNAi、 デコイ RNAとデコイ RNA、 アン チセンス RNA とアンチセンス RNA、 リボザィムとリボザィム、 tRNase ZL-EGS と tRNase ZL-EGS, RNase P—EGSと RNase P - EGS、 RNAi とデコイ RNA、 RNAi とアンチ センス RNA、 RNAi とリボザィム、 RNAi と tRNase ZL-EGS, RNAi と RNase P— EGS、 デコイ RNAとアンチセンス RNA、 デコイ RNAとリボザィム、 デコイ RNAと tRNase
ZL-EGS, デコイ RNA と RNase P - EGS、 アンチセンス RNA とリボザィム、 アンチセ ンス RNAと tRNase ZL-EGS,アンチセンス RNAと RNase P - EGS、リボザィムと tRNase
ZL-EGS, リボザィムと RNase P-EGSおよび tRNase ZL-EGSと RNase P-EGSが挙げ られる。 また、 3種類以上の RNA配列が連結していてもよく、 3種類の RNA配列 が連結する場合、 上記の RNA医薬を発揮する RNA部分の任意の組合せでよい。 好 ましくは、 RNAi医薬としての作用を発揮する RNA部分が必ず含まれている。 本発 明のキメラ RNAに含まれる shRNA部分もしくは miRNA部分、 デコイ RNA部分、 了 ンチセンス RNA、 リボザィムからなる RNA部分、 tRNase ZL-EGSからなる RNA部分 および RNase P- EGSからなる RNA部分は、 生体内で酵素等の切断手段により切断 し得る。 従って、 本発明のキメラ RNAは、 shRNA部分もしくは miRNA部分、 デコ ィ RNA部分、アンチセンス RNA部分、リボザィムからなる RNA部分、 tRNase ZL EGS からなる RNA部分および Zまたは RNase P - EGSからなる RNA部分が切断可能に連 結されたキメラ RNAである。 RNAi と他の RNA部分、 特に RNAi とデコイ RNAの組 合せが好ましい。 これは、 RNAi機構によりウィルスを抑制しょうとした場合、 ゥ ィルスに変異が生じ、 ウィルスが RNAi耐性を獲得してしまうからである。デコイ
RNA機構は、ゥィルスの変異によっても効果を失わないので、最初に RNAi機構で、 多くのウィルスを攻撃し、 次いで変異が生じても、 デコイ RNA機構により変異の 生じたウィルスをさらに攻撃できるように上記組合せが好ましい。
RNAi医薬とは、 RNAi (RNA干渉）により特定の配列を有する標的 mRNAを切断し、 その mRNAに対応する遺伝子の発現を抑制し得る医薬である。 RNAiにおいては、 特定の標的 mRNA と実質的に同一な配列を有するセンス鎖と該センス鎖に相捕的 なアンチセンス鎖からなる siRNA (short interfering RNA)がガイ ド RNAとしてタ ーゲット配列を認識し、 ターゲット mRNAを切断することにより、遺伝子の発現が 抑制される。 siRNAは細胞内または生体内でダイサー（Dicer)によりプロセッシン グを受けて 2重鎖 RNA (dsRNA)より形成される。 従って、 本発明のキメラ RNAは、 特定の mRNAを標的とする siRNAを形成し得るキメラ RNAである。 特定の mRNAを 標的とする siRNAを生成し得るキメラ RNAの siRNAを形成し得る部分はショート ヘアピン構造を有している RNA (shRNA)である。 shRNAは、 2本鎖部分を含みセン ス鎖とアンチセンス鎖がループ配列を介して連結しているステムループ構造を有 する。 2本鎖構造は、 1本の RNA鎖中にセンス鎖とアンチセンス鎖を逆方向配列 として含む自己相補的 RNA鎖によって形成される。 ショートヘアピン RNAは、 細 胞内または生体内でプロセッシングを受けて siRNAが産生される。 5 '側には、三 リン酸（ppp)が結合していてもよレ、。 また、 アンチセンス鎖の 3， 末端にオーバー ハングを有していてもよく、 該オーバーハングの塩基の種類、 数は限定されず、 例えば、 1 〜 5、 好ましくは 1 〜 3、 さらに好ましくは 1もしくは 2塩基からな る配列が挙げられ、 例えば、 UUが挙げられる。 なお、 本発明において、 オーバー ハングとは、 shRNA の一方の鎖の末端に付加された塩基であって、 もう一方の鎖 の対応する位置に相補的に結合し得る塩基が存在しない塩基をいう。 2本鎖部分 は、 RNA干渉によりノックダウンしょうとする標的遺伝子の配列またはノンコー ディング領域に含まれる特定の標的配列にハイプリダイズし得る配列を有する RNA鎖 （センス鎖） および該配列に相補的な RNA鎖 （アンチセンス鎖） が相補的 に結合した構造を有する。
本発明の shRNAにおいて、 センス鎖の 3， 末端とアンチセンス鎖の 5， 末端がル ープ （ヘアピンループ配列） を介して連結されている。 ヘアピンループ配列は限 定されないが、 5〜； 12塩基からなる UUで始まる配列、例えば UUCAAGAGA (配列番 号 1 9 ) が挙げられる。 そのほかのループ配列としては、 Lee NS. et al. (2002) Nat. Biotech. 20， 500 - 505、Paddison PJ. et al. (2002) Genes and Dev. 16, 948 - 958、 Sui G. et al . (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99， 5515 - 5520、 Paul CP. et al. (2002) Nat. Biotech. 20, 505-508、 Kawasaki H. et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31, 700 - 707等に記載の配列からなるループを採用することができる。
本発明のキメラ RNAの shRNA部分の標的配列はウィルスの複製に関与する遺伝 子の一部配列である。 本発明の shRNAの標的遺伝子またはノンコーディング領域 の特定の標的配列の塩基数は、 限定されず、 15〜500 塩基の範囲で選択される。 好ましくは 15〜50、 15〜45、 15〜40、 15〜35もしくは 15〜30塩基、 さらに好ま しくは 20〜35塩基、 さらに好ましくは 19〜30塩基、特に好ましくは 19〜29塩基 もしくは 28塩基である。標的遺伝子またはノンコーディング領域中の標的配列は、 例えば標的遺伝子により適宜発現抑制効果の大きい部分を選択すればよい。 本発 明の shRNAと標的配列は、 同一であることが望ましいが、 実質的に同一、 すなわ ち相同な配列であってもよい。 すなわち、 本発明の shRNAのセンス鎖配列と標的 配列がハイブリダィズする限り 1または複数、 すなわち、 1 〜 1 0個、 好ましく は 1〜 5個、 さらに好ましくは、 1〜 3個、 2個もしくは 1個のミスマッチがあ つてもよいが、 ミスマッチにより遺伝子抑制効果は減少する。 この場合のハイブ リダイズする条件は、 本発明の shRNAを生体内に投与して医薬として用いる場合 は、生体内の条件であり、本発明の shRNAを試薬として in vitroで用いる場合は、 中度のス トリンジェントな条件あるいは高度なス トリンジェントな条件であり、 このような条件として、 例えば、 400mM NaCl、 40mM PIPES pH6. 4, IraM EDTA, 50°C から 70°Cで 12~ 16時間でのハイプリゼーシヨン条件が挙げられる。 また、 本発 明の shRNAのセンス鎖配列と標的配列は、 90%以上、 好ましくは 95%以上、 さら に好ましくは％、 96、 97、 98もしくは 99%以上の配列相同性を有する。
本発明のキメラ RNAの shRNA部分が標的とするウィルス遺伝子は、 ウィルスの 複製に関連する遺伝子ならば限定されず、 該遺伝子の一部配列を標的とすること ができる。 例えば、 HIV- 1 ウィルスの場合、 LTR (long terminal repeats) , 5， 非翻訳領域、 スプライス供与-受容部位、 プライマー結合部位、 3 ' 非翻訳領域、 gagヽ po丄、 フ ロアノ■ ίτ、 ィノアクつ' ~" ίτヽ env、 tatゝ revヽ nefゝ vif、 vprヽ vpu または vpx領域よりなる群から選択される。 これらの領域の配列の一部をセンス 鎖として shRNAを設計すればよい。 これらの配列は公知であり、 公知の配列情報 から適宜一部配列を選択すればよい。 また、 HCV ウィルスの場合、構造蛋白質（コ ァ蛋白質； C、外被蛋白質； El、 E2)ならびに非構造蛋白質（NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A, NS5B) の各領域の配列の一部をセンス鎖として shRNAを設計すればよい。 これらの配列は公知であり、公知の配列情報から適宜一部配列を選択すればよい。 miRNA (マイクロ RNA) とは、 18〜25塩基の 1本鎖 RNAであり、 70塩基前後の 2本鎖 RNA領域を含む miRNA前駆体からダイサ一によつてプロセシングされる。 miRNAも siRNAと同様に、 RNAiにより標的配列を含む遺伝子の発現を抑制する。 本発明のキメラ RNAにおいて miRNAは、 18〜25塩基の 1本鎖 RNAとして含まれて いてもよく、 また 70塩基前後の 2本鎖 RNA (miRNA前駆体） として含まれていて もよい。 本発明のおいては、 いずれの場合も miRNA部分という。 キメラ RNAに 70 塩基前後の 2本鎖 RNA (raiRNA前駆体） として含まれている場合、 ダイサ一により 18〜25塩基の 1本鎖 RNAが生じ標的配列を含む遺伝子の発現を抑制する。 miRNA 部分が含む標的配列は、 siRNAの場合と同様である。
デコイ核酸型 （RNA) 医薬 （おとり型核酸医薬） とは、 目的の標的遺伝子と結合 し目的の遺伝子の発現を阻止し得る医薬である。 例えば、 目的の転写調節因子と 結合し遺伝子の転写を阻害し得る。 本発明のキメラ RNAのデコイ RNA部分は、 ゥ ィルスのライフサイクルに関与するタンパク質と結合し、 該遺伝子の発現を阻害 する。 ここで、 ウィルスのライフサイクルに関与するタンパク質とはウィルスの 転写調節因子タンパク質やウィルスの複製や増殖に必要な酵素等が挙げられる。 例えば、 本発明のキメラ RNAのデコイ RNA部分は、 転写調節因子が認識結合す る領域と類似の 1次構造および 2次構造を有する。 例えば、 HIV-1 遺伝子の発現 は、 細胞性因子と、 HIV-1の LTRに特定の調節要素を有するウィルスのトランス 活性化因子タンパク質 Tat との相互作用によって調節される。 HIV-1の調節タン パク質 Tatは、 トランス活性化応答領域 （TAR) と呼ばれる、 59ヌク レオチド LTR 領域の調節要素の 1つと結合する。 TAR は安定したヘアピン構造を形成し、 Tat の結合を可能とする。 また、 HIV-1には Tatのほかに、 Revや Nef が転写調節因子 として作用し、 Revタンパク質は PRE領域に結合する。 Revのデコイについては、 例えば Ding SF et al. , Front Biosci. 2002 Feb 01 ; 7 : al5-28、 Kohn DB et al. ,
Blood. 1999 Jul 1；94 (1)： 368-71 , Akkina R et al. , Anticancer Res. 2003 May-Jun ;
23 (3A)： 1997-2005に詳述されており、 これらの文献に基づいて設計することがで きる。 この場合、 本発明のキメラ RNAのデコイ RNA部分は、 TAR領域または PRE 領域と類似の立体構造を有しており、従って 1次および 2次構造も類似している。 具体的には、 TAR領域の配列または PRE領域の配列と実質的に同一、 すなわち相 同な配列を有している RNAである。 すなわち、 本発明のキメラ RNAのデコイ RNA 部分と TAR領域または PRE領域とがハイプリダイズする限り 1または複数、 すな わち、 1〜 1 0個、 好ましくは 1〜5個、 さらに好ましくは、 1〜3個、 2個も しくは 1個のミスマッチがあってもょレ、。この場合のハイブリダイズする条件は、 生体内の条件である。本発明のキメラ RNAのデコイ RNA部分と TAR領域または PRE 領域の配列は、 90%以上、 好ましくは 95%以上、 さらに好ましくは 95、 96、 97、
98もしくは 99%以上の配列相同性を有する。 また、 本発明のキメラ RNA部分は、 ループ-ステム構造を有していることが望ましく、 ループ-ステム構造とは、 一本 鎖の RNAがループとステムを形成した構造をいう。 TAR領域に類似した構造を有 する本発明のデコイ RNA部分の配列として、 CAC CAG AUC UGA GCC UGG GAG CUC UCU
GGC UUC CUU UUU GAA UUC G (配列番号 1 ) が挙げられ、 該配列に対して 1個から 数個のミスマッチがある RNAも Tatタンパク質と結合する限り用いることができ る。
また、 HCVの複製を抑制する場合の本発明のキメラ RNAのデコイ RNA部分とし て、 NS3プロテアーゼゃ NS3ヘリカーゼに結合する RNAが挙げられる。 例えば、 特開 2002-345475号公開公報を参考に設計することができる。
本発明のデコイ RNA部分は、 特定のタンパク質に結合し得る RNAであり、 アブ タマ一 RNA部分ともいう。
アンチセンス医薬とは、 目的の標的遺伝子に相補的でありハイプリダイズする 配列を持つ DNAまたは RNAであり、 その遺伝子の発現を抑止する医薬である。 本 発明キメラ RNAのアンチセンス RNA部分は、 目的の標的遺伝子の標的配列との相 補的な配列であり、 ウィルスの複製に関与する遺伝子の領域の配列に相補的な配 列である。 アンチセンス RNA部分は、 ウィルス複製に関与する遺伝子の mRNAに相 補的に結合し、 翻訳を阻害し、 遺伝子の発現を抑制する。 例えば、 HIV- 1 ウィル スの場合、 LTR (long terminal repeats) , 5， 非翻訳領域、 スプライス供 -受 容部位、 プライマー結合部位、 3 ' 非翻訳領域、 gag、 po プロテアーゼ、 イン テグラ1 ~" ヽ envヽ tatヽ rev、 nef、 vif vprヽ vpuまたは vpx領域よりなる群力 ら選択される。 これらの領域の配列の一部に相補的なアンチセンス RNAを設計す ればよい。 また、 HCVウィルスの場合、構造蛋白質（コア蛋白質； 外被蛋白質； El、 E2) ならびに非構造蛋白質 （NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 NS5B) の各領域 の配列の一部に相補的なアンチセンス RNAを設計すればよい。 該 RNAは、 長さが 10から 400ヌクレオチドであり、 好ましくは長さが 250以下のヌクレオチド、 さ らに好ましくは長さが 100以下のヌクレオチド、さらに好ましくは長さが 50以下 のヌクレオチド、特に好ましくは長さが 12〜28の間のヌクレオチドである。 アン チセンス RNA部位は適宜ループ構造を有していてもよい。
リボザィムとは、 核酸を切断する活性を有する RNAをいう。 リボザィムとして はハンマーヘッド型リボザィム、 ヘアピン型リボザィム、 ヒ トデルタ型肝炎ウイ ル由来のリボザィム等があり、 本発明においてはいずれのリボザィムからなる
RNA部分をキメラ RNAに含ませることができる。 リボザィムも標的配列を有して おり、 公知の方法によりリボザィム RNA部分を設計することができる。 リボザィ ムからなる RNA部分 （リボザィム RNA部分） は、 ウィルス複製に関与する遺伝子 の raRNAを認識し切断し、 遺伝子の発現を抑制する。 例えば、 HIV- 1 ウィルスの場 合、 LTR (long terminal repeats) , 5 ' 非翻訳領域、 スプライス供与-受容部位、 プライマー結合部位、 3， 非翻訳領域、 gag、 pol、 プロテアーセ、 インテグラー ゼ、 env、 tat, rev、 nef、 v 、 vpr、 vpuまたは vpx領域よりなる群から選択さ れる。
tRNase ZL- EGSおよび RNase P-EGS とは、 リボザィムと同様に核酸を切断する 活性を有する RNAをいい、 Nucleic Acids Research, 2005， Vol. 33, No. 1 235 - 243 や Bioorg. Med， Chem. Lett. 14 (2004) 4941- 4944等の記載に基づいて設計できる。 tRNase ZL- EGSおよび RNase P- EGSもリボザィムと同様に、 ウィルス複製に関与 する遺伝子の mRNAを認識し切断し、 遺伝子の発現を抑制する。
本発明において、 RNAi医薬、 デコイ型医薬、 アンチセンス医薬、 リボザィム医 薬、 tRNase ZL-EGS医薬、 RNase P-EGS医薬いずれも、 遺伝子の発現を抑制するこ とから、 これらの医薬をアンチジーン医薬と呼ぶことがある。' すなわち、 本発明 のキメラ RNAは複数のアンチジーンを含みアンチジーン医薬として作用し得る。 また、 従来にない遺伝子医薬であることから、 第二世代アンチジーン医薬と呼ぶ こと t>める。
本発明のキメラ RNAにおいて、上記 shRNA部分もしくは miRNA部分、デコイ RNA 部分、 アンチセンス RNA部分、 リボザィムからなる RNA部分、 tRNase ZL - EGSか らなる RNA部分およぴ RNase P-EGSからなる RNA部分は、 連結した形態で化学合 成や、プロモーターおよび RNAポリメラーゼを用いた転写系により in vitroで合 成することができる。 この際、 DNA配列には、適宜ターミネータ一等を含ませる。 ターミネータ一配列として例えば、 TTTTT 配列等を用いればよい。 プロモーター としては、 in vitroで製造する場合、 T3 プロモーター、 T7 プロモーター等が用 いられ、 ベクターに本発明のキメラ RNAのテンプレート DNAを遺伝子導入し、 該 ベクターを生体内に投与して生体内でキメラ RNAを合成する場合、 U6プロモータ 一、 HIプロモーターなどの PolIII系プロモーターや tRNAプロモーター等が用い られる。 ベクターを用いる場合、 ベクターとしては、 プラスミ ドベクター、 ウイ ルスベクター等を用いることができる。 プラスミ ドベクターとしては、 pBAsi ベ クタ一、 pSUPERベクター等を用いればよく、 ウィルスベクタ一としては、 アデノ ウイノレスベクター、 レンチウィルスベクター、 レ トロウイ/レスベクター等を用い ることができる。 ベクタ ~^■の本発明のキメラ RNAの発現可能な状態での組み込 みは、 公知の方法で行うことができる。 本発明のキメラ RNAが shRNA部分を含む 場合、 shRNA部分と他の RNA部分とは、 生体内のダイサ一の作用により切断され る。 ダイサ一に認識され切断される配列は shRNA部分の 3 ' オーバーハング部位 に存在する UUであり、 従って shRNA部分と他の RNA部分の間に而配列を含ませ ればよレ、。 この結果、 ベクターから各 RNA部分を含むキメラ RNAが 1分子として 発現され、 生体内のダイサ一等の切断手段により書く部分に切断され、 shRNA 部 分または miRNA部分からは、 siRNAまたは miRNAが形成され、 デコイ RNA部分か らはデコイ RNA力 アンチセンス RNA部分からはアンチセンス RNAが、 リボザィ ムからなる RNA部分からはリボザィムが、 tRNase ZL-EGSからなる RNA部分力 ら は tRNase ZL-EGSが、 RNase P-EGSからなる RNA部分からは RNase P-EGSが生じ、 それぞれの機能を発揮する。 ·
本発明のキメラ RNAは、 遺伝子抑制のための医薬として用いることができ、 特 にウイルスの複製を抑制することから、ウィルス抑制剤、ウィルス感染症の予防、 治療薬、 ウィルス感染が原因となるがんの予防、 治療薬として用いることができ る。
本発明のキメラ RNAの導入方法としては、 被験体が細胞や組織の場合、 細胞や 組織と同時に培養することにより導入することができる。 その他、 カルシウムィ オンを用いる方法、 エレク ト口ポレーシヨン法、 スフエロプラス ト法、 酢酸リチ ゥム法、 リン酸カルシウム法、 リポフエクシヨン法、 マイクロインジェクション 法等が挙げられる。 被験体が動物個体の場合、 経口ルート、 並びに静脈内、 筋肉 内、 皮下および腹腔内の注射または非経腸的ルートで投与することができる。 ま た、 特定の部位に投与する場合、 ドラッグデリバリーシステムを用いて特定部位 にデリバリーしてもよい。 ドラッグデリバリーシステムは種々の公知の方法があ り、 投与しょうとする部位に応じて適当な方法を採用することができる。 ドラッ グデリバリーシステムとしては、 例えば、 キャリアとしてリボソーム、 ェマルジ ヨン、 ポリ乳酸等を利用した公知の方法等が挙げられる。 投与は、 医薬的に許容 され得る希釈剤またはキャリアと混合して行うことが望ましい。 適切なキヤリァ には、 生理的食塩水、 リン酸緩衝生理食塩水、 リン酸緩衝生理食塩水グルコース 液、 および緩衝生理食塩水が含まれるが、 これらに限定されるものではない。 導 入するキメラ RNAの量は、 予防、 治療しょうとする疾患の種類、 重篤度、 被検体 の年齢、 体重等により適宜決定することができるが、 疾患部の細胞 1個当たり少 なく とも、 1コピーのキメラ RNAが導入されるような量が好ましい。 キメラ RNA を投与する場合、 RNA量として、 0. l /i g〜100mg程度を 1 日 1回から数回投与すれ ばよい。 また、 レンチウィルスベクター等のウィルスベクターを用いる場合、 ベ クタ一 DNA量として、 0. l A( g〜100mg程度を投与すればよく、 1 日 1回から数回投 与すればよい。
例えば、 本発明のキメラ RNAが shRNA部分もしくは miRNA部分とデコイ RNA部 分からなる場合、 キメラ RNAまたはキメラ RNAをコードする DNAを含むベクター を投与した場合、 生体内で siRNAもしくは miRNAとデコイ RNAが生成する。 投与 当初は、 siRNAもしくは miRNAがウィルス遺伝子の発現を抑制し、 ウィルスの複 製を抑制する。 しかしながら、 投与から数週間でウィルス遺伝子の siRNAもしく は miRNA標的配列に変異が生じ、時間と共に変異が増加し、 siRNAもしくは miRNA が標的配列を認識できなくなり、 s iRNAもしくは miRNAの効果はなくなる。 この 場合でも、 デコイ RNAは、 ウィルスの変異と関係なく、 ウィルスの転写調節因子 と結合することにより、 ウィルスの複製を抑制することができるので、 siRNA が 効果を失った後でも、 デコイ RNAの作用によりウィルスの複製を抑制することが できる。
また、 本発明の shRNA部分もしくは miRNA部分とデコイ RNA部分からなるキメ ラ RNAまたはキメラ RNAをコードする DNAを含むベクターを投与した場合、 shRNA もしくは miRNAまたは shRNAもしくは miRNAをコードする DNAを含むベクターを 単独で投与した場合に、 ウィルスの変異速度が遅くなる減少が観察される。 すな わち、 本発明のキメラ RNAまたはキメラ RNAをコードする DNAを含むベクターを 投与した場合、 ウィルスの変異速度を遅くできるという効果もある。
さらに、本発明のキメラ RNAをコードする DNAを含むベクターを投与した場合、 細胞の核内でキメラ RNAが生成されたのち、 ェクスポーチンの作用で細胞質に輸 送され、 細胞質で良好に機能を発揮するという効果もある。
本発明は上記キメラ RNAを被験体に投与し、 被験体内でのウィルス複製を抑制 し、 ウィルス感染症を予防する方法または治療する方法をも包含する。 さらに、 本発明は上記キメラ RNAのウイルス複製抑制剤、 ゥィルス感染症予防剤またはゥ ィルス感染症治療剤の製造への使用をも包含する。
図 2 Aに本発明のキメラ RNAの一例を示す。 図 2 Aに示す例は、 HIV- 1複製を抑 制する RNAi医薬としての作用およびデコイ RNAとしての作用を有する shRNA部分 およびデコイ RNA部分からなるキメラ RNAである。配列番号 2に配列を示す。 shRNA 部分は、 HIV- 1の vif 遺伝子の発現を抑制し、 デコイ RNA部分は、 HIV- 1 の Tat タンパク質に結合し、 TAR領域の転写を抑制する。 HIV- 1において、 vif遺伝子部 分は、 変異が起こりやすく、 vif 遺伝子を標的遺伝子とした RNAi医薬単独では、 経時的に効果を失う。 しかしながら、 本発明のキメラ医薬は、 デコイ RNAをも含 むので、 vif遺伝子に変異が生じ、 shRNA部分が vif遺伝子の発現を抑制できなく なった後でも、 TAR領域の転写を抑制することにより、 HIV-1の複製を抑制しえる。 従って、 長期間にわたって、 HIV- 1 の複製を抑制し得るので、 効率的かつ確実な HIV-1 感染の予防または治療薬として用いることができる。 本発明のキメラ RNA は、 キメラ RNAとして化学合成または in vitroの転写系を用いて製造し、 予防ま たは治療を必要とする被験体に投与して芋よいし、 レンチウィルス等のウィルス ベクターにキメラ RNAを発現しえるように鎵型 DNAを導入し、 該ベクターを被験 体に投与してもよい。 後者のようにベクターを用いた場合、 被験体体内で長期間 にわたつて本発明のキメラ RNAが合成されるので、 HIV- 1複製抑制の効果が持続 する。 図 4に本発明の図 2 Aのキメラ RNAがどのようにして HIV- 1複製を抑制す る力、を示す。
また、図 2の配列を有するキメラ RNAとハイプリダイズする限り 1または数個、 すなわち、 1〜3個、 2個もしくは 1個のミスマッチがあってもよい。 この場合 のハイブリダィズする条件は、 生体内の条件である。 本発明のキメラ RNAは図 2 のキメラ RNAと 90%以上、好ましくは 95%以上、 さらに好ましくは 95、 96、 97、
98もしくは 99%以上の配列相同性を有する RNAも含まれる。
さらに、本発明は、 RNAi医薬として作用する shRNAもしくは miRNAとデコイ RNA 医薬として作用するデコイ RNAを別々に含む医薬組成物をも包含する。 該医薬組 成物において、 shRNAもしくは miRNAとデコイ RNAは連結してキメラ RNAを形成 しておらず、 それぞれ単独で存在する。 該医薬組成物はウィルス複製抑制剤、 ゥ ィルス感染症予防剤またはウイルス感染症治療剤として用いることができる。 さ らに、 本発明は上記の shRNAもしくは miRNAとデコイ RNAを被験体に同時にまた は前後して投与することを含む被験体内でのウィルス複製を抑制し、 ウィルス感 染症を予防する方法または治療する方法をも包含する。 この場合、 shRNA もしく は miRNAを先に投与して、 デコイ RNAを数日から数週間後に投与してもよレ、。 本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例 によって限定されるものではない。
本実施例においては、 各実験は以下に記載の方法で行った。
細胞培養
HeLa 293T、 Jurkat、 H9および MT-4細胞は 10% (v/v) 熱非動化ゥシ胎児 血清 （FBS)、 L-グルタミン（2mM)、 ペニシリ ン （lOOU/mL) およびス トレプトマイ シン （lOO ^a g/mL) を補足した RPMI IMO 培地 （Sigma Chemical 社製） または DMEM (Gibco 社製）からなる完全培地で培養した。 すべての培養は 37°C、 5 %C02 雰囲気下で行った。 人末梢血リンパ球（PBMCs)
血液分離用試験管、 リユーコセップ (ファルコン社) に Faicol を入れ鮮血を Faicol：鮮血 = 1 ： 3になるようにする。 1500rpmで 15分遠心分離 L、 赤血球と 白血球を分離した。 白血球の部分を 50ml遠心管に移し倍量の PBSを入れ 1500rPra で 5分遠心分離した。 この操作をもう一度繰り返し、 1. 0 X 106/mlになるように 10%RPMIを加えた。 最後に、 1 /z mol/mlになるように PHAを加えて 2〜 3日培養 し幼若化させた。
U6発現プラスミ ドおよびレンチウィルスベースのベクターの構築
発現プラスミ ドは公知の方法により構築した。 2つの相補的 DNAオリゴヌタレ ォチドとして化学的に合成したヘアピン s iRNA配列を等モル量で混合し、 95°Cで 5分間加熱処理し、 アニーリングバッファー （10mM Tris- HCl/100mM NaCl) 中で 徐々に冷却した。得られた 2重鎖をエタノール沈殿し、 U6プロモーター（Lee N. S. et al. , at Biotechnol 2002， 20, 500- 5)上流の Kpnlおよび BamHIクローニン グ部位に連結し、 以下のベクターを作製した。
U6- vif shRNA- TARベクター： HIV- 1 vif shRNAとデコイ TARの両方を、 KPnI、 EcoRI および BamHIクローニング部位を含む dsRNAセンス配列（5， - CCA GAT GGC AGG TGA TGA TTG TCC ACA CCA CAA TCA TCA CCT GCC ATC TTG TTA CCA GAT CTG AGC CTG GGA GCT CTC TGG CTT CCT TTT TGA ATT CG- 3，、 配列番号 3 ) およびアンチセンス配列 (5 ' -GAT CCG ATA TCA A AA A AG GAA G CC AGA GAG CTC CCA GGC TCA GAT CTG GTA ACA GAT GGC AGG TGA TGA TTG TGG TGT GGA CAA TCA TCA CCT GCC ATC TGG GTA C - 3 '、 配列番号 4 ) としてコードしている。
U6- vif shRNAベクター： HIV-1 vif センスフラグメント配列 （5， - CCA GAT GGC AGG TGA TGA TTG TCC ACA CCA CAA TCA TCA CCT GCC ATC TGT TCC TTT TTG AAT TCG - 3，、 配列番号 5 ) およびアンチセンス配列 （5， -GAT CCG ATT CAA AAA GGA ACA GAT GGC AGG TGA TGA TTG TGG TGT GGA CAA TCA TCA CCT GCC ATC TGG GTA C- 3，、 配列番 号 6 ) をコードしている。
U6-vif shRNA - Ran RNAベクター ： ランダム v:if センス配列 （5， -CGG ACG TTG ATT AGT ATG CGG ACC ACA CCT CCG CAT ACT AAT CAA CGT CCT TCC TTT TTG AAT TCG- 3 '、 配列番号 7 ) およびアンチセンス配列 （5 ' -GAT CCG AAT TCA AAA AGG AAG GAC GTT GAT TAG TAT GCG GAG GTG TGG TCC GCA TAG TAA TCA ACG T— 3，、 配列番号 8 ) を コードしている。
U6-TAR RNAベクター ： HIV— 1 TARセンス配列 （5， — CAC CAG ATC TGA GCC TGG GAG CTC TCT GGC TTC CTT TTT GAA TTC G- 3 '、 配列番号 9 ) およびアンチセンス配列 (5 ' -GAT CCG AAT TCA AAA GGA AGC CAG AGA GCT CCC AGG CTC AGA TCT GGT GGT AC - 3 '、 配列番号 1 O ) をコードしている。
U6- mTAR31 - 34 RNAベクター：変異 TARループセンス配列 （5 ' -CAC CAG AGA GCC TGG
GAG CTC TCT GGC TTC CTT TTT GAA TTC G- 3，、 配列番号 1 1 ) およびアンチセン ス配列 （5， -GAT CCG AAT TCA AAA AGG AAG CCA GAG ACT CCC AGG CTC TCT GGT GGT
AC - 3 '、 配列番号 1 2 ) をコードしている。 U6-vif shRNA - Ran - mTARベクター ： ランダム vif および変異 TARセンス配列 （5， - CGG ACG TTG ATT AGT ATG CGG ACC ACA CCT CCG CAT ACT AAT CAA CGT CCT TCC ACC AGA GAG CCT GGG AGC TCT CTG GCT TCC TTT TTG AA T TCG- 3，、 配列番号 1 3 ) お よびアンチセンス配列 （5， -GAT CCG AAT TTC AAA AAG GAA GCC AGA GAG CTC- 3 '、 配列番号 1 4 ) をコードしている。
レンチウィルスベクターは以下のようにして構築した。 U6プロモーターの上流 の EcoRI部位およびィンサートフラグメントの下流の EcoRIクローニング部位を 消化し、 レンチウィルスベクター （CS- CDF - CG- PRE) の Eco RI部位にクローニン グし、 CS - vif shRNA- TAR、 CS - TAR、 CS-vif shRNA、 CS-vif Ran- MTAR およぴコン トロールトランスファーベクターを構築した。 mRNA発現の RT- PCR解析
HeLa CD4+細胞 （5 X 105細胞） を 60mmディッシュに播いた。 24時間後、 培地を 抗生物質を含まない新鮮な培地に交換し、製造者のプロ トコールに従い、 Opti- MEM により最適ィ匕された Lipofectamine 2000 transfection reagent を用いて 3 μ g のベクター DNAでトランスフエタ トした。 72時間後、 ベクターでトランスフエク トした細胞およびトランスフエク トしていない HeLa CD4+細胞からのトータル RNA をトリゾール試薬 （Invitrogen社製） を用いて抽出した。 次に RNA PCR high- plus kit (東洋紡社製） を使用し、 HeLa CD4+細胞内因性のダイサ一の存在を検出する ためにダイサ一の上流プライマー (ヌクレオチド 1-24、 フォワードプライマー F- (5， - CCA GAT GGC AGG TGA TGA TTG TCC -3 '、 配列番号 1 5 ) ) および下流 （ヌ クレオチド 435—459、 リバースプライマー R- (5， - GGA AGC CAG AGA GCT CCC AGG CTC - 3 '、 配列番号 1 6 ) ) を用いて RT- PCRを行った。 内部コントロールとして、 ヒ トコントロール遺伝子 （GAPDH) の mRNAを GADPH- F (ヌクレオチド 230-254) お よび下流の GADPH- R (ヌクレオチド 422-466) プライマーを用いて増幅した。 すべ ての抽出 RNA産物を RNaseを含まない 2 μ gの DNase Iを用いて 37°Cで 30分間処 理した。 この際、 DNAのコンタミンをチェックするために抽出 vif-TAR RNAを用 レヽた non- RT- PCRも行った。 得られた RT-PCR産物を分画し、 2 %ァガロースゲル を用いた電気泳動により分析した。 ノーザンプロット分析
一過性でトランスフエク トした HeLa CD4+細胞 5 X 105細胞から 24時間後にトー タル RNAを抽出し、 1 レーンにつき の RNAを 20%のポリァクリルアミ ド / 8 M 尿素ゲルを用いて電気泳動を行った。 電気泳動の後、 RNA のバンドを Hybond- N™ ナイロン膜 （Amersham社製） に転写した。 Vif- shRNA- TAR RNAのアンチセンス鎖 に相補的な合成オリゴヌクレオチドをプロープとして用いてパンドを検出した。 ハイブリダイゼーションは 37°Cで行い、 2 X SSPEを用い得 39°Cで洗浄し、 次い でオート トラジオグラフィーに曝す前に 1 X SSPEを用いて 41°Cで一度洗浄した。 in vitroおよび in vivoでのダイサー切断アツセィ
BLOCK- iT RNAi T0P0 Transcription Kit (Invitrogen社製） を使用して T7 RNA ポリメラーゼ プロモーターから転写した精製 v:if-TAR dsRNA (60 μ g) を、 製造 業者のプロ トコール （BLOCK- iT Dicer RNAiキット ·マニュアル (Invitrogen) ) に従って切断した （反応容積 300 μ 1)。 すなわち、 ダイシング反応物を 37°Cで 20 時間インキュベートし、 得られたダイシング産物を 20%のポリァクリルアミ ドゲ ノレ (Invitrogen l ife technologies社製） 上で分析した。 Vif shRNA - TARキメラ
RNA基質が本当に細胞中で切断されるかを確認するために、 HeLaCD4+細胞を 3 / g のべクター DNAでトランスフエク トし、 トータル RNAをトリゾール試薬を用いて トランスフエク ト 24時間後に抽出した。 対照として、 vif shRNA - TAR DNA を T7 ポリメラーゼを用いて RNAに転写した。 トランスフエク トしたものと T7で転写し た RNAの両方を 20%ポリアクリルアミ ド / 8 M尿素ゲル上で分画し Hybond- Nniナイ ロン膜に転写しノーザンプロット分析を行った。 細胞中での標的 mRNAのダウンレギユレーションおよび HIV- 1の複製の抑制
2 // gのべクターDNAぉょび0. 2 J gの HIV—l pNLEと共に同時トランスフエク ト した HeLa CD4+細胞を 72時間培養した後に、 トリゾール試薬を用いてトータル RNA を抽出した。 HIV-1 vif ウィルス mRNAおよび TAR mRNAの検出が可能なプライマ ーセッ トを用いて RNA含量を調べた。回収した細胞を含まない培養上清中の HIV - 1 gag 24抗原産生レベルを、 完全自動化 ELISAシステム （CLEIA社） により測定し た （Lee . N. S. et al. , at Biotechnol 2002, 20, 500—5·)。
HIV- 1複製の用量依存的な抑制
HIV-1複製の抑制についての用量依存性範囲を決定するために、 HeLa CD4+細胞 3 X 105細胞を 0. 1、 1および のべクタ一 DNAと HIV lpNLEの DNA 0.2 μ gで 同時トランスフエタ トした。 細胞を含まない培養上清を回収し、 ウィルス複製の ィンデッタスとして細胞外の HIV- 1 gag p24抗原産生レベルを測定した。
293T細胞のリン酸カルシウム沈殿トランスフエクション
レンチウィルスベクターを製造するために、 15 のトランスファーベクター カセット DNA、 gag-pol (15 μ g) をコードするヘルパー構築物ならびに tat、 rev および VSV-Gそれぞれ 5 M g とともにリン酸カルシウム沈殿トランスフエク ト法 で 293T細胞を同時トランスフエタ トした（Anne- Lyse, D. et al, Nucleic Acids Research, 2002, 30， (14)： 65-69)。 トランスフエタ ト後 72時間で、 培養上清を 回収し、 0.45μ ιηフィルタディスクによりろ過し、 オーバーナイ トでの 6， 000gの 超遠心により 100倍に濃縮した。 得られたウィルスペレッ トを、 無血清無抗生物 質 RPMI培地に再懸濁し、 用時まで- 80°Cで保存した。 ウィルス力価を決定するた めに、 5X105細胞の 293T細胞に調製したウィルスストックを用いて遺伝子導入し、 72時間の培養の後でフローサイ トメーター分析により GFP陽性細胞をカウントし た（Anne- Lyse， D. et al. , Nucleic Acids Res. 30， 65-69 (2002))。
Jurkat細胞の遺伝子導入
Jurkat細胞に遺伝子導入するため、 3 X 105細胞を 15mLの遠心チューブに 1 mL の培養用培地とともに、 CS- V shRNA-TAR および対照レンチウィルスベクター 20M0Iおよび 8 g/mLのポリブレンの存在下で播いた。 800gで 1時間遠心した後 に、 細胞を 24ゥエル培養プレートに移し、 24時後、 ウィルス感染の前に培養用 培地を換えた。 HIV - 1によるチヤレンジぉよび長期の培養アツセィ
遺伝子導入の 24時間後、 1 X 106の Jurkat細胞を 0. 01MOIの HIV- l¾ 3で感染さ せた。 オーバーナイ トでインキュベートした後に、 細胞を 3回無血清培地を用い て洗浄し、 R10 (RPMI1640+10%FBS)で培養した。同じインターバルで培養体積の半 量を回収し、 同体積の培養用培地で交換した。 回収した培養物を遠心し、 細胞を 含まない培地を HIV- 1 gag p24抗原分析に用い、細胞ペレツトは細胞生存率試験、 GFP発現おょぴ RNA抽出に用いた。
HIV ¼Hの Vif RNA標的領域の遺伝子配列分析
QIAampウィルス RNAキット （Qiagen社製） を用いて、製造業者のプロトコール に従って細胞を含まない培養上清からウィルス RNAを単離した。 5 // Lのウィルス RNAを、 Powerscrip逆転写酵素 （クローンテック社製）、 それぞれ ImMのデォキシ ヌクレオチド三リン酸、 I X第 1鎖バッファー (クローンテック社製）、 200ngの ランダムへキサマー （Promega社） と 10Uの RNasin (Promega'社製） と混合し、 逆転写酵素反応に用いた。 逆転写は 42°Cで 1時間行い、 次いで、 70°Cで 15分間 逆転写酵素の熱不活化を行った。 次に、 2 μ 1の cDN Aを l X Qiagen Taq PCRノ ッ ファー、 1. 5mMの MgCl2、 20pmol のセンスプライマー vif F： (5， - ATG GAA AAC AGA
TGG CAG GTG AT - 3，、配列番号 1 7 ) およびアンチセンスプライマー vif R： (5， - CTA GTG TCC ATT CAT TGT ATG GCT- 3，、 配列番号 1 8 )、 ImMのデォキシヌクレオチド 三リン酸、 および2. 5Uの Taqポリメラーゼ （Qiagen社製） を含む PCR混合物 48 μ 1に添加した。 PCRは、 グラジェント PCRサーマル 'サイクラ一 （ASTEC社製） を用い 95°C 1分間、 95°C 15秒間 35サイクル、 58°C30秒間、および 72°C30秒間、 および 72°C 5分間の条件で行なった。 PCR産物を分画し、 1%の seakemゲル上で分 析し、 QIAEX IIゲル抽出キット （Qiagen社製） を用いて精製した。 ヌクレオチド サイクルシクエンスは、 Dye標識した化合物を用いて行った。 本実施例によって、 以下の結果が得られた。
U6プラスミ ドと CS レンチウィルスベクターについてベクター設計、 標的部位 および構造を図 1 Aおよび Bに示す。図 1 Aは、第二世代 shRNA発現ベクターの構 築を示す図であり、 HIV - 1ゲノムを示すとともに tatタンパク質に対するデコイ TAR RNA標的および V shRNA標的位置を表す 5 ' LTRを拡大して示す。図 1 Bは、 ヒ ト U6プロモーターで転写される vif shRNA - TARおよびターミネータ一シグナノレ 配列を有する対照発現カセットを示す図である。 レンチウィルスベースの発現力 セットは U6プロモーターの上流の EcoRI部位おょぴ U6ベクターからのターミネ 一ター配列の下流の EcoRIクローニング部位を消化することにより作られ、 次い で CS - CDF - CG- PRE発現カセット中の EcoRI部位にクローニングされレンチウィル スベクターが作られる。 全ての構築物は標準的な分子生物学的技術によって製造 し、 配列はヌクレオチドシークェンシングにより決定した。 Vif shRNA-TAR キメ ラ分子の RNA二次構造を GENETYXソフトウェアを用いて分析し （図 2 A)、 製造業 者のプロ トコールに従って、 HeLa CD4+細胞 （5 X 105) 中での U6 vif shRNA-TAR および対照 mRNAの発現を測定した。すなわち、 3 Lの DNAを 47 ju 1の Opti- MEM と混合し、 DNA複合体形成を最適化した。 HIV-1アンチジーン mRNAの発現が HIV- 1 遺伝子 mRNAの分解または細胞のタンパク質相互作用に不可欠なので、 HIV- 1アン チジーン mRNAの発現のトランスフエタト効率を高めた。 vif- TAR mRNAも PCRに より検出し、 ノーザンプロット分析により細胞内局在を決定し （図 2 B)、 すべて のべクターの発現の完全なプロファイルを得た（図 2 C)。図 2 Bは、第 2世代 HIV- 1 vif shRNA (vif shRNA-TAR キメラ RNA)の細胞内局在を示す。細胞は vif shRNA-TAR 構築物でトランスフエク トされた。 核および細胞質 RNAから抽出されたトランス フエタ ト 24時間後の RT-PCR産物はキメラ RNAがおそらく トランスポート因子で あるェクスポーチンの助けにより核よりも細胞質に局在していることを示してい る。 図 2 Cは、 HeLa CD4+細胞中の発現ベクター mRNAのノーザンブロット分析を示 す。 細胞は種々のベクター構築物でトランスフエタトされ、 細胞における mRNA 発現効率が調べられた。
vif shRNA-TAR分子は核よりも細胞質中に強く局在していた。 これにより、 生 物学的機能をどこで発揮するかを決定することができる。
RNAi機構は細胞中のダイサ一と呼ばれる内因性の RNAase III様酵素の活性に 強く関連しているので、 トランスフエクトした HeLa CD4+細胞における.内因性のダ ィサ一の発現を特異的なダイサーブライマーを用いた RT- PCRにより調べた。すな わち、 vif shRNA-TAR RNA分子が s iRNAにプロセシングされ、 細胞中で RNAi効果 とデコイ RNA TAR効果の両方を発揮するかどうかの証拠を確立するために行った。 興味深いことに、 ダイサ一の高いレベルの発現が細胞中で観察された （図 2 D)。 図 2 D は HeLa CD4+細胞中に存在するダイサーを示す。 細胞中のトータル RNA は HeLa CD4+細胞から回収され、特異的ダイサー検出プライマーを用いて増幅された。 これは一過性にトランスフエクトされた細胞および感染した安定な発現細胞の両 方のウィルスに対して効くデュアルタイプの抗 HIV-1効果の原因となる。
HeLa CD4+細胞において U6 vif-TAR mRNA分子のダイサ一による切断を確認する ために、 U6 V - TAR DNAをトランスフエタトする力、 あるいは内部対照サンプル として in vitro で T7ポリメラーゼにより転写し、 トランスフエクト 24時間後 に、得られた切断産物を 20%ポリァクリルアミ ドゲル上で分画しノーザンブロッ ト分析を行った。 その結果、 分子が vif siRNAおよびデコイ TAR RNAコンポーネ ントに切断されることがわかった (図 2 E)。 図 2 Eは、 in vivoでの切断を示す。 キメラ RNAの細胞内プロセッシングを確認するための HeLa CD4+細胞のトランスフ ェクシヨ ン 72時間後に抽出された vif shRNA-TAR RNAのノ一ザンプロット分析の 結果を示す。 各レーンは以下を示している。
レーン 1 ： エンドヌクレアーゼおよびダイサー効果の非存在下において T7RNAポ リメラーゼに転写された vif shRNA-TAR DNA I、 レーン 2および 3 ： HeLa CD4+細 胞中で発現された V shRNA-TARおよび TAR RNAを示す。 ヒ ト対照遺伝子 G3PDH を同時にインプッ ト RNA の標準化のために流した。 レーン 2における vif shRNA-TARおよび TAR RNAバンドの両方の検出は細胞におけるキメラ RNAの in vivo での切断を示している。' レーン 3の TAR RNAは、 vif shRNA- TAR基質の切断 された TAR RNAコンポーネントの移動をチェックするための対照である。
レーン 1は、 T7RNAポリメラーゼにより転写された対照合成オリゴヌクレオチ ドであり、 内在性ダイサ一は非存在である。 レーン 2は、 内在性ダイサーを発現 するトランスフエク ト細胞からトランスフヱク ト 24 時間後に抽出された vif shRNA-TAR基質を示す。残りの切断されていない vif shRNA - TAR mRNAと同時に TAR RNAコンポーネントを検出した。 これは、 細胞内での in vivo の切断を示し。 レ ーン 3は vif shRNA-TARキメラ RNAの切断された TAR RNAコンポーネントのため の内部対照マーカーとしてのトランスフエク トした HeLa CD4+細胞から抽出した 発現された TAR mRNAを示している。 v:if shRNA- TAR分子の高い切断ァフィ二ティ 一のさらなる証拠として、 基質を転写しヒ トリコンビナントダイサーを含むダイ サー反応混合液に添加し室温で 20時間ィンキュベートし、ノーザンプロット分析 を行った。 その結果、 ダイサ一と vif shRNA- TARの複合体において、 ダイサ一で 切断されていない vif shRNA - TAR 産物に対して 90%より多く切断されたことを示 している （図 2F)。 図 2Fは in vitro での切断を示す。 ヒトリコンビナントダイ サ一で室温で 20 時間以上処理された T7 - RNA ポリメラーゼで転写された vif shRNA-TAR のノーザンプロット分析を示す。 各レーンは以下の通りである。 レー ン 1 ： ダイサ一およびサンプルのない反応混合物 （陰性対照）、 レーン 2 ： vif shRNA- TAR RNA を含むがダイサーを含まない反応混合物、 レーン 3 ：ダイサ一お ょぴ vif shRNA- TAR RNAを含む反応混合物。 従って、 2つの別々の mRNA分子 （vif s iRNA mRNAおよび TAR mRNA) 力 S RNAiおよびデコイ TAR RNA経路を通してデュア ル抗 HIV - 1効果を発揮し、 細胞における HIV複製（Elbashir, S. M. et a;. Nature 2001, 411, 494-498； Rosel, K. F. et al, Nucleic Acid Res. 2003， 31 (15), 4417-4425)の抑制効果を増強したことが予測される。
vif shRNA - TAR分子の可能性と抑制効果を調べるために、 HeLa CD4+細胞を種々 の量のベクター DNA (0. 1、 1.0、 3.0μ g)で同時トランスフエク トした。その結果、 HIV-1複製効果が用量依存性を示すことがわかった。 3 μ g濃度の DNAで 9 0 %を 超える抑制効果を示した（データは、 3つの独立実験の上清の測定値土 SDで表す）。 興味深いことに、 抑制の結果は HIV- 1 vif mRNAのダウンモジュレーションの程度 と相関していた （図 3 A)。 図 3Aは HIV- 1抗ウィルス効果を示す。 HeLa CD4+細胞 は U6- vif shRNA— TAR、 vif shRNA, shRNA Random, デコイ TAR、 デコイ M— TARおよ ぴコントロール U6ベクターの種々の DNA濃度（0. 1、 1.0、 および 3.0 g)で、 0.2 ju gの HIV - l pNLEとともに同時トランスフエクトされた。培養上清はトランスフ ェクト 72時間後に回収され HI V-1 p24アツセィを自動 ELISAシステムを用いて行 つた。 同時トランスフエクト細胞からの HIV- 1 mRNA分析によりウィルス mRNA発 現のダウンレギュレーションが示された。 さらに、 vif shRNA- TAR キメラ RNA、 vif shRNAおよびデコイ TAR RNAを示すパネルに示されるように、 HIV - 1 pNLE、 vif shRNA Ranおよび M- TAR を示すパネルと比較して HIV- 1 レポーター遺伝子発 現 （EGFP) の有意の減少が認められた （図 3 B)。 図 3 Bは、 HIV- 1レポーター遺伝 子発現の抑制を示す。細胞への同時トランスフエクト 72時間後に細胞を顕微鏡ス ライドに移し、 EGFP発現を調べた。 パネルは vif- TAR、 vif shRNAおよび TARデ コィに介在された HIV-1 レポーター遺伝子の抑制を示す。 パネルは vif shRNA randomおよぴ変異 TARが HIV- lpNLEを示すパネルに比べて同じレベルの発現を維 持していることを示す。
vif shRNA - TAR構築物の潜在的な抑制能力と安定性をさらに調べるために、 レ ンチウィルスベクターを作製し、キメラ RNA (CS-vif shRNA- TAR)、 CS-vif shRNA、 CS - TARおよび対照発現カセットのデリバリーを高めた。 HIV- 1アンチジーンを安 定に発現する遺伝子導入 Jurkai：、 H9細胞および PBMCsに対して HIV- 1 NL4-3によ る感染を行い 8週間以上培養した。 サンプリングした細胞を含まない培養上清の HIV- 1 gag p24抗原分析を行い、 HIV- 1複製の抑制を評価し （ウィルス複製アツセ ィにおける gag p24抗原の変化として測定した）、 HIV - 1複製に対するアンチジー ンの抗 HIV- 1効果の評価を行った。 その結果、 感染し,た遺伝子導入細胞において 第 2世代抗 HIV分子の抑制効果が安定に長期化されたことがわかった （図 3 C、 D および E)。 図 3 C、 Dおよび Eは CS- vif shRNA- TARによる HIV- 1複製の長期抑制 を示す。 遺伝子導入 Jurkat、 H9細胞および PBMCsは HIV- l 3の感染下で、 9週 間以上培養された。 HIV- 1 p24量の著しい減少が vif shRNA-TAR発現細胞で認め られた。 vif shRNAの HIV - 1 p24抗原産生レベルは Jurkat細胞では 4週目から徐々 に増加し、 対照 HIV- 1 NL4-3およぴ vif shRNA Ran-M-TARと同一レベルまで達し た（図 3 C)。 PBMCsでは 2週目から徐々に増カ卩し、対照 HIV - 1 NL4- 3および vif shRNA Ran-M-TARと同一レベルまで達した（図 3 D)。 さらに、 H9細胞では 3週目から徐々 に増加し、 対照 HIV- 1 NL4- 3および vif shRNA Ran-M-TARと同一レベルまで達し た（図 3 E)。
CS-vif shRNAを発現する培養物におけるウィルスの変異と欠損を調べるために, HIV- 1 Ηの感染細胞（Jurkat および PBMCs)に CS- v:Lf shRNA- TAR または CS- vif shRNAを感染させた細胞から 28、 35および 48 日目にウィルス RNAを単離し、 vif - shRNAおよび TAR標的部位によっておこる HIV- l _3の vif および Tat遺伝子 における変異及び欠損を分析した。 配列決定により、 CS-vif shRNA - TAR および CS- vif shRNA (単独） の両方において、 CS- vif shRNA標的部位における変異およ び欠損が認められた。 しかしながら、 HIV - 1 ウィルス RNAの Tat標的領域には変 異および欠損は認められなかった。 CS- vif- shRNAは、 CS- vif shRNA- TARを発現す る培養物での変異および欠損速度が遅いのに対して変異および欠損速度が速い
(図 3 Fおよび G)。 図 3 Fおよび Gは、 それぞれ Jurkat細胞およぴ PBMCsにおけ る遺伝子の分析の結果を示す。 ウィルス RNA を CS- V shRNA および CS vif shRNA - TAR培養上清から抽出し、 Jurkat細胞では 2、 3、 4、 5および 6週と siRNA による変異について配列分析した。 一方、 PBMCs では 2、 3、 4、 5、 6および 8週と siRNA仲介変異おょぴ欠損について配列分析した。 HIV- 1NL4 - 3の vif shRNA 標的部位における変異おょぴ欠損を vif shRNAまたは vif shRNA- TARのいずれか を発現しているすべての培養細胞において検出した。 TAR- RNA と tatタンパク質 の間のタンパク質 - RNA相互作用は vif shRNA- TARの培養細胞で観察される RNAi 耐性の制御に重要である。 Tatタンパク質と TAR RNA特異的相互作用 （タンパク 質- RNA相互作用） は長期ァッセィで観察される RNAi耐性株下での高い抗ウィル ス活性を補助するための siRNAとの併合遺伝子治療戦略に重要である。
すなわち、 本実施例において、 細胞において切断され得る単独の RNA分子を通 して発現されるデ アルまたはマルチ HIV- 1了ンチジーンの発現は長期間にわた つて HIV - 1複製の抑制効率を増強させることができる。従って、 HIV - 1デコイ TAR RNAの競合的相互作用的役割は、 HIV-1複製に対する V siRNAの抑制効果を高め
(98%を超えて）、 9週間といった長期間にわたる HIV - 1 感染細胞で v:Lf shRNA による変異体およぴ欠損の出現が起こっても、デコイ TAR RNAが引き続いて HIV - 1 の産生を阻止する。 従って、 デュアルまたはマルチ HIV-1アンチジーンを発現さ せる新しい戦略的方法は HIV/AIDS の予防おょぴ治療に適用することのできる有 望な HIV - 1遺伝子治療となり得る。 産業上の利用可能性
本発明のキメラ RNAは、遺伝子の発現を抑制する siRNAを形成し得る shRNA (シ ョートヘアピン RNA)部分もしくは miRNA部分とデコイとして作用し遺伝子転写因 子の作用を抑制するデコイ RNA部分、 遺伝子の発現を抑制するアンチセンス RNA 部分、リボザィムからなる RNA部分、 tRNase ZL - EGSからなる RNA部分およぴ RNase P- EGSからなる RNA部分の少なくとも 1つの RNA部分を含み、 RNAi医薬とデコイ 型核酸 （RNA) 医薬、 アンチセンス RNA医薬、 リボザィム医薬、 tRNase ZL-EGS医 薬および RNase P - EGS医薬の少なくとも 1つの医薬としての作用を発揮する。 本 発明のキメラ RNAは、変異を生じ RNAi耐性を獲得し得るウィルスの複製防止等の ウィルス抑制に効果的であり、 ウィルス感染症の予防または治療薬として用いる ことができる。 RNAi医薬がウィルスの変異により効果を失ったとしても、 他の作 用を発揮する核酸医薬の効果または他の標的配列を指向する同一の作用を発揮す る核酸医薬の効果により変異が生じたウィルスを抑制することにより、 効率的か つ確実にウィルスを抑制することが可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 配列表フリーテキスト
配列番号 1から 8 ：合成

Claims

請求の範囲
1 . ウィルス RNAを標的配列としウィルスを抑制し得る siRNAを形成し得る少 なく とも 1つの shRNA (ショートヘアピン RNA) 部分もしくは miRNA部分を含み、 さらにウィルスのライフサイクルに関与するタンパク質と結合しウィルスを抑制 し得る少なく とも 1つのデコイ RNA部分、 ウィルスのライフサイクルに関与する 遺伝子にハイブリダイズしウィルスを抑制し得る少なく とも一つのアンチセンス RNA 部分、 ウィルスのライフサイクルに関与するタンパク質の発現を抑制し得る 少なく とも 1つのリボザィムからなる RNA部分、 ウィルスのライフサイクルに関 与するタンパク質の発現を抑制し得る少なくとも 1つの tRNase ZL - EGSからなる RNA 部分ならびにウィルスのライフサイクルに関与するタンパク質の発現を抑制 し得る少なくとも 1つの RNase P- EGSからなる RNA部分からなる群から選択され る少なく とも 1つの RNA部分を含み、 2つ以上の上記 RNA部分が切断可能に連結 したキメラ RNA分子。 '
2 . ウィルス RNAを標的配列としウィルスを抑制し得る siRNAを形成し得る少 なく とも 1つの shRNA部分もしくは miRNA部分ならびにウィルスのライフサイク ルに関与するタンパク質と結合しウィルスを抑制し得る少なく とも 1つのデコイ RNA部分が切断可能に連結したキメラ RNA分子。
3 . shRNA部分または miRNA部分と他の RNA部分との間に UU配列が存在する請 求項 1または 2に記載のキメラ RNA分子。
4 . ウィルスが HIV_1、 HIV- 2、 HCV、 ガンおよびィンフルェンザウィルスから なる群から選択される請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載のキメラ RNA分子。
5 . shRNA部分、 miRNA部分、 アンチセンス RNA部分、 リボザィムからなる RNA 部分、 tRNase ZL-EGSからなる RNA部分または RNase P-EGSからなる RNA部分が HIV-1の gag、 pol、 env、 tat、 rev、 nef、 vif、 vpr、 vpu、 vpx、 まには LTR領域 からなる群から選択される領域の一部配列を標的とする、 HIV - 1 を抑制する請求 項 1記載のキメラ RNA分子。
6 . shRNA部分または miRNA部分が HIV-1の gag、 pol、 env、 tatヽ rev、 nef、 vif、 vpr、 vpu、 vpx、 または LTR領域からなる群から選択される領域の一部配列 を標的とする、 HIV - 1を抑制する請求項 2記載のキメラ RNA分子。
7 . デコイ RNA部分が、 HIV- 1の TAR領域と相同な配列を有し Tatタンパク質 と結合し得る、 請求項 5または 6に記載のキメラ RNA分子。
8 . 下記の 2次構造を有する請求項 7記載のキメラ RNA分子。
Figure imgf000034_0001
9 . 請求項 1〜8のいずれか 1項に記載のキメラ RNA分子の铸型 DNAを含みキ メラ RNAを発現するベクター。
1 0 . ウィルスベクターである請求項 9記載のベクター。
1 1 . 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載のキメラ RNA分子を含み、 生体内で 各 RNA部分に切断されるウイルス感染症おょぴガンの予防または治療剤。
1 2 . 請求項 9または 1 0に記載のベクターを含むウィルス感染症の予防また は治療剤であって、 生体内で各 RNA部分が生成するウイルス感染症の予防または 治療剤。
1 3 . ウィルスの変異に基づくウィルスの RNAi耐性を阻止することができる請 求項 1 1または 1 2に記載のウィルス感染症およびガンの予防または治療剤。
1 4 . ウィルス RNAを標的配列としウィルスを抑制し得る siRNAを形成し得る 少なく とも 1つの shRNAもしくは miRNAならびにウィルスのライフサイクルに関 与するタンパク質と結合しウィルスを抑制し得る少なくとも 1つのデコイ RNAを 含むウィルス感染症の予防または治療剤。
1 5 . ウィルス RNAを標的配列としウィルスを抑制し得る siRNAを形成し得る shRNAもしくは miRNA力、 HIV - 1の gag、 pol、 env、 tat、 rev nef、 vif、 vpi\ vpu、 vpx、または LTR領域からなる群から選択される領域の一部配列を標的とする請求 項 1 4記載のウィルス感染症の予防または治療剤。
1 6 . デコイ RNA部分が、 HI V - 1の TAR領域と相同な配列を有し Tatタンパク 質と結合し得る、 請求項 1 4または 1 5に記載のウィルス感染症の予防または治 療剤。
1 7 . ウィルスの変異に基づくウィルスの RNAi耐性を阻止することができる請 求項 1 5または 1 6に記載のウィルス感染症およびガンの予防または治療剤。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3636781A1 (en) * 2018-10-10 2020-04-15 Heinrich-Pette-Institut Leibniz-Institut für Experimentelle Virologie Novel screening assays for identifying compounds resersing hiv-1 latency
JP2022170641A (ja) * 2021-04-28 2022-11-10 沛爾生技醫藥股▲分▼有限公司 レンチウイルスパッケージングシステム、それにより製造されたレンチウイルス、及び、該レンチウイルスで形質導入された細胞、並びに、それを使用して宿主細胞のレンチウイルスの収率を向上させる方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116334103A (zh) * 2020-07-25 2023-06-27 上海市公共卫生临床中心 一种艾滋病病毒的靶点序列及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09110894A (ja) * 1995-10-17 1997-04-28 Soyaku Gijutsu Kenkyusho:Kk ハイブリッドｄｎａ／ｒｎａオリゴヌクレオチド及び抗ウイルス剤

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09110894A (ja) * 1995-10-17 1997-04-28 Soyaku Gijutsu Kenkyusho:Kk ハイブリッドｄｎａ／ｒｎａオリゴヌクレオチド及び抗ウイルス剤

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HABU Y. ET AL.: "HIV-1 vif shRNA Oyobi hu-APOBEC3G no Kyo Hatsugen ni yoru HIV-1 Kansen Sogai", DAI 27 KAI ANNUAL MEETING OF THE MOLECULAR BIOLOGY SCIENTY OF JAPAN PROGRAM KOEN YOSHISHU, 25 November 2004 (2004-11-25), pages 878, XP003004787 *
KATO M. ET AL.: "Decoy RNA ho o Mochiita Eizu ni Taisuru Idenshi Chiryoho no Kaihatsu", THE JOURNAL OF AIDS RESEARCH, vol. 5, no. 4, 2003, pages 443, XP003004789 *
NISHITSUJI H. ET AL.: "Inhibition of HIV-1 replication by 5' LTR decoy RNA", NUCLEIC ACID RES., no. SUPPL. 1, 2001, pages 141 - 142, XP003004788 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3636781A1 (en) * 2018-10-10 2020-04-15 Heinrich-Pette-Institut Leibniz-Institut für Experimentelle Virologie Novel screening assays for identifying compounds resersing hiv-1 latency
JP2022170641A (ja) * 2021-04-28 2022-11-10 沛爾生技醫藥股▲分▼有限公司 レンチウイルスパッケージングシステム、それにより製造されたレンチウイルス、及び、該レンチウイルスで形質導入された細胞、並びに、それを使用して宿主細胞のレンチウイルスの収率を向上させる方法
US11993782B2 (en) 2021-04-28 2024-05-28 PELL Bio-Med Technology Co., Ltd. Lentivirus packaging system, lentivirus produced by the same, cell transduced by the lentivirus, method for improving lentivirus production in a host cell, and method of using the cell for treating cancer

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