PT100052A

PT100052A - Regulacao da translacao do acido nucleico

Info

Publication number: PT100052A
Application number: PT10005292A
Authority: PT
Inventors: Robert L Lechner
Original assignee: Us Biochemical Corp
Priority date: 1991-01-25
Filing date: 1992-01-24
Publication date: 1993-03-31
Also published as: AU1341092A; EP0568641A1; EP0568641A4; CA2100251A1; WO1992013070A1; JPH06505161A; IE920229A1

Description

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REGULAÇÃO -DA TRANSLAÇÃO DO ÁCIDO NUCLElCO 10 * 15

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Eundaroentos da Intenção A invenção refere-se à regulação da translação do ARN. 0 ARN de sentido inverso é um ARN cuja sequência é complementar à de uma molécula particular de ARN (ver, por exemplo, Kimelman e al., Cell 59:687, 1989; Melton, Proc.Natl.Acad.Sei.USA 82:144, 1985). In vivo, o ARN de sentido inverso correspondente a um gene particular é geralmente produzido por um gene artificial que foi preparado para transcrever a cadeia normalmente não transcrita do gene escolhido. Um gene assim preparado é facilmente gerado por meio da inversão da orientação do ADN transcrito no gene normal. 0 ARN de sentido inverso bloqueia a produção do polipéptido codificado pelo seu ARN de sentido complementar.Pensa-se que esta inibição da translação se dá devido à formação de um duplo ARN-ARN que não pode ser transladado. 0 ARN de sentido inverso tem sido utilizado para controlar a produção de dismutase de superóxido manganoso nas células renais embriónicas humanas (Wong e al., Cell 58:923, 1989), percursor da proteína β amilóide nos fibroblastos humanos (Saitoh e al., Cell 58:615, 1989) e carboxilase de bifosfato de ribulose nas plantas do tabaco (Rodermal e al., Cell 55:673). Nos oócitos de Xenopus pensa-se que o ARN de sentido inverso provoca a modificação das moléculas de ARN com as quais combinam e considera-se que esta modificação provoca uma degradação rápida do ARN (Kimelman e al., supra). ARN de sentido inverso e ARNase H endógena têm sido utilizados para bloquear a produção de ciclina em extractos de células de oócitos de Xenopus (Minshull e al., Cell 56:947, 1989). 3 35 t 1 5

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Resumo A invenção apresenta uma molécula de ARN, denominada molécula responsiva de ARN que, quando presente numa célula, responde à presença de outros ácidos nucleícos. Por "responde" quer-se significar que a molécula responsiva de ARN será transladada para formar um ou mais polipéptidos em presença de certos ácidos nucleícos (que podem combinar com o ARN responsivo) e não serão significativamente transladados na ausência de tais ácidos nucleícos. Uma tal molécula responsiva de ARN codificará geralmente uma ou mais moléculas de polipéptidos, cuja produção depende da translação dessa molécula responsiva de ARN. Geralmente, a translação da molécula responsiva de ARN e portanto a produção do polipéptido, não terão lugar em qualquer célula particular, a menos que um ácido nucleíco específico, denominado um ácido nucleíco sinalizador, se encontre também presente no interior da célula. Um ARN responsivo pode ser utilizado para matar ou danificar células específicas de entre uma população de células. Por exemplo, um ARN responsivo codifica uma molécula de toxina que é produzida a partir de ARN responsivo, apenas quando a molécula responsiva de ARN que se encontra no interior de uma dada célula é exposta a ura ácido nucleíco sinalizador, indicativo de um estado (por exemplo, infecção com um virus perigoso tal como o HIV-I) exijindo que a célula seja destruída. Mais especificamente, a molécula responsiva de ARN codifica toxina da cólera e a translação da molécula t responsiva de ARN e produção da toxina da cólera apenas tem lugar quando a molécula responsiva de ARN se encontra presente no interior de uma célula que está infectada com HIV-I. Aqui, uma molécula de ARN específica para o HIV-I serve como ácido nucleíco sinalizador e interactua com a molécula responsiva de ARN para permitir a translação das sequências codificadoras da toxina da molécula responsiva de ARN. 4 35 1 5

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Uma molécula responsiva de ARN é produzida criando-se um ARN codificador de polipéptidos que, na ausência de um ácido nucleíco sinalizador, tem uma estrutura que evita a translação. Um tipo de molécula responsiva de ARN pode dobrar-se para formar um domínio de base emparelhada dentro da sua região codificadora do polipéptido. Tal domínio emparelhado, pela base quando suficientemente estável, bloqueia a translação, ao evitar que a maquinaria translacional de uma célula leia a sequência nucleótida do ARN. Um exemplo específico de uma molécula responsiva de ARN deste tipo, tem um domínio que codifica o polipéptido desejado (ou "exão") e um domínio regulador que não codifica o polipéptido desejado. Dentro do domínio regulador encontra-se uma região, referida como região inibidora, que é complementar em sequência tanto para uma região que fica dentro do exão, referida como região de substrato, como para uma região de um ácido nucleíco sinalizador, referida como uma região anti-inibidora. Na ausêrrcia do ácido nucleíco de sinal, a região inibidora da molécula responsiva de ARN, combina coro a região de substrato da molécula responsiva de ARN, formando um domínio intramolecular emparelhado, pela base, que bloqueia ou reduz a translação. Quando o ácido nucleíco sinalizador se encontra presente, a região anti-inibidora compete com a região de substrato' para a fixação à região inibidora. A formação de um domínio intermolecular emparelhada pela base entre a região anti-inibição do ácido nucleíco sinalizador e a região inibidora do ARN responsivo, evita a formação de uma região emparelhada pela base dentro do exão; nessas circunstâncias o exão pode ser transladado. Um segundo tipo de molécula responsiva de ARN tem pelo menos duas regiões de exão e um intrão que evita a translação dos exões. Este tipo de molécula responsiva de ARN é criado de forma que possa sofrer uma reacção de interligação sob condições desejadas (por exemplo, em presença de uma molécula específica de ARN—o ácido nucleíco 5 35 f í

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Mod. 71 -20.000 ex. - 90f08 20 25 30 sinalizador), que remove o intrão e junta as duas porções que flanqueiam a molécula de ARN que o rodeiam , formando assim uma molécula que pode produzir um polipéptido.É esta regulação desta reacção de interligação que, por sua vez, regula a translação. Este segundo tipo de molécula responsiva de ARN é semelhante ao primeiro tipo de molécula responsiva de ARN pelo facto de ter uma região inibidora que é complementar em sequência, tanto para a região anti-inibidora de um ácido nucleico sinalizador como para uma região de substrato no interior da molécula responsiva de ARN. Neste segundo tipo de ARN responsivo, a região de substrato não faz necessariamente parte de um exão, mas antes contém uma região que é essencial à reacção de auto-inter1igação. Quando a região de substrato é emparelhada pela base à região inibidora, a reacção de auto-interligação não pode dar-se e assim é impedida a translação.Em contraste, quando um ácido nucleico sinalizador se encontra presente, a sua região anti-inibidora combina com a região inibidora do ARN responsivo, formando um domínio intermolecular emparelhado pela base, que evita o emparelharoento intermolécular pela base entre a região inibidora e a região de substrato. Nessas circunstâncias, a região de substrato é livre de participar na reacção de interligação, o intrão é então removido e a translação pode dar-se. Assim, num primeiro aspecto, o invento apresenta uma molécula responsiva de ARN que codifica, num ou mais exões, um polipéptido e que inclui um domínio regulador, uma região de substrato e um ponto de fixação do ribosoma. Esta molécula responsiva de ARN tem uma região inibidora no domínio regulador, domínio regulador esse que é separado dos exões e complementar, tanto a uma região de substrato da molécula responsiva de ARN como a uma região anti-inibidora de um ácido nucleico sinalizador, de tal forma que, na ausência do ácido nucleico sinalizador, as regiões de substrato e inibidora formam domínio emparelhado pela base, 6 35 ϊ 1 5

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Mod. 71 - 20.000 «. - 90/08 20 t 25 30 domínio esse cuja formação reduz o nível de translação de um dos exões na molécula responsiva de ARN, em comparação com o nível de translação desse exão quando observado na presença do ácido nucleíco sinalizador. A região anti-inibidora do ácido nucleíco sinalizador é complementar em sequência com a região inibidora da molécula responsiva de ARN, de forma que, quando a região anti-inibidora é emparelhado pela base com a região inibidora, a translação de um exão da responsiva é aumentada em comparação com o nível de translação desse exão observado na ausência do ácido nucleíco sinalizador. 0 "domínio regulador" é uma região da molécula responsiva de ARN que regulará o nivel de translação da molécula responsiva de ARN, dependendo da presença do ácido nucleíco sinalizador. Um "ponto de fixação do ribosoma" é uma região de uma molécula de ARN que é necessária para que a translação se inicie num determinado codão AUG. Tal ponto é reconhecido por um ribisoma e fixado pelo ribosoma antes da iniciação da translação do ARN. 0 "ácido nucleíco sinalizador" é um ácido nucleíco (por exemplo, um ARN virai) que é indicativo de um estado sob o qual é desejável produzir-se o polipeptido codificado pela molécula responsiva de ARN. Um domínio "emparelhado pela base" é uma região sobre a qual os nucleótidos de duas regiões de ácido nucleíco são ligados uns aos outros pelo hidrogénio. 0 termo inclui a ligação de menos do que a totalidade dos nucleótidos contíguos de tais regiões. A "região de substrato" é uma região da molécula responsiva de ARN que, quando emparelhado pela base, reduz o nível de translação de um ou mais dos exões existentes na molécula responsiva de ARN. A "região inibidora" é uma região da molécula responsiva de ARN que, quando emparelhado pela base com a região de substrato, reduz o nivel de translação de um ou mais exões na molécula responsiva de ARN. 7 35 1 5

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A "região anti-inibidora" é uma região do ácido nucleíco sinalizador que, quando .emparelhado pela base com a região inibidora, aumenta o nivel de translação de um ou mais exões da molécula responsiva de ARN, em comparação com a observada na ausência da molécula ácido nucleico sinalizador. Estas três regiões interactuam para regular o nível de translação da molécula responsiva de ARN e são escolhidas para assegurarem níveis adequados de produção de polipeptido, dependente da presença do ácido nucleíco sinalizador. Por "nível apropriado” quer-se significar que, na ausência de ácido nucleico sinalizador, o nível de polipeptido é suficientemente baixo para ter pouco ou nenhum efeito sobre a fisiologia da célula e na presença do ácido nucleíco sinalizador o nivel de polipeptido é suficientemente elevado para afectar a célula.0 nível de translação do ARN responsivo pode ser determinado por meio de processos normalizados. Geralmente, um nivel baixo de translação é aquele em que menos de 0,1% do polipeptido produzido por uma célula é polipeptido codificado pela molécula responsiva de ADN. Era formas de realização preferidas, a região de substrato inclui parte de um dos exões; parte de um intrão adjacente à extremidade 5'- de um exão; e parte do ponto de fixação do ribosoma. Conforme aqui utilizado, um "intrão" é um domínio da molécula responsiva de ARN que está separado dos exões e do domínio regulador. Numa outra forma de realização preferida, a molécula responsiva de ARN é purificada. Ainda numa outra forma de realização preferida, o ARN responsivo codifica um polipeptido que interfere com a viabilidade da célula, com a proliferação celular, com a transcrição do ARN, com a translação do ARN ou cora a replicação do ARN. Numa forma de realização mais preferida, a molécula responsiva de ARN codifica um polipeptido que tem actividade de toxina de difteria ou actividade de ribonuclease. Por "ARN purificado" 8 35 1 5

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quer-se significar ARN isolado de um ambiente em que ocorre naturalmente. Por exemplo, o ARN encontra-se presente numa célula em que não ocorre naturalmente. Alternativamente, é proporcionado como único ácido nucleíco presente numa solução. Noutras formas de realização preferidas, o intrã0 reduz o nível de translação de um dos exões, era comparação com o nível de translação desse exão na ausência do intrão; o intrão encontra-se localizado entre o ponto de fixação do ribosoma e o exão mais próximo do ponto de fixação do ribosoma; o intrão encontra-se localizado entre dois dos exões; e o intrão inclui na sua extremidade 5'- uma junção de agregação 5'- e na sua extremidade 3'- uma junção de agregação 3'-. Numa forma de realização ainda mais preferida, o intrão cataliza duas reacções de clivagem, uma dentro da junta de agregação 5'- e uma dentro da junta de agregação 3'-. Numa forma de realização ainda mais preferida, o intrão é um intrão auto-agregável. Ainda numa outra forma de realização preferida, a região de substrato inclui a junção de agregação 5'- do intrão. Em formas de realização mais preferidas, a região inibidora, quando emparelhado pela base com a região de substrato, interfere com a reacção de clivagem dentro da junção de agregação 5'-, em comparação com quando a região inibidora não é emparelhado de base com a região de substrato; o ácido nucleíco sinalizador é· de cadeia única; o ácido nucleíco sinalizador é um ADN virai. Por "junção de agregação 5'-" entende-se a sequência da ewxtremidade 5'- de um intrão que é necessário para uma reacção de agregação. Por "junção de agregação 3'-" quer-se significar a sequência da extremidade 3'- de um intrão que é necessária para uma reacção de agregação. Tais junções de agregação são, por exemplo, parte de um intrão auto-agregável tal como os equivalentes à sequência 9 35

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Mod. 71 -20.000 ex. - 90|08 20 I 25 30 interveniente do Tetrahymena thermophilia. Um "intrão auto-agregável" é um pedaço de ARN que contém todas as sequências necessárias para que o intrão se excise por si mesmo de um pedaço maior de ARN e para juntar os dois pedaços de ARN que flanqueavam o intrão antes da reacção de excisão. Quer dizer que o intrão é capaz de clivar e ligar duas porções de uma molécula de ARN. Num aspecto relacionado com este, a invenção apresenta um método para regular a expressão dos polipeptidos numa célula que é portadora de um ácido nucleíco sinalizador, por meio da introdução de uma molécula responsiva de ARN, conforme descrita acima, no interior de uma célula. Num aspecto relacionado, a invenção apresenta uma molécula de ADN que codifica uma molécula responsiva de ARN. Descrição de formas de realizac;ão_jBr.eferidas Primeiramente faz-se uma breve descrição dos desenhos. Breve Pescricão dos Desenhos As Figs. 1, IA e 1B são desenhos esquemáticos de uma molécula responsiva de ARN. A linha a cheio representa um exão, uma série de linhas verticais curtas indicam um domínio emparelhado pela base e as caixas acima e abaixo dessas linhas indicam várias características da molécula de ARN. Especificamente, na Fig.lA, o ARN responsivo está desenhado de forma a representar o emparelhamento pela base intramolecular que evita a translação; e na Fig. 1B, a molécula responsiva de ARN está representada como combinada com um ácido nucleíco sinalizador. As Figs. 2, 2A, 2B e 2C são desenhos esquemáticos de uma molécula responsiva de ARN que inclui um intrão auto-agregável. A linha tracejada representa um intrão auto-agregável, a linha a cheio representa um exão, uma série de linhas verticais curtas indica um domínio emparelhado pela 10 35

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1 base e as caixas acima e abaixo dessas linhas representam várias características do ARN. Especificamente, na Fig. 2A a molécula responsiva de ARN está desenhada de forma a 5 representar o emparelhamento pela base intramolecular que impede a auto-agregação; na Fig. 2B a molécula responsiva de ARN está representada como combinada com um ácido nucleíco sinalizador; e a Fig. 2C representa a molécula inter-agragada produzida pela reacção de auto-agregação.

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Moléculas responsivas de ARN Moléculas responsivas de ARN estão descritas acima de uma forma geral. Abaixo são apresentados exemplos específicos para ilustrar essas moléculas para os técnicos do ramo. Estes exemplos não são limitativos desta invenção. EXEMPLO 1: Um primeiro tipo de molécula responsiva de ARN está ilustrado na Fig.l. Uma porção dessa molécula, o exão, codifica um polipeptido cuja produção apenas é desejada em presença de um ácido nucleíco sinalizador. Uma segunda porção desta molécula, o domínio regulador, não codifica um polipéptido. 0 domínio regulador inclui uma região inibidora que é complementar em sequência de uma região de substrato no interior do exão. A região inibidora pode ser emparelhado pela base com a região de substrato para formar um domínio emparelhado pela base que bloqueia a translação do exão. Referindo a Fig.l, a molécula responsiva de ARN 10 tem as extremidade 5'- 12 e extremidade 3'- 14; domínio regulador 16 com a extremidade 5' - 12; e exão 18 com a extremidade 3' - 14. Dentro do domínio regulador 16 encontra- -se uma região inibidora 20; dentro do exão 18 encontra-se uma região de substrato 22. Imediatamente em 5'- do exão 18 encontra-se o ponto de fixação do ribosoma 21 e o codão de iniciação AUG 23. Referindo-se a Fig. IA, a região inibidora 20 11 35 r j 64.345 Ref:' 193/231 - Portugal 1 combina com a região' de substrato 22 para formar o domínio emparelhado pela base 28. Tal emparelhamento pela base com a molécula responsiva de ARN 10 inibe a translação do exão 18 da molécula responsiva de ARN. 5 A inibição da translação é retirada pela presença de um ácido nucleíco sinalizador, de que uma região, referida como a região anti-inibidora, é complementar de uma região inibidora do ARN responsivo. A região anti-inibidora do ácido nucleíco sinalizador compete com a região de substrato da· 10 § molécula responsiva de ARN para combinação (emparelhamento pela base) com a região inibidora da molécula responsiva de ARN. Nestas circunstâncias não há formação de pares de base dentro do exão, dá-se a translação e é produzido o polipéptido desejado. 71 - 20.000 ex.-90/08 Ol Por exemplo, com referência à Fig. 1B, o ácido nucleíco sinalizador 30 tem uma extremidade 3'- 32, uma extremidade 5'- 34 e uma região anti-inibidora 36, complementar em sequência da região inibidora 20 da molécula responsiva de ARN 10. A combinação da região anti-inibidora 1 20 36 com a região inibidora 20 forma o domínio emparelhado pela base 38 e reduz a extensão da combinação da região inibidora 20 com a região de substrato 22. Nestas circunstâncias pode * ocorrer a translação do exão codificador de polipéptido 18. Dado que a região inibidora do ARN responsivo tem 25 de ser complementar, tanto da região de substrato do ARN responsivo como da região anti-inibidora do ácido nucleíco alvo, as sequências dessas três regiões devem ser escolhidas de forma a permitirem uma regulação adequada da translação do ARN responsivo. Isso não significa que a sequência da região 30 de substrato tenha de ser idêntica à sequência da região anti-inibidora. Nenhum dos dois domínios alternativos 35 emparelhados pela base que se podem formar necessita de estar perfeitamente emparelhado pela base (isto é, todas as bases contíguas ao longo dos domínios serem emparelhados pela base), nem têm de ter o mesmo comprimento. Há flexibilidade

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para a selecção da região anti-inibidora, desde que a região seja suficientemente específica para indicar quando deve ocorrer a translação. Por exemplo, se o sinal a que o ARN responsivo responde fôr a presença de HIV-I no interior de uma célula, poderá ser escolhida qualquer sequência específica de ácido nucleíco do HIV-I e evidentemente fica-se limitado à êscolha de uma sequência de ácido nucleíco presente no HIV-I. A sequência da região de substrato é escolhida para criar uma molécula responsiva de ARN que produz um polipeptido biologicamente activo. Dado que a região de substrato está dentro de ura exão, qualquer modificação da sua sequência deve preservar uma quantidade significativa de actividade do polipeptido codificado. A degeneração do código genético permite modificações na sequência do exão que não afecta a sequência do polipeptido codificado. Dado que a guanosina pode emparelhar pela base com a uridina bem como cora a citosina, há uma flexibilidade adicional nas sequências que podem ser usadas. Além disso, dado que as modificações conservativas de amino-ácido numa ou mais posições das proteínas, frequentemente não eliminam a actividade da proteína, o número de sequências úteis aumenta substancialmente. 0 domínio emparelhada pela base formado por combinação da região inibidora com a região de substrato, · tem de ser suficiente mente estável, por forma a não ser rompido por ácidos nucleícos diferentes do ácido nucleíco sinalizador, que podem também encontrar-se presente na célula. Por exemplo, se a região inibidora e a região de substrato forem complementares apenas ao longo de quatro nucleótidos contíguos, qualquer ácido nucleíco de cadeia única que inclua essa sequência de quatro bases poderá competir com a região de substrato para a combinação com a região inibidora e se o ácido nucleíco que inclui essa sequência estiver presente numa concentração suficientemente elevada, a inibição da translação será retirada. Geralmente, 13 35 1 5

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o domínio emparelhada pela base formado pela combinação da região de substrato com a região inibidora deverá incluir pelo menos 12 e de preferência 15 nucleótidos contíguos, para que a molécula responda apenas ao ácido nucleíco sinalizador. A molécula responsiva de ARN pode incluir uma região que permita que o ácido nucleíco sinalizador seja mais facilmente combinado com a região inibidora. Esta região adicional é chamada uma região de nucleação e consiste num numero de nucleótidos iraediatamente adjacentes à região inibidora e complementares a uma porção do ácido nucleíco sinalizador, a extensão anti-inibidora, de tal forma que a região de nucleação e a inibidora formem, em conjunto, uma região de complementaridade prolongada com o ácido nucleíco sinalizador. A região de nucleação não é,. geralmente, complementar de qualquer região imediatamente adjacente à região de substrato. A região de nucleação proporciona uma região de cadeia única que fica prontamente disponível para a combinação com o ácido nucleíco sinalizador. 0 emparelhamento pela base entre a região de nucleação e a extensão anti-inibidora tenderá a favorecer a deslocação da região de substrato para longe da região inibidora ao posicionar correctamente a região anti-inibidora para a combinação com a região inibidora. Além disso, a formação de pares de bases entre tal região de nucleação e a extensão anti-inibidora aumentará a estabilidade do domínio intermolecular emparelhada pela base, tanto num sentido absoluto como num sentido relativo - em comparação com a região emparelhada pela base formada pela região inibidora e pela região de substrato. 0 domínio regulador pode também incluir uma região que desfavorecerá a combinação de ácidos nucleícos não específicos (isto é, ácidos nucleícos diferentes do ácido nucleíco sinalizador) com o domínio regulador. Esta região, referida como uma repetição invertida, fica dentro 14 35 1 5

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do domínio regulador mas fora da região inibidora. A repetição invertida pode dobrar-se e emparelhar pela base para formar uma estrutura em gancho que tem o efeito de limitar os pontos em que o emparelharaento pela base pode dar-se dentro do domínio regulador. A natureza pormenorizada da região inibidora, da região de substrato e da região anti-inibidora dependerá, em parte, do rigor com que a translação deverá ser regulada. Quanto ma is estável o domínio intramolecular emparelhado pela base formado por combinação da região inibidora com a região de substrato, mais translação será inibida. Para duplas ARN-ARN, a estabilidade de um domínio emparelhado pela base depende do número de factores que inclui o número de nucleótidos de facto emparelhado pela base dentro de uma região contígua de nucleótidos, o número de pares mal formados dentro de um domínio geralmente emparelhado pela base e a composição de nucleótidos do domínio emparelhado pela base. Uma consideração adicional, que apenas se aplica à formação de pares de bases intramoleculares, é o número de nucleótidos que ficam entre as duas regiães a serem emparelhadas pela base; quando o numero de nucleótidos é relativamente pequenos, tensóes do tipo torçional podem impedir a formação de bases emparelhadas. Os técnicos estão bem conscientes de como estes parâmetros podem ser ajustados para se obterem domínios emparelhado pela base mais ou menos estáveis. A estabilidade do domínio emparelhado pela base intramolecular pode ser ajustada, dependendo do nivel de translação que seja desejado a qualquer nível de ácido nucleíco sinalizador. Sendo todos os outros factores iguais, o nível geral de trans--lação dependerá da proporção de moléculas responsivas de ARN em que a região inibidora está combinada com a região de substrato. Esta proporção, em presença do ácido nucleíco sinalizador, depende da proporção de moléculas responsivas de ARN em que a região inibidora se encontra combinada com a 15 35 «F 64.345 Ref: 193/231 - Portugal

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Mod. 71 - 20.000 e*. - 90/08 20 25 região anti-inibidora do ácido nucleíco sinalizador. Os técnicos do ramo apreciarão que a quantidade de cada domínio emparelhado pela base que se forma, depende da estabilidade relativa dos dois domínios emparelhada pela base, bem como da quantidade de ácido nucleíco sinalizador e ARN responsivo presentes numa determinada célula. Se uma molécula altamente tóxica fôr codificada pelo ARN responsivo, será necessária uma regulação muito apertada. Por exemplo, se fôr codificada a toxina do cólera apenas são necessárias algumas moléculas para matar uma célula. Neste caso, a translação tem de ser completamente inibida na ausência de ácido nucleíco sinalizador. Isto é melhor assegurado se se tiver uma complementaridade quase completa entre as regiões de substrato e inibidora, por exemplo, 85% de complementaridade duma região de 20 nucleótidos. A expressão apenas se dá quando um ARN sinalizador altamente complementar, como por exemplo 100% de complementaridade com a região inibidora ao longo de uma região de 25 nucleótidos, se encontra presente. Neste exemplo, a região inibidora encontra-se do lado 5'- do exão, mas a molécula responsiva funcionará igualmente bem se a região inibidora estiver localizada no lado 3'- do exão . Se’a molécula responsiva de ARN fôr sujeita a degradação exonucleótica, isso deverá ser tomado em consideração quando se criar a molécula. Assim, se a molécula fôr degradada com início na extremidade 5'- será melhor localizar a região inibidora na extremidade 3'- da molécula a fim de se evitar a formação de uma molécula que contenha todas as sequências necessárias para a translação mas a que falte a região inibidora. 30 templo 2: Molécula responsiva de ARN com intrão auto-agregável Um segundo tipo de molécula responsiva de ARN inclui um intrão auto-agregável que impede a produção do desejado polipéptido. 0 intrão pode ser removido por meio 35 16 1 5

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de uma reacção de agregação e a molécula agregada é capaz de codificar o polipéptido desejado. Um ácido nucleíco Sinalizador regula a translação deste tipo de molécula responsiva de ARN mas a regulação é conseguida indirectarnente por meio da utilização de ácido nucleíco sinalizador para regular a reacção de agregação. Para que este tipo de regulação funcione a molécula responsiva de ARN deve, na ausência do ácido nucleíco sinalizador, dobrar-se de maneira a formar um domínio emparelhado pela base que impede a agregação. Na presença do ácido nucleíco sinalizador forma-se um domínio emparelhado pela base intermolecular e dá-se a agregação. Um exemplo deste segundo tipo de . molécula responsiva encontra-se ilustrado na Fig.2. Esta molécula tem um intrão localizado entre o ponto de fixação do ribosoma e o codão AUG de um único exão que codifica um polipéptido. Este intrão evita a translação porque impede um ribosoma de simultaneamente reconhecer o ponto de fixação do ribosoma e o codão AUG. Neste exemplo, o intrão é um intrão auto--agregável derivado de pré-ARNr de Tetrahymena. Os intrães detes tipo podem dobrar-se numa estrutura que causa duas reacçães de clivagem, uma de cada lado do intrão e uma reacção de ligação que junta as porçães da molécula do ARN que flanqueiam o intrão. Um passo essencial na auto-agregação· de tais intrães é a combinação de uma região do intrão, referida como uma junção de agregação 5'-, cora uma segunda região do intrão, referida como uma sequência de guia interna. Assim, a actividade auto-agregável do intrão pode ser regulada para impedir a combinação da junção de agregaçã0 5'- com a sequência de guia interna. A molécula responsiva de ARN representada na Fig.2 tem um domínio regulador que é distinto tanto de um intrão auto-agregável como de um exão. Este domínio regulador tem uma região inibidora que é complementar da região de substrato que, neste tipo de molécula responsiva de ARN inclui a junção de agregação 17 35 ♦ c 10i 15 64.345 Ref: 193/231 - Portugal

Mod. 71 · 20.000 ex. - 90/08 20 t 25 30 5'- do intrão auto-agregável. A formação de pares de bases intramoleculares entre a região inibidora e a região de substrato impede a combinação da Junção de agregação 5'-com a sequência de guia interna e impede-se a agregação. Esta molécula responsiva de ARN é criada de forma que a região inibidora seja também complementar da região anti--inibidora do ácido nucleíco sinalizador. Assim, em presença do ácido nucleíco sinalizador, a região inibidora combina-se com a região anti-inibidora, libertando a junção de agregação 5- para participação na reacção de auto-agregação. Referindo-se a Fig.2, a molécula responsiva de ARN 40 tem as extremidades 5'- 42 e 3'- 44. Adjacente à extremidade 5'- 42 encontra-se o domínio regulador 46, adjacente ao qual se encontra o intrão auto-agregável 48 e depois o exão codificador de polipéptido 50. 0 intrão auto-agregável 48 fica, assim, entre o domínio regulador 46 e o exão 50 e é flanqueado no seu lado 5'por um ponto de fixação do ribosoma 56 e do seu lado 3' por um codão AUG 66. Uma região inibidora 52, dentro do domínio regulador 46 é complementar da região de substrato 54 na junção entre o domínio regulador 46 e o intrão auto-agregável 48 e inclui parte do domínio regulador 46 e do intrão auto-agregável 48. Dentro do domínio regulador 46, do lado 3'- da região inibidora 52, encontra-se a região de nucleação 45, que é contígua da região inibidora e complementar de uma região do ácido nucleíco sinalizador iraediatamente adjacente à região anti-inibidora referida como a extensão anti--inibidora. A região reguladora inclui também uma repetição invertida 47 do lado 5'- da região inibidora. A região de substrato 54 inclui o ponto de fixação de ribosoma 56, a junção de agregação 5'- 58 e a região estabilizadora 60. 0 intrão auto-agregável 48 inclui a junção de agregação 5'- 58, a sequência de guia interna 62 e a junção de agregação 3'- 64 que é adjacente ao codão AUG 66 dentro do exão 50 . Referindo-se a Fig. 2A, quando a região inibidora 18 35 i. * 1 5 10

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30 52 combina com a região de substrato 54, forma-se o domínio emparelhado pela base 70, impedindo a junção de agregação 5'- 58 de interagir com a sequência de guia interna 62. A repetição invertida 47 pode formar pares de base de forma a criar um, gancho estabilizador emparelhado pela base 63. Na presença de um ácido nucleíco sinalizador, forma-se um domínio intermolecular emparelhado pela base entre as regióes de extensão inibidora e anti-inibidora do ácido nucleíco sinalizador e as regiães inibidora e de nucleação da molécula responsiva de ARN. Essa interacção liberta a junção de agregação 5'- permitindo-lhe que interactue com a sequência de guia interna. Em tais circunstâncias dá-se uma reacção de autro-agregação. Assim, coro referência à Fig. 2B, o ácido nucleíco sinalizador 71, com uma extremidade 3'- 72 e uma extremidade 5'- 73 inclui uma região anti-inibidora 74 e uma extensão anti-inibidora 77 que combinam, respectivamente, com a região inibidora 52 e a região de nucleação 45, formando o domínio emparelhado pela base 75. Esta interacção permite que se dê uma reacção específica de auto-agregação. Embora não esteja ilustrada, a interacção entre o ácido nucleíco sinalizador e o domínio regulador, liberta a junção de agregação 5'-, permitindo-lhe que interactue com a sequência de guia interna e nessas circunstâncias pode ocorrer uma reacção de auto-agregação. A reacção de auto--agregação remove todo o intrão auto-agregável com excepção de uma pequena porção da junção de agregação 5'- e uma pequena porção da junção de agregação 3'- que, juntas, formam uma junção de agregação fundida. A molécula agragada pode agora produzir o polipéptido codificado porque o ponto de fixação do ribosoma se encontra agora em justaposição próxima com o codão AUG do exão, permitindo que um ribosoma reconheça o codão AUG como primeiro codão de um polipéptido. Referindo-se a Fig. 2C, a molécula agragada 90 19 35 64.345 Ref: 193/231 - Portugal

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Mod. 71 - 20.000 ex. 20 I 25 30 inclui extremidade -5'- 42, extremidade 3'- 44, domínio regulador 46, exão 50, ponto fixador do ribosoma 56, codão AUG 66 e junção de agregação fundida 95. Qualquer intrão que se saiba que possui uma actividade auto-agregável pode ser adaptado para uso como molécula responsiva de ARN. Ura ARN auto-agregável adequado pode ser derivado de um pré-ARNr nuclear de Tetrahymena, o pré-ARNr mitocôndrico de Saccharomyces e Neurospora e o pré-ARNm mitocôndrico de Saccharomyces ou outros ARNs auto-agragáveis do grupo I equivalentes. Intróes do grupo II podem também ser usados nesta invenção, ou qualquer ARN que tenha pelo menos actividade de clivagem de ARN. A actividade de ligase de ARN pode ser proporcionada por outras moléculas de ARN ou seus equivalente. Uma vez que tenha sido seleccionado o ARN auto-agregável, deve ser posicionado correctamente entre o ponto de fixação do ribosoma e o codão AUG de início do polipéptido codificado, de forma que após a reacção de auto-agregação ter ocorrido o ponto de fixação do ribosoma é posicionado correctamente em relação ao codão AUG. Nos eucariotes, a translação começa geralmente no codão AUG ma is 5' de um ARN coberto, desde que a sequência que rodeia o AUG se conforme com A/GNNAUGG. Consequentemente, a molécula responsiva de ARN tem de ser criada de forma que esta sequência apenas apareça depois da agregação se ter dado. Numa variação deste tipo de molécula responsiva de ARN o intrão auto-agregável é colocado de forma a interromper uma região codificadora da proteína. Se o intrão incluir um codão de paragem, a translação será bloqueada. Mesmo se o intrão não codificar um codão de paragem, pode ser criado de forma a adicionar amino ácidos ao polipéptido que destruirá a sua actividade. A remoção de um tal intrão resulta na formação de um exão intacto capaz de ser transladado para gerar um polipéptido com a desejada actividade. 20 35 1 5

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A exigência de que a região inibidora seja complementar, tanto da regicfo anti-inibidora como da região de substrato coloca certas restrições às sequências dessas regiões; não obstante, conforme discutido acima, no primeiro exemplo, a região de substrato não tem de ter a mesma sequência que a região anti-inibidora do ácido nucleíco sinalizador. No exemplo em causa, a região de substrato tem de incluir uma junção dê agregação 5'-utilizável; esta exigência coloca restrições à sequência da região inibidora e consequentemente, na sequência da região anti-inibidora. Dado a anti-inibidora fazer parte do ácido nucleíco sinalizador, essa restrição pode ser acomodada por meio de uma escolha cuidadosa de sequências. A junção de agregação 5'- mínima num intrão de ARNr de Tetrahymena tem apenas quatro nucleótidos de comprimento. Dado que qualquer sequência de quatro nucleótidos poderá ocorrer com uma probabilidade de 1/64, muitas regiões anti--inibidoras potenciais incluirão a sequência da junção de agregação 5'-. É muito provável que muitas sequências diferentes de quatro bases possam servir como junção de agregação 5'-, desde que a sequência da região de guia interna seja ajustada para receber as modificações na junção de agregação 5'- (Zaug e al., Nature 324:430, 1986). Embora seja adequado que a junção de agregação 5'- mínima possa emparelhar pela base com a sequência de guia interna, um complexo com um único mau emparelhamento poderá ser funcional (Zaug e al., Biochemistry 27:8924, 1988). 0 domínio emparelhado pela base formado por combinação da região inibidora e da região de substrato tem de ser ma is estável do que o domínio emparelhado pela base que se forma entre a junção de agregação 5'- e a sequência de guia interna, durante a reacção de agregação. Isso pode conseguir-se por meio da escolha de uma região inibidora e de uma região de substrato que combinarão para formar um domínio emparelhado pela base mais longo do que os cerca 21 35 é l 1 5

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25 30 de quatro a seis pares de base formados por combinação da junção de agregação 5'- com a sequência de guia interna. A região de substrato é criada para incluir uma região estabilizadora que prolonga a homologia entre a região de substrato e a sequência da região inibidora para lá da junção de agregação 5'-. Esta região estabilizadora pode ser localizada precisamente a 5' da junção de agregação 5'- como no exemplo presente. No caso de tais intrães auto-agre-gáveis localizados entre o ponto de fixação do ribosoma e o codão AUG, pode ser preferível localizar a região estabilizadora precisamente a 3' da junção de agregação 5'-. Este arranjo assegura que o domínio estabilizador será removido como parte de uma reacção de agregação e não interferirá com a relação entre o ponto de fixação do ribosoma eo codão AUG. 0 ponto de fixação do ribosoma pode também ser incluido na região que emparelha pela base com a região inibidora, mas nada obriga a que assim seja. No caso de um intrão auto-agregável que esteja inserido entre exães que codificam porçães do mesmo polipéptido, a região estabilizadora deverá preferivelmente estar localizada dentro do intrão, isto é, do lado 3' da junção de agregação 5'-, de forma que a reacção de agregação removerá o estabilizador juntamente com o resto do intrão. É importante que o domínio emparelhado pela base inibidor/substrato, apenas seja rompido pelo ácido nucleíco sinalizador e não por outros ácidos nucleícos presentes na célula. Conforme discutido acima no primeiro exemplo, isso significa que a formação do domínio emparelhado pela base intramolecular tem de ser suficientemente extensa para apenas ser rompida por uma única sequência de ácido nucleíco. Evidentemente que qualquer aumento da estabilidade do domínio emparelhado pela base inibidor/substrato torna mais difícil que a região anti-inibidora de se combinar com a região inibidora. Conforme esboçado acima, esta dificuldade pode ser ultrapassada por meio da inclusão de uma região de 22 35 15

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nucleação adjacente à região inibidora; isso favorecerá a combinação da região inibidora com a região anti-inibidora. No exemplo acima descrito, o domínio regulador, o intrão auto-agregável e o exão, encontram-se numa ordem particular; este arranjo particular não é apenas um arranjo útil. Conforme notado acima, o intrão auto-agregável pode estar localizado entre dois exães; nessas circunstâncias, o exão mais 5'- da molécula não interligada pode ser transladado, mas não pode ser produzido um polipéptido funcional completo. A região inibidora pode estar localizada no lado 5'- ou no lado 3'- do intrão auto-agregável. Dado que o ARN é sintetizado na direcção de 5' para 3', é preferível localizar a região inibidora no lado 5'-, de forma que o inibidor possa ser sintetizado e ter uma oportunidade de se combinar com a junção de agregação 5'-, antes da produção da sequência de guia interna. 0 inibidor pode estar localizado no lado 3'- do intrão auto-agregável se a dobragem do ARN para formar o complexo de agregação fôr lenta em comparação com o ritmo de síntese da região inibidora. Prefere-se que a reacção de auto-agregação seja específica e precisa; se a agregação ocorrer na localização indevida, o ponto de fixação do ribosoraa será posicionado incorrectamente. No caso de ura intrão auto-agregável localizado entre dois exães, a agregação incorrecta pode resultar numa fusão forã do quadro das sequências codificadoras do polipéptido. Os intrães auto-agregáveis em que a distância entre a sequência de guia interna e a junção de agregação 5'- é relativamente pequena, tendem a catalisar reacçães de agregação mais precisas. É também importante assegurar a não existência sequências que sejam reconhecidas como junçães de agregação 5'- alteradoras na região 5' da verdadeira junção de agregação 5'-. As moléculas responsivas de ARN acima descritas podem ser preparadas por meio de qualquer metodologia 23 35 1 5

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Em muitos casos não há maneira de evitar a infecção virai de tais células. As moléculas da invenção permitirão a criação de linhas de células que são resistentes a qualquer virus dado em que quaisquer células que fiquem infectadas serão destruídas antes do virus ter possibilidade de se transmitir a outras células. Esta seção descreve os métodos pelos os quais um ARN responsivo pode ser usado para afectar o estado fisiológico ou a viabilidade de um determinado tipo de célula. No caso de moléculas responsivas de ARN que são reguladas pela formação de um domínio emparelhado pela base dentro de um exão, o método exige a construção de um ARN responsivo que codifica uma proteína que afectará a fisiologia ou viabilidade de uma célula e identificação de um activador ARN (ácido nucleíco sinalizador) que seja específico para o tipo de célula, isto é, uma molécula de ARN que transporta uma sequência nucleótida que apenas está presente ou é acessível numa população de ARN do tipo de célula que é para ser afectado. Para as moléculas responsivas de ARN reguladas por intróes auto-agregaveis, o método requer a construção de um ARN responsivo que codifique uma proteína que vai afectar a fisiologia ou viabilidade de uma célula. A proteína activa tem de ser codificada pela mensagem não agragada. Requer também a identificação de uma molécula de ARN que transporta uma sequência de nucleótidos que apenas está presente ou é acessível na população de ARN do tipo de célula que deve ser af ectado. Por exemplo, um ARN responsivo pode ser criado para matar específicamente: células infectadas por virus que contenham ARN virai e não células não infectadas; células contendo ARN mutante e não células contendo ARN do tipo natural; células de um tecido ou orgão particulares e não outros tipos de células; ou células neoplásicas ou cancerosas e não células contendo ARN celular normal. 24 35 1 5

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normal. 0 ARN pode, por exemplo, ser produzido por transcrição de uma molécula de ADN, seja in vitro seja in vitro. Geralmente a molécula de ARN será produzida por construção de um ADN de plasmídeo ou virai que inclui sequências que codificam a molécula respons.iva, sequências apropriadas para transcrição regulada da molécula responsiva de ARN e sequências apropriadas para a replicação da ADN. São descritos acima critérios importantes para moléculas responsivas de ARN. De um ponto de vista prático é preferível primeiro identificar e sequenciar um intrâfo auto-agregável. Esta sequência pode então ser modificada para gerar uma molécula responsiva de ARN. Por exemplo, o ADN que codifica o intrão auto-agregável pode ser isolado utilizando-se a reacção de cadeia de polimerase e de iniciadores apropriados. 0 ADN que codifica o intrão pode então ser agregado ao ADN que codifica o desejado polipéptido. Uma sequência de adição de ADN que vai servir como domínio regulador pode também ser adicionado. A junção de agregação 5'- e a sequência de guia interna podem então ser modificadas, dentro dos limites acima descritos, de forma que a junção de agregação 5'- seja complementar ao domínio inibidor. Se necessário, os pontos de nucleação e as repetiçães invertidas podem ser criadas no interior do domínio regulador. Esta molécula de ADN pode portanto ser usada para gerar ARN conforme descrito acima. ptilisftçga,

As moléculas responsivas de ARN da invenção são úteis para a produção de células que respondem à presença de um dado virus. Particularmente, no caso de cultura in vitro em larga escala para produção comercial de compostos biológicos, a contaminação virai é um problema grave que pode levar à destruição de toda a cultura, 25 35 10

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Ref: 183/231 - Portugal A eficácia de um tal ARN responsivo para a alteração do estado fisiológico de uma célula, dependerá de diversos factores, incluindo: o ARN responsivo ser administrado à localização na célula onde o ARN activador (isto é, o ácido nucleíco sinalizador) reside; o ARN responsivo ter todas as sequências de nucleótidos necessárias para todos os processos que levam à produção da proteína codificada incluindo agregação, adição de poli-A, sobreposição, transporte através da membrana nuclear e fixação do ribosoma; e o ARN responsivo ter elementos de sequência que lhe confiram estabilidade dentro do citoplasma (e talvez no núcleo).

Uma molécula responsiva de ARN pode ser introduzida no interior de uma célula sob a forma de ARN ou sob a forma de um gene feito de ADN ou ARN (isto é, um retrovirus). A introdução de ARN numa célula pode ser efectuada por meio de injecção com uma agulha, ou por meio da utilização de liposonas, incluindo os feitos de lípidos catiónicos. 0 fornecimento do ARN sob a forma de gene pode ser conseguido por meio da utilização de um virus não virulento. Isso requer a inserção do conjunto ARN responsivo-gene codificador, juntamente com os elementos sinalizadores transcritores ou replicativos,. no genoma do virus. Tem sido criados retrovirus, virus polioma e virus de vacina que são capazes de introduzir e expressar genes e outros virus poderão ser desenvolvidos e usados para esse fim.

Outro método geral de utilização de um ARN responsivo para controlar a fisiologia de um tipo particular de célula, envolve um gene responsivo de ARN integrado no genoma da célula. A activação da agregação do ARN responsivo poderá portanto ser causada por polinucleótidos adicionados exogenamente. 26 r s- 64.345 Ref: 193/231 - Portugal 1 Lisboa ,27 M1992 5 Por UNITED BIOCHEMICAL CORPORATION Λ 10 1 ENG." MANUEl MONIZ PEREIRA Adjunto do AOPI Eng.° Vasco leite Arco da Conceição, 3-1.° - 1100 LISBOA 15 s s X V Mod. 71 - 20.00 IO O 1 25 • 30 35

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Claims

* >0 ' 64.345 Eef: 193/231 - Portugal a ^Αβή ί?7·Μΐ9921 ^ 1 REIVINDICAÇÕES δ lã. - Molécula responsiva de ARN com um ponto de fixação do ribosoma, um domínio regulador, uma região substrato e codificando, num ou roais exães, um polipéptido; sendo o referido domínio regulador constituído por uma região inibidora que está separada dos referidos um ou mais exães e é complementar à referida região substrato; podendo as 10 1 referidas regides inibidora e substrato, formar um domínio de base emparelhada, na ausência de um ácido nucleíco de sinal; caracterizada por a formação do referido domínio de base emparelhada reduzir o nivel de translação de um dos referidos exdes na referida molécula responsiva ao ARN, em comparação com o nivel de translação de um dos referidos exôes na 1. 71 - 20.000 ex. - 90/08 σϊ ausência de formação do referido domínio de base emparelhada; tendo o referido ácido nucleico de sinal uma região anti-inibidora complementar à referida região inibidora que, quando emparelhada pela base com a referida região inibidora, evita a formação do referido domínio de base emparelhada e I 20 dessa forma aumenta o nível de tranlação de um dos referidos exães no referido ARN responsivo em comparação com o nível de translação do referido exão observado na ausência do referido ácido nucleico de sinal. 2sl. - ARN responsivo de acordo com a reivindicação· 1, caracterizado por a referida região de substrato compreender parte de um dos referidos exões. 30 3ã. - ARN responsivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida região de substrato compreender parte de um intrão adjacente à extremidade 5'- de um dos referidos exães. 35 4ã. - ARN responsivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida região de substrato Mod. 71 - 20.000 ex. 28

compreender parte do referido ponto de fixação do ribosoma. 5ã. - ARN responsivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido ARN responsivo ser purificado.

15 Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 6â. - ARN responsivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido polipéptido interferir com a viabilidade da célula, com a proliferação da célula, com a transcrição do ADN, a translação do ARN ou a replicação do ADN. 7ã. - ARN responsivo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido polipéptido ter actividade de toxina da difteria ou actividade de ribonuclease . 8ã. - ARN responsivo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a presença do referido intrão no referido ARN responsivo, reduzir o nível de translação de um dos referidos exães, em comparação com o nível de translação do referido exão na ausência do referido intrão no referido ARN responsivo.

25 9ã. - ARN responsivo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o referido intrão se encontrar localizado entre o referido ponto de fixação do ribosoma e o exão çais próximo do referido ponto de fixação do ribosoma. lOã. - ARN responsivo de acordo coro a reivindicação 8, caracterizado por o referido intrão se encontrar localizado entre dosi dos referidos exóes. 11-· - ARN responsivo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o referido intrão compreender, na sua extremidade 5'- uma junção de sobreposição 5'- e na sua 29 64.345 Ref: 193/231 - Portugal

extremidade 3'- uma junção de sobreposição 3'-. 12ã. - ARN responsivo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o referido intrão catalisar duas reacçães de clivagem de ARN, uma dentro da referida ·> junção de sobreposição 5'- e outra dentro da referida junção de sobreposição 3'-.

15 13ã. - ARN responsivo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o referido intrão ser um intrão auto-sobreponível. 14ã. - ARN responsivo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a região substrato compreender a referida junção de sobreposição 5'- do referido intrão. Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20

15ã. - ARN responsivo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a referida região inibidora, quando emparelhado pela base com a referida .região substrato, reduzir o nivel de ocorrência da referida reacção de clivagem dentro da referida junção de sobreposição 5'-, em comparação com, a referida região inibidora qaundo esta não é emparelhada pela base em relação à referida região substrato. 16â. - ARN responsivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido ácido nucleíco de sinal ser de cordão único. 17â. - ARN responsivo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido ácido nucleíco de sinal ser um ARN virai. 18i. - Molécula de ADN caracterizada por codificar o ARN responsivo de acordo com a reivindicação 1. 30 35 1 1* 5

15 Mod. 71 - 20.000 ex. - 90(08 20 J 25 64.345 Ref: 193/231 - Portugal 19â. - Método para provocar especificamente a expressão do polipéptido numa célula que apresenta um ácido nucleíco de sinal, por meio da introdução na referida célula de um ARN responsivo, caracterizado por o referido ARN responsivo compreender um ponto de fixação do ribosoma, um domínio regulador, uma região substrato e codificar, num ou mais exães, um polipéptido; sendo o referido domínio regulador constituído por uma região inibidora que está separada dos referidos um ou mais exães e é complementar à referida região substrato; podendo as referidas regiães inibidora e substrato formar um domínio de base emparelhada, na ausência de um ácido nucleíco de sinal; caracterizado por a formação do referido domínio emparelhado pela base reduzir o nível de translação de um dos referidos exôes na molécula responsiva de ARN em comparação com o nivel de translação do referido exão na ausência da formação do referido domínio emparelhada pela base; tendo o referido ácido nucleíco de sinal uma região anti-inibidora, complementar à referida região inibidora que, quando emparelhada pela base com a referida região inibidora, impede a formação do referido domínio emparelhada pela base e por isso aumenta o nivel de translação do referido exão no referido ARN responsivo, em comparação com o nivel de translação do referido exão, observado na ausência do referido ácido nucleíco de sinal. Lisboa, 27 ABR. »992 Por UNITED BI0CHEMICAL CORPORATION

Adjunto do AOPI Eng." Vesco leite Arco da Conceição, 3-1.° - 1ΪΙΧ) U3BOA 31 30