JP3660718B2 - Ｒｎａの切断方法並びにそれに用いられるリボヌクレアーゼ - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、任意のＲＮＡを任意の部位で塩基配列特異的に切断することができるＲＮＡの切断方法並びにこの切断方法に用いられるリボヌクレアーゼに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＲＮＡを塩基配列特異的に切断する技術として、グループＩイントロン、リボヌクレアーゼＰ、ハンマーヘッドリボザイム及びヘアピンリボザイムを利用した方法が知られている。
【０００３】
グループＩイントロンを用いた方法は、チェックらにより報告されている(Nature 324, 429-, 1986)。彼らは、テトラヒメナのｒＲＮＡ前駆体中に発見されたセルフスプライシング能をもつグループＩイントロンを改変し、４塩基対合により標的ＲＮＡを認識するＲＮＡのみから成るエンドリボヌクレアーゼを作り出した。
【０００４】
細菌から哺乳動物まであらゆる種で存在していると考えられているｔＲＮＡ前駆体の５’プロセシング酵素（リボヌクレアーゼＰ）は、リボ核タンパク質である。大腸菌由来のものはＲＮＡ成分のみでも触媒活性を示すが、ヒト由来のものではタンパク質成分も必須である。アルトマンらは、リボヌクレアーゼＰを、標的ＲＮＡと塩基対合してｔＲＮＡ前駆体様構造を形成するようなエクスターナルガイドシークエンスと共に使用することにより塩基配列特異的エンドリボヌクレアーゼ活性を得ている(Science 249, 783-, 1990, Science 263, 1269-, 1994) 。
【０００５】
植物ウイロイドなどで発見された自己切断する５０ヌクレオチド程の小さなリボザイム（ハンマーヘッド）や、タバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡ由来のヘアピンと呼ばれている６０ヌクレオチド程の小さなリボザイムは、触媒配列と基質配列に分断することにより触媒配列を持つＲＮＡを塩基配列特異的エンドリボヌクレアーゼに改変することができる。この触媒ＲＮＡは、塩基対合により基質ＲＮＡを認識するので、触媒ＲＮＡ中の基質認識配列を変えることで、このエンドリボヌクレアーゼの塩基配列特異性を自由に変える事が出来る(Nature 328, 596-, 1987, Nucleic Acids Res. 18, 299-, 1990) 。
【０００６】
これらの他に、動物細胞のサイトゾル抽出液中に発見されたリボヌクレアーゼ６５は、塩基配列特異的ＲＮＡ切断活性を持っており、その特異性は活性に必須な３’末端が欠失した６５ヌクレオチド程のｔＲＮＡによってもたらせれることが知られている。このｔＲＮＡは２種類知られており、ひとつは、アルギニンｔＲＮＡであることが判明している。(Biochem. Biophy. Res. Commun. 176, 1163-, 1991, Biochem. Biophy. Res. Commun. 178, 1247-, 1991, Nucleic Acids Res. 20, 3737-, 1992, Nucleic Acids Res. 21, 4696-, 1993)。もうひとつは、グリシンｔＲＮＡであることが示唆されていたが、最近、グリシンｔＲＮＡではなく、アラニンｔＲＮＡであることが証明された。さらに、このリボヌクレアーゼ６５のタンパク質成分は、ｔＲＮＡ前駆体の３’プロセシング酵素と同一であり（ｔＲＮＡArg 前駆体のプロセッシングの様子を図２に示す）、標的ＲＮＡは３’欠失ｔＲＮＡの５’末端にある４塩基との塩基対合により認識されていることも証明された。リボヌクレアーゼ６５のＲＮＡ成分が３’欠失ｔＲＮＡArg の時には、５’末端配列ＧＧＧＣと標的ＲＮＡ中の４塩基配列ＧＣＣＣとが塩基対合することにより認識され、標的ＲＮＡは配列ＧＣＣＣのとなりの３’側のヌクレオチドの後で切断される（図３）。５’末端にＧＧＧＧを持つ３’欠失ｔＲＮＡAla の時は、標的ＲＮＡの配列ＣＣＣＣのとなりの３’側のヌクレオチドの後で切断が起こる（図４）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
グループＩイントロンを改変した４塩基認識エンドリボヌクレアーゼやハンマーヘッド、ヘアピンリボザイムは、標的ＲＮＡの切断部位の近くに、必須塩基があり、標的ＲＮＡの切断部位に束縛を与えている。一方、エクスターナルガイドシークエンスと共にリボヌクレアーゼＰを用いる方法や、リボヌクレアーゼ６５活性には、そのような束縛塩基は存在しないようである。グループＩイントロンを改変したエンドリボヌクレアーゼやリボヌクレアーゼ６５は、４塩基の特異性しか持たないが、ハンマーヘッド、ヘアピンリボザイム、エクスターナルガイドシークエンスと共に用いるリボヌクレアーゼＰは、標的ＲＮＡ上の１０塩基程の配列との対合を基質認識のために利用している。
【０００８】
本発明は、基質ＲＮＡ上の特定の４ヌクレオチド（ＣＣＣＣあるいはＧＣＣＣ）を認識するだけのリボヌクレアーゼ６５活性を、標的ＲＮＡの認識に関与するｔＲＮＡ成分を改変することにより、任意の塩基配列を認識して基質ＲＮＡをより特異的に切断できるようにすることをひとつの目的としてなされたものである。
【０００９】
上記のような、様々な塩基配列特異的ＲＮＡ切断活性は、ＨＩＶ−１やＨＴＬＶ−１などのレトロウイルスに感染したヒト細胞内で、このウイルス由来のＲＮＡを特異的に切断したり、ガン細胞内で、ガン化の原因となる遺伝子のｍＲＮＡを特異的に分解するのに応用できる可能性がある。そのためには、標的となる細胞にＲＮＡ、あるいは、ＲＮＡを発現するように工夫されたＤＮＡを取り込ませる必要がある。培地に加えた様々な長さのoligo(dT) の培養細胞への取り込み効率は、短いほどよく、oligo(dT)7は、oligo(dT)20 の４倍程である(Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3474-, 1989)。グループＩイントロンを改変した４塩基認識エンドリボヌクレアーゼは数百ヌクレオチド、ハンマーヘッドやヘアピンリボザイムは３０ー５０ヌクレオチド程、ヒトのリボヌクレアーゼＰと共に用いるエクスターナルガイドシークエンスは５０ヌクレオチド程必要であり、これらの長さは、細胞に直接効率よく取り込ませるには長すぎる。そこで、本発明では、細胞に取り込まれやすいより短いＲＮＡを用いて特異性の高い切断活性を生み出すことも目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、第１鎖ＲＮＡと、５’末端から少なくとも連続する５ヌクレオチドが前記第１鎖ＲＮＡと対合した第２鎖ＲＮＡとの対合部分を認識し、前記第１鎖ＲＮＡの該対合部分の３’側端部又はこの端部から１〜３塩基３’側を切断する、新規なリボヌクレアーゼを単離することに成功した。また、この新規なリボヌクレアーゼを利用すれば、切断しようとするＲＮＡ（以下、切断しようとするＲＮＡを「標的ＲＮＡ」ということがある）の任意の部分に対合する少なくとも連続する５ヌクレオチドを有する核酸とを対合したものに該リボヌクレアーゼを作用させることにより、標的ＲＮＡの対合部分の３’側端部又はこの端部から１〜３塩基３’側を切断することが可能であり、ひいては任意の標的ＲＮＡを所望の位置で切断することが可能であることを見出し本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、下記の理化学的性質を有し、ｔＲＮＡ前駆体の３’トレーラーを除去する酵素であるリボヌクレアーゼを提供する。
（１）作用及び特異性：第１鎖ＲＮＡと、５’末端から少なくとも連続する５ヌクレオチドが前記第１鎖ＲＮＡと対合した第２鎖ＲＮＡとの対合部分を認識し、前記第１鎖ＲＮＡの該対合部分の３’側端部又はこの端部から１〜３塩基３’側を切断する。
（２）至適ｐＨ：７．０−７．５
（３）至適温度５０−６０℃
（４）分子ふるいクロマトグラフィーによる分子量１００ｋＤａ
（５）クロマトフォーカシング法による等電点４．５
【００１２】
また、本発明は、切断すべき標的ＲＮＡの少なくとも連続する５塩基と相補的なガイド配列を５’側端部に有する核酸から成るＲＮＡ切断ガイド剤の前記ガイド配列を前記標的ＲＮＡの相補的部分と対合させ、これに前記本発明のリボヌクレアーゼを作用させることから成るＲＮＡの切断方法を提供する。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明の新規なリボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼ６５として知られるリボ核タンパク質のタンパク成分である。
【００１５】
リボヌクレアーゼ６５活性は、哺乳動物細胞や植物細胞のサイトゾル抽出液内での存在が知られており、最近、このリボヌクレアーゼ６５のタンパク質成分は、ｔＲＮＡ前駆体の３’プロセシング酵素と同一であることが証明された。ｔＲＮＡ前駆体の３’プロセシング酵素は、ｔＲＮＡ前駆体の３’トレーラーを除去する活性を持つエンドリボヌクレアーゼであり、原核細胞での存在は報告されていないが、すべての真核細胞に存在すると考えられている(tRNA:Structure, Biosynthesis, and Function, Chapters 5 and 9, ASM Press, 1995) 。ｔＲＮＡ前駆体３’プロセシング酵素活性は、サイトゾル抽出液、核抽出液、ミトコンドリア抽出液、葉緑体抽出液の中に見いだされている。これらの活性が同一のタンパク質によるものかは知られていないが、これらの酵素活性を、３’欠失ｔＲＮＡや、本発明のＲＮＡ切断用塩基配列を用いて、塩基配列特異的エンドリボヌクレアーゼに改変できる可能性もある。
【００１６】
このリボヌクレアーゼ６５のタンパク成分に関しては、その粗精製物について報告があるが(Nucleic Acids Res. 20, 3737-, 1992)、いまだ精製単離された例は無い。以下、本発明のリボヌクレアーゼの理化学的特徴を示す。なお、以下の値は、豚肝臓由来のリボヌクレアーゼ６５のタンパク成分（ｔＲＮＡ前駆体３’プロセシング酵素）を、基質として１９ヌクレオチドの３’トレーラーを持つｔＲＮＡArg 前駆体5' GGGCCAGUGGCGCAAUGGAUAACGCGUCUGACUACGGAUCAGAAGAUUCCAGGUUCGACUCCUGGCUGGCUCG|GUGUAAGCAGGGUCGUUUU 3' （｜は切断部位）を用いて測定した際の値である。
【００１７】
(1) 作用及び特異性：
第１鎖ＲＮＡと、５’末端から少なくとも連続する５ヌクレオチドが前記第１鎖ＲＮＡと対合した第２鎖ＲＮＡとの対合部分を認識し、前記第１鎖ＲＮＡの該対合部分の３’側端部又はこの端部から１〜３塩基３’側を切断する。
(2) 至適ｐＨ：
７．０−７．５
(3) 至適温度
５０−６０℃
(4) 分子ふるいクロマトグラフィーによる分子量
１００ｋＤａ
(5) クロマトフォーカシング法による等電点
４．５。
なお、これらの理化学的性質の測定方法は下記実施例に具体的に記載されている。
【００１８】
本発明のリボヌクレアーゼは、例えば以下の２通りの方法により得ることができるが、調製方法はこれらに限定されるものではない。
【００１９】
培養細胞、動物組織などから、Dignamら(Nucleic Acids Res. 11, 1475-, 1983)の方法に従って、サイトゾル抽出液を得た後、以下のようにして純度を高めていく。この過程は、すべて４℃で行う。培養細胞あるいは、動物組織に、２倍体積のバッファーＡ（１０ｍＭヘペス、ｐＨ７．９、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ジチオスレイトール）を加え、ダウンスホモジェナイザーを用いて、１５回すりつぶす。１，０００ｘＧで１０分間遠心後の上清に、１０分の１体積のバッファーＢ（０．３Ｍヘペス、ｐＨ７．９、１．４ＭＫＣｌ、０．０３Ｍ ＭｇＣｌ2 ）を加えた後、１００，０００ｘＧで１時間遠心する。この上清を、バッファーＤ（２０ｍＭヘペス、ｐＨ７．９、１００ｍＭＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール、２０％グリセロール）に対して約５時間透析する。その後、５０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、沈澱物をバッファー2 （20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol ）で溶解して、同じバッファー2 で、透析する。この透析後の試料を、バッファー3 （20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT)で前もって平衡化したＱセファロースにかけて、バッファー3 でカラム体積量洗い、０から１，０００ｍＭＫＣｌの線形勾配によりタンパク質を溶出させる。この時、目的のタンパク質成分はおよそ３５０ｍＭＫＣｌの付近で溶出される。この画分を、５００ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー3 で前もって平衡化したブルーセファロースにかけ、カラム体積の５倍の同バッファーで洗う。結合したタンパク質を、２，０００ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー3 で溶出させ、限外濾過法によりバッファー３を使って脱塩濃縮する。この時のフロースルー画分を用いて再度同様にブルーセファロースカラムクロマトグラフィーを行う。２度目のブルーセファロースカラムクロマトグラフィーで結合した画分は、１度目の画分よりも６倍程比活性が高い。このブルーセファロース結合画分を、ＫＣｌを含まないバッファーＤを用いて限外濾過法により脱塩濃縮された後に、−８０℃で、使用するまで保存する。
【００２０】
本発明のリボヌクレアーゼは、次のようにして肝臓などの動物組織から得ることもできる。以下の操作は、５５℃熱処理の他は４℃で行う。組織に２倍体積のバッファー１（50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol ）を加えて、回転式刃のミキサーで２分間細胞を破砕し、１３，０００ｘＧで３０分間遠心する。この上清中に目的タンパク質があり、以下のようにして純度を高めていくことができる。９０℃の水浴で５５℃になるまで熱をかけ、ひき続き５５℃の水浴で５分間靜置する。その後、１３，０００ｘＧで３０分間遠心し、上清を得る。この上清に５０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、沈澱物を６，０００ｘＧで１時間遠心し回収する。この沈澱物をバッファー2 （20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol ）で溶解して、同じバッファー2 で、５回バッファー交換をして透析する。この透析後の試料を、バッファー3 （20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT)で前もって平衡化したＱセファロースにかけて、バッファー3 でカラム体積量洗い、０から１０００ｍＭ ＫＣｌの線形勾配によりタンパク質を溶出させる。この時、目的のタンパク質成分はおよそ３５０ｍＭ ＫＣｌの付近で溶出される。この画分を、５００ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー３で前もって平衡化したブルーセファロース（ファルマシア社製）にかけ、カラム体積の５倍の同バッファーで洗う。結合したタンパク質を、２０００ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー３で溶出させ、限外濾過法によりバッファー３を使って脱塩濃縮する。この時のフロースルー画分を用いて再度同様にブルーセファロースカラムクロマトグラフィーを行う。２度目のブルーセファロースカラムクロマトグラフィーで結合した画分は、一度目の画分よりも６倍程比活性が高い。この２度目の結合画分を、さらに、１００ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー3 で平衡化したヘパリンセファロースにかけられ、カラム体積の５倍量の同バッファーで洗浄する。その後、１００から２０００ｍＭ ＫＣｌの線形勾配によりタンパク質を溶出させる。目的のタンパク質は、１２００ｍＭ ＫＣｌ付近で溶出する。この画分を、限外濾過法によりバッファー3 を使って脱塩濃縮した後、バッファー3 で平衡化したＭｏｎｏＱカラムにかける。溶出は、０から１０００ｍＭ ＫＣｌの線形勾配で行い、目的の活性は、４００ｍＭ ＫＣｌ付近で溶出する。高度に精製されたこのタンパク質は、使用するまで−８０℃で保存する。
【００２１】
次に本発明の方法に使用されるＲＮＡ切断ガイド剤について説明する。ＲＮＡ切断ガイド剤は、標的ＲＮＡと対合することにより、前記本発明のリボヌクレアーゼによる標的ＲＮＡの切断を可能にするものであり、その本質は核酸である。核酸としてはＲＮＡが好ましい。また、ここで言う「核酸」には、標的ＲＮＡとの対合を阻害しない修飾を受けた核酸誘導体も包含される。このような核酸誘導体の例として、ホスホロチオエート化核酸を挙げることができる。また、ＲＮＡ切断ガイド剤の５’末端は一燐酸、三燐酸、水酸基のいずれでもよく、３’末端に関しても一燐酸、水酸基のどちらでもよい。
【００２２】
図１に本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の好ましい基本型を示す。なお、後述のように、この基本型のうち、必須な部分はガイド配列だけであり、ガイド配列のみから成るＲＮＡ切断ガイド剤も本発明の範囲に含まれる。また、ガイド配列以外の部分を含む場合であっても、後述のように種々の形態が可能であり、図１に示したものはあくまでも好ましい１例である。
【００２３】
図１に示す、本発明のＲＮＡ切断ガイド剤１０の好ましい基本型は、５’末端にあるガイド配列１２と、それに続くステム・ループ部１４と、それに続くサブガイド配列１６と、それに続く任意の３’配列１８とから成る。ステム・ループ部１４のステムの部分にある短い縦の線は向い合った塩基が対合した塩基対合を示す。なお、この基本型は図５に示すｔＲＮＡ前駆体の５’側前半部の構造と類似している。
【００２４】
図１に示す基本型が、標的ＲＮＡと対合して複合体を形成した様子の一例が図６に示されている。図６中、矢印は本発明のリボヌクレアーゼによる切断部位を示し、また、縦、横の短い線は向い合ったヌクレオチド間の塩基対合を示す。図６に示されるように、ガイド配列１２とサブガイド配列１６が標的ＲＮＡと対合しており、標的ＲＮＡのガイド配列との対合部の３’側端部又はこの端部から１〜３塩基３’側が切断される。なお、図６に示す例では、標的ＲＮＡが図５に示すｔＲＮＡ前駆体の３’側後半部と類似した形態を有しているが、後述のように、標的ＲＮＡの形態はこのようなものに限定されない。
以下、上記基本型の各要素について説明する。
【００２５】
ガイド配列１２は、上記基本型の５’末端に位置し、図５に示すｔＲＮＡ前駆体のアクセプターステムに対応する。このガイド配列は、切断しようとする標的ＲＮＡの一部と相補的であってこれと対合し、この対合部分の標的ＲＮＡの３’側端部又はこの端部から１〜３塩基３’側が切断される（図６）。ガイド配列の長さは少なくとも５塩基であり、通常５〜７塩基、好ましくは７塩基である。本発明のＲＮＡ切断ガイド剤において必須の部分はこのガイド配列だけであり、従って、本発明のＲＮＡ切断ガイド剤は、最も単純な構造の場合、単に５ヌクレオチドのみから成る核酸であることができる。
【００２６】
図１に示す基本型では、ガイド配列１２の３’側下流にステム・ループ部１４が存在する。ステム・ループ部１４は、ｔＲＮＡ分子中のＤステム・ループ領域と同一又は類似の配列であることが好ましく、通常１９〜２２塩基から成る。もっとも、本発明の切断法によるＲＮＡの切断効率の低下を問題にしない場合には、この配列を短くしたり削除することも可能である（図８、図９、図１０）。
【００２７】
図１に示す基本型では、ループ・ステム部１４の３’側下流にサブガイド配列１６が存在する。このサブガイド配列は、切断しようとする標的ＲＮＡの一部と相補的であり、対合する（図６）。サブガイド配列１６は、通常３塩基から５塩基から成り、好ましくは５塩基から成る。なお、サブガイド配列は必須的ではなく、切断効率の低下を問題にしなければ存在しなくてもよい（図１０、図１１）。なお、サブガイド配列が存在する場合には、ガイド配列との間が少なくとも７塩基、好ましくは少なくとも１１塩基離れていることが好ましいが、ガイド配列とサブガイド配列が直接つながっていてもよい（図９）。
【００２８】
図１に示す基本型では、サブガイド配列の３’側下流に任意の３’配列を有する。この任意の３’配列は、通常３〜５塩基程度、特に５塩基程度であるが、存在しなくても切断効率の低下は起きない。また、本発明のリボヌクレアーゼによる認識及び切断を阻害しない範囲で、この３’配列は任意の長さの任意の配列にすることができる。例えば、図１２に示すように、ｔＲＮＡ分子のＴステム・ループ領域の３’末端までとすることもできるし、また、図１３に示すように、ｔＲＮＡ分子のＴステム・ループ領域の途中までとすることもできる。
【００２９】
上記した種々の形態のＲＮＡ切断ガイド剤が、標的ＲＮＡと対合して形成される複合体の種々の態様を図６ないし図１３に基づき説明する。もっとも、これらは例示であり、ＲＮＡ切断ガイド剤と標的ＲＮＡとの複合の形態はこれらに限定されるものではなく、本発明のリボヌクレアーゼにより切断可能ないかなる態様のものであってもよい。なお、これらの各図とも矢印の位置は切断部位を示す（ただし、上述のように、切断位置は対合部分の３’側端部からさらに１〜３塩基３’側（標的ＲＮＡの３’側）になることもある）。
【００３０】
図６に示す態様では、図１に示す基本型のＲＮＡ切断ガイド剤と、ｔＲＮＡ前駆体分子の３’側後半部分の形態を有する標的ＲＮＡとが対合している。この態様では、標的ＲＮＡは、ｔＲＮＡ前駆体分子のＴステム・ループ領域及びその５’側上流にエクストラループ領域に対応する領域を有する。
【００３１】
図７に示す態様では、基本形のＲＮＡ切断ガイド剤と、ほぼ線状の標的ＲＮＡが対合している。この図に示されるように、標的ＲＮＡにはｔＲＮＡ前駆体分子のＴステム・ループ領域やエクストラループ領域は必要ではない。
【００３２】
図８に示す態様では、標的ＲＮＡは図６に示すものと同様な形態であるが、ＲＮＡ切断ガイド剤のガイド配列とサブガイド配列とをつなぐ部分がループ・ステムになっておらず、ほぼ線状になっている。
【００３３】
図９に示す態様では、ＲＮＡ切断ガイド剤のガイド配列とサブガイド配列が直接つながっており、それに対応して標的ＲＮＡも線状になっている。
【００３４】
図１０に示す態様では、ＲＮＡ切断ガイド剤はガイド配列のみからなり、標的ＲＮＡはｔＲＮＡ前駆体分子の３’側後半と同様な形態をしている（ただし、エクストラループ領域はない）。
【００３５】
図１１に示す態様では、ＲＮＡ切断ガイド剤のサブガイド配列以降がなく、標的ＲＮＡはｔＲＮＡ前駆体分子の３’側後半と類似した形態になっている（ただし、エクストラループ領域はない）。
【００３６】
図１２に示す態様では、ＲＮＡ切断用ガイド剤がｔＲＮＡ分子のＴステム・ループ領域の３’末端までのような形態になっており、標的ＲＮＡはほぼ線状の形態をしている。
【００３７】
図１３に示す態様では、ＲＮＡ切断用ガイド剤が、ｔＲＮＡ分子のＴステム・ループ領域の途中までのような形態になっており、標的ＲＮＡはほぼ線状であるがガイド剤との対合により直角に曲がっている。
【００３８】
本発明のＲＮＡ切断ガイド剤は、以下の２通りの方法により得ることができる。
【００３９】
ひとつは、鋳型となるＤＮＡを化学的に合成し、ＲＮＡポリメラーゼを用いて試験管内転写反応により合成する方法である。鋳型ＤＮＡは、合成したいＲＮＡに対応するＤＮＡ塩基配列の上流に、バクテリオファージ由来のＴ７，Ｔ３，ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼなどのプロモーター塩基配列を持つものと、これの相補鎖をパーキンエルマー社等の市販のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて合成する。精製された２本のＤＮＡをアニーリングさせ、宝酒造、日本ジーン社等から得られる、上記ＲＮＡポリメラーゼを用いて、製造元の説明書に従って目的とするＲＮＡ切断用ＲＮＡを合成する。
【００４０】
二つ目の方法は、上記のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機等を用いて直接化学的に合成する方法である。
【００４１】
どちらの方法においても、合成されたＲＮＡおよびその誘導体は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動あるいは、ＨＰＬＣなどを用いて、精製した後、使用する。
【００４２】
なお、図１に示すような、ステム・ループ部は、普通は自然に形成されるが、場合によっては、８０℃で１分間加熱した後に徐々に室温まで下げることにより形成される。
【００４３】
標的ＲＮＡの切断は、標的ＲＮＡ、本発明のＲＮＡ切断ガイド剤及び本発明のリボヌクレアーゼを緩衝液中で好ましくは２０〜５０℃、特に好ましくは３７℃、ｐＨ６．５〜８．５、特に好ましくはｐＨ７．９で反応させることにより行うことができる。用いるリボヌクレアーゼの量は、特に限定されず、酵素の量が少なくても時間がかかるだけで切断反応は可能であるが、通常、標的ＲＮＡ０．１ピコモルに対して１〜５ユニット程度が好ましい。なお、ここで、１ユニットとは、ｔＲＮＡArg 前駆体０．１ｐｍｏｌの３’トレーラーと、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＤＴＴ、３．２ｍＭスペルミジン溶液１０μｌ中で３７℃で１０分間反応させることにより５０％切除できる量として定義されるものである。また、用いるＲＮＡ切断ガイド剤の量は、特に限定されないが、標的ＲＮＡに対してモル基準で１０〜１００倍程度が好ましい。また、標的ＲＮＡの濃度の下限は存在せず、１分子であっても切断は可能である。標的ＲＮＡの濃度の上限も特にないが、通常１００μＭ以下であることが好ましい。また、反応時間は、標的ＲＮＡの濃度や用いるリボヌクレアーゼの量等に基づき適宜選択されるが、上記の好ましい条件下においては、通常３０〜６０分間程度である。また、緩衝液としては、特に限定されず、ヘペス、トリス、ビストリス緩衝液等が好ましいがこれらに限定されるものではない。また、緩衝液は０．５〜１．０ｍＭのジチオスレイトール及び１〜５ｍＭのスペルミジンを含むことが好ましい。また、外来の非特異的リボヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼＡ等）による、標的ＲＮＡ及びＲＮＡ切断ガイド剤の非特異的分解を抑えるために、反応液中に市販のリボヌクレアーゼ阻害剤（例えば宝酒造社製）を加えることも可能である。
【００４４】
in vitroでの切断の効率を測定するために切断産物を解析する場合には、予め標的ＲＮＡを標識しておくことが好ましい。例えば、標的ＲＮＡは、［α−32Ｐ］ＮＴＰ（ＮはＡ，Ｕ，ＧまたはＣ）の存在下で合成することにより、32Ｐで均一に標識することができる。32Ｐで標識された反応物は、８Ｍウレアを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離され、その後、オートラジオグラフィーによりＲＮＡ切断効率等を解析することができる。切断部位は、標的ＲＮＡの切断産物の長さから決定されうるが、化学的ＲＮＡ塩基配列決定法や末端ヌクレオチドの２次元薄層クロマトグラフィー法を用いて確認することもできる(Nucleic Acids Res. 21, 4696-, 1993)。実際のＲＮＡ切断は、切断予定部位の他に切断予定部位から１−２ヌクレオチドずれた所でも見られたり、切断予定部位から１ヌクレオチド下流でのみ見られることもある。
【００４５】
本発明の塩基配列特異的ＲＮＡ切断方法のin vitroでの応用について以下に説明する。
【００４６】
１．遺伝子工学への応用。ＤＮＡ制限酵素がＤＮＡ工学的手法において必須であるように、塩基配列特異的ＲＮＡ切断方法はＲＮＡ工学において様々な所で応用されうる。たとえば、二つ以上の大きなＲＮＡを塩基配列特異的に切断し、その断片のパターンを比較することにより、その類似性を解析することができる。さらに、断片化することにより、ＲＮＡの詳細な解析は、大きなＲＮＡそのものよりもはるかに容易にできるようになる。その他にも、本発明の塩基配列特異的ＲＮＡ切断法は、自由に特異的切断部位を設定できるので、ＲＮＡリガーゼと共に用いることにより原理的にＲＮＡ分子間のあらゆる組換えを可能にする。この組換え技術は、ＤＮＡ組換えにも利用できる。従来のＤＮＡ組換え技術では、４から８塩基配列（ほとんどがパリンドローム構造）特異的にＤＮＡを切断するＤＮＡ制限酵素が用いられているが、この酵素ではＤＮＡの切断部位（組換え部位）が限定されてしまう。一方、本発明の塩基配列特異的ＲＮＡ切断法では、ＲＮＡのより長い塩基配列（パリンドローム構造に限定されない）を認識し切断できる。そこで、組換えたいＤＮＡを転写反応によりＲＮＡに変換し、このＲＮＡに上記のＲＮＡ組換え法を施し、組換えられたＲＮＡを逆転写反応でＤＮＡに再変換することにより、原理的にＤＮＡ分子間のあらゆる組換えを可能にする。
【００４７】
２．診断薬への応用。特定の既知ＲＮＡが細胞内に存在しているかどうか、あるいは、そのＲＮＡが突然変異を起こして細胞内に存在しているかを解析するために応用できる。細胞からＲＮＡ混合物をヌクレアーゼにより分解されないように注意深く抽出し、３’末端の水酸基をｐＣｐなどを用いてＲＮＡリガーゼにより完全にブロックする。存在を調べたいＲＮＡを特異的に切断できる本発明のＲＮＡ切断ガイド剤（３’末端水酸基をｐＣｐ等を用いてブロックしておく）を合成し、リボヌクレアーゼ６５タンパク質と共に用いて、抽出した全ＲＮＡに対して切断反応を行う。この反応後、３２ｐＣｐなどの放射性標識を用いて、特異的切断により生じた３’末端水酸基にＲＮＡリガーゼにより標識する。この時、目的ＲＮＡの５’切断産物の他は３’末端水酸基を持たないので標識されない。未反応の３２ｐＣｐを除去した後、放射能測定やゲル電気泳動を行うことにより、目的ＲＮＡの存在を調べることができる。目的ＲＮＡ上のＲＮＡ切断ガイド剤との塩基対合領域に突然変異がある場合には、特異的切断の低下がおこるので、正常ＲＮＡを含む試料との比較により、容易に検出できる。この方法は、ＨＩＶ感染の診断、がんの診断など多くの診断に応用可能である
【００４８】
次に、本発明の培養細胞などでのＲＮＡ切断方法および切断結果の解析法について説明する。
【００４９】
本発明のリボヌクレアーゼ、すなわち、リボヌクレアーゼ６５タンパク質即ちｔＲＮＡ前駆体３’プロセシング酵素は、サイトゾル抽出液、核抽出液、ミトコンドリア抽出液、葉緑体抽出液の中に見いだされており、すべての真核細胞に存在すると考えられている。従って、本発明のＲＮＡ切断ガイド剤を細胞内に持ち込むことにより、任意のＲＮＡを任意の部位で特異的に切断できると考えられる。in vitroで目的の標的ＲＮＡの目的の部位での切断に用いられることが確認されたＲＮＡ切断ガイド剤は、in vitroで合成したものを直接導入するか、または、このＲＮＡを細胞内転写反応で合成できるような、転写制御領域を含むＤＮＡとして導入する。この切断用ＲＮＡあるいはヌクレアーゼ耐性のある様々な誘導体のin vitroでの合成は、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機等を用いて行うことができる。切断用ＲＮＡ発現ＤＮＡは、目的のＲＮＡ切断ガイド剤に対応するＤＮＡを合成機等を用いて化学合成し、これを標準的遺伝子工学技術を用いて発現ベクターに組み込むことで得ることができる(Molecular cloning A laboratory manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons Inc., 1990)。細胞内への導入法としては、燐酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法など様々な方法がある(Molecular cloning A laboratory manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons Inc., 1990)。切断結果は、標的ＲＮＡの量、タンパク質をコードしているのであればその量、細胞特性などから解析される。特異的に切断された標的ＲＮＡが不安定になり分解されていく結果として標的ＲＮＡ量が減少するので、ノーザンブロッティング法やリボヌクレアーゼプロテクションマッピング法を用いて、この減少を解析することで標的ＲＮＡの特異的切断の程度を判定できる。コードされているタンパク質の量は、それに対する抗体を用いたウエスタンブロッティング法や、そのタンパク質の活性の測定を行うことで解析でき、タンパク質の減少量から間接的に目的ＲＮＡの切断効率を判定できる。標的ＲＮＡの翻訳産物が、細胞増殖速度や細胞形態などの細胞特性に影響を及ぼすタンパク質であるならば、その特性の変化から標的ＲＮＡの特異的切断の程度を解析することができる。
【００５０】
次に、本発明の特異的ＲＮＡ切断法の生物個体に対する応用およびその切断結果の解析法について説明する。
【００５１】
生物個体に対しても、基本的には上記の培養細胞等に対する応用方法が利用される。ただし、個体内の細胞へのＲＮＡ切断ガイド剤、または、その発現用ＤＮＡの導入方法に関しては、様々な工夫が必要である。
【００５２】
動物を対象にする場合には、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスなどから開発したウイルスベクターを利用することができる(Blood, 76, 271-, 1990, Cell, 68, 143-, 1992, J. Virol., 63, 3822-, 1989) 。センダイウイルスのエンベロープタンパク質を用いた膜融合リポソーム法(J. Biol. Chem., 266, 3361-, 1991)や、プラスミドＤＮＡなどを直接臓器や腫瘍に注入するネイキドＤＮＡ法(Science, 247, 1465-, 1990) なども用いることができる。組織特異的遺伝子導入法として、特異的受容体を介して細胞に取り込まれるタンパク質とポリリシン及びＤＮＡとの複合体を用いて、この受容体を発現している細胞にのみ遺伝子を導入する方法を使うことも考えられる(Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 3410-, 1990) 。標的細胞が造血幹細胞である場合には、細胞を一旦個体外に取り出して、遺伝子導入をした後に再び個体に戻してやる方法を利用できる(Hum. Gene Ther., 1, 331-,1990) 。標的ＲＮＡとしては、異常発現した細胞増殖関連遺伝子のｍＲＮＡやウイルス由来のＲＮＡなどを対象にすることもできる。生物個体に対する本発明の特異的ＲＮＡ切断法の効果の解析に関しては、上記の培養細胞に対する解析法に加えて、ウイルス感染症が直る、腫瘍が消失するなどの個体レベルでの変化から、本発明の効果を推測することができる。
【００５３】
他にも、生物個体に対する応用として、有用トランスジェニック植物の作出がある。ＲＮＡ切断ガイド剤を細胞内転写反応で合成できるような、転写制御領域を含むＤＮＡを植物細胞に導入する方法として、Ｔｉプラスミドとアグロバクテリウムを利用した方法、燐酸カルシウム法、ウイルスベクター法などがある（植物バイオテクノロジーＩＩ、東京化学同人、１９９１）。標的ＲＮＡとしては、植物が本来持っている好ましくない遺伝形質に関与するｍＲＮＡや、ウイルス由来のＲＮＡなどが考えられる。植物個体に対する本発明の特異的ＲＮＡ切断法の効果の解析に関しては、上記の培養細胞に対する解析法に加えて、問題の好ましくない遺伝形質が抑えられる、ウイルス抵抗性になるなどの個体レベルでの変化から、本発明の効果を推測することができる。
【００５４】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００５５】
実施例１ リボヌクレアーゼの単離
以下の操作は、５５℃熱処理の他は４℃で行った。２ｋｇのブタ肝臓組織に２倍体積のバッファー１（50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol ）を加えて、回転式刃のミキサーで２分間細胞を破砕し、１３，０００ｘＧで３０分間遠心した。９０℃の水浴で５５℃になるまで熱をかけ、ひき続き５５℃の水浴で５分間靜置した。その後、１３，０００ｘＧで３０分間遠心し、上清を得た。この上清に５０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、沈澱物を６，０００ｘＧで１時間遠心し回収した。この沈澱物をバッファー２（20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol ）で溶解して、同じバッファー２で、５回バッファー交換をして透析した。この透析後の試料を、バッファー３（20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT)で前もって平衡化したＱセファロース（ファルマシア社製）にかけて、バッファー３でカラム体積量洗い、０から１０００ｍＭ ＫＣｌの線形勾配によりタンパク質を溶出させた。この時、目的のタンパク質成分はおよそ３５０ｍＭ ＫＣｌの付近で溶出された。この画分を、５００ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー３で前もって平衡化したブルーセファロース（ファルマシア社製）にかけ、カラム体積の５倍の同バッファーで洗った。結合したタンパク質を、２０００ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー３で溶出させ、限外濾過法によりバッファー３を使って脱塩濃縮した。この時のフロースルー画分を用いて再度同様にブルーセファロースカラムクロマトグラフィーを行った。２度目のブルーセファロースカラムクロマトグラフィーで結合した画分は、一度目の画分よりも６倍程比活性が高かった。この２度目の結合画分を、さらに、１００ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー３で平衡化したヘパリンセファロースにかけ、カラム体積の５倍量の同バッファーで洗浄した。その後、１００から２０００ｍＭ ＫＣｌの線形勾配によりタンパク質を溶出させた。目的のタンパク質は、１２００ｍＭ ＫＣｌ付近で溶出した。この画分を、限外濾過法によりバッファー3 を使って脱塩濃縮した後、バッファー３で平衡化したＭｏｎｏＱカラムにかけた。溶出は、０から１０００ｍＭ ＫＣｌの線形勾配で行い、目的の活性は、４００ｍＭ ＫＣｌ付近で溶出した。高度に精製されたこのタンパク質は、使用するまで−８０℃で保存した。
【００５６】
上記の各工程後のリボヌクレアーゼの総活性、比活性、収率及び精製率を下記表１に示す。表１に示されるように、熱処理後の酵素画分の約１５，０００倍の比活性を持つ、高度に精製された酵素がMono Qクロマトグラフィー後に得られた。
【００５７】
【表１】
【００５８】
実施例２ リボヌクレアーゼの理化学的性質
(1) 至適ｐＨ
ｔＲＮＡArg 前駆体を基質とし、上記方法により単離されたリボヌクレアーゼによる切断実験を種々のｐＨ下で行うことにより、リボヌクレアーゼの至適ｐＨを調べた。ｔＲＮＡArg 前駆体(GenBank/EMBL accession number X64282)は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む合成ＤＮＡからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて［α-32P]UTP存在下で合成した。切断反応は、0.1 pmol 基質ＲＮＡ，10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 3.2 mMスペルミジン、 50 ユニットのリボヌクレアーゼインヒビター（宝酒造社製、１ユニットの定義は、５ｎｇのＲＮａｓｅＡの特性を５０％阻害する活性）を含む１０μｌ溶液中３７℃で３０分間行い、その後、８Ｍウレアー１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により切断産物の解析を行った。ただし、酵素量は約0.1 ユニット使用し、ＴｒｉｓバッファーのｐＨは変化させた。
【００５９】
結果を図１４に示す。図１４に示されるように、本発明のリボヌクレアーゼの至適ｐＨは７．０ないし７．５である。
【００６０】
(2) リボヌクレアーゼの至適温度
種々の温度下において、ｔＲＮＡArg を基質とし、至適ｐＨを測定したのと同様な切断実験を行った（ただし、緩衝液のｐＨは７．９）。結果を図１５に示す。これからわかるように、本発明のリボヌクレアーゼの至適温度は５０〜６０℃であった。
【００６１】
(3) リボヌクレアーゼの分子量
ブタ肝臓由来のリボヌクレアーゼ６５タンパク質（ｔＲＮＡ前駆体３’プロセシング酵素）の天然状態での分子量。ＭｏｎｏＱクロマトグラフィー後の酵素画分（表１）を、０．１５Ｍ ＫＣｌを含むバッファー３で平衡化したスーパーデックス２００ＨＲ１０／３０（ファルマシア）にかけ、４０の分画（Fraction）に分けた。各分画は、限外濾過法によりバッファー３を用いて脱塩濃縮され、その一部を用いてｔＲＮＡArg 前駆体を基質として、上記至適ｐＨを測定したのと同様な切断実験を行った（ただし、緩衝液のｐＨは７．９）。キャリブレーションは、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）、アルブミン（６７ｋＤａ）、ベータラクトグロブリン（３５ｋＤａ）を分子量マーカーとして行った。
【００６２】
結果を図１６に示す。図１６中、挿入図のＫａｖは、（溶出体積−排除体積）／（ベッド体積−排除体積）で定義される。矢頭は、切断活性のピークの位置を示す。図１６より、上記方法により測定された、本発明のヌクレオチドの分子量は約１００ｋＤａであることがわかる。
【００６３】
(4) リボヌクレアーゼの等電点
一回目のブルーセファロースクロマトグラフィー結合画分（表１）を、０．０２５Ｍメチルピペラジン（ｐＨ５．７）で平衡化したMonoP HR5/20 （ファルマシア）にかけ、ポリバッファー７４（ｐＨ４．０）で溶出させ、１５の分画（Fraction）に分けた。各分画は、限外濾過法によりバッファー３を用いて濃縮し、その一部を用いてｔＲＮＡArg 前駆体を基質として、分子量測定の場合と同じ条件で切断実験を行なった。結果を図１７に示す。図１７から、本発明のリボヌクレアーゼの等電点は約４．５であることがわかる。
【００６４】
(5) 本発明のリボヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼ６５のタンパク質成分）とｔＲＮＡ前駆体３’プロセシング酵素(3' tRNase) が同一であることの証明。
ｔＲＮＡArg 前駆体(Pre-tRNA)（レーン１から３）、基質ＲＮＡ（Ｓ１）（レーン４から６）および基質ＲＮＡ（Ｓ２）（レーン７から９）の、単離された（表１のＭｏｎｏＱクロマトグラフィー後の）リボヌクレアーゼ(0.4ユニット) による切断実験の結果を示している。１９ヌクレオチドの３’トレーラーを持つ９２ヌクレオチドのｔＲＮＡArg 前駆体(GenBank/EMBL accession number X64282)は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む合成ＤＮＡからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて［α -32P]UTP 存在下で合成した。１６８ヌクレオチドの基質ＲＮＡ（Ｓ１）は、ＨｉｎｆＩで切断されたｐＳＰＣからＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて［α-32P]UTP存在下で合成した。５０ヌクレオチドの基質ＲＮＡ（Ｓ２）は、ＸｂａＩで切断されたｐＳＰＣからＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて［α-32P]UTP存在下で合成した(Nucleic Acids Res. 21, 4696-, 1993)。切断反応及び切断産物の解析は、分子量測定の場合と同じ条件で行った。Ｓ１は10 ng の３’欠失ｔＲＮＡArg 画分（レーン６）、Ｓ２は10 ng の３’欠失ｔＲＮＡAla 画分（レーン９）が存在する時にのみ切断された。一番左のカラムの数字の単位はヌクレオチドで、棒は基質ＲＮＡ、矢頭は切断産物を示す。
【００６５】
実施例３
マウスＦＭ３Ａ細胞（新潟大学医療技術短期大学部 三間博士より分譲。なお、同細胞はＪＣＲＢ細胞バンク（Japanese Research Resources Bank) にＪＣＲＢ０７０１の受託番号で寄託されているので、ここから分譲を受けることができる）から、実施例１と同様にして本発明のリボヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼ６５のタンパク質成分）を単離した。
【００６６】
実施例４
１９ヌクレオチドの３’トレーラーを持つｔＲＮＡArg 前駆体のアンチコドンの後ろから３’末端までの次のような５６ヌクレオチドを標的ＲＮＡ(T3H) として、［α-32P]UTP存在下でＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
（| は切断予定部位）
【００６７】
ＲＮＡ切断ガイド剤（以下の実施例において、ＲＮＡ切断ガイド剤がＲＮＡの場合にはこれを「ＲＮＡ切断用ＲＮＡ」と呼ぶ）として、ｔＲＮＡArg 前駆体の５’末端からアンチコドンまでの、上記の標的ＲＮＡと２カ所（* と+ で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ(GT7H)をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
【００６８】
これらの標的ＲＮＡとＲＮＡ切断用ＲＮＡの組み合わせは、本発明の切断法の基本であり、塩基対合により、アンチコドンの後ろで燐酸ジエステル結合が切れている点を除けば、ｔＲＮＡArg 前駆体とほとんど同じ構造になると考えられ、図６の型に入る。
【００６９】
このＲＮＡ切断用ＲＮＡと部分精製された（２回目のブルーセファロースクロマトグラフィー後の分画）マウスＦＭ３Ａ細胞由来の本発明のリボヌクレアーゼ（実施例３）を含む反応溶液（10 mM Hepes (pH 7.9), 0.5 mM DTT, 3.2 mMスペルミジン）内で、32Ｐにより標識された標的ＲＮＡ（０．１ｐｍｏｌ）を、３０分間３７℃で反応させた。反応後、切断産物を、８Ｍウレア−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、そのゲルのオートラジオグラフをとることにより解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が見られた（図１９、レーン１−４）。なお、図１９のレーン１は未反応の標的ＲＮＡ（上記反応に供さなかったもの）、レーン２ないし４はそれぞれ、ＲＮＡ切断用ＲＮＡ（ＧＴ７Ｈ）を０ｐｍｏｌ（対照）、１２．５ｐｍｏｌ及び５０ｐｍｏｌ加えた場合の結果を示す。
【００７０】
実施例５
実施例５から７では、実施例４のうち、標的ＲＮＡ内のｔＲＮＡの高次構造に関与しているＴループに対応する塩基を変えて、特異的切断を調べた。次のような５６ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(SPHM1) を［α-32P]UTPの存在下でSP6 ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
（| は切断予定部位、下線は実施例４の標的ＲＮＡ：Ｔ３Ｈと異なる塩基を示す。また、＊及び＋は上記実施例４で用いたＲＮＡ切断用ＲＮＡであるＧＴ７Ｈの＊及び＋を付した部分とそれぞれ対合する領域を示す。以下、標的ＲＮＡに付されたこれらの符号は、特に断りがない限り同じ意味を示す。）
【００７１】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【００７２】
実施例６
次のような５６ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(SPHM2) を［α-32P]UTPの存在下でSP6 ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
【００７３】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【００７４】
実施例７
次のような５６ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(SPHM3) を［α-32P]UTPの存在下でSP6 ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
【００７５】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【００７６】
実施例５から７の結果より、標的ＲＮＡは、ｔＲＮＡの高次構造に関与するＴループ内の塩基を、ＲＮＡ切断用ＲＮＡと複合体を作った時にｔＲＮＡのＴループに対応する部位に持たなくとも、切断されることが示された。
【００７７】
実施例８
実施例８から１０では、実施例４のうち、標的ＲＮＡ内のｔＲＮＡのＴステムに対応する塩基を変えて、ここの塩基対合を壊した時の特異的切断を調べた。次のような５６ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(T7HM1) を［α-32P]UTP存在下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
【００７８】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【００７９】
実施例９
次のような５６ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(T7HM2) を［α-32P]UTP存在下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
【００８０】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の７０％程度だった。
【００８１】
実施例１０
次のような５６ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(T7HM3) を［α-32P]UTP存在下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
【００８２】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の７０％程度だった。
【００８３】
実施例８から１０の結果より、標的ＲＮＡは、ｔＲＮＡのＴステムに対応する塩基対合を持たなくとも、ＲＮＡ切断用ＲＮＡと複合体を作った時に切断されることが示された。
【００８４】
実施例１１
実施例１１から１３では、実施例４のうち、標的ＲＮＡ内のｔＲＮＡのＴステム・ループに対応する構造を小さくした時（図７型）の特異的切断を調べた。
【００８５】
次のような48ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(T3HM1) を［α-32P]UTP存在下でＴ3 ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
【００８６】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の７０％程度だった。
【００８７】
実施例１２
次のような44ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(T3HM2) を［α-32P]UTP存在下でＴ3 ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
【００８８】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の５％程度だった。
【００８９】
実施例１３
次のような39ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(T3HM3) を［α-32P]UTP存在下でＴ3 ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
【００９０】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の３％程度だった。
【００９１】
実施例１１から１３の結果は、標的ＲＮＡは、ｔＲＮＡのＴステム・ループに対応する構造を持たなくとも、ＲＮＡ切断用ＲＮＡと図７のような複合体を作った時に切断されることが示された。
【００９２】
実施例１４
実施例４のＲＮＡ切断用ＲＮＡと標的ＲＮＡの基本的塩基対合構造を保ちながら標的ＲＮＡの５’末端を９ヌクレオチド長くした、次のような６５ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(SPH2)を［α-32P]UTP存在下でＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
【００９３】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。電気泳動後のオートラジオグラフが図１９のレーン５〜８に示されている。なお、図１９のレーン５は未反応の標的ＲＮＡ（上記反応に供さなかったもの）、レーン６ないし８はそれぞれ、ＲＮＡ切断用ＲＮＡ（ＧＴ７Ｈ）を０ｐｍｏｌ（対照）、５ｐｍｏｌ及び５０ｐｍｏｌ加えた場合の結果を示す。
【００９４】
この切断実験における４６ヌクレオチドの５’切断産物の３’塩基配列を、化学的ＲＮＡ塩基配列決定法により決めた所、3' GCUCGGUC・・・ という予想した配列が確認された（図２０）。同様の切断実験は、ブタ肝臓由来の高度に精製された本発明のリボヌクレアーゼ（実施例１のＭｏｎｏＱクロマトグラフィー後）を用いて、10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 3.2 mMスペルミジンを含む反応溶液中でも行われて、同様の結果が得られた。この結果は、標的ＲＮＡの、ＲＮＡ切断用ＲＮＡと５塩基対合する配列の上流領域を、ｔＲＮＡのアンチコドンループより長くしても、本発明の切断法で特異的に標的ＲＮＡを切断できることを示している。
【００９５】
実施例１５
実施例１５と１６では、実施例１４のＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7H)の標的ＲＮＡと塩基対合する３’側５塩基の下流配列を変えたり、除去したりして標的ＲＮＡの切断を解析した。
【００９６】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7H)の３’末端５塩基をすべてＵに変え、実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と２カ所（* と+ で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HT5)をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
【００９７】
標的ＲＮＡとして、実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【００９８】
実施例１６
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7H)の３’末端５塩基をすべて削除し、実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と２カ所（＊と＋で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HM1)をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
【００９９】
標的ＲＮＡとして、実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【０１００】
実施例１５と１６の結果より、ＲＮＡ切断用ＲＮＡは、標的ＲＮＡと塩基対合する３’側５塩基の下流配列を変えたり、除去できることが示された。
【０１０１】
実施例１７
実施例１７から２１では、実施例１６のＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HM1)のｔＲＮＡ上でＤステム・ループに対応する領域を短くして（図８型）、標的ＲＮＡの切断を解析した。
【０１０２】
実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と２カ所（* と+ で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HM2)をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
【０１０３】
標的ＲＮＡとして、実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【０１０４】
実施例１８
実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と２カ所（* と+ で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HM3)をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
【０１０５】
標的ＲＮＡとして、実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【０１０６】
実施例１９
実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と２カ所（＊と＋で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HM4)をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
【０１０７】
標的ＲＮＡとして、実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【０１０８】
実施例２０
実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と２カ所（＊と＋で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HM5)をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
【０１０９】
標的ＲＮＡとして、実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【０１１０】
実施例２１
実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と２カ所（＊と＋で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HM6)をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
【０１１１】
標的ＲＮＡとして、実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【０１１２】
実施例１７から２１の結果より、ＲＮＡ切断用ＲＮＡはｔＲＮＡ上でＤステム・ループに対応する領域を短くし、図８のような構造にしても、標的ＲＮＡの切断に用いられることが明らかにされた。
【０１１３】
実施例２２
実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と１カ所（＋で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HM80) （図１０型）をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
【０１１４】
標的ＲＮＡとして、実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。電気泳動後のオートラジオグラフが図２１に示されている。なお、図２１のレーン１は未反応の標的ＲＮＡ（切断反応に供さなかったもの）、レーン２及び３はそれぞれ、ＲＮＡ切断用ＲＮＡ（GT7HM80)を０ｐｍｏｌ（対照）及び５０ｐｍｏｌ加えた場合の結果を示す。また、図２１において、一番右のカラムの数字の単位はヌクレオチドで、棒は基質ＲＮＡ、矢頭は切断産物を示す。
【０１１５】
同様の切断実験は、ブタ肝臓由来の高度に精製された本発明のリボヌクレアーゼ（実施例１のＭｏｎｏＱクロマトグラフィー後）を用いて、10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 3.2 mMスペルミジンを含む反応溶液中でも行われて、同様の結果が得られた。この結果は、ＲＮＡ切断用ＲＮＡは、標的ＲＮＡとわずか７塩基対合するだけで機能し得ることを示している（図１０）。
【０１１６】
実施例２３
実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と１カ所（＋で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ切断用ＲＮＡ(G5)（図１０型）をＤＮＡ／ＲＮＡ合成機により合成した。
【０１１７】
標的ＲＮＡとして実施例１４で用いたＳＰＨ２（対合領域に＋を付して以下に示す。
を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして上記Ｇ５を用いて実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の５０％程度であった。電気泳動後のオートラジオグラフが図２２に示されている。なお、図２２のレーン１は未反応の標的ＲＮＡ（切断反応に供さなかったもの）、レーン２及び３はそれぞれ、ＲＮＡ切断用ＲＮＡ（G5) を０ｐｍｏｌ（対照）及び５０ｐｍｏｌ加えた場合の結果を示す。また、図２２において、一番右のカラムの数字の単位はヌクレオチドで、棒は基質ＲＮＡ、矢頭は切断産物を示す。この結果は、ＲＮＡ切断用ＲＮＡは、標的ＲＮＡとわずか５塩基対合するだけで機能し得ることを示している（図１０）。
【０１１８】
実施例２４
次のような５６ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(T7HM3) を［α-32P]UTP存在下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
【０１１９】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、上記の標的ＲＮＡと２カ所（＊と＋で示された領域）で塩基対合して、図９のような構造をとる次のようなＲＮＡ(GT7HM7)をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
【０１２０】
上記標的ＲＮＡ(T7HM3) 及びＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HM7)並びに実施例３で調製したリボヌクレアーゼ部分精製物（２回目のブルーセファロースクロマトグラフィー後の分画）を用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の４０％程度であった。この結果より、標的ＲＮＡは、ｔＲＮＡのアクセプターステムとアンチコドンステムに対応する塩基対合を持つだけで、ＲＮＡ切断用ＲＮＡと複合体を作った時に切断されることが示された（図９）。
【０１２１】
実施例２５
次のような48ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(T3HM1) を［α-32P]UTP存在下でＴ3 ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
【０１２２】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして実施例２４で用いたGT7HM7を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の４０％程度であった。この結果は実施例２４と共に、標的ＲＮＡは、ｔＲＮＡのアクセプターステムとアンチコドンステムに対応する塩基対合を持つだけで、ＲＮＡ切断用ＲＮＡと複合体を作った時に切断されることを示している（図９）。
【０１２３】
実施例２６
ＲＮＡ切断ガイド剤として、実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と２カ所（* と+ で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＤＮＡを合成機により合成した。
【０１２４】
標的ＲＮＡとして実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、ＲＮＡ切断ガイド剤として上記GT7HDNA を用いて実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が僅かながら確認された。切断効率は、実施例４の１０％程度であった。
【０１２５】
実施例２７
ＲＮＡ切断ガイド剤として、実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と２カ所（* と+ で示された領域）で塩基対合可能な次のようなホスホロチオエート化ＤＮＡを合成機により合成した。
【０１２６】
標的ＲＮＡとして実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、ＲＮＡ切断ガイド剤として上記GT7HSDNAを用いて実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が僅かながら確認された。切断効率は、実施例４の１０％程度であった。
【０１２７】
実施例２６と２７の結果は、ＲＮＡ切断ガイド剤は、ＤＮＡあるいは、化学修飾されたＤＮＡでも機能し得ることを示している。
【０１２８】
実施例２８
次に、標的ＲＮＡとして、ｔＲＮＡ塩基配列とは全く関係のないＨＩＶ−１の遺伝子ｅｎｖ内に存在する次のような６０ヌクレオチドの標的ＲＮＡを［α-32P]UTP存在下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成し、切断実験を試みた。
【０１２９】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、上記の標的ＲＮＡと２カ所（* と+ で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
【０１３０】
上記標的ＲＮＡ（HIV1) 及び上記ＲＮＡ切断用ＲＮＡ（GHIVA)を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度であった。
【０１３１】
電気泳動後のオートラジオグラフを図２３のレーン１〜１０に示す。図２３中、レーン１は標的ＲＮＡを切断反応に供さなかった場合、レーン２〜４はそれぞれ、ＲＮＡ切断用ＲＮＡとしてGHIVA をそれぞれ０ｐｍｏｌ、０．５ｐｍｏｌ、５．０ｐｍｏｌ加えた場合、レーン５及び６はＲＮＡ切断用ＲＮＡとして酵母のｔＲＮＡをそれぞれ０．５ｐｍｏｌ及び５．０ｐｍｏｌ加えた場合、レーン７及び８はＲＮＡ切断用ＲＮＡとして実施例３０で用いたＧＨＩＶＢをそれぞれ０．５ｐｍｏｌ及び５ｐｍｏｌ加えた場合、レーン９及び１０はＲＮＡ切断用ＲＮＡとして実施例４で用いたＧＴ７Ｈをそれぞれ０．５ｐｍｏｌ及び５ｐｍｏｌ加えた場合の結果を示す。図２３に示されるように、ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、標的ＲＮＡと部分的に対合するGHIVA を用いた場合には標的ＲＮＡが切断されるが、標的ＲＮＡと対合しない酵母ｔＲＮＡやＧＴ７Ｈを用いた場合には標的ＲＮＡの特異的切断は起きなかった。
【０１３２】
同様の切断実験は、ブタ肝臓由来の高度に精製された本発明のリボヌクレアーゼ（実施例１のＭｏｎｏＱクロマトグラフィー後）を用いて、10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 3.2 mMスペルミジンを含む反応溶液中でも行われて、同様の結果が得られた。ただし、切断は予定された部位の他に１ヌクレオチド５’よりと３’よりの部位でも起こった。
【０１３３】
実施例２９
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、実施例２８で用いた標的ＲＮＡ（ＨＩＶ１）と1 カ所（＋で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
【０１３４】
このＲＮＡ切断用ＲＮＡと、実施例２８で用いた標的ＲＮＡ（ＨＩＶ１）と、実施例４で用いたリボヌクレアーゼとを用いて実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、実施例２８と同じところで標的ＲＮＡの切断が確認された。切断効率は、実施例４の７０％程度であった。同様の切断実験は、ブタ肝臓由来の高度に精製された本発明のリボヌクレアーゼ（実施例１のＭｏｎｏＱクロマトグラフィー後）を用いて、10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 3.2 mMスペルミジンを含む反応溶液中でも行われて、同様の結果が得られた。
【０１３５】
この結果は、実施例２２と共に、標的ＲＮＡとＲＮＡ切断用ＲＮＡの塩基対合構造が、図１０のような単純な構造であっても、本発明のリボヌクレアーゼが認識し得ることを示している。
【０１３６】
実施例３０
実施例２５、２６とは異なる、ＨＩＶ−１の遺伝子ｇａｇ内に存在する次のような５６ヌクレオチドの標的ＲＮＡを［α-32P]UTP存在下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
【０１３７】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、上記の標的ＲＮＡと２カ所（* と+ で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
【０１３８】
上記標的ＲＮＡ（HIV2) 及び上記ＲＮＡ切断用ＲＮＡ（GHIVB)を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の５０％程度であった。ただし、切断は予定された部位の他に１ヌクレオチド５’よりと、２ヌクレオチド３’よりの部位でも起こった。このＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GHIVB) の代わりに、実施例４と２８でそれぞれ用いたGT7HやGHIVA のＲＮＡ切断用ＲＮＡあるいは酵母のｔＲＮＡを使用した時には、この５６ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(HIV2)の特異的切断は起こらなかった。
【０１３９】
実施例３１
次に、標的ＲＮＡとして、ｔＲＮＡ程の短いＲＮＡでなく、かなり長いＲＮＡを用いて切断実験を行った。以下のような、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ配列の部分を含む415 ヌクレオチドの標的ＲＮＡを［α-32P]UTP存在下でT7ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
【０１４０】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、上記の標的ＲＮＡと２カ所（* と+ で示された領域）で塩基対合可能な次のような基本型のＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
【０１４１】
標的ＲＮＡとして上記ＣＡＴＣを用い、ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして上記ＧＣＡＴ１を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の７０％程度であった。ただし、切断は予定された部位から１ヌクレオチド３’よりの部位で起こった。
【０１４２】
実施例３２
実施例３２から３４では、Ｄステム・ループに対応する配列を短くしたＲＮＡ切断用ＲＮＡと実施例３１で用いた標的ＲＮＡ（ＧＣＡＴ）とを用いて切断実験を行なった。
【０１４３】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、上記の標的ＲＮＡ（ＧＣＡＴ）と２カ所（＊と＋で示された領域）で塩基対合可能な次のＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
【０１４４】
標的ＲＮＡとして上記ＣＡＴＣを用い、ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして上記ＧＣＡＴＭ１を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、実施例３１と同様に標的ＲＮＡの切断が確認された。切断効率は、実施例４の７０％程度であった。
【０１４５】
実施例３３
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、上記の標的ＲＮＡ（ＧＣＡＴ）と２カ所（＊と＋で示された領域）で塩基対合可能な次のＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
【０１４６】
標的ＲＮＡとして上記ＣＡＴＣを用い、ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして上記ＧＣＡＴＭ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、実施例３１と同様に標的ＲＮＡの切断が確認された。切断効率は、実施例４の１５％程度であった。
【０１４７】
実施例３４
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、上記の標的ＲＮＡ（ＧＣＡＴ）と２カ所（＊と＋で示された領域）で塩基対合可能な次のＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
【０１４８】
標的ＲＮＡとして上記ＣＡＴＣを用い、ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして上記ＧＣＡＴＭ３を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、実施例３１と同様に標的ＲＮＡの切断が確認された。切断効率は、実施例４の１５％程度であった。
【０１４９】
実施例３２から３４の結果より、図８のような構造をとる、Ｄステム・ループに対応する配列を短くしたＲＮＡ切断用ＲＮＡは、４１５ヌクレオチドのかなり長い標的ＲＮＡに対しても有効であることが明らかになった。
【０１５０】
実施例３５
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、７塩基から成る標的ＲＮＡ結合用５’配列（ガイド配列）と２０塩基程のステム・ループのみから構成され、上記の標的ＲＮＡ（ＧＣＡＴ）と１カ所（＋で示された領域）で塩基対合可能な次の図１１型のＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
【０１５１】
標的ＲＮＡとして上記ＣＡＴＣを用い、ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして上記ＧＣＡＴ１２６を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、実施例３１と同様に標的ＲＮＡの切断が確認された。切断効率は、実施例４の３０％程度であった。
【０１５２】
【発明の効果】
本発明により、任意のＲＮＡを所望の部位で切断する方法並びにそのために用いられる新規なリボヌクレアーゼ及びＲＮＡ切断ガイド剤が提供された。本発明の方法によれば、任意のＲＮＡを塩基配列特異的に所望の位置で切断することができるので、上記のように、遺伝子工学並びに診断及び治療の分野に大いに貢献するものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の構造を模式的に示す図である。
【図２】ｔＲＮＡArg 前駆体の構造を示す図である。
【図３】３’欠失ｔＲＮＡArg と基質ＲＮＡ（Ｓ１）との複合体の構造を示す図である。
【図４】３’欠失ｔＲＮＡAla と基質ＲＮＡ（Ｓ２）との複合体の構造を示す図である。
【図５】ｔＲＮＡ前駆体の構造を模式的に示す図である。
【図６】本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の一例と標的ＲＮＡの一例との複合体の構造を模式的に示す図である。
【図７】本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の一例と標的ＲＮＡの一例との複合体の構造を模式的に示す図である。
【図８】本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の一例と標的ＲＮＡの一例との複合体の構造を模式的に示す図である。
【図９】本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の一例と標的ＲＮＡの一例との複合体の構造を模式的に示す図である。
【図１０】本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の一例と標的ＲＮＡの一例との複合体の構造を模式的に示す図である。
【図１１】本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の一例と標的ＲＮＡの一例との複合体の構造を模式的に示す図である。
【図１２】本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の一例と標的ＲＮＡの一例との複合体の構造を模式的に示す図である。
【図１３】本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の一例と標的ＲＮＡの一例との複合体の構造を模式的に示す図である。
【図１４】本発明のリボヌクレアーゼの活性のｐＨ依存性を調べた結果を示す図である。
【図１５】本発明のリボヌクレアーゼの活性の温度依存性を調べた結果を示す図である。
【図１６】本発明のリボヌクレアーゼの分子量を測定した結果を示す図である。
【図１７】本発明のリボヌクレアーゼの等電点を測定した結果を示す図である。
【図１８】本発明のリボヌクレアーゼがｔＲＮＡ前駆体３’プロセシング酵素と同一であることを示す切断実験の結果を示す図である。
【図１９】本発明の実施例４及び１４の切断実験の結果を示す図である。
【図２０】本発明の実施例１４における５’切断産物の部分塩基配列を決定した結果を示す図である。
【図２１】本発明の実施例２２の切断実験の結果を示す図である。
【図２２】本発明の実施例２３の切断実験の結果を示す図である。
【図２３】本発明の実施例２８の切断実験の結果を示す図である。
【符号の説明】
１０ ＲＮＡ切断ガイド剤
１２ ガイド配列
１４ ステム・ループ部
１６ サブガイド配列
１８ 任意の３’配列
【産業上の利用分野】
本発明は、任意のＲＮＡを任意の部位で塩基配列特異的に切断することができるＲＮＡの切断方法並びにこの切断方法に用いられるリボヌクレアーゼに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＲＮＡを塩基配列特異的に切断する技術として、グループＩイントロン、リボヌクレアーゼＰ、ハンマーヘッドリボザイム及びヘアピンリボザイムを利用した方法が知られている。
【０００３】
グループＩイントロンを用いた方法は、チェックらにより報告されている(Nature 324, 429-, 1986)。彼らは、テトラヒメナのｒＲＮＡ前駆体中に発見されたセルフスプライシング能をもつグループＩイントロンを改変し、４塩基対合により標的ＲＮＡを認識するＲＮＡのみから成るエンドリボヌクレアーゼを作り出した。
【０００４】
細菌から哺乳動物まであらゆる種で存在していると考えられているｔＲＮＡ前駆体の５’プロセシング酵素（リボヌクレアーゼＰ）は、リボ核タンパク質である。大腸菌由来のものはＲＮＡ成分のみでも触媒活性を示すが、ヒト由来のものではタンパク質成分も必須である。アルトマンらは、リボヌクレアーゼＰを、標的ＲＮＡと塩基対合してｔＲＮＡ前駆体様構造を形成するようなエクスターナルガイドシークエンスと共に使用することにより塩基配列特異的エンドリボヌクレアーゼ活性を得ている(Science 249, 783-, 1990, Science 263, 1269-, 1994) 。
【０００５】
植物ウイロイドなどで発見された自己切断する５０ヌクレオチド程の小さなリボザイム（ハンマーヘッド）や、タバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡ由来のヘアピンと呼ばれている６０ヌクレオチド程の小さなリボザイムは、触媒配列と基質配列に分断することにより触媒配列を持つＲＮＡを塩基配列特異的エンドリボヌクレアーゼに改変することができる。この触媒ＲＮＡは、塩基対合により基質ＲＮＡを認識するので、触媒ＲＮＡ中の基質認識配列を変えることで、このエンドリボヌクレアーゼの塩基配列特異性を自由に変える事が出来る(Nature 328, 596-, 1987, Nucleic Acids Res. 18, 299-, 1990) 。
【０００６】
これらの他に、動物細胞のサイトゾル抽出液中に発見されたリボヌクレアーゼ６５は、塩基配列特異的ＲＮＡ切断活性を持っており、その特異性は活性に必須な３’末端が欠失した６５ヌクレオチド程のｔＲＮＡによってもたらせれることが知られている。このｔＲＮＡは２種類知られており、ひとつは、アルギニンｔＲＮＡであることが判明している。(Biochem. Biophy. Res. Commun. 176, 1163-, 1991, Biochem. Biophy. Res. Commun. 178, 1247-, 1991, Nucleic Acids Res. 20, 3737-, 1992, Nucleic Acids Res. 21, 4696-, 1993)。もうひとつは、グリシンｔＲＮＡであることが示唆されていたが、最近、グリシンｔＲＮＡではなく、アラニンｔＲＮＡであることが証明された。さらに、このリボヌクレアーゼ６５のタンパク質成分は、ｔＲＮＡ前駆体の３’プロセシング酵素と同一であり（ｔＲＮＡArg 前駆体のプロセッシングの様子を図２に示す）、標的ＲＮＡは３’欠失ｔＲＮＡの５’末端にある４塩基との塩基対合により認識されていることも証明された。リボヌクレアーゼ６５のＲＮＡ成分が３’欠失ｔＲＮＡArg の時には、５’末端配列ＧＧＧＣと標的ＲＮＡ中の４塩基配列ＧＣＣＣとが塩基対合することにより認識され、標的ＲＮＡは配列ＧＣＣＣのとなりの３’側のヌクレオチドの後で切断される（図３）。５’末端にＧＧＧＧを持つ３’欠失ｔＲＮＡAla の時は、標的ＲＮＡの配列ＣＣＣＣのとなりの３’側のヌクレオチドの後で切断が起こる（図４）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
グループＩイントロンを改変した４塩基認識エンドリボヌクレアーゼやハンマーヘッド、ヘアピンリボザイムは、標的ＲＮＡの切断部位の近くに、必須塩基があり、標的ＲＮＡの切断部位に束縛を与えている。一方、エクスターナルガイドシークエンスと共にリボヌクレアーゼＰを用いる方法や、リボヌクレアーゼ６５活性には、そのような束縛塩基は存在しないようである。グループＩイントロンを改変したエンドリボヌクレアーゼやリボヌクレアーゼ６５は、４塩基の特異性しか持たないが、ハンマーヘッド、ヘアピンリボザイム、エクスターナルガイドシークエンスと共に用いるリボヌクレアーゼＰは、標的ＲＮＡ上の１０塩基程の配列との対合を基質認識のために利用している。
【０００８】
本発明は、基質ＲＮＡ上の特定の４ヌクレオチド（ＣＣＣＣあるいはＧＣＣＣ）を認識するだけのリボヌクレアーゼ６５活性を、標的ＲＮＡの認識に関与するｔＲＮＡ成分を改変することにより、任意の塩基配列を認識して基質ＲＮＡをより特異的に切断できるようにすることをひとつの目的としてなされたものである。
【０００９】
上記のような、様々な塩基配列特異的ＲＮＡ切断活性は、ＨＩＶ−１やＨＴＬＶ−１などのレトロウイルスに感染したヒト細胞内で、このウイルス由来のＲＮＡを特異的に切断したり、ガン細胞内で、ガン化の原因となる遺伝子のｍＲＮＡを特異的に分解するのに応用できる可能性がある。そのためには、標的となる細胞にＲＮＡ、あるいは、ＲＮＡを発現するように工夫されたＤＮＡを取り込ませる必要がある。培地に加えた様々な長さのoligo(dT) の培養細胞への取り込み効率は、短いほどよく、oligo(dT)7は、oligo(dT)20 の４倍程である(Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3474-, 1989)。グループＩイントロンを改変した４塩基認識エンドリボヌクレアーゼは数百ヌクレオチド、ハンマーヘッドやヘアピンリボザイムは３０ー５０ヌクレオチド程、ヒトのリボヌクレアーゼＰと共に用いるエクスターナルガイドシークエンスは５０ヌクレオチド程必要であり、これらの長さは、細胞に直接効率よく取り込ませるには長すぎる。そこで、本発明では、細胞に取り込まれやすいより短いＲＮＡを用いて特異性の高い切断活性を生み出すことも目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、第１鎖ＲＮＡと、５’末端から少なくとも連続する５ヌクレオチドが前記第１鎖ＲＮＡと対合した第２鎖ＲＮＡとの対合部分を認識し、前記第１鎖ＲＮＡの該対合部分の３’側端部又はこの端部から１〜３塩基３’側を切断する、新規なリボヌクレアーゼを単離することに成功した。また、この新規なリボヌクレアーゼを利用すれば、切断しようとするＲＮＡ（以下、切断しようとするＲＮＡを「標的ＲＮＡ」ということがある）の任意の部分に対合する少なくとも連続する５ヌクレオチドを有する核酸とを対合したものに該リボヌクレアーゼを作用させることにより、標的ＲＮＡの対合部分の３’側端部又はこの端部から１〜３塩基３’側を切断することが可能であり、ひいては任意の標的ＲＮＡを所望の位置で切断することが可能であることを見出し本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、下記の理化学的性質を有し、ｔＲＮＡ前駆体の３’トレーラーを除去する酵素であるリボヌクレアーゼを提供する。
（１）作用及び特異性：第１鎖ＲＮＡと、５’末端から少なくとも連続する５ヌクレオチドが前記第１鎖ＲＮＡと対合した第２鎖ＲＮＡとの対合部分を認識し、前記第１鎖ＲＮＡの該対合部分の３’側端部又はこの端部から１〜３塩基３’側を切断する。
（２）至適ｐＨ：７．０−７．５
（３）至適温度５０−６０℃
（４）分子ふるいクロマトグラフィーによる分子量１００ｋＤａ
（５）クロマトフォーカシング法による等電点４．５
【００１２】
また、本発明は、切断すべき標的ＲＮＡの少なくとも連続する５塩基と相補的なガイド配列を５’側端部に有する核酸から成るＲＮＡ切断ガイド剤の前記ガイド配列を前記標的ＲＮＡの相補的部分と対合させ、これに前記本発明のリボヌクレアーゼを作用させることから成るＲＮＡの切断方法を提供する。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明の新規なリボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼ６５として知られるリボ核タンパク質のタンパク成分である。
【００１５】
リボヌクレアーゼ６５活性は、哺乳動物細胞や植物細胞のサイトゾル抽出液内での存在が知られており、最近、このリボヌクレアーゼ６５のタンパク質成分は、ｔＲＮＡ前駆体の３’プロセシング酵素と同一であることが証明された。ｔＲＮＡ前駆体の３’プロセシング酵素は、ｔＲＮＡ前駆体の３’トレーラーを除去する活性を持つエンドリボヌクレアーゼであり、原核細胞での存在は報告されていないが、すべての真核細胞に存在すると考えられている(tRNA:Structure, Biosynthesis, and Function, Chapters 5 and 9, ASM Press, 1995) 。ｔＲＮＡ前駆体３’プロセシング酵素活性は、サイトゾル抽出液、核抽出液、ミトコンドリア抽出液、葉緑体抽出液の中に見いだされている。これらの活性が同一のタンパク質によるものかは知られていないが、これらの酵素活性を、３’欠失ｔＲＮＡや、本発明のＲＮＡ切断用塩基配列を用いて、塩基配列特異的エンドリボヌクレアーゼに改変できる可能性もある。
【００１６】
このリボヌクレアーゼ６５のタンパク成分に関しては、その粗精製物について報告があるが(Nucleic Acids Res. 20, 3737-, 1992)、いまだ精製単離された例は無い。以下、本発明のリボヌクレアーゼの理化学的特徴を示す。なお、以下の値は、豚肝臓由来のリボヌクレアーゼ６５のタンパク成分（ｔＲＮＡ前駆体３’プロセシング酵素）を、基質として１９ヌクレオチドの３’トレーラーを持つｔＲＮＡArg 前駆体5' GGGCCAGUGGCGCAAUGGAUAACGCGUCUGACUACGGAUCAGAAGAUUCCAGGUUCGACUCCUGGCUGGCUCG|GUGUAAGCAGGGUCGUUUU 3' （｜は切断部位）を用いて測定した際の値である。
【００１７】
(1) 作用及び特異性：
第１鎖ＲＮＡと、５’末端から少なくとも連続する５ヌクレオチドが前記第１鎖ＲＮＡと対合した第２鎖ＲＮＡとの対合部分を認識し、前記第１鎖ＲＮＡの該対合部分の３’側端部又はこの端部から１〜３塩基３’側を切断する。
(2) 至適ｐＨ：
７．０−７．５
(3) 至適温度
５０−６０℃
(4) 分子ふるいクロマトグラフィーによる分子量
１００ｋＤａ
(5) クロマトフォーカシング法による等電点
４．５。
なお、これらの理化学的性質の測定方法は下記実施例に具体的に記載されている。
【００１８】
本発明のリボヌクレアーゼは、例えば以下の２通りの方法により得ることができるが、調製方法はこれらに限定されるものではない。
【００１９】
培養細胞、動物組織などから、Dignamら(Nucleic Acids Res. 11, 1475-, 1983)の方法に従って、サイトゾル抽出液を得た後、以下のようにして純度を高めていく。この過程は、すべて４℃で行う。培養細胞あるいは、動物組織に、２倍体積のバッファーＡ（１０ｍＭヘペス、ｐＨ７．９、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ジチオスレイトール）を加え、ダウンスホモジェナイザーを用いて、１５回すりつぶす。１，０００ｘＧで１０分間遠心後の上清に、１０分の１体積のバッファーＢ（０．３Ｍヘペス、ｐＨ７．９、１．４ＭＫＣｌ、０．０３Ｍ ＭｇＣｌ2 ）を加えた後、１００，０００ｘＧで１時間遠心する。この上清を、バッファーＤ（２０ｍＭヘペス、ｐＨ７．９、１００ｍＭＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール、２０％グリセロール）に対して約５時間透析する。その後、５０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、沈澱物をバッファー2 （20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol ）で溶解して、同じバッファー2 で、透析する。この透析後の試料を、バッファー3 （20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT)で前もって平衡化したＱセファロースにかけて、バッファー3 でカラム体積量洗い、０から１，０００ｍＭＫＣｌの線形勾配によりタンパク質を溶出させる。この時、目的のタンパク質成分はおよそ３５０ｍＭＫＣｌの付近で溶出される。この画分を、５００ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー3 で前もって平衡化したブルーセファロースにかけ、カラム体積の５倍の同バッファーで洗う。結合したタンパク質を、２，０００ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー3 で溶出させ、限外濾過法によりバッファー３を使って脱塩濃縮する。この時のフロースルー画分を用いて再度同様にブルーセファロースカラムクロマトグラフィーを行う。２度目のブルーセファロースカラムクロマトグラフィーで結合した画分は、１度目の画分よりも６倍程比活性が高い。このブルーセファロース結合画分を、ＫＣｌを含まないバッファーＤを用いて限外濾過法により脱塩濃縮された後に、−８０℃で、使用するまで保存する。
【００２０】
本発明のリボヌクレアーゼは、次のようにして肝臓などの動物組織から得ることもできる。以下の操作は、５５℃熱処理の他は４℃で行う。組織に２倍体積のバッファー１（50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol ）を加えて、回転式刃のミキサーで２分間細胞を破砕し、１３，０００ｘＧで３０分間遠心する。この上清中に目的タンパク質があり、以下のようにして純度を高めていくことができる。９０℃の水浴で５５℃になるまで熱をかけ、ひき続き５５℃の水浴で５分間靜置する。その後、１３，０００ｘＧで３０分間遠心し、上清を得る。この上清に５０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、沈澱物を６，０００ｘＧで１時間遠心し回収する。この沈澱物をバッファー2 （20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol ）で溶解して、同じバッファー2 で、５回バッファー交換をして透析する。この透析後の試料を、バッファー3 （20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT)で前もって平衡化したＱセファロースにかけて、バッファー3 でカラム体積量洗い、０から１０００ｍＭ ＫＣｌの線形勾配によりタンパク質を溶出させる。この時、目的のタンパク質成分はおよそ３５０ｍＭ ＫＣｌの付近で溶出される。この画分を、５００ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー３で前もって平衡化したブルーセファロース（ファルマシア社製）にかけ、カラム体積の５倍の同バッファーで洗う。結合したタンパク質を、２０００ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー３で溶出させ、限外濾過法によりバッファー３を使って脱塩濃縮する。この時のフロースルー画分を用いて再度同様にブルーセファロースカラムクロマトグラフィーを行う。２度目のブルーセファロースカラムクロマトグラフィーで結合した画分は、一度目の画分よりも６倍程比活性が高い。この２度目の結合画分を、さらに、１００ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー3 で平衡化したヘパリンセファロースにかけられ、カラム体積の５倍量の同バッファーで洗浄する。その後、１００から２０００ｍＭ ＫＣｌの線形勾配によりタンパク質を溶出させる。目的のタンパク質は、１２００ｍＭ ＫＣｌ付近で溶出する。この画分を、限外濾過法によりバッファー3 を使って脱塩濃縮した後、バッファー3 で平衡化したＭｏｎｏＱカラムにかける。溶出は、０から１０００ｍＭ ＫＣｌの線形勾配で行い、目的の活性は、４００ｍＭ ＫＣｌ付近で溶出する。高度に精製されたこのタンパク質は、使用するまで−８０℃で保存する。
【００２１】
次に本発明の方法に使用されるＲＮＡ切断ガイド剤について説明する。ＲＮＡ切断ガイド剤は、標的ＲＮＡと対合することにより、前記本発明のリボヌクレアーゼによる標的ＲＮＡの切断を可能にするものであり、その本質は核酸である。核酸としてはＲＮＡが好ましい。また、ここで言う「核酸」には、標的ＲＮＡとの対合を阻害しない修飾を受けた核酸誘導体も包含される。このような核酸誘導体の例として、ホスホロチオエート化核酸を挙げることができる。また、ＲＮＡ切断ガイド剤の５’末端は一燐酸、三燐酸、水酸基のいずれでもよく、３’末端に関しても一燐酸、水酸基のどちらでもよい。
【００２２】
図１に本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の好ましい基本型を示す。なお、後述のように、この基本型のうち、必須な部分はガイド配列だけであり、ガイド配列のみから成るＲＮＡ切断ガイド剤も本発明の範囲に含まれる。また、ガイド配列以外の部分を含む場合であっても、後述のように種々の形態が可能であり、図１に示したものはあくまでも好ましい１例である。
【００２３】
図１に示す、本発明のＲＮＡ切断ガイド剤１０の好ましい基本型は、５’末端にあるガイド配列１２と、それに続くステム・ループ部１４と、それに続くサブガイド配列１６と、それに続く任意の３’配列１８とから成る。ステム・ループ部１４のステムの部分にある短い縦の線は向い合った塩基が対合した塩基対合を示す。なお、この基本型は図５に示すｔＲＮＡ前駆体の５’側前半部の構造と類似している。
【００２４】
図１に示す基本型が、標的ＲＮＡと対合して複合体を形成した様子の一例が図６に示されている。図６中、矢印は本発明のリボヌクレアーゼによる切断部位を示し、また、縦、横の短い線は向い合ったヌクレオチド間の塩基対合を示す。図６に示されるように、ガイド配列１２とサブガイド配列１６が標的ＲＮＡと対合しており、標的ＲＮＡのガイド配列との対合部の３’側端部又はこの端部から１〜３塩基３’側が切断される。なお、図６に示す例では、標的ＲＮＡが図５に示すｔＲＮＡ前駆体の３’側後半部と類似した形態を有しているが、後述のように、標的ＲＮＡの形態はこのようなものに限定されない。
以下、上記基本型の各要素について説明する。
【００２５】
ガイド配列１２は、上記基本型の５’末端に位置し、図５に示すｔＲＮＡ前駆体のアクセプターステムに対応する。このガイド配列は、切断しようとする標的ＲＮＡの一部と相補的であってこれと対合し、この対合部分の標的ＲＮＡの３’側端部又はこの端部から１〜３塩基３’側が切断される（図６）。ガイド配列の長さは少なくとも５塩基であり、通常５〜７塩基、好ましくは７塩基である。本発明のＲＮＡ切断ガイド剤において必須の部分はこのガイド配列だけであり、従って、本発明のＲＮＡ切断ガイド剤は、最も単純な構造の場合、単に５ヌクレオチドのみから成る核酸であることができる。
【００２６】
図１に示す基本型では、ガイド配列１２の３’側下流にステム・ループ部１４が存在する。ステム・ループ部１４は、ｔＲＮＡ分子中のＤステム・ループ領域と同一又は類似の配列であることが好ましく、通常１９〜２２塩基から成る。もっとも、本発明の切断法によるＲＮＡの切断効率の低下を問題にしない場合には、この配列を短くしたり削除することも可能である（図８、図９、図１０）。
【００２７】
図１に示す基本型では、ループ・ステム部１４の３’側下流にサブガイド配列１６が存在する。このサブガイド配列は、切断しようとする標的ＲＮＡの一部と相補的であり、対合する（図６）。サブガイド配列１６は、通常３塩基から５塩基から成り、好ましくは５塩基から成る。なお、サブガイド配列は必須的ではなく、切断効率の低下を問題にしなければ存在しなくてもよい（図１０、図１１）。なお、サブガイド配列が存在する場合には、ガイド配列との間が少なくとも７塩基、好ましくは少なくとも１１塩基離れていることが好ましいが、ガイド配列とサブガイド配列が直接つながっていてもよい（図９）。
【００２８】
図１に示す基本型では、サブガイド配列の３’側下流に任意の３’配列を有する。この任意の３’配列は、通常３〜５塩基程度、特に５塩基程度であるが、存在しなくても切断効率の低下は起きない。また、本発明のリボヌクレアーゼによる認識及び切断を阻害しない範囲で、この３’配列は任意の長さの任意の配列にすることができる。例えば、図１２に示すように、ｔＲＮＡ分子のＴステム・ループ領域の３’末端までとすることもできるし、また、図１３に示すように、ｔＲＮＡ分子のＴステム・ループ領域の途中までとすることもできる。
【００２９】
上記した種々の形態のＲＮＡ切断ガイド剤が、標的ＲＮＡと対合して形成される複合体の種々の態様を図６ないし図１３に基づき説明する。もっとも、これらは例示であり、ＲＮＡ切断ガイド剤と標的ＲＮＡとの複合の形態はこれらに限定されるものではなく、本発明のリボヌクレアーゼにより切断可能ないかなる態様のものであってもよい。なお、これらの各図とも矢印の位置は切断部位を示す（ただし、上述のように、切断位置は対合部分の３’側端部からさらに１〜３塩基３’側（標的ＲＮＡの３’側）になることもある）。
【００３０】
図６に示す態様では、図１に示す基本型のＲＮＡ切断ガイド剤と、ｔＲＮＡ前駆体分子の３’側後半部分の形態を有する標的ＲＮＡとが対合している。この態様では、標的ＲＮＡは、ｔＲＮＡ前駆体分子のＴステム・ループ領域及びその５’側上流にエクストラループ領域に対応する領域を有する。
【００３１】
図７に示す態様では、基本形のＲＮＡ切断ガイド剤と、ほぼ線状の標的ＲＮＡが対合している。この図に示されるように、標的ＲＮＡにはｔＲＮＡ前駆体分子のＴステム・ループ領域やエクストラループ領域は必要ではない。
【００３２】
図８に示す態様では、標的ＲＮＡは図６に示すものと同様な形態であるが、ＲＮＡ切断ガイド剤のガイド配列とサブガイド配列とをつなぐ部分がループ・ステムになっておらず、ほぼ線状になっている。
【００３３】
図９に示す態様では、ＲＮＡ切断ガイド剤のガイド配列とサブガイド配列が直接つながっており、それに対応して標的ＲＮＡも線状になっている。
【００３４】
図１０に示す態様では、ＲＮＡ切断ガイド剤はガイド配列のみからなり、標的ＲＮＡはｔＲＮＡ前駆体分子の３’側後半と同様な形態をしている（ただし、エクストラループ領域はない）。
【００３５】
図１１に示す態様では、ＲＮＡ切断ガイド剤のサブガイド配列以降がなく、標的ＲＮＡはｔＲＮＡ前駆体分子の３’側後半と類似した形態になっている（ただし、エクストラループ領域はない）。
【００３６】
図１２に示す態様では、ＲＮＡ切断用ガイド剤がｔＲＮＡ分子のＴステム・ループ領域の３’末端までのような形態になっており、標的ＲＮＡはほぼ線状の形態をしている。
【００３７】
図１３に示す態様では、ＲＮＡ切断用ガイド剤が、ｔＲＮＡ分子のＴステム・ループ領域の途中までのような形態になっており、標的ＲＮＡはほぼ線状であるがガイド剤との対合により直角に曲がっている。
【００３８】
本発明のＲＮＡ切断ガイド剤は、以下の２通りの方法により得ることができる。
【００３９】
ひとつは、鋳型となるＤＮＡを化学的に合成し、ＲＮＡポリメラーゼを用いて試験管内転写反応により合成する方法である。鋳型ＤＮＡは、合成したいＲＮＡに対応するＤＮＡ塩基配列の上流に、バクテリオファージ由来のＴ７，Ｔ３，ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼなどのプロモーター塩基配列を持つものと、これの相補鎖をパーキンエルマー社等の市販のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて合成する。精製された２本のＤＮＡをアニーリングさせ、宝酒造、日本ジーン社等から得られる、上記ＲＮＡポリメラーゼを用いて、製造元の説明書に従って目的とするＲＮＡ切断用ＲＮＡを合成する。
【００４０】
二つ目の方法は、上記のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機等を用いて直接化学的に合成する方法である。
【００４１】
どちらの方法においても、合成されたＲＮＡおよびその誘導体は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動あるいは、ＨＰＬＣなどを用いて、精製した後、使用する。
【００４２】
なお、図１に示すような、ステム・ループ部は、普通は自然に形成されるが、場合によっては、８０℃で１分間加熱した後に徐々に室温まで下げることにより形成される。
【００４３】
標的ＲＮＡの切断は、標的ＲＮＡ、本発明のＲＮＡ切断ガイド剤及び本発明のリボヌクレアーゼを緩衝液中で好ましくは２０〜５０℃、特に好ましくは３７℃、ｐＨ６．５〜８．５、特に好ましくはｐＨ７．９で反応させることにより行うことができる。用いるリボヌクレアーゼの量は、特に限定されず、酵素の量が少なくても時間がかかるだけで切断反応は可能であるが、通常、標的ＲＮＡ０．１ピコモルに対して１〜５ユニット程度が好ましい。なお、ここで、１ユニットとは、ｔＲＮＡArg 前駆体０．１ｐｍｏｌの３’トレーラーと、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＤＴＴ、３．２ｍＭスペルミジン溶液１０μｌ中で３７℃で１０分間反応させることにより５０％切除できる量として定義されるものである。また、用いるＲＮＡ切断ガイド剤の量は、特に限定されないが、標的ＲＮＡに対してモル基準で１０〜１００倍程度が好ましい。また、標的ＲＮＡの濃度の下限は存在せず、１分子であっても切断は可能である。標的ＲＮＡの濃度の上限も特にないが、通常１００μＭ以下であることが好ましい。また、反応時間は、標的ＲＮＡの濃度や用いるリボヌクレアーゼの量等に基づき適宜選択されるが、上記の好ましい条件下においては、通常３０〜６０分間程度である。また、緩衝液としては、特に限定されず、ヘペス、トリス、ビストリス緩衝液等が好ましいがこれらに限定されるものではない。また、緩衝液は０．５〜１．０ｍＭのジチオスレイトール及び１〜５ｍＭのスペルミジンを含むことが好ましい。また、外来の非特異的リボヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼＡ等）による、標的ＲＮＡ及びＲＮＡ切断ガイド剤の非特異的分解を抑えるために、反応液中に市販のリボヌクレアーゼ阻害剤（例えば宝酒造社製）を加えることも可能である。
【００４４】
in vitroでの切断の効率を測定するために切断産物を解析する場合には、予め標的ＲＮＡを標識しておくことが好ましい。例えば、標的ＲＮＡは、［α−32Ｐ］ＮＴＰ（ＮはＡ，Ｕ，ＧまたはＣ）の存在下で合成することにより、32Ｐで均一に標識することができる。32Ｐで標識された反応物は、８Ｍウレアを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離され、その後、オートラジオグラフィーによりＲＮＡ切断効率等を解析することができる。切断部位は、標的ＲＮＡの切断産物の長さから決定されうるが、化学的ＲＮＡ塩基配列決定法や末端ヌクレオチドの２次元薄層クロマトグラフィー法を用いて確認することもできる(Nucleic Acids Res. 21, 4696-, 1993)。実際のＲＮＡ切断は、切断予定部位の他に切断予定部位から１−２ヌクレオチドずれた所でも見られたり、切断予定部位から１ヌクレオチド下流でのみ見られることもある。
【００４５】
本発明の塩基配列特異的ＲＮＡ切断方法のin vitroでの応用について以下に説明する。
【００４６】
１．遺伝子工学への応用。ＤＮＡ制限酵素がＤＮＡ工学的手法において必須であるように、塩基配列特異的ＲＮＡ切断方法はＲＮＡ工学において様々な所で応用されうる。たとえば、二つ以上の大きなＲＮＡを塩基配列特異的に切断し、その断片のパターンを比較することにより、その類似性を解析することができる。さらに、断片化することにより、ＲＮＡの詳細な解析は、大きなＲＮＡそのものよりもはるかに容易にできるようになる。その他にも、本発明の塩基配列特異的ＲＮＡ切断法は、自由に特異的切断部位を設定できるので、ＲＮＡリガーゼと共に用いることにより原理的にＲＮＡ分子間のあらゆる組換えを可能にする。この組換え技術は、ＤＮＡ組換えにも利用できる。従来のＤＮＡ組換え技術では、４から８塩基配列（ほとんどがパリンドローム構造）特異的にＤＮＡを切断するＤＮＡ制限酵素が用いられているが、この酵素ではＤＮＡの切断部位（組換え部位）が限定されてしまう。一方、本発明の塩基配列特異的ＲＮＡ切断法では、ＲＮＡのより長い塩基配列（パリンドローム構造に限定されない）を認識し切断できる。そこで、組換えたいＤＮＡを転写反応によりＲＮＡに変換し、このＲＮＡに上記のＲＮＡ組換え法を施し、組換えられたＲＮＡを逆転写反応でＤＮＡに再変換することにより、原理的にＤＮＡ分子間のあらゆる組換えを可能にする。
【００４７】
２．診断薬への応用。特定の既知ＲＮＡが細胞内に存在しているかどうか、あるいは、そのＲＮＡが突然変異を起こして細胞内に存在しているかを解析するために応用できる。細胞からＲＮＡ混合物をヌクレアーゼにより分解されないように注意深く抽出し、３’末端の水酸基をｐＣｐなどを用いてＲＮＡリガーゼにより完全にブロックする。存在を調べたいＲＮＡを特異的に切断できる本発明のＲＮＡ切断ガイド剤（３’末端水酸基をｐＣｐ等を用いてブロックしておく）を合成し、リボヌクレアーゼ６５タンパク質と共に用いて、抽出した全ＲＮＡに対して切断反応を行う。この反応後、３２ｐＣｐなどの放射性標識を用いて、特異的切断により生じた３’末端水酸基にＲＮＡリガーゼにより標識する。この時、目的ＲＮＡの５’切断産物の他は３’末端水酸基を持たないので標識されない。未反応の３２ｐＣｐを除去した後、放射能測定やゲル電気泳動を行うことにより、目的ＲＮＡの存在を調べることができる。目的ＲＮＡ上のＲＮＡ切断ガイド剤との塩基対合領域に突然変異がある場合には、特異的切断の低下がおこるので、正常ＲＮＡを含む試料との比較により、容易に検出できる。この方法は、ＨＩＶ感染の診断、がんの診断など多くの診断に応用可能である
【００４８】
次に、本発明の培養細胞などでのＲＮＡ切断方法および切断結果の解析法について説明する。
【００４９】
本発明のリボヌクレアーゼ、すなわち、リボヌクレアーゼ６５タンパク質即ちｔＲＮＡ前駆体３’プロセシング酵素は、サイトゾル抽出液、核抽出液、ミトコンドリア抽出液、葉緑体抽出液の中に見いだされており、すべての真核細胞に存在すると考えられている。従って、本発明のＲＮＡ切断ガイド剤を細胞内に持ち込むことにより、任意のＲＮＡを任意の部位で特異的に切断できると考えられる。in vitroで目的の標的ＲＮＡの目的の部位での切断に用いられることが確認されたＲＮＡ切断ガイド剤は、in vitroで合成したものを直接導入するか、または、このＲＮＡを細胞内転写反応で合成できるような、転写制御領域を含むＤＮＡとして導入する。この切断用ＲＮＡあるいはヌクレアーゼ耐性のある様々な誘導体のin vitroでの合成は、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機等を用いて行うことができる。切断用ＲＮＡ発現ＤＮＡは、目的のＲＮＡ切断ガイド剤に対応するＤＮＡを合成機等を用いて化学合成し、これを標準的遺伝子工学技術を用いて発現ベクターに組み込むことで得ることができる(Molecular cloning A laboratory manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons Inc., 1990)。細胞内への導入法としては、燐酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法など様々な方法がある(Molecular cloning A laboratory manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons Inc., 1990)。切断結果は、標的ＲＮＡの量、タンパク質をコードしているのであればその量、細胞特性などから解析される。特異的に切断された標的ＲＮＡが不安定になり分解されていく結果として標的ＲＮＡ量が減少するので、ノーザンブロッティング法やリボヌクレアーゼプロテクションマッピング法を用いて、この減少を解析することで標的ＲＮＡの特異的切断の程度を判定できる。コードされているタンパク質の量は、それに対する抗体を用いたウエスタンブロッティング法や、そのタンパク質の活性の測定を行うことで解析でき、タンパク質の減少量から間接的に目的ＲＮＡの切断効率を判定できる。標的ＲＮＡの翻訳産物が、細胞増殖速度や細胞形態などの細胞特性に影響を及ぼすタンパク質であるならば、その特性の変化から標的ＲＮＡの特異的切断の程度を解析することができる。
【００５０】
次に、本発明の特異的ＲＮＡ切断法の生物個体に対する応用およびその切断結果の解析法について説明する。
【００５１】
生物個体に対しても、基本的には上記の培養細胞等に対する応用方法が利用される。ただし、個体内の細胞へのＲＮＡ切断ガイド剤、または、その発現用ＤＮＡの導入方法に関しては、様々な工夫が必要である。
【００５２】
動物を対象にする場合には、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスなどから開発したウイルスベクターを利用することができる(Blood, 76, 271-, 1990, Cell, 68, 143-, 1992, J. Virol., 63, 3822-, 1989) 。センダイウイルスのエンベロープタンパク質を用いた膜融合リポソーム法(J. Biol. Chem., 266, 3361-, 1991)や、プラスミドＤＮＡなどを直接臓器や腫瘍に注入するネイキドＤＮＡ法(Science, 247, 1465-, 1990) なども用いることができる。組織特異的遺伝子導入法として、特異的受容体を介して細胞に取り込まれるタンパク質とポリリシン及びＤＮＡとの複合体を用いて、この受容体を発現している細胞にのみ遺伝子を導入する方法を使うことも考えられる(Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 3410-, 1990) 。標的細胞が造血幹細胞である場合には、細胞を一旦個体外に取り出して、遺伝子導入をした後に再び個体に戻してやる方法を利用できる(Hum. Gene Ther., 1, 331-,1990) 。標的ＲＮＡとしては、異常発現した細胞増殖関連遺伝子のｍＲＮＡやウイルス由来のＲＮＡなどを対象にすることもできる。生物個体に対する本発明の特異的ＲＮＡ切断法の効果の解析に関しては、上記の培養細胞に対する解析法に加えて、ウイルス感染症が直る、腫瘍が消失するなどの個体レベルでの変化から、本発明の効果を推測することができる。
【００５３】
他にも、生物個体に対する応用として、有用トランスジェニック植物の作出がある。ＲＮＡ切断ガイド剤を細胞内転写反応で合成できるような、転写制御領域を含むＤＮＡを植物細胞に導入する方法として、Ｔｉプラスミドとアグロバクテリウムを利用した方法、燐酸カルシウム法、ウイルスベクター法などがある（植物バイオテクノロジーＩＩ、東京化学同人、１９９１）。標的ＲＮＡとしては、植物が本来持っている好ましくない遺伝形質に関与するｍＲＮＡや、ウイルス由来のＲＮＡなどが考えられる。植物個体に対する本発明の特異的ＲＮＡ切断法の効果の解析に関しては、上記の培養細胞に対する解析法に加えて、問題の好ましくない遺伝形質が抑えられる、ウイルス抵抗性になるなどの個体レベルでの変化から、本発明の効果を推測することができる。
【００５４】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００５５】
実施例１ リボヌクレアーゼの単離
以下の操作は、５５℃熱処理の他は４℃で行った。２ｋｇのブタ肝臓組織に２倍体積のバッファー１（50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol ）を加えて、回転式刃のミキサーで２分間細胞を破砕し、１３，０００ｘＧで３０分間遠心した。９０℃の水浴で５５℃になるまで熱をかけ、ひき続き５５℃の水浴で５分間靜置した。その後、１３，０００ｘＧで３０分間遠心し、上清を得た。この上清に５０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、沈澱物を６，０００ｘＧで１時間遠心し回収した。この沈澱物をバッファー２（20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glycerol ）で溶解して、同じバッファー２で、５回バッファー交換をして透析した。この透析後の試料を、バッファー３（20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 mM EDTA, 1 mM DTT)で前もって平衡化したＱセファロース（ファルマシア社製）にかけて、バッファー３でカラム体積量洗い、０から１０００ｍＭ ＫＣｌの線形勾配によりタンパク質を溶出させた。この時、目的のタンパク質成分はおよそ３５０ｍＭ ＫＣｌの付近で溶出された。この画分を、５００ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー３で前もって平衡化したブルーセファロース（ファルマシア社製）にかけ、カラム体積の５倍の同バッファーで洗った。結合したタンパク質を、２０００ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー３で溶出させ、限外濾過法によりバッファー３を使って脱塩濃縮した。この時のフロースルー画分を用いて再度同様にブルーセファロースカラムクロマトグラフィーを行った。２度目のブルーセファロースカラムクロマトグラフィーで結合した画分は、一度目の画分よりも６倍程比活性が高かった。この２度目の結合画分を、さらに、１００ｍＭ ＫＣｌを含むバッファー３で平衡化したヘパリンセファロースにかけ、カラム体積の５倍量の同バッファーで洗浄した。その後、１００から２０００ｍＭ ＫＣｌの線形勾配によりタンパク質を溶出させた。目的のタンパク質は、１２００ｍＭ ＫＣｌ付近で溶出した。この画分を、限外濾過法によりバッファー3 を使って脱塩濃縮した後、バッファー３で平衡化したＭｏｎｏＱカラムにかけた。溶出は、０から１０００ｍＭ ＫＣｌの線形勾配で行い、目的の活性は、４００ｍＭ ＫＣｌ付近で溶出した。高度に精製されたこのタンパク質は、使用するまで−８０℃で保存した。
【００５６】
上記の各工程後のリボヌクレアーゼの総活性、比活性、収率及び精製率を下記表１に示す。表１に示されるように、熱処理後の酵素画分の約１５，０００倍の比活性を持つ、高度に精製された酵素がMono Qクロマトグラフィー後に得られた。
【００５７】
【表１】
実施例２ リボヌクレアーゼの理化学的性質
(1) 至適ｐＨ
ｔＲＮＡArg 前駆体を基質とし、上記方法により単離されたリボヌクレアーゼによる切断実験を種々のｐＨ下で行うことにより、リボヌクレアーゼの至適ｐＨを調べた。ｔＲＮＡArg 前駆体(GenBank/EMBL accession number X64282)は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む合成ＤＮＡからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて［α-32P]UTP存在下で合成した。切断反応は、0.1 pmol 基質ＲＮＡ，10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 3.2 mMスペルミジン、 50 ユニットのリボヌクレアーゼインヒビター（宝酒造社製、１ユニットの定義は、５ｎｇのＲＮａｓｅＡの特性を５０％阻害する活性）を含む１０μｌ溶液中３７℃で３０分間行い、その後、８Ｍウレアー１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により切断産物の解析を行った。ただし、酵素量は約0.1 ユニット使用し、ＴｒｉｓバッファーのｐＨは変化させた。
【００５９】
結果を図１４に示す。図１４に示されるように、本発明のリボヌクレアーゼの至適ｐＨは７．０ないし７．５である。
【００６０】
(2) リボヌクレアーゼの至適温度
種々の温度下において、ｔＲＮＡArg を基質とし、至適ｐＨを測定したのと同様な切断実験を行った（ただし、緩衝液のｐＨは７．９）。結果を図１５に示す。これからわかるように、本発明のリボヌクレアーゼの至適温度は５０〜６０℃であった。
【００６１】
(3) リボヌクレアーゼの分子量
ブタ肝臓由来のリボヌクレアーゼ６５タンパク質（ｔＲＮＡ前駆体３’プロセシング酵素）の天然状態での分子量。ＭｏｎｏＱクロマトグラフィー後の酵素画分（表１）を、０．１５Ｍ ＫＣｌを含むバッファー３で平衡化したスーパーデックス２００ＨＲ１０／３０（ファルマシア）にかけ、４０の分画（Fraction）に分けた。各分画は、限外濾過法によりバッファー３を用いて脱塩濃縮され、その一部を用いてｔＲＮＡArg 前駆体を基質として、上記至適ｐＨを測定したのと同様な切断実験を行った（ただし、緩衝液のｐＨは７．９）。キャリブレーションは、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）、アルブミン（６７ｋＤａ）、ベータラクトグロブリン（３５ｋＤａ）を分子量マーカーとして行った。
【００６２】
結果を図１６に示す。図１６中、挿入図のＫａｖは、（溶出体積−排除体積）／（ベッド体積−排除体積）で定義される。矢頭は、切断活性のピークの位置を示す。図１６より、上記方法により測定された、本発明のヌクレオチドの分子量は約１００ｋＤａであることがわかる。
【００６３】
(4) リボヌクレアーゼの等電点
一回目のブルーセファロースクロマトグラフィー結合画分（表１）を、０．０２５Ｍメチルピペラジン（ｐＨ５．７）で平衡化したMonoP HR5/20 （ファルマシア）にかけ、ポリバッファー７４（ｐＨ４．０）で溶出させ、１５の分画（Fraction）に分けた。各分画は、限外濾過法によりバッファー３を用いて濃縮し、その一部を用いてｔＲＮＡArg 前駆体を基質として、分子量測定の場合と同じ条件で切断実験を行なった。結果を図１７に示す。図１７から、本発明のリボヌクレアーゼの等電点は約４．５であることがわかる。
【００６４】
(5) 本発明のリボヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼ６５のタンパク質成分）とｔＲＮＡ前駆体３’プロセシング酵素(3' tRNase) が同一であることの証明。
ｔＲＮＡArg 前駆体(Pre-tRNA)（レーン１から３）、基質ＲＮＡ（Ｓ１）（レーン４から６）および基質ＲＮＡ（Ｓ２）（レーン７から９）の、単離された（表１のＭｏｎｏＱクロマトグラフィー後の）リボヌクレアーゼ(0.4ユニット) による切断実験の結果を示している。１９ヌクレオチドの３’トレーラーを持つ９２ヌクレオチドのｔＲＮＡArg 前駆体(GenBank/EMBL accession number X64282)は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む合成ＤＮＡからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて［α -32P]UTP 存在下で合成した。１６８ヌクレオチドの基質ＲＮＡ（Ｓ１）は、ＨｉｎｆＩで切断されたｐＳＰＣからＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて［α-32P]UTP存在下で合成した。５０ヌクレオチドの基質ＲＮＡ（Ｓ２）は、ＸｂａＩで切断されたｐＳＰＣからＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて［α-32P]UTP存在下で合成した(Nucleic Acids Res. 21, 4696-, 1993)。切断反応及び切断産物の解析は、分子量測定の場合と同じ条件で行った。Ｓ１は10 ng の３’欠失ｔＲＮＡArg 画分（レーン６）、Ｓ２は10 ng の３’欠失ｔＲＮＡAla 画分（レーン９）が存在する時にのみ切断された。一番左のカラムの数字の単位はヌクレオチドで、棒は基質ＲＮＡ、矢頭は切断産物を示す。
【００６５】
実施例３
マウスＦＭ３Ａ細胞（新潟大学医療技術短期大学部 三間博士より分譲。なお、同細胞はＪＣＲＢ細胞バンク（Japanese Research Resources Bank) にＪＣＲＢ０７０１の受託番号で寄託されているので、ここから分譲を受けることができる）から、実施例１と同様にして本発明のリボヌクレアーゼ（リボヌクレアーゼ６５のタンパク質成分）を単離した。
【００６６】
実施例４
１９ヌクレオチドの３’トレーラーを持つｔＲＮＡArg 前駆体のアンチコドンの後ろから３’末端までの次のような５６ヌクレオチドを標的ＲＮＡ(T3H) として、［α-32P]UTP存在下でＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
【００６７】
ＲＮＡ切断ガイド剤（以下の実施例において、ＲＮＡ切断ガイド剤がＲＮＡの場合にはこれを「ＲＮＡ切断用ＲＮＡ」と呼ぶ）として、ｔＲＮＡArg 前駆体の５’末端からアンチコドンまでの、上記の標的ＲＮＡと２カ所（* と+ で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ(GT7H)をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
これらの標的ＲＮＡとＲＮＡ切断用ＲＮＡの組み合わせは、本発明の切断法の基本であり、塩基対合により、アンチコドンの後ろで燐酸ジエステル結合が切れている点を除けば、ｔＲＮＡArg 前駆体とほとんど同じ構造になると考えられ、図６の型に入る。
【００６９】
このＲＮＡ切断用ＲＮＡと部分精製された（２回目のブルーセファロースクロマトグラフィー後の分画）マウスＦＭ３Ａ細胞由来の本発明のリボヌクレアーゼ（実施例３）を含む反応溶液（10 mM Hepes (pH 7.9), 0.5 mM DTT, 3.2 mMスペルミジン）内で、32Ｐにより標識された標的ＲＮＡ（０．１ｐｍｏｌ）を、３０分間３７℃で反応させた。反応後、切断産物を、８Ｍウレア−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、そのゲルのオートラジオグラフをとることにより解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が見られた（図１９、レーン１−４）。なお、図１９のレーン１は未反応の標的ＲＮＡ（上記反応に供さなかったもの）、レーン２ないし４はそれぞれ、ＲＮＡ切断用ＲＮＡ（ＧＴ７Ｈ）を０ｐｍｏｌ（対照）、１２．５ｐｍｏｌ及び５０ｐｍｏｌ加えた場合の結果を示す。
【００７０】
実施例５
実施例５から７では、実施例４のうち、標的ＲＮＡ内のｔＲＮＡの高次構造に関与しているＴループに対応する塩基を変えて、特異的切断を調べた。次のような５６ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(SPHM1) を［α-32P]UTPの存在下でSP6 ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
【００７１】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【００７２】
実施例６
次のような５６ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(SPHM2) を［α-32P]UTPの存在下でSP6 ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【００７４】
実施例７
次のような５６ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(SPHM3) を［α-32P]UTPの存在下でSP6 ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【００７６】
実施例５から７の結果より、標的ＲＮＡは、ｔＲＮＡの高次構造に関与するＴループ内の塩基を、ＲＮＡ切断用ＲＮＡと複合体を作った時にｔＲＮＡのＴループに対応する部位に持たなくとも、切断されることが示された。
【００７７】
実施例８
実施例８から１０では、実施例４のうち、標的ＲＮＡ内のｔＲＮＡのＴステムに対応する塩基を変えて、ここの塩基対合を壊した時の特異的切断を調べた。次のような５６ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(T7HM1) を［α-32P]UTP存在下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【００７９】
実施例９
次のような５６ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(T7HM2) を［α-32P]UTP存在下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の７０％程度だった。
【００８１】
実施例１０
次のような５６ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(T7HM3) を［α-32P]UTP存在下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の７０％程度だった。
【００８３】
実施例８から１０の結果より、標的ＲＮＡは、ｔＲＮＡのＴステムに対応する塩基対合を持たなくとも、ＲＮＡ切断用ＲＮＡと複合体を作った時に切断されることが示された。
【００８４】
実施例１１
実施例１１から１３では、実施例４のうち、標的ＲＮＡ内のｔＲＮＡのＴステム・ループに対応する構造を小さくした時（図７型）の特異的切断を調べた。
【００８５】
次のような48ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(T3HM1) を［α-32P]UTP存在下でＴ3 ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の７０％程度だった。
【００８７】
実施例１２
次のような44ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(T3HM2) を［α-32P]UTP存在下でＴ3 ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の５％程度だった。
【００８９】
実施例１３
次のような39ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(T3HM3) を［α-32P]UTP存在下でＴ3 ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の３％程度だった。
【００９１】
実施例１１から１３の結果は、標的ＲＮＡは、ｔＲＮＡのＴステム・ループに対応する構造を持たなくとも、ＲＮＡ切断用ＲＮＡと図７のような複合体を作った時に切断されることが示された。
【００９２】
実施例１４
実施例４のＲＮＡ切断用ＲＮＡと標的ＲＮＡの基本的塩基対合構造を保ちながら標的ＲＮＡの５’末端を９ヌクレオチド長くした、次のような６５ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(SPH2)を［α-32P]UTP存在下でＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ及びリボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に反応を行い、切断産物を解析したところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。電気泳動後のオートラジオグラフが図１９のレーン５〜８に示されている。なお、図１９のレーン５は未反応の標的ＲＮＡ（上記反応に供さなかったもの）、レーン６ないし８はそれぞれ、ＲＮＡ切断用ＲＮＡ（ＧＴ７Ｈ）を０ｐｍｏｌ（対照）、５ｐｍｏｌ及び５０ｐｍｏｌ加えた場合の結果を示す。
【００９４】
この切断実験における４６ヌクレオチドの５’切断産物の３’塩基配列を、化学的ＲＮＡ塩基配列決定法により決めた所、3' GCUCGGUC・・・ という予想した配列が確認された（図２０）。同様の切断実験は、ブタ肝臓由来の高度に精製された本発明のリボヌクレアーゼ（実施例１のＭｏｎｏＱクロマトグラフィー後）を用いて、10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 3.2 mMスペルミジンを含む反応溶液中でも行われて、同様の結果が得られた。この結果は、標的ＲＮＡの、ＲＮＡ切断用ＲＮＡと５塩基対合する配列の上流領域を、ｔＲＮＡのアンチコドンループより長くしても、本発明の切断法で特異的に標的ＲＮＡを切断できることを示している。
【００９５】
実施例１５
実施例１５と１６では、実施例１４のＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7H)の標的ＲＮＡと塩基対合する３’側５塩基の下流配列を変えたり、除去したりして標的ＲＮＡの切断を解析した。
【００９６】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7H)の３’末端５塩基をすべてＵに変え、実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と２カ所（* と+ で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HT5)をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
標的ＲＮＡとして、実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【００９８】
実施例１６
ＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7H)の３’末端５塩基をすべて削除し、実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と２カ所（＊と＋で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HM1)をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
標的ＲＮＡとして、実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【０１００】
実施例１５と１６の結果より、ＲＮＡ切断用ＲＮＡは、標的ＲＮＡと塩基対合する３’側５塩基の下流配列を変えたり、除去できることが示された。
【０１０１】
実施例１７
実施例１７から２１では、実施例１６のＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HM1)のｔＲＮＡ上でＤステム・ループに対応する領域を短くして（図８型）、標的ＲＮＡの切断を解析した。
【０１０２】
実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と２カ所（* と+ で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HM2)をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
標的ＲＮＡとして、実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【０１０４】
実施例１８
実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と２カ所（* と+ で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HM3)をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
標的ＲＮＡとして、実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【０１０６】
実施例１９
実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と２カ所（＊と＋で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HM4)をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
標的ＲＮＡとして、実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【０１０８】
実施例２０
実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と２カ所（＊と＋で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HM5)をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
標的ＲＮＡとして、実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【０１１０】
実施例２１
実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と２カ所（＊と＋で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HM6)をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
標的ＲＮＡとして、実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。
【０１１２】
実施例１７から２１の結果より、ＲＮＡ切断用ＲＮＡはｔＲＮＡ上でＤステム・ループに対応する領域を短くし、図８のような構造にしても、標的ＲＮＡの切断に用いられることが明らかにされた。
【０１１３】
実施例２２
実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と１カ所（＋で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HM80) （図１０型）をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
標的ＲＮＡとして、実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度だった。電気泳動後のオートラジオグラフが図２１に示されている。なお、図２１のレーン１は未反応の標的ＲＮＡ（切断反応に供さなかったもの）、レーン２及び３はそれぞれ、ＲＮＡ切断用ＲＮＡ（GT7HM80)を０ｐｍｏｌ（対照）及び５０ｐｍｏｌ加えた場合の結果を示す。また、図２１において、一番右のカラムの数字の単位はヌクレオチドで、棒は基質ＲＮＡ、矢頭は切断産物を示す。
【０１１５】
同様の切断実験は、ブタ肝臓由来の高度に精製された本発明のリボヌクレアーゼ（実施例１のＭｏｎｏＱクロマトグラフィー後）を用いて、10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 3.2 mMスペルミジンを含む反応溶液中でも行われて、同様の結果が得られた。この結果は、ＲＮＡ切断用ＲＮＡは、標的ＲＮＡとわずか７塩基対合するだけで機能し得ることを示している（図１０）。
【０１１６】
実施例２３
実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と１カ所（＋で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡ切断用ＲＮＡ(G5)（図１０型）をＤＮＡ／ＲＮＡ合成機により合成した。
標的ＲＮＡとして実施例１４で用いたＳＰＨ２（対合領域に＋を付して以下に示す。
【０１１８】
実施例２４
次のような５６ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(T7HM3) を［α-32P]UTP存在下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、上記の標的ＲＮＡと２カ所（＊と＋で示された領域）で塩基対合して、図９のような構造をとる次のようなＲＮＡ(GT7HM7)をＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
上記標的ＲＮＡ(T7HM3) 及びＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GT7HM7)並びに実施例３で調製したリボヌクレアーゼ部分精製物（２回目のブルーセファロースクロマトグラフィー後の分画）を用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の４０％程度であった。この結果より、標的ＲＮＡは、ｔＲＮＡのアクセプターステムとアンチコドンステムに対応する塩基対合を持つだけで、ＲＮＡ切断用ＲＮＡと複合体を作った時に切断されることが示された（図９）。
【０１２１】
実施例２５
次のような48ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(T3HM1) を［α-32P]UTP存在下でＴ3 ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして実施例２４で用いたGT7HM7を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の４０％程度であった。この結果は実施例２４と共に、標的ＲＮＡは、ｔＲＮＡのアクセプターステムとアンチコドンステムに対応する塩基対合を持つだけで、ＲＮＡ切断用ＲＮＡと複合体を作った時に切断されることを示している（図９）。
【０１２３】
実施例２６
ＲＮＡ切断ガイド剤として、実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と２カ所（* と+ で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＤＮＡを合成機により合成した。
標的ＲＮＡとして実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、ＲＮＡ切断ガイド剤として上記GT7HDNA を用いて実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が僅かながら確認された。切断効率は、実施例４の１０％程度であった。
【０１２５】
実施例２７
ＲＮＡ切断ガイド剤として、実施例１４で用いた標的ＲＮＡであるＳＰＨ２と２カ所（* と+ で示された領域）で塩基対合可能な次のようなホスホロチオエート化ＤＮＡを合成機により合成した。
標的ＲＮＡとして実施例１４で用いたＳＰＨ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、ＲＮＡ切断ガイド剤として上記GT7HSDNAを用いて実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が僅かながら確認された。切断効率は、実施例４の１０％程度であった。
【０１２７】
実施例２６と２７の結果は、ＲＮＡ切断ガイド剤は、ＤＮＡあるいは、化学修飾されたＤＮＡでも機能し得ることを示している。
【０１２８】
実施例２８
次に、標的ＲＮＡとして、ｔＲＮＡ塩基配列とは全く関係のないＨＩＶ−１の遺伝子ｅｎｖ内に存在する次のような６０ヌクレオチドの標的ＲＮＡを［α-32P]UTP存在下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成し、切断実験を試みた。
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、上記の標的ＲＮＡと２カ所（* と+ で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
上記標的ＲＮＡ（HIV1) 及び上記ＲＮＡ切断用ＲＮＡ（GHIVA)を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４と同程度であった。
【０１３１】
電気泳動後のオートラジオグラフを図２３のレーン１〜１０に示す。図２３中、レーン１は標的ＲＮＡを切断反応に供さなかった場合、レーン２〜４はそれぞれ、ＲＮＡ切断用ＲＮＡとしてGHIVA をそれぞれ０ｐｍｏｌ、０．５ｐｍｏｌ、５．０ｐｍｏｌ加えた場合、レーン５及び６はＲＮＡ切断用ＲＮＡとして酵母のｔＲＮＡをそれぞれ０．５ｐｍｏｌ及び５．０ｐｍｏｌ加えた場合、レーン７及び８はＲＮＡ切断用ＲＮＡとして実施例３０で用いたＧＨＩＶＢをそれぞれ０．５ｐｍｏｌ及び５ｐｍｏｌ加えた場合、レーン９及び１０はＲＮＡ切断用ＲＮＡとして実施例４で用いたＧＴ７Ｈをそれぞれ０．５ｐｍｏｌ及び５ｐｍｏｌ加えた場合の結果を示す。図２３に示されるように、ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、標的ＲＮＡと部分的に対合するGHIVA を用いた場合には標的ＲＮＡが切断されるが、標的ＲＮＡと対合しない酵母ｔＲＮＡやＧＴ７Ｈを用いた場合には標的ＲＮＡの特異的切断は起きなかった。
【０１３２】
同様の切断実験は、ブタ肝臓由来の高度に精製された本発明のリボヌクレアーゼ（実施例１のＭｏｎｏＱクロマトグラフィー後）を用いて、10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 3.2 mMスペルミジンを含む反応溶液中でも行われて、同様の結果が得られた。ただし、切断は予定された部位の他に１ヌクレオチド５’よりと３’よりの部位でも起こった。
【０１３３】
実施例２９
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、実施例２８で用いた標的ＲＮＡ（ＨＩＶ１）と1 カ所（＋で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
このＲＮＡ切断用ＲＮＡと、実施例２８で用いた標的ＲＮＡ（ＨＩＶ１）と、実施例４で用いたリボヌクレアーゼとを用いて実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、実施例２８と同じところで標的ＲＮＡの切断が確認された。切断効率は、実施例４の７０％程度であった。同様の切断実験は、ブタ肝臓由来の高度に精製された本発明のリボヌクレアーゼ（実施例１のＭｏｎｏＱクロマトグラフィー後）を用いて、10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 3.2 mMスペルミジンを含む反応溶液中でも行われて、同様の結果が得られた。
【０１３５】
この結果は、実施例２２と共に、標的ＲＮＡとＲＮＡ切断用ＲＮＡの塩基対合構造が、図１０のような単純な構造であっても、本発明のリボヌクレアーゼが認識し得ることを示している。
【０１３６】
実施例３０
実施例２５、２６とは異なる、ＨＩＶ−１の遺伝子ｇａｇ内に存在する次のような５６ヌクレオチドの標的ＲＮＡを［α-32P]UTP存在下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、上記の標的ＲＮＡと２カ所（* と+ で示された領域）で塩基対合可能な次のようなＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
上記標的ＲＮＡ（HIV2) 及び上記ＲＮＡ切断用ＲＮＡ（GHIVB)を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の５０％程度であった。ただし、切断は予定された部位の他に１ヌクレオチド５’よりと、２ヌクレオチド３’よりの部位でも起こった。このＲＮＡ切断用ＲＮＡ(GHIVB) の代わりに、実施例４と２８でそれぞれ用いたGT7HやGHIVA のＲＮＡ切断用ＲＮＡあるいは酵母のｔＲＮＡを使用した時には、この５６ヌクレオチドの標的ＲＮＡ(HIV2)の特異的切断は起こらなかった。
【０１３９】
実施例３１
次に、標的ＲＮＡとして、ｔＲＮＡ程の短いＲＮＡでなく、かなり長いＲＮＡを用いて切断実験を行った。以下のような、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのｍＲＮＡ配列の部分を含む415 ヌクレオチドの標的ＲＮＡを［α-32P]UTP存在下でT7ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、上記の標的ＲＮＡと２カ所（* と+ で示された領域）で塩基対合可能な次のような基本型のＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
標的ＲＮＡとして上記ＣＡＴＣを用い、ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして上記ＧＣＡＴ１を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、標的ＲＮＡの切断予定部位での切断が確認された。切断効率は、実施例４の７０％程度であった。ただし、切断は予定された部位から１ヌクレオチド３’よりの部位で起こった。
【０１４２】
実施例３２
実施例３２から３４では、Ｄステム・ループに対応する配列を短くしたＲＮＡ切断用ＲＮＡと実施例３１で用いた標的ＲＮＡ（ＧＣＡＴ）とを用いて切断実験を行なった。
【０１４３】
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、上記の標的ＲＮＡ（ＧＣＡＴ）と２カ所（＊と＋で示された領域）で塩基対合可能な次のＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
標的ＲＮＡとして上記ＣＡＴＣを用い、ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして上記ＧＣＡＴＭ１を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、実施例３１と同様に標的ＲＮＡの切断が確認された。切断効率は、実施例４の７０％程度であった。
【０１４５】
実施例３３
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、上記の標的ＲＮＡ（ＧＣＡＴ）と２カ所（＊と＋で示された領域）で塩基対合可能な次のＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
標的ＲＮＡとして上記ＣＡＴＣを用い、ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして上記ＧＣＡＴＭ２を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、実施例３１と同様に標的ＲＮＡの切断が確認された。切断効率は、実施例４の１５％程度であった。
【０１４７】
実施例３４
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、上記の標的ＲＮＡ（ＧＣＡＴ）と２カ所（＊と＋で示された領域）で塩基対合可能な次のＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
標的ＲＮＡとして上記ＣＡＴＣを用い、ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして上記ＧＣＡＴＭ３を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、実施例３１と同様に標的ＲＮＡの切断が確認された。切断効率は、実施例４の１５％程度であった。
【０１４９】
実施例３２から３４の結果より、図８のような構造をとる、Ｄステム・ループに対応する配列を短くしたＲＮＡ切断用ＲＮＡは、４１５ヌクレオチドのかなり長い標的ＲＮＡに対しても有効であることが明らかになった。
【０１５０】
実施例３５
ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして、７塩基から成る標的ＲＮＡ結合用５’配列（ガイド配列）と２０塩基程のステム・ループのみから構成され、上記の標的ＲＮＡ（ＧＣＡＴ）と１カ所（＋で示された領域）で塩基対合可能な次の図１１型のＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成した。
標的ＲＮＡとして上記ＣＡＴＣを用い、ＲＮＡ切断用ＲＮＡとして上記ＧＣＡＴ１２６を用い、リボヌクレアーゼは実施例４で用いたものと同じものを用い、実施例４と同様に切断反応及びその後の解析を行ったところ、実施例３１と同様に標的ＲＮＡの切断が確認された。切断効率は、実施例４の３０％程度であった。
【０１５２】
【発明の効果】
本発明により、任意のＲＮＡを所望の部位で切断する方法並びにそのために用いられる新規なリボヌクレアーゼ及びＲＮＡ切断ガイド剤が提供された。本発明の方法によれば、任意のＲＮＡを塩基配列特異的に所望の位置で切断することができるので、上記のように、遺伝子工学並びに診断及び治療の分野に大いに貢献するものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の構造を模式的に示す図である。
【図２】ｔＲＮＡArg 前駆体の構造を示す図である。
【図３】３’欠失ｔＲＮＡArg と基質ＲＮＡ（Ｓ１）との複合体の構造を示す図である。
【図４】３’欠失ｔＲＮＡAla と基質ＲＮＡ（Ｓ２）との複合体の構造を示す図である。
【図５】ｔＲＮＡ前駆体の構造を模式的に示す図である。
【図６】本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の一例と標的ＲＮＡの一例との複合体の構造を模式的に示す図である。
【図７】本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の一例と標的ＲＮＡの一例との複合体の構造を模式的に示す図である。
【図８】本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の一例と標的ＲＮＡの一例との複合体の構造を模式的に示す図である。
【図９】本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の一例と標的ＲＮＡの一例との複合体の構造を模式的に示す図である。
【図１０】本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の一例と標的ＲＮＡの一例との複合体の構造を模式的に示す図である。
【図１１】本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の一例と標的ＲＮＡの一例との複合体の構造を模式的に示す図である。
【図１２】本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の一例と標的ＲＮＡの一例との複合体の構造を模式的に示す図である。
【図１３】本発明のＲＮＡ切断ガイド剤の一例と標的ＲＮＡの一例との複合体の構造を模式的に示す図である。
【図１４】本発明のリボヌクレアーゼの活性のｐＨ依存性を調べた結果を示す図である。
【図１５】本発明のリボヌクレアーゼの活性の温度依存性を調べた結果を示す図である。
【図１６】本発明のリボヌクレアーゼの分子量を測定した結果を示す図である。
【図１７】本発明のリボヌクレアーゼの等電点を測定した結果を示す図である。
【図１８】本発明のリボヌクレアーゼがｔＲＮＡ前駆体３’プロセシング酵素と同一であることを示す切断実験の結果を示す図である。
【図１９】本発明の実施例４及び１４の切断実験の結果を示す図である。
【図２０】本発明の実施例１４における５’切断産物の部分塩基配列を決定した結果を示す図である。
【図２１】本発明の実施例２２の切断実験の結果を示す図である。
【図２２】本発明の実施例２３の切断実験の結果を示す図である。
【図２３】本発明の実施例２８の切断実験の結果を示す図である。
【符号の説明】
１０ ＲＮＡ切断ガイド剤
１２ ガイド配列
１４ ステム・ループ部
１６ サブガイド配列
１８ 任意の３’配列
Claims (9)
- 下記の理化学的性質を有し、ｔＲＮＡ前駆体の３’トレーラーを除去する酵素であるリボヌクレアーゼ。
（１）作用及び特異性：第１鎖ＲＮＡと、５’末端から少なくとも連続する５ヌクレオチドが前記第１鎖ＲＮＡと対合した第２鎖ＲＮＡとの対合部分を認識し、前記第１鎖ＲＮＡの該対合部分の３’側端部又はこの端部から１〜３塩基３’側を切断する。
（２）至適ｐＨ：７．０−７．５
（３）至適温度５０−６０℃
（４）分子ふるいクロマトグラフィーによる分子量１００ｋＤａ
（５）クロマトフォーカシング法による等電点４．５。 - 切断すべき標的ＲＮＡの少なくとも連続する５塩基と相補的なガイド配列を５’側端部に有する核酸から成るＲＮＡ切断ガイド剤の前記ガイド配列を前記標的ＲＮＡの相補的部分と対合させ、これに請求項１記載のリボヌクレアーゼを作用させることから成るＲＮＡの切断方法。
- 前記ＲＮＡ切断ガイド剤がＲＮＡである請求項２記載の方法。
- 前記ガイド配列が７塩基である請求項２または３記載のＲＮＡの切断方法。
- 前記ＲＮＡ切断ガイド剤が、前記ガイド配列の３’側下流に、前記標的ＲＮＡの少なくとも連続する５塩基と相補的なサブガイド配列を有する請求項２ないし４の何れか１項に記載のＲＮＡの切断方法。
- 前記ＲＮＡ切断ガイド剤において、前記ガイド配列とサブガイド配列との間が少なくとも７塩基離れている請求項５記載のＲＮＡの切断方法。
- 前記ＲＮＡ切断ガイド剤が、前記ガイド配列の３’側下流にステム・ループ部を有する請求項２ないし６の何れか１項に記載のＲＮＡの切断方法。
- 前記標的ＲＮＡの前記ガイド配列に相補的な配列と、前記サブガイド配列に相補的な配列との間が、少なくとも１１塩基離れている請求項２ないし７の何れか１項に記載のＲＮＡの切断方法。
- 前記標的ＲＮＡが、前記ガイド配列に相補的な配列の５’側下流にステム・ループ部を有する請求項２ないし８の何れか１項に記載のＲＮＡの切断方法。
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019044974A1 (ja) | 2017-08-31 | 2019-03-07 | 株式会社Ｖｅｒｉｔａｓ Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ | スモールガイドアンチセンス核酸とその使用 |
-
1995
- 1995-07-05 JP JP19247595A patent/JP3660718B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019044974A1 (ja) | 2017-08-31 | 2019-03-07 | 株式会社Ｖｅｒｉｔａｓ Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ | スモールガイドアンチセンス核酸とその使用 |
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