JP2005341865A - 核酸プローブ、核酸検出方法、核酸分析用デバイス、および反応速度を制御する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 検査対象に適した反応温度において簡便で高感度な標的核酸配列を検出可能とする核酸プローブ、それを用いた標的核酸の検出方法および核酸分析用マイクロアレイ等を提供することにある。
【解決手段】 標的核酸1を検出するための核酸プローブ2であって、該核酸プローブは所定の反応温度において前記標的核酸にハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位6及び/又は7と自己核酸酵素5を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有しており、前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする核酸プローブ。
【選択図】 図1
【解決手段】 標的核酸1を検出するための核酸プローブ2であって、該核酸プローブは所定の反応温度において前記標的核酸にハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位6及び/又は7と自己核酸酵素5を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有しており、前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする核酸プローブ。
【選択図】 図1
Description
本発明は特定配列を有する核酸を検出する核酸プローブ、それを用いた核酸検出方法および核酸分析用デバイスに関するものである。
近年、遺伝子情報に関する技術が盛んに開発され、特に医療分野では、疾患関連遺伝子を解析することにより、疾患の分子レベルでの治療が可能となってきている。また、遺伝子診断により患者個人ごとに対応したテーラーメイド医療も可能となってきており、例えば製薬分野においては、遺伝子情報に基づいて抗体やホルモンなどのタンパク質を特定し、薬剤として利用している。
さらに、農業や食品関連分野などにおいても多くの遺伝子情報を利用した製品が創り出されている。
さらに、農業や食品関連分野などにおいても多くの遺伝子情報を利用した製品が創り出されている。
ところが、遺伝子情報の整備に基づく疾患関連遺伝子同定技術の進歩にもかかわらず、ゲノム創薬によって創薬された活性小分子は未だに限られている。これは、薬剤と遺伝子発現・抑制の関係を直接的に関連付ける高速スクリーニング技術の開発が不十分であり、これらの活性小分子が生きた細胞内で及ぼす影響を定量的かつ高速に検出する手法が確立されていなかったためである。
そのような背景から、本発明者等は細胞内で発現されるDNAやRNAの細胞内での検出、細胞内配列解析を可能とする新規核酸プローブの開発を目的とし、標的遺伝子の存在により蛍光等による信号を発する新規な核酸プローブ「QUALプローブ」を開発した。このQUALプローブは、細胞内鋳型DNAあるいはRNA上で自己核酸連結化学反応を起こし、反応の進行に付随して信号(蛍光)を発するものである。まず、QUALプローブを使用して細胞外における遺伝子診断を試み、細胞から抽出されたK−rasがん遺伝子上の変異を瞬時に診断することに成功した。QUALプローブの配列選択性は非常に高く、1塩基の違いさえも精密に診断することが可能となった(非特許文献1)。
さらに、このプローブを用いて標的遺伝子を検出する場合、酵素や試薬等を必要としないため、“生きた細胞”への応用が可能となった。すなわち、1塩基の精度で細胞内遺伝子診断を非常な短時間(細胞への導入から検出まで30分程度)で行うことを可能にした。
しかし、上記方法は、RNAまたはDNA1分子から蛍光シグナルを1つしか発生させることができないという欠点があった。従って、たとえば細胞中に多数存在するrRNA等の検出は容易であるが、極微量しか存在しないmRNA等の測定に用いた場合、十分な蛍光が認識できず検出が非常に困難であるという問題があった。
Sando S et.al. J. Am. Chem. Soc. 2002,124,9686
Sando S et.al. J. Am. Chem. Soc. 2002,124,9686
そこで本発明者らは、標的核酸を検出するための新規核酸プローブを開発した。該核酸プローブは前記標的核酸にハイブリダイズした後構造変化を生じ、構造変化した前記核酸プローブはハイブリダイズの結合力が減少し、前記標的核酸から解離するよう設計されていることを特徴とする。
前記核酸プローブは、自己核酸酵素の形成を含む構造変化を生じるものであることが好ましい。また、前記自己核酸酵素は、前記核酸プローブを特異的に切断する切断活性を有するものであることが好ましい。
この核酸プローブは、核酸プローブのハイブリダイズと解離が一つの標的核酸に対して複数回繰り返されるので、検出シグナルが増幅される。そのため、簡便で高感度な標的核酸配列を検出可能とする。
しかしながら、検査対象となる標的核酸に適した検査環境は、検査対象の採取源、例えば、生物の種類、組織により異なる。一つの代表的な検査環境としては温度条件がある。体温は生物間でも異なっており、鳥インフルエンザ、狂牛病、ヒト癌遺伝子などの診断、治療に用いられる標的核酸に応じて適した検査温度を設定する必要がある。従って、検査に用いる核酸プローブは、標的核酸に適した検査温度の範囲内において検出の反応性が高いものであることが望まれる。
特に、核酸プローブを“生きた細胞”へ導入する場合には、検査温度を細胞本来の活動温度の範囲内に設定する必要性が高いため、核酸プローブが検査温度の範囲内で適した検出反応性をもつように調節することが強く望まれる。
前記核酸プローブは、自己核酸酵素の形成を含む構造変化を生じるものであることが好ましい。また、前記自己核酸酵素は、前記核酸プローブを特異的に切断する切断活性を有するものであることが好ましい。
この核酸プローブは、核酸プローブのハイブリダイズと解離が一つの標的核酸に対して複数回繰り返されるので、検出シグナルが増幅される。そのため、簡便で高感度な標的核酸配列を検出可能とする。
しかしながら、検査対象となる標的核酸に適した検査環境は、検査対象の採取源、例えば、生物の種類、組織により異なる。一つの代表的な検査環境としては温度条件がある。体温は生物間でも異なっており、鳥インフルエンザ、狂牛病、ヒト癌遺伝子などの診断、治療に用いられる標的核酸に応じて適した検査温度を設定する必要がある。従って、検査に用いる核酸プローブは、標的核酸に適した検査温度の範囲内において検出の反応性が高いものであることが望まれる。
特に、核酸プローブを“生きた細胞”へ導入する場合には、検査温度を細胞本来の活動温度の範囲内に設定する必要性が高いため、核酸プローブが検査温度の範囲内で適した検出反応性をもつように調節することが強く望まれる。
本発明の目的は、上記の問題点を解決し、検査対象に応じて設定された検査温度において、簡便で高感度な標的核酸配列を検出可能とする核酸プローブ、そのための核酸プローブの反応性を調節する方法、かかる核酸プローブを用いた標的核酸の検出方法および核酸分析用デバイスを提供することにある。
より具体的には、検査対象に適した反応温度で検出シグナル増幅を可能とし、かつスループットが早く、極微量あるいは短寿命の標的遺伝子の挙動も測定可能とする核酸プローブ、該核酸プローブの所定の検査温度での反応速度を適した範囲内に調節する方法、かかる核酸プローブを用いた核酸検出方法および核酸分析用デバイスを提供する。
より具体的には、検査対象に適した反応温度で検出シグナル増幅を可能とし、かつスループットが早く、極微量あるいは短寿命の標的遺伝子の挙動も測定可能とする核酸プローブ、該核酸プローブの所定の検査温度での反応速度を適した範囲内に調節する方法、かかる核酸プローブを用いた核酸検出方法および核酸分析用デバイスを提供する。
上記課題の解決は、下記(1)〜(25)の本発明により達成される。
(1)標的核酸を検出するための核酸プローブであって、
該核酸プローブは、所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有しており、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする核酸プローブ。
該核酸プローブは、所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有しており、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする核酸プローブ。
(2)前記自己核酸酵素は、前記核酸プローブを特異的に切断する切断活性を有するものである前記(1)に記載の核酸プローブ。
(3)前記所定の反応温度(Tx)は、前記ステム部のみの核酸融解温度(T1)よりも高く、且つ、前記標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度(T2)よりも低い前記(1)又は(2)に記載の核酸プローブ。
(4)前記標的核酸の存在を認識容易にする標識物質を有する前記(1)乃至(3)のいずれかに記載の核酸プローブ。
(5)前記標識物質は少なくとも一対の蛍光物質と消光物質とを有する前記(4)に記載の核酸プローブ。
(6)担体に固定化されている前記(1)乃至(5)のいずれかに記載の核酸プローブ。
(7)核酸プローブを用いて標的核酸を検出する核酸検出方法であって、
前記核酸プローブは、所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有しており、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする核酸検出方法。
前記核酸プローブは、所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有しており、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする核酸検出方法。
(8)前記核酸プローブを、前記所定の反応温度で前記標的核酸にハイブリダイズさせるハイブリダイズ形成工程と、
ハイブリダイズさせた前記核酸プローブを同じ反応温度のまま保持して標的核酸から解離させる解離工程と、
前記解離工程で解離した前記核酸プローブの少なくとも一部を検出する検出工程と、を有することを特徴とする前記(7)に記載の核酸検出方法。
ハイブリダイズさせた前記核酸プローブを同じ反応温度のまま保持して標的核酸から解離させる解離工程と、
前記解離工程で解離した前記核酸プローブの少なくとも一部を検出する検出工程と、を有することを特徴とする前記(7)に記載の核酸検出方法。
(9)前記自己核酸酵素の作用により前記核酸プローブが特異的に切断される前記(7)又は(8)に記載の核酸検出方法。
(10)前記所定の反応温度(Tx)は、前記ステム部のみの核酸融解温度(T1)よりも高く、且つ、前記標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度(T2)よりも低い前記(7)乃至(9)のいずれかに記載の核酸検出方法。
(11)前記核酸プローブが標的核酸の存在を認識容易にする標識物質を有する前記(7)乃至(10)のいずれかに記載の核酸検出方法。
(12)前記標識物質は、少なくとも一対の蛍光物質と消光物質とを有する前記(11)に記載の核酸検出方法。
(13)前記核酸プローブが担体に固定されている前記(7)乃至(12)のいずれかに記載の核酸検出方法。
(14)試料中の標的核酸を検出するための核酸プローブが担体に固定された核酸分析用デバイスであって、
前記核酸プローブは、所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有しており、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする核酸分析用デバイス。
前記核酸プローブは、所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有しており、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする核酸分析用デバイス。
(15)前記自己核酸酵素は、前記核酸プローブを特異的に切断する切断活性を有するものである前記(14)に記載の核酸分析用デバイス。
(16)前記所定の反応温度(Tx)は、前記ステム部のみの核酸融解温度(T1)よりも高く、且つ、前記標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度(T2)よりも低い前記(14)又は(15)に記載の核酸分析用デバイス。
(17)前記核酸プローブが標的核酸の存在を認識容易にする標識物質を有する前記(14)乃至(16)のいずれかに記載の核酸分析用デバイス。
(18)前記標識物質は少なくとも一対の蛍光物質と消光物質とを有する前記(17)に記載の核酸分析用デバイス。
(19)所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有している核酸プローブを用いた標的核酸の検出において、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度を、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節することを特徴とする反応速度の制御方法。
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度を、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節することを特徴とする反応速度の制御方法。
(20)自己核酸酵素の形成し易さは、前記自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により制御される前記(19)に記載の反応速度の制御方法。
(21)前記自己核酸酵素は、前記核酸プローブを特異的に切断する切断活性を有するものである前記(19)又は(20)に記載の反応速度の制御方法。
(21)前記自己核酸酵素は、前記核酸プローブを特異的に切断する切断活性を有するものである前記(19)又は(20)に記載の反応速度の制御方法。
(22)前記所定の反応温度(Tx)は、前記ステム部のみの核酸融解温度(T1)よりも高く、且つ、前記標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度(T2)よりも低い前記(19)乃至(21)のいずれかに記載の反応速度の制御方法。
(23)前記核酸プローブが標的核酸の存在を認識容易にする標識物質を有する前記(19)乃至(22)のいずれかに記載の反応速度の制御方法。
(24)前記標識物質は少なくとも一対の蛍光物質と消光物質とを有する前記(23)に記載の反応速度の制御方法。
(25)前記核酸プローブが担体に固定されている前記(19)乃至(24)のいずれかに記載の反応速度の制御方法。
本発明の核酸プローブは、標的核酸とハイブリダイズした時に、構造変化を起こして分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、この自己核酸酵素の作用により、標的核酸1分子上で、核酸プローブの結合・解離からなる反応サイクルを容易に形成することができ、標的核酸の検出感度が向上する。
また、自己核酸酵素によれば、核酸プローブ分子内で例えばヌクレオチドの特異的切断等の酵素活性を得ることができ、核酸プローブを切断等するために制限酵素等を使用しないため、本発明の核酸プローブを細胞内に導入するだけで特異的酵素反応を利用して、細胞内の標的核酸を容易に検出することができる。
さらに、本発明の核酸プローブは、検査対象に応じて設定された検査温度において良好な反応性が得られるように核酸プローブの反応速度が制御されているので、高い検査感度が得られ又は効率よく検査を終了することができる。
さらに、例えば生きた細胞内での検出を行う場合のように、検査温度が特に厳しく制約される場合でも、本発明の核酸プローブを用いることによって、簡便に高感度の検査を行うことが可能である。
従って、本発明によれば、複雑かつ大掛かりな装置を必要とすることなく、短時間で高感度かつ簡便に標的核酸を「認識」、「シグナル増幅」、「検出」することができる。さらに、制限酵素や他の化学物質等を必要としないため、生きた細胞内に導入しても遺伝子等の標的核酸を「認識」、「シグナル増幅」、「診断」できる。したがって、細胞内のmRNAなどの極微量の遺伝子をモニターすることもできるので、ポストゲノム薬剤の遺伝子発現誘導・抑制の高速スクリーニングを可能とする。
また、自己核酸酵素によれば、核酸プローブ分子内で例えばヌクレオチドの特異的切断等の酵素活性を得ることができ、核酸プローブを切断等するために制限酵素等を使用しないため、本発明の核酸プローブを細胞内に導入するだけで特異的酵素反応を利用して、細胞内の標的核酸を容易に検出することができる。
さらに、本発明の核酸プローブは、検査対象に応じて設定された検査温度において良好な反応性が得られるように核酸プローブの反応速度が制御されているので、高い検査感度が得られ又は効率よく検査を終了することができる。
さらに、例えば生きた細胞内での検出を行う場合のように、検査温度が特に厳しく制約される場合でも、本発明の核酸プローブを用いることによって、簡便に高感度の検査を行うことが可能である。
従って、本発明によれば、複雑かつ大掛かりな装置を必要とすることなく、短時間で高感度かつ簡便に標的核酸を「認識」、「シグナル増幅」、「検出」することができる。さらに、制限酵素や他の化学物質等を必要としないため、生きた細胞内に導入しても遺伝子等の標的核酸を「認識」、「シグナル増幅」、「診断」できる。したがって、細胞内のmRNAなどの極微量の遺伝子をモニターすることもできるので、ポストゲノム薬剤の遺伝子発現誘導・抑制の高速スクリーニングを可能とする。
本発明は、標的核酸を検出するための核酸プローブであって、その構造が、所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離するように設計されており、且つ、前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、前記分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする。
このような構成とすることにより、標的核酸を検出、測定する環境に応じて設定された所定の反応温度における標的核酸の存在を示すシグナルの増幅、検出感度の向上を適切に図ることができる。
このような構成とすることにより、標的核酸を検出、測定する環境に応じて設定された所定の反応温度における標的核酸の存在を示すシグナルの増幅、検出感度の向上を適切に図ることができる。
また、本発明の核酸プローブは標識物質を有するものであることが好ましい。これによって、標的核酸の存在をより容易に確認することができる。さらに、かかる標識物質は、前記核酸プローブが前記標的核酸から解離する前後で異なるシグナルを発するものであることがより好ましい。
以下、本発明を実施するための最良の形態を、図面を参照しながら説明する。図1は本発明の核酸検出方法における反応サイクルの一例を示す概念図、図2は本発明の核酸プローブの一例(核酸プローブ2)を示す模式図、図3は、同じ核酸プローブ2が標的核酸にハイブリダイズした状態を示す模式図、図4は、本発明の一実施例による標的核酸の検出反応の結果を示すグラフである。なお、図において用いた符号としては、核酸プローブがハイブリダイズする前、ハイブリダイズした状態および解離した後を通して、核酸プローブの共通する部位に対して同じ符号を用いた。
本発明の核酸プローブを用いて標的核酸を検出する場合には、図1に示すように、標的核酸1の分子上で、核酸プローブの結合・解離を含む反応サイクルが形成される。図1において、核酸プローブ2と標的核酸1とが接触すると、相互にハイブリダイズし複合体を形成する(A)。ハイブリダイズした核酸プローブ2は自己核酸酵素5を形成し、この酵素5は特定配列を有する切断部位9で切断する(B)。切断された核酸プローブは、標的核酸との結合状態を維持できず自発的に解離する(C)。このとき蛍光物質Fは、消光物質Qとの相互作用を喪失し蛍光を発する。フリーになった標的核酸1には、再び新たな核酸プローブ2がハイブリダイズし、プロセス(A)〜(C)を繰返すことにより蛍光シグナルが増幅される。このように、1分子の標的核酸上で、検出シグナルの増幅が行われるため、標的核酸が、極微量あるいは短寿命の場合であっても高感度で検出することができる。
また、この反応サイクルにおいて、制限酵素や化学物質等を使用しないため、本発明の核酸プローブを直接生きた細胞に導入し、プロセス(A)〜(C)を進行させることも可能である。したがって、本発明によれば、細胞内で遺伝子等の標的核酸の「認識」、「シグナル増幅」、「診断」ができ、例えば投与された薬剤とそれによる遺伝子の発現・抑制との関係を直接的に観察するスクリーニングが可能となる。
さらに、PCR等による遺伝子増幅や反応温度の制御等の必要がないため、実験室や分析機器等の特殊な機器や設備が不要となり、家庭内や学校、職場等、医療・研究施設外においても遺伝子診断を行なうことができる。
さらに、PCR等による遺伝子増幅や反応温度の制御等の必要がないため、実験室や分析機器等の特殊な機器や設備が不要となり、家庭内や学校、職場等、医療・研究施設外においても遺伝子診断を行なうことができる。
ここで、本発明でいう「標的核酸」とは、定量的、定性的検出、または単なる検出を目的とする核酸または遺伝子を意味し、精製、未精製のいずれの状態のものをも含む。また標的核酸は、その種類はいかなるものでもよく、RNA、DNA、PNAおよび人工的に修飾された核酸等を挙げることができる。標的核酸の塩基配列は、例えば、マキサム・ギルバート法、ジデオキシ法等により決定することができる。
本発明の核酸プローブの一例(核酸プローブ2)を図2及び図3に示す。この核酸プローブ2はオリゴヌクレオチドで構成され、通常、一般的なオリゴヌクレオチド製造方法で製造することができる。例えば、化学合成法、プラスミドベクターやファジーベクター等を使用する微生物法、あるいは核酸合成機を使用する方法等が挙げられるが、核酸合成機を使用することが好ましい。
核酸プローブ2の塩基数は、5〜100塩基が好ましく、10〜70塩基がより好ましい。塩基数が大きすぎる場合、非特異的ハイブリダイズが起こって検出精度が低下するおそれがある。また、細胞内遺伝子診断を行なう場合、細胞膜に対する透過性が低下し、効率良く細胞内核酸検出が行ない得ない場合がある。一方、塩基数が小さすぎる場合、ハイブリダイズ力が十分でなく検出感度が低下するおそれがある。
核酸プローブ2の塩基数は、5〜100塩基が好ましく、10〜70塩基がより好ましい。塩基数が大きすぎる場合、非特異的ハイブリダイズが起こって検出精度が低下するおそれがある。また、細胞内遺伝子診断を行なう場合、細胞膜に対する透過性が低下し、効率良く細胞内核酸検出が行ない得ない場合がある。一方、塩基数が小さすぎる場合、ハイブリダイズ力が十分でなく検出感度が低下するおそれがある。
本発明の核酸プローブは、標的核酸の少なくとも一部の塩基配列と相補的な配列を有する相補部位を有する。これにより、核酸プローブはサンプル中の検出すべき標的核酸を捕捉することができる。
また、本発明の核酸プローブは、前記相補部位を介して標的核酸にハイブリダイズした時に、分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素として作用する部位を含むステム部を形成可能なステム部形成領域を有する。
図2に示した核酸プローブ2は、標的核酸の少なくとも一部の塩基配列と相補的な配列を有する相補部位3a、3bと共に、分子内ハイブリダイズ部位6、7及び自己核酸酵素5を含むステム部を形成可能なステム部形成領域4とを備える。
また、本発明の核酸プローブは、前記相補部位を介して標的核酸にハイブリダイズした時に、分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素として作用する部位を含むステム部を形成可能なステム部形成領域を有する。
図2に示した核酸プローブ2は、標的核酸の少なくとも一部の塩基配列と相補的な配列を有する相補部位3a、3bと共に、分子内ハイブリダイズ部位6、7及び自己核酸酵素5を含むステム部を形成可能なステム部形成領域4とを備える。
核酸プローブは、図2に示すようにステム部形成領域4の両側に少なくとも各々1箇所以上、合計で2箇所以上の相補部位3a、3bを有することが好ましい。これにより、複数の部位で標的核酸を見分けることができ、検出感度の向上を図ることができる。
また、ステム部形成領域4の両側に少なくとも各々1箇所以上、合計で2箇所以上の相補部位3a、3bを有する場合には、核酸プローブと標的核酸との結合力を容易に制御することが可能となる。例えば、標的核酸に対する結合力は相補配列の数に概ね比例し、図1中(A)において、核酸プローブ2の標的核酸1に対する結合力は、相補部位3aと相補部位3bとの結合力の和であると解される。これに対し、核酸プローブに切断等が生じた場合(B)、各断片の結合力は標的核酸に相補結合している部分(相補部位3a、相補部位3b)単独の結合力しかないことになる。すなわち、切断によって標的核酸への結合力は減少することになる。この結合力の減少を利用することにより、標的核酸へのハイブリダイズと解離のプロセスを含む反応サイクルを確立させることができる。
また、ステム部形成領域4の両側に少なくとも各々1箇所以上、合計で2箇所以上の相補部位3a、3bを有する場合には、核酸プローブと標的核酸との結合力を容易に制御することが可能となる。例えば、標的核酸に対する結合力は相補配列の数に概ね比例し、図1中(A)において、核酸プローブ2の標的核酸1に対する結合力は、相補部位3aと相補部位3bとの結合力の和であると解される。これに対し、核酸プローブに切断等が生じた場合(B)、各断片の結合力は標的核酸に相補結合している部分(相補部位3a、相補部位3b)単独の結合力しかないことになる。すなわち、切断によって標的核酸への結合力は減少することになる。この結合力の減少を利用することにより、標的核酸へのハイブリダイズと解離のプロセスを含む反応サイクルを確立させることができる。
さらに、核酸プローブ2を2箇所以上の相補部位(3a、3b)を介してステム部の両側の位置で標的核酸1にハイブリダイズさせることにより、形成される自己核酸酵素5をより安定化させ、切断効率の向上を図ることができる。
核酸プローブが少なくとも2箇所以上の相補部位を有する場合、各相補部位の塩基数は、1〜13塩基とすることが好ましく、2〜10塩基程度がより好ましい。各相補部位の長さを1〜10塩基とすることによって、生物体内温度付近(37℃付近)において、各相補部位単独では標的核酸とのハイブリダイズを維持できないものとし、より容易に自発的に解離させることができる。したがって、このような設計にすれば、直接生体内や細胞内に導入して核酸プローブと標的核酸との反応サイクルを成立させることが容易となる。なお、各相補部位の塩基数は同数であっても相異なる数としてもよい。
核酸プローブが少なくとも2箇所以上の相補部位を有する場合、各相補部位の塩基数は、1〜13塩基とすることが好ましく、2〜10塩基程度がより好ましい。各相補部位の長さを1〜10塩基とすることによって、生物体内温度付近(37℃付近)において、各相補部位単独では標的核酸とのハイブリダイズを維持できないものとし、より容易に自発的に解離させることができる。したがって、このような設計にすれば、直接生体内や細胞内に導入して核酸プローブと標的核酸との反応サイクルを成立させることが容易となる。なお、各相補部位の塩基数は同数であっても相異なる数としてもよい。
ステム部形成領域4は、核酸プローブ2が標的核酸1にハイブリダイズした時に自己核酸酵素の形成等の構造変化が起こる領域であり、その後、自己核酸酵素の作用による構造変化に起因して核酸プローブから解離することができる。
ここで「ステム部」とは、図3に示すように、核酸プローブが前記相補部位により標的核酸にハイブリダイズした時に生じる、いわゆる3方向連結(three-way junction)の交差部分から突出した核酸プローブのヘアピン構造を形成する部分である。
ここで「ステム部」とは、図3に示すように、核酸プローブが前記相補部位により標的核酸にハイブリダイズした時に生じる、いわゆる3方向連結(three-way junction)の交差部分から突出した核酸プローブのヘアピン構造を形成する部分である。
ステム部形成領域4は、例えば相補部位が2箇所以上ある場合には、一の相補部位3aと他の相補部位3bとの間の領域にあることが好ましい。このような構成にすることにより、核酸プローブが標的核酸に確実に固定され、ステム部内の自己核酸酵素5はより安定化する。
そして、自己核酸酵素の作用の結果、ヌクレオチドの切断等、構造変化が進行したとき、核酸プローブと標的核酸との結合力を減少させるよう設計することがより容易になる。
そして、自己核酸酵素の作用の結果、ヌクレオチドの切断等、構造変化が進行したとき、核酸プローブと標的核酸との結合力を減少させるよう設計することがより容易になる。
自己核酸酵素形成部位5は、核酸プローブが標的核酸に結合したとき、酵素活性を発現するための金属イオンを捕捉する空洞を形成するようコンホメーション変化し得る領域を含む。
ここで「自己核酸酵素」とは、核酸プローブが標的核酸とハイブリダイズし自己核酸酵素を含むステム部を形成した時に、ハイブリダイズした核酸プローブ自体にアロステリックに作用して、該核酸プローブを標的核酸との結合を維持できない構造に変化させて、標的核酸からの解離を誘発する酵素を意味する。
ここで「自己核酸酵素」とは、核酸プローブが標的核酸とハイブリダイズし自己核酸酵素を含むステム部を形成した時に、ハイブリダイズした核酸プローブ自体にアロステリックに作用して、該核酸プローブを標的核酸との結合を維持できない構造に変化させて、標的核酸からの解離を誘発する酵素を意味する。
本発明では、自己核酸酵素形成部位から形成される自己核酸酵素は、切断活性、結合活性、その他いずれの活性を有するものであってもよいが、例示した核酸プローブ2のような切断活性を有するものが好ましい。例えば、図2および図3に示すように、核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズした後、自己核酸酵素の作用により2つの相補部位3aと3bの間の切断部位9で特異的に切断された場合、各相補部位の結合力の総和力でもって標的核酸と結合状態を維持していたものが、切断後、短くなった各断片は標的核酸とのハイブリダイズを維持できず標的核酸から解離する。フリーとなった標的核酸は新たな核酸プローブと結合し、自己核酸酵素の形成、切断、解離、新たなハイブリダイズ形成を順次繰り返す反応サイクルを繰り返すことができる。したがって、遊離した切断片がシグナルを発するように設計された核酸プローブを使用した場合、1分子の標的核酸上でシグナルが増幅されるため、検出感度の向上を図ることができる。
自己核酸酵素形成部位から形成される自己核酸酵素5としては、DNA酵素、RNA酵素等が挙げられるがそのいずれであってもよく、これらの核酸酵素は、ハンマーヘッド型、ヘアピン型、HDV型およびその他のいずれのタイプを含むものでもよい。
この自己核酸酵素の作用により、標的核酸1分子上で、核酸プローブの結合・解離からなるサイクルを容易に形成することができ、標的核酸の検出感度が向上する。
また、自己核酸酵素によれば、核酸プローブ分子内で例えばヌクレオチドの特異的切断等の酵素活性を得ることができ、核酸プローブを切断等するために制限酵素等を使用しないため、本発明の核酸プローブを細胞内に導入するだけで特異的酵素反応を利用して、細胞内の標的核酸を容易に検出することができる。
また、自己核酸酵素によれば、核酸プローブ分子内で例えばヌクレオチドの特異的切断等の酵素活性を得ることができ、核酸プローブを切断等するために制限酵素等を使用しないため、本発明の核酸プローブを細胞内に導入するだけで特異的酵素反応を利用して、細胞内の標的核酸を容易に検出することができる。
また、通常、特異的切断をさせたい場合、切断しようとする特定配列部位を認識する酵素を選択して使用しなければならないが、任意の配列で核酸を切断しようとすると、あらゆる場合において特定配列部位を認識し切断する制限酵素が存在するとは限らない。しかし、本発明の核酸プローブは、同一分子内に自己核酸酵素形成部位とともに自己核酸酵素により認識・切断等される特定配列を有するため、酵素活性の発現について所望の特性を備えるよう設計が自由であり、制限酵素を用いる場合のごとき上記制限がない。
なお、切断部位9は、核酸プローブがハイブリダイズした後自己核酸酵素5が形成されたとき、切断活性が最も効率よく発揮される位置に配置されることが好ましい。
なお、切断部位9は、核酸プローブがハイブリダイズした後自己核酸酵素5が形成されたとき、切断活性が最も効率よく発揮される位置に配置されることが好ましい。
従って、本発明の核酸プローブは、標的核酸をアロステリックエフェクターとする、例えば自己切断型遺伝子診断プローブとして機能することができる。自己切断したヌクレオチドの各断片は、等温下ではそれぞれ標的核酸との相補的結合(ハイブリダイズ)を維持することができず自発的に解離する。その後、新たな核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズし、自己核酸酵素を形成した後解離する。こうして図1に示すような核酸プローブの結合・解離からなる触媒サイクルが順次繰り返されることにより、蛍光シグナル等に代表される検出シグナルが増幅されるため、PCR等の核酸増幅等を行うことなく、従来の核酸測定法では非常に困難であった微量の核酸や遺伝子等も容易に検出可能となった。
また、本発明の核酸プローブは自己核酸酵素を形成するため特別の酵素や試薬の添加を必要とせず、生きた細胞への導入を可能にするものである。従って、本発明の核酸プローブを用いれば、細胞内における1分子レベルの核酸や遺伝子の挙動をも観察することができる。
また、本発明の核酸プローブは自己核酸酵素を形成するため特別の酵素や試薬の添加を必要とせず、生きた細胞への導入を可能にするものである。従って、本発明の核酸プローブを用いれば、細胞内における1分子レベルの核酸や遺伝子の挙動をも観察することができる。
また、本発明の核酸プローブは、該核酸プローブが標的核酸とハイブリダイズする時に分子内ハイブリダイズ部位となる配列(分子内ハイブリダイズ形成領域)をステム部形成領域内に有する。このように設計することによって、自己核酸酵素による切断効率が向上する。すなわち、核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズした後、形成された自己核酸酵素がより安定化され、特異的切断等の酵素活性の発現がより確実となる。
例えば図2に示した核酸プローブ2の場合には、そのステム部形成領域4内に、標的核酸とハイブリダイズした時にステム部内の塩基同士での自己ハイブリダイズ可能な分子内ハイブリダイズ形成領域6a、6b、7a、7bが存在している。この核酸プローブ2が標的核酸にハイブリダイズしたときに、図3に示すように、自己核酸酵素5の両側に、領域6aと領域6bによる分子内ハイブリダイズ部位6と、領域7aと領域7bによる分子内ハイブリダイズ部位7が形成され、ステム部のヘアピン部分にループ部8が形成される。
自己核酸酵素を安定化させる観点から、分子内ハイブリダイズ部位6及び部位7のうち少なくとも一方が形成可能であることが好ましく、両方が形成可能であることがさらに好ましい。
なお「ループ部」とは、ステム部のヘアピン部位に存在する環状部分であり、核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズした時に形成される。
自己核酸酵素を安定化させる観点から、分子内ハイブリダイズ部位6及び部位7のうち少なくとも一方が形成可能であることが好ましく、両方が形成可能であることがさらに好ましい。
なお「ループ部」とは、ステム部のヘアピン部位に存在する環状部分であり、核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズした時に形成される。
核酸プローブを様々な検査対象に有効利用するためには、核酸プローブが検査対象の検査温度において適正な反応性を有することが望ましい。かかる観点から本発明においては、標的核酸の検出における核酸プローブの反応速度を、分子内ハイブリダイズ形成領域(6,7)に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節する。
分子内ハイブリダイズ形成領域に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数は、ステム部内に分子内ハイブリダイズが1箇所しか形成されない場合には、その部位に存在する自己ハイブリダイズした相補的塩基対の数を意味し、ステム部内に分子内ハイブリダイズが2箇所以上に形成される場合には、全ての分子内ハイブリダイズ部位に存在する自己ハイブリダイズした相補的塩基対の数の合計を意味する。
例えば、図3に例示する核酸プローブ2の場合には、分子内ハイブリダイズ部位6に存在する相補的結合した塩基対の数Yと、分子内ハイブリダイズ部位7に存在する相補的結合した塩基対の数Zの選択により、反応性を制御することができる。
なお、分子内ハイブリダイズ形成領域にステム部内で相補的結合しない塩基(ミスマッチ部位)が含まれていても差し支えないが、その部位の塩基は、自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数には算入しない。
例えば、図3に例示する核酸プローブ2の場合には、分子内ハイブリダイズ部位6に存在する相補的結合した塩基対の数Yと、分子内ハイブリダイズ部位7に存在する相補的結合した塩基対の数Zの選択により、反応性を制御することができる。
なお、分子内ハイブリダイズ形成領域にステム部内で相補的結合しない塩基(ミスマッチ部位)が含まれていても差し支えないが、その部位の塩基は、自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数には算入しない。
本発明の核酸プローブを標的核酸と反応させる温度を一定とした場合、分子内ハイブリダイズ形成領域に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数が多いほど核酸プローブは安定化する傾向がある。
しかしながら、自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数が多すぎる場合には、標的核酸が存在していない場合においても核酸プローブが自己核酸酵素を形成したり、核酸プローブ同士のクロスハイブリダイゼーションを生じて擬陽性シグナルを発する等、検出精度・感度の低下を招くおそれがある。
一方、分子内ハイブリダイズ形成領域に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数が少ないほど核酸プローブの反応速度は減少し、S/N比(検査上のノイズ)は改善される傾向にある。
しかしながら、自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数が少なすぎる場合には、ステム部の構造が不安定になり、自己核酸酵素による自己切断速度が減少し、検査の感度が悪くなるおそれがある。
しかしながら、自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数が多すぎる場合には、標的核酸が存在していない場合においても核酸プローブが自己核酸酵素を形成したり、核酸プローブ同士のクロスハイブリダイゼーションを生じて擬陽性シグナルを発する等、検出精度・感度の低下を招くおそれがある。
一方、分子内ハイブリダイズ形成領域に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数が少ないほど核酸プローブの反応速度は減少し、S/N比(検査上のノイズ)は改善される傾向にある。
しかしながら、自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数が少なすぎる場合には、ステム部の構造が不安定になり、自己核酸酵素による自己切断速度が減少し、検査の感度が悪くなるおそれがある。
従って、本発明においては、検査対象の検査温度として設定された一定の反応温度における標的核酸存在下での自己核酸酵素の形成のし易さ、核酸プローブの切断等の構造変化の反応速度並びにこれに起因する解離のし易さを、核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズした時にステム部内において自己ハイブリダイズする相補的塩基対の数を変えることにより調節することができ、それによって検査温度に応じて核酸プローブに適正な反応性を付与することができる。
すなわち、所定の反応温度における自己核酸酵素の活性が低く、核酸プローブの反応速度が遅い場合には、分子内ハイブリダイズ形成領域に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数を多くすることにより反応速度を加速し、一方、所定の反応温度における自己核酸酵素の活性が過剰で、標的核酸が存在しないのに擬陽性反応を呈する場合には、分子内ハイブリダイズ形成領域に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数を少なくすることにより反応速度を抑制し、それによって検査温度に応じて核酸プローブに適正な反応性を付与することができる。
すなわち、所定の反応温度における自己核酸酵素の活性が低く、核酸プローブの反応速度が遅い場合には、分子内ハイブリダイズ形成領域に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数を多くすることにより反応速度を加速し、一方、所定の反応温度における自己核酸酵素の活性が過剰で、標的核酸が存在しないのに擬陽性反応を呈する場合には、分子内ハイブリダイズ形成領域に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数を少なくすることにより反応速度を抑制し、それによって検査温度に応じて核酸プローブに適正な反応性を付与することができる。
一例として、図3に例示する核酸プローブ2を用い、反応温度を37℃に設定する場合には、自己核酸酵素5を挟んで分子内ハイブリダイズ部位6に存在する相補的結合した塩基対の数Yと、分子内ハイブリダイズ部位7に存在する相補的結合した塩基対の数Zの合計Y+Zは2〜12塩基程度とすることが好ましい。
分子内ハイブリダイズ形成領域内に存在する自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数は、前記ステム部4のみの核酸融解温度(T1)が所定の反応温度(Tx)よりも低く、且つ、核酸プローブ2が標的核酸1とハイブリダイズした時の核酸融解温度(T2)が反応温度(Tx)よりも高くなるように設定されることが好ましい。すなわち、式で表すと次の通りである。
T1<Tx<T2
ここで、「ステム部4のみの核酸融解温度(T1)」とは、標的核酸非存在時のステム部の塩基配列のみからなるポリ又はオリゴヌクレオチドの核酸融解温度を意味し、UV吸光度の温度変化で測定できる。
また、「核酸プローブが標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度(T2)」とは、核酸プローブが標的核酸とハイブリダイズした後、自己核酸酵素の作用により構造変化した後の核酸融解温度を意味し、UV吸光度の温度変化で測定できる。
T1<Tx<T2
ここで、「ステム部4のみの核酸融解温度(T1)」とは、標的核酸非存在時のステム部の塩基配列のみからなるポリ又はオリゴヌクレオチドの核酸融解温度を意味し、UV吸光度の温度変化で測定できる。
また、「核酸プローブが標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度(T2)」とは、核酸プローブが標的核酸とハイブリダイズした後、自己核酸酵素の作用により構造変化した後の核酸融解温度を意味し、UV吸光度の温度変化で測定できる。
ステム部4のみの核酸融解温度(T1)が所定の反応温度(Tx)よりも高い場合には、反応温度Txにおいてステム部が非常に安定で自己核酸酵素を容易に形成し、核酸プローブ2は標的核酸が存在するか否かに係わらず、自己切断等の自発的な構造変化又は解離が促進される。
一方、核酸プローブ2と標的核酸1のハイブリダイズ後の核酸融解温度(T2)が所定の反応温度(Tx)よりも低い場合には、反応温度Txにおいて標的核酸とのハイブリダイズの安定性が低すぎるために、自己核酸酵素が形成されず、反応が起こりにくい。
一方、核酸プローブ2と標的核酸1のハイブリダイズ後の核酸融解温度(T2)が所定の反応温度(Tx)よりも低い場合には、反応温度Txにおいて標的核酸とのハイブリダイズの安定性が低すぎるために、自己核酸酵素が形成されず、反応が起こりにくい。
本発明の核酸プローブは、標的核酸の存在を認識容易にする手段を備える標識物質10を有することが好ましい。標識物質を有することにより、より確実に標的核酸の存在を確認することができる。
標識物質10としては、例えば蛍光物質、化学発光物質、電気化学発光物質やこれらの誘導体物質およびラジオアイソトープ等を挙げることができるが、なかでも蛍光物質(蛍光物質の誘導体物質を含む)を使用することが好ましい。蛍光物質を使用すれば、標的核酸の存在をシグナルとして視認容易にし、標的核酸の検出がより簡便・かつ確実になる。さらに、細胞内に導入しても生体安全性を損なわないものを選択可能で、細胞内での標的核酸の挙動を追跡する動的パラメータとしても使用することができる。
蛍光物質としては特に限定されず、任意のものを使用することができるが、例えば、アントラセン、フルオロセイン、テトラメチルローダミン、スルホローダミン等のローダミン類、ダンシルクロライド、テキサスレッド等を挙げることができるが、検出目的等に応じてその他のいかなる蛍光物質も使用することができる。
標識物質10としては、例えば蛍光物質、化学発光物質、電気化学発光物質やこれらの誘導体物質およびラジオアイソトープ等を挙げることができるが、なかでも蛍光物質(蛍光物質の誘導体物質を含む)を使用することが好ましい。蛍光物質を使用すれば、標的核酸の存在をシグナルとして視認容易にし、標的核酸の検出がより簡便・かつ確実になる。さらに、細胞内に導入しても生体安全性を損なわないものを選択可能で、細胞内での標的核酸の挙動を追跡する動的パラメータとしても使用することができる。
蛍光物質としては特に限定されず、任意のものを使用することができるが、例えば、アントラセン、フルオロセイン、テトラメチルローダミン、スルホローダミン等のローダミン類、ダンシルクロライド、テキサスレッド等を挙げることができるが、検出目的等に応じてその他のいかなる蛍光物質も使用することができる。
さらに標識物質10としては、少なくとも1つの蛍光物質から構成されるものでもよく、相互に蛍光共鳴エネルギー輸送が可能な蛍光物質の組合せからなるもの、および1対の蛍光物質と消光物質かなる組合せからなるもの等が挙げられるが、一対の蛍光物質と消光物質とを有することが好ましい。蛍光物質と消光物質との相互作用を利用することにより、核酸プローブと標的核酸とのハイブリダイズ・解離の現象が異なるシグナル、すなわち蛍光特性の変化として視覚化され、標的核酸の存在が蛍光強度の増加として観察可能となる。
図3において本発明の核酸プローブの一例を示すように、蛍光物質Fと消光物質Qとは、自己核酸酵素による切断部位9を介した位置にそれぞれ設けられていることが好ましい。その原理は蛍光共鳴エネルギー移動(fluorescence resource energy transfer:FRET)に基づく。FRETが成立するためには、特に蛍光物質(F)と消光物質(Q)との物質間の距離が重要となるが、本発明の核酸プローブ2が標的核酸1にハイブリダイズしている状態では、FとQとの物質間距離はFRETが成立していて消光するような距離に設計されている。その後、自己核酸酵素が作用し、オリゴヌクレオチドが所定の切断部位で切断されると、各切断片は標的核酸との結合を維持できず解離する。その結果、FRETから解放された蛍光物質は蛍光発光する。このように蛍光強度の増加から標的核酸を検出・定量することができる。
また、このようなFRET法によれば、ハイブリダイズした核酸プローブと、ハイブリダイズしない核酸プローブとを分離することなく目的の標的核酸の検出が可能となり、手順が簡略化され好ましい。
蛍光物質と消光物質とは、標的核酸にハイブリダイズした状態で切断部位を挟んで、約5〜30塩基配列の距離で隔てられていることが好ましいが、必ずしもこの場合に限られるものではない。
なお、核酸プローブに導入する標識物質としては、エネルギー供与物質とエネルギー受容物質(FITC/TRITC)からなる組合わせを採用することもできる。
また、このようなFRET法によれば、ハイブリダイズした核酸プローブと、ハイブリダイズしない核酸プローブとを分離することなく目的の標的核酸の検出が可能となり、手順が簡略化され好ましい。
蛍光物質と消光物質とは、標的核酸にハイブリダイズした状態で切断部位を挟んで、約5〜30塩基配列の距離で隔てられていることが好ましいが、必ずしもこの場合に限られるものではない。
なお、核酸プローブに導入する標識物質としては、エネルギー供与物質とエネルギー受容物質(FITC/TRITC)からなる組合わせを採用することもできる。
本発明の核酸プローブは、ガラス製基板等の担体表面に固定された形態、いわゆる「DNAチップ」として使用することが可能であり、Lab−on−Chipとして使用することもできる。
また、核酸プローブを担体表面にアレイ状に配列させたDNAマイクロアレイ、流動的なビーズに固定されたDNAマイクロビーズアレイとすることも可能である。DNAマイクロアレイとする場合、塩基配列の異なる核酸プローブを同一固体上に固定させておくことにより、同時に多種・多量の遺伝子の検出・定量も可能となる。さらに、標的核酸によって異なる色を発するマルチカラープローブとしての適用も可能である。
また、核酸プローブを担体表面にアレイ状に配列させたDNAマイクロアレイ、流動的なビーズに固定されたDNAマイクロビーズアレイとすることも可能である。DNAマイクロアレイとする場合、塩基配列の異なる核酸プローブを同一固体上に固定させておくことにより、同時に多種・多量の遺伝子の検出・定量も可能となる。さらに、標的核酸によって異なる色を発するマルチカラープローブとしての適用も可能である。
DNAチップやDNAマイクロアレイ等に代表される核酸分析用デバイスの担体の材質としては、例えばプラスチック、無機高分子、金属、天然高分子、セラミックおよびこれらを含む複合材料等が挙げられる。プラスチックとして具体的には、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド及びアクリル樹脂等が挙げられる。
また、無機高分子として具体的には、ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル及びグラファイト等が挙げられる。また、金属として具体的には、金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、パラマグネット及びアパタイト等が挙げられる。
天然高分子としては、ポリアミノ酸、セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸及びそれら誘導体が挙げられる。また、セラミックとして具体的には、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及び炭化ホウ素等が挙げられる。
また、無機高分子として具体的には、ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル及びグラファイト等が挙げられる。また、金属として具体的には、金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石、パラマグネット及びアパタイト等が挙げられる。
天然高分子としては、ポリアミノ酸、セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸及びそれら誘導体が挙げられる。また、セラミックとして具体的には、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及び炭化ホウ素等が挙げられる。
上記担体の形状としては、例えば、フィルム、平板、粒子、各種成形品(ビーズ、ストリップ、マルチウェルプレートのウェルまたはストリップ、チューブ、メッシュ、連続発砲フォーム、膜、紙、針、ファイバー、プレート、中空糸、スライド及び細胞培養容器等)およびラテックス等を挙げることができ、それらの大きさについては特に制限はない。
本発明の核酸の検出方法は、上記本発明の核酸プローブを使用するものであって、この核酸プローブは標的核酸にハイブリダイズした後構造変化を生じ、構造変化した前記核酸プローブは前記標的核酸から解離するよう設計されていることを特徴とする。
このような本発明の方法によれば、核酸プローブ自身が標的核酸の認識、シグナルの増幅の両者を行うため、PCR等によってサンプルDNA(RNA)を増幅する必要がない。したがって、従来法のように制限酵素等を必要としないので、核酸プローブ内に制限酵素部位を設ける必要もない。さらに化学物質等の添加を必要とせず、一定温度下で反応が進行するため、細胞内における標的核酸の検出方法としても使用することができる。
換言すれば、基本的には核酸プローブを試料中に存在する標的核酸にハイブリダイズさせる操作のみであり、この後、自発的に核酸プローブの構造変化、ハイブリダイズ結合力の減少、核酸プローブの解離、シグナルの蓄積、が起こって標的核酸の測定が可能となる。このように操作が非常に簡単なため、複雑・特殊な装置や特別の試薬等が不要であり、必要時に必要なところ、例えば診療所、家庭、学校、職場等において速かに遺伝子診断を行なうことができる。
このような本発明の方法によれば、核酸プローブ自身が標的核酸の認識、シグナルの増幅の両者を行うため、PCR等によってサンプルDNA(RNA)を増幅する必要がない。したがって、従来法のように制限酵素等を必要としないので、核酸プローブ内に制限酵素部位を設ける必要もない。さらに化学物質等の添加を必要とせず、一定温度下で反応が進行するため、細胞内における標的核酸の検出方法としても使用することができる。
換言すれば、基本的には核酸プローブを試料中に存在する標的核酸にハイブリダイズさせる操作のみであり、この後、自発的に核酸プローブの構造変化、ハイブリダイズ結合力の減少、核酸プローブの解離、シグナルの蓄積、が起こって標的核酸の測定が可能となる。このように操作が非常に簡単なため、複雑・特殊な装置や特別の試薬等が不要であり、必要時に必要なところ、例えば診療所、家庭、学校、職場等において速かに遺伝子診断を行なうことができる。
本発明の核酸検出方法は、核酸プローブが前記標的核酸から解離する前後において、異なるシグナルを発する標識物質を有する核酸プローブを用いることが好ましい。
このように構成することにより、核酸プローブと標的核酸とのハイブリダイズ・解離などの現象が、シグナルの変化として視認容易となり、標的核酸の検出がより容易になる。
また、本発明の核酸検出方法は、標的核酸の少なくとも一部の塩基配列と相補的な配列を有する相補部位と、自己核酸酵素を形成可能な核酸酵素形成部位と、を有する核酸プローブを用いる標的核酸の検出方法であって、標的核酸に前記核酸プローブを相補的に結合させるハイブリダイズ形成工程と、ハイブリダイズ形成の後、前記自己核酸酵素が形成され前記核酸プローブの構造が変化し、その結果ハイブリダイズの結合力が減少して該核酸プローブが前記標的核酸から解離する解離工程と、前記解離工程で解離した前記核酸プローブの少なくとも一部を検出する検出工程と、を有することを特徴とする。
このような方法によれば、標的核酸と一度ハイブリダイズした核酸プローブ上にある標識物質をポジティブに検出できるため、操作性に優れ、容易かつ高精度で標的核酸の検出を行うことができる。
さらに、核酸プローブの相補部位でのみ標的核酸とハイブリダイズさせるため、ハイブリダイゼーションを完了するのに要する時間を短縮することができ、検査の迅速化を図ることができる。
このように構成することにより、核酸プローブと標的核酸とのハイブリダイズ・解離などの現象が、シグナルの変化として視認容易となり、標的核酸の検出がより容易になる。
また、本発明の核酸検出方法は、標的核酸の少なくとも一部の塩基配列と相補的な配列を有する相補部位と、自己核酸酵素を形成可能な核酸酵素形成部位と、を有する核酸プローブを用いる標的核酸の検出方法であって、標的核酸に前記核酸プローブを相補的に結合させるハイブリダイズ形成工程と、ハイブリダイズ形成の後、前記自己核酸酵素が形成され前記核酸プローブの構造が変化し、その結果ハイブリダイズの結合力が減少して該核酸プローブが前記標的核酸から解離する解離工程と、前記解離工程で解離した前記核酸プローブの少なくとも一部を検出する検出工程と、を有することを特徴とする。
このような方法によれば、標的核酸と一度ハイブリダイズした核酸プローブ上にある標識物質をポジティブに検出できるため、操作性に優れ、容易かつ高精度で標的核酸の検出を行うことができる。
さらに、核酸プローブの相補部位でのみ標的核酸とハイブリダイズさせるため、ハイブリダイゼーションを完了するのに要する時間を短縮することができ、検査の迅速化を図ることができる。
本発明の核酸検出方法の具体例を図面に基づいて説明する。
まず、標的核酸1と本発明の核酸プローブ2とをハイブリダイズさせる(図1(A))。ハイブリダイズ形成工程において、反応条件は適宜設定可能であり、公知の方法によって行うことができ、いわゆる「ストリンジェント」なハイブリダイゼーション条件下で行われる。例えば、pH7.0〜8.5、温度30〜60℃の約0.01〜0.1M未満のナトリウムイオン塩濃度の溶液を用いて行われる。
なお、標的核酸は、通常、高温処理等によって予め一本鎖に変性されていることが好ましい。
まず、標的核酸1と本発明の核酸プローブ2とをハイブリダイズさせる(図1(A))。ハイブリダイズ形成工程において、反応条件は適宜設定可能であり、公知の方法によって行うことができ、いわゆる「ストリンジェント」なハイブリダイゼーション条件下で行われる。例えば、pH7.0〜8.5、温度30〜60℃の約0.01〜0.1M未満のナトリウムイオン塩濃度の溶液を用いて行われる。
なお、標的核酸は、通常、高温処理等によって予め一本鎖に変性されていることが好ましい。
次に、ハイブリダイズした核酸プローブは一定条件の下、分子内バイブリダイズ部位6,7と自己核酸酵素5を形成する(図1(A))。この自己核酸酵素5によって特定配列の認識と酵素活性の発現が核酸プローブ2内で起こる。自己核酸酵素5が切断活性を有する場合、特定配列を有する切断部位9でヌクレオチドが切断される(図1(B))。このように切断された核酸プローブ2は、標的核酸1との結合状態を維持することができず解離する(図1(C))。これにより、核酸プローブ断片上の蛍光物質Fは消光物質Qの影響を受けることがなくなって蛍光シグナルを発する。このシグナルを次の検出工程において検出・解析する。
検出工程は、核酸プローブの性状や標識物質に応じ、適宜検出手段を選択することにより行なうことができる。例えば、核酸プローブが蛍光物質で標識されている場合は、蛍光顕微鏡等で検出することができ、放射性同位元素で標識されている場合はオートラジオグラフィー、化学発光物質で標識されている場合には、感光フィルムを用いた解析やCCDカメラを用いたデジタル解析を実施し標的核酸の定性、定量分析が可能である。
なお、標識物質を有しない核酸プローブを用いた場合には、例えば切断された核酸プローブ断片をゲル電気泳動などで確認することにより標的核酸の検出を行なうことができる。
なお、標識物質を有しない核酸プローブを用いた場合には、例えば切断された核酸プローブ断片をゲル電気泳動などで確認することにより標的核酸の検出を行なうことができる。
本発明の核酸検出方法において、核酸酵素反応工程では前記核酸プローブが切断されることが好ましい。
上述のとおり、自己核酸酵素の活性は特に限定されないが、切断活性の発現により核酸プローブが切断されることが好ましい。核酸プローブが切断されることによりできた各断片は、標的核酸とのハイブリダイズを維持できず標的核酸から解離し、その後、新たな核酸プローブが標的核酸に結合する。その結果、このようなシグナルの増幅を可能にする反応サイクルを容易に形成することができる。
また、本発明においては、検査対象に応じて設定された検査温度において良好な反応性が得られるように核酸プローブの反応速度が制御されているので、高い検査感度が得られ又は効率よく検査を終了することができる。
さらに、例えば生きた細胞内での検出を行う場合のように、検査温度が特に厳しく制約される場合でも、本発明の核酸プローブを用いることによって、簡便に高感度の検査を行うことが可能である。
上述のとおり、自己核酸酵素の活性は特に限定されないが、切断活性の発現により核酸プローブが切断されることが好ましい。核酸プローブが切断されることによりできた各断片は、標的核酸とのハイブリダイズを維持できず標的核酸から解離し、その後、新たな核酸プローブが標的核酸に結合する。その結果、このようなシグナルの増幅を可能にする反応サイクルを容易に形成することができる。
また、本発明においては、検査対象に応じて設定された検査温度において良好な反応性が得られるように核酸プローブの反応速度が制御されているので、高い検査感度が得られ又は効率よく検査を終了することができる。
さらに、例えば生きた細胞内での検出を行う場合のように、検査温度が特に厳しく制約される場合でも、本発明の核酸プローブを用いることによって、簡便に高感度の検査を行うことが可能である。
また、本発明の核酸検出方法において、核酸プローブは担体に固定されていることが好ましい。このようにすることによって、DNAチップ、DNAマイクロアレイ等の核酸分析用デバイスを構成することができ、高感度で多量の遺伝子データを得ることが可能となる。
さらに、本発明の核酸プローブを使用した核酸分析用デバイスによれば、例えば、薬剤投与後の経過時間ごとに細胞あるいは臓器からmRNAを取り出し、本発明の核酸プローブを固定化したDNAチップ等で測定することで、遺伝子ごとのmRNA量の経時変化を見ることができる。mRNA量が増加することは、DNA分子からの遺伝情報が活発に転写されることを意味し、遺伝子の働きが増加することに対応する。この遺伝子の働きの時間変化をコンピュータ解析することで、遺伝子パスウェイの情報等が得られる。
また、塩基配列の異なる2以上の本発明の核酸プローブを同一担体に固定させた核酸検出用デバイスを構成することにより、一度に多種類の標的核酸を検出・測定することができる。
さらに、本発明の核酸プローブを使用した核酸分析用デバイスによれば、例えば、薬剤投与後の経過時間ごとに細胞あるいは臓器からmRNAを取り出し、本発明の核酸プローブを固定化したDNAチップ等で測定することで、遺伝子ごとのmRNA量の経時変化を見ることができる。mRNA量が増加することは、DNA分子からの遺伝情報が活発に転写されることを意味し、遺伝子の働きが増加することに対応する。この遺伝子の働きの時間変化をコンピュータ解析することで、遺伝子パスウェイの情報等が得られる。
また、塩基配列の異なる2以上の本発明の核酸プローブを同一担体に固定させた核酸検出用デバイスを構成することにより、一度に多種類の標的核酸を検出・測定することができる。
(実施例1)
上記本発明の核酸プローブの製造例を具体的に説明する。
(1)核酸プローブの設計
下記式(I)(配列番号1)で表される3種類の核酸プローブ(TASC1、TASC2、TASC3)を設計した。
上記本発明の核酸プローブの製造例を具体的に説明する。
(1)核酸プローブの設計
下記式(I)(配列番号1)で表される3種類の核酸プローブ(TASC1、TASC2、TASC3)を設計した。
式(I)に含まれる各機能的部位及び標的核酸にハイブリダイズした状態を以下に図示する。
核酸プローブTASC1、2及び3の構造は式(I)で表される。核酸プローブTASC1(塩基数59:配列番号2)、TASC2(塩基数57:配列番号3)及びTASC3(塩基数55:配列番号4)は、1本鎖ヌクレオチドの両端に、検出目的となる標的核酸とハイブリダイズする塩基配列を有する2つの相補部位3a(配列の長さ10塩基)、3b(配列の長さ10塩基)を設けた。そして、その中間領域にステム部形成領域4を設けた。
自己核酸酵素形成部位と各相補部位3a、3bとの間の領域には、分子内ハイブリダイズを可能とする領域を設けた。各プローブは、領域6aと6bから形成される分子内ハイブリダイズ部位6及び領域7aと7bから形成される分子内ハイブリダイズ部位7の2箇所で相補的結合可能な塩基対の種類又は存在の有無が、表1の如く相違する。また、分子内ハイブリダイズ部位7は、相補的塩基対と共にG−Tミスマッチを1つ含んでいる。
図3中、分子内ハイブリダイズ部位6に含まれる相補的塩基対の数をY、及び、分子内ハイブリダイズ部位7に含まれる相補的塩基対の数(G−Tミスマッチを除いた数)をZとすると、TASC1の場合には、Y+Z=7(Y=4、Z=3)、TASC2の場合には、Y+Z=6(Y=3、Z=3)、TASC3の場合には、Y+Z=5(Y=3、Z=2)である。
自己核酸酵素形成部位と各相補部位3a、3bとの間の領域には、分子内ハイブリダイズを可能とする領域を設けた。各プローブは、領域6aと6bから形成される分子内ハイブリダイズ部位6及び領域7aと7bから形成される分子内ハイブリダイズ部位7の2箇所で相補的結合可能な塩基対の種類又は存在の有無が、表1の如く相違する。また、分子内ハイブリダイズ部位7は、相補的塩基対と共にG−Tミスマッチを1つ含んでいる。
図3中、分子内ハイブリダイズ部位6に含まれる相補的塩基対の数をY、及び、分子内ハイブリダイズ部位7に含まれる相補的塩基対の数(G−Tミスマッチを除いた数)をZとすると、TASC1の場合には、Y+Z=7(Y=4、Z=3)、TASC2の場合には、Y+Z=6(Y=3、Z=3)、TASC3の場合には、Y+Z=5(Y=3、Z=2)である。
さらに、5'末端から18番目のチミンの塩基環の5位に消光物質Qとして「Dabcyl−dT」(Glen Research(株)社製、米国)を、また5'末端から14番目のチミンの塩基環の5位に蛍光物質Fとして「Fluorescein−dT」(Glen Research(株)社製、米国)を導入した。
(2)核酸プローブの合成
上記のように設計された各核酸プローブ(TASC1、2及び3)は、DNA合成機を使用した固相法により固相合成し、脱保護を行った後、ゲル電気泳動法により目的鎖長のヌクレチド鎖のみを分離精製した。
詳しくは、まずA−TOM−CE Phosphoramidite(Glen Research(株)社製、米国)を保護基として用いて標識物質(蛍光物質Fおよび消光物質Q)を保護し、DNA合成機(Glen Research(株)社製、米国)を用いた固相法により、1μmolスケールで、標識物質を導入した上記の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。
合成後、生成物をチューブに移し、ここにメチルアミン(40% aqueous methylamineと33% ethanolic methylamineとの等量混合溶液)を1.5mL加え、35℃で6時間インキュベートすることにより、核酸プローブを樹脂固相から切り出すと同時に、塩基部位、リン酸基、および蛍光物質部位の保護基を除去した。
上記のように設計された各核酸プローブ(TASC1、2及び3)は、DNA合成機を使用した固相法により固相合成し、脱保護を行った後、ゲル電気泳動法により目的鎖長のヌクレチド鎖のみを分離精製した。
詳しくは、まずA−TOM−CE Phosphoramidite(Glen Research(株)社製、米国)を保護基として用いて標識物質(蛍光物質Fおよび消光物質Q)を保護し、DNA合成機(Glen Research(株)社製、米国)を用いた固相法により、1μmolスケールで、標識物質を導入した上記の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。
合成後、生成物をチューブに移し、ここにメチルアミン(40% aqueous methylamineと33% ethanolic methylamineとの等量混合溶液)を1.5mL加え、35℃で6時間インキュベートすることにより、核酸プローブを樹脂固相から切り出すと同時に、塩基部位、リン酸基、および蛍光物質部位の保護基を除去した。
次に、このチューブを氷上で冷やした後、チューブを注意深く開け、滅菌状態下で上澄み液を回収し、これを完全に乾燥するまで凍結乾燥した。
凍結乾燥した後、テトラブチルアンモニウムフルオライド(1M in THF)1mLをチューブに加え、50℃で10分間振盪することにより保護基のついた核酸プローブを溶解して保護基をはずし、ついで35℃に冷却した後、再び6時間振盪した。
次に1M トリス緩衝液(pH=7.4)1mLをチューブに加え、よく振盪した。これを遠心濃縮法によってTHFを除去した。さらに、1M トリス緩衝液(pH=7.4)1mLを先ほどのチューブに加え、全量を約2mLとした。
凍結乾燥した後、テトラブチルアンモニウムフルオライド(1M in THF)1mLをチューブに加え、50℃で10分間振盪することにより保護基のついた核酸プローブを溶解して保護基をはずし、ついで35℃に冷却した後、再び6時間振盪した。
次に1M トリス緩衝液(pH=7.4)1mLをチューブに加え、よく振盪した。これを遠心濃縮法によってTHFを除去した。さらに、1M トリス緩衝液(pH=7.4)1mLを先ほどのチューブに加え、全量を約2mLとした。
(3)核酸プローブの精製
NAP−25カラム(ファルマシア社製)を水15mLで平衡化した後、先ほどの核酸プローブ溶液2mLをカラムに加えた。溶液を完全にゲルに浸透させた後、水0.5mLを加えゲル濾過を行い、未反応物を除去した。この後、水3mLを用いて脱塩した核酸プローブを溶出した。
得られた核酸プローブを凍結乾燥した後、7M尿素含有20%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。電気泳動後、UV照射することにより核酸プローブのバンド(分画)を確認し、この分画を切り出した。これを遠心管でガラス棒を用いてゲルを粉砕し、緩衝液(0.5M酢酸アンモニウム−0.1%SDS1mLのEDTA溶液 、pH=7.8)を10mL加え、37℃で6時間振盪し、遠心後に上清よりエタノール沈殿して沈殿物を回収した。この沈殿物を水0.4mLに溶解した後、−20℃で保存した。
NAP−25カラム(ファルマシア社製)を水15mLで平衡化した後、先ほどの核酸プローブ溶液2mLをカラムに加えた。溶液を完全にゲルに浸透させた後、水0.5mLを加えゲル濾過を行い、未反応物を除去した。この後、水3mLを用いて脱塩した核酸プローブを溶出した。
得られた核酸プローブを凍結乾燥した後、7M尿素含有20%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。電気泳動後、UV照射することにより核酸プローブのバンド(分画)を確認し、この分画を切り出した。これを遠心管でガラス棒を用いてゲルを粉砕し、緩衝液(0.5M酢酸アンモニウム−0.1%SDS1mLのEDTA溶液 、pH=7.8)を10mL加え、37℃で6時間振盪し、遠心後に上清よりエタノール沈殿して沈殿物を回収した。この沈殿物を水0.4mLに溶解した後、−20℃で保存した。
(実施例2)
上記実施例1で製造した核酸プローブTASC1を用いた標的核酸の検出法を具体的に説明する。
(1)ハイブリダイゼーションおよび自己核酸酵素反応
標的核酸として20merのオリゴDNAを使用した。この標的核酸100pmolと核酸プローブ(TASC1)1μmolとを、50mM トリス−25mM 塩化マグネシウム水溶液(pH=8.0)100μL中で、37℃、0〜2時間インキュベートした。
そこへ、エタノール800μLを加え、温度4℃、12,000×gで遠心することによりエタノール沈殿を行った。上清を除き、さらに残存しているエタノールを真空乾燥によって完全に除去した。
上記実施例1で製造した核酸プローブTASC1を用いた標的核酸の検出法を具体的に説明する。
(1)ハイブリダイゼーションおよび自己核酸酵素反応
標的核酸として20merのオリゴDNAを使用した。この標的核酸100pmolと核酸プローブ(TASC1)1μmolとを、50mM トリス−25mM 塩化マグネシウム水溶液(pH=8.0)100μL中で、37℃、0〜2時間インキュベートした。
そこへ、エタノール800μLを加え、温度4℃、12,000×gで遠心することによりエタノール沈殿を行った。上清を除き、さらに残存しているエタノールを真空乾燥によって完全に除去した。
(2)標的核酸の検出
A 電気泳動法による検出
真空乾燥によりエタノールが完全に除去された沈殿物をホルムアミド5μLに溶解し、7M尿素含有20% ポリアクリルアミドゲルによるゲル電気泳動を行った。UVランプを照射し、バンドの存在を確認したところ、核酸プローブよりも長さが短い核酸プローブ断片の存在が認められた。この結果、核酸プローブは標的核酸とハイブリダイゼーションし、自己切断酵素反応を起こしたことが確認され、標的核酸の存在が確認された。
B 蛍光シグナルによる検出
上記(4)と同様に標的核酸として20merのオリゴDNAを選択し、標的核酸100pmolと、核酸プローブ1μmolとを50mM トリス−25mM 塩化マグネシウム水溶液(pH=8.0)350mL中で、37℃、6時間インキュベートした。
この反応溶液に波長495nmの励起光を照射し、測定蛍光波長520nmの蛍光スペクトルの経時変化を測定した。蛍光波長520nmにおける蛍光強度の増加により、標的核酸の存在を確認することができた。
A 電気泳動法による検出
真空乾燥によりエタノールが完全に除去された沈殿物をホルムアミド5μLに溶解し、7M尿素含有20% ポリアクリルアミドゲルによるゲル電気泳動を行った。UVランプを照射し、バンドの存在を確認したところ、核酸プローブよりも長さが短い核酸プローブ断片の存在が認められた。この結果、核酸プローブは標的核酸とハイブリダイゼーションし、自己切断酵素反応を起こしたことが確認され、標的核酸の存在が確認された。
B 蛍光シグナルによる検出
上記(4)と同様に標的核酸として20merのオリゴDNAを選択し、標的核酸100pmolと、核酸プローブ1μmolとを50mM トリス−25mM 塩化マグネシウム水溶液(pH=8.0)350mL中で、37℃、6時間インキュベートした。
この反応溶液に波長495nmの励起光を照射し、測定蛍光波長520nmの蛍光スペクトルの経時変化を測定した。蛍光波長520nmにおける蛍光強度の増加により、標的核酸の存在を確認することができた。
上記実施例の結果を図4に示す。図中、実線は本実施例において標的核酸の検出を行った場合の核酸プローブ切断量を示し、点線は触媒サイクルを確立しない従来の核酸プローブを用いた場合の核酸プローブ切断量の理論値を示す。
この結果から明らかなように、従来の核酸プローブでは、1等量の標的核酸に対して理論上、最大1等量のプローブしか反応しないところ、本発明の核酸プローブでは、時間とともに切断量が増加している。このことから1等量の標的核酸に対し、1等量以上の核酸プローブが結合し、自己切断した後解離していくことがわかった。
以上のように、本発明によれば、標的核酸が微量にしか存在しないものであっても検出シグナル等を増幅でき、感度よく測定可能であることがわかる。
この結果から明らかなように、従来の核酸プローブでは、1等量の標的核酸に対して理論上、最大1等量のプローブしか反応しないところ、本発明の核酸プローブでは、時間とともに切断量が増加している。このことから1等量の標的核酸に対し、1等量以上の核酸プローブが結合し、自己切断した後解離していくことがわかった。
以上のように、本発明によれば、標的核酸が微量にしか存在しないものであっても検出シグナル等を増幅でき、感度よく測定可能であることがわかる。
(実施例3)
上記実施例1で製造した核酸プローブTASC1、2及び3の各々について、標的オリゴヌクレオチドの存在下(5倍モル過剰)及び非存在下における核酸プローブの自己開裂速度定数を測定した。
その手順としては、最終濃度1μMとなるように核酸プローブを50mM トリス−25mM 塩化マグネシウム水溶液(pH=8.0)100μL中に溶解させ、5μMの標的核酸を加えたのち、37℃でインキュベートした。核酸プローブはエタノール沈殿により回収し、全量をローディングバッファーに溶解させ、8%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動後、ATTOデンシトグラフによってそれぞれのバンド強度を定量し、標的オリゴヌクレオチド存在下での速度定数(kobs +)、標的オリゴヌクレオチド非存在下での速度定数(kobs −)、及び、アロステリック活性係数(kobs +/kobs −)を算出した。
その結果は、表2に示した通りである。
上記実施例1で製造した核酸プローブTASC1、2及び3の各々について、標的オリゴヌクレオチドの存在下(5倍モル過剰)及び非存在下における核酸プローブの自己開裂速度定数を測定した。
その手順としては、最終濃度1μMとなるように核酸プローブを50mM トリス−25mM 塩化マグネシウム水溶液(pH=8.0)100μL中に溶解させ、5μMの標的核酸を加えたのち、37℃でインキュベートした。核酸プローブはエタノール沈殿により回収し、全量をローディングバッファーに溶解させ、8%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動後、ATTOデンシトグラフによってそれぞれのバンド強度を定量し、標的オリゴヌクレオチド存在下での速度定数(kobs +)、標的オリゴヌクレオチド非存在下での速度定数(kobs −)、及び、アロステリック活性係数(kobs +/kobs −)を算出した。
その結果は、表2に示した通りである。
標的オリゴヌクレオチド存在下でのTASC1の自己開裂速度定数(kobs +)は、14×10−3min−1であり、標的オリゴヌクレオチド非存在下でのTASC1の自己開裂速度定数(kobs −)は、0.9×10−3min−1であった。kobs +/kobs −で表されるアロステリック活性係数の値が大きいほどアロステリック活性が高いことを表すが、TASC1は、この係数(kobs +/kobs −)の値がほぼ16であった。
速度定数kobs +及びkobs −の両方ともステム部から相補的塩基対(N1とN4の対及びN2とN3の対)が段階的に除去されるとき(すなわちプローブ1からプローブ2を経てプローブ3となるとき)に減少した。そして、この場合に、速度定数kobs −のほうがより高い感度で減少した。この結果、プローブ3のアロステリック活性係数(kobs +/kobs −)が最も向上したが、検知速度(kobs +)はプローブ1が最も大きかった。
表2に示した結果は、TASC1、2及び3を反応温度37℃で用いた場合の結果である。この結果より、ステム部の安定性と自己切断反応の速度は比例関係にあることが分かる。しかし、ステム部が最も安定なTASC1においても、37℃において標的核酸依存的な自己切断を起こすことが確認された。
速度定数kobs +及びkobs −の両方ともステム部から相補的塩基対(N1とN4の対及びN2とN3の対)が段階的に除去されるとき(すなわちプローブ1からプローブ2を経てプローブ3となるとき)に減少した。そして、この場合に、速度定数kobs −のほうがより高い感度で減少した。この結果、プローブ3のアロステリック活性係数(kobs +/kobs −)が最も向上したが、検知速度(kobs +)はプローブ1が最も大きかった。
表2に示した結果は、TASC1、2及び3を反応温度37℃で用いた場合の結果である。この結果より、ステム部の安定性と自己切断反応の速度は比例関係にあることが分かる。しかし、ステム部が最も安定なTASC1においても、37℃において標的核酸依存的な自己切断を起こすことが確認された。
1 標的核酸
2 核酸プローブ
3a 相補部位
3b 相補部位
4 ステム部形成領域又はステム部
5 自己核酸酵素形成部位又は自己核酸酵素
6 分子内ハイブリダイズ形成領域又は分子内ハイブリダイズ部位
7 分子内ハイブリダイズ形成領域又は分子内ハイブリダイズ部位
8 ループ部
9 切断部位
10 標識物質
F 蛍光物質
Q 消光物質
2 核酸プローブ
3a 相補部位
3b 相補部位
4 ステム部形成領域又はステム部
5 自己核酸酵素形成部位又は自己核酸酵素
6 分子内ハイブリダイズ形成領域又は分子内ハイブリダイズ部位
7 分子内ハイブリダイズ形成領域又は分子内ハイブリダイズ部位
8 ループ部
9 切断部位
10 標識物質
F 蛍光物質
Q 消光物質
Claims (22)
- 標的核酸を検出するための核酸プローブであって、
該核酸プローブは、所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有しており、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする核酸プローブ。 - 前記自己核酸酵素は、前記核酸プローブを特異的に切断する切断活性を有するものである請求項1に記載の核酸プローブ。
- 前記所定の反応温度(Tx)は、前記ステム部のみの核酸融解温度(T1)よりも高く、且つ、前記標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度(T2)よりも低い請求項1又は2に記載の核酸プローブ。
- 前記標的核酸の存在を認識容易にする標識物質を有する請求項1乃至3のいずれかに記載の核酸プローブ。
- 前記標識物質は少なくとも一対の蛍光物質と消光物質とを有する請求項4に記載の核酸プローブ。
- 担体に固定化されている請求項1乃至5のいずれかに記載の核酸プローブ。
- 核酸プローブを用いて標的核酸を検出する核酸検出方法であって、
前記核酸プローブは、所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有しており、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする核酸検出方法。 - 前記核酸プローブを、前記所定の反応温度で前記標的核酸にハイブリダイズさせるハイブリダイズ形成工程と、
ハイブリダイズさせた前記核酸プローブを同じ反応温度のまま保持して標的核酸から解離させる解離工程と、
前記解離工程で解離した前記核酸プローブの少なくとも一部を検出する検出工程と、を有することを特徴とする請求項7に記載の核酸検出方法。 - 前記自己核酸酵素の作用により前記核酸プローブが特異的に切断される請求項7又は8に記載の核酸検出方法。
- 前記所定の反応温度(Tx)は、前記ステム部のみの核酸融解温度(T1)よりも高く、且つ、前記標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度(T2)よりも低い請求項7乃至9のいずれかに記載の核酸検出方法。
- 前記核酸プローブが標的核酸の存在を認識容易にする標識物質を有する請求項7乃至10のいずれかに記載の核酸検出方法。
- 前記標識物質は、少なくとも一対の蛍光物質と消光物質とを有する請求項11に記載の核酸検出方法。
- 前記核酸プローブが担体に固定されている請求項7乃至12のいずれかに記載の核酸検出方法。
- 試料中の標的核酸を検出するための核酸プローブが担体に固定された核酸分析用デバイスであって、
前記核酸プローブは、所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有しており、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度が、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節されていることを特徴とする核酸分析用デバイス。 - 前記自己核酸酵素は、前記核酸プローブを特異的に切断する切断活性を有するものである請求項14に記載の核酸分析用デバイス。
- 前記所定の反応温度(Tx)は、前記ステム部のみの核酸融解温度(T1)よりも高く、且つ、前記標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度(T2)よりも低い請求項14又は15に記載の核酸分析用デバイス。
- 前記核酸プローブが標的核酸の存在を認識容易にする標識物質を有する請求項14乃至16のいずれかに記載の核酸分析用デバイス。
- 前記標識物質は少なくとも一対の蛍光物質と消光物質とを有する請求項17に記載の核酸分析用デバイス。
- 所定の反応温度において前記標的核酸とハイブリダイズした時に構造変化を生じて分子内ハイブリダイズ部位と自己核酸酵素を含むステム部を形成し、該自己核酸酵素の作用により標的核酸に対するハイブリダイズの結合力を減少させて前記標的核酸から解離する構造を有している核酸プローブを用いた標的核酸の検出において、
前記所定の反応温度における核酸プローブの反応速度を、分子内ハイブリダイズ部位となる配列に含まれる自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により調節することを特徴とする反応速度の制御方法。 - 自己核酸酵素の形成し易さは、前記自己ハイブリダイズ可能な相補的塩基対の数により制御される請求項19に記載の反応速度の制御方法。
- 前記自己核酸酵素は、前記核酸プローブを特異的に切断する切断活性を有するものである請求項19又は20に記載の反応速度の制御方法。
- 前記所定の反応温度(Tx)は、前記ステム部のみの核酸融解温度(T1)よりも高く、且つ、前記標的核酸とハイブリダイズした時の核酸融解温度(T2)よりも低い請求項19乃至21に記載の反応速度の制御方法。
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Cited By (6)
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WO2009066758A1 (ja) | 2007-11-22 | 2009-05-28 | Japan Science And Technology Agency | 低分子rnaによる細胞または人工細胞モデルでの翻訳制御システム |
US7833716B2 (en) | 2006-06-06 | 2010-11-16 | Gen-Probe Incorporated | Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods |
JP2010538298A (ja) * | 2007-09-07 | 2010-12-09 | ケアストリーム ヘルス インク | ナノ粒子を用いた蛍光共鳴エネルギ移動検出 |
WO2011145908A2 (ko) * | 2010-05-20 | 2011-11-24 | 고려대학교 산학협력단 | 효소가 집적된 미세튜브를 이용한 정량분석법 |
US9255274B2 (en) | 2007-11-22 | 2016-02-09 | Japan Science And Technology Agency | Protein-responsive translational regulatory system using RNA-protein interacting motif |
WO2019044974A1 (ja) * | 2017-08-31 | 2019-03-07 | 株式会社Veritas In Silico | スモールガイドアンチセンス核酸とその使用 |
-
2004
- 2004-06-02 JP JP2004165084A patent/JP2005341865A/ja active Pending
Cited By (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9284549B2 (en) | 2006-06-06 | 2016-03-15 | Gen-Probe Incorporated | Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods |
US10167500B2 (en) | 2006-06-06 | 2019-01-01 | Gen-Probe Incorporated | Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods |
US8580510B2 (en) | 2006-06-06 | 2013-11-12 | Gen-Probe Incorporated | Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods |
US8034570B2 (en) | 2006-06-06 | 2011-10-11 | Gen-Probe Incorporated | Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods |
US7833716B2 (en) | 2006-06-06 | 2010-11-16 | Gen-Probe Incorporated | Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods |
USRE48909E1 (en) | 2006-06-06 | 2022-02-01 | Gen-Probe Incorporated | Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods |
US8278052B2 (en) | 2006-06-06 | 2012-10-02 | Gen-Probe Incorporated | Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods |
JP2010538298A (ja) * | 2007-09-07 | 2010-12-09 | ケアストリーム ヘルス インク | ナノ粒子を用いた蛍光共鳴エネルギ移動検出 |
US8592569B2 (en) | 2007-11-22 | 2013-11-26 | Japan Science And Technology Agency | Small RNA-dependent translational regulatory system in cell or artificial cell model |
EP2500427A1 (en) | 2007-11-22 | 2012-09-19 | Japan Science and Technology Agency | Translation regulation system in cell or artifical cell model by using low-molecular-weight RNA |
US9057065B2 (en) | 2007-11-22 | 2015-06-16 | Japan Science And Technology Agency | Small RNA-dependent translational regulatory system in cell or artificial cell model |
US9255274B2 (en) | 2007-11-22 | 2016-02-09 | Japan Science And Technology Agency | Protein-responsive translational regulatory system using RNA-protein interacting motif |
WO2009066758A1 (ja) | 2007-11-22 | 2009-05-28 | Japan Science And Technology Agency | 低分子rnaによる細胞または人工細胞モデルでの翻訳制御システム |
WO2011145908A3 (ko) * | 2010-05-20 | 2012-05-31 | 고려대학교 산학협력단 | 효소가 집적된 미세튜브를 이용한 정량분석법 |
WO2011145908A2 (ko) * | 2010-05-20 | 2011-11-24 | 고려대학교 산학협력단 | 효소가 집적된 미세튜브를 이용한 정량분석법 |
WO2019044974A1 (ja) * | 2017-08-31 | 2019-03-07 | 株式会社Veritas In Silico | スモールガイドアンチセンス核酸とその使用 |
JPWO2019044974A1 (ja) * | 2017-08-31 | 2020-12-03 | 株式会社Veritas In Silico | スモールガイドアンチセンス核酸とその使用 |
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