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Regulacion de la expresion del gen bcl-2.
ES2326118T3
Spain
- Other languages
English - Inventor
John C. Reed - Current Assignee
- University of Pennsylvania Penn
Worldwide applications
Application ES04025522T events
2009-10-01
Application granted
2009-10-01
2014-09-20
Anticipated expiration
Status
Expired - Lifetime
Description
translated from
Regulación de la expresión del gen
bcl-2.
La investigación de esta solicitud de patente
fue financiada en parte por los Institutos Nacionales de Salud,
subvención CA 26380. El gobierno de los Estados Unidos posee ciertos
derechos en la invención.
La presente invención se relaciona con el sector
de los tratamientos del cáncer y más en particular al sector de los
tratamientos del cáncer con oligómeros anticódigo.
Esta solicitud es una continuación en parte del
documento No. de Serie 07/840.716 presentado el 21 de febrero, 1992,
que era una continuación en parte del documento No. de Serie
07/288.692 presentado el 22 de diciembre, 1988, que fue
abandonado.
Los enfoques actuales del tratamiento del cáncer
sufren de ausencia de especificidad. La mayoría de los fármacos que
se han desarrollado son productos naturales o derivados que, o
bloquean las rutas enzimáticas o interactúan de manera aleatoria
con el ADN. Debido a los bajos índices terapéuticos, la mayoría de
los fármacos para el tratamiento de cáncer van acompañados de
graves toxicidades que limitan la dosis. La administración de
fármacos para tratar el cáncer destruye no sólo las células
cancerosas sino también las células normales no cancerosas. Debido
a estos efectos perjudiciales, se necesitan tratamientos que sean
más específicos para las células cancerosas.
Se ha descubierto que una clase de genes, los
oncogenes, juegan un papel importante en la transformación y
mantenimiento del estado canceroso y que apagando estos genes, o
inhibiendo sus efectos de alguna manera, se puede hacer retornar
una célula a su fenotipo normal. El papel de los oncogenes en la
etiología de muchos cánceres humanos ha sido reseñado en Bishop,
"Oncogenes Celulares y Retroviruses" ("Cellular Oncogenes and
Retroviruses") Science, 235:305-311 (1987). En
muchos tipos de tumores humanos, incluyendo linfomas y leucemias,
el gen humano bcl-2 está sobreexpresado y puede
estar asociado con tumorigenicidad (Tsujimoto y otros. Participación
del gen bcl-2 en el linfoma folicular humano
(Involvement of the bcl-2 gene in human follicular
lynphoma) Science 228:1440-1443 (1985).
Los oligodesoxinucleótidos antisentido son un
ejemplo de una herramienta terapéutica específica con el potencial
para la ablación de la función de los oncogenes. Estos ADNs cortos
(usualmente de aproximadamente 30 bases) sintéticos de cadena
simple tienen una secuencia de bases complementaria al ARNm diana y
forman un dúplex híbrido mediante el pareamiento de bases mediante
enlace de hidrógeno. Esta hibridación se supone que evite la
expresión del código del ARNm diana en su producto proteico y, de
esta manera, impedir los efectos posteriores del producto proteico.
Debido a que la secuencia de ARNm expresada por el gen se denomina
secuencia en sentido, la secuencia complementaria se denomina
secuencia antisentido. Bajo algunas circunstancias, la inhibición
de ARNm podría ser más eficiente que la inhibición de sitio activo
de un enzima, ya que una molécula de ARNm da lugar a múltiples
copias de proteínas.
Los oligodesoxinucleótidos sintéticos
complementarios al ARNm (antisentido) del oncogén
c-myc se han utilizado para inhibir de
manera específica la producción de la proteína
c-myc, deteniendo, de esta manera, el
crecimiento in vitro de células leucémicas humanas, Holt y
otros, Mol. Cell Biol. 8:963-973 (1988) y
Wickstrom y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
85:1028-1-32 (1988). Los
oligodesoxinucleótidos también ha sido empleados como inhibidores
específicos de retroviruses, incluyendo el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH-I), Zamecnik y
Stephenson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
75:280-284 (1978) y Zamecnik y otros, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 83:4143-4146 (1986).
La presente invención da a conocer oligómeros
anticódigo y procedimientos de inhibición del crecimiento de
células cancerosas. El crecimiento de células de linfoma o leucemia,
que son tipos de linfocitos, se inhibe mediante los oligómeros
anticódigo y procedimientos de la presente invención. Se da a
conocer un oligómero anticódigo complementario, como mínimo, a una
parte efectiva de la cadena en sentido de ARNm al gen
bcl-2 humano y las células se ponen en
contacto, a continuación, con el oligómero anticódigo en una
concentración suficiente para inhibir el crecimiento de células.
Los métodos de la presente invención son adecuados para inhibir el
crecimiento de células de linfoma/leucemia, que expresan el gen
bcl-2 humano y tienen translocación
cromosomal t (14; 18), así como aquellas que expresan el gen
bcl-2 y no tienen translocación cromosomal t
(14; 18).
Según realizaciones preferentes, el oligómero
anticódigo es complementario sustancialmente a un sitio estratégico
en la cadena en sentido del pre-ARNm. Un sitio
estratégico preferente es el sitio de iniciación de la traducción
de la cadena codificadora de pre-ARNm. Sitios
estratégicos alternativos incluyen sitios de codificación para
empalme, transporte o degradación. El oligómero anticódigo en
cuestión, ya sea en su forma "nativa" no modificada
-oligonucleótido- o como un derivado, se pone en contacto con las
células de linfoma o leucemia dianas. Para su uso terapéutico in
vivo, es preferible un derivado del oligonucleótido
"nativo", tal como la forma fósforotioada, ya que se cree que
estas formas son más resistentes a la degradación, a pesar del hecho
de que se ha encontrado que los tiempos de respuesta a algunos
análogos, tales como análogos fósforotioatos, son algo más lentos
que los de la forma "nativa" del oligonucleótido.
Un oligómero anticódigo preferente, denominado
en este documento TI-AS (oligómero anticódigo de
iniciación de la traducción), es un oligodesoxinucleótido que se
acopla al sitio de iniciación de la traducción de la cadena del
ARNm codificadora del gen bcl-2 humano y es
complementaria a esa región. Más preferentemente, este nucleótido
comprende una porción TAC que es complementaria a la secuencia de
iniciación ATG de la cadena codificadora del gen
bcl-2 y preferentemente comprende, además,
porciones de flanqueo de dos hasta aproximadamente cien bases, más
preferentemente de aproximadamente cinco hasta aproximadamente
veinte bases, que son complementarias a las porciones de la cadena
codificadora del gen bcl-2 que flanquean
dicha secuencia de iniciación. Se ha encontrado que el nucleótido
TI-AS es efectivo en la inhibición del crecimiento
de células diana tanto en presencia como en ausencia de suero.
Por consiguiente, un objetivo primario de la
presente invención es proporcionar nuevos oligómeros anticódigo,
que sean útiles en la inhibición del crecimiento de células
cancerosas. La presente invención también incluye composiciones
para la inhibición del crecimiento de células tumorales, cuya
composición comprende el oligómero anticódigo de la presente
invención junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
Este y otros objetivos de la presente invención
serán más evidentes a partir de la siguiente descripción
detallada.
La figura 1 muestra gráficas de los efectos de
la variación de las concentraciones de oligodesoxinucleótidos
antisentido sobre la inhibición de la proliferación celular.
La figura 2 muestra gráficas de la dependencia
de la concentración de inhibición de la proliferación celular por
oligodesoxinucleótidos antisentido normales y fósforotioatos.
Adiciones de oligodesoxinucleótidos a cultivos incluido
TI-AS fósforotioato (\medcirc y \medcirc; dos
experimentos por separado), TI-S fósforotioato
(\Delta) TI-AS normal (\Box) y
TI-S normal (\Delta).
La figura 3 muestra los resultados de la
electroforesis en gel de seis oligonucleótidos antisentido que
tienen como diana el sitio de iniciación de la traducción del ARNm
de bcl-2.
La figura 4 muestra el grado de fragmentación
del ADN que resulta del tratamiento con oligonucleótidos de las
células RS11846. La figura 4(a) muestra el efecto de
oligonucleótidos que tienen como diana el sitio de iniciación de la
traducción. La figura 4(b) muestra el efecto de
oligonucleótidos dirigidos contra la región 5'-cap
del ARNm de
bcl-2.
bcl-2.
La figura 5 es una gráfica que muestra la
dependencia de la concentración de la inhibición mediante un
oligonucleótido antisentido que tiene como diana el sitio de
iniciación de la traducción del ARNm de
bcl-2.
Las figuras 6 (a) y (b) son gráficas que
muestran los resultados del análisis de inmunofluorescencia de los
niveles de proteína bcl-2 en células tratadas
con oligonucleótidos.
Las figuras 7 (a)-(d) son perfiles de FACS para
células 697 antes y después del tratamiento con oligonucleótidos
antisentido de bcl-2.
Las figuras 8 (a)-(c) muestran
oligodesoxinucleótidos antisentido de bcl-2 que
producen reducciones específicas de secuencias en el ARNm de
bcl-2 y en la proteína bcl-2 y que
producen una sensibilidad aumentada de las células
SU-DHL-4 a los fármacos
quimioterapéuticos contra el cáncer.
La figura 9 demuestra los efectos diferenciales
de los oligómeros antisentido de bcl-2 sobre la
quimiosensibilidad de las células
32D-bcl-2 y
32D-BHRF-1.
La figura 10 (a-b) muestra la
reducción de la quimiorresistencia de las células RS11846 a partir
de la expresión antisentido de bcl-2 inducible a
partir de un plásmido de expresión.
La figura 11 muestra oligómeros
metilfosfonato/fosfodiester antisentido de bcl-2 que
inducen la muerte de las células de linfoma DOHH2.
La figura 12 muestra oligómeros quiméricos
metilfosfonato (MP)/Fosfodiester (PO) que inhiben el crecimiento de
las células MCF-7 de cáncer de mama humano.
La figura 13 muestra la optimización de
secuencias del oligómero antisentido de bcl-2.
Según la presente invención, los oligómeros
anticódigo se dan a conocer para inhibir del crecimiento de células
cancerosas, para aumentar la sensibilidad de las células cancerosas
a los agentes quimioterapéuticos contra el cáncer, o para inducir la
muerte de la célula cancerosa solos o en combinación con cualquiera,
uno o más, de los agentes quimioterapéuticos contra el cáncer.
Tal como se utiliza en el presente documento, el
término "oligómeros anticódigo" significa oligonucleótidos
anticódigo y análogos de los mismos y se refiere a la gama de
especies químicas que reconocen secuencias de polinucleótidos diana
mediante interacciones de enlaces de hidrógeno con las bases
nucleotídicas de las secuencias dianas. Las secuencias diana pueden
ser de ARN de simple y de doble cadena o ADN de simple o de doble
cadena.
Los oligonucleótidos anticódigo y análogos de
los mismos pueden ser ARN o ADN, o análogos de ARN o ADN, a los que
se les hace referencia comúnmente como oligómeros antisentido u
oligonucleótidos antisentido. Dichos análogos de ARN o ADN
comprenden, sin constituir limitación, modificaciones
2-'O-alquilo azúcares, modificaciones en las
cadenas principales metilfosfonadas, fósforotioadas,
fósforoditioadas, formacetal, 3'-tioformacetal,
sulfona, sulfamato y nitróxido, y análogos en los que las fracciones
de las bases se han modificado. Además, los análogos de los
oligómeros pueden ser polímeros en los que la fracción de azúcares
ha sido modificada o reemplazada por otra fracción adecuada, dando
como resultado polímeros que incluyen, sin constituir limitación,
análogos de morfolino y análogos de ácidos nucleicos peptídicos
(PNA)(Egholm y otros. Ácidos nucleicos peptídicos (PNA). Análogos
de oligonucleótidos con una cadena principal peptídica aquiral,
(1992).
Los análogos anticódigo pueden ser también
mezclas de cualquiera de los tipos de oligonucleótidos análogos
juntos o en combinación con ADN o ARN nativos. Al mismo tiempo, los
oligonucleótidos y los análogos de los mismos pueden utilizarse
solos o en combinación con uno o más oligonucleótidos adicionales o
análogos de los mismos. Los oligonucleótidos pueden ser de una
longitud desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 1.000
nucleótidos. Aunque los oligonucleótidos de 10 a 100 nucleótidos son
útiles en la presente invención, el intervalo preferente de
longitud de los oligonucleótidos es de alrededor de 15 hasta
alrededor de 24 bases.
Los oligonucleótidos anticódigo y los análogos
de los mismos también comprenden conjugados de los oligonucleótidos
y de los análogos de los mismos. (John Goodchild, Conjugados de
Oligonucleótidos y Oligonucleótidos Modificados: Una Revisión de su
Síntesis y Propiedades, Bioconjugate Chemistry, Volumen 1 No.
3 Mayo/Junio (1990)). Dichos conjugados presentan propiedades para
mejorar la absorción, farmacocinéticas y resistencia a las nucleasas
del oligonucleótido, o la capacidad de mejorar la reticulación o la
fragmentación de la secuencia diana mediante el oligonucleótido.
Tal como se utiliza en el presente documento, el
término "proliferación celular" se refiere al ciclo celular de
velocidad de división celular. El término "crecimiento" tal
como se utiliza en el presente documento, abarca tanto el número de
células aumentado debido a una división celular más rápida y debido
a velocidades más lentas de muerte celular.
Tal como se utiliza en el presente documento, la
expresión del gen bcl-2 se refiere a la producción
de proteína bcl-2 a partir del gen
bcl-2 humano; por ejemplo, la expresión reducida de
la expresión del gen bcl-2 significa niveles
reducidos de proteína bcl-2.
Tal como se utiliza en el presente documento,
"sitios estratégicos" se definen como cualquier sitio en el
que cuando se le unen las moléculas anticódigo reivindicadas o
análogos de las mismas resulta en una inhibición de la expresión del
gen bcl-2.
Tal como se utiliza en el presente documento,
"porción de secuencia" es una porción de la secuencia de
nucleótidos de un oligonucleótido de ARN. En contextos apropiados,
"porción de secuencia" se puede referir a una porción de la
secuencia de nucleótidos de un segmento de ADN u oligonucleótido de
ADN.
La proliferación no controlada de células es un
marcador para los tipos de células cancerosas o anormales. Las
células normales no cancerosas se dividen de manera regular, a una
frecuencia característica para el tipo de célula en particular.
Cuando una célula ha sido transformada a un estado canceroso, la
célula se divide y prolifera de manera descontrolada. La inhibición
de la proliferación modula la división no controlada de la célula.
La contención de la división celular a menudo correlaciona con un
retorno al estado no canceroso.
Un gen humano denominado bcl-2
(linfoma de células B/leucemia-2) está implicado en
la etiología de algunos tumores linfoides comunes, Croce y otros,
"Bases Moleculares de la Neoplasia de células B y T humanas"
en: Avances en Oncología Viral, 7:35-51, G.
Klein (ed.), Nueva York: Raven Press, 1987. Se han encontrado altos
niveles de expresión del gen bcl-2 humano en
todos los linfomas con translocaciones cromosomales t (14;18)
incluyendo la mayoría de linfomas de células B foliculares y muchos
linfomas de células grandes no Hodgkin. También se han encontrado
altos niveles de expresión del gen bcl-2 en
ciertas leucemias que no tienen translocación cromosomal t (14;18),
incluyendo la mayoría de los casos agudos de leucemia linfocítica
crónica, muchas leucemias linfocíticas del tipo de célula
pre-B, neuroblastomas, carcinomas nasofaríngeos y
muchos adenocarcinomas de la próstata, de mama y de colon. (Reed y
otros, Expresión diferencial del protooncogén en neuroblastomas y
otras líneas celulares tumorales humanas de origen neural. Cancer
Res. 51:6529 (1991); Yunis y otros, Bcl-2 y
otras alteraciones genómicas en el pronóstico de linfomas de células
grandes. New England J. Med. 320:1047; Campos y otros, Alta
expresión de la proteína bcl-2 en la leucemia
mieloide aguda está asociada con una pobre respuesta a la
quimioterapia. Blood 81: 3091-3096 (1993);
McDonnell y otros, Expresión del protooncogén bcl-2
y su asociación con la aparición de cáncer de próstata independiente
de andrógeno. Cancer Res. 52: 6940-6944
(1992); Lu Q-L y otros, Expresión del protoncogén
bcl-2 en el carcinoma nasofaríngeo asociado al virus
de Epstein Barr, Int. J Cancer 53: 29-35
(1993); Bonner y otros, Protooncogén bcl-2 y el
modelo de progresión del tumor epitelial de la mucosa
gastrointestinal relacionado con secuencias morfológicas y
moleculares propuestas, Lab Invest. 68:43A (1993)).
Aunque no se limita a la explicación siguiente,
la presente invención explota mecanismos celulares que tienen que
ver con la muerte de células normales. Debido a que la mayoría de
los tipos de células tienen un tiempo de vida finito y están
programadas para morir, la acumulación descontrolada de células
puede también ser debida a un defecto en los mecanismos de muerte
celular y más que a un aumento de la velocidad de división celular.
El gen bcl-2 contribuye a la patogénesis del cáncer
principalmente mediante la prolongación de la supervivencia celular
en lugar de la aceleración de la división celular.
Oligómeros antisentido adecuados para utilizar
en la presente invención incluyen oligómeros nucleotídicos que
tienen de dos a doscientas bases nucleotídicas de longitud; más
preferentemente de diez a cuarenta bases de longitud; lo más
preferente veinte bases de longitud. Los oligonucleótidos se
seleccionan preferentemente entre aquellos oligonucleótidos
complementarios a sitios estratégicos a lo largo del
pre-ARNm de bcl-2, tales
como el sitio de iniciación de la traducción, sitios donadores y de
empalme, o sitios para la transportación o degradación.
Bloqueando la traducción en dichos sitios
estratégicos se evita la formación de un producto del gen
bcl-2 funcional. Sin embargo, debe ser
apreciado que cualquier combinación o subcombinación de oligómeros
anticódigo, incluyendo oligonucleótidos complementarios o
sustancialmente complementarios al pre-ARNm o ARNm
de bcl-2 que inhiba la proliferación celular
es adecuado para utilizar en la presente invención. Por ejemplo,
oligodesoxinucleótidos complementarios a porciones de secuencia de
tramos contiguos o no contiguos del ARN de
bcl-2 pueden inhibir la proliferación celular
y podrían, de esta manera, ser adecuados para utilizar en la
presente invención.
También se puede apreciar que los oligómeros
anticódigo adecuados para utilizar en la presente invención pueden
también incluir oligonucleótidos que flanquean aquellos
complementarios o sustancialmente complementarios a dichas
porciones de secuencia como las estratégicas u otros sitios a lo
largo del ARNm de bcl-2. Las porciones de
secuencia flanqueadoras son preferentemente de dos hasta
aproximadamente cien bases, más preferentemente de aproximadamente
5 hasta aproximadamente veinte bases de longitud. También es
preferente que los oligómeros anticódigo sean complementarios a una
porción de secuencia del pre-ARNm o ARNm que no se
encuentre comúnmente en el pre-ARNm o ARNm de otros
genes para minimizar la homología de los oligómeros anticódigo con
las cadenas codificadoras del pre-ARNm o ARNm de
otros genes.
Los oligodesoxinucleótidos antisentido, o
complementarios, preferentes se enumeran en la tabla 1.
Será apreciado por los expertos en el sector al
que pertenece la presente invención, que los oligómeros anticódigo
que tienen un número mayor o menor de nucleótidos sustituyentes o
que se extiendan más a lo largo del ARNm de
bcl-2 en la dirección 3' o 5' que en las
realizaciones preferentes, pero que también inhiban la proliferación
celular, están también dentro del alcance de la presente
invención.
Es preferente utilizar derivados modificados
químicamente o análogos de los oligómeros anticódigo en la
realización de la presente invención en lugar de
oligodesoxinucleótidos "nativos" o no modificados. Los
oligodesoxinucleótidos "nativos" pueden ser sintetizados
convenientemente con un sintetizador de ADN utilizando química de
fosforamidita estándar. Derivados adecuados, y procedimientos para
la preparación de los derivados, incluyen fósforotioato, Stein y
otros, Nucl Acids Res., 16:3209-3221 (1998);
metilfosfonato, Blake y otros, Biochemistry
24:6132-6138 (1985) y alfadesoxinucleótidos, Morvan
y otros, Nucl Acids Res., 14:5019-5032 (1986),
2'-O-metilribonucleósidos (Monia y
otros, Evaluación de ribonucleótidos modificados en 2' que contienen
desajustes en 2'desoxi gaps como inhibidores antisentido de la
expresión génica. J. Biol. Chem.
268:14514-14522(1933)) y derivados unidos de
manera covalente tales como acridina, Asseline y otros, Proc Natl
Acad Sci USA 81:3297-3201 (1984); alquilados (por
ejemplo, N-2-clorocetilamina),
Knorre y otros, Biochemie 67:783-789 (1985) y
Vlassov y otros, Nucl. Acids Res 14:4065-4076
(1986); fenazina, Knorre y otros, arriba, y Vlassov y otros, arriba;
5-metil-N^{4}-N^{4}-etanocitosina,
Webb y otros, Nucl. Acids Res. 14:7661-7674 (1986);
ácido etilendiamina tetraacético-Fe (EDTA) y
análogos, Boutorin y otros, FEBS Letter's 172:43-46
(1984); 5-glicilamido-1,
10-o-fenantrolina,
Chi-Hong y otros, Proc. Natl. Acad. Sci.
83:7147-7151 (1986); y derivados del ácido
dietiléntriamina pentaacético (DPTA), Chu y otros, Proc Natl. Acad.
Sci. 82:963-967 (1985).
El oligómero anticódigo de la presente invención
puede también estar combinado con un portador farmacéuticamente
aceptable para la administración a un individuo o para
administración ex vivo. Ejemplos de portadores
farmacéuticamente adecuados son una variedad de lípidos catiónicos,
que incluyen, sin constituir limitación, cloruro de
N-(1-2-3-dioliloxi)propil)-n,n,n-trimetilamonio
(DOTMA) y dioloilfosfotidiletanolamina (DOPE)]. Los liposomas son
también portadores adecuados para los oligómeros anticódigo de la
presente invención.
Los oligómeros anticódigo pueden ser
administrados a pacientes a través de cualquier ruta efectiva,
incluyendo la administración intravenosa, intramuscular,
intratecal, intranasal, intraperitoneal, inyección subcutánea,
inyección in situ y oral. La administración oral requiere
recubrimientos entéricos para proteger las moléculas anticódigo
reivindicadas y análogos de las mismas de la degradación a lo largo
del tracto gastrointestinal. Los oligómeros anticódigo pueden estar
mezclados con una cantidad de un portador o diluyente
fisiológicamente aceptable, tales como una solución salina u otro
líquido adecuado. Los oligómeros anticódigo adecuados pueden
también estar combinados con liposomas u otros portadores destinados
a proteger las moléculas anticódigo o análogos de las mismas de la
degradación hasta que alcancen sus dianas y/o faciliten el
movimiento de las moléculas anticódigo o análogos de las mismas a
través de las barreras del tejido.
Los oligómeros anticódigo pueden también ser
útiles para la extracción de la médula ósea ex vivo.
Normalmente, las cantidades de agentes quimioterapéuticos
convencionales contra el cáncer o fármacos y la irradiación que un
paciente puede recibir están limitados por la toxicidad a la médula,
es decir, anemia (fatiga, insuficiencia cardiaca), trombocitopenia
(sangramiento), neutropenia (infección). Por lo tanto, para
administrar concentraciones de fármaco suficientes e irradiación
para eliminar totalmente el tumor, los médicos podrían destruir
simultáneamente las células normales de la médula ósea del paciente
que conduce a la muerte del paciente. Alternativamente, pueden
extraerse grandes cantidades de médula ósea quirúrgicamente del
paciente y almacenarlas in Vitro, mientras el paciente
recibe el tratamiento agresivo convencional. A continuación, el
paciente puede ser rescatado mediante reinfusión de sus propias
células de médula ósea, pero sólo si a esta médula se le han
"extraído" las células malignas residuales. Los oligómeros
anticódigo reivindicados pueden ser utilizados para eliminar las
células malignas residuales de la médula ósea.
Los oligómeros anticódigo son administrados en
cantidades efectivas para inhibir el crecimiento de células
cancerosas o neoplásicas. La cantidad real de cualquier oligómero
anticódigo administrado dependerá de factores tales como el tipo de
cáncer, la toxicidad del oligómero anticódigo para otras células del
cuerpo, su velocidad de absorción por las células cancerosas y el
peso y edad del individuo al que le será administrado el oligómero
anticódigo. Debido a los inhibidores presentes en el suero humano
que pueden interferir con la acción del oligómero anticódigo puede
variar la cantidad efectiva del oligómero anticódigo para cada
individuo.
Una dosis efectiva para el paciente puede ser
determinada mediante métodos convencionales tales como aumentar de
manera incrementada la dosis del oligómero anticódigo a partir de
una cantidad inefectiva para inhibir la proliferación celular hasta
una cantidad efectiva. Se espera que concentraciones expuestas a las
células cancerosas en el intervalo de aproximadamente 0,001
micromolar hasta aproximadamente 100 micromolar serán efectivas para
inhibir la proliferación celular.
Los oligómeros anticódigo son administrados al
paciente, como mínimo, durante un tiempo suficiente para inhibir la
proliferación de las células cancerosas. Los oligómeros anticódigo
son administrados preferentemente a los pacientes a una frecuencia
suficiente para mantener el nivel de oligómeros anticódigo en un
nivel efectivo en las células cancerosas o alrededor de éstas. Para
mantener el nivel efectivo, puede ser necesario administrar los
oligómeros anticódigo varias veces al día, diariamente o, como
mínimo, en intervalos frecuentes. Los oligómeros anticódigo son
administrados hasta que las células cancerosas no puedan detectarse,
o se hayan reducido a un número de manera que tratamientos
adicionales no proporcionen una reducción significativa en el
número, o las células se hayan reducido hasta un número manejable
mediante cirugía u otros tratamientos. El período de tiempo en que
se administran los oligómeros anticódigo dependerá de factores tales
como la velocidad de absorción del oligodesoxinucleótido en
particular por las células cancerosas y el tiempo necesario para que
las células respondan al oligodesoxinucleótido. In vitro, la
inhibición máxima del crecimiento de células neoplásicas mediante
oligómeros anticódigo "nativos" no modificados tiene lugar dos
días después del inicio de los cultivos, mientras que los
oligodesoxinucleótidos fósforotioatos requirieron de 4 a 7 días para
lograr la inhibición máxima. In vivo, el tiempo necesario
para la inhibición máxima de la proliferación celular puede ser más
corto o más largo.
Los oligómeros anticódigo de la presente
invención pueden ser administrados a pacientes como una combinación
de dos o más secuencias de oligodesoxinucleótidos oligoméricos
anticódigo diferentes o como un tipo individual de secuencia. Por
ejemplo, TI-AS y SD-AS podrían ser
administrados a un paciente o TI-AS solo.
También se cree que los oligómeros anticódigo de
la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento de
enfermedades autoinmunes. Las enfermedades autoinmunes son aquellas
enfermedades en el que el sistema inmune del cuerpo ha funcionado
mal de alguna manera. La administración de oligómeros anticódigos de
la presente invención a una persona que tiene una enfermedad
autoinmune debe inhibir la proliferación de linfocitos que
sobreexpresan bcl-2, que a su vez podría
reducir los síntomas de la enfermedad autoinmune. Para utilizar en
el tratamiento de enfermedades autoinmunes, los oligómeros
anticódigos pudieran ser administrados tal como se describe en este
documento.
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Los Ejemplos a continuación utilizan los
siguientes protocolos:
A. Células y cultivos celulares. Las líneas
celulares leucémicas humanas utilizadas para estos estudios fueron
células de linfoma folicular RS11846, células de leucemia
linfocítica aguda de células pre -B 697, células de leucemia
linfocítica aguda de células T JURAT, tal como se describe en
Tsujimoto y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
83:5214-5218 (1986) y Weiss y otros, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 138:2169-2174 (1987). Se aislaron
linfocitos de sangre periférica humana (PBL) a partir de sangre
entera fresca, tal como se describe en Reed y otros, J Immunol,
134:314-319 (1985). Todas las células linfoides se
cultivaron a 5x10^{5} células/ml en medio RPMI suplementado con
glutamina 1 mM, antibióticos, y tanto con suero fetal bovino (FSB)
5-10% (v:v), suero de ternero 5-10%
(v:v) (ambos de Hyclone Laboratories), o suplemento concentrado HLI
1% (v:v) (Ventrex Laboratories) para los cultivos libres de suero.
Las líneas celulares de fibroblastos murinos se añadieron a
10^{3} células/cm^{2} en medio DMEM conteniendo glutamina,
antibióticos y FCS 5-10% (v:v). Las líneas
celulares de fibroblastos fueron células NIH 3T3, células
3T3-B-alfa-S y
células
3T3-B-alfa-AS. Estas
dos últimas líneas celulares son células NIH 3T3 que expresan altos
niveles de ADNc de bcl-2-alfa humano tanto
en la orientación en sentido como antisentido, respectivamente, en
virtud de la transfección estable con construcciones de vectores de
expresión.
B. Medición del crecimiento celular. El
crecimiento de las líneas celulares cultivadas en presencia o
ausencia de oligómeros anticódigo se midió mediante dos métodos:
conteo celular utilizando un hemocitómetro; y síntesis de ADN
ensayando la incorporación de [^{3}H]-timidina,
esencialmente como se describe en Reed y otros, J Immunol,
134:314-319 (1985). Brevemente, las células se
cultivaron en placas de microtitulación de fondo plano de 96 celdas
(Falcon) a 0,2 ml/celda. En tiempos adecuados, las células se
resuspendieron, se extrajeron 25 \mul de los cultivos para el
conteo celular y este volumen fue reemplazado con 25 \mul de
[^{3}H]-timidina 20 UCi/ML (actividad específica
6,7 Ci/mmol) (New England Nuclear). A continuación, los cultivos de
microtitulación fueron retornados a 37ºC y 95% de aire: CO_{2}
atmosférico 5% durante 8 horas antes de romper las células en
filtros de vidrio y determinar los niveles relativos de
incorporación de [^{3}H]-timidina en el ADN
mediante conteo de centelleo. Los conteos celulares se realizaron
en presencia de tinte azul tripán para determinar la concentración
de células viables en los microcultivos por duplicado.
Los ensayos de reducción del tinte MTT [bromuro
de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil
tetrazolio)] se realizaron mediante el método de Tada y otros, J
Immunol. Methods 93, 157 (1986) y se confirmó que estaban dentro
del intervalo lineal del ensayo bajo las condiciones descritas en el
presente documento. El número de células viables por celda fue
extrapolado a partir de curvas estándar que fueron incluidas en cada
ensayo y que consistieron en una serie de diluciones dobles
seriadas de células SU-DHL-4 con
crecimiento exponencial en medio HL-1, comenzando
con 10^{6} células/ml (0,2 mi/celda). Las muestras se ensayaron
por triplicado y la DO600_{nm} para un blanco medio/reactivo se
sustrajo de todos los valores antes de los cálculos.
C. Análisis de transferencia de ARN. El ARN
total celular se aisló mediante un procedimiento de isotiocianato
de guanidina/fenol, tal como se describe en Chomczynski y otros,
Analyt. Biochem., 162:156-159 (1987). La fracción
poliadenilada se purificó mediante cromatografía de
oligodesoxitimidina-celulosa, tal como se describe
en Aviv y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
69:1408-1412 (1972). Se fraccionaron por tamaño
alícuotas de aproximadamente 5 \mug de ARNm en geles de agarosa
0,8%/formaldehído 6% y se transfirieron a membranas de nailon. Las
transferencias fueron prehibridadas, hibridadas y lavadas
exactamente como se describe en Reed y otros, Mol. Cell. Biol.,
5:3361-3366 (1985), utilizando tanto un
^{32}p-ADNc para el bcl-2
humano, tal como se describe en Tsujimoto y otros, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 83:5214-5218 (1986), o una sonda
murina de bcl-2 pMBCL5.4, tal como se
describe en Negrini y otros, Cell, 49:455-463
(1987). Las transferencias se expusieron a películas Kodak XAR con
pantallas intensificadoras a -70ºC durante 1-10
días. La elusión de las sondas
^{32}p-bcl-2 de las membranas y la
rehibridación con una sonda ^{32}p para
beta-2-microglobulina de ratón
constató cantidades casi equivalentes de ARNm para todas las
muestras en las transferencias.
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Los oligodesoxinucleótidos normales y
fósforotioatos se sintetizaron utilizando un sintetizador de ADN
Applied Biosystems 308B y se purificaron mediante cromatografía de
fase reversa HPLC (columna RPR-1), tal como se
describe en Stein y otros, Nucl. Acids Res.,
16:3209-3221 (1988). En algunos casos fue necesaria
una purificación adicional de los oligodesoxinucleótidos mediante
cromatografía C18-Sep-Pak (Waters
Associates, Millipore, Inc.), tal como se describió anteriormente
en Kern y otros, J. Clin. Invest., 81:237-244
(1988), para eliminar la actividad citotóxica no específica. Los
oligodesoxinucleótidos eluidos en acetonitrilo 30% se evaporaron
hasta secar, se resuspendieron en tampón fosfato salino de Dulbecco
o tampón solución salina de Hanks 1-2 mM (ambos de
Gibco) y se almacenaron a -80ºC en alícuotas pequeñas.
La tabla 1 muestra los oligodesoxinucleótidos
sintetizados y su relación con la cadena en sentido del gen
bcl-2 humano. Se muestran las porciones de la
secuencia de la cadena codificadora del gen
bcl-2 humano, que incluye el sitio de
iniciación de la traducción (zona superior), el sitio donador de
empalme (zona media), el sitio aceptador de empalme (zona inferior)
y sitios seleccionados de manera empírica en la porción 5' no
traducida del pre-ARN de bcl-2. Las
secuencias consenso del codón de iniciación ATG, del donador de
empalme GT y del aceptador de empalme AG están en recuadros.
Se presentan las secuencias de los
oligodesoxinucleótidos sintetizados para estas investigaciones y se
indica sus relaciones con los ARNm de bcl-2. El
oligodesoxinucléotido TI-AS es antisentido en el
sitio de iniciación de la traducción y TI-S es su
versión en sentido complementario. SD-AS y
SD-S son oligodesoxinucleótidos que tienen
orientaciones antisentido y en sentido, respectivamente, en relación
a la región donadora de empalme.
El oligodesoxinucleótido TI-AS
se superpone al sitio de iniciación de la traducción predicho de los
ARNm de bcl-2 y es complementario
(antisentido) a esta región. Como control, se sintetizó también la
versión en sentido de este oligodesoxinucleótido de 20 bp,
TI-S.
En un esfuerzo para bloquear el empalme de los
ARNm de bcl-2, se sintetizó un
oligodesoxinucleótido antisentido de 20 bp, SD-AS,
que se superpone al sitio donador de empalme en los transcriptos
primarios de bcl-2. Además, se preparó un
oligodesoxinucléotido en sentido complementario,
SD-S, como se representa en la tabla 1. El gen
humano bcl-2 da lugar a varios transcriptos
mediante selecciones de sitios de empalme alternativos, ver
Tsujimoto y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
83:5214-5218 (1986). La preponderancia de estos
transcriptos depende del empalme y codifica una proteína de 26 kDa,
bcl-2-alfa. Un transcripto menor,
sin embargo, no se empalma y como consecuencia codifica una
proteína de 22 kDa, bcl-2-beta. El
oligodesoxinucleótido SD-AS puede, de esta manera,
bloquear de manera potencial la maduración de la mayoría, pero no
todos, los transcriptos de bcl-2.
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Debido a que los oligodesoxinucleótidos son
sensibles a la degradación por nucleasas presentes en el suero, se
contrastó la eficacia del oligodesoxinucleótido
TI-AS en suero fetal bovino (FBS) calentado durante
30 minutos a 56ºC (el procedimiento habitual para inactivar el
complemento de suero) con la eficacia de TI-AS en
FBS calentado durante una hora a 68ºC, una temperatura suficiente
para la inactivación irreversible de muchas nucleasas. Se utilizó
la línea celular de linfoma folicular RS11846. Las células RS11846
contienen una translocación cromosomal t(14;18) que no
regula la expresión de bcl-2, dando como resultado
la acumulación de altos niveles de ARNm de bcl-2,
Tsujimoto y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
83:5214-5218 (1986).
Las células de linfoma folicular RS11846 se
cultivaron en un medio que contiene suero fetal bovino (FBS) 5%
(vol:vol) que había sido calentado a 56ºC durante 0,5 horas o a 68ºC
durante una hora. El oligodesoxinucleótido normal
TI-AS se añadió al inicio del cultivo, y se
determinó la densidad de las células viables dos días después.
El oligodesoxinucleótido normal
TI-AS fue más efectivo en el suero tratado a 68ºC
suprimiendo el crecimiento en el cultivo de estas células de
linfoma. En todos los experimentos posteriores se utilizaron en los
cultivos sueros calentados a 68ºC durante una hora antes de
utilizarlos. Este tratamiento no perjudicó la capacidad de apoyo al
crecimiento de los sueros.
Oligodesoxinucleótidos normales antisentido
dirigidos contra el sitio de iniciación de la traducción
(TI-AS) y el sitio donador de empalme
(SD-AS) de los transcriptos de bcl-2
se ensayaron para determinar su capacidad para suprimir la
proliferación de células linfoides normales y neoplásicas.
Se cultivaron células de linfoma folicular
RS11846, células de leucemia de células T JUKRAT y linfocitos de
sangre periférica recién aislados en medio que contiene FBS 10%
(vol:vol) que había sido calentado a 68ºC durante una hora. Se
añadieron varias concentraciones de oligodesoxinucleótidos normales
al inicio del cultivo, incluyendo: TI-AS,
TI-S, SD-AS y SD-S.
La síntesis de ADN relativa se midió en los cultivos después de
2-3 días mediante la incorporación de [^{3}H]
timidina. Los datos se calcularon como el porcentaje de los cultivos
de control que contenían volúmenes de PBS o HBSS equivalentes a los
cultivos tratados con oligodesoxinucleótidos y representan el
promedio (\pm desviación estándar) de cultivos por duplicado.
Se obtuvieron datos similares mediante conteo de
células que excluyeron la inhibición de timidina fría como una
explicación para la supresión de la síntesis de ADN observada en los
cultivos tratados con oligodesoxinucleótidos antisentido.
Como se muestra en la figura 1, tanto los
oligodesoxinucleótidos TI-AS y SD-AS
inhibieron el crecimiento de las células RS11846 de una manera
dependiente de la concentración. El oligonucleótido
SD-AS fue menos efectivo en la inhibición del
crecimiento celular que el oligodesoxinucleótido
TI-AS. Al contrario que estos oligodesoxinucleótidos
antisentido, los oligodesoxinucleótidos en sentido
(TI-S y SD-S) no fueron inhibitorios
incluso a concentraciones de hasta 250 \muG/ml. Además,
oligodesoxinucleótidos sin sentido (es decir, aquellos que tiene la
misma composición de bases que los oligodesoxinucleótidos
antisentido pero con secuencias mezcladas) también fallaron en
suprimir la proliferación de las células RS11846. Por lo tanto, los
datos indican que los oligodesoxinucleótidos antisentido pueden
bloquear de manera específica la proliferación de estas células
tumorales. Otras líneas celulares de leucemia que expresan el gen
bcl-2 fueron también ensayadas para determinar la
inhibición de su proliferación mediante los oligonucleótidos
TI-AS y SD-AS. Como con las células
de leucemia aguda linfocítica de células T JURKAT, se observó una
disminución específica y dependiente de la concentración en el
crecimiento de estas células leucémicas humanas en cultivos que
contienen oligodesoxinucleótidos antisentido en todos los casos.
Se ha demostrado que la expresión de
bcl-2 es inducida de manera transciente en
linfocitos normales de sangre periférica humana (PBL) cuando estas
células son estimuladas para proliferar, sugiriendo que este gen
puede jugar un papel en la regulación del crecimiento de linfocitos
normales, Reed y otros, Science 236:1295-1297
(1987). Por lo tanto, fue ensayada la capacidad de los
oligodesoxinucleótidos antisentido para impedir el crecimiento de
PBL cultivado con un anticuerpo monoclonal, OKT3 (Van den Elsen y
otros, Nature 312:413-418 (1984)), que estimula su
proliferación. PBL fue estimulado con 50 \mul de anticuerpo
monoclonal purificado OKT3. Como se muestra en la figura 1, el
oligodesoxinucleótido TI-AS suprimió de manera
específica la proliferación de PBL de una manera dependiente de la
concentración. Estos oligodesoxinucleótidos normales antisentido
suprimieron de esta manera el crecimiento en cultivo de células
leucémicas que expresan de manera constitutiva el gen
bcl-2 Y de linfocitos normales donde la expresión de
bcl-2 es inducible.
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Las cinéticas de inhibición mediante los
oligodesoxinucleótidos antisentido fueron examinadas en cultivos de
células de linfoma folicular RS11846 y de células de leucemia
linfocítica aguda de células pre-B 697. Ambas
líneas celulares neoplásicas B transcriben y acumulan ARNm de
bcl-2 a altos niveles, Tsujimoto y otros, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 83: 5214-5218 (1986).
Las células de linfoma folicular RS11846 y de
leucemia de células pre-B 697 se cultivaron en medio
que contiene FBS 10% (vol:vol) tratado a 68ºC y
oligodesoxinucleótidos normales. Las células se cultivaron con 50
\mug/ml de TI-AS, 100 \mug/ml de
SD-AS, 50 \mug/ml de TI-S (células
RS11846) o 100 \mug/ml de SD-S (células 697), o
PBS como control. La síntesis de ADN (kcpm/10^{5} células viables)
y las densidades celulares (10^{5} células viables/ml) se
midieron en varios momentos después del inicio de los cultivos.
Los oligodesoxinucleótidos antisentido normales
inhibieron de una manera notable la síntesis de ADN medidos en los
cultivos de estas células dentro de 24 horas. Las densidades
celulares disminuidas fueron aparentes en estos cultivos a los dos
días. Por lo tanto, los oligodesoxinucleótidos normales antisentido
inhibieron rápidamente el crecimiento in vitro de las
células leucémicas. La acción de estos oligodesoxinucleótidos
antisentido fue específica, ya que los oligodesoxinucleótidos en
sentido no impidieron la proliferación de estos cultivos. Aunque
las viabilidades celulares a menudo disminuyeron durante los últimos
días de cultivo no se observó un aumento en la muerte celular
durante los primeros 1-2 días de cultivo con los
oligodesoxinucleótidos antisentido, sugiriendo un mecanismo no
citotóxico.
La inhibición de la proliferación de células
leucémicas con oligodesoxinucleótidos antisentido puede variar mucho
en dependencia del lote de suero utilizado en los cultivos.
Para determinar los efectos del suero en la
inhibición de la proliferación, se midieron los niveles relativos
de síntesis de ADN en cultivos de células de leucemia de células
pre-B 697 dos días después de la adición de 200
\muM del oligodesoxinucleótido normal TI-AS. Las
células se cultivaron en medio suplementado con concentrado HL1 1%
(vol:vol) (condición libre de medio), 5% (vol:vol) de dos lotes
diferentes de suero de ternero (CS1 y CS2) o 5% (vol:vol) de los
lotes de suero fetal bovino (FBS1 y FBS2). Todos los sueros fueron
calentados a 68ºC durante 1 hora ante de utilizarlos en los
cultivos.
El oligodesoxinucleótido normal
TI-AS inhibió notablemente la síntesis de ADN (92%)
y la proliferación celular en cultivos libres de suero (HL1) de las
células 697. Este oligodesoxinucléotido antisentido fue igualmente
efectivo (94%) en cultivos que contienen 5% (v:v) de uno de los
lotes de suero fetal bovino (FBS2). Por el contrario, la inhibición
fue significativamente reducida en cultivos que contienen otras
preparaciones de suero (CS1, CS2, FBS1). Se ha observado de manera
general que los oligodesoxinucleótidos antisentido normales son
menos efectivos en cultivos suplementados con suero de ternero (CS
que en aquellos que contienen suero fetal bovino (FBS).
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Se cultivaron células de leucemia de células
pre-B 697 en medio tanto con HL1 concentrado 1%
(vol:vol) (condiciones libres de suero o FBS2 5% (vol:vol) tratado
a 68ºC). Se midieron los niveles relativos de síntesis de ADN y
densidades celulares después de dos días en los cultivos que
contienen varias concentraciones de oligodesoxinucleótido normal
TI-AS.
El oligodesoxinucléotido normal
TI-AS fue inhibitorio a bajas concentraciones cuando
se utilizaron cultivos libres de suero. A 100 \muM, por ejemplo,
no se observó inhibición de la proliferación celular en cultivos
que contienen FBS2, mientras que los conteos celulares se redujeron
en aproximadamente 75% en los cultivos libres de suero. Sin,
embargo, a concentraciones mayores de oligodesoxinucléotidos
antisentido (200-250 \muM), la inhibición de la
proliferación celular de 697 fue comparable en ambos tipos de
cultivo. La eficacia incrementada de los oligodesoxinucléotidos
normales en cultivos libres de suero fue específica, ya que el
oligonucleótido en sentido (TI-S) no fue inhibitorio
a las mismas concentraciones.
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Para comparar la eficacia de
oligodesoxinucleótidos fósforotioatos con los oligodesoxinucleótidos
normales en relación a la inhibición del crecimiento de células
leucémicas humanas, se cultivaron oligodesoxinucleótidos
fósforotioatos con células de leucemia de células
pre-B 697 y se midieron los efectos sobre la
inhibición. Se cultivaron las células de leucemia de células
pre-B 697 en medio libre de suero durante varios
tiempos antes de medir la síntesis de ADN (kcpm) y las densidades
celulares (10^{6} células/ml). Las células se sembraron a una
concentración inicial tanto de 0,2x10^{5} células/ml ó
0,5x10^{5} células/ml. Las condiciones del cultivo fueron
TI-AS fósforotioato 25 \muM, TI-S
fósforotioato 25 \muM y cultivos de control tratados con HBSS.
Para evitar la variación experimental debido a
las diferencias entre los lotes de suero, las células leucémicas
697 se cultivaron en condiciones libres de suero. Cuando se
cultivaron a una concentración inicial de siembra de 0,5x10^{6}
células/ml, las células 697 alcanzaron una síntesis de ADN y
densidades celulares máximas a los 4-5 días. La
adición del oligodesoxinucleótido fósforotioato en sentido
(TI-S) al inicio de estos cultivos tuvo poco efecto
sobre el crecimiento de las células 697. Sin embargo, en cultivos de
réplica que contienen antisentido fósforotioato
(TI-AS) fue evidente alguna disminución en la
síntesis de ADN a los dos días y fue máxima a los
4-5 días. La inhibición máxima del crecimiento de
células 697, como se determinó mediante conteos celulares, se
observó a los 6 días después del inicio de los cultivos.
Cuando las células 697 se sembraron inicialmente
a 0,2x10^{6} células/ml, el oligodesoxinucleótido antisentido
fósforotioato, TI-AS, dio lugar a sólo una ligera
inhibición a los dos días, alcanzando una supresión máxima de la
síntesis de ADN en estos cultivos en el día 7. Como con los
oligodesoxinucleótidos normales, esta inhibición mediante los
oligodesoxinucleótidos fósforotioatos parece estar mediada a través
de mecanismos no citotóxicos, ya que las viabilidades celulares no
disminuyeron hasta tarde en el curso del cultivo. Por lo tanto,
comparado con los oligodesoxinucleótidos antisentido normales, los
oligodesoxinucleótidos fósforotioatos tienen un inicio de acción más
lento.
Se comparó la dependencia de la concentración de
la inhibición mediante oligodesoxinucleótidos TI-AS
normales y fósforotioatos en cultivos de células 697 en medio libre
de suero como sigue.
Se cultivaron células 697 en medio libre de
suero durante 3 días (oligodesoxinucleótidos normales) o 4 días
(oligodesoxinucleótido fósforotioatos) antes de medir las densidades
celulares y los niveles de síntesis de ADN. Las adiciones de
oligodesoxinucleótidos a los cultivos incluyeron
TI-AS fósforotioato, TI-S
fósforotioato, TI-AS normal y TI-S
normal.
Tal como se muestra en la figura 2, los
oligodesoxinucleótidos fósforotioatos TI-AS
inhibieron notablemente la proliferación de las células 697 a
25-50 \muM. Por el contrario, los
oligodesoxinucleótidos normales TI-AS requirieron
concentraciones de 5 a 10 veces más altas (aproximadamente 250
\muM) para provocar una supresión comparable de la proliferación
celular de 697. La supresión mediante el oligodesoxinucleótido
antisentido fósforotioato TI-AS fue específica en
este intervalo de concentración, ya que su oligodesoxinucleótido en
sentido complementario(TI-S) produjo una
pequeña inhibición del crecimiento de 697 en réplicas de cultivos
(ver figura 2).
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Para definir con mayor precisión los efectos de
la preparación de suero en la actividad inhibitoria de los
oligodesoxinucleótido fósforotioatos, se añadió FBS a los cultivos
de células de linfoma RS11846, que había sido calentado a 56ºC
durante 30 minutos, a 68ºC durante 1 hora o que no se había
calentado antes de la adición a los cultivos.
Las células RS11846 se cultivaron en medio que
contiene concentrado HL1 1% (vol:vol) o FBS 5% (vol:vol) que había
sido calentado a 56ºC durante 0,5 horas, a 68ºC durante 1 hora o que
no se había calentado. Los conteos celulares se calcularon como el
porcentaje relativo a los cultivos de control tratados con
concentraciones equivalentes de oligodesoxinucleótido
TI-S fósforotioato y representa el porcentaje
promedio (la desviación estándar fue inferior al 10% para todos los
valores) de cultivos por duplicado contados los días 4 y 5.
El oligodesoxinucleótido fósforotioato
TI-AS inhibió completamente el crecimiento de las
células RS11846 a 25 \muM, con una concentración inhibitoria
máxima 50 estimada de aproximadamente 11 \muM. Por el contrario,
este oligodesoxinucleótido fósforotioato fue considerablemente menos
efectivo en cultivos que contienen FBS 5% (v:v). Además, el
calentamiento de FBS antes de adicionarlo a los cultivos no mejoró
de manera significativa la capacidad del oligodesoxinucleótido
fósforotioato TI-AS para suprimir el crecimiento de
las células de linfoma RS11846. A una concentración de
oligodesoxinucleótido de 50 \muM, la inhibición de la
proliferación de las células RS11846 no superó en ningún momento el
48% en los cultivos que contienen suero, a pesar del procedimiento
de calentamiento utilizado.
\vskip1.000000\baselineskip
Para caracterizar adicionalmente la naturaleza
de las sustancias que interfieren en el suero, se realizaron
experimentos en los que el suero calentado a 68ºC se dializó de
manera extensiva (peso molecular de corte = 3.500) antes de ser
añadido a los cultivos de células de leucemia 697. Los experimentos
se realizaron con oligodesoxinucleótido fósforotioato
TI-AS 12,5 \muM Y 200 \mum del
oligodesoxinucleótido normal TI-AS basado en
oxígeno.
Las células 697 se cultivaron en medio que
contiene concentrado HL1 1% (vol.vol)(A) o 5% (vol:vol) de tres
lotes diferentes de FBS calentado a 68ºC (B, C, D). Cada preparación
de suero se contrastó antes (ND) y después (D) de diálisis
extensiva. Se añadieron los oligodesoxinucleótidos
TI-AS (+) y TI-S (-) a réplicas de
cultivos a 200 \muM para los oligodesoxinucleótidos normales
basados en oxígeno (OXY) y a 12,5 \muM para los
oligodesoxinucleótidos fósforotioatos (PT). Se midieron los niveles
relativos de síntesis de ADN (kcpm) después de 2 ó 4 días de cultivo
para los oligodesoxinucleótidos normales y fósforotioatos,
respectivamente.
Para los tres lotes diferentes de FBS ensayados,
dos mostraron un pequeño cambio después de la diálisis en los
cultivos que contienen tanto oligodesoxinucleótidos normales o
fósforotioatos. Sin embargo, un lote de FBS pareció interferir menos
con las actividades inhibitorias de estos oligodesoxinucleótidos
antisentido después de la diálisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque los oligodesoxinucleótidos antisentido
descritos en el presente documento estaban diseñados para bloquear
la traducción del ARNm de bcl-2
(TI-AS) y el empalme (SD-AS), los
mecanismos moleculares de sus acciones no son aún conocidos. Para
determinar el efecto de la formación de híbridos
ARN-oligodesoxinucleótido en las células sobre la
inhibición del crecimiento celular, independientemente de la
secuencia de nucleótidos, se cultivaron células transformadas para
expresar transcriptos de ADNc de bcl-2 humano
con oligodesoxinucleótidos normales.
Se añadieron 200 \muM de
oligodesoxinucleótidos TI-AS y TI-S
a cultivos de células NIH 3T3 típicas y a cultivos de estas células
que habían sido transfectados de manera estable con construcciones
de expresión que producen altos niveles de transcriptos de ADNc de
bcl-2 humano, ya sea por la cadena en sentido
habitual (células 3T3-alfa-S) o
antisentido (células
3T3-alfa-AS).
Para los ensayos de transferencia de ARN, se
purificó ARNm poliadenilado de células NIH 3T3 y de células
transfectadas de manera estable con construcciones de expresión que
producen tanto ARNm recombinantes de
bcl-2-alfa en sentido
(3T3-alfa-S) o antisentido
(3T3-alfa-AS), según el método de
13. Se sometieron aproximadamente 5 \mug de ARNm a análisis de
transferencia de ARN, esencialmente tal como se describe en (16),
utilizando tanto sondas de hibridación marcadas ^{3}_{2P}
derivadas de humanos o secuencias de bcl-2
murinas.
Un autoradiograma resultante de un día de
exposición de una transferencia que contiene ARNs de células 3T3
normales, de células 3T3-alfa-AS y
de células 3T3-alfa-S mostró altos
niveles relativos de transcriptos recombinantes de
bcl-2 de 2,4 y 1,4 kbp producidos a partir de
construcciones de expresión de bcl-2 que
fueron transfectadas en células
3T-alfa-AS y
3T3-alfa-S.
Una exposición de 10 días de una transferencia
que contiene ARN de células 3T3 normales que fueron proliferadas o
quiescentes en el momento de la colecta de ARN mostró niveles bajos
pero detectables de transcriptos de bcl-2
murinos normales de 7,5 y 2,4 kbp presentes en las células 3T3
proliferantes.
El oligodesoxinucleótido TI-AS
suprimió de manera específica la síntesis de ADN y la replicación
celular en cultivos de células NIH 3T3 normales, lo que fue
consistente con lo encontrado por otros que los fibroblastos no
contienen transcriptos de bcl-2, aunque a
bajos niveles. El oligonucleótido TI-AS que se da a
conocer en el presente documento es complementario a la secuencia
de bcl-2 de ratón en 18 de sus 20 bases (17),
explicando su capacidad para suprimir el crecimiento de células NIH
3T3 murinas.
Las células NIH 3T3, las células
3T3-alfa-AS y las células
3T3-alfa-S se cultivaron en un medio
que contiene suero tratado a 68ºC 5% (vol:vol) y con HBSS,
oligodesoxinucleótido normal TI-S 200 \muM, u
oligodesoxinucleótido normal TI-AS 200 \muM. Los
niveles relativos de síntesis de ADN(kcpm) se midieron en
cultivos después de 3 días y reflejaron una incubación de 16 horas
con 0,5 \muci/celda de [^{3}H]-timidina. Las
densidades celulares, estimadas mediante microscopía de fases,
fueron consistentes con la síntesis de ADN medida en los cultivos.
El porcentaje de inhibición de la síntesis de ADN en los cultivos
que contenían oligodesoxinucleótidos TI-AS se
calculó con relación a los cultivos de control que contenían
HBSS.
Como con las células NIH 3T3, el cultivo de las
células 3T3-alfa-S (que producen
transcriptos en sentido de bcl-2-alfa
humano) con oligodesoxinucleótidos TI-AS y
TI-S demostró una supresión específica, ya que el
oligodesoxinucleótidos TI-S en sentido no fue
inhibitorio. Sin embargo, el nivel de inhibición de la proliferación
celular del oligodesoxinucleótidos antisentido no fue tan grande en
las células 3T3-alfa-S, tal como se
esperaba, ya que estas células contienen más ARNm de
bcl-2.
Añadiendo el oligodesoxinucléotido
TI-S a los cultivos de las células
3T3-alfa-AS (producen transcriptos
antisentido de bcl-2) se ha descartado la
inhibición del crecimiento celular a través de un mecanismo no
específico que implica la formación del híbrido
oligodesoxinucleótido-ARN. El oligodesoxinucléotido
TI-S provocó una pequeña supresión de la
proliferación de las células
3T3-alfa-AS, mientras que el
oligodesoxinucléotido TI-AS fue notablemente
inhibitorio en estas células. Datos similares se obtuvieron con
oligodesoxinucleótidos fósforotioatos TI-AS y
TI-S.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayaron los oligonucleótidos que tienen las
secuencias mostradas en la tabla 2 para determinar su capacidad
para inducir muerte celular programada (fragmentación de ADN) en la
línea celular RS11846 de linfoma humano que contiene
t(14:18). Los oligonucleótidos fueron todos fosfodiésteres y
estaban dirigidos contra el sitio de iniciación de la traducción o
la región 5'-cap de los pre-ARNm de
bcl-2. Los oligodesoxinucleótidos de control
incluyen a una versión en sentido de bcl-2
(TI-S) de TI-AS (que tiene la SEQ ID
NO: 7) y una versión codificada de TI-AS que tiene
la misma composición de bases, pero con un orden de nucleótidos
mezclado.
Las células RS11846 se adaptaron a crecer en el
medio HL1 con 1% de FCS sus ADN marcados metabólicamente mediante
la adición a los cultivos de I^{125}-desoxiuridina
durante tres horas. A continuación, las células marcadas se lavaron
vigorosamente y se cultivaron durante dos días en presencia de
varios oligonucleótidos a 50 AM. A continuación, las células fueron
recuperadas a partir de cultivos de 200 \muL mediante
centrifugación y se rompieron en un tampón hipotónico conteniendo
EDTA 10 mM y 14 Triton X100. Después de centrifugar a 16.000 xg
para precipitar el ADN genómico no fragmentado, la fracción de
sobrenadante conteniendo el ADN fragmentado fue extraída con
fenol/cloroformo y precipitada con etanol. A continuación, este ADN
fue sometido a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% y se
transfirió a membranas de nailon para autoradiografía.
Los resultados de dos experimentos se muestran
en las figuras 3 y 4. Fueron ensayados los seis oligonucleótidos
antisentido de bcl-2 dirigidos a la vecindad
del sitio ATG de iniciación de la traducción en los ARNm de
bcl-2.
"C-Oligo-2" se refiere a un
oligonucleótido con 4 errores de pareamiento propuestos. "U"
indica células de control no tratadas. La figura 4 muestra los
resultados para los oligonucleótidos mostrados en la figura 3.
"Sc20" se refiere a un 20 mer con la misma composición de bases
que TI-AS, pero con la secuencia mezclada. La
figura 4 (b) muestra los resultados para tres oligonucleótidos
dirigidos contra los 5'-cap del ARNm del
bcl-2. Los números hacen referencia a la
distancia de estos oligómeros desde el sitio ATG de iniciación de la
traducción.
La presencia de una escalera de fragmentos de
ADN (tamaño de la unidad de aproximadamente 200 bp) es indicativa de
muerte celular programada. A 50 \muM, TI-AS
provocó una pequeña fragmentación de ADN, mientras que los
oligonucleótidos que tienen la secuencia SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO:
10 y uno de los oligonucléotidos 5'-cap (SEQ ID NO:
14) dieron lugar a una pronunciada fragmentación de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Células 697 de leucemia de células
pre-B se cultivaron en medio concentrado
HL-1 al 1% (vol:vol) (condiciones libre de suero [o]
o con suero tratado a 68ºC al 3% (vol:vol)(FBS2)[__], ver figura 5.
Se muestran las densidades celulares medidas después de dos días en
cultivos que contienen varias concentraciones de
oligodesoxinucleótido fosfodiester TI-AS. Los datos
se muestran como porcentajes relativos a cultivos de control
tratados con un oligonucleótido en sentido y reflejan el promedio
\pm desviación estándar de muestras por duplicado.
\vskip1.000000\baselineskip
Para los estudios con oligodesoxinucleótidos,
las células 697 0,25x10^{4} (para fósforotioato) ó 0,5x10^{5}
(para oligodesoxinucleótidos normales), se cultivaron en 1 ml de
medio libre de suero HL-1 en placas de cultivo de
24 celdas (Linbro. Flow Lab, Inc.). Después de dos días (para los
normales) o 4 días (para los fósforotioatos), se recuperaron las
células de los cultivos, se lavaron una vez en [PBS, pH 7,4 (Gibco)
- 0,1% de albúmina de suero bovino - azida sódica 0,1%] y se
fijaron durante 5-10 minutos en hielo en una
solución de paraformaldehído/PBS. A continuación, las células se
lavaron una vez en PBS y se incubaron en 1 ml de metanol absoluto a
20ºC durante 10 minutos. Después de lavar una vez en
PBS-A, las células se resuspendieron in PBC
conteniendo Triton X-100 al 0,05% durante 3 minutos
en hielo, se lavaron en PBS-A y se prebloquearon
durante 30 minutos a 4ºC en PBS con suero de cabra inactivado por
calor al 10% (v/v).
Para la adición del primer anticuerpo, las
células prebloqueadas se resuspendieron en 100 \mul de
PBS-G (PBS - suero de cabra 1% - azida sódica 0,1%)
antes de hacer alícuotas de 50 \mul en tubos por separado que
contenían 1 \mul de anticuerpo BCL2 (Halder y otros, Nature
(Londres), 342:195-197 (1989)) o IgG normal de
conejo purificada por afinidad de control (Cappel
6012-0080) y se incubaron durante 1 hora en hielo.
El anticuerpo BCL2 utilizado para estos estudios se preparó en
conejos utilizando un péptido sintético que se corresponde con los
aminoácidos (98-114) de la proteína BCL2 y fue
purificado por afinidad mediante cromatografía de
proteína-A Sepharose y utilizado a aproximadamente 1
mg/ml. A continuación, las células fueron lavadas en
PBS-A e incubadas en 0,5-1,0 ml de
PBS-A durante 15-20 minutos en hielo
para permitir la difusión del anticuerpo no específico asociado a
células antes de resuspender las células en 100 \mul de
PBS-G conteniendo 5 \mug de IgG
anti-conejo biotinilado SCAT (BAIOOO; Vector Labs)
durante 30 minutos. Después de lavar una vez e incubar durante 15
minutos en PBS-A, las células fueron resuspendidas
finalmente en PBS-A conteniendo 2 \mug de avidina
conjugada con FITC (Vector Labs A2011) durante 20 minutos y lavadas
tres veces en PBS-A antes de analizar con un Orto
citofluorógrafo 50-H conectado a un sistema Orto
2150 de manejo de datos. La especificidad del método para detectar
la proteína BCL2 se confirmó mediante microscopía de
inmunofluorescencia (que muestra competición de péptidos
citosólicos teñidos y estudios de líneas celulares que expresan
varios niveles de ARNm de BCL2 y proteínas a través de
manipulaciones de transferencia genética.
Para las mediciones de la expresión del antígeno
de superficie HLA-DR se utilizó un método indirecto
de ensayo inmunofluorescente (Reed y otros, J. Immunol.
134:1631-1639 (1985)) que implica la incubación de
células viables con un anticuerpo monoclonal murino
anti-HLA-DR
(IgG2a)(Becton-Dickinson 7360) o un anticuerpo de
control negativo, R3-367 (IgG2a), seguido de IgG
anti-ratón SCAT conjugado con FITC (Cappel
1711-0081). Las células se fijaron en
paraformaldehído/PBS al 1% antes del análisis de FACS.
Las células 697 fueron cultivadas durante 2 días
(PO) ó 4 días (PS) con varios oligonucleótidos. En la figura 6, las
columnas en negro muestran los resultados con un oligonucleótido en
sentido y las columnas rayadas con un oligonucleótido antisentido
TI-AS. Las células fueron marcadas con antisuero
anti-bcl-2 y analizadas mediante FACS. Los
datos se expresan como porcentajes relativos al promedio de
fluorescencia obtenido con células 697 no tratadas.
La figura 7 muestra los resultados de FACS
típicos obtenidos para 697 células antes y después del tratamiento
con 100 \muM de oligonucleótidos PO bcl-2
antisentido. A: células 697 no tratadas marcadas con antisuero
anti- bcl-2 (área rayada) o control de suero
normal de conejo (área blanca); B: células 697 no tratadas marcadas
con anticuerpo anti-HLA-DR (área
rayada) o un anticuerpo de control negativo (área blanca); C:
células 697 cultivadas durante 2 días con oligodesoxinucleótidos
TI-AS de bcl-2 normal (área
blanca) o TI-AS (área rayada) y marcados con
anticuerpo anti-bcl-2; D: células
697 cultivadas con oligodesoxinucleótidos TI-AS y
TI-S (como en C), pero marcados con anticuerpo
anti-HLA-DR.
Como se muestra en las figuras 6 (a) y (b), los
oligonucleótidos antisentido de bcl-2 PO y PS
produjeron reducciones específicas dependientes de la concentración
en los niveles de proteínas de bcl-2, sin
alterar los niveles de expresión HLA-DR (figura 7)
y otros antígenos de control. Por ejemplo, a 150 \muM, el
oligodesoxinucleótido antisentido PO provocó una reducción de
aproximadamente 75-95% en la fluorescencia de
bcl-2, mientras que el oligodesoxinucleótido
en sentido de control disminuyó los niveles de proteína
bcl-2 sólo en 10-20% (figura
6 (a)). De manera similar, el cultivo de células 697 durante 4 días
con el oligodesoxinucleótido antisentido a 25 \muM provocó una
reducción en un 70% de la fluorescencia de
bcl-2. En comparación, el
oligodesoxinucleótido en sentido PS TI-AS inhibió
los niveles de proteína bcl-2 sólo en
aproximadamente 15%, tal como fue medido mediante este ensayo
(figura 6 (b)).
\vskip1.000000\baselineskip
En los oligodesoxinucleótidos fósforotioatos,
uno de los átomos de oxígeno no enlazado en cada enlace de fosfato
internucleótido es reemplazado con un átomo de azufre. Esta
modificación hace a los oligodesoxinucleótidos fósforotioatos
extremadamente resistentes a la escisión por nucleasas, Stein y
otros, Nucl. Acids Res., 16:3209-3221 (1988). A
pesar de la sustitución de un átomo de azufre por un oxígeno, los
oligodesoxinucleótidos fósforotioatos mantienen una buena
solubilidad en soluciones acuosas; hibridan bien, aunque con alguna
disminución en la temperatura de fusión de los
oligodesoxinucleótidos ARN dobles; y son convenientemente
sintetizados mediante el método ampliamente utilizado de síntesis
automática de oligodesoxinucleótidos con fósforodiamiditas.
Se ha descubierto que los oligodesoxinucleótidos
bcl-2 antisentido fósforotioatos son
inhibidores más potentes del crecimiento de células leucémicas que
sus contrapartes normales basadas en oxígeno. Cuando se ensayó bajo
condiciones libres de suero, estos oligodesoxinucleótidos redujeron
la proliferación celular a la mitad a concentraciones de
aproximadamente 15-23 \muM, mientras que el
oligodesoxinucleótido normal logró un 50% de inhibición a
125-250 \muM. Este descubrimiento puede ser
explicado por la reducida sensibilidad de los
oligodesoxinucleótidos fósforotioatos a las nucleasas celulares, o
se le puede atribuir a otros mecanismos. Por ejemplo, los ARNm
hibridados con oligodesoxinucleótidos fósforotioatos pueden
experimenta una degradación intensificada a través de un mecanismo
que implica una actividad ARNasa similar a H.
A pesar de su actividad inhibitoria
incrementada, los oligodesoxinucleótidos antisentido fósforotioatos
mantienen su especificidad a una secuencia. En las concentraciones
ensayadas (menos de 25 \muM), las versiones en sentido de estos
oligodesoxinucleótidos tuvieron un pequeño efecto sobre el
crecimiento de células leucémicas. Tanto los oligodesoxinucleótidos
antisentido normales como los fósforotioatos mostraron suprimir
inicialmente la proliferación de células leucémicas a través de
mecanismos no citotóxicos. Durante los primeros días de cultivo, la
replicación celular fue inhibida sin un aumento concomitante de la
muerte celular. Sin embargo, más tarde en estos cultivos (días
4-5 para oligodesoxinucleótidos normales, días
6-8 para los fósforotioatos) disminuyeron las
viabilidades celulares.
La comparación de las cinéticas de inhibición de
los oligodesoxinucleótidos normales y fósforotioatos demostró que
los últimos compuestos tienen un inicio de acción más lento. La
máxima inhibición de la proliferación de células leucémicas
mediante oligodesoxinucleótidos antisentido normales tuvo lugar dos
días después de la iniciación de los cultivos, mientras que los
oligodesoxinucleótidos fósforotioatos requirieron de 4 a 7 días para
lograr la inhibición máxima.
La utilidad de los oligómeros antisentido en la
inhibición de células humanas de linfoma/leucemia y otros tipos de
células cancerosas que expresan el gen bcl-2
se ha mostrado en los ejemplos de este documento.
Oligodesoxinucleótidos antisentido complementarios, como mínimo, a
una porción efectiva de ARNm del gen bcl-2
humano se ha encontrado que inhiben el crecimiento de células
RS11846 de linfoma folicular humano con translocación cromosomal t
(14; 18) y alta expresión de bcl-2, células
697 de leucemia humana pre células B, (alta expresión de
bcl-2), células JURKAT de leucemia
linfocítica humana aguda (expresión de bcl-2
media), linfocitos humanos normales (expresión de
bcl-2 media) y fibroblastos murinos (baja
expresión de bcl-2). Aunque los reactivos
antisentido de bcl-2 pueden suprimir el
crecimiento de muchos tipos de células, las células de linfoma
t(14; 18) y de leucemia parecen ser las sensibles,
permitiendo la inhibición específica de células malignas.
Como se demuestra en los siguientes Ejemplos,
una variedad de ADNs análogos pueden ser empleados en la presente
invención. Por ejemplo, fósforotioatos, metifosfonados y mezclas de
oligómeros que contienen combinaciones de fosfodiésteres y
nucleósidos fósforotioatos o metilfosfonados. Debe entenderse que
los ARN análogos pueden ser también empleados en la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El propósito de este estudio fue determinar la
eficacia de varios análogos de los oligómeros anticódigo para
inhibir la supervivencia de células de linfoma.
DoHH2 es una línea celular de linfoma humano que
contiene una translocación t(14:18) que activa el gen
bcl-2. Las células DoHH2 se cultivaron durante 3
días sin oligómeros o en presencia de varias concentraciones de
oligómeros Metilfosfonato (MP)/Fosfodiester (PO) antisentido (AS) y
mezclados (SC) durante 3 días. La viabilidad celular se evaluó
mediante exclusiones con tinte azul de tripano y los datos
expresados como porcentaje relativo a las células DoHH2 cultivadas
sin oligómeros. Los oligómeros MP/PO fueron 18-mero
dirigidos contra los primeros 6 codones del marco de lectura
abierto de bcl-2, en el que 5 uniones internas
fueron fosfodiester y los nucleósidos que flanquean fueron
metilfosfonatos.
Los resultados indican que estos oligómeros
anticódigo análogos son inhibidores potentes y específicos de la
supervivencia de las células de linfoma.
\vskip1.000000\baselineskip
El propósito de este estudio fue determinar la
eficacia de los análogos del oligómero anticódigo reivindicado para
inhibir la supervivencia de células tumorales sólidas que expresan
altos niveles de bcl-2.
MCF-7 es una línea celular de
adenocarcinoma de mama humano que contiene niveles relativamente
altos de proteína bcl-2. Las células se cultivaron
a 4.000 células por pocillo en placas de microtitulación de 96
pocillos en presencia o ausencia de oligómeros MP/MO. A
continuación, el número relativo de células por pocillo fue estimado
mediante ensayo de MTT, basado en una curva estándar preparada
utilizando células MCF-7 no tratadas recién
sembradas. Los oligómeros MP/PO antisentido (AS) y mezclados (SC)
fueron los mismos que los descritos en el ejemplo 15. Los datos
representan el promedio \pm desviación estándar para las
determinaciones.
Los resultados demuestran una inhibición
específica de secuencia del crecimiento de las células tumorales
sólidas por los análogos del oligómero anticódigo reivindicado.
\vskip1.000000\baselineskip
El propósito de este estudio fue determinar los
sitios diana óptimos o porciones de secuencias en el ARNm para la
inhibición de la supervivencia celular mediante el contacto de las
células con diversas moléculas anticódigo reivindicadas, cuyas
secuencias fueron generadas mediante ordenador.
Se trataron células de linfoma DoHH2 con varias
concentraciones de oligómeros dirigidos a diferentes sitios del
ARNm de bcl-2. El oligómero ATG se dirige al sitio
de iniciación de la traducción y es complementario a los primeros 6
codones del marco de lectura abierto. Los oligómeros Dscore 23 y
Dscore 72 se dirigen a sitios en la región no traducida 5' del
ARNm. Los oligómeros Sc representan controles negativos que tienen
la misma longitud y composición de bases, pero un orden mezclado.
Todos los oligómeros fueron preparados como quimeras de
fosfodiester (PO)/fósforotioato (PS), donde solamente los dos
últimos enlaces internucleósidos (3') fueron fósforotioatos. Se
añadieron oligómeros directamente a los cultivos y se estimaron
mediante un ensayo MTT los números relativos de células viables
tres días después. Los datos representan el promedio \pm la
desviación estándar.
Los resultados indican que el oligómero Dscore
23 que estaba dirigido a la región no traducida 5', comparado con
otros oligómeros anticódigo ensayados en este ejemplo, tiene
actividad superior para inhibir la supervivencia de células.
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente trabajo se llevó a cabo para
determinar si los oligómeros anticódigo dirigidos contra la
expresión del gen bcl-2 podrían revertir la
quimiorresistencia, es decir, incrementar la sensibilidad a los
agentes quimioterapéuticos contra el cáncer en células tumorales
cancerosas que expresan el gen bcl-2.
Altos niveles de proteína bcl-2
parecen incrementar la resistencia relativa de las células linfoides
a la muerte inducida mediante una amplia variedad de agentes
quimioterapéuticos contra el cáncer incluyendo, sin constituir
limitación, Ara-c, MTX, vincristina, taxol,
cisplatina, adriamicina, etopósido, mitozantrón,
2-clorodesoxiadenosina, dexametasona (DEX) y
agentes alquilantes. (Miyashita, T. y Reed, J.C., Cancer Res.
52:5407, octubre 1, 1992). Aunque estos fármacos tienen diversos
mecanismos bioquímicos de acción, se cree que todos tienen en común
la capacidad de, en última instancia, provocar la muerte de la
célula cancerosa activando un mecanismo celular endógeno que
conduce a la apoptosis (Eastman, A. Cancer Cells. 2:275 1990)). Se
entiende que las moléculas anticódigo reivindicadas y los análogos
de las mismas, tal como se utilizan en el presente documento son
efectivas para sus propósitos destinados de aumentar la
sensibilidad a los medicamentos quimioterapéuticos contra el cáncer
incluyendo, sin constituir limitación, antimetabolitos, agentes
alquilantes, alcaloides de plantas y antibióticos.
Los antimetabolitos incluyen, sin constituir
limitación, metotreoxato, 5-fluoracil,
6-mercaptopurina, citosina arabinosida, hidroxiurea,
2-clorodesoxiadenosina.
Los agentes alquilantes incluyen sin constituir
limitación, ciclofosfamida, melfalán, busulfán, sisplatino,
paraplatino, cloroambucilo y mostazas nitrogenadas.
Los alcaloides de plantas incluyen, sin
constituir limitación, vincristina, vinblastina,
VP-16.
Los antibióticos incluyen, sin constituir
limitación, doxorubicina (adriamicina), daunorubicina, mitomicina c,
bleomicina.
Otros agentes quimioterapéuticos contra el
cáncer incluyen DTCI (decarbacina), mAMSA, hexametil melamina,
mitroxantrona, taxol, etopósido, dexametasona.
En el presente trabajo se emplearon tanto
fósforotioatos resistentes a nucleasas (PS) y fosfodiésteres en los
que solamente el enlace internucleósido mas 3' fue un enlace tioato
(PO/PS). Los oligómeros PO/PS son resistentes a exonucleasas 3' (la
principal actividad nucleasa del suero) y generalmente forma
heteroduplex con ARN dianas más estables.
Se utilizaron lípidos catiónicos para mejorar la
absorción y la liberación posterior de los oligómeros en
compartimientos intracelulares efectivos y son ejemplos de
portadores farmacéuticos para los oligómeros anticódigo
reivindicados.
Los métodos para la preparación y purificación
de oligonucleótidos 18-mero antisentido (AS) y
mezclados (SC) utilizados para el presente trabajo fueron descritos
anteriormente en Métodos Generales y en Kitada y otros. (Antisense
R & D, 3:157 (1993)). Se sintetizaron oligonucleótidos
fosfodiester en una escala de 10-15 micromoles
utilizando química de fosforoamidato con oxidación mediante yodo y,
a continuación, se purificó utilizando una columna de fase reversa
C_{18}. En la mayoría de los casos, los oligómeros fueron
adicionalmente precipitados cinco veces con etanol para eliminar
cualquier actividad citotóxica no específica y, a continuación, se
secaron y resuspendieron en un medio HL-1 estéril
(Ventrex Labs, Inc; Burlingame, CA) a 1-10 mM. El pH
de esta solución se ajustó utilizando NaOH 1-10 M
de NaOH hasta que el indicador rojo de fenol en el medio retornó a
su color original.
Los principales oligómeros utilizados fueron
18-meros, que tienen tanto la secuencia:
- I.
- TCTCCCAGCGTGCGCCAT (ID DE SEQ Nº. 17), que es antisentido a los primeros 6 codones del marco de lectura abierto de bcl-2 humano (ID DE SEQ Nº. 19); o
- II.
- TGCACTCACGCTCGGCCT (ID DE SEQ Nº. 18), que es una versión mezclada utilizada como control.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron métodos de transfección estándar
para producir células tumorales que expresan ya sea el gen
bcl-2 o un oligodesoxinucleótido antisentido que
también se une al ARNm de bcl-2. Se entiende que el
vector podría también codificar un oligodesoxinucleótido
antisentido que se une al pre-ARNm de
bcl-2. La secuencia de nucleótidos particular que
codifica los oligonucleótidos antisentido de la presente invención
no es crítica, excepto porque las secuencias son preferentemente
seleccionadas de tal manera que expresen oligonucleótidos
antisentido suficientes para reducir la expresión del gen
bcl-2 en células tumorales e incrementen la
sensibilidad de las células tumorales a los agentes
quimioterapéuticos contra el cáncer o suficientes para destruir las
células tumorales cuando son tratadas con agentes quimioterapéuticos
contra el cáncer. Sólo es necesario que el oligonucleótido
antisentido codificado en el vector se exprese bajo condiciones
suficientes para reducir la expresión del gen bcl-2
en las células tumorales. Los métodos utilizados para la preparación
de los vectores y, en particular, plásmidos de expresión, para la
transferencia de genes a las células de mamíferos recaen en
técnicas rutinarias en el campo de la biología molecular. Un texto
básico que da a conocer los métodos generales de preparación de
plásmidos de expresión utilizados en la presente invención es
Clonaje Molecular, Un Manual de Laboratorio, 2^{da}
edición, eds. Sambrook y otros., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, (1989), particularmente el Capítulo 16 sobre Expresión de
Genes Clonados en Cultivos de Células de Mamíferos. Los ejemplos 15
C-D siguientes desarrollan métodos particulares para
la preparación de los plásmidos de expresión utilizados en la
presente invención. El vector particular utilizado para transferir
los oligonucleótidos antisentido de la presente invención no es
crítico y dichos vectores pueden incluir vectores derivados de fagos
lambda y relacionados o de fagos filamentosos. Sólo es necesario
que la secuencia de nucleótidos transferida, que codifica los
oligonucleótidos antisentido de la presente invención, se exprese en
la célula tumoral transfectada bajo condiciones suficientes para
reducir la expresión del gen bcl-2 en las células
tumorales. La presente invención incluye la expresión de
oligonucleótidos antisentido, ya sea a partir de una posición
extracromosomal (por ejemplo a partir de un plásmido de expresión)
o a partir de una posición integrada dentro del propio genoma
huésped, como los mediados por otros vectores, tales como vectores
retrovirales recombinantes (Reed y otros. Tumorigenicidad mediada
por bcl-2 en una línea celular linfoide
de células T: sinergia con C-MYC e inhibición mediante antisentido bcl-2. PNAS USA 87:3660 (1990)).
de células T: sinergia con C-MYC e inhibición mediante antisentido bcl-2. PNAS USA 87:3660 (1990)).
\vskip1.000000\baselineskip
La línea celular de linfoma
SU-DHL-4, obtenida a partir del uso
de linfoma no Hodgins histiocítico difuso (Epstein y otros. Dos
nuevos anticuerpos monoclonales (LN-1,
LN-2) reactivos en tejidos B5 fijado con formalina
sumergidos en parafina con linfocitos B humanos con centro folicular
y zona del manto y tumores derivados. J. Immunol. 133:1028 (1984))
y que contiene una translocación t(14;18) se trató con
oligodesoxinucleótidos bcl-2-AS
sintéticos 18-mero dirigidos a la unión con los
primeros seis codones del ARNm de bcl-2. Como
control, se trataron las células
SU-DHL-4 con varios oligómeros de
control, incluyendo 18-mero que tienen la misma
composición nucleosídica que el oligómero AS, pero en el que las
bases estaban en orden mezclado (SC).
Se combinaron alícuotas de 1,5 ml de medio
HL-1 libre de suero (Ventrex Labs, Inc.)
suplementado con L-glutamina 1 mM, penicilina 50
unidades/ml y estreptomicina 100 \mug/ml y tanto 5 \mug de
oligonucleótidos purificados ó 30 \mug de Lipofectin^{R}
[mezcla 1:1 peso/peso de cloruro de
N-(1-2,3-dioliloxi)
propil)-n,n,n-trimetilamonio
(DOTMA) y dioleoilfosfotidiletanolamina (DOPE)] y se añadieron a
0,75 x 10^{6} células SU-DHL-4 en
3 ml de medio HL-1. A continuación, las células se
cultivaron a 37ºC en una atmósfera humidificada de 5% de
CO_{2}/95% de aire en placas de 24 pocillos (2 ml/pocillo) para
inmunotransferencia y ensayos RT-PCR, o en placas
de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos (0,1 ml/pocillo)
para ensayos MTT. Para las células en los cultivos de
microtitulación típicamente se añadieron 0,1 ml de medio
HL-1 adicional con o sin varios fármacos
quimioterapéuticos después de un día, y las células se cultivaron
por un período adicional de dos días antes de realizar los ensayos
MTT.
Las células se lavaron una vez en PBS, se les
realizó una lisis en un tampón que contiene Tritón X100 1% y las
muestras se normalizaron por contenido de proteínas (25 \mug)
antes del fraccionamiento por tamaño de las proteínas mediante
SDS-PAGE (geles al 12%) y se transfirieron a filtros
de nitrocelulosa para los ensayos de inmunotransferencia, tal como
se describe en Reed y otros. Cancer Res. 51:6529 (1991).
Experimentos preliminares determinaron que alícuotas de los lisados
que contienen 25 \mug de proteína total produjeron resultados en
el rango lineal del ensayo. Las transferencias se incubaron
primeramente con antisuero de conejo 0,1% (v/v) dirigido contra un
péptido sintético que se corresponde con los aminoácidos (aa)
41-54 de la proteína Bcl-2 humana,
tal como se muestra en el identificador de secuencia Nº. 21 (ID SEQ)
seguido por 2,8 \mug/ml de IgG anti-conejo de
cabra biotinilado (Vector Labs, Inc). A continuación, las bandas
correspondientes a p26-Bcl-2 se
visualizaron mediante desarrollo de color utilizando un reactivo
complejo avidin-biotina-peroxidasa
de rábano picante (HRP) (Vector Labs Inc) y
3,3'-diaminobencidina (DAB). A continuación, las
transferencias teñidas se incubaron con un segundo anticuerpo
anti-Bcl-2 dirigido contra aa
61-67 de la proteína Bcl-2 (ID SEQ
NO. 21) seguido de 0,25 \muCi/ml de
^{125}I-proteína A. Las bandas de
Bcl-2 se escindieron de las transferencias y se
sometieron a conteo gamma.
\global\parskip0.900000\baselineskip
A pesar de la ubicación mitocondrial de la
proteína Bcl-2, no se notaron diferencias en la
velocidad de reducción del tinte MTT por las enzimas mitocondriales
en las células, que fueron idénticas excepto por sus niveles de
p26-Bcl-2. Estas comparaciones se
hicieron utilizando pares de líneas celulares linfoides en
crecimiento exponencial que se diferencian sólo en que una línea ha
sido infectada de manera estable con retrovirus
bcl-2 recombinante y la otra con el vector
retroviral parental que le falta el inserto de ADNc de
bcl-2 (Miyashita y otros. Cancer Res.
52:5407 (1992); Blood 81:151 (1993)).
Se detectaron reducciones específicas de
anticódigos en los niveles relativos de ARNm de
bcl-2 en 1 día mediante un ensayo de reacción en
cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa
semi-cuantitativo (RT-PCR). Ver
figura 8A.
Las células
SU-DHL-4 se cultivaron con 0,83
\mug/ml de oligómeros complejados con 5 \mug de lípidos
catiónicos (Lipofectin; BRL/Gibco, Inc.) por ml de medio libre de
suero y(13,19). En la figura 8A, el ARN total fue aislado de
las células después de 1 día y los niveles relativos de
bcl-2 y ARNm de glyceraldehído 3' fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) se evaluaron mediante el ensayo de
RT-PCRtal como se describe en Kitata y otros.
Antisense R & D 3:157 (1993).
En la figura 8B, las células
SU-DHL-4 se cultivaron con pares de
oligómeros Sc y As, ya sean PS (cuadrados) o PO/PS (círculos)
durante 3 días. A continuación, se midieron los niveles relativos de
proteína Bcl-2 utilizando un ensayo de
inmunotransferencia cuantitativo, tal como se describió
anteriormente, y los datos se expresaron como porcentaje relativo a
células tratadas con oligómeros Sc de control. El recuadro muestra
los resultados de la inmunotransferencia para
p26-Bcl-2 y una banda de reacción
cruzada (CR) de p75 en un caso donde el oligómero
As-PO/PS produjo una disminución relativa del 41% en
los niveles de proteína Bcl-2. En la figura 8C, se
añadió Ara-C, MTX o DEX 10^{-4} M 1 día después
de la adición de los oligómeros PS (cuadrados) o PO/PS (círculos) a
los cultivos de células SU-DHL-4 y
se realizaron ensayos MTT en el tercer día. Los datos se presentaron
como % del control en relación a las células cultivadas con
fármacos en ausencia de cualquier oligómero y representan los
resultados de 9 de 10 experimentos consecutivos [en un experimento,
el ensayo MTT falló]. Se obtuvieron resultados similares cuando se
utilizaron ensayos de exclusión de tinte en lugar de ensayos MTT
para evaluar la supervivencia celular [no mostrados].
Los valores promedios para los datos se indican
mediante líneas horizontales. El análisis estadístico de los datos
se realizó mediante la prueba t pareada (As contra Sc). Las
concentraciones de los oligómeros As y Sc (\approx150 nM) se
ajustaron para maximizar los efectos de As mientras se mantenía la
especificidad a la secuencia.
Las variaciones en la cantidad de ARN inicial se
controlaron mediante análisis RT-PCR utilizando
iniciadores específicos para ARNm GAPDH.
La larga vida media de la proteína
bcl-2 (aproximadamente 14 horas) puede explicar que
las reducciones mediadas por As en proteínas de
bcl-2 no sean tan dramáticas como para las
reducciones en ARNm de bcl-2, que toma mayor tiempo
para lograrlo (cerca de 3 días) y parece más variable.
La figura 8B muestra los resultados compuestos
para 10 experimentos, donde los niveles relativos de proteína
bcl-2 se compararon en células
SU-DHL-4 tratadas con oligómeros AS
o SC. Las reducciones mediadas por AS en los niveles de proteínas
bcl-2 se encontraban en el intervalo de tanto como
66% hasta tan sólo 10%, con una reducción relativa promedio de
aproximadamente 30%, comparada con las células
SU-DHL-4 que fueron tratadas de una
manera idéntica con los oligómeros de control. Los niveles de una
variedad de proteínas mitocondriales de control tales como
F_{1}-beta-ATPasa y citocromo C,
que como bcl-2 son codificadas por genes nucleares,
no fueron afectados de manera adversa por los oligómeros AS (no
mostrado), indicando que las reducciones mediadas por AS en los
niveles de proteína bcl-2 fueron específicas. El
inserto en la figura 8B, por ejemplo, muestra una comparación de
p26-Bcl-2 con una proteína de 78 kDa
que reacciona de manera cruzada con uno de los antisueros de conejo
empleados para el ensayo de inmunotransferencia, demostrando una
disminución en los niveles de
p26-bcl-2, pero no de p78, en las
células tratadas con AS en relación con células que recibieron los
oligómeros SC de control.
\vskip1.000000\baselineskip
Este estudio se realizó para determinar si el
tratamiento de las células SU-DHL-4
con oligómeros AS de bcl-2 podría incrementar su
sensibilidad a la destrucción por los agentes quimioterapéuticos
contra el cáncer Ara-C, MTX y DEX, que son fármacos
anticáncer.
Los estudios de control anteriores demostraron
que los oligómeros AS de bcl-2 tenían poco o ningún
efecto sobre el crecimiento y supervivencia de las células
SU-DHL-4, como mínimo, durante los
primeros tres días de cultivo (Kitada y otros. Antisense R & D
3:157 (1993)). Las reducciones mediadas por AS en los niveles de
proteína bcl-2 en estas células de linfoma, así como
en otras células, no acelera típicamente la velocidad de muerte
celular en los cultivos, a menos que las células sean privadas de
los factores de crecimiento del suero (Reed y otros. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87:3660 (1990)).
En el presente trabajo, estudios preliminares
demostraron que más del 90% de las células
SU-DHL-4 sobrevivieron al
tratamiento durante 4 días con una dosis alta (10^{-4}) de
Ara-CX, MTX o DEX, presumiblemente debido a sus
altos niveles de proteína bcl-2 (No mostrado). A
estas concentraciones, sin embargo, todos los fármacos indujeron
esencialmente la inhibición completa de la proliferación de las
células SU-DHL-4, consistente con
fármacos de bcl-2 convertidos de citotóxicos a
citostáticos. Las comparaciones de los oligómeros AS y SC
demostraron que el tratamiento en AS de bcl-2
aumentó notablemente la sensibilidad de estas células de linfoma a
MTX y Ara-C y en un menor grado a DEX. (Figura
8C).
A pesar de alguna variabilidad en los
resultados, como promedio, la adición de oligómeros As de
bcl-2 a los cultivos de células
SU-DHL-4 tratadas con MTX o
Ara-C resultaron en una mayor inhibición
79-84% (reducción en el número de células viables)
que con el uso de cualquier fármaco solo (P< 0,002 para AS contra
SC) en ausencia de la introducción de los oligómeros AS de
bcl-2 de la presente invención. Se obtuvieron
resultados estadísticamente significativos para las células
SU-DHL-4 tratadas con DEX (P=0,01).
La reducción en un 20-30% del número de células
viables observadas para las células tratadas con el oligómero de
control podría reflejar un grado sin especificidad de secuencia,
pero se relaciona probablemente al uso de lípidos catiónicos para
facilitar la liberación del oligómero dentro de las células.
\vskip1.000000\baselineskip
Para confirmar aún más la especificidad de
secuencia de los oligómeros AS de bcl-2 para
aumentar la sensibilidad a los fármacos quimioterapéuticos
anticáncer, se llevó a cabo un estudio utilizando una línea celular
hemopoyética murina 32D.C13 dependiente de
interleucina-3 (IL-3), que había
sido transfectada de manera estable con el plásmido de expresión
que codifica tanto la proteína bcl-2 humana o un
homólogo viral de bcl-2, BHRF-1, que
tiene sólo un 22% de homología con bcl-2. Las
células 32D.C13 se obtuvieron del Dr. Giovanni Rovera del Wistar
Institute, Philadelphia, PA.
El tratamiento de las células 32D con complejos
oligómero/lípido catiónico fue tal como se describió anteriormente
excepto en que se incluyeron 50 Unidades/ml de IL-3
murina recombinante (rIL-3) en el medio
HL-1, la densidad celular inicial fue de 10^{5}
por ml y se añadió adenovirus de replicación defectuosa dl3l2
(MOI=200) 30 minutos después de la exposición de las células a los
oligómeros para facilitar la salida del ADN de los endosomas
[Yoshimura K, y otros. J Biol Chem. 268, 2300, (1993)].
Las células 32D que habían sido transfectadas de
manera estable con plásmidos de expresión que codifican tanto
p26-Bcl-2 o EBV
p19-BHFR-1 humanos (Takayama, S. y
otros enviado) se cultivaron en medio (10^{5}/ml) que contiene
IL-3 y oligómeros PO/PS durante 3 días para lograr
reducciones en los niveles de proteína Bcl-2 humana.
A continuación, las células se trataron nuevamente con oligómeros
solos (C) o en combinación con varias concentraciones de MTX y se
evaluó el número relativo de células viables 2 días después mediante
el ensayo MTT. Los datos representan el promedio \pm desviación
estándar para determinaciones por triplicado y se expresaron como %
relativo a las células que no recibieron MTX. El análisis
estadístico de los datos para MTX 10^{-6} a 10^{-4} M se
realizó mediante un método de Análisis de Variables de dos factores.
(Finney, D.J. En Métodos Estadísticos en Ensayos Biológicos, p. 72,
1978 (3^{ra} edición, Charles Griffin & Co., London). Se
obtuvieron resultados comparables con los ensayos de exclusión de
tinte [no mostrados].
Los ARN derivados de la construcción de
bcl-2 humano en las células
32D-BCL-2 fueron una diana para los
oligómeros AS de bcl-2, mientras que los ARN de los
plásmidos de expresión BHRF-1 no lo fueron. En
consecuencia, la quimiosensibilidad a los fármacos citotóxicos de
las células 32D.C13 que expresan BHRF-1 podría no
haber sido afectada por el tratamiento con AS.
Los experimentos preliminares demostraron que
con la retirada de IL-3 de las células 32D.C13, los
niveles proteína bcl-2 de ratón endógena
disminuyeron y las células sufrieron apoptosis.
Bcl-2 y BHRF-1 soportaron de manera
comparable la supervivencia de las células 32D.C13 en ausencia de
IL-3, y las velocidades de proliferación de las
células 32D.C13 que contienen altos niveles de éstas proteínas
fueron similares en presencia de IL-3, excluyendo
así estas variables como explicación de cualquier diferencia en la
quimiosensibilidad.
La figura 9 compara la sensibilidad de las
células 32D-BCL-2 y
32D-BHRF-1 a varias concentraciones
de MTX. El tratamiento con oligómeros AS de bcl-2
dio lugar a aumentos específicos de secuencia en la sensibilidad de
las células 32D-BCL-2 a la
inhibición por MTX a concentraciones de 10^{-6} a 10^{-4} M (P
\leq 0,001 para AS contra SC). Por el contrario, el tratamiento
con oligómeros AS de bcl-2 no produjo diferencias
significativas en la sensibilidad de las células
32D-BHRF-1 a MTX, en relación con
los oligómeros SC de control (figura 9). Estos datos indican que el
efecto de los oligómeros AS de bcl-2 en la
quimiosensibilidad a fármacos agentes citotóxicos son específicos
de secuencia. Además, varios oligómeros de control, que incluyen
bcl-2 en sentido, otras secuencias mezcladas con la
misma composición nucleosídica que AS y oligómeros con secuencias
totalmente sin relación, todos tuvieron un efecto comparativamente
pequeño en la quimiosensibilidad de las células (no mostrado).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los descubrimientos anteriores demostraron que
los oligómeros AS de bcl-2 produjeron reducciones
específicas de secuencia en los niveles de ARNm de
bcl-2 y de proteína bcl-2 y que
estos eventos estaban asociados con un incremento de la
sensibilidad a los agentes quimioterapéuticos, tales como fármacos
anticáncer. La parte de las células tumorales destruidas por los
agentes quimioterapéuticos fue mayor que la parte destruida por la
misma cantidad de agentes quimioterapéuticos en ausencia de la
introducción de los oligómeros AS de bcl-2 de la
presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se empleó una estrategia diferente para
determinar si las reducciones mediadas por AS en la expresión del
gen bcl-2 podrían lograrse con un plásmido de
expresión AS de bcl-2 inducible, que utilizaba un
promotor de metal pesado sensible a
metalotioneina-IIa humana en otra línea de linfoma,
que contiene la translocación t(14;18) RS11846. Se
obtuvieron las RS11846 del Dr Carlo Croce (Wistar Institute,
Philadelphia, PA (Tsujimoto y Croce, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 83:5214 (1986)).
Para preparar el plásmido de expresión, se
subclonó un ADNc de bcl-2 (ibid) de 0,91 kbp
tanto en orientación antisentido (AS) o en sentido (S) en un sitio
HindIII aguas abajo de un promotor de
metalotioneina-IIa humana en el plásmido
pMEP-4 (Invitrogen, Inc.), que contiene un gen de
higromicina fosfotransferasa y el gen EBNA-1 y se
origina de la replicación del ADN a partir del virus de Epstein Varr
para mantenimiento episomal de copia alta.
Fueron electroporadas las células RS11846 (5 x
10^{6}) en un tampón salino de fosfato de Dulbeco que contiene 30
\mug de ADN plasmídico (1500 \muF, 270 V/cm) utilizando un
sistema de electroporación Cellject Electrooration System de
EquiBio, Inc. Las células se retornaron a su medio de cultivo
habitual (RPMI-L 1640 suplementado con suero fetal
bovino 10%, L-glutamina 1 mM, penicilina 50
unidades/ml y estreptomicina 10 \mug/ml) a 2 x 10^{5} células
por ml y se cultivaron durante 2 días antes de sembrar las células a
2 x 10^{5} por ml en un medio que contiene 200 \mug/ml de
higromicina. Después de tres semanas de cultivo, se pasó la masa
celular resultante a concentraciones de higromicina sucesivamente
mayores en incrementos de 200 \mug/ml hasta que la concentración
alcanzó 1 mg/ml (alrededor de las 4 semanas).
Las células resistentes a la higromicina RS11846
se cultivaron en medio RPMI/10% de suero que contiene CdCl_{2}
0,5 \muM y 3 días después se realizaron ensayos de
inmunotransferencia utilizando 25 \mug de proteína/carril,
esencialmente como se describe en Tanka S y otros. J. Biol. Chem.
268, 10920 (1993) y en Reed y otros. Cancer Res 51:6529 (1991)).
Como se resume en la figura 10, los plásmidos de
control ("C") y bcl-2-AS
("AS") se introdujeron en las células RS11846 y la expresión
se indujo con CdCl_{2} 0,5 \muM o ZnCl_{2} 50 \muM varias
veces. Como control adicional, también se analizaron células
RS11846 que contienen plásmidos inducibles con ADNc de
bcl-2 en orientación en sentido ("S"). Las
células RS11846 se indujeron durante 3 días y se evaluaron los
niveles relativos de las proteínas Bcl-2 y
F_{1}-\beta-ATPasa mediante el
ensayo de inmunotransferencia de Tanka y otros. J Biol Chem
268:10920 (1993). En la figura 10A, las células RS11846 se
cultivaron a 10^{5} células/ml en un medio que contiene
CdCl_{2} 0,5 \muM y un día después se añadió
Ara-C 10^{-7} M o un volumen equivalente de
diluyente de control. Se estimaron los números relativos de células
viables a partir del ensayo MTT en diversos tiempos y se calculó el
promedio \pm desviación estándar para muestras por triplicado. En
la figura 10B, las células RS11846 se cultivaron como en la figura
10A, excepto en que se añadieron varias concentraciones de
Ara-C, MTX o DEX. Los datos representan el promedio
\pm desviación estándar para muestras por triplicado. Los
cálculos estadísticos se realizaron mediante Análisis de Variables
de dos factores. DEX sirvió aquí como control negativo, ya que las
células RS11846 habían perdido los receptores de
glucocorticoides.
Los experimentos preliminares demostraron que
las células RS118846 toleraron la adición de hasta 0,5 microM de
CdCl_{2} o microM de ZnCl_{2} a los cultivos durante una semana,
experimentando una ligera disminución en la velocidad de
crecimiento, pero esencialmente no disminuye el porcentaje de
viabilidad celular (no mostrado).
En ausencia de inducción por metales pesados,
los niveles relativos de la proteína bcl-2 en las
células RS11846 que contienen el control o el plásmido AS de
bcl-2 fueron comparables, tal como se determino
mediante ensayo de inmunotransferencia (no mostrado). Cuando se
añadió CdCl_{2} 0,5 \muM o ZnCl_{2} \muM, las reducciones
en la proteína bcl-2 se hace evidente en las células
que expresan AS a los 2 días y se obtuvo una inhibición máxima de
30-40% del tercer al cuarto día, en relación con las
células RS11846 de control.
La figura 10A muestra un ejemplo de los datos de
la inmunotransferencia derivados las células RS11846 después de
tres días de exposición a CdCl_{2} 0,5 mM, demostrando niveles
reducidos de proteína bcl-2 en las células que
contienen el plásmido AS, comparado con las células RS11846 que
albergaron el plásmido de control. Los niveles relativos de una
proteína mitocondrial de control
F_{1}-beta-ATPasa fueron
comparables en todas las líneas celulares, consistente con las
alteraciones específicas de secuencia en los niveles de proteína
bcl-2.
Cuando las células RS11846, que contienen tanto
los plásmidos de control o bcl-2-AS,
se cultivaron varias veces en CdCl_{2} 0,5 \muM o ZnCl_{2} 50
\muM, no se observaron diferencias significativas en las
velocidades de crecimiento de estas dos líneas celulares (figura
8B). Por lo tanto, las reducciones mediadas por As en los niveles
de proteína Bcl-2 por sí mismas no perjudicaron la
proliferación o supervivencia celular de RS11846.
La inclusión de bajas dosis de
Ara-C (10^{-7} M) en los cultivos de control de
células RS11846 sólo dio lugar a una ligera disminución del numero
de células viables, presumiblemente debido a los altos niveles de
proteína Bcl-2 encontrados en estas células de
linfoma que contienen t(14;18). Por el contrario, la adición
de Ara-C 10^{-7} M a cultivos de células RS11846
que expresan bcl-2-AS fue
notablemente inhibitoria (figura 8B). Ara-C, sin
embargo, no tuvo ningún efecto sobre las células RS11846 que
expresan AS de bcl-2 en ausencia de inducción por
metales pesados del promotor MT, cuando se compara directamente con
las células RS11846 que contienen el plásmido de control bajo las
mismas condiciones [no mostrado]. La figura 8C muestra que el
aumento de la sensibilidad a Ara-C observado para
las células RS11846 que expresan
bcl-2-AS, ocurre sobre un amplio
intervalo de concentraciones de fármacos. (P < 0,001). La
inducción por metales pesados del plásmido de expresión
bcl-2-AS también aumentó la
sensibilidad relativa de las células de linfoma a MTX (P<0,01),
pero no a DEX. Los ensayos de unión de receptores glucocorticoides
demuestran que las células RS11846 han perdido receptores para esas
hormonas esteroides [no mostrado], proporcionando así un control
específico que muestra que la reducción mediada por AS en los
niveles de proteína bcl-2 son insuficientes por sí
mismos para perjudicar el crecimiento o la supervivencia de estas
células de linfoma.
Utilizando una diversidad de enfoques de
anticódigos, la presente invención demostró que reducciones de
30-40% como promedio en los niveles relativos de
proteína bcl-2 aumenta notablemente la sensibilidad
de las células de linfoma, en particular, líneas celulares de
linfoma que contienen t(14;18) a los agentes
quimioterapéuticos tales como los fármacos anticáncer
convencionales. Estos ejemplos demostraron que con la introducción
del oligómero anticódigo reivindicado dentro de las células
tumorales se logra una reducción de la expresión de
bcl-2 y aumenta la quimiosensibilidad de las células
neoplásicas a los agentes quimioterapéuticos o a los fármacos
anticáncer.
Por consiguiente, la presente invención logra un
método para la destrucción de células tumorales introduciendo
oligómeros anticódigo en las células tumorales, que reducen la
expresión del gen bcl-2 o perjudica la función de
la proteína Bcl-2 antes de poner en contacto las
células con agentes quimioterapéuticos, incluyendo los fármacos
anticáncer. Los fármacos anticáncer convencionales redujeron el
número de células malignas viables y la parte de células tumorales
eliminadas fue mayor que en la parte que se hubiera eliminado por la
misma cantidad de fármaco en ausencia de la introducción de los
oligómeros anticódigos en las células.
Por lo tanto, habiendo dado a conocer las
realizaciones a modo de ejemplos de la presente invención, debe
observarse por los expertos en la materia que esta divulgación es
solamente a manera de ejemplo y que otras diversas alternativas,
adaptaciones y modificaciones se pueden hacer dentro del alcance de
la presente invención. Por consiguiente, no está limitada a las
realizaciones específicas que se ilustran en el presente documento,
sino que está solamente limitada por las siguientes
reivindicaciones.
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: FIDEICOMISIARIOS DE LA UNIVERSIDAD DE PENSILVANIA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Regulación de la expresión del gen bcl-2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 23
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMATO DE LECTURA DEL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco de 3,5 pulgadas, 1,44 Mb de almacenamiento
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC COMPATIBLE IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMAS: PatentIn Relase #1.0, Version #1.25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5086 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 717 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..717
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 239 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 615 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENADO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACION: 1..615
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 205 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (20)
Hide Dependent
translated from
Claims (20)
Hide Dependent
translated from
1. Oligómero anticódigo de hasta 24 nucleótidos,
caracterizado porque comprende la secuencia
TCTCCCAGCG
TGCGCCAT (ID DE SEQ NO: 17), porque, como mínimo, un enlace internucleósido en dicha secuencia es un enlace fósforotioato y porque es útil para inhibir el crecimiento in vivo de células que expresan el gen bcl-2 humano.
TGCGCCAT (ID DE SEQ NO: 17), porque, como mínimo, un enlace internucleósido en dicha secuencia es un enlace fósforotioato y porque es útil para inhibir el crecimiento in vivo de células que expresan el gen bcl-2 humano.
2. Oligómero anticódigo de la reivindicación 1,
caracterizado porque todos los enlaces internucleósidos son
enlaces fósforotioatos.
3. Oligómero anticódigo de la reivindicación 1,
caracterizado porque es un oligonucleótido antisentido.
4. Composición farmacéutica útil para inhibir el
crecimiento de células que expresan el gen bcl-2
humano, caracterizada porque comprende un oligómero
anticódigo, según la reivindicación 1, junto con un portador
farmacéuticamente aceptable.
5. Composición farmacéutica útil para aumentar
la sensibilidad de células cancerosas humanas a agentes
quimioterapéuticos, en la que dichas células expresan el gen
bcl-2 humano, caracterizada porque comprende
un oligómero anticódigo, según la reivindicación 1, junto con un
portador farmacéuticamente aceptable.
6. Composición farmacéutica, según la
reivindicación 4 ó 5, caracterizada porque dicho portador
farmacéuticamente aceptable es un lípido catiónico.
7. Composición farmacéutica, según la
reivindicación 4 ó 5, caracterizada porque dicho oligómero
anticódigo está encapsulado en liposomas.
8. Composición farmacéutica útil para destruir
células cancerosas humanas que expresan el gen
bcl-2, caracterizada porque comprende un
oligómero anticódigo, según la reivindicación 1, y un agente
quimioterapéutico tóxico para dichas células cancerosas humanas.
9. Utilización de un oligómero según la
reivindicación 1, para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de cáncer humano.
10. Utilización, según la reivindicación 9, en
la que dicho cáncer es un linfoma o leucemia.
11. Utilización, según la reivindicación 10, en
la que dicho cáncer es un linfoma no Hodgkin.
12. Utilización, según la reivindicación 9, en
la que dicho cáncer es un cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer
gastrointestinal o cáncer de colon.
13. Utilización, según la reivindicación 9, en
la que dicho medicamento se destina para ser utilizado en
combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos contra el
cáncer.
14. Utilización, según la reivindicación 13, en
la que dicho agente quimioterapéutico se selecciona entre
dacarbazina, paclitaxel, etoposida,
2-clorodesoxiadenosina, desametasona, AMSAm,
hexametilo, melamina y mitroxantrona.
15. Utilización, según la reivindicación 13, en
la que dicho agente quimioterapéutico se selecciona entre
antimetabolitos, agentes alquilantes, alcaloides de plantas y
antibióticos.
16. Utilización, según la reivindicación 15, en
la que dichos antimetabolitos se seleccionan entre metrotrexato,
5-fluorouracilo, 6,-mercaptopurina, citosina
arabinósida, hidroxiurea y
2-clorodesoxiadenosina.
17. Utilización, según la reivindicación 15, en
la que dichos agentes alquilantes se seleccionan entre
ciclofosfamida, melfalano, busulfán, cisplatino, paraplatino,
clorambucilo y mostazas nitrogenadas.
18. Utilización, según la reivindicación 15, en
la que dichos alcaloides de plantas se seleccionan entre
vincristina, vinblastina y VP6.
19. Utilización, según la reivindicación 15, en
la que dichos antibióticos se seleccionan entre doxorubicina,
daunorubicina, mitomicina C y bleomicina.
20. Un kit de partes para utilización simultánea
o secuencial para destruir células cancerosas humanas que expresan
el gen bcl-2, caracterizado porque comprende:
un oligómero anticódigo, según la reivindicación 1, y un agente
quimioterapéutico tóxico para dichas células cancerosas humanas.