WO2019044974A1 - スモールガイドアンチセンス核酸とその使用 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to the regulation of gene expression using oligonucleotides. More particularly, the present invention relates to pharmaceutical compositions containing relatively short oligonucleotides for modulating gene expression and treatment of diseases using them. The invention also relates to methods of designing relatively short oligonucleotides to modulate gene expression.
- Non-patent Document 1 As basic research, researches such as antisense nucleic acid and RNAi (RNA interference) (Non-patent Document 1) are conducted, and drug development based on the technology is conducted, and products to be marketed are beginning to appear. Furthermore, the function of a nucleic acid having no protein genetic information is being clarified, and its application to drug discovery technology as gene expression regulation technology as miRNA (microRNA) is in progress (Non-patent Document 2).
- microRNA miRNA
- TRUE gene silencing In the technology of antisense nucleic acid, Nashimoto et al. Have developed a gene expression suppression technology named as TRUE gene silencing (tRNase Z L -utilizing efficacious gene silencing) (patent documents 1 to 3, non-patent documents 3 to 10) ).
- TRUE gene silencing can cleave any part of any RNA by recognizing a pre-tRNA-like or micro-pre-tRNA-like complex formed by the target RNA and the synthetic small guide antisense nucleic acid It is based on the unique enzymatic properties of mammalian tRNase Z L that it can.
- TRUEB gene silencing has been reported for human BCL-2, WT-1, and CCND-1 when the synthetic small guide antisense nucleic acid has 7 bases (Non-patent Documents 5 to 8).
- the effect of TRUE gene silencing is equivalent to RNA interference (RNAi: RNAi) (Non-patent Document 9), and in some cases, it has been confirmed to surpass the effect of RNAi (Non-patent document 10).
- RNA therapeutics RNAi and antisense mechanisms and clinical applications.
- the present invention provides a pharmaceutical composition containing a relatively short oligonucleotide (small guide antisense oligonucleotide; hereinafter also referred to as sgASO) for regulating gene expression, and a method of treating a disease using the same. It is one of the purposes. Also, for purposes of the present invention, the present invention includes providing methods for designing relatively short oligonucleotides to modulate gene expression.
- a relatively short oligonucleotide small guide antisense oligonucleotide
- sgASO small guide antisense oligonucleotide
- At least one of the target RNA sequences in order for small guide antisense oligonucleotides (sgASO) used as active agents to bind to the target RNA to form a substrate for tRNaseZ L It is necessary that an endogenous stem loop structure be formed, and a step of identifying such sequences in the target RNA sequence.
- sgASO small guide antisense oligonucleotides
- the present invention it is an object of the present invention to provide a method for identifying in a target RNA sequence a sequence in which sgASO binds to target RNA and at least one stem loop structure is formed to become a substrate for tRNaseZ L.
- the present inventors conducted structural analysis of a target RNA sequence to be subjected to gene expression regulation based on the sequence information. And each existence probability was computed from the obtained structural-analysis result and each energy amount.
- the inventors of the present invention are relatively able to identify a more preferable endogenous stem-loop substructure by uniformly calculating the existence probability of the endogenous stem-loop substructure and establish a method of designing sgASO.
- the present invention is based on such an approach developed by the present inventors, and includes the following aspects:
- a method for cleaving target RNA in a eukaryotic cell comprising: 1) identifying in the target RNA sequence a sequence in which at least one stem loop structure is formed by hybridization of a 6-mer to 10-mer oligonucleotide (sgASO) complementary to the target RNA; 2) preparing the sgASO and contacting with target RNA in a eukaryotic cell, Including A method characterized in that tRNaseZ L in a eukaryotic cell recognizes a stem loop structure formed by hybridizing said sgASO and cleaves a target RNA.
- sgASO 6-mer to 10-mer oligonucleotide
- Aspect 2 The method according to Aspect 1, wherein the number of base pairs of the stem portion of said stem-loop structure formed by hybridization of said sgASO is 11 to 14.
- Aspect 3 The method according to Aspect 1 or 2, wherein the base pair count of the stem portion of said stem-loop structure formed by hybridizing said sgASO is 12.
- Aspect 4 The method according to any one of Aspects 1 to 3, wherein the sgASO is a 7-mer.
- Aspect 5 The method according to any one of Aspects 1 to 4, wherein in the stem-loop structure formed by hybridization of said sgASO, the number of base pairs of the stem portion formed by the target RNA is 5.
- Aspect 6 The method according to any one of Aspects 1 to 5, characterized in that a loop portion is formed by a target RNA in the stem-loop structure formed by hybridization of the sgASO.
- Aspect 7 The method according to any one of Aspects 1 to 6, wherein the number of bases in the loop portion of the stem-loop structure formed by hybridization of said sgASO is 3 to 10.
- Aspect 8 The method according to any one of Aspects 1 to 7, wherein the number of bases in the loop portion of the stem-loop structure formed by hybridization of the sgASO is 4 to 8.
- Aspect 9 The method according to any one of Aspects 1 to 8, wherein the number of bases in the loop portion of the stem-loop structure formed by hybridization of the sgASO is 7.
- Aspect 10 The method according to any of Aspects 1 to 9, wherein the sgASO is completely complementary to a target RNA.
- Aspect 11 The method according to any of Aspects 1 to 10, wherein the stem portion of the stem-loop structure formed by hybridization of the sgASO does not contain a mismatch or a bulge.
- Aspect 12 The method according to any one of Aspects 1 to 10, wherein a stem portion of said stem-loop structure formed by hybridizing said sgASO contains a mismatch or a bulge.
- Aspect 16 The method according to any of Aspects 1 to 14, wherein the target RNA is RNA derived from mitochondrial genome.
- Aspect 17 The method according to any of Aspects 1 to 14, wherein the target RNA is RNA derived from a viral genome or a bacterial genome.
- Aspect 18 The method according to any of Aspects 1-17, wherein sgASO comprises a modified nucleoside and / or a modified internucleoside linkage.
- Aspect 19 The method according to any one of Aspects 1 to 18, wherein the difference in the number of bases between the 5 ′ side sequence and the 3 ′ side sequence of the stem portion formed by the target RNA is 1 or less.
- Aspect 20 The difference in the number of bases between the 5 ′ side sequence and the 3 ′ side sequence of the stem portion formed by the target RNA is 1 or less.
- a pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of a disease or disorder in a patient comprising an approximately 7-mer oligonucleotide,
- the approximately 7-mer oligonucleotide is complementary to a target RNA associated with a disease or disorder, Said target RNA can form at least one stem loop structure,
- the about 7-mer oligonucleotide can be hybridized to the 3 'region of the stem loop structure to form at least one larger stem loop structure in combination with the stem loop formed by the target RNA;
- a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer which comprises sgASO comprising any of sequences selected from the following: 5'-GAAACUU-3 '; 5'-CUGUCAA-3 '; 5'-UCUUCAA-3 '; 5'-UUAUCGU-3 '; 5'-CUUAUAA-3 '; 5'-GCGGGGG-3 '; 5'-ACUCAAA-3 '.
- a method for designing an oligonucleotide (sgASO) for cleaving a target RNA in a eukaryotic cell 1) identifying a sequence in which at least one stem loop structure is formed in the target RNA sequence, 2) identifying a sequence of 6 to 10 bases on the 3 'side adjacent to the stem loop structure as a binding sequence of sgASO, and 3) identifying a sequence complementary to the binding sequence as a sequence of sgASO ,Method.
- sgASO oligonucleotide
- the base formed from the 5 'side of the sgASO-bound region on the target RNA is N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, and further adjacent to the 3' side of the sgASO-bound region
- sgASO small guide antisense oligonucleotide
- the step of identifying a stem loop having a high probability of existing on the target RNA is i) A frame n of W base width is set from the 5 'end in increments of R bases, n max pieces of the frame n are obtained from the target RNA, and in each frame n, pattern matching is performed for the base sequences of the constituting W bases Calculating a possible base pairing pattern, applying known thermodynamic stability calculations to the result, and providing as ⁇ G for each base pairing pattern; ii) Assuming that the state in the cell in which the RNA is placed is in equilibrium from the predicted structure results obtained in frame n and the amount of energy of each obtained predicted structure results The existence probability is calculated according to Maxwell-Boltzmann statistics, and here, for the m-th prediction result from the most stable structure among the structure prediction results in the n-th frame, let each existence probability be j (n, m) Structural analysis steps, including iii) starting from an absolute position x on the sequence not in the frame,
- FIG. 1 is a graph showing the results of testing the suppression of Bcl-2 mRNA expression by sgASO (VIS-1 to VIS-7) designed according to the present invention using human leukemia cell line HL60. As a result, it was possible to obtain VIS-1 and VIS-5 as sgASO showing twice as much activity as Hep1, which has already been reported.
- the vertical axis shows relative Bcl-2 mRNA levels when mock (sample of water only as solvent) is 1.
- the present inventors have developed a method for efficiently regulating gene expression in cells using relatively short oligonucleotides. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
- TRUE Gene Silencing The inventors of the present invention have developed a novel gene expression suppression technology named TRUE Gene Silencing (tRNase Z L -utilizing efficacious gene silencing).
- TRUE Gene Silencing tRNase Z L is a large molecular weight type of endoribonuclease (tRNase Z or 3 't RNase) that processes the 3' end of tRNA, and excises the 3 'end of precursor tRNA.
- This TRUE gene silencing can cleave any part of any RNA by recognizing a pre-tRNA-like or micro-pre-tRNA-like complex formed by the target RNA and the synthetic small guide antisense nucleic acid It is based on the unique enzymatic properties of mammalian tRNase Z L that it can.
- Small guide antisense oligonucleotides are 5'-half tRNA (Nashimoto, M. (1996) Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5 'half tRNA by mammalian tRNA 3' processing endoribonuclease.
- RNA , 2, 2523-2524. 12 to 16 nt linear RNA
- the T-loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem., 280, 22326-22334.
- Heptameric RNA Non-semiconucleic acid Res., 26, 2565-2571.
- hook-type RNA Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M. and Nashimoto, M. (2004) A novel four- Nucleic Acids Res., 32, e91.) are divided into four types: base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3 'terminal nucleotides from RNA molecules.
- TRUE gene silencing in various mammalian cells by introducing small guide antisense oligonucleotides (sgASO) targeting different mRNAs by their expression plasmid or 2'-O-methylated RNA
- sgASO small guide antisense oligonucleotides
- HIV-1 expression in Jurkat cells was suppressed for more than 18 days by 5'-half tRNA type sgRNA (Habu et al. (2005) mentioned above), and luciferase expression in mouse liver was suppressed by heptamer type sgASO (Nakashima et al. (2007), supra).
- TRUE gene silencing is equivalent to RNA interference (RNAi), and in some cases, it has been confirmed to outweigh the effect of RNAi.
- tRNase Z L is present not only in the nucleus but also in the cytosol, and the same 5'-half tRNA in the cytoplasm as was used as sgASO.
- human cytosolic tRNase Z L regulates gene expression by cleaving mRNA under the direction of 5'-half tRNA
- PPM1F mRNA is one of the true targets of tRNase Z L (Elbarbary, RA, Takaku, H., Uchiumi, N., Tamiya, H., Abe, M., Takahashi, M., Nishida, H. and Nashimoto, M.
- TRUE gene silencing is the use of sgASO as a disease therapeutic or prophylactic agent due to the expression of specific genes.
- intracellular mRNA levels encoding Bcl-2 and VEGF which have been promising as molecular targets for cancer therapy, are 5'-half tRNA type sgASO, 14-nt linear type sgASO or It has been found that the expression is suppressed by heptameric sgASO (Tamura et al. (2003) and Elbarbary et al. (2009) mentioned above).
- One embodiment of the present invention is a method for cleaving target RNA in eukaryotic cells, which comprises: (1) hybridizing a 6-mer to 10-mer oligonucleotide (sgASO) complementary to the target RNA Identifying in the target RNA sequence a sequence in which at least one stem loop structure is formed, and (2) preparing the sgASO to contact with the target RNA in a eukaryotic cell, the sgASO comprising
- the present invention relates to a method characterized in that tRNaseZ L in a eukaryotic cell recognizes a stem loop structure formed by hybridization and cleaves a target RNA. The method may be applied in vitro or in vivo.
- one of the aspects of the present invention is a method for the treatment of a disease or disorder associated with expression of an undesired gene in a human or non-human animal, comprising: Identifying in the target RNA sequence a sequence in which at least one stem loop structure is formed by hybridizing a 6-mer to 10-mer oligonucleotide (sgASO) complementary to the target RNA transcribed from the target gene, and (2) preparing the sgASO, administering it to a human or non-human animal, and contacting with the target RNA in the cell, wherein the stem loop structure formed by the hybridization of the sgASO is formed in the cell.
- sgASO 6-mer to 10-mer oligonucleotide
- the present invention relates to a method characterized in that tRNaseZ L recognizes and cleaves a target RNA.
- the small guide antisense nucleic acid is a relatively short oligonucleotide, for example a 6 mer to 10 mer, ie, a 6 mer, 7 mer, 8 mer, 9 mer, or 10 mer, preferably a 7 mer oligonucleotide (heptameric sgASO) is there.
- sgASO is used as a drug component, shorter sgASO is preferable from the viewpoints of pharmacology and CMC (Chemistry, Manufacturing and Control). Because shorter sgASO can be synthesized more conveniently and inexpensively than long chain sgASO.
- shorter sgASO can be easily taken into cells without using a cell transfer agent (such as transfection reagent) and a DDS base (Loke, SL, Stein, CA, Zhang XH, Mori, K (Nakanishi, M., Subasinghe, C., Cohen, JS and Neckers, LM (1989) Characterization of oligonucleotide transport into living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3474-3478.). In practical applications, 7-mer oligonucleotides may be preferred in terms of synthetic advantages and specificity of sequence recognition.
- the sgASO according to the present invention can be produced by a known method using chemical synthesis, an enzymatic transcription method or the like.
- known methods using chemical synthesis include phosphoroamidite method, phosphorothioate method, phosphotriester method, etc.
- ABI 3900 high throughput nucleic acid synthesizer manufactured by Applied Biosystems
- Enzymatic transcription can be exemplified by transcription using an RNA polymerase such as T7, T3 or SP6 RNA polymerase with a plasmid or DNA having a target nucleotide sequence as a template.
- the heptameric sgASO produced by the synthesis method or transfer method is then purified by HPLC or the like. For example, at the time of HPLC purification, sgASO is eluted from the column using a mixed solution of triethylammonium acetate (TEAA) or hexylammonium acetate (HAA) and acetonitrile.
- TEAA triethylammonium acetate
- HAA hexylammonium acetate
- the eluted solution is dialyzed for 10 hours with 1000 times the elution volume of distilled water, and the dialyzed solution is lyophilized and then stored frozen until used. At the time of use, for example, it is dissolved in distilled water so that the final concentration is about 100 ⁇ M.
- the nucleic acid used for sgASO according to the present invention may be any molecule as long as it has a molecule similar to a nucleoside or a molecule having the same function as that of the nucleoside via an internucleoside bond.
- a nucleoside is a type of compound in which a base (nucleobase) and a sugar are linked.
- base purine bases such as adenine and guanine, pyrimidine bases such as thymine, cytosine and uracil, nicotinamide, dimethylisoalloxazine and the like are included.
- Adenosine, thymidine, guanosine, cytidine, uridine and the like are representative nucleosides.
- a nucleotide is a substance in which a phosphate group is linked to a nucleoside.
- oligonucleotides also referred to as polynucleotides
- RNA which is a polymer of ribonucleotides
- DNA which is a polymer of deoxyribonucleotides
- polymers in which RNA and DNA are mixed and nucleotide polymers, which contain modified nucleosides.
- Be Natural DNA and RNA have phosphodiester bonds as internucleoside bonds.
- nucleic acid used for sgASO according to the present invention may contain a modification. Positions of nucleic acid modification include sugar moieties, backbone (linkage) moieties, nucleobase (base) moieties, 3 'or 5' end moieties.
- sgASO used in the present invention may include morpholino nucleic acid and peptide nucleic acid.
- Modified Nucleosides for example to improve or stabilize nuclease resistance as compared to RNA or DNA, to increase affinity to complementary strand nucleic acids, to enhance cell permeability, or to provide visualization. Mention may be made of modified nucleosides, deoxyribonucleosides, RNA or DNA. For example, sugar moiety modified nucleosides can be mentioned.
- the sgASOs of the present invention may comprise, for example, the modified nucleic acid molecules disclosed in Khvorova & Watts (Nature Biotechnology 35, 238-248 (2017) doi: 10.1038 / nbt. 3765).
- Modified sugar refers to a sugar having a substitution and / or any change from a natural sugar moiety (ie, a sugar moiety found in DNA (2′-H) or RNA (2′-OH))
- Modified nucleosides refer to modified nucleosides that include modified sugars.
- the sugar moiety-modified nucleoside may be any one in which any chemical structural substance is added or substituted to part or all of the chemical structure of the nucleoside sugar, for example, 2'-O-methyl ribose Modified modified nucleoside, modified nucleoside substituted with 2'-O-propyl ribose, modified nucleoside substituted with 2'-methoxyethoxy ribose, modified nucleoside substituted with 2'-O-methoxyethyl ribose, 2 ' Modified nucleoside substituted with -O- [2- (guanidinium) ethyl] ribose, modified nucleoside substituted with 2'-O-fluoro ribose, bridge having two cyclic structures by introducing a crosslinked structure into the sugar moiety Structured artificial nucleic acid (Bridged Nucleic Acid) (BNA), more specifically, oxygen atom at the 2 'position and 4 Locked artificial nucleic
- PNA peptide nucleic acid
- OPNA oxypeptide nucleic acid
- PRNA peptide ribonucleic acid
- 2'-O-methyl (2'-OMe) modification (2'-OMe-RNA) of RNA is a modification which also exists naturally, and it improves the binding affinity and nuclease resistance of the modified oligonucleotide and Reduce irritation.
- 2'-O-Methoxyethyl (2'-MOE) has a further increase in nuclease resistance over 2'-OMe modification and also significantly increases the binding affinity ( ⁇ Tm) of the modified nucleotide.
- SgASO containing 2'-OMe is also compatible with recognition and cleavage by tRNaseZ L.
- the 2'-fluoro (2'-F) modification (2'-F-RNA) of RNA can also be used to increase the affinity of the oligonucleotide.
- Other 2′-modified nucleic acids include 2′-F-ANA and 2′-modified derivatives of Sekine et al. (Japanese Patent No. 5194256, Japanese Patent Laid-Open No.
- LNA Locked nucleic acid linking the 2 'oxygen and the 4' carbon of ribose results in a significant increase in binding affinity.
- LNA Longed nucleic acid
- the 2 'oxygen and 4' carbons of the ribose sugar of RNA are fixed in the ring structure. This modification increases specificity, affinity, and half-life, enabling effective delivery to the tissue of interest with lower toxicity.
- Oligomers longer than about 8 nucleotides fully modified with LNA are known to tend to aggregate and are generally used in admixture with DNA and other sugar-modified nucleic acids.
- SgASO containing LNA is also compatible with recognition and cleavage by tRNaseZ L.
- CEt a methylated analog of LNA
- LNA Tricyclo-DNA
- tcDNA Tricyclo-DNA
- an atom of the base portion of nucleic acid eg, hydrogen atom, oxygen atom
- a functional group eg, hydroxyl group, amino group
- nucleosides for example, lipids, phospholipids, phenazines, folates
- molecules to which another chemical substance is added such as phenanthridine, anthraquinone, acridine, fluorescein, rhodamine, coumarin, or a dye may be used.
- Modified nucleobases include any nucleobase other than adenine, cytosine, guanine, thymine or uracil, for example 5-methylcytosine, 5-fluorocytosine, 5-bromocytosine, 5- Iodocytosine, N4-methylcytosine, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-iodouracil, 2-thiothymine, N6-methyladenine, 8-bromoadenine, N2-methylguanine, 8-bromoguanine, and inosine etc. It can be mentioned.
- the internucleoside linkage may comprise a modification.
- a modified internucleoside linkage refers to an internucleoside linkage having a substitution or any change from a naturally occurring internucleoside linkage (ie, a phosphodiester linkage), and a modified internucleoside linkage includes an internucleoside linkage containing a phosphorus atom And internucleoside linkages that do not contain a phosphorus atom.
- any chemical substance may be added or substituted to a part or all of the chemical structure of the phosphodiester bond of the nucleotide, for example, a modified internucleoside bond substituted by phosphorothioate bond, A modified internucleoside bond or the like substituted for the N3'-P5 'phosphoramidate bond can be mentioned.
- Other modified internucleoside linkages include (S C5 ′ R p ) - ⁇ , ⁇ -CNA, PMO and the like.
- Representative phosphorus-containing internucleoside linkages include, for example, phosphodiester linkages, phosphorothioate linkages, phosphorodithioate linkages, phosphotriester linkages, and methyl phosphonate linkages, methyl thiophosphonate linkages, boranophosphate linkages, phosphoroamidate linkages Can be mentioned.
- the phosphorothioate (PS) bond serves to protect the oligonucleotide from degradation by nucleases.
- PS phosphorodithioate
- PS increases binding to receptor sites and plasma proteins by altering the charge of the ASO and increases the amount of ASO reaching the target tissue.
- Heparin binding proteins are among the highest affinity targets of phosphorothioate modified oligonucleotides. Proper binding by plasma proteins suppresses rapid clearance from the blood by the renal system and promotes optimal delivery.
- SgASO with phosphothioate linkage is also compatible with recognition and cleavage by tRNaseZ L.
- the phosphorothioate bond has a stereocenter at the phosphorus atom part, and a fully modified oligonucleotide is usually a mixture of 2 n-1 kinds of diastereomers (eg, a 7-mer phosphorothioate oligonucleotide has 2 6 kinds) It becomes a mixture of diastereomers).
- the S p and R p diastereomeric bonds are known to exhibit different properties.
- the R p diastereomers are less nuclease resistant than the S p diastereomers, but bind to the complementary strand with higher affinity.
- the synthesis may be controlled such that particular phosphorothioate linkages become particular diastereomers.
- Examples of the molecule in which another chemical substance is added to the oligonucleotide / terminal-modified oligonucleotide nucleic acid to which a ligand or the like is linked include: 5'-polyamine addition derivative, cholesterol addition derivative, steroid addition derivative, bile acid addition derivative, vitamin addition derivative And Cy 5 addition derivatives, Cy 3 addition derivatives, 6-FAM addition derivatives, biotin addition derivatives and the like, and derivatives of Hoide et al. (PCT / JP2007 / 000087, PCT / JP2016 / 59398).
- the site to which a ligand or the like is added may be at the end (5 'end or 3' end) of the oligonucleotide and / or inside the oligonucleotide.
- GalNAc linked oligonucleotides and PUFA linked oligonucleotides are known as examples of end modification. By ligating GalNAc to the end, the efficiency of delivery of the oligonucleotide to the liver can be enhanced.
- a ligand such as GalNAc may be linked to sgASO used in the present invention.
- Short oligonucleotides tend to be delivered more to the kidney and longer oligomers tend to be delivered more to the liver. Short oligonucleotides tend to be less likely to bind to plasma proteins, resulting in shorter half-lives in plasma, but it is possible to construct multimers using cleavable linkers and the like.
- the sgASO used in the present invention may be linked to another sgASO using a cleavable linker or the like.
- the sgASO according to the present invention may have a phosphate group added to the 5 'end and / or the 3' end.
- Other terminal modifications include E-VP, methylphosphonates, phosphorothioates, C-methyl analogues, etc., which are known to increase the stability of oligonucleotides.
- the sgASO used in the present invention may contain these terminal modifications.
- sgASO enables specific cleavage of a target RNA by tRNase Z L by forming a tRNA acceptor stem-like duplex with the target RNA through base pairing
- the target site for sgASO is directly below the stable hairpin structure region similar to the tRNA T arm.
- sgASO effectively cleaves RNA not only by its seven bases, but also by the specificity of the sequence region that forms a stable hairpin structure. Therefore, the nucleotide sequence of sgASO can be designed based on the mRNA sequence information of the target gene.
- One aspect of the present invention is a method for cleaving target RNA in eukaryotic cells as described above, wherein (1) a 6-mer to 10-mer oligonucleotide (sgASO) complementary to the target RNA is hybridized. Identifying the sequence in which at least one stem-loop structure is formed in the target RNA sequence by soybeanizing, and (2) preparing the sgASO to contact with the target RNA in a eukaryotic cell The present invention relates to a method characterized in that tRNaseZ L in a eukaryotic cell recognizes a stem loop structure formed by hybridizing said sgASO and cleaves a target RNA.
- sgASO 6-mer to 10-mer oligonucleotide
- the acceptor stem and T arm of the tRNA are three-dimensionally connected in series to form a single stem-loop structure, and it is considered that tRNase Z L recognizes this stem-loop structure and cleaves RNA. Therefore, by hybridizing sgASO with the target RNA, if it is possible to reproduce a single stem-loop structure similar to the structure formed by such an acceptor stem and T arm, cleavage of the target RNA is also possible.
- the acceptor stem is 7 bases long
- the stem part of the T arm is 5 bases long
- the loop part of the T arm is 7 bases long
- the sgASO corresponding to the acceptor stem may be, for example, 7 bases long, but is not necessarily limited thereto.
- the length of sgASO according to the present invention may be, for example, 6 to 10 mer.
- the T arm-like stem-loop structure formed by the target RNA may be 5 bases long in the stem portion and 7 bases in the loop portion, but is not necessarily limited thereto.
- the length of the stem portion of the T arm-like stem loop structure formed by the target RNA may be, for example, 4 to 8 bases in length.
- the number of bases in the loop portion can be, for example, 3 to 10 bases, preferably 4 to 8 bases.
- the sum of the length of sgASO and the length of the stem portion of the T-arm like stem loop structure formed by the target RNA may be 12 bases, but this is not necessarily limited thereto. The sum of this length may be, for example, 11-14 bases.
- sgASO be a 7-mer oligonucleotide in terms of synthetic advantages and specificity of sequence recognition.
- the stem portion has a length of 5 bases in terms of the stability and the presence probability.
- the lengths of the two strands of the stem portion are equal (the 5 'side sequence and the 3' side sequence of the stem sandwiching the loop) It is preferable that the difference in the number of bases of (1) is within 1) and the length of the loop portion does not exceed 10.
- the base composed from the 5 'side of the region to which sgASO binds on the target RNA is N1, N2, N3, N4, Assuming that N5, N6, N7, and the first base adjacent to the 3 'side of the sgASO binding region is N8, the sequence is designed to satisfy at least one of the following conditions 1 to 3: Well, the sequence may be designed to satisfy at least two of conditions 1-3, or all of conditions 1-3: -Condition 1: N8 is A or G; -Condition 2: N7 is C; Condition 3: N 6 is A, C or G.
- the T arm-like stem loop structure formed by the target RNA and / or the acceptor stem-like structure formed by the target RNA and the sgASO include non-Watson-click base pairs other than Watson-click base pairs (eg, G- U bond may be included. Also, the stem may contain a mismatch or a bulge.
- sgASO When sgASO is a 7-mer, sgASO can be an oligonucleotide consisting of any one sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16384.
- SEQ ID NO: n may be written as "SEQ ID NO: n”.
- the sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16384 are shown in the following table:
- thermodynamic stability In order to identify a T-arm like stem-loop structure formed by the target RNA in the target RNA, structural analysis can be performed by performing pattern matching and evaluation based on thermodynamic stability.
- 1) mRNA is single-stranded and forms a conformation only by itself without involvement of proteins, 2) mRNA is not full-length during protein synthesis by ribosomes, and it is not full-length 3)
- a single primary structure mRNA (or a partial sequence of a fixed length as a part thereof) has a plurality of higher-order forms. It is possible to put the working hypothesis that it is assumed to take a structure and they are in equilibrium (ie the existence probability is distributed according to the amount of energy).
- a frame n of the width of W bases is set in R base increments from the 5 'end of mRNA (a frame is obtained nmax from the target transcript), and in each frame n, the predicted structure result and each From the amount of energy, the existence probability of each of the predicted structure results is calculated from Maxwell's Boltzmann statistics, assuming that the state in the cell in which the mRNA is placed is in equilibrium.
- the m-th prediction result from the most stable structure in the frame n, mmax (n) predicted structure results are obtained
- the existence probability can be j (n, m).
- stem loop structure in the stem loop
- stem loop structure in the stem loop
- stem loops in the stem loop
- stem loops there may be a mismatch (one in the stem where the bases not participating in the base pair are opposed) or a bulge (one in the stem where the bases not participating in the base pair are not opposed).
- stem loop contained in the stem loop is also regarded as a separate stem loop (e.g., one having a base pair farthest from the most loop of the stem is regarded as another stem loop as an unsolved one).
- stem loops start from the absolute position x on the sequence not in the frame, and p is the feature profile of the constituent loops and stem (the individuality of the stem loop defined by the positions of the bases of the base pairs constituting the stem) is p.
- motif (x, p) the existence probability in the frame n of motif (x, p) be a partial existence probability P_local (x, p, n), and the value thereof is the relevant one of the structure prediction results obtained in the n frame.
- P_local x, p, n
- ⁇ P_local (x, p, n) is the result of taking the sum of the P_local (x, p, n) from frame 1 to nmax, and the total length of the array constituting the stem loop can be within the frame. Assuming that the number is n_all (x, p), the existence probability P_global (x, p) of motif (x, p) in the whole is ⁇ P_local (x, p, n) / n_all (x, p) It is represented as
- the local existence probability P_local (x, p, n) of motif (x, p) is:
- the probability of existence P_global (x, p) in the whole for motif (x, p) is: Is represented by
- p2 "equal left and right (less than one difference in the number of bases between the 5 'side sequence and 3' side sequence of the stem across the loop is 1) and the loop length does not exceed 10"
- Certain motifs (x, p2) can be further identified.
- loop portion has three bases and It is assumed that what is predicted is a loop of 5 bases by unwinding the next base pair, (2) Bases ignoring mismatches in stems and bulges if the number of bases is 2 or less When the number of mismatches in the stem and / or (3) the number of bases of the bulge or bulge is 3 or more, the number of bases of the mismatch or bulge is counted as the number of base pairs.
- 5 base pairs of the stem-loop structure can be identified, and immediately thereafter (3 'side) can be made the sgASO binding site.
- One embodiment of the present invention is a method for designing an oligonucleotide (sgASO) for cleaving a target RNA in a eukaryotic cell, wherein (1) at least one stem loop structure is formed in the target RNA sequence Identifying a sequence, (2) identifying a 6-10 base sequence on the 3 'side adjacent to the stem loop structure as a binding sequence of sgASO, and (3) a sequence complementary to the binding sequence is sgASO
- the method comprises the steps of:
- target RNA is a transcript RNA of a gene (target gene) to be suppressed or eliminated its expression (target gene), in particular mRNA, but may be ncRNA.
- target RNAs include RNAs derived from nuclear genomes, RNAs derived from mitochondrial genomes, RNAs derived from viral genomes or bacterial genomes, and the like.
- sgASO used in the present invention does not necessarily have to be completely complementary to the target RNA, it is typically completely complementary to the target RNA.
- the expression suppression of a target gene is to reduce the amount of protein transcribed and synthesized from the gene to 25% or less, preferably 50% or less, more preferably 75% or less, particularly preferably 95% or less.
- a target gene is a gene whose expression suppression or loss of expression has an industrial application value, and in particular, a gene whose enhanced expression of the gene causes a specific disease (hereinafter referred to as a pathogenic gene) ).
- pathogenic genes include, for example, ras, erbb2, myc, apc, brca1, rb, Bcl-2, BGEF oncogene, genes involved in hypertension such as renin, diabetes related genes such as insulin, LDL receptor And hyperlipidemia related genes such as leptin, arteriosclerosis disease related genes such as angiotensin, apolipoprotein and precerinin known as causes of dementia, genes related to aging, and the like.
- genes and their mRNA sequences are known in known databases (NCBI nucleotide database etc.).
- the small guide antisense nucleic acid can be formulated alone, but is usually mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers and is well known in the pharmaceutical arts. It is desirable to administer as a pharmaceutical preparation manufactured by any of the methods described above.
- the pharmaceutical composition may comprise a mixture of multiple sg ASOs having different sequences.
- Subjects for administration include human or non-human animals, such as non-human mammals.
- the preferred route of administration is to use the most effective one for treatment, and oral administration or parenteral administration such as buccal, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular, intravenous and transdermal.
- oral administration or parenteral administration such as buccal, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular, intravenous and transdermal.
- intravenous administration can be mentioned.
- the preparations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
- Liquid preparations such as emulsions and syrups are water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, glycols such as polyethylene glycol, propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil, p-hydroxybenzoic acid It can be manufactured using preservatives such as esters, and flavors such as strawberry flavor and peppermint as additives.
- excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol etc., starch, disintegrants such as sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, polyvinyl alcohol, hydroxy It can be manufactured using, as additives, binders such as propyl cellulose and gelatin, surfactants such as fatty acid esters, and plasticizers such as glycerin.
- Suitable preparations for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
- the injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution or a mixture of both.
- Suppositories are prepared with carriers such as cocoa butter, hydrogenated fats or carboxylic acids.
- the spray is prepared using a carrier or the like which does not irritate the oral cavity and airway mucous membranes of the recipient and disperses the active ingredient as fine particles to facilitate absorption.
- the carrier include lactose, glycerin, liposomes, nanomicelles and the like.
- the carrier include lactose, glycerin, liposomes, nanomicelles and the like.
- the carrier it is possible to prepare an aerosol, dry powder and the like.
- the component illustrated as an additive by the oral agent can also be added also in these parenteral agents.
- the dose or the number of administrations vary depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight and the like, it is usually 10 ⁇ g / kg to 100 mg / kg per adult per day.
- One embodiment of the present invention is a pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of a disease or disorder in a patient, comprising about 7 mer oligonucleotide (sgASO), wherein said about 7 mer oligonucleotide is a disease or disorder Complementary to a target RNA related to E. coli, wherein the target RNA can form at least one stem loop structure, and the about 7-mer oligonucleotide is hybridized to the 3 'region of the stem loop structure
- the at least one larger stem loop structure can be formed together with the stem loop formed by the target RNA, and the formed structure is recognized by tRNaseZ L in a patient's body to cleave the target RNA.
- the present invention relates to a pharmaceutical composition that is characterized.
- the patient may be a human or non-human animal.
- the term “about 7 mer” is understood to include 6 mer, 7 mer and 8 mer.
- sgASO is a base immediately adjacent to the 3 'side of the base forming the base of the stem-loop structure (that is, the end base pair opposite to the loop) formed by the target RNA, and the 3' of sgASO.
- the terminal base is designed to form a base pair, but is not limited thereto.
- it may be designed such that the second to third bases and the 3 'terminal base of sgASO form a base pair, counting from the base of the stem-loop structure formed by the target RNA.
- the pharmaceutical composition can comprise at least one sgASO of VIS-01 to VIS-07 disclosed in the Examples of the present application.
- the pharmaceutical composition may be a composition for treating or preventing cancer, or a composition for use in treating or preventing cancer.
- One embodiment of the present invention is a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer, or a pharmaceutical composition for use in treating or preventing cancer, comprising any sequence selected from the following: It relates to a pharmaceutical composition comprising sgASO consisting of any sequence: 5'-GAAACUU-3 '; 5'-CUGUCAA-3'; 5'-UCUUCAA-3 '; 5'-UUAUCGU-3'; CUUAUAA-3 '; 5'-GCGGGGG-3'; 5'-ACUCAAA-3 '.
- sgASO may have a phosphate group at one or both ends.
- Cancers in which the present pharmaceutical composition can be used are cancers in which the Bcl-2 gene is involved, and include, for example, lymphomas.
- One aspect of the present invention is the use of an about 7 mer oligonucleotide (sgASO) in the manufacture of a medicament for use in the treatment or prevention of a disease or disorder in a patient.
- the 7-mer oligonucleotide is complementary to a target RNA associated with a disease or disorder, and the target RNA can form at least one stem-loop structure, and the about 7-mer oligonucleotide is 3 of the stem-loop structure.
- the 'side region can be hybridized with the stem loop formed by the target RNA to form at least one larger stem loop structure, and the formed structure is recognized by tRNaseZ L in the patient's body , Use, characterized in that the target RNA is cleaved.
- one embodiment of the present invention is a method for the treatment or prevention of a disease or disorder in a patient, comprising administering to said patient an approximately 7-mer oligonucleotide (sgASO), wherein The 7 mer oligonucleotide is complementary to a target RNA associated with a disease or disorder, and the target RNA can form at least one stem loop structure, and the about 7 mer oligonucleotide is 3 of the stem loop structure.
- the 'side region can be hybridized with the stem loop formed by the target RNA to form at least one larger stem loop structure, and the formed structure is recognized by tRNaseZ L in the patient's body , A method characterized in that the target RNA is cleaved.
- One aspect of the present invention relates to the use of sgASO comprising or consisting of any sequence selected from the following in the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of cancer: 5'-GAAACUU- 3 '; 5'-CUGUCAA-3'; 5'-UCUUCAA-3 '; 5'-UUAUCGU-3'; 5'-CUUAUAA-3 '; 5'-GCGGGGG-3'; 5'-ACUCAAA-3 ' .
- one embodiment of the present invention is a method for treating or preventing cancer in a patient, which comprises administering sgASO comprising or consisting of any sequence selected from the following: It relates to a method comprising the steps: 5'-GAAACUU-3 '; 5'-CUGUCAA-3'; 5'-UCUUCAA-3 '; 5'-UUAUCGU-3'; 5'-CUUAUAA-3 '; 5'-GCGGGGGGG -3 '; 5'-ACUCAAA-3'.
- Example 1 Structural prediction and structural analysis> Sequence information (accession number: NM — 000633.2) of Bcl-2 mRNA was obtained from the database of NCBI. Based on the sequence information, a frame with a width of 300 bases was set every three bases from the 5 'end (the first frame is from the base at the 5' end (first base) to the 300th base. The second frame is The fourth base to the 303rd base, and so on, assuming that nmax frames are obtained). In each frame, pattern matching and structure prediction based on thermodynamic stability were performed for the base sequence of 300 bases that constitute (see, for example, the following reference: Markham, NR & Zuker, M. (2005) DINAMelt Markham, N.
- stem loop structure in the stem loop
- stem loop structure in the stem loop
- stem loops in the stem loop
- stem loops there may be a mismatch (one in the stem where the bases not participating in the base pair are opposed) or a bulge (one in the stem where the bases not participating in the base pair are not opposed).
- stem loop contained in the stem loop is also regarded as a separate stem loop (e.g., one having a base pair farthest from the most loop of the stem is regarded as another stem loop as an unsolved one).
- stem loops are not in the frame but at an absolute position x on the sequence, and the information profile of the constituent loops and stems (the identity of the stem loop defined by the positions of the bases of the base pairs constituting the stem) is p.
- motif (x, p) the existence probability in the frame n of motif (x, p) be a partial existence probability P_local (x, p, n), and the value thereof is the relevant one of the structure prediction results obtained in the n frame.
- P_local x, p, n
- ⁇ P_local (x, p, n) is the result of taking the sum of the P_local (x, p, n) from frame 1 to nmax, and the total length of the array constituting the stem loop can be within the frame. Assuming that the number is n_all (x, p), the existence probability P_global (x, p) of motif (x, p) in the whole is ⁇ P_local (x, p, n) / n_all (x, p) It is represented as
- the sequence of the binding site where sgASO is expected to be effective is AAGUUUC, UUGACAG, UUGAAGA, ACGAUAA, UUAUAAG, CCCCCGC, UUUGAGU, and the 7-mer antisense oligos (VIS-01 to VIS-07) was synthesized (synthesized by Nippon Bioservice Co., Ltd.).
- Target sequence Name sgASO sequence SEQ ID NO: AAGUUUC VIS-01 5'- pGAAACUUp -3 '8224 UUGACAG VIS-02 5 '-pCUGUCAAp -3' 7889 UUGAAGA VIS-03 5 '-pUCUUCAA p -3' 14289 ACGAUAA VIS-04 5 '-pUUAUCGUp -3' 15580 UUAUAAG VIS-05 5'- pCUUUAAAP-3 '7985 CCC CCGC VIS-06 5'- pGCGGGGGp -3 '9899 UUUGAGU VIS-07 5'- pACUCAAAP-3 '1857
- Example 3 Cell Experiment> The above-mentioned Bcl-2 mRNA expression suppression experiment by sgASO (VIS-1 to VIS-7) was performed using human leukemia cell line HL60. All nucleic acid strands were phosphorylated at both ends and OMe-ized at the 2 'OH moiety. Hep1 (sequence: GGGCCAG; see Japanese Patent No. 5959849 and Cancer Letters 328 (2013) 362-368), which is one of sgASOs already reported, was also used as a reference.
- a RPMI-1640 medium (containing 10% fetal calf serum and 1% penicillin-streptomycin) at a density of 10,000 cells / 500 ⁇ L of HL60 cells in a 24-well plate at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator Cultured. Each sg ASO was added to the medium to a final concentration of 1 ⁇ M, and culture was further continued for 48 hours. After 48 hours, total RNA was extracted from HL60 cells using RNAisoPlus, and quantitative RT-PCR was performed. The amount of Bcl-2 mRNA was normalized using the amount of GAPDH mRNA as an internal control.
- the present inventors predict the structure of the target RNA sequence to be subjected to gene expression regulation based on the sequence information, and calculate the respective existence probabilities from the predicted structure results obtained and the respective amounts of energy,
- a method for designing sgASO based on the probability of existence and stem-loop structure we developed a method for efficiently regulating gene expression in cells using relatively short oligonucleotides.
- the present method is applicable to the regulation of any gene expression in principle, and thus is useful for the treatment or prevention of various diseases and disorders.
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Abstract
本発明は、望ましくない遺伝子の発現に関連する疾患または障害を処置するための核酸医薬を提供することに関する。より具体的には、本発明者らは、遺伝子発現調節の対象となる標的RNA配列について、その配列情報を元に構造解析を行ない、得られた構造解析結果とそれぞれのエネルギー量から、それぞれの存在確率を算出し、内在性のステムループ部分構造の存在確率を統一的に算出することでより好ましい内在性ステムループ部分構造を特定し、核酸医薬を設計する方法を確立することで、比較的短いオリゴヌクレオチドを用いて、効率よく細胞内における遺伝子発現を調節する手法を開発した。本手法は、原理的にあらゆる遺伝子発現の調節に応用可能であることから、多様な疾患および障害の治療または予防に有用である。
Description
本願は、特願2017-166641号(出願日:2017年8月31日)の優先権を主張する出願であり、これは引用することによりその全体が本明細書に取り込まれる。
本発明は、オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子発現の調節に関する。より詳細には、遺伝子発現を調節するための比較的短いオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物とそれを用いた疾患の処置に関する。また、本発明は遺伝子発現を調節するための比較的短いオリゴヌクレオチドの設計方法にも関する。
医薬品開発における創薬技術では、従来より創薬標的を蛋白質とする取組みが多く推進されて、低分子医薬や抗体とはじめとする蛋白医薬およびペプチド医薬による創薬が中心であった。近年、ゲノム科学や個別化医療など疾患の原因が遺伝子レベルで解明されてきたため、創薬標的を核酸とする取組みが開発され、低分子医薬品や抗体医薬品では狙いにくい治療標的にも対応できると考えられるため、核酸医薬が新しいモダリティ(創薬手法)として、期待されつつある。
基礎研究としては、アンチセンス核酸やRNAi(RNA干渉)などの研究(非特許文献1)が行われ、その技術に基づく医薬品開発が行われ、上市される製品も出始めている。さらに、蛋白質の遺伝情報を持たない核酸の機能が明らかとされつつあり、miRNA(マイクロRNA)として遺伝子発現調節技術としての創薬技術への応用が進められている(非特許文献2)。
アンチセンス核酸の技術において、梨本らは、TRUEジーンサイレンシング(tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing)と名付けた遺伝子発現抑制技術を開発している(特許文献1~3、非特許文献3~10)。このTRUEジーンサイレンシングは、標的RNAと合成スモールガイドアンチセンス核酸とによって形成されるpre-tRNA様またはマイクロpre-tRNA様複合体を認識することによって、いかなるRNAの任意箇所をも切断することができるという哺乳動物tRNase ZLのユニークな酵素的特性に基づいている。特に、合成スモールガイドアンチセンス核酸が7塩基である場合については、humanBCL-2、WT-1、CCND-1について、TRUEジーンサイレンシングの報告がある(非特許文献5~8)。TRUEジーンサイレンシングの効果は、RNA干渉(RNA interference:RNAi)と同等であり(非特許文献9)、幾つかの場合ではRNAiの効果を凌ぐことも確認されている(非特許文献10)。
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本発明は、遺伝子発現を調節するための比較的短いオリゴヌクレオチド(スモールガイドアンチセンスオリゴヌクレオチド;以下、sgASOとも言う)を含有する医薬組成物とそれを用いた疾患の処置方法を提供することを目的の一つとする。また、本発明の目的には、本発明は遺伝子発現を調節するための比較的短いオリゴヌクレオチドの設計方法を提供することが含まれる。
TRUEジーンサイレンシングにおいて、活性薬剤として用いられるスモールガイドアンチセンスオリゴヌクレオチド(sgASO)が標的RNAに結合して、tRNaseZLの基質となる構造を形成するためには、標的RNAの配列において少なくとも1つの内在性ステムループ構造が形成されることが必要であり、そのような配列を標的RNA配列中に同定する工程が必要である。しかし、これまでは標的とするRNAの一次配列より網羅的にステムループ構造などの高次構造やその安定性をこのような創薬技術として活用するレベルの精度で解析する手法は開発されてこなかった。本発明においては、sgASOが標的RNAに結合して、tRNaseZLの基質となるために少なくとも1つのステムループ構造が形成されるような配列を標的RNA配列中に同定する方法を提供することを課題の一つとする。
本発明者らは、遺伝子発現調節の対象となる標的RNA配列について、その配列情報を元に構造解析を行なった。そして、得られた構造解析結果とそれぞれのエネルギー量から、それぞれの存在確率を算出した。内在性のステムループ部分構造の存在確率を統一的に算出することでより好ましい内在性ステムループ部分構造を特定し、sgASOを設計するという方法を確立することで、本発明者らは、比較的短いオリゴヌクレオチドを用いて、効率よく細胞内における遺伝子発現を調節する手法を開発した。本発明は、本発明者らが開発したこのような手法に基づくものであり、以下の態様を包含する:
[態様1]真核細胞内の標的RNAを切断するための方法であって、
1)標的RNAに相補的な6merから10merのオリゴヌクレオチド(sgASO)がハイブリダイズすることによって、少なくとも1つのステムループ構造が形成される配列を標的RNA配列中に同定する工程、
2)該sgASOを調製して、真核細胞内において標的RNAと接触させる工程、
を含み、
該sgASOがハイブリダイズして形成されるステムループ構造を真核細胞内のtRNaseZLが認識して標的RNAを切断することを特徴とする、方法。
[態様2]該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のステム部分の塩基対数が11から14である、態様1記載の方法。
[態様3]該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のステム部分の塩基対数が12である、態様1または2記載の方法。
[態様4]sgASOが7merである、態様1~3のいずれか記載の方法。
[態様5]該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のうち、標的RNAによって形成されるステム部分の塩基対数が5である、態様1~4のいずれか記載の方法。
[態様6]該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のうち、ループ部分が標的RNAによって形成されることを特徴とする、態様1~5のいずれか記載の方法。
[態様7]該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のループ部分の塩基数が3から10である、態様1~6のいずれか記載の方法。
[態様8]該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のループ部分の塩基数が4から8である、態様1~7のいずれか記載の方法。
[態様9]該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のループ部分の塩基数が7である、態様1~8のいずれか記載の方法。
[態様10]該sgASOが標的RNAに完全に相補的であることを特徴とする、態様1~9のいずれか記載の方法。
[態様11]該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のステム部分がミスマッチまたはバルジを含まない、態様1~10のいずれか記載の方法。
[態様12]該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のステム部分がミスマッチまたはバルジを含む、態様1~10のいずれか記載の方法。
[態様13]ステム部分の塩基対数の計数において、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が2以下の場合は、ミスマッチまたはバルジが塩基対を形成するとみなしてカウントし、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が3以上の場合は、ミスマッチまたはバルジの塩基数の2分の1の数を塩基対数としてカウントする、態様12記載の方法。
[態様14]標的RNAがmRNAまたはncRNAである、態様1~13のいずれか記載の方法。
[態様15]標的RNAが核ゲノム由来のRNAである、態様1~14のいずれか記載の方法。
[態様16]標的RNAがミトコンドリアゲノム由来のRNAである、態様1~14のいずれか記載の方法。
[態様17]標的RNAがウイルスゲノムまたは細菌ゲノム由来のRNAである、態様1~14のいずれか記載の方法。
[態様18]sgASOが修飾ヌクレオシドおよび/または修飾ヌクレオシド間結合を含む、態様1~17のいずれか記載の方法。
[態様19]標的RNAによって形成されるステム部分の5’側配列と3’側配列の塩基数の差が1以下である、態様1~18のいずれか記載の方法。
[態様20]該sgASOの末端水酸基の一方または両方が修飾されている、態様1~19のいずれか記載の方法。
[態様21]該sgASOの末端水酸基の一方または両方にリン酸基が付加されている、態様1~20のいずれか記載の方法。
[態様22]標的RNA上のsgASOが結合する領域の5’側から構成する塩基をN1、N2、N3、N4、N5、N6、N7とし、さらにsgASOが結合する領域の3’側に隣接する最初の塩基をN8とした場合に、以下の条件1~3の少なくとも一つが満たされることを特徴とする、態様1~21のいずれか記載の方法:
-条件1:N8がAもしくはGである;
-条件2:N7がCである;
-条件3:N6がA、CもしくはGである。
[態様23]sgASOが配列番号1から配列番号16384のいずれか1つの配列から成るオリゴヌクレオチドである、態様1~22のいずれか記載の方法。
[態様24]約7merのオリゴヌクレオチドを含む、患者における疾患または障害の治療または予防に用いるための医薬組成物であって、
該約7merのオリゴヌクレオチドが、疾患または障害に関連する標的RNAに相補的であり、
該標的RNAが少なくとも1つのステムループ構造を形成することができ、
該約7merのオリゴヌクレオチドが該ステムループ構造の3’側の領域にハイブリダイズして、該標的RNAが形成するステムループと合わせて少なくとも1つのより大きなステムループ構造を形成することができ、
形成された構造が患者体内のtRNaseZLによって認識されて、標的mRNAが切断されることを特徴とする、医薬組成物。
[態様25]癌の治療もしくは予防のための医薬組成物であって、以下から選択されるいずれかの配列を含むsgASOを含む、医薬組成物:
5’-GAAACUU-3’;
5’-CUGUCAA-3’;
5’-UCUUCAA-3’;
5’-UUAUCGU-3’;
5’-CUUAUAA-3’;
5’-GCGGGGG-3’;
5’-ACUCAAA-3’。
[態様26]真核細胞内の標的RNAを切断するためのオリゴヌクレオチド(sgASO)の設計方法であって、
1)標的RNA配列中に少なくとも1つのステムループ構造が形成される配列を同定する工程、
2)該ステムループ構造に隣接する3’側の6~10塩基の配列をsgASOの結合配列として同定する工程、および
3)該結合配列に相補的な配列をsgASOの配列として同定する工程
を含む、方法。
[態様27]態様25記載のオリゴヌクレオチド(sgASO)の設計方法であって、
i)標的RNAによって形成されるステムループ構造のステム部分の塩基対数が4~8であり、
ii)該ステムループ構造のループ部分の塩基数が3から10であり、
iii)該ステムループ構造のステム部分がミスマッチまたはバルジを含む場合、ステム部分の塩基対数の計数において、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が2以下の場合は、ミスマッチまたはバルジが塩基対を形成するとみなしてカウントし、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が3以上の場合は、ミスマッチまたはバルジの塩基数の2分の1の数を塩基対数としてカウントし、そして
iv)該ステム部分の5’側配列と3’側配列の塩基数の差が1以下である、
方法。
[態様28]標的RNA上のsgASOが結合する領域の5’側から構成する塩基をN1、N2、N3、N4、N5、N6、N7とし、さらにsgASOが結合する領域の3’側に隣接する最初の塩基をN8とした場合に、以下の条件1~3の少なくとも一つが満たされることを特徴とする、態様27記載の方法:
-N8がAもしくはGである;
-N7がCである;
-N6がA、CもしくはGである。
[態様29]スモールガイドアンチセンスオリゴヌクレオチド(sgASO)の設計方法であって、
1)標的RNA上に、存在確率の高いステムループを同定する工程、
2)該ステムループを評価する工程、および
3)該ステムループを形成する塩基対の3’側直後から7塩基を標的配列(センス鎖)とし、そのアンチセンス鎖をsgASO配列として同定する工程
を含み、
ここで、1)標的RNA上に、存在確率の高いステムループを同定する工程は、
i)5’末端からR塩基刻みでW塩基の幅の枠nを設定し、該枠nは標的RNAからnmax個得られ、それぞれの枠nにおいて、構成するW塩基の塩基配列についてパターンマッチングによって取り得る塩基対パターンを算出し、その結果に公知の熱力学的安定性計算を適用し、それぞれの塩基対パターンに対してΔGとして与えることを含む、構造予測ステップと、
ii)枠nにおいてmmax(n)個得られている予測構造結果とそれぞれのエネルギー量から該RNAがおかれている細胞内での状態が平衡状態であることを仮定し、予測構造結果それぞれの存在確率をマクスウェル=ボルツマン統計に従って算出し、ここで、n枠目での構造予測結果のうち最安定構造からm番目の予測結果について、その存在確率をおのおのj(n,m)とすることを含む、構造解析ステップと、
iii)枠内ではなく配列上の絶対位置xから始まり、構成するループとステムの特徴プロファイル(ステムを構成する塩基対の塩基の位置で定義されるステムループの個性)をpとした時に、当該ステムループをmotif(x,p)と呼び、motif(x,p)の枠n内での存在確率を、部分的な存在確率P_local(x,p,n)とし、その値は、枠nにおいて得られた構造予測結果すべてについての中で当該ステムループが存在する構造予測結果についてのj値の総和Σj(n,m)であるとすることを含む、局所存在確率計算ステップ、ここで、枠nにおける、motif(x,p)の局所的な存在確率P_local(x,p,n)は以下で表され:
iv)P_local(x,p,n)について枠1からnmaxまで総和をとった結果をΣP_local(x,p,n)、ステムループmotif(x,p)を構成する配列全長が枠内におさまることのできる枠の数をn_all(x,p)個としたとき、全体の中でのmotif(x,p)の存在確率P_global(x,p)をΣP_local(x,p,n)/n_all(x,p)として表すことを含む、存在確率計算ステップ、ここで、motif(x,p)についての全体の中での存在確率P_global(x,p)は以下で表され:
v)得られたmotif(x、p)についての存在確率P_global(x,p)に対して、存在確率および特徴pから、ステムループを選択する解析ステップ
を含む、方法。
1)標的RNAに相補的な6merから10merのオリゴヌクレオチド(sgASO)がハイブリダイズすることによって、少なくとも1つのステムループ構造が形成される配列を標的RNA配列中に同定する工程、
2)該sgASOを調製して、真核細胞内において標的RNAと接触させる工程、
を含み、
該sgASOがハイブリダイズして形成されるステムループ構造を真核細胞内のtRNaseZLが認識して標的RNAを切断することを特徴とする、方法。
[態様2]該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のステム部分の塩基対数が11から14である、態様1記載の方法。
[態様3]該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のステム部分の塩基対数が12である、態様1または2記載の方法。
[態様4]sgASOが7merである、態様1~3のいずれか記載の方法。
[態様5]該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のうち、標的RNAによって形成されるステム部分の塩基対数が5である、態様1~4のいずれか記載の方法。
[態様6]該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のうち、ループ部分が標的RNAによって形成されることを特徴とする、態様1~5のいずれか記載の方法。
[態様7]該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のループ部分の塩基数が3から10である、態様1~6のいずれか記載の方法。
[態様8]該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のループ部分の塩基数が4から8である、態様1~7のいずれか記載の方法。
[態様9]該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のループ部分の塩基数が7である、態様1~8のいずれか記載の方法。
[態様10]該sgASOが標的RNAに完全に相補的であることを特徴とする、態様1~9のいずれか記載の方法。
[態様11]該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のステム部分がミスマッチまたはバルジを含まない、態様1~10のいずれか記載の方法。
[態様12]該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のステム部分がミスマッチまたはバルジを含む、態様1~10のいずれか記載の方法。
[態様13]ステム部分の塩基対数の計数において、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が2以下の場合は、ミスマッチまたはバルジが塩基対を形成するとみなしてカウントし、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が3以上の場合は、ミスマッチまたはバルジの塩基数の2分の1の数を塩基対数としてカウントする、態様12記載の方法。
[態様14]標的RNAがmRNAまたはncRNAである、態様1~13のいずれか記載の方法。
[態様15]標的RNAが核ゲノム由来のRNAである、態様1~14のいずれか記載の方法。
[態様16]標的RNAがミトコンドリアゲノム由来のRNAである、態様1~14のいずれか記載の方法。
[態様17]標的RNAがウイルスゲノムまたは細菌ゲノム由来のRNAである、態様1~14のいずれか記載の方法。
[態様18]sgASOが修飾ヌクレオシドおよび/または修飾ヌクレオシド間結合を含む、態様1~17のいずれか記載の方法。
[態様19]標的RNAによって形成されるステム部分の5’側配列と3’側配列の塩基数の差が1以下である、態様1~18のいずれか記載の方法。
[態様20]該sgASOの末端水酸基の一方または両方が修飾されている、態様1~19のいずれか記載の方法。
[態様21]該sgASOの末端水酸基の一方または両方にリン酸基が付加されている、態様1~20のいずれか記載の方法。
[態様22]標的RNA上のsgASOが結合する領域の5’側から構成する塩基をN1、N2、N3、N4、N5、N6、N7とし、さらにsgASOが結合する領域の3’側に隣接する最初の塩基をN8とした場合に、以下の条件1~3の少なくとも一つが満たされることを特徴とする、態様1~21のいずれか記載の方法:
-条件1:N8がAもしくはGである;
-条件2:N7がCである;
-条件3:N6がA、CもしくはGである。
[態様23]sgASOが配列番号1から配列番号16384のいずれか1つの配列から成るオリゴヌクレオチドである、態様1~22のいずれか記載の方法。
[態様24]約7merのオリゴヌクレオチドを含む、患者における疾患または障害の治療または予防に用いるための医薬組成物であって、
該約7merのオリゴヌクレオチドが、疾患または障害に関連する標的RNAに相補的であり、
該標的RNAが少なくとも1つのステムループ構造を形成することができ、
該約7merのオリゴヌクレオチドが該ステムループ構造の3’側の領域にハイブリダイズして、該標的RNAが形成するステムループと合わせて少なくとも1つのより大きなステムループ構造を形成することができ、
形成された構造が患者体内のtRNaseZLによって認識されて、標的mRNAが切断されることを特徴とする、医薬組成物。
[態様25]癌の治療もしくは予防のための医薬組成物であって、以下から選択されるいずれかの配列を含むsgASOを含む、医薬組成物:
5’-GAAACUU-3’;
5’-CUGUCAA-3’;
5’-UCUUCAA-3’;
5’-UUAUCGU-3’;
5’-CUUAUAA-3’;
5’-GCGGGGG-3’;
5’-ACUCAAA-3’。
[態様26]真核細胞内の標的RNAを切断するためのオリゴヌクレオチド(sgASO)の設計方法であって、
1)標的RNA配列中に少なくとも1つのステムループ構造が形成される配列を同定する工程、
2)該ステムループ構造に隣接する3’側の6~10塩基の配列をsgASOの結合配列として同定する工程、および
3)該結合配列に相補的な配列をsgASOの配列として同定する工程
を含む、方法。
[態様27]態様25記載のオリゴヌクレオチド(sgASO)の設計方法であって、
i)標的RNAによって形成されるステムループ構造のステム部分の塩基対数が4~8であり、
ii)該ステムループ構造のループ部分の塩基数が3から10であり、
iii)該ステムループ構造のステム部分がミスマッチまたはバルジを含む場合、ステム部分の塩基対数の計数において、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が2以下の場合は、ミスマッチまたはバルジが塩基対を形成するとみなしてカウントし、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が3以上の場合は、ミスマッチまたはバルジの塩基数の2分の1の数を塩基対数としてカウントし、そして
iv)該ステム部分の5’側配列と3’側配列の塩基数の差が1以下である、
方法。
[態様28]標的RNA上のsgASOが結合する領域の5’側から構成する塩基をN1、N2、N3、N4、N5、N6、N7とし、さらにsgASOが結合する領域の3’側に隣接する最初の塩基をN8とした場合に、以下の条件1~3の少なくとも一つが満たされることを特徴とする、態様27記載の方法:
-N8がAもしくはGである;
-N7がCである;
-N6がA、CもしくはGである。
[態様29]スモールガイドアンチセンスオリゴヌクレオチド(sgASO)の設計方法であって、
1)標的RNA上に、存在確率の高いステムループを同定する工程、
2)該ステムループを評価する工程、および
3)該ステムループを形成する塩基対の3’側直後から7塩基を標的配列(センス鎖)とし、そのアンチセンス鎖をsgASO配列として同定する工程
を含み、
ここで、1)標的RNA上に、存在確率の高いステムループを同定する工程は、
i)5’末端からR塩基刻みでW塩基の幅の枠nを設定し、該枠nは標的RNAからnmax個得られ、それぞれの枠nにおいて、構成するW塩基の塩基配列についてパターンマッチングによって取り得る塩基対パターンを算出し、その結果に公知の熱力学的安定性計算を適用し、それぞれの塩基対パターンに対してΔGとして与えることを含む、構造予測ステップと、
ii)枠nにおいてmmax(n)個得られている予測構造結果とそれぞれのエネルギー量から該RNAがおかれている細胞内での状態が平衡状態であることを仮定し、予測構造結果それぞれの存在確率をマクスウェル=ボルツマン統計に従って算出し、ここで、n枠目での構造予測結果のうち最安定構造からm番目の予測結果について、その存在確率をおのおのj(n,m)とすることを含む、構造解析ステップと、
iii)枠内ではなく配列上の絶対位置xから始まり、構成するループとステムの特徴プロファイル(ステムを構成する塩基対の塩基の位置で定義されるステムループの個性)をpとした時に、当該ステムループをmotif(x,p)と呼び、motif(x,p)の枠n内での存在確率を、部分的な存在確率P_local(x,p,n)とし、その値は、枠nにおいて得られた構造予測結果すべてについての中で当該ステムループが存在する構造予測結果についてのj値の総和Σj(n,m)であるとすることを含む、局所存在確率計算ステップ、ここで、枠nにおける、motif(x,p)の局所的な存在確率P_local(x,p,n)は以下で表され:
iv)P_local(x,p,n)について枠1からnmaxまで総和をとった結果をΣP_local(x,p,n)、ステムループmotif(x,p)を構成する配列全長が枠内におさまることのできる枠の数をn_all(x,p)個としたとき、全体の中でのmotif(x,p)の存在確率P_global(x,p)をΣP_local(x,p,n)/n_all(x,p)として表すことを含む、存在確率計算ステップ、ここで、motif(x,p)についての全体の中での存在確率P_global(x,p)は以下で表され:
v)得られたmotif(x、p)についての存在確率P_global(x,p)に対して、存在確率および特徴pから、ステムループを選択する解析ステップ
を含む、方法。
本発明者らは、比較的短いオリゴヌクレオチドを用いて、効率よく細胞内における遺伝子発現を調節する手法を開発した。以下に、本発明を詳細に説明する。
TRUEジーンサイレンシング
本発明の発明者らは、TRUEジーンサイレンシング(tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing)と名付けた新しい遺伝子発現抑制技術を開発している。tRNase ZLは、tRNAの3’末端部をプロセシングするエンドリボヌクレアーゼ(tRNase Zまたは3’tRNase)の分子量の大きい種類の酵素であり、前駆体tRNAの3’末端部を切除する。このTRUEジーンサイレンシングは、標的RNAと合成スモールガイドアンチセンス核酸とによって形成されるpre-tRNA様またはマイクロpre-tRNA様複合体を認識することによって、いかなるRNAの任意箇所をも切断することができるという哺乳動物tRNase ZLのユニークな酵素的特性に基づいている。スモールガイドアンチセンスオリゴヌクレオチド(特にスモールガイドRNA)は、5’-half tRNA(Nashimoto,M. (1996) Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5’ half tRNA by mammalian tRNA 3’ processing endoribonuclease. RNA, 2, 2523-2524.)、12~16-nt直鎖RNA(Shibata,H.S., Takaku,H., Takagi,M. and Nashimoto,M. (2005) The T ループ structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem., 280, 22326-22334.)、ヘプタマー型RNA(Nashimoto,M., Geary,S., Tamura,M. and Kasper,R. (1998) RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3’ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res., 26, 2565-2571.)およびフック型RNA(Takaku,H., Minagawa,A., Takagi,M. and Nashimoto,M. (2004) A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3’ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res., 32, e91.)の4種に分けられる。
本発明の発明者らは、TRUEジーンサイレンシング(tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing)と名付けた新しい遺伝子発現抑制技術を開発している。tRNase ZLは、tRNAの3’末端部をプロセシングするエンドリボヌクレアーゼ(tRNase Zまたは3’tRNase)の分子量の大きい種類の酵素であり、前駆体tRNAの3’末端部を切除する。このTRUEジーンサイレンシングは、標的RNAと合成スモールガイドアンチセンス核酸とによって形成されるpre-tRNA様またはマイクロpre-tRNA様複合体を認識することによって、いかなるRNAの任意箇所をも切断することができるという哺乳動物tRNase ZLのユニークな酵素的特性に基づいている。スモールガイドアンチセンスオリゴヌクレオチド(特にスモールガイドRNA)は、5’-half tRNA(Nashimoto,M. (1996) Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5’ half tRNA by mammalian tRNA 3’ processing endoribonuclease. RNA, 2, 2523-2524.)、12~16-nt直鎖RNA(Shibata,H.S., Takaku,H., Takagi,M. and Nashimoto,M. (2005) The T ループ structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL. J. Biol. Chem., 280, 22326-22334.)、ヘプタマー型RNA(Nashimoto,M., Geary,S., Tamura,M. and Kasper,R. (1998) RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3’ processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res., 26, 2565-2571.)およびフック型RNA(Takaku,H., Minagawa,A., Takagi,M. and Nashimoto,M. (2004) A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3’ terminal nucleotides from RNA molecules. Nucleic Acids Res., 32, e91.)の4種に分けられる。
これまでに、様々なmRNAを標的とするスモールガイドアンチセンスオリゴヌクレオチド(sgASO)を、その発現プラスミドまたは2’-O-メチル化RNAを導入することによって、様々な哺乳動物細胞におけるTRUEジーンサイレンシングの有効性が実証されている。例えば、Jurkat細胞におけるHIV-1発現は、5’-half tRNA型sgRNAによって18日間以上抑制され(上掲のHabu et al. (2005))、マウス肝臓におけるルシフェラーゼ発現はヘプタマー型sgASOによって抑制された(上掲のNakashima et al. (2007))。さらに、TRUEジーンサイレンシングの効果は、RNA干渉(RNA interference:RNAi)と同等であり、幾つかの場合ではRNAiの効果を凌ぐことも確認されている。
tRNase ZLが核内だけでなくサイトゾルにも存在すること、そしてsgASOとして使用していたのと同一の5’-half tRNAが細胞質に存在することが見出されている。また、ヒトサイトゾルtRNase ZLが、5’-half tRNAの指揮のもとでmRNAを切断することによって遺伝子発現を調節すること、そしてPPM1F mRNAがtRNase ZLの真の標的の一つであることが見出されている(Elbarbary,R.A., Takaku,H., Uchiumi,N., Tamiya,H., Abe,M., Takahashi,M., Nishida,H. and Nashimoto,M. (2009) Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA. PLoS ONE, 4, e5908.)。さらにまた、miR-103を含むマイクロRNAの一部がフック型sgASOとして働き、サイトゾルtRNase ZLによるmRNA切断を介して遺伝子発現を下方調節し得ることが証明されている(Elbarbary,R.A., Takaku,H., Uchiumi,N., Tamiya,H., Abe,M., Nishida,H. and Nashimoto,M. (2009) Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA. FEBS Lett., 583, 3241-3246.)。以上のことから、TRUEジーンサイレンシングは、細胞内の小さな非コードRNAによって作動されるサイトゾルtRNase ZLの新たに解明された生理学的役割を基礎として機能していることは明らかである。
TRUEジーンサイレンシングの最終的な目的の一つは、特定遺伝子の発現を原因とする疾患治療剤または予防剤としてのsgASOの使用である。例えば、発明者らは以前に、癌治療の分子標的として有望視されているBcl-2およびVEGFをコードする細胞内mRNAレベルが、5’-half tRNA型sgASO、14-nt直鎖型sgASOまたはヘプタマー型sgASOによって発現抑制されることを見出している(上掲のTamura et al.(2003)およびElbarbary et al. (2009))。本発明の態様の一つは、真核細胞内の標的RNAを切断するための方法であって、(1)標的RNAに相補的な6merから10merのオリゴヌクレオチド(sgASO)がハイブリダイズすることによって、少なくとも1つのステムループ構造が形成される配列を標的RNA配列中に同定する工程、および(2)該sgASOを調製して、真核細胞内において標的RNAと接触させる工程を含み、該sgASOがハイブリダイズして形成されるステムループ構造を真核細胞内のtRNaseZLが認識して標的RNAを切断することを特徴とする方法に関する。本方法は、in vitroでも、in vivoでも適用されうる。ヒトもしくは非ヒト動物に対してin vivoで適用される場合、このような、真核細胞内の標的RNAを切断するための方法は、望ましくない遺伝子の発現に関係する疾患または障害の治療のために用いられうる。したがって、別の観点からは、本発明の態様の一つは、ヒトもしくは非ヒト動物における望ましくない遺伝子の発現に関係する疾患または障害の治療のための方法であって、(1)疾患に関係する遺伝子から転写された標的RNAに相補的な6merから10merのオリゴヌクレオチド(sgASO)がハイブリダイズすることによって、少なくとも1つのステムループ構造が形成される配列を標的RNA配列中に同定する工程、および(2)該sgASOを調製して、ヒトもしくは非ヒト動物に投与し、その細胞内において標的RNAと接触させる工程を含み、該sgASOがハイブリダイズして形成されるステムループ構造を該細胞内のtRNaseZLが認識して標的RNAを切断することを特徴とする方法に関する。対象とする疾患は、例えば、癌でありうる。
スモールガイドアンチセンス核酸(sgASO)
一つの態様において、スモールガイドアンチセンス核酸は、比較的短いオリゴヌクレオチドであり、例えば6merから10mer、つまり、6mer、7mer、8mer、9mer、または10mer、好ましくは7merのオリゴヌクレオチド(ヘプタマー型sgASO)である。sgASOを薬剤成分とする場合、薬理学的およびCMC(Chemistry,Manufacturing and Control)の視点からは、より短いsgASOが好ましい。何故ならば、より短いsgASOは長鎖のsgASOよりも簡便かつ安価に合成することができる。また、より短いsgASOは、細胞導入剤(トランスフェクション試薬等)およびDDS基剤を用いることなく容易に細胞内に取込ませることができる(Loke,S.L., Stein,C.A., Zhang X.H., Mori,K., Nakanishi,M., Subasinghe,C., Cohen,J.S. and Neckers,L.M. (1989) Characterization of oligonucleotide transport into living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3474-3478.)。実際の応用において、合成上の利点や、配列認識の特異性の観点からは、7merのオリゴヌクレオチドが好ましいとされ得る。
一つの態様において、スモールガイドアンチセンス核酸は、比較的短いオリゴヌクレオチドであり、例えば6merから10mer、つまり、6mer、7mer、8mer、9mer、または10mer、好ましくは7merのオリゴヌクレオチド(ヘプタマー型sgASO)である。sgASOを薬剤成分とする場合、薬理学的およびCMC(Chemistry,Manufacturing and Control)の視点からは、より短いsgASOが好ましい。何故ならば、より短いsgASOは長鎖のsgASOよりも簡便かつ安価に合成することができる。また、より短いsgASOは、細胞導入剤(トランスフェクション試薬等)およびDDS基剤を用いることなく容易に細胞内に取込ませることができる(Loke,S.L., Stein,C.A., Zhang X.H., Mori,K., Nakanishi,M., Subasinghe,C., Cohen,J.S. and Neckers,L.M. (1989) Characterization of oligonucleotide transport into living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3474-3478.)。実際の応用において、合成上の利点や、配列認識の特異性の観点からは、7merのオリゴヌクレオチドが好ましいとされ得る。
本発明に係るsgASOは、公知の化学合成を用いる方法、あるいは酵素的転写法等にて製造することができる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法等をあげることができ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機(アプライドバイオシステムズ社製)やNTS H-6核酸合成機(日本テクノサービス社製)、Oligoilot10核酸合成機(GEヘルスケア社製)により合成することができる。酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有するプラスミドまたはDNAを鋳型として、T7、T3、SP6RNAポリメラーゼ等のRNAポリメラーゼを用いた転写をあげることができる。合成法または転写法により製造したヘプタマー型sgASOは、次いでHPLC等にて精製する。例えばHPLC精製時には、triethylammonium acetate(TEAA)またはhexylammonium acetate(HAA)とアセトニトリルの混合溶液を用いて、sgASOをカラムから溶出する。その後、溶出体積の1000倍量の蒸留水で溶出溶液を10時間透析し、透析溶液を凍結乾燥した後、使用時まで冷凍保存する。使用時には、例えば、蒸留水で最終濃度が100μM程度になるように溶解する。
本発明に係るsgASOに用いられる核酸としては、ヌクレオシドまたはそのヌクレオシドと同等の機能を有する分子がヌクレオシド間結合を介して重合した分子であればいかなるものでもよい。ヌクレオシドは、塩基(核酸塩基)と糖が結合した化合物の一種である。塩基としては、アデニン、グアニンなどのプリン塩基、チミン、シトシン、ウラシルなどのピリミジン塩基、ニコチンアミド、ジメチルイソアロキサジンなどを含む。アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジンなどが代表的なヌクレオシドである。ヌクレオチドとは、ヌクレオシドにリン酸基が結合した物質である。オリゴヌクレオチド(ポリヌクレオチドとも言う)としては、例えばリボヌクレオチドの重合体であるRNA、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるDNA、RNAおよびDNAが混合した重合体、修飾ヌクレオシドを含むヌクレオチド重合体が、それぞれあげられる。天然のDNA、RNAはヌクレオシド間結合として、ホスホジエステル結合を有している。本発明に係るsgASOに用いられる核酸は、修飾を含むものであってもよい。核酸修飾の位置には、糖部分、骨格(連結)部分、核酸塩基(塩基)部分、3’または5’末端部分が含まれる。また、本発明において用いられるsgASOには、モルホリノ核酸、ペプチド核酸が含まれていてもよい。
修飾ヌクレオシド
修飾ヌクレオシドとしては、例えばRNAまたはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上または安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、あるいは可視化させるために、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、RNAまたはDNAに修飾を施した分子を挙げるこことができる。例えば、糖部修飾ヌクレオシドがあげられる。本発明のsgASOは、例えば、Khvorova & Watts(Nature Biotechnology 35, 238-248 (2017) doi:10.1038/nbt.3765)に開示の修飾核酸分子を含んでいてもよい。
修飾ヌクレオシドとしては、例えばRNAまたはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上または安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、あるいは可視化させるために、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、RNAまたはDNAに修飾を施した分子を挙げるこことができる。例えば、糖部修飾ヌクレオシドがあげられる。本発明のsgASOは、例えば、Khvorova & Watts(Nature Biotechnology 35, 238-248 (2017) doi:10.1038/nbt.3765)に開示の修飾核酸分子を含んでいてもよい。
修飾糖とは、天然糖部分(すなわち、DNA(2’-H)またはRNA(2’-OH)中に認められる糖部分)からの置換および/または任意の変化を有する糖を指し、糖部修飾ヌクレオシドとは、修飾糖を含む修飾ヌクレオシドを指す。糖部修飾ヌクレオシドとは、ヌクレオシドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学構造物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、2’-O-メチルリボースで置換された修飾ヌクレオシド、2’-O-プロピルリボースで置換された修飾ヌクレオシド、2’-メトキシエトキシリボースで置換された修飾ヌクレオシド、2’-O-メトキシエチルリボースで置換された修飾ヌクレオシド、2’-O-[2-(グアニジウム)エチル]リボースで置換された修飾ヌクレオシド、2’-O-フルオロリボースで置換された修飾ヌクレオシド、糖部に架橋構造を導入することにより2つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)、より具体的には、2’位の酸素原子と4’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid:LNA)、エチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid:ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004)]等があげられ、さらにペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]、およびペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等をあげることができる。
RNAの2’-O-メチル(2’-OMe)修飾(2’-OMe-RNA)は、天然にも存在する修飾であり、修飾オリゴヌクレオチドの結合親和性とヌクレアーゼ耐性を向上させると共に、免疫刺激性を低下させる。2’-O-メトキシエチル(2’-MOE)は、ヌクレアーゼ耐性が2’-OMe修飾よりもさらに増加しており、修飾ヌクレオチドの結合親和性(ΔTm)も大幅に上昇している。2’-OMeを含有するsgASOは、tRNaseZLによる認識と切断にも適合する。RNAの2’-フルオロ(2’-F)修飾(2’-F-RNA)を用いてオリゴヌクレオチドの親和性を増加させることもできる。他の2’修飾核酸としては、2’-F-ANAや、関根らの2’―修飾誘導体(特許第5194256号、特開2015-020994)を挙げることができる。
リボースの2’酸素と4’炭素を連結したLNA(Locked nucleic acid)は、結合親和性に大幅な増加をもたらす。LNAでは、RNAのリボース糖の2’酸素と4’炭素が環構造において固定されている。この修飾は、特異性、親和性、および半減期を増加させ、目的の組織への効果的な送達を、より低い毒性で可能とする。LNAで完全に修飾された約8ヌクレオチドよりも長いオリゴマーは凝集する傾向があることが知られており、一般的には、DNAや他の糖部修飾核酸との混合で用いられる。LNAを含有するsgASOは、tRNaseZLによる認識と切断にも適合する。
LNAのメチル化類似体であるcEtもLNAと同様に有用である。トリシクロ-DNA(tcDNA)は、3環骨格に基づく拘束型ヌクレオチドである。
修飾ヌクレオシドとしては、その他に、核酸の塩基部分の原子(例えば、水素原子、酸素原子)もしくは官能基(例えば、水酸基、アミノ基)が他の原子(例えば、水素原子、硫黄原子)、官能基(例えば、アミノ基)、もしくは炭素数1~6のアルキル基で置換されたものまたは保護基(例えばメチル基またはアシル基)で保護されたもの、ヌクレオシドに、例えば脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素など、別の化学物質を付加した分子等を用いてもよい。
修飾核酸塩基(または修飾塩基)には、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、またはウラシル以外のあらゆる核酸塩基が含まれるが、例えば、5-メチルシトシン、5-フルオロシトシン、5-ブロモシトシン、5-ヨードシトシン、N4-メチルシトシン、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-ヨードウラシル、2-チオチミン、N6-メチルアデニン、8-ブロモアデニン、N2-メチルグアニン、8-ブロモグアニン、およびイノシンなどが挙げられる。
ヌクレオシド間結合
天然のDNA、RNAはヌクレオシド間結合として、ホスホジエステル結合を有している。本発明の一つの態様においては、ヌクレオシド間結合は、修飾を含んでいてもよい。修飾ヌクレオシド間結合とは、天然に存在するヌクレオシド間結合(すなわち、ホスホジエステル結合)からの置換または任意の変化を有するヌクレオシド間結合を指し、修飾ヌクレオシド間結合には、リン原子を含むヌクレオシド間結合、およびリン原子を含まないヌクレオシド間結合が含まれる。修飾ヌクレオシド間結合としては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学物質を付加あるいは置換したものでもよく、例えば、ホスホロチオエート結合に置換された修飾ヌクレオシド間結合、N3’-P5’ホスフォアミデート結合に置換された修飾ヌクレオシド間結合等をあげることができる。他の修飾ヌクレオシド間結合としては(SC5’Rp)-α,β-CNA、PMOなどが挙げられる。
天然のDNA、RNAはヌクレオシド間結合として、ホスホジエステル結合を有している。本発明の一つの態様においては、ヌクレオシド間結合は、修飾を含んでいてもよい。修飾ヌクレオシド間結合とは、天然に存在するヌクレオシド間結合(すなわち、ホスホジエステル結合)からの置換または任意の変化を有するヌクレオシド間結合を指し、修飾ヌクレオシド間結合には、リン原子を含むヌクレオシド間結合、およびリン原子を含まないヌクレオシド間結合が含まれる。修飾ヌクレオシド間結合としては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学物質を付加あるいは置換したものでもよく、例えば、ホスホロチオエート結合に置換された修飾ヌクレオシド間結合、N3’-P5’ホスフォアミデート結合に置換された修飾ヌクレオシド間結合等をあげることができる。他の修飾ヌクレオシド間結合としては(SC5’Rp)-α,β-CNA、PMOなどが挙げられる。
代表的なリン含有ヌクレオシド間結合としては、例えば、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホトリエステル結合、およびメチルホスホネート結合、メチルチオホスホネート結合、ボラノホスフェート結合、ホスホロアミデート結合を挙げることができる。
主要な修飾ヌクレオシド間結合の一つであるホスホロチオエート(PS)結合は、ヌクレアーゼによる分解からオリゴヌクレオチドを保護するのに役立つ。ホスホロジチオエート(PS)修飾は、もともとはヌクレアーゼ耐性を付与するためにオリゴヌクレオチドに組み込まれたものであるが、この修飾は、オリゴヌクレオチドの輸送と取り込みにも大きな影響を与える。PSは、ASOの電荷を変えることによって、受容体部位および血漿タンパク質への結合を増加させ、標的組織に到達するASOの量を増加させる。ヘパリン結合タンパク質は、ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドの最も親和性の高い標的の一つである。血漿タンパク質による適切な結合は、腎臓系による血液からの迅速な排除を抑制し、最適な送達を促進する。ホスホチオエート結合を有するsgASOは、tRNaseZLによる認識と切断にも適合する。
ホスホロチオエート結合は、リン原子部分に立体中心を有しており、完全修飾オリゴヌクレオチドは通常、2n-1種のジアステレオマーの混合物となる(例えば、7merのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、26種のジアステレオマーの混合物となる)。SpおよびRpジアステレオマー結合は、異なる特性を示すことが知られている。Rpジアステレオマーは、Spジアステレオマーよりもヌクレアーゼ耐性が低いが、より高い親和性で相補鎖と結合する。本発明のsgASOにおいては、特定のホスホロチオエート結合が特定のジアステレオマーとなるように合成を制御してもよい。
リガンド等を連結したオリゴヌクレオチド/末端修飾オリゴヌクレオチド
核酸に別の化学物質を付加した分子としては、例えば、5’-ポリアミン付加誘導体、コレステロール付加誘導体、ステロイド付加誘導体、胆汁酸付加誘導体、ビタミン付加誘導体、Cy5付加誘導体、Cy3付加誘導体、6-FAM付加誘導体、ビオチン付加誘導体等および北出らの誘導体(PCT/JP2007/000087、PCT/JP2016/59398)をあげることができる。リガンド等を付加する部位は、オリゴヌクレオチドの末端(5’末端または3’末端)および/またはオリゴヌクレオチドの内部でありうる。
核酸に別の化学物質を付加した分子としては、例えば、5’-ポリアミン付加誘導体、コレステロール付加誘導体、ステロイド付加誘導体、胆汁酸付加誘導体、ビタミン付加誘導体、Cy5付加誘導体、Cy3付加誘導体、6-FAM付加誘導体、ビオチン付加誘導体等および北出らの誘導体(PCT/JP2007/000087、PCT/JP2016/59398)をあげることができる。リガンド等を付加する部位は、オリゴヌクレオチドの末端(5’末端または3’末端)および/またはオリゴヌクレオチドの内部でありうる。
末端修飾の例として、GalNAc連結オリゴヌクレオチドやPUFA連結オリゴヌクレオチドが知られている。GalNAcを末端に連結することにより、オリゴヌクレオチドの肝臓への送達効率を高めることができる。本発明において用いられるsgASOには、GalNAcなどのリガンドが連結されていてもよい。
短いオリゴヌクレオチドは、腎臓に多く送達され、長いオリゴマーは肝臓に多く送達される傾向がある。短いオリゴヌクレオチドは、血漿タンパク質に結合しにくく、結果として血漿中の半減期が短くなる傾向があるが、切断可能なリンカーなどを用いて多量体を構築することが可能である。本発明において用いられるsgASOは、切断可能なリンカーなどを用いて、他のsgASOに連結されていてもよい。
本発明に係るsgASOは、5’末端および/または3’末端にリン酸基が付加されていてもよい。他の末端修飾としては、E-VP、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、C-メチルアナログなどがあり、オリゴヌクレオチドの安定性を高めることが知られている。本発明において用いられるsgASOは、これらの末端修飾を含んでいてもよい。
sgASOの配列設計
本発明に係るsgASOは、塩基対合を介して標的RNAとtRNAアクセプターステム様二重鎖を形成することによって、tRNase ZLによる標的RNAの特異的切断を可能とするため、sgASOの標的部位は、tRNA Tアームに類似する安定したヘアピン構造領域の直下となる。sgASOはその7塩基だけでなく、安定したヘアピン構造を形成する配列領域の特異性によって効果的にRNAを切断する。したがって、sgASOの塩基配列は、標的遺伝子のmRNA配列情報に基づき設計することができる。
本発明に係るsgASOは、塩基対合を介して標的RNAとtRNAアクセプターステム様二重鎖を形成することによって、tRNase ZLによる標的RNAの特異的切断を可能とするため、sgASOの標的部位は、tRNA Tアームに類似する安定したヘアピン構造領域の直下となる。sgASOはその7塩基だけでなく、安定したヘアピン構造を形成する配列領域の特異性によって効果的にRNAを切断する。したがって、sgASOの塩基配列は、標的遺伝子のmRNA配列情報に基づき設計することができる。
本発明の態様の一つは、上述のとおり、真核細胞内の標的RNAを切断するための方法であって、(1)標的RNAに相補的な6merから10merのオリゴヌクレオチド(sgASO)がハイブリダイズすることによって、少なくとも1つのステムループ構造が形成される配列を標的RNA配列中に同定する工程、および(2)該sgASOを調製して、真核細胞内において標的RNAと接触させる工程を含み、該sgASOがハイブリダイズして形成されるステムループ構造を真核細胞内のtRNaseZLが認識して標的RNAを切断することを特徴とする方法に関する。
tRNAのアクセプターステムとTアームは、立体構造上は直列して一本のステムループ構造をとっており、tRNase ZLはこのステムループ構造を認識して、RNAの切断を行うと考えられる。よって、sgASOと標的RNAとがハイブリダイズすることにより、このようなアクセプターステムとTアームが形成する構造と類似の一本のステムループ構造を再現できれば、標的RNAの切断も可能となる。
例えば、ヒトのグルタミン酸tRNAの場合、アクセプターステムは7塩基長であり、Tアームのステム部分は5塩基長であり、Tアームのループ部分は7塩基長である。よって、アクセプターステムに対応するsgASOは、例えば、7塩基長であり得るが、必ずしもこれに限定はされない。本発明に係るsgASOの長さは、例えば、6~10merであり得る。また、標的RNAが形成するTアーム様のステムループ構造は、ステム部分が5塩基長であり、ループ部分が7塩基であり得るが、必ずしもこれに限定はされない。標的RNAが形成するTアーム様ステムループ構造のステム部分の長さは、例えば、4~8塩基長であり得る。ループ部分の塩基数は、例えば、3~10塩基であることができ、好ましくは4~8塩基である。さらに、sgASOの長さと、標的RNAが形成するTアーム様のステムループ構造のステム部分の長さの和は、12塩基長であり得るが、これも必ずしもそれに限定はされない。この長さの和は、例えば、11~14塩基であり得る。ただし、実際の応用において、合成上の利点や、配列認識の特異性の観点からは、sgASOは7merのオリゴヌクレオチドであることが好ましいとされ得る。また、標的RNAが形成するTアーム様のステムループ構造については、安定性や存在確率の観点から、ステム部分の長さが5塩基長であることが好ましいとされ得る。また、同様な観点から、標的RNAが形成するTアーム様のステムループ構造については、ステム部分の2本の鎖の長さが均等(ループを挟んでステムの5’側配列と3’側配列の塩基数の差が1つ以内)であって、ループ部分の長さが10を超えないものが好ましいとされ得る。
sgASOの配列設計においては、本発明者らが行ったtRNA遺伝子の配列解析の結果に基づき、標的RNA上のsgASOが結合する領域の5’側から構成する塩基をN1、N2、N3、N4、N5、N6、N7とし、さらにsgASOが結合する領域の3’側に隣接する最初の塩基をN8とした場合に、以下の条件1~3の少なくとも1つを満たすように配列を設計してもよく、条件1~3の少なくとも2つ、あるいは条件1~3の全てを満たすように配列を設計してもよい:
-条件1:N8がAもしくはGである;
-条件2:N7がCである;
-条件3:N6がA、CもしくはGである。
-条件1:N8がAもしくはGである;
-条件2:N7がCである;
-条件3:N6がA、CもしくはGである。
標的RNAが形成するTアーム様のステムループ構造および/または標的RNAとsgASOとが形成するアクセプターステム様構造には、ワトソン-クリック型塩基対以外の非ワトソン-クリック型塩基対(例えばG-U結合)が含まれていてもよい。また、ステムにはミスマッチやバルジが含まれていてもよい。
sgASOが7merである場合は、sgASOは、配列番号1から配列番号16384のいずれか1つの配列から成るオリゴヌクレオチドでありうる。なお、本明細書において「配列番号n」は「SEQ ID NO:n」と表記する場合もある。配列番号1から配列番号16384の配列を以下の表に示す:
標的RNAが形成するTアーム様のステムループ構造を標的RNA中に同定するために、パターンマッチングおよび熱力学的安定性に基づく評価を行うという構造解析を行うことができる。構造解析のための計算においては、1)mRNAは一本鎖でタンパク質の関与なく自身のみで高次構造をとる、2)mRNAはリボソームによりタンパク質合成の最中にあっては全長ではなくリボソームとリボソームに挟まれたと仮定されるある部分としての一定長の部分配列で高次構造をとる、3)単一の一次構造のmRNA(あるいはその部分としての一定長の部分配列)は複数の高次構造をとることが想定されそれらは平衡状態にある(すなわちエネルギー量に応じて存在確率が分布している)、という作業仮説を置くことができる。内在性の部分構造の算出や評価については、この仮説を元に算出することができる。さらに、sgASOの設計は、sgASOと内在性の構造が形作る高次構造をtRNase ZLが認識しうるかという点について、内在性の構造として1)ループが10塩基以下、2)ステムが5塩基対、であるという仮説を置くことができる。パターンマッチングおよび熱力学的安定性に基づく構造解析においては網羅的に考えうるすべての構造を取り扱うこともできれば、一般的な構造予測ソフトウェアを用いて重要と思われる構造のみを算出することで解析を簡素化することもできる。構造予測には、例えば、vswindow、UNAFold、mfoldなどのソフトウェアを利用することができる。
構造予測に関しては、以下の参考文献を参照してもよい:
- Markham, N. R. & Zuker, M. (2005) DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res., 33, W577-W581;
- Markham, N. R. & Zuker, M. (2008) UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. In Keith, J. M., editor, Bioinformatics, Volume II. Structure, Function and Applications, number 453 in Methods in Molecular Biology, chapter 1, pages 3-31. Humana Press, Totowa, NJ. ISBN 978-1-60327-428-9.)。
- Markham, N. R. & Zuker, M. (2005) DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res., 33, W577-W581;
- Markham, N. R. & Zuker, M. (2008) UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. In Keith, J. M., editor, Bioinformatics, Volume II. Structure, Function and Applications, number 453 in Methods in Molecular Biology, chapter 1, pages 3-31. Humana Press, Totowa, NJ. ISBN 978-1-60327-428-9.)。
例えば、mRNAの5’末端からR塩基刻みでW塩基の幅の枠nを設定し(枠は、対象とするトランスクリプトからnmax個得られる)、それぞれの枠nにおいて、予測構造結果とそれぞれのエネルギー量から、当該mRNAがおかれている細胞内での状態が平衡状態であることを仮定して、予測構造結果それぞれの存在確率をマクスウェル=ボルツマン統計より算出する。ここで、n枠目での構造予測結果のうち最安定構造からm番目の予測結果(枠nにおいて、予測構造結果はmmax(n)個得られている)については、その予測された構造の存在確率をj(n,m)とすることができる。
ここで、各構造予測結果中それぞれに発見される部分構造として、ループ部位を1つだけ持ち、互いに相手とだけ相補的である1つのステムよりなるものをステムループ構造と定義する(ステムループ中のステムの「互いに相手とだけ相補的である」とは、他の予測構造枠であっても他のステムループを構成しないという意味ではなく、ある1つの予測構造結果において、単一のステムループ中に他のステムループの一部を決して含まないという意味である)。ここで、ステムにはミスマッチ(ステム中にある、塩基対に参加しない塩基が対向しているもの)やバルジ(ステム中にある、塩基対に参加しない塩基が対向していないもの)を含んでもよいが、両端は塩基対であるものとする。さらに、ステムループが内包するステムループも別個のステムループとみなす(例えば、ステムの最もループから遠い塩基対がほどけたものは、解けていないものと別のステムループとみなす)。
こうしたステムループを、枠内ではなく配列上の絶対位置xから始まり、構成するループとステムの特徴プロファイル(ステムを構成する塩基対の塩基の位置で定義されるステムループの個性)をpとした時に、motif(x,p)と呼ぶ。そして、motif(x,p)の枠n内での存在確率を、部分的な存在確率P_local(x,p,n)とし、その値は、n枠において得られた構造予測結果の中で当該ステムループが存在する構造についてのj値の総和すなわちΣj(n,m)であるとする。さらに、このP_local(x,p,n)について枠1からnmaxまで総和をとった結果をΣP_local(x,p,n)、当該ステムループを構成する配列全長が枠内におさまることのできる枠の数をn_all(x,p)個としたとき、全体の中でのmotif(x,p)の存在確率P_global(x,p)は、ΣP_local(x,p,n)/n_all(x,p)として表される。
標的RNA中に、P_global(x,p)が50%以上であってp1=“ステムが5塩基対”であるmotif(x,p1)を同定することができる。このうち、p2=“左右均等(ループを挟んでステムの5’側配列と3’側配列の塩基数の差が1つ以内)であって、ループの長さが10を超えないもの”であるmotif(x,p2)をさらに同定することができる。
ついで、motif(x,p2)のそれぞれのステムループ直後の7塩基に対してsgASOの結合サイトとすることができるが、以下の補正処理を行なってもよい:(1)ループ部分が3塩基と予測されているものはその次の塩基対をほどいて5塩基のループとなっていると想定する、(2)ステム中のミスマッチやバルジの塩基数が2以下の場合はそれを無視して塩基対数をカウントする、かつ/または(3)ステム中のミスマッチやバルジの塩基数が3以上の場合はミスマッチやバルジの塩基数の2分の1の数を塩基対数とカウントする。こうした処理によってステムループ構造の5塩基対目を特定し、その直後(3’側)をsgASO結合サイトとすることができる。
本発明の一つの態様は、真核細胞内の標的RNAを切断するためのオリゴヌクレオチド(sgASO)の設計方法であって、(1)標的RNA配列中に少なくとも1つのステムループ構造が形成される配列を同定する工程、(2)該ステムループ構造に隣接する3’側の6~10塩基の配列をsgASOの結合配列として同定する工程、および(3)該結合配列に相補的な配列をsgASOの配列として同定する工程を含む、方法に関する。
標的転写産物
標的RNAは、その発現を抑制または消失させる対象となる遺伝子(標的遺伝子)の転写産物RNA、特にmRNAであるが、ncRNAであってもよい。また、標的RNAとしては、核ゲノム由来のRNA、ミトコンドリアゲノム由来のRNA、ウイルスゲノムまたは細菌ゲノム由来のRNAなどが含まれる。本発明において用いられるsgASOは、必ずしも標的RNAに完全に相補的である必要はないが、典型的には、標的RNAに完全に相補的である。標的遺伝子の発現抑制とは、その遺伝子から転写合成されるタンパク質量が、25%以下、好ましくは50%以下、さらに好ましくは75%以下、特に好ましくは95%以下に低減することである。標的遺伝子は、その発現抑制または発現消失が産業上の利用価値を有する遺伝子であり、とくにその遺伝子の発現亢進が特定の疾患の原因となるような遺伝子(以下、病原遺伝子と記載することがある)。そのような病原遺伝子の例としては、例えば、ras、erbb2、myc、apc、brca1、rb、Bcl-2、BGEF癌遺伝子、レニンなどの高血圧に関与する遺伝子、インスリンなどの糖尿病関連遺伝子、LDLレセプターなどの高脂血症関連遺伝子、レプチンなどの肥満関連遺伝子、アンギオテンシンなどの動脈硬化疾患関連遺伝子、痴呆の原因として知られているアポリポタンパク質およびプレセリニン、老化に関連する遺伝子などが例示される。これらの遺伝子およびそのmRNA配列は公知のデータベース(NCBIヌクレオチドデータベース等)において公知である。
標的RNAは、その発現を抑制または消失させる対象となる遺伝子(標的遺伝子)の転写産物RNA、特にmRNAであるが、ncRNAであってもよい。また、標的RNAとしては、核ゲノム由来のRNA、ミトコンドリアゲノム由来のRNA、ウイルスゲノムまたは細菌ゲノム由来のRNAなどが含まれる。本発明において用いられるsgASOは、必ずしも標的RNAに完全に相補的である必要はないが、典型的には、標的RNAに完全に相補的である。標的遺伝子の発現抑制とは、その遺伝子から転写合成されるタンパク質量が、25%以下、好ましくは50%以下、さらに好ましくは75%以下、特に好ましくは95%以下に低減することである。標的遺伝子は、その発現抑制または発現消失が産業上の利用価値を有する遺伝子であり、とくにその遺伝子の発現亢進が特定の疾患の原因となるような遺伝子(以下、病原遺伝子と記載することがある)。そのような病原遺伝子の例としては、例えば、ras、erbb2、myc、apc、brca1、rb、Bcl-2、BGEF癌遺伝子、レニンなどの高血圧に関与する遺伝子、インスリンなどの糖尿病関連遺伝子、LDLレセプターなどの高脂血症関連遺伝子、レプチンなどの肥満関連遺伝子、アンギオテンシンなどの動脈硬化疾患関連遺伝子、痴呆の原因として知られているアポリポタンパク質およびプレセリニン、老化に関連する遺伝子などが例示される。これらの遺伝子およびそのmRNA配列は公知のデータベース(NCBIヌクレオチドデータベース等)において公知である。
医薬組成物
スモールガイドアンチセンス核酸はそれ単独で製剤化することもできるが、通常は薬理学的に許容される1つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として投与するのが望ましい。医薬組成物には、異なる配列を有する複数のsgASOの混合物が含まれていてもよい。
スモールガイドアンチセンス核酸はそれ単独で製剤化することもできるが、通常は薬理学的に許容される1つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として投与するのが望ましい。医薬組成物には、異なる配列を有する複数のsgASOの混合物が含まれていてもよい。
投与対象には、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物が含まれる。投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、静脈内および経皮などの非経口投与をあげることができ、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン、リポソーム、ナノミセルなどが例示される。本発明で用いる核酸、さらには用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人1日当たり10μg/kg~100mg/kgである。
本発明の一つの態様は、約7merのオリゴヌクレオチド(sgASO)を含む、患者における疾患または障害の治療または予防に用いるための医薬組成物であって、該約7merのオリゴヌクレオチドが、疾患または障害に関連する標的RNAに相補的であり、該標的RNAが少なくとも1つのステムループ構造を形成することができ、該約7merのオリゴヌクレオチドが該ステムループ構造の3’側の領域にハイブリダイズして、該標的RNAが形成するステムループと合わせて少なくとも1つのより大きなステムループ構造を形成することができ、形成された構造が患者体内のtRNaseZLによって認識されて、標的RNAが切断されることを特徴とする、医薬組成物に関する。患者は、ヒトもしくは非ヒト動物でありうる。なお、本明細書において、約7merと言った場合は、6mer、7mer、および8merを含むものと解される。
sgASOは一般的には、標的RNAが形成するステムループ構造の根本(つまり、ループとは反対側の末端塩基対)を形成する塩基の3’側に直に隣接する塩基と、sgASOの3’末端塩基とが塩基対を形成するように設計されるが、これに限定はされない。例えば、標的RNAが形成するステムループ構造の根本から数えて2~3番目の塩基とsgASOの3’末端塩基とが塩基対を形成するように設計されてもよい。
本発明の一つの態様において、医薬組成物は、本願の実施例に開示されるVIS-01~VIS-07の少なくとも1つのsgASOを含むことができる。本発明の一つの態様において、医薬組成物は、癌の治療もしくは予防のための組成物、または癌の治療もしくは予防に用いるための組成物でありうる。
本発明の一つの態様は、癌の治療もしくは予防のための医薬組成物、または癌の治療もしくは予防に用いるための医薬組成物であって、以下から選択されるいずれかの配列を含むか、いずれかの配列から成るsgASOを含む、医薬組成物に関する:5’-GAAACUU-3’;5’-CUGUCAA-3’;5’-UCUUCAA-3’;5’-UUAUCGU-3’;5’-CUUAUAA-3’;5’-GCGGGGG-3’;5’-ACUCAAA-3’。sgASOは、その一方または両方の末端にリン酸基を有していてもよい。本医薬組成物が用いられうる癌は、Bcl-2遺伝子が関与する癌であり、例えば、リンパ腫を含む。
医薬の製造における使用および治療方法
本発明の一つの態様は、患者における疾患または障害の治療または予防に用いるための医薬の製造における、約7merのオリゴヌクレオチド(sgASO)の使用であって、該約7merのオリゴヌクレオチドが、疾患または障害に関連する標的RNAに相補的であり、該標的RNAが少なくとも1つのステムループ構造を形成することができ、該約7merのオリゴヌクレオチドが該ステムループ構造の3’側の領域にハイブリダイズして、該標的RNAが形成するステムループと合わせて少なくとも1つのより大きなステムループ構造を形成することができ、形成された構造が患者体内のtRNaseZLによって認識されて、標的RNAが切断されることを特徴とする、使用に関する。
本発明の一つの態様は、患者における疾患または障害の治療または予防に用いるための医薬の製造における、約7merのオリゴヌクレオチド(sgASO)の使用であって、該約7merのオリゴヌクレオチドが、疾患または障害に関連する標的RNAに相補的であり、該標的RNAが少なくとも1つのステムループ構造を形成することができ、該約7merのオリゴヌクレオチドが該ステムループ構造の3’側の領域にハイブリダイズして、該標的RNAが形成するステムループと合わせて少なくとも1つのより大きなステムループ構造を形成することができ、形成された構造が患者体内のtRNaseZLによって認識されて、標的RNAが切断されることを特徴とする、使用に関する。
また、本発明の一つの態様は、患者における疾患または障害の治療または予防のための方法であって、該患者に約7merのオリゴヌクレオチド(sgASO)を投与する工程を含み、ここで、該約7merのオリゴヌクレオチドは、疾患または障害に関連する標的RNAに相補的であり、該標的RNAが少なくとも1つのステムループ構造を形成することができ、該約7merのオリゴヌクレオチドが該ステムループ構造の3’側の領域にハイブリダイズして、該標的RNAが形成するステムループと合わせて少なくとも1つのより大きなステムループ構造を形成することができ、形成された構造が患者体内のtRNaseZLによって認識されて、標的RNAが切断されることを特徴とする、方法に関する。
本発明の一つの態様は、癌の治療もしくは予防のための医薬の製造における、以下から選択されるいずれかの配列を含むか、いずれかの配列から成るsgASOの使用に関する:5’-GAAACUU-3’;5’-CUGUCAA-3’;5’-UCUUCAA-3’;5’-UUAUCGU-3’;5’-CUUAUAA-3’;5’-GCGGGGG-3’;5’-ACUCAAA-3’。
また、本発明の一つの態様は、患者における癌の治療もしくは予防のための方法であって、以下から選択されるいずれかの配列を含むか、いずれかの配列から成るsgASOを患者に投与する工程を含む方法に関する:5’-GAAACUU-3’;5’-CUGUCAA-3’;5’-UCUUCAA-3’;5’-UUAUCGU-3’;5’-CUUAUAA-3’;5’-GCGGGGG-3’;5’-ACUCAAA-3’。
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
概要
対象疾患として、癌を選び、その治療法としてBcl-2をダウンレギュレーションすることを想起した。そのために、Bcl-2 mRNAを標的とした核酸医薬品を創出することを試みた。構造予測および構造解析セクションでは、1)mRNAは一本鎖でタンパク質の関与なく自身のみで高次構造をとる、2)単一の一次構造のmRNAは複数の高次構造をとることが想定されそれらは平衡状態にある(すなわちエネルギー量に応じて存在確率が分布している)、という作業仮説を置いている。内在性の部分構造の算出や評価については、この仮説を元に算出する。さらに、sgASOの設計は、sgASOと内在性の構造が形作る高次構造をtRNase ZLが認識しうるかという点について、内在性の構造として1)ループが10塩基以下、2)ステムが5塩基対、であるという仮説を基本的に置いている。
対象疾患として、癌を選び、その治療法としてBcl-2をダウンレギュレーションすることを想起した。そのために、Bcl-2 mRNAを標的とした核酸医薬品を創出することを試みた。構造予測および構造解析セクションでは、1)mRNAは一本鎖でタンパク質の関与なく自身のみで高次構造をとる、2)単一の一次構造のmRNAは複数の高次構造をとることが想定されそれらは平衡状態にある(すなわちエネルギー量に応じて存在確率が分布している)、という作業仮説を置いている。内在性の部分構造の算出や評価については、この仮説を元に算出する。さらに、sgASOの設計は、sgASOと内在性の構造が形作る高次構造をtRNase ZLが認識しうるかという点について、内在性の構造として1)ループが10塩基以下、2)ステムが5塩基対、であるという仮説を基本的に置いている。
<例1:構造予測および構造解析>
Bcl-2 mRNAの配列情報(アクセッション番号:NM_000633.2)をNCBIのデータベースより取得した。その配列情報を元に、5’末端から3塩基刻みで300塩基の幅の枠を設定した(第一枠は、5’末端の塩基(1塩基目)から300塩基目まで。第2枠は、4塩基目から303塩基目まで。以下同様。枠はnmax個得られているとする)。それぞれの枠において、構成する300塩基の塩基配列についてパターンマッチングおよび熱力学的安定性に基づく構造予測を行なった(例えば、以下の参考文献を参照:Markham, N. R. & Zuker, M. (2005) DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res., 33, W577-W581; Markham, N. R. & Zuker, M. (2008) UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. In Keith, J. M., editor, Bioinformatics, Volume II. Structure, Function and Applications, number 453 in Methods in Molecular Biology, chapter 1, pages 3-31. Humana Press, Totowa, NJ. ISBN 978-1-60327-428-9.)。得られた予測構造結果とそれぞれのエネルギー量から、当該mRNAがおかれている細胞内での状態が平衡状態であることを仮定して、予測構造結果それぞれの存在確率を算出した。ここで、n枠目での構造予測結果のうち最安定構造からm番目の予測結果(枠nにおいて、予測構造結果はmmax(n)個得られている)については、その存在確率をj(n,m)とした。
Bcl-2 mRNAの配列情報(アクセッション番号:NM_000633.2)をNCBIのデータベースより取得した。その配列情報を元に、5’末端から3塩基刻みで300塩基の幅の枠を設定した(第一枠は、5’末端の塩基(1塩基目)から300塩基目まで。第2枠は、4塩基目から303塩基目まで。以下同様。枠はnmax個得られているとする)。それぞれの枠において、構成する300塩基の塩基配列についてパターンマッチングおよび熱力学的安定性に基づく構造予測を行なった(例えば、以下の参考文献を参照:Markham, N. R. & Zuker, M. (2005) DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res., 33, W577-W581; Markham, N. R. & Zuker, M. (2008) UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. In Keith, J. M., editor, Bioinformatics, Volume II. Structure, Function and Applications, number 453 in Methods in Molecular Biology, chapter 1, pages 3-31. Humana Press, Totowa, NJ. ISBN 978-1-60327-428-9.)。得られた予測構造結果とそれぞれのエネルギー量から、当該mRNAがおかれている細胞内での状態が平衡状態であることを仮定して、予測構造結果それぞれの存在確率を算出した。ここで、n枠目での構造予測結果のうち最安定構造からm番目の予測結果(枠nにおいて、予測構造結果はmmax(n)個得られている)については、その存在確率をj(n,m)とした。
ここで、各構造予測結果中それぞれに発見される部分構造として、ループ部位を1つだけ持ち、互いに相手とだけ相補的である1つのステムよりなるものをステムループ構造と定義する(ステムループ中のステムの「互いに相手とだけ相補的である」とは、他の予測構造枠であっても他のステムループを構成しないという意味ではなく、ある1つの予測構造結果において、単一のステムループ中に他のステムループの一部を決して含まないという意味である)。ここで、ステムにはミスマッチ(ステム中にある、塩基対に参加しない塩基が対向しているもの)やバルジ(ステム中にある、塩基対に参加しない塩基が対向していないもの)を含んでもよいが、両端は塩基対であるものとする。さらに、ステムループが内包するステムループも別個のステムループとみなす(例えば、ステムの最もループから遠い塩基対がほどけたものは、解けていないものと別のステムループとみなす)。
こうしたステムループを、枠内ではなく配列上の絶対位置xから始まり、構成するループとステムの情報プロファイル(ステムを構成する塩基対の塩基の位置で定義されるステムループのアイデンティティ)をpとした時に、motif(x,p)と呼ぶ。そして、motif(x,p)の枠n内での存在確率を、部分的な存在確率P_local(x,p,n)とし、その値は、n枠において得られた構造予測結果の中で当該ステムループが存在する構造についてのj値の総和すなわちΣj(n,m)であるとする。さらに、このP_local(x,p,n)について枠1からnmaxまで総和をとった結果をΣP_local(x,p,n)、当該ステムループを構成する配列全長が枠内におさまることのできる枠の数をn_all(x,p)個としたとき、全体の中でのmotif(x,p)の存在確率P_global(x,p)は、ΣP_local(x,p,n)/n_all(x,p)として表される。
<例2:sgASO配列設計>
Bcl-2 mRNAの5’UTRおよびCDSおよび3’UTR中に、P_global(x,p)が50%以上であってp1=“ステムが5塩基対”であるmotif(x,p1)を探したところ、12個が見つかった。このうち、p2=“左右均等(ループを挟んでステムの5’側配列と3’側配列の塩基数の差が1つ以内)であって、ループの長さが10を超えないもの”であるmotif(x,p2)は7個であった。
Bcl-2 mRNAの5’UTRおよびCDSおよび3’UTR中に、P_global(x,p)が50%以上であってp1=“ステムが5塩基対”であるmotif(x,p1)を探したところ、12個が見つかった。このうち、p2=“左右均等(ループを挟んでステムの5’側配列と3’側配列の塩基数の差が1つ以内)であって、ループの長さが10を超えないもの”であるmotif(x,p2)は7個であった。
ついで、motif(x,p2)のそれぞれのステムループ直後の7塩基に対してsgASOの結合サイトとするが、以下の補正処理を行なった。1)ループ部分が3塩基と予測されているものはその次の塩基対をほどいて5塩基のループとなっていると想定する、2)ステム中のミスマッチやバルジの塩基数が2以下の場合はそれを無視して塩基対数をカウント、3)ステム中のミスマッチやバルジの塩基数が3以上の場合はミスマッチやバルジの塩基数の2分の1の数を塩基対数とカウント、こうした処理によって5塩基対目を特定し、その直後をsgASO結合サイトとした。
結果として、sgASOが効果を発揮すると期待される結合箇所の配列は、AAGUUUC、UUGACAG、UUGAAGA、ACGAUAA、UUAUAAG、CCCCCGC、UUUGAGUであり、それぞれに対して以下の7merのアンチセンスオリゴ(VIS-01~VIS-07)を合成した(株式会社日本バイオサービスにて合成)。
標的配列 名称 sgASO配列 配列番号
AAGUUUC VIS-01 5’- pGAAACUUp -3’ 8224
UUGACAG VIS-02 5’- pCUGUCAAp -3’ 7889
UUGAAGA VIS-03 5’- pUCUUCAAp -3’ 14289
ACGAUAA VIS-04 5’- pUUAUCGUp -3’ 15580
UUAUAAG VIS-05 5’- pCUUAUAAp -3’ 7985
CCCCCGC VIS-06 5’- pGCGGGGGp -3’ 9899
UUUGAGU VIS-07 5’- pACUCAAAp -3’ 1857
AAGUUUC VIS-01 5’- pGAAACUUp -3’ 8224
UUGACAG VIS-02 5’- pCUGUCAAp -3’ 7889
UUGAAGA VIS-03 5’- pUCUUCAAp -3’ 14289
ACGAUAA VIS-04 5’- pUUAUCGUp -3’ 15580
UUAUAAG VIS-05 5’- pCUUAUAAp -3’ 7985
CCCCCGC VIS-06 5’- pGCGGGGGp -3’ 9899
UUUGAGU VIS-07 5’- pACUCAAAp -3’ 1857
<例3:細胞実験>
上記sgASO(VIS-1~VIS-7)によるBcl-2 mRNA発現抑制実験をヒト白血病細胞株HL60を用いて行った。核酸鎖は全て、両末端をリン酸化し、2’OH部分をOMe化したものを用いた。すでに報告されているsgASOの一つであるHep1(配列:GGGCCAG;日本国特許第5995849号およびCancer Letters 328 (2013) 362-368を参照)についても参考として用いた。24-wellプレートを用いてHL60細胞を10,000cells/500μLの密度で、RPMI-1640培地(10%ウシ胎仔血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含有)中、37℃、5%CO2インキュベーターにて培養した。培地に最終濃度1μMになるように各sgASOを添加し、更に48時間培養した。48時間後、HL60細胞からRNAisoPlusを用いて全RNAを抽出し、定量RT-PCRを行った。インターナルコントロールとしてGAPDH mRNA量を用い、Bcl-2 mRNA量をノーマライズした。結果として、既に報告されているsgASOであるHep1と比して倍程度の活性を示すsgASOとしてVIS-1、VIS-5を得ることができた(図1)。この結果より、本発明によるsgASOの設計および同定方法が、先行技術より優れていることが明らかとなった。
上記sgASO(VIS-1~VIS-7)によるBcl-2 mRNA発現抑制実験をヒト白血病細胞株HL60を用いて行った。核酸鎖は全て、両末端をリン酸化し、2’OH部分をOMe化したものを用いた。すでに報告されているsgASOの一つであるHep1(配列:GGGCCAG;日本国特許第5995849号およびCancer Letters 328 (2013) 362-368を参照)についても参考として用いた。24-wellプレートを用いてHL60細胞を10,000cells/500μLの密度で、RPMI-1640培地(10%ウシ胎仔血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含有)中、37℃、5%CO2インキュベーターにて培養した。培地に最終濃度1μMになるように各sgASOを添加し、更に48時間培養した。48時間後、HL60細胞からRNAisoPlusを用いて全RNAを抽出し、定量RT-PCRを行った。インターナルコントロールとしてGAPDH mRNA量を用い、Bcl-2 mRNA量をノーマライズした。結果として、既に報告されているsgASOであるHep1と比して倍程度の活性を示すsgASOとしてVIS-1、VIS-5を得ることができた(図1)。この結果より、本発明によるsgASOの設計および同定方法が、先行技術より優れていることが明らかとなった。
本明細書には、本発明の好ましい実施態様を示してあるが、そのような実施態様が単に例示の目的で提供されていることは、当業者には明らかであり、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、様々な変形、変更、置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が、本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。また、本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む、全ての刊行物に記載の内容は、その引用によって、本明細書中に明記された内容と同様に取り込まれていると解釈すべきである。
本発明者らは、遺伝子発現調節の対象となる標的RNA配列について、その配列情報を元に構造予測を行ない、得られた予測構造結果とそれぞれのエネルギー量から、それぞれの存在確率を算出し、存在確率とステムループ構造より、sgASOを設計する方法を確立することで、比較的短いオリゴヌクレオチドを用いて、効率よく細胞内における遺伝子発現を調節する手法を開発した。本手法は、原理的にあらゆる遺伝子発現の調節に応用可能であることから、多様な疾患および障害の治療または予防に有用である。
Claims (20)
- 真核細胞内の標的RNAを切断するための方法であって、
1)標的RNAに相補的な6merから10merのオリゴヌクレオチド(sgASO)がハイブリダイズすることによって、少なくとも1つのステムループ構造が形成される配列を標的RNA配列中に同定する工程、
2)該sgASOを調製して、真核細胞内において標的RNAと接触させる工程、
を含み、
該sgASOがハイブリダイズして形成されるステムループ構造を真核細胞内のtRNaseZLが認識して標的RNAを切断することを特徴とする、方法。 - 該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のステム部分の塩基対数が11から14である、請求項1記載の方法。
- sgASOが7merである、請求項1または2記載の方法。
- 該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のうち、ループ部分が標的RNAによって形成されることを特徴とする、請求項1~3のいずれか記載の方法。
- 該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のループ部分の塩基数が3から10である、請求項1~4のいずれか記載の方法。
- 該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のステム部分がミスマッチまたはバルジを含まない、請求項1~5のいずれか記載の方法。
- 該sgASOがハイブリダイズして形成される該ステムループ構造のステム部分がミスマッチまたはバルジを含む、請求項1~6のいずれか記載の方法。
- ステム部分の塩基対数の計数において、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が2以下の場合は、ミスマッチまたはバルジが塩基対を形成するとみなしてカウントし、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が3以上の場合は、ミスマッチまたはバルジの塩基数の2分の1の数を塩基対数としてカウントする、請求項7記載の方法。
- 標的RNAがmRNAまたはncRNAである、請求項1~8のいずれか記載の方法。
- sgASOが修飾ヌクレオシドおよび/または修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項1~9のいずれか記載の方法。
- 標的RNAによって形成されるステム部分の5’側配列と3’側配列の塩基数の差が1以下である、請求項1~10のいずれか記載の方法。
- 該sgASOの末端水酸基の一方または両方が修飾されている、請求項1~11のいずれか記載の方法。
- 該sgASOの末端水酸基の一方または両方にリン酸基が付加されている、請求項1~12のいずれか記載の方法。
- 標的RNA上のsgASOが結合する領域の5’側から構成する塩基をN1、N2、N3、N4、N5、N6、N7とし、さらにsgASOが結合する領域の3’側に隣接する最初の塩基をN8とした場合に、以下の条件1~3の少なくとも一つが満たされることを特徴とする、請求項1~13のいずれか記載の方法:
-条件1:N8がAもしくはGである;
-条件2:N7がCである;
-条件3:N6がA、CもしくはGである。 - sgASOが配列番号1から配列番号16384のいずれか1つの配列から成るオリゴヌクレオチドである、請求項1~14のいずれか記載の方法。
- 約7merのオリゴヌクレオチドを含む、患者における疾患または障害の治療または予防に用いるための医薬組成物であって、
該約7merのオリゴヌクレオチドが、疾患または障害に関連する標的RNAに相補的であり、
該標的RNAが少なくとも1つのステムループ構造を形成することができ、
該約7merのオリゴヌクレオチドが該ステムループ構造の3’側の領域にハイブリダイズして、該標的RNAが形成するステムループと合わせて少なくとも1つのより大きなステムループ構造を形成することができ、
形成された構造が患者体内のtRNaseZLによって認識されて、標的mRNAが切断されることを特徴とする、医薬組成物。 - 癌の治療もしくは予防のための医薬組成物であって、以下から選択されるいずれかの配列を含むsgASOを含む、医薬組成物:
5’-GAAACUU-3’;
5’-CUGUCAA-3’;
5’-UCUUCAA-3’;
5’-UUAUCGU-3’;
5’-CUUAUAA-3’;
5’-GCGGGGG-3’;
5’-ACUCAAA-3’。 - 真核細胞内の標的RNAを切断するためのオリゴヌクレオチド(sgASO)の設計方法であって、
1)標的RNA配列中に少なくとも1つのステムループ構造が形成される配列を同定する工程、
2)該ステムループ構造に隣接する3’側の6~10塩基の配列をsgASOの結合配列として同定する工程、および
3)該結合配列に相補的な配列をsgASOの配列として同定する工程
を含む、方法。 - 請求項18記載のオリゴヌクレオチド(sgASO)の設計方法であって、
i)標的RNAによって形成されるステムループ構造のステム部分の塩基対数が4~8であり、
ii)該ステムループ構造のループ部分の塩基数が3から10であり、
iii)該ステムループ構造のステム部分がミスマッチまたはバルジを含む場合、ステム部分の塩基対数の計数において、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が2以下の場合は、ミスマッチまたはバルジが塩基対を形成するとみなしてカウントし、ステム中のミスマッチまたはバルジの塩基数が3以上の場合は、ミスマッチまたはバルジの塩基数の2分の1の数を塩基対数としてカウントし、そして
iv)該ステム部分の5’側配列と3’側配列の塩基数の差が1以下である、
方法。 - スモールガイドアンチセンスオリゴヌクレオチド(sgASO)の設計方法であって、
1)標的RNA上に、存在確率の高いステムループを同定する工程、
2)該ステムループを評価する工程、および
3)該ステムループを形成する塩基対の3’側直後から7塩基を標的配列(センス鎖)とし、そのアンチセンス鎖をsgASO配列として同定する工程
を含み、
ここで、1)標的RNA上に、存在確率の高いステムループを同定する工程は、
i)5’末端からR塩基刻みでW塩基の幅の枠nを設定し、該枠nは標的RNAからnmax個得られ、それぞれの枠nにおいて、構成するW塩基の塩基配列についてパターンマッチングによって取り得る塩基対パターンを算出し、その結果に公知の熱力学的安定性計算を適用し、それぞれの塩基対パターンに対してΔGとして与えることを含む、構造予測ステップと、
ii)枠nにおいてmmax(n)個得られている予測構造結果とそれぞれのエネルギー量から該RNAがおかれている細胞内での状態が平衡状態であることを仮定し、予測構造結果それぞれの存在確率をマクスウェル=ボルツマン統計に従って算出し、ここで、n枠目での構造予測結果のうち最安定構造からm番目の予測結果について、その存在確率をおのおのj(n,m)とすることを含む、構造解析ステップと、
iii)枠内ではなく配列上の絶対位置xから始まり、構成するループとステムの特徴プロファイル(ステムを構成する塩基対の塩基の位置で定義されるステムループの個性)をpとした時に、当該ステムループをmotif(x,p)と呼び、motif(x,p)の枠n内での存在確率を、部分的な存在確率P_local(x,p,n)とし、その値は、枠nにおいて得られた構造予測結果すべてについての中で当該ステムループが存在する構造予測結果についてのj値の総和Σj(n,m)であるとすることを含む、局所存在確率計算ステップ、ここで、枠nにおける、motif(x,p)の局所的な存在確率P_local(x,p,n)は以下で表され:
iv)P_local(x,p,n)について枠1からnmaxまで総和をとった結果をΣP_local(x,p,n)、ステムループを構成する配列全長が枠内におさまることのできる枠の数をn_all(x,p)個としたとき、全体の中でのmotif(x,p)の存在確率P_global(x,p)をΣP_local(x,p,n)/n_all(x,p)として表すことを含む、存在確率計算ステップ、ここで、motif(x,p)についての全体の中での存在確率P_global(x,p)は以下で表され:
v)得られたmotif(x、p)についての存在確率P_global(x,p)に対して、存在確率および特徴pから、ステムループを選択する解析ステップ
を含む、方法。
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