ES2616561T3

ES2616561T3 - Molécula para tratar un trastorno inflamatorio

Info

Publication number: ES2616561T3
Application number: ES10807401.4T
Authority: ES
Inventors: Garrit-Jan Boudewijn Van Ommen; Annemieke Aartsma-Rus; Judith Christina Theodora Van Deutekom; Josephus Johannes De Kimpe; Joseph Stephan Verbeek; Aliye Seda Yilmaz-Elis
Original assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC; Biomarin Technologies BV
Current assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC; Biomarin Technologies BV
Priority date: 2009-12-24
Filing date: 2010-12-22
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2030-12-22
Also published as: US20120259002A1; CA2785451C; EP2516647A1; AU2010335039A1; US8802645B2; CA2785451A1; AU2010335039B2; AU2010335039A2; JP6141018B2; WO2011078672A1; EP2516647B1; JP2013515479A

Abstract

Oligonucleótido que es capaz de alterar el empalme de un pre-ARNm que codifica un IL-1RAcP para aumentar la cantidad de un IL-1RAcP soluble donde dicho oligonucleótido es capaz de inducir el salto del exón que codifica el dominio de transmembrana de IL-1RAcP y no interrumpe el marco de lectura abierto de IL-1RAcP, donde dicho oligonucleótido comprende o consiste en una secuencia que es complementaria de una extensión contigua de al menos 8 nucleótidos de SEQ ID NO: 5, 64 o 65.

Description

Molécu la para tratar un trastorno inflamatorio

S: Campo de la invención

10: [0001] La divulgación proporciona un tipo de oligonucleótidos para tratar un trastorno inflamatorio: una molécula que es capaz de alterar el empalme de un pre-ARNm Que codifica una CS para reducir la cantidad de una CSa. La invención proporciona una molécula que es capaz de alterar el empalme de un pre-ARNm que codifica un IL1RAcP para aumentar la cantidad de IL-1RAcP soluble, La divulgación ademas proporciona el uso de dichas molécu las para prevenir o tratar un trastorno inflamatorio.

Antecedentes de la invención

1S: [0002] En un número de enfermedades inflamatorias, incluyendo artritis reumatoide (RA) y dermatitis, hay una activación de complemento excesiva e inapropiada al igual que una conce ntración excesiva de IL-1 en el plasma.

20 2S 30 35: [0003] El sistema de complemento es parte del sistema inmunológ ico innato, Que actúa para proteger el huésped de microorganismos tales como bacterias, y otras células extrañas y anormales (por ejemplo células apoptóticas). Sin embargo, la activación de complemento principalmente protectora puede también provocar daño al huésped. CS, el Qu into componente del sistema de complemento es una glicoproteina consistente en 1679 aminoacidos en dos cadenas de polipéptidos enlazadas por disulfuro, CSa y CS¡3 (2). Después de la activació n por la CS convertasa, Que se activa por complejos inmunitarios (IC), CS se divide en CSa y CSb. CSa , muestra actividades biológicas potentes Que conducen a la inflamación (1) (3). Es un Quimioatrayente muy involucrado en el reclutamiento de células inflamatorias tales como neutrófilos, eosinófilos , monocitos, y linfocitos T, la activación de células fagocíticas y la inducción de la liberación de enzimas con base en gránulos y generación de oxidantes, todos los mecanismos pueden contribuir a funciones inmunitarias innatas pero también a daño de los tej idos. Se sabe Que la activación excesiva de complemento Que conduce a niveles de plasma elevados de CSa se asocia con muchas condiciones clínicas, incl uyendo sepsis, síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto, artritis reumatoide, enfermedad de Alzheimer (4), y cardiopatía isquémica. CSb, por otro lado, a través de sus sitios de unión múltiples, inicia y dirige el ensamblaje del complejo de ataque de membrana (MAC). Csb sirve como un anclaje para el ensamblaje de C6, C7 , C8 , y C9 (conocido como Csb-9) y se inserta en la membrana celular de los patógenos, conduciendo a la lisis celular.

40: [0004] Hay por lo tanto una necesidad de un medicamento que sea capaz de dirig irse específicamente a Csa y no CSb. Un anticuerpo monoclonal anti-Cs ha sido desarrollado para su uso en terapia. Este anticuerpo previene la artritis inducida por colágeno y mejora la enfermedad establecida (S) (6). Sin embargo, este anticuerpo bloquea C5a y C5b, la reducción de los niveles de C5b Que es necesaria para la formación de MAC es un inconveniente de este anticuerpo.

45: [0005] Hay por lo tanto todav ía una necesidad para una terapia más específica solo estando dirig ida a Csa y dejando Csb intacto. Como se ha demostrado aquí, una terapia con base en oligonucleótidos se asume para estar dirigida específicamente a Csa mientras se mantiene el Csb intacto para la formación de MAC.

SO: [0006] La citocina proinflamatoria interleucina-1 (IL-1) es un mediador importante Que controla los efectos locales y sistém icos en una amplia variedad de células diana, regu lando la inmunidad e inflamación (7). Ésta media la inflamación por reclutam iento de neutrófilos, la activación de macrófagos y la estimulación de células T y B.

SS 60 65: [0007] IL-1 se enlaza al receptor tipo I IL-1 (IL-1RI), Que resulta en el reclutamiento de la proteína accesoria del receptor IL-1 (IL-1RAcP) (8) . IL-1RAcP no reconoce el ligando pero estabiliza la unión de IL-1 aIIL-1RI. Ademas , IL-1 RAcP es un correceptor crucial en este complejo al permitir el reclutamiento y unión de proteínas de adaptador intracelular tal como MyD88 y Quinasas tales como Qu inasas asociadas a IL-1 R, finalmente conduciendo a la activación de NF-t.:B. Además de la forma de transmembrana de IL-1RAcP, se ha identificado una proteína menor y soluble que comprende los tres dominios Ig extracelulares y un dominio C terminal único. Este s1 L-1 RAcP se produce principalmente por el hígado (29) y circula sistémicamente. Otro miembro de la familia de receptores IL-1 es IL-1RII Que tras la unión de IL-1 también se asocia con IL-1RAcP; sin embargo, esto no conduce a la transducción de señales.

Así este receptor se considera como un receptor señuelo y se puede encontrar en la transmembrana y en formas solubles (9).

S: [0008J Los niveles de IL-1 aumentan en algunas enfermedades inflamatorias como artritis reumatoide. Por lo tanto , es necesario reducir y regular el nivel y la actividad de IL-1. sIL-1RAcP puede interactuar con IL-1RII soluble as í formando un depurador de IL-1 de alta afinidad (8) y ha sido ya mostrado (9) que la sobre-expresión sistémica de sIL-1RAcP por un vector de expresión adenovírica en ratones mejora notablemente la artritis inducida por colágeno (CIA) . Por lo tanto, hay una necesidad de un medicamento para aumentar la cantidad de sIL-1RAcP en circulación .

10: La sobreexpresión adenovírica de sI L-1RAcP no es atractiva ya que los vectores de los v irus se pueden considerar como inseguros y no son faciles de generar. Como se demuestra en la presente, una terapia con base en oligonucleótidos está considerada como siendo más especifica, más segura y más barata que tal terapia con base en virus .

1S: [0009] Diferentes tratamientos son ya conocidos para tratar una enfermedad inflamatoria tal como RA. Sin em bargo, cada uno de estos tratamientos tiene inconvenientes . Por lo tanto , todavía existe una necesidad de diseñar nuevos tratamientos para enfermedades ínflamatorias tales como RA que no tienen todos los inconvenientes de los tratamientos existentes.

20: Descripción de la invención

[0010J Los inventores diseñaron dos tipos de moléculas : un tipo o familia de molécula es especificamente capaz de reducir el nivel de una CSa, el segundo es capaz de aumentar el nivel de un IL-1 RAcP soluble .

25: Molécu la

30 35: [0011J En un primer aspecto de la divulgación , se proporciona una molécula, preferiblemente un oligonucl e6tido o un equ ivalente funcional del mismo, que es capaz de alterar o altera el empalme de un pre-ARNm que cod ifica una CS para reducir la cantidad de una CSa. Una molécula , preferiblemente un oligonucleótido tal y como se define aquí es específicamente capaz de alterar o modificar el empalme de un pre-ARNm de CS para reducir la cantidad de una proteina CSa . Dicha alteración del empalme del pre-ARNm de CS ocurre preferiblemente en un paciente o en una célula de dicho paciente o en una línea celular o en un sistema in vitro sin células según se identifica en la presente. Como se ha explicado anteriormente, una proteína CS se divide en una proteína CSa y CSb.

40: [0012J Disminuyendo la producción de una CSa en un paciente o en una célula de dicho paciente o en una línea celular o en un sistema in vitro sin células se puede evaluar en el nivel de ARNm y preferiblemente significa que 99%, 90% , 80%, 70% , 60%, 50% , 40%, 30% , 20%, 10%, 5% o menos de la cantidad in icial de un ARNm de CSa , sigue siendo detectable por RT PCR. En este contexto , un ARNm de CSa significa un exón dirigido de CS que codifica una parte de una proteína CSa . Preferiblemente, ningún ARNm de CSa es detectable.

45: [00131 Disminuyendo la producción de CSa en un paciente o en una célula de dicho paciente o en una linea celular o en un sistema in vitro sin células se puede evaluar en el nivel de ARNm y preferiblemente significa que 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40% , 30%, 20% , 10%, 5% o menos de la cantidad inicial de un exón previsto de CS que cod ifica una parte de C5a , sigue siendo detectable por RT PCR . Preferiblemente, no se detecta ningún exón dirigido que codifica una parte de ARNm de CSa.

50: [0014J Disminuyendo la producción de una C5a en un paci ente o en una célula de dicho paciente o en una línea celular o en un sistema in vitro sin células se puede evaluar a nivel de las prote ínas (por análisis de inmunofluorescencia y/o de Western blot) y preferiblemente sign ifica que 99%, 90% , 80% , 70% , 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% o menos de la cantidad inicial de una proteína CSa , sigue siendo detectable por análisis de inmunofluorescencia o de electrotransferencia.

55: Preferiblemente, ninguna proteína CSa es detectable. [0015] Una disminución es preferiblemente evaluada en un tejido o en una célula de un individuo o un paciente por comparación a la cantidad presente en dicho individuo o paciente antes del tratamiento con dicha composición de la invención.

60 65: Alternativamente , la comparación puede ser hecha con un tejido o célula de dicho ind ividuo o paciente que no ha sido tratado todavía con dicha composición en el caso de que el tratamiento sea local. La comparación es preferiblemente realizada en todas partes donde se expresa o se produce CS. Ya que C5 se expresa o produce principalmente en el hígado de cualquier sujeto se prefiere que dicha comparación se realice utilizando una célula hepática, y{o un tej ido hepático y/o un hígado. En una forma de realización preferida , un tejido es un tejido hepático, una célula es una célula hepática. Lo mismo ocurre con IL-I RAcP como se defi ne más adelante en este documento.

[0016J En una forma de realización preferida, una molécula, preferiblemente un oligonucleótido es tal que la cantidad de una C5b es invariada. La cantidad de una C5b en un paciente o en una célula de dicho paciente o en una línea celular o en un sistema in vitro sin células se puede evaluar a nivel de ARNm o a nivel de las proteínas como se ha definido en la presente anteriormente. En una forma de realización preferida, la cantidad de una C5b no se modifica en comparación con la cantidad de una CSb en el mismo sistema (en un paciente o en una célula de dicho paciente o en una línea celular o en un sistema in vitro sin células) antes del tratamiento. Es sin embargo posible que la cantidad de una C5b sea disminuida de 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% por comparación a la cantidad inicial de una C5b antes del tratamiento. Un ensayo preferido ha sido diseñado para valorar si una proteína funcional C5b está siendo producida. Este ensayo se describe en la parte experimental y se denomina ensayo de complemento hemolitico.

[0017] En una forma de realización preferida, una molécula, preferiblemente un oligonucleótido es capaz de inducir la omisión del exón 17 del pre-ARNm que codifica una CS. Este exón es atractivo para ser omitido ya que conducirá a la producción de una proteína C5a no funcional truncada que carece del dominio de anafilotoxina. Se prevé que dicha proteína C5a truncada y no funcional sea degradada por el sistema de ubiquitina-proteasoma. Alternativamente, si se introduce un codón de terminación prematuro en un gen C5, provocará un decaimiento mediado por sin sentido de la parte restante de C5a.

[0018J En la invención, se proporciona un oligonucleótido que es capaz de alterar el empalme de un pre-ARNm que codifica un IL-1 RAcP para aumentar la cantidad de un IL-1 RAcP soluble. Un oligonucleótido como se define aquí es específicamente capaz de alterar o modificar el empalme de un pre- ARNm que codifica un IL-1RAcP para aumentar la cantidad de un IL-1RAcP soluble. Dicha alteración del empalme del pre-ARNm de IL-1RAcP ocurre preferiblemente en un paciente o en una célula de dicho paciente o en una línea celular o en un sistema in vitro sin células según se identifica aquí.

[0019] En el contexto de la invención, un IL-1RAcP soluble significa preferiblemente una forma segregada de dicho IL-1RAcP. Una proteína segregada o soluble significa que dicha proteína no se liga a una membrana celular. Por lo tanto, un IL-1 RAcP será llamada soluble o segregada cuando es detectable en una fracción celular que no está asociada con una membrana celular que utiliza un ensayo convencional conocido por el experto en la materia. Un ejemplo de tal fracción celular es un sobrenadante celular o un suero. Un ejemplo de un ensayo convencional es un método de ELlSA o de Western blol.

[0020] Una proteína segregada o soluble se define por oposición a una forma ligada a la membrana de una proteína. Una proteína ligada a la membrana es una proteína con una secuencia de aminoácidos que abarca una membrana celular con aminoácido a cada lado de la membrana. Por lo tanto, se dice que una proteína está ligada a la membrana cuando es detectable en una fracción celular que se asocia a una membrana celular usando un ensayo convencional conocido por el experto en la materia. Un ejemplo de tal fracción celular es un extracto celular que comprende proteínas ligadas a la membrana. Tal extracto se puede preparar utilizando Nonidet P40. Un ejemplo de un ensayo convencional es un ELlSA o un Western blol.

[0021] Aumentar la producción de un IL-1RAcP soluble en un paciente o en una célula de dicho paciente o en una linea celular o en un sistema in vitro sin células se puede evaluar a nivel del ARNm y preferiblemente significa que dicho ARNm es detectable usando RT-PCR.

[0022] El aumento de la producción de un IL-1RAcP soluble en un paciente o en una célula de dicho paciente o en una linea celular o en un sistema in vitro sin células se puede evaluar a nivel de la proteína (por análisis de inmunofluorescencia y/o Westem blot yfo ELlSA) y preferiblemente significa que dicha proteína es detectable.

[0023J Alternativamente o en combinación con la evaluación de la producción de una proteína IL-1RAcP soluble (evaluación a nivel de la proteína o del ARNm), se puede también valorar la presencia de IL-1 no unida o libre o soluble. En una forma de realización preferida, un oligonucleótido o un equivalente funcional del mismo, que es capaz de alterar el empalme de un pre-ARNm que codifica una IL-1RAcP para reducir la cantidad de una IL-1 no unida o

libre y por lo tanto su actividad biológica.

[0024] En el contexto de la invención, una IL-1 no unida o libre significa preferiblemente una IL-1 que no está unida a una proteína. Por lo tanto, una IL-1 será llamada libre cuando es detectable o detectada en una fracción celular que no está asociada con una membrana celular o con una proteína o un complejo de proteínas que utiliza un ensayo convencional conocido por el experto en la materia. Un ejemplo de tal fracción celular es un sobrenadante celular o un suero.

Un ejemplo de un ensayo convencional es un ELlSA o un Western blol.

[0025] Disminuyendo la cantidad de una IL-1 soluble o libre o no unida en un paciente o en una célula de dicho paciente o en una línea celular o en un sistema in vitro sin células se puede evaluar a nivel de las proteínas (por análisis de inmunofluorescencia yfo de Western blot yfo ELlSA) y preferiblemente significa Que una IL-l libre es reducida de 1%, 2%, 5%, 10%, 15%,20%, 25%,30%, 35% por comparación a la cantidad inicial de dicha IL-l libre antes del tratamiento. La cantidad de IL-1 se puede cuantificar utilizando Western blot como se ejemplifica en la parte experimental. Alternativamente o en combinación con la evaluación de la producción de una proteína IL-1RAcP soluble, se puede también valorar la presencia o nivel de expresión o nivel de activación de una molécula conocida por ser inducida o activada por IL-l. Por ejemplo, se sabe Que IL-l induce la activación de NF-K8 yfo la producción o liberación de diferentes quimiocinas como IL-6f1CAM-l . Por lo tanto, alternativamente o en combinación con la evaluación de la producción de una proteína IL-1RAcP soluble, se puede también valorar la activación de NF-K8 y/o la liberación de IL-6f1CAM-1 .

[0026] En una forma de realización preferida, un oligonucleótido es capaz de alterar el empalme de un pre-ARNm que codifica un IL-1RAcP para reducir la activación de NF-K8 yfo la liberación de IL-6I1CAM-l.

[0027] l a disminución de la activación de NF-K8 y/o la liberación de IL-6/1CAM -1 en un paciente o en una célula de dicho paciente o en una línea celular o en un sistema in vitro sin células se puede evaluar a nivel de las proteínas como se ejemplifica en la parte experimental y preferiblemente significa que NF-K8 activado y/o IL-6f1CAM-l liberado es disminuido de 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% por comparación a la cantidad inicial de dicho NF KB activado yfo IL-6I1CAM-lliberado antes del tratamiento.

[0028] Un aumento o una reducción es preferiblemente evaluada en un tejido o en una célula de un individuo o un paciente por comparación a la cantidad presente en dicho individuo o paciente antes del tratamiento con dicha molécula o composición de la invención. Alternativamente, la comparación se puede hacer con un tejido o célula de dicho individuo o paciente que todavía no ha sido tratado con dicha molecula o composición en el caso de que el tratamiento sea local. En una forma de realización preferida, un tejido es un tejido hepático, una célula es una célula hepática, ya que como para C5, IL-1RAcP se expresa principalmente o se produce en el hígado.

[0029] En una forma de realización preferida, un oligonucleótido es capaz de inducir la omisión del exón 9 del pre- ARNm que codifica un IL-1RAcP. Este exón es atractivo para ser omitido ya Que codifica el dominio de transmembrana de un IL-l RAcP y ya Que su omisión está previsto que no interrumpa el marco de lectura abierto de IL-l RAcP. Esperamos que la omisión del exón 9 de un pre-ARNm que codifica IL-1RAcP conduzca a la producción de IL1 RAcP soluble.

[0030J Información técnica general en cuanto a los oligonucleótidos de la invención y una de la divulgación Un oligonucleótido como se utiliza en este caso preferiblemente comprende un oligonucleótido antisentido o oligorribonucleótido antisentido: llamado también un AON. En la invención una técnica de salto de exón es aplicada. El salto de exón interfiere con los procesos de empalme natural que ocurren dentro de una célula eucariota. En eucariotas superiores la información genética para proteínas en el ADN de la célula se codifica en exones Que son separados entre sí por secuencias intrónicas. Estos intrones son en algunos casos muy largos. La maquinaria de transcripción de eucariotas genera un pre-ARNm que contiene tanto exones como intrones, mientras la maquinaria de empalme, frecuentemente ya durante la producción del pre-ARNm, genera la región de codificación real para la proteína por el empalme junto con los exones presentes en el pre-ARNm.

[0031] El salto de exón produce ARNm maduro que carece de al menos un exón saltado. Así. cuando dicho exón codifica para aminoácidos. el salto de exón lleva a la expresión de una proteína alterada. La tecnología para el salto de exón se dirige actualmente al uso de oligonucleótidos antisentido (AON).

[0032] El salto de un exón es preferiblemente inducido por la unión de AON dirigiéndose bien a uno o a ambos sitios de empalme. o secuencias internas del exÓn. Un oligonucleótido dirigido a una secuencia interna del exón no muestra tipicamente ningún recubrimiento con secuencias sin exÓn. Preferiblemente no se solapa con los sitios de empalme al menos no en la medida en que estos están presentes en el intrón. Un oligonucleótido dirigido hacia una secuencia interna de exón preferiblemente no contiene una secuencia complementaria a un intrón adyacente.

Un oligonucleótido según la invención, es para inhibir la inclusión de un exón de un pre-ARNm de IL-1RAcP para producir una proteína de IL1RAcP que carece de dicho exón.

[0033J Una técnica de salto de exón es preferiblemente aplicada de manera que la ausencia de un exón a partir de un ARNm producido a partir de un gen C5 o pre-ARNm genera una región de codificación para una prote ína C5a no funcional que se prevé que se degrade. C5b por lo tanto sigue siendo producida y en la teoria nada o menos C5a es producida, mientras que sin AON, C5a y C5b se producen en cantidades similares.

[0034J En el caso de IL-1RAcP, una técn ica de salto de exón es preferiblemente apl icada de manera que la ausencia de un exón de dicho ARNm dará lugar a la producción de una forma soluble en vez de una forma unida a la membrana. En este contexto, la inhibición de la inclusión de un exón preferiblemente significa que la cantidad de C5a de longitud total detectada u original, respectivamente ARNm de IL-1RAcP y/o proteína de longitud total o unida a la membrana es disminuida como se ha definido en la presente anteriormente.

[0035] Ya que un exón de una C5, respectivamente pre-ARNm de IL-1RAcP solo será incluido en el ARNm resultante cuando los sitios de empalme son reconocidos por el complej o de espliceosoma , los sitios de empalme han sido obvios objetivos para AON. Una forma de realización por lo tanto proporciona un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, que comprende una secuencia que es complementaria a una región sin exón de una C5, respectivamente pre ARNm de IL-1RAcP. En una forma de realización de la divulgación un AON se usa que es complementario solamente a una región sin exón de una C5, respectivamente pre ARNm de IL-1RAcP. Sin embargo, esto no es necesario: es posible también usar un AON que comprende una secuencia especifica de intrón al igual que una secuencia específica de exÓn. Tal AON comprende una secuencia que es complementaria a una región sin exón de una C5, respectivamente pre ARNm de IL-1RAcP, al igual que una secuencia que es complementaria a una reg ión de exón de una C5, respectivamente pre ARNm de IL-1RAcP. Por supuesto, un AON no es complementario necesariamente a la secuencia entera de una C5, respectivamente exón o inlrón de IL-1RAcP. AON que son complementarios a una parte de tal exón o intrón son preferidos. Un AON es preferiblemente complementario a al menos parte de una C5, respectivamente exón yfo intrón de IL1 RAcP, dicha parte teniendo al menos 8, 9, 10,11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20 nucleótidos o más.

[0036J El empalme de una C5, respectivamente pre-ARNm de IL-1RAcP ocurre por medio de dos reacciones de transesterificación secuencial. Primero, el 2'OH de un nucleótido del punto de ramificación específico en el intrón que se define durante el ensamblaje del espliceosoma ejecuta un ataque nucleofilico en el primer nuc!eótido del intrón en el sitio de empalme 5' que forma el lazo intermedio. Segundo, el 3'OH del exón liberado 5' luego ejecuta un ataque nucleofílico en el nucleótido último del intrón en el sitio de empalme 3' así uniendo los exones y liberando el lazo de intrón. El punto de derivación y sitios de empalme de un intrón están así implicados en un evento de empalme. Por lo tanto, un oligonucleótido que comprende una secuencia que es complementaria de tal punto de derivación yfo sitio de empalme es preferiblemente usado para el sallo de exÓn. Se proporciona además por lo tanto un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, que comprende una secuencia que es complementaria a un sitio de empalme yfo punto de derivación de una C5, respectivamente pre ARNm de IL-1RAcP.

[0037J Ya que los sitios de empalme contienen secuencias de consenso, el uso de un oligonucleótido o un equivalente funcional del mismo (aquí también llamado un AON) que comprende una secuencia que es complementaria de un sitio de empalme implica el riesgo de hibridación promiscua. La hibridación de AON a otros sitios de empalme distintos de los sitios del exón que deben ser saltados podrían fácilmente interferir con la exactitud del proceso de empalme. Para superar estos y otros problemas potenciales relacionados con el uso de AON que son complementarios a una secuencia de intrón, una forma de realización preferida proporciona un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, que comprende una secuencia que es complementaria a una C5, respectivamente exón de pre-ARNm de IL-1RAcP. Preferiblemente, dicho AON es capaz de inhibir específicamente una señal de inclusión de exón de al menos un exón en dicho pre-ARNm. La interferencia con una señal de inclusión de exón (EIS) tiene la ventaja de que tales elementos se sitúan en el exón. Con la proporción de un AON en el interior del exón que se debe saltar, es posible interferir con la señal de inclusión del exón enmascarando así eficazmente el exón desde el aparato de empalme. El fallo del aparato de empalme para reconocer el exón que se debe sallar lleva por tanto a la exclusión del exón desde el ARNm final.

1S

2S

3S

65 E10a07401

Esta forma de realización no interfiere directamente con el proceso enzimático de la maquinaria de empalme (la unión de los exones). Se piensa que esto permite que el método sea más especifico y/o fiable. Se piensa que una EIS es una estructura particular de un exón que permite al aceptor y donador del empalme asumir una conformación espacial particular. En este concepto es la conformación espacial particular que permite a la maquinaria de empalme reconocer el exón. Sin embargo, la invención ciertamente no se limita a este modelo. En una forma de realización preferida, se hace uso de un oligonucleótido que es capaz de unirse a un exón y es capaz de inh ibir un EIS . Un AON puede especificamente contactar dicho exón en cualquier punto y todavía ser capaz de inhibir especifica mente dicho EIS.

[003a] En el contexto de la divulgación, una molecula puede significar cualquier tipo de molécula en tanto que esta molécula es capaz de alterar o altera el empalme de un pre-ARNm que codifica la C5 para reducir la cantidad de cSa, respectivamente alterando o altera el empalme de un pre-ARNm que codifica eIIL-1RAcP para aumentar la cantidad de IL-1RAcP soluble en una célula o en un tejido o en un individuo como se identifica en la presente. Dicha molécula es por lo tanto capaz de inducir la producción de un ARNm que carece de un exón, preferiblemente exón 17 en el caso de eSa, respectivamente exón 9 en el caso de IL-1RAcP, dando como resultado la producción de una proteina o una isotorma de proteína, es decir una proteína no funcional CSa segun se identifica aquí o una proteína soluble IL-1RAcP según se identifica aquí alterando el empalme de un pre-ARNm correspondiente. Por lo tanto, en una forma de realización preferida, dicha molécula no impide la traducción del ARNm correspondiente ya que una proteína será formada o producida a partir de dicho ARNm. Preferiblemente dicha molécula es un oligonucleótido o un equivalente funcional del mismo. Un equivalente funcional de un oligonucleótido significa preferiblemente un oligonucleótido como se define aquí donde uno o más nucleótidos han sido sustituidos y donde una actividad de dicho equivalente funcional se retiene al menos en cierta medida. Preferiblemente, una actividad de dicho equivalente funcional está proporcionando una reducción detectable de CSa, respectivamente una producción detectable de IL-1RAcP soluble. Por lo tanto dicha actividad de dicho equivalente funcional es preferiblemente evaluado por la cuantificación de la cantidad de una CSa, respectivamente proteína IL-1RAcP soluble o cuantificando la cantidad del ARNm correspondiente. La evaluación de dicha actividad de un oligonucleótido se realiza preferiblemente por RT-PCR (ARNm) o por análisis de Inmunofluorescencia o Westem blot (proteína). Dicha actividad es preferiblemente retenida hasta al menos alguna extensión cuando representa al menos 50%, o al menos 60'%, o al menos 70% o al menos aO% o al menos 90% o al menos 9S% o más de la actividad correspondiente de dicho oligonucleótido del que deriva el equivalente funcional. Tal actividad se puede medir en un tejido de hígado o en una célula hepática de un individuo o in vitro en una célula por comparación a una actividad de un oligonucleótido correspondiente de dicho oligonucleótido del que deriva el equ ivalente funcional. En toda esta solicitud, cuando se usa la palabra oligonucleótido se puede sustituir por un equivalente funcional de la misma tal y como se define aquí.

[0039] Por lo tanto, un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, que comprende o que consiste en una secuencia que es complementaria de o se enlaza a una C5, respectivamente un exón de pre-ARNm de IL1 RAcP preferiblemente proporciona un resultado terapéutico. En una forma de realización preferida se usa un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, que comprende o consiste en una secuencia que es complementaria de o se enlaza a al menos parte o a una extensión contigua de una C5, respectivamente exón de pre-ARNm de IL-1 RAcP, dicha parte teniendo o comprendiendo al menos a nucleótidos. Sin embargo, dicha parte también puede tener al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24,25, 26, 27, 28 , 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42,43,44,45,46,47, 48, 49, 50 nucleótidos. Una parte de una C5, respectivamente exón de pre-ARNm de IL-1RAcP al que un oligonucleótido es complementario también se puede llamar una extensión contigua de dicho pre-ARNm. Para C5 murina o humana, una extensión contigua preferida es una extensión del exón 17 de pre-ARNm, más preferiblemente una extensión del exón 17 de pre-ARNm cerca del extremo 3' de dicho exón .. En este contexto, cerca puede significar 1 nucleótido desde el extremo 3' de dicho exón o 2, 3, 4, 5, 6, 7, a, 9, 10, 11 , o 12 nucleótidos. La secuencia de pre ARNm murino y humano del exón 17 se representa por SEO ID NO: 1 y 2 respectivamente. Por lo tanto, un oligonucle6tido es preferiblemente complementario o se enlaza a una extensión de al menos 8 nucleólidos de SEQ ID NO: 1 02.

[0040] Altemativamente, un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, comprende o consiste en una secuencia que es complementaria de o se enlaza al intrón 17 de pre-ARNm de es . La secuencia de pre-ARNm murino y humano del intrón 17 se representa por SEa ID NO: 3 y 4 respectivamente. Por lo tanto, un oligonucle6tido es preferiblemente complementario o se enlaza a una extensión de al menos a nucleótidos de SEa ID NO: 3 o 4.

[0041] La expresión "se une a un exón o intrón de un pre-ARNm de CS" en este contexto, preferiblemente significa que dicho oligonucleótido es capaz de reducir la producción de una CSa en un paciente o en una célula de dicho paciente o en una línea celular. CSa en este contexto puede referirse a una proteína CSa. La expresión "se une a un exón o intrón de un pre-ARNm" en este contexto, preferiblemente significa que dicho oligonucleótido es capaz de alterar el empalme de un pre-ARNm que codifica un IL·1RAcP para aumentar la cantidad de un IL-1RAcP soluble o en un sistema in vitro sin células se puede evaluar a ni vel del ARNm. Una secuencia de ARNm preferida de una CS murina se representa por SEO ID NO:7. Una secuencia de ARNm preferida de CS humano se representa por SEO ID NO:8. Una secuencia de ARNm preferida de IL-1RAcP murino se representa por SEO ID NO:9. Una secuencia de ARNm preferida de IL-1 RAcP humano se representa por SEO ID NO:10.

[0042] Para IL-1RAcP murino o humano, una extensión contigua preferida es una extensión del exón g de pre ARNm, preferiblemente que incluye un sitio ESE, más preferiblemente que incluye un sitio ESE cerca del extremo 5' del exón 9 .. En este contexto, cerca de puede significar 1 nucleótido desde el extremo 5' de dicho exón de pre ARNm o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , o 12 nucleótidos.

[0043] Para IL-1 RAcP murino o humano, otra extensión contigua preferida es una extensión del exón 9 de pre ARNm que incluye un sitio ESE ylo cerca del extremo 3' del exón 9. Aún más preferiblemente, para IL-1RAcP humano, una extensión contigua es una extensión del exón 9 de pre ARNm que incluye un sitio ESE ylo cerca del extremo 3' del exón 9. En este contexto, cerca puede significar 1 nucleótido del extremo 3' de dicho exón de pre-ARNm o 2, 3, 4, S, 6, 7, 8, 9,10,11,012 nucleótidos. Una secuencia murina y humana del exón 9 de pre-ARNm se representa por SEO ID NO: 5 y 6. Por lo tanto, un oligonucle6tido es preferiblemente complementario o se enlaza a una extensión de al menos 8 nucleólidos de SEO ID NO: 5 o 6.

[0044] Alternativamente, un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo, de la divulgación comprende o consiste en una secuencia que es complementaria de o se enlaza al intrón 8 o 9 humano de pre-ARNm de IL· 1RAcP. Una secuencia de pre-ARNm humana del intrón 8 y 9 se representa por SEO ID NO: 62 y 63 respectivamente. Por lo tanto, un oligonucle6tido es preferiblemente complementario de o se enlaza a una extensión de al menos 8 nucleótidos de SEO ID NO: 62 o 63.

[0045] Alternativamente, un oligonucieótido, o un equivalente funcional del mismo, comprende o consiste en una secuencia que es complementaria de o se enlaza a una secuencia de pre-ARNm que comprende parte del intrón 8 y parte del exón 9 o un intrón 8 y exón 9 de superposición de secuencias (es decir bordes de intrón 8-exón 9) de IL· 1 RAcP humano o una secuencia que comprende parte del exón 9 y parte del intrón 9 o un exón 9 e intrón 9 de superposición de secuencias (es decir bordes de exón 9-intrón 9) de IL-1RAcP humano. Una secuencia de pre-ARNm humana preferida que se superpone al intrón 8 y exón 9 se representa por SEO ID NO: 64 . Una secuencia de pre-ARNm humano preferida que se superpone al exón 9 e intrón 9 se representa por SEO ID NO: 65. Por lo tanto, un oligonucleótido es preferiblemente complementario de o se enlaza a una extensión de al menos 8 nucleólidos de SEO ID NO: 64 o 65.

[0046] De la forma más preferible se usa un oligonucleótido que comprende o consiste en una secuencia que es complementaria a al menos parte de un pre-ARNm de CS, respectivamente al menos parte de un pre-ARNm de IL1 RAcP dicha parte teniendo o comprendiendo al menos 8 nucleótidos. Sin embargo, dicha parte también puede tener al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24,25,26,27,28, 29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,49,50 nucleótidos. Los oligonucleótidos más preferidos para CS se representan por una secuencia que comprende o consiste en cada una de las siguientes secuencias SEO ID NO: 11 a SEO ID NO:24:

•: SEO ID nO 11, 12, 16, 17, 18, 19, 20,22,23 y 24 (es decir PS29S; PS296; PS349; PS350; PS3S1; PS3S2; PS3S3, 377,378 Y 379) son complementarias o se dirigen o se enlazan a una parte o una extensión del exón 17 de una C5,

•: SEO ID nO 13,14 y 21 (es decir PS329; PS330 y PS354) son complementarias o se dirigen o se enlazan a una parte o una extensión de los bordes del exón 17-intrón 17 de una CS,

•: SEO ID NO:15 (es decir PS348) es complementaria o se dirige o se enlaza a una parle o una extensión de los bordes de inlrón 16-exón 17 de una CS. Oligonucleótidos más preferidos comprenden o consisten en SEO ID NO:13 (PS329) y SEO ID N022 (377). Oligonucleótidos más preferidos para IL-1RAcP se representan por una secuencia que comprende o consiste en cada una de las siguientes secuencias SEO ID NO : 25 a SEO ID N0:42.

•: SEO ID nO 25, 26, 28, 33, 34, 35, 36, 39, 40,41 (es decir PS299; PS300; PS326; PS357, PS 358; PS359; PS360, 373,374 y 375) son complementarias o se dirigen o se enlazan a una parte o una extensión del exón 9 de un IL· 1RAcP,

•: SEO ID nO 27, 31,32 Y 42 (es decir PS325; PS355; PS356 y 376) son complementarias o se dirigen o se enlazan a una parte o una extensión de los bordes de intrón 8-exón 9 de un IL-1RAcP,

•: SEO ID nO 29, 30,37 Y 38 (es decir PS327; PS328; PS361 y 372) son complementarios o se dirigen o se enlazan a una parte o una extensión de los bordes del exón 9-intrón 9 de un IL-1RAcP. Los oligonucleótidos mas preferidos comprenden o consisten en SEO ID NO:26 (PS300) y SEO ID NO:39 (373).

[0047J Cada uno de los oligonucleótidos se identifica en la tabla 3. La Tabla 5 identifica la región dirigida por cada oligonucleótido.

[0048] En una forma de realización preferida, un oligonucleótido de la invención o de la divulgación como se ha identificado anteriormente en la presente comprende ademas al menos una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases wobble esta presente en dicha secuencia. Preferiblemente, una inosina ha sido introducida en una de estas secuencias para reemplazar una guanina, adenina,

o un uracilo. El uso de una inosina yfo un nucleótido con una base capaz de formar un par de bases wobble en un oligonucleótido de la invención es muy atractivo como se explica mas abajo. La inosina por ejemplo es una base modificada conocida que puede aparearse con tres bases: uracilo, adenina, y citosina. La inosina es un nucleósido que se forma cuando la hipoxantina se fija a un anillo de ribosa (conocido también como una ribofuranosa) por medio de un enlace ~-N9-glicosidico. La inosina se encuentra comúnmente en ARNt y es esencial para la propia traducción del código genético en los pares de bases wobble. Un par de bases wobble es un par G-U e I-U / I-A I I-C fundamental en la estructura secundaria de ARN . Su estabilidad termodinámica es comparable a aquella del par de bases Watson-Crick. Los pares de bases wobble son críticos para la traducción apropiada del código genético. El código genético compensa disparidades en el número de aminoácidos (20) para codones de triplete (64), usando pares de bases modificados en la primera base del anti-codÓn. De forma similar, al diseñar los cebadores para la reacción en cadena de polimerasa, la inosina es útil en cuanto a que ésta se apareará indiscriminadamente con adenina, timina, o citosina. Una primera ventaja del uso de tal base permite a uno diseñar un cebador que abarca un polimorfismo de nucleótido único (SNP), sin la preocupación de que el polimorfismo interrumpa la eficiencia de anillado del cebador. Por lo tanto en la invención, el uso de tal base permite diseñar un oligonucleótido que se puede utilizar para un individuo con un SNP en la extensión de pre-ARNm que esta prevista por un oligonucleótido de la invención. Una segunda ventaja del uso de una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases wobble en un oligonucleótido de la invención es cuando dicho oligonucleótido normalmente contenga un CpG que se hubiera diseñado como siendo complementario a una extensión de pre-ARNm según se identifica aquí. La presencia de un CpG en un oligonucleótido esta normalmente asociada a una inmunogenicidad aumentada de dicho oligonucleótido (10). Esta inrnunogenicidad aumentada no es deseada. Se prevé que la sustitución de uno, dos o más CpG por la inosina correspondiente y/o una base capaz de formar un par de bases wobble en dicho oligonucleótido proporcione un oligonucleótido con un nivel disminuido y/o aceptable de inmunogenicidad. La inmunogenicidad se puede evaluar en un modelo animal por la evaluación de la presencia de células T CD4+ y/o C08+ y/o células mieloides inflamatorias en una biopsia de dicho animal. La inmunogenicidad también se puede evaluar en la sangre de un animal o de un ser humano tratado con un oligonucleótido de la invención por la detección de la presencia de un anticuerpo neutralizante y/o un anticuerpo que reconoce dicho oligonucleótido utilizando un inmunoensayo estándar conocido por la persona experta tal como una ELISA. Un aumento en la inmunogenicidad preferiblemente corresponde a un aumento detectable de al menos uno de estos tipos celulares por comparación a la cantidad de cada tipo celular en una biopsia correspondiente de un animal antes de tratamiento o tratado con un oligonucleótido correspondiente teniendo al menos una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases wobble. Alternativamente, un aumento en la inmunogenicidad se puede evaluar detectando la presencia o una cantidad en aumento de un anticuerpo que reconoce dicho oligonucleótido utilizando un inmunoensayo estándar. Una reducción en la inmunogenicidad preferiblemente corresponde a una reducción detectable de al menos uno de estos tipos celulares por comparación al número de tipos de célula correspondientes en una biopsia correspondiente de un animal antes del tratamiento o tratado con un oligonucleótido correspondiente sin inosina y/o una base capaz de formar un par de bases wobble. Alternativamente una reducción en la inmunogenicidad se puede evaluar por la ausencia de o una cantidad decreciente de dichos anticuerpos usando un inmunoensayo estándar.

[0049] Una tercera ventaja del uso de una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases wobble en un oligonucleótido de la invención es evitar o reducir una multimerización potencial o agregación de oligonucleótidos. Es por ejemplo conocido que un oligonucleótido que comprende un motivo de cuarteto G tiende a formar un cuádruple, un multimero o agregado formado por el apareamiento de bases Hoogsteen de cuatro oligonucleótidos

monocatenarios (11), que por supuesto no es deseado: como resultado, se prevé que la eficiencia del oligonucleótido disminuya. La mullimerización o agregación es preferiblemente evaluada por técnicas de electroforesis en gel no desnaturalizante de poliacrilamida estándar conocidas por la persona experta. En una forma de realización preferida, menos del 20% o 15%, 10%, 7%, 5% o menos de una cantidad total de un oligonucleótido de la invención tiene la capacidad de multimerizarse o agregarse evaluado utilizando el ensayo mencionado anteriormente.

[0050J Una cuarta ventaja del uso de una inosina y{o una base capaz de formar un par de bases wobble en un oligonucleótido de la invención es también evitar estructuras cuádruples que han sido asociadas a la actividad antitrombótica (12) al igual que a la unión a, e inhibición de, el receptor depurador macrófago (13).

[0051J Una quinta ventaja del uso de una inosina y{o una base capaz de formar un par de bases wobble en un oligonucleótido de la invención es permitir diseñar un oligonucleótido con cinética de unión de ARN mejorada y{o propiedades termodinámicas. La cinética de unión de ARN y{o propiedades termodinámicas son al menos en parte determinadas por la temperatura de fusión de un oligonucleótido (Tm; calculada con el calculador de propiedades oligonucleótidas (http:/{www.unc.edu/~cailfbiotoolfoligolindex.html ) para ARN monocatenario que utiliza la Tm básica y el modelo vecino más cercano), y{o la energía libre del complejo de exón objetivo-AON (usando la versión de estructura de ARN 4.5). Si una Tm es demasiado alta, el oligonucle6tido está previsto que sea menos específico. Una Tm aceptable y energía libre dependen de la secuencia del oligonucleótido. Por lo tanto, resulta difícil dar gamas preferídas para cada uno de estos parámetros. Una Tm aceptable puede ser al menos 35 y no mayor de 65Q C y una energía libre aceptable puede ser al menos 15 Y no mayor de 45 kcalfmol.

[0052] La persona experta puede por lo tanto primero elegir un oligonucleótido como un compuesto terapéutico potencial. En un segundo paso, puede usar la invención para optimizar adicionalmente dicho oligonucleótido decreciendo su inmunogenicidad y/o evitando la agregación y/o formación de cuádruples y{u optimizando su Tm y/o energía libre del complejo objetivo-AON. Puede tratar de introducir al menos una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases wobble en dicho oligonucleótido en una posición adecuada y valorar como la inmunogenicidad y/o agregación y{o formación de cuádruples yfo Tm y{o energía libre del complejo objetivQ-AON han sido alterados por la presencia de dicha inosina ylo una base capaz de formar un par de bases wobble. Si la alteración no proporciona la alteración deseada o reducción de inmunogenicidad y{Q agregación y/o formación de cuádruples y{o su Tm y{o energía libre del complejo objetivo-AON puede elegir introducir otra inosina y{o una base capaz de formar un par de bases wobble en dicho oligonucleótido y/o introducir una inosina dada y/o una base capaz de formar un par de bases wobble en una posición adecuada diferente dentro de dicho oligonucleótido

[0053J En una forma de realización preferida, un oligonucleótido de la invención o de la divulgación que comprende una secuencia que es complementaria a la parte de una C5 , respectivamente pre-ARNm de IL-1RAcP es de manera que la parte complementaria es al menos 50% de la longitud del oligonucleótido de la invención o de la divulgación, más preferiblemente al menos 60%, aún más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 80%, aún mas preferiblemente al menos 90% o aún más preferiblemente al menos 95%, o aún más preferiblemente 98% o aún más preferiblemente al menos 99%, o aún más preferiblemente 100%. En una forma de realización más preferida, el oligonucleótido de la invención o de la divulgación consiste en una secuencia que es complementaria a la parte de una C5, respectivamente pre-ARNm de IL-1RAcP tal y como se define aquí. Como un ejemplo, un oligonucleótido puede comprender una secuencia que es complementaria a la parte de una C5, respectivamente pre-ARNm de IL-1 RAcP tal y como se define aquí y secuencias flanqueantes adicionales. En una forma de realización más preferida, la longitud de dicha parte complementaria de dicho oligonucleótido es de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,38, 39,40, 41,42,43,44,45,46,47,48,49, 50 nucleótidos. Preferiblemente, secuencias nanqueantes adicionales se utilizan para modificar la unión de una proteína al oligonucleótido, o para modificar una propiedad termodinámica del oligonucleótido, más preferiblemente para modificar la afin idad de enlace de ARN objetivo,

[0054] Una forma de realización preferida proporciona un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo que comprende:

•: una secuencia que es complementaria a una reg ión de una C5 respectivamente exón de pre-ARNm de IL-1RAcP que se hibrida a otra parte de una C5 respectivamente exón de IL-1RAcP (estructura cerrada), y

•: una secuencia que es complementaria a una región de una C5 respectivamente exón de pre-ARNm de IL-1RAcP que no se hibrida en dicha C5 respectivamente pre-ARNm de IL-1RAcP (estructura abierta).

[0055] Para esta forma de realización, se hace referencia a WO 2004f083432.

BO

Las moléculas de ARN presentan estructuras secundarias fuertes, en su mayoría debido al apareamiento de bases de las extensiones complementarias o parcialmente complementarias en el mismo ARN. Durante mucho tiempo se ha pensado que las estructuras en el ARN juegan un papel en la función del ARN. Sin pretender limitarse por ninguna teoría, se cree que la estructura secundaria del ARN de un exón juega un papel en la estructuración del proceso de empalme. La estructura de un exón es un parametro que se considera que dirige su inclusión en el ARNm. Sin embargo, otros parámetros también pueden jugar un papel en esto. Aqui esta función de señalización es referida como una señal de inclusión del exón. Un oligonucieótido complementario de esta forma de realización es capaz de interferir con la estructura del exón y por lo tanto es capaz de interferir con la señal de inclusión del exón del exón. Se ha descubierto que muchos oligonucleótidos complementarios de hecho comprenden esta capacidad, algo mas eficaz que otros. Los oligonucleótidos de esta forma de realización preferida, es decir aquellos con dicho recubrimiento dirigido a estructuras abiertas y cerradas en el exón nativo de ARN, son una selección de todos los oligonucleótidos posibles. La selección abarca oligonucleótidos que pueden interferir eficazmente con una señal de inclusión del exÓn. Sin pretender imponer ninguna teoría se piensa que el recubrimiento con una estructura abierta mejora la eficiencia de invasión del oligonucleótido y previene la un ión de factores de empalme (es decir aumenta la eficiencia con la cual el oligonucleótido puede introducirse en la estructura), mientras que el recubrimiento con la estructura cerrada aumenta posteriormente la eficiencia de la interferencia con la estructura secundaria del ARN del exón, y por lo tanto interliere con la señal de inclusión del exÓn. Se ha descubierto que la longitud de la complementariedad parcial para la estructura abierta y cerrada no es extremadamente restringida. Hemos observado eficiencias altas con oligonucieótidos con longitudes variables de complementariedad en cada estructura. El término complementariedad se utiliza en este caso para referirse a una extensión de ácidos nucieicos que pueden hibridar a otra extensión de acidos nucleicos bajo condiciones fisiológicas. No es absolutamente requerido por tanto que todas las bases en la región de complementariedad sean capaces de aparearse con bases en la cadena opuesta. Por ejemplo, cuando se diseña el oligonucleótido uno puede querer incorporar por ejemplo un residuo que no se aparea con la base en la cadena complementaria. Los desapareamientos pueden hasta cierto punto ser permitidos, si dadas las circunstancias en la célula, la extensión de nucleótidos es suficientemente capaz de hibridar a la parte complementaria. En este contexto, "suficientemente" preferiblemente significa que utilizando un ensayo de cambio de movilidad de gel como se describe en el ejemplo 1 de EP 1 619249, se puede detectar la unión de un oligonucleótido. Opcionalmente, dicho oligonucieótido puede ser ademas evaluado por transfección en las células hepáticas humanas. El salto del exón previsto se puede evaluar por RT-PCR (como se describe en EP 1 619249). Las regiones complementarias son preferiblemente diseñadas de manera que, cuando se combinan, son especificas para el exón en el pre-ARNm . Tal especificidad se puede crear con varias longitudes de regiones complementarias ya que depende de las secuencias reales en otro (pre-)ARNm en el sistema. El riesgo de que tamb ién uno o más pre-ARNm sean capaces de hibridar al oligonucleótido se reduce con el aumento de tamaño del oligonucleótido. Está claro que los oligonucleótidos que comprenden desapareamientos en la región de complementariedad pero que retienen la capacidad para hibridar a la región{s) dirigida en el pre-ARNm, se pueden usar en la presente invención o divulgación. Sin embargo, preferiblemente al menos las partes complementarias no comprenden tales desapareamientos dado que típicamente tienen una eficiencia más alta y una especificidad mas alta, que los oligonucleótidos que tienen tales desapareamientos en una o más regiones complementarias. Se piensa que fuerzas de hibridación más altas, (es decir aumento del número de interacciones con la cadena opuesta) son favorables para aumentar la eficiencia del proceso de interferencia con la maquinaria de empalme del sistema. Preferiblemente, la complementariedad es entre 90 y 100%. En general esto permite 1 02 desapareamiento{s) en un oligonucleótido de 20 nucleótidos.

[0056] La estructura secundaria es mejor analizada en el contexto del pre-ARNm donde reside el exÓn. Tal estructura se puede analizar en el ARN real. Sin embargo, es actualmente posible predecir la estructura secundaria de una molécula de ARN (a costes de energía mín imos) bastante bien usando programas de modelado de estructura. Un ejemplo no limitativo de un programa adecuado es ARN mfold version 3.1 server (14). Un experto en la técnica será capaz de predecir, con reproducibilidad adecuada, una estructura posible del exón, dada la secuencia de nucleótidos. Mejores predicciones se obtienen cuando se proporcionan tales programas de modelación con el exón y secuencias de intrones f1anqueantes. Normalmente no es necesario modelar la estructura del pre-ARNm entero.

[OOS7J La estructura abierta y cerrada a la que el oligonudeótido se dirige. son preferiblemente adyacentes entre sí. Se piensa que de esta manera el anillado del oligonucleótido a la estructura abierta induce la apertura de la estructura cerrada a partir de lo cual el anillado progresa en esta estructura cerrada. Tras esta acción la estructura cerrada previamente asume una conformación diferente. La conformación diferente produce la interrupción de la señal de inclusión del exÓn. Sin embargo, cuando un aceptar de empalme (criptico) potencial y/o secuencias donadoras están presentes en el exón dirigido, ocasionalmente una señal de inclusión de exón nueva es generada definiendo un (neo) exón diferente, es decir con un extremo 5' diferente, un extremo 3' diferente, o ambos. Este tipo de actividad está dentro del campo de la presente invención o de la divulgación ya que el exón dirigido está excluido del ARNm y mientras que la proteina CSa es disminuida, se prOduce respectivamente un IL 1 RAcP soluble.

[OOS8J También se proporciona un oligonucleótido, o un equivalente funcional del mismo que comprende una secuencia que es complementaria a un sitio de unión para una proteína serina-arginina (SR) en el ARN de un exón de un pre-ARNm. En WO 2006/112705 hemos descrito la presencia de una correlación entre la efectividad de un oligonucleótido antisentido interno (AON)-exón para inducir el salto de exón y la presencia de un sitio de unión SR predicho (por ejemplo por buscador ESE) en el sitio de pre-ARNm objetivo de dicho AON. Por lo tanto, en una forma de realización un oligonucleótido es generado comprendiendo la determinación de un sitio de unión (putativo) para una proteína SR (Ser-Arg) en el ARN de un exón previsto de una CS, respectivamente pre- ARNm de IL-1 RAcP y produciendo un oligonucleótido que es complementario de dicho ARN y que al menos superpone parcialmente dicho sitio de unión (putativo). El término "al menos superpone parcialmente" se define aquí por comprender un recubrimiento de solo un nucleótido único de un sitio de unión SR al igual que nucleótidos múltiples de dicho sitio de unión al igual que un recubrimiento completo de dicho sitio de unión. Esta forma de realización preferiblemente comprende además determinar a partir de una estructura secundaria de dicho ARN, una región que se hibrida a otra parte de dicho ARN (estructura cerrada) y una región que no se hibrida en dicha estructura (estructura abierta), y posteriormente generar un oligonucleótido que al menos superpone parcialmente dicho sitio de unión (putativo) y que superpone al menos parte de dicha estructura cerrada y superpone al menos parte de dicha estructura abierta. De esta manera aumentamos la posibilidad de obtener un oligonucleótido que es capaz de interferir con la inclusión de exón desde el pre-ARNm en el ARNm. Es posible que una primera región de enlace SR seleccionada no tenga la estructura cerrada-abierta solicitada en cuyo caso otro (segundo) sitio de unión a proteínas SR se selecciona que es luego posteriormente evaluado para la presencia de una estructura cerrada-abierta. Este proceso es continuado hasta que se identifica una secuencia que contiene un sitio de unión a proteínas SR al igual que una estructura cerrada-abierta (parcialmente superpuesta). Esta secuencia es luego usada para diseñar un oligonucleótido que es complementario a dicha secuencia.

[OOS9J Tal método de la divulgación para generar un oligonucleótido es también realizado por la inversión del orden descrito, es decir generando primero un oligonucleótido que comprende determinar, a partir de una estructura secundaria de ARN a partir de una CS, respectivamente el exón de IL-1RAcP, una región que asume una estructura que se hibrida a otra parte de dicho ARN (estructura cerrada) y una región que no se hibrida en dicha estructura (estructura abierta), y posteriormente generar un oligonucleótido, del cual al menos una parte de dicho oligonucleótido es complementaria de dicha estructura cerrada y del cual al menos otra parte de dicho oligonucleótido es complementaria de dicha estructura abierta. Esto es luego segu ido de la determinación de si un sitio de un ión a proteínas SR al menos se superpone con dicha estructura abierta/cerrada. De esta manera el método de WO 2004f083432 es mejorado. En otra forma de realización las selecciones son realizadas simultáneamente.

[0060J Sin desear quedar limitado por ninguna teoría se piensa actualmente que el uso de un oligonucleótido dirigido a un sitio de unión a proteínas SR resulta en el perjuicio (al menos parcialmente) de la unión de una proteína SR al sitio de unión de una proteína SR que resulta en un empalme interrumpido o perjudicado.

[0061] Preferiblemente, una estructura abierta/cerrada y un sitio de unión a proteinas SR se superpone parcialmente e incluso más preferido una estructura abiertafcerrada se superpone completamente a un sitio de unión a proteínas SR o un sitio de unión a proteínas SR se superpone completamente a una estructura abierta/cerrada. Esto permite una interrupción mejorada de la inclusión del exón.

[0062J Además de las secuencias de sitios de empalme de consenso, muchos (si no todos) exones contienen secuencias reguladoras de empalme tales como secuencias de potenciador de empalme exónico (ESE) para facilitar el reconocimiento de los sitios de empalme genuinos por el espliceosoma (15,16). Un subgrupo de factores de empalme, llamado las proteínas SR, se puede enlazar con estos ESE y recluta otros factores de empalme, tal como U1 y U2AF a sitios de empalme (definidos débilmente).

Los sitios de unión de las cuatro proteínas SR mas abundantes (SF2/ASF, SC35; SRp40 y SRp55) han sido analizados en detalle y estos resultados se implementan en el buscador ESE, una fuente de red que predice sitios de unión potenciales para estas proteínas SR (15,16). Hay una correlación entre la eficacia de un oligonucleótido y la presencia/ausencia de un sitio de unión SF2/ASF, SC35 y SRp40. En una forma de realización preferida, la invención así proporciona una combinación como se ha descrito anteriormente, donde dicha proteína SR es SF2/ASF o SC35 o SRp40.

[0063J En una forma de realización un oligonucle6tido, o un equivalente funcional del mismo es capaz de unirse específicamente a una secuencia de ARN reguladora que se requ iere para el empalme correcto de un exón en una transcripción. Diferentes secuencias de ARN que actúan en cis se requ ieren para el empalme correcto de exones en una transcripción. En particular, elementos suplementarios tales como potenciadores de empalme intrónico o exónico (ISE y ESE) o silenciadores (ISS y ESE) se identifican para regular empalme específico y eficaz de exones constitutivos y altemativos. Usando oligonucleótidos antisentido específicos de secuencía (AON) que se enlazan con los elementos, su función reguladora es perturbada de modo que el exón es saltado, como se muestra para DMD. Por lo tanto, en una forma de realización preferida un equivalente oligonudeótido o funcional de la misma se usa que es complementaria de un potenciador de empalme intrónico (ISE), un potenciador de empalme exónico (ESE), un silenciador de empalme intrónico (ISS) y/o un silenciador de empalme exónico (ESS). Como ya se ha descrito aquí antes, una C5, respectivamente el exón de IL-1RAcP esta en una forma de realización preferida saltada por un agente capaz de inhibir específicamente una señal de inclusión de exón de dicho exón, de modo que dicho exón no se reconoce por la maquina ria de empalme como una parte que necesita ser incluida en el ARNm. Como resultado, se forma un ARNm sin dicho exón.

[0064J Un oligonucleótido usado aquí es preferiblemente complementario a una parte consecutiva o una extensión contigua de 8 y 50 nucleótidos de una C5, respectivamente ARN de exón de IL-1 RAcP o una C5, respectivamente ARN de intrón de IL-1 RAcP. En una forma de realización un oligonucle6tido usado aquí es complementario a una parte consecutiva o una extensión contigua de 14 y 50 nucleótidos de una C5, respectivamente ARN de exón de IL-1RAcP o una C5, respectivamente ARN de intrón de IL-1 RAcP. Preferiblemente, dicho oligonucleótido es complementario a una parte consecutiva o extensión contigua de 14 y 25 nucleótidos de dicho exón de ARN. Mas preferiblemente, se usa un oligonudeótido que comprende una secuencia que es complementaria a una parte consecutiva o una extensión contigua de 20 y 25 nucleótidos de una C5, respectivamente ARN de exón de IL-1RAcP

o una C5, respectivamente ARN de intrón de IL-1RAcP. Por lo tanto tal oligonucleótido preferido, que es complementario de una parte consecutiva o una extensión contigua de 8 y 50 nucleótidos de una C5, respectivamente pre-ARNm del exón de IL-1RAcP induce la producción de una proteína C5a a la que le falta la región codificada por dicho exón, respectivamente una proteína IL-1RAcP a la que le falta la región codificada por dicho exón.

[0065J Diferentes tipos de monómeros de acidos nucleicos se pueden utilizar para generar un oligonucleótido. Un acido nucleico puede tener un esqueleto, un azúcar y/o una modificación de bases en comparación con un oligonucleótido basado en ARN. Las modificaciones de estructura preteridas incluyen pero no se limitan a: fosforoditioato, fosforotioato, un fosforotioato quiralmente puro, fosfonato de metilo, y/o fosfonato de H. Alternativamente o en combinación con una modificación de estructura, un acido nucleico puede tener una modificación de azúcar y/o una modificación de base. Modificaciones de azúcar preferidas incluyen: carno-azúcar y/o azazúcar incluyendo mixmeros. Otras modificaciones de azúcar incluyen: un acido nucleico bloqueado (ANB), un acido nucleico con puentes de etileno (ENA) yfo una variante de los mismos incluyendo mixmeros. Otras modificaciones de azúcar incluyen 2'-haluro y/o 2'-O-alquilo y/o modificaciones de 2'-O-alquilo(sustituido) tal como 2'-O-metilo, 2'-F, 2'-O-(2-metoxi)etilo 2'-O-etilo, 2'-O-alilo, 2'-O-butinilo, 2'-O-propargilo, 2'-O-(2-amino)etilo. La persona experta entendera que no se puede modificar cada azúcar de la misma manera. Diferentes azúcares modificados se pueden combinar en un acido nucleico único. Modificaciones de bases preferidas incluyen: un uracilo 5-halogenado yfo una citosina, un 5-aminometil-uracilo, una 2,6-diaminopurina, una 5-propargil-citosina, un 5-propargil-uracilo, una unión de G y sus derivados), una 5-metilcitosina-yfo un 5-metil-uracilo. La persona experta entendera que no se puede modificar cada base de la misma manera. Varias bases modificadas diferentes se pueden combinar en un acido nucleico único. Preferiblemente, dicho oligonucleótido comprende ARN, ya que los dúplex de ARNfARN son muy estables. Dado que uno de los objetivos de la técnica de salto de exón es dirigir el empalme en un sujeto, se prefiere que un ARN oligonucleótido comprenda una modificación que proporcione el ARN con una propiedad adicional, por ejemplo resistencia a endonucleasas, exonucleasas, y RNasaH, fuerza de hibridación adicional, estabilidad aumentada (por

ejemplo en un flu ido corporal), flexibilidad aumentada o disminu ida, toxicidad reducida , transporte intracelular

aumentado , especificidad de tejido , etc. Mod ificaciones preferidas han sido identificadas arriba .

Preferiblemente dicho oligonucleótido comprende o consiste en monómeros de ARN de 2'-Ometilo conectados a

través de un esqueleto de fosforotioato.

S: Una forma de realización asi proporciona un oligonucleótido que comprende ARN que contiene además una

modificación , preferiblemente una ribosa mod ificada de 2'-0-metilo (ARN) , más preferiblemente un ARN de 2'-0

metilfosforotioato .

[0066J En una forma de realización la invención proporciona un oligonucleótido híbrido que comprende

10: modificaciones oligorribonucleótidas de 2'-0-metil fosforotioato y monómeros de ácido nucleico bloqueados.

Este oligonucleótido particular comprende mejor especificidad de secuencia en comparación con un equivalente

consistente en ácido nucleico bloqueado solo , y comprende efectividad mejorada cuando se compara con un

oligonucleótido consistente en modificación oligorribonucleótida de 2'-0-metil fosforotioato .

Por lo tanto en una forma de realización preferida, un oligonucleótido comprende ARN y preferiblemente dicho ARN

15: contiene una modificación, más preferiblemente una ribosa modificada de 2'-0-metilo (ARN) o modificación de

desoxirribosa (ADN) o donde dicho equivalente funcional de dicho oligonucleótido comprende PNA, ácido nucleico

de péptido que contiene carbaborano, (LNA) , (ENA), ácido nucléico desbloqueado (UNA), ácido nucleico de glicol

(GNA), fosforod iamidato de morfolino, o cualquier combinación de los mismos , de la forma más preferible

fosforodiamidato de morfol ino.

20: En una forma de realización preferida , un oligonucleótido tiene un esqueleto , un azúcar y/o una mod ificación de

bases en comparación con un oligonucleótido basado en ARN , preferiblemente donde el oligonucleótido comprende

o consiste en uno o más 2'-0-metil fosforotioato y/o un nucleótido de fosfordiam idato de morfolino.

[0067] Cada una de las modificaciones de bases, azúcar, de la estru ctura identificadas se considera que aumentan o

25: mejora n la capacidad del oligonucleótido para inducir el salto del exón objetivo.

[0068J Con la llegada de la tecnología de imitación de ácido nucleico se ha vuelto posible generar moléculas que

tienen similares, preferiblemente las mismas características de hibridación en cuanto al tipo y no necesar iamente a

la cantidad como el ácido nucleico mismo.

30: Tales equ ivalentes funcionales son por supuesto también adecuados para usar en la invención.

Ejemplos preferidos de equ ivalentes funcionales de un oligonucleótido son PNA y/o LNA.

De la forma más preferible, se usa un fosforodiamidato de morfol ino.

Ejemplos adecuados pero no limitativos de equ ivalentes de ol igonucleótidos de la invenció n se pueden encontrar en

17-23.

35: Híbridos entre uno o más de los equivalentes entre ellos y/o junto con ácido nucleico son por supuesto también

adecuados .

En una forma de realización preferida LNA se usa como un equ ivalente funcional de un ol igonucleótido, ya que LNA

muestra una afinidad objetivo más alta y toxicidad reducida.

LNA también muestra una eficiencia más alta de sallo de exón.

40

[0069] También se proporciona un oligonucleótido que comprende al menos 8, preferiblemente 16 a 80 , nucleótidos

consecutivos que son complementarios a un primer exón de una CS, respectivamente pre-ARNm de IL-1 RAcP y

donde se usa una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 8, preferiblemente 16 a 80 , nucleótidos

consecutivos que son complementarios a un segundo exón de dicho CS, respectivamente pre-ARNm de IL-1RAcP .

45

[0070J En una forma de realización preferida de la divulgación dicho primer y dicho segundo exón se separan en

dicha CS, respectivamente pre-ARNm de IL-1RAcP por al menos un exón con el que dicho oligonucleótido no es

complementario.

Alternativamente , dicho primer y dicho segundo exón son adyacentes.

50

[0071] Es posible promover específicamente el sallo de también los exones intervinientes mediante una conexión

entre los dos ol igonucleótidos complementarios.

Por lo tanto, en una forma de realización extensiones de nucleótidos complementarias a al menos dos CS ,

respectivamente exones de IL-1RAcP se separan por una fracción de conexión.

55: Al menos dos extensiones de nucleótidos son así enlazadas en esta forma de realización para formar una molécula

única.

Además se proporciona en la divulgación por lo tanto un oligonucleótido, o equivalente funcional del mismo que es

complementario a al menos dos partes de dos exones en una CS, respectivamente pre-ARNm de IL-1RAcP, dicho

equ ivalente oligonucle6tido o funcional que comprende al menos dos partes donde una primera parte comprende un

60: oligonucleótido ten iendo al menos 8, preferiblemente 16 a 80, nucleótidos consecutivos que son complementarios a

un primer de dichos al menos dos exones y donde una segunda parte comprende un oligonucleótido teniendo al

menos 8, preferiblemente 16 a 80 , nucleótidos consecutivos que son complementarios a un segundo exón en dicha

CS, respectivamente pre-ARNm de IL-l RAcP.

La conexión puede ser a través de cualqu ier medio pero es preferiblemente realizada a través de una conexión de

65: nucleótido.

En este último caso el número de nuc!eótidos que no contienen un recubrimiento entre uno u otro exón complementario pueden ser cero, 1, 2,3 o 4 a 40 nucleótidos. La fracción de conexión puede ser cualquier tipo de fracción capaz de conectar oligonucleótidos. Preferiblemente, dicha fracción de conexión comprende al menos 4 nuc!eótidos de uracilo. Actualmente, muchos compuestos diferentes estan disponibles que imitan caracteristicas de hibridación de oligonucleótidos. Tal compuesto, llamado aquí un equivalente funcional de un oligonucleótido, es también adecuado para la presente invención si tal equivalente comprende características de hibridación similares en cuanto al tipo y no necesariamente en cuanto a la cantidad. Equivalentes funcionales adecuados son mencionados anteriormente en esta descripción. Tal y como se menciona, un oligonucleótido de la invención no tiene que consistir solo en oligonucleótidos que contribuyen a la hibridación al exón objetivo. Puede haber material ad icional ylo nuc!eótidos añadidos.

[00721 Los rangos de dosis de oligonucleótidos según la invención o divulgación son preferiblemente diseñados basándose en estudios de dosis crecientes en pruebas clínicas (uso in vivo) para las cuales existen requisitos de protocolo rigurosos. Una molécula o un oligonucleótido tal y como se define aquí se puede usar a una dosis que es de 0,1 a 60 mglkg, preferiblemente de 0,5 a 55 mglkg. En una forma de realización preferida, se usa una concentración de un oligonucleótido tal y como se define aqui, que es de 0,1 nM a 1 IJM. Preferiblemente, esta gama es para uso in vitro en un modelo celular tal como células hepáticas o tejido hepático. Mas preferiblemente, la concentración usada es de 0,3 a 700 nM, aún mas preferiblemente de 1 a 600 nM , aún mas preferiblemente de 50 a 550 nM. Si se usan diferentes oligonucleótidos, esta concentración o dosis puede referirse a la concentración total o dosis de oligonucleótidos o la concentración o dosis de cada oligonucleótido añadido.

[0073J Las gamas de concentración o dosis de oligonucleótido(s) como se dan arriba son concentraciones preferidas

o dosis para uso in vitro o ex vivo. La persona experta entenderá que dependiendo del(los) oligonucleótido(s) usado(s), la célula objetivo a tratar, el gen objetivo y sus niveles de expresión, el medio usado y la transfección y condiciones de incubación, la concentración o dosis de oligonucleótido(s) usado(s) puede variar aún mas y puede necesitar ser optimizada algo mas. En una forma de realización preferida, tal molécula, preferiblemente oligonucleótido es preferiblemente un medica mento o para uso como un medicamento. Más preferiblemente, dicho medicamento es para prevenir o tratar un trastorno inflamatorio en un sujeto que lo necesite. En el contexto de la invención, un trastomo inflamatorio es cualquier enfermedad o condición inflamatoria y preferiblemente se refiere a una enfermedad, trastomo, u otra condición médica que al menos en parte resulta o se agrava por una proteína C5a o por señalización de IL-1 . Ejemplos de enfermedades o condiciones inflamatorias incluyen, pero de forma no limitativa, artritis reumatoide (RA), artritis reumatoide juvenil, psoriasis, artritis psoriatica, espondilitis anquilosa, enfermedad inflamatoria intestinal (incluyendo enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa), hepatitis, sepsis, enfermedad hepática alcohólica, y esteatosis no alcohólica, nefritis, tal como nefritis glomerular, asma, endocarditis, miastenia grave Como se usa aquí, el término ·hepatit is~ se refiere a una enfermedad, condición, o trastorno gastroenterológico que se caracteriza, al menos en parte, por inflamación del hígado. Ejemplos de hepatitis incluyen, pero de forma no limitativa, hepatitis asociada al virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, o inflamación del hígado asociada a isquemiafrepelfusiÓn.

[0074J Aún más preferiblemente, dicho medicamento es capaz de reducir la cantidad de una C5a, respectivamente aumentar la cantidad de un IL-1RAcP soluble tal y como se define aquí anteriormente. En una forma de realización más preferida, dicho medicamento es capaz de aliviar uno o más síntoma(s) de un paciente tratado ylO una o mas caracteristica(s) o parametro(s) de una célula o tejido de un paciente tratado esfson mejorado(s) utilizando una molécula o una composición de la invención. Para cada enfermedad inflamatoria, la persona experta conoce al menos un síntoma, parámetro o característica, valores de dicho para metro o característica asociados a dicha enfermedad y cómo valorar cada uno de éstos. Mas abajo, damos un parámetro específico para artritis reumatoide. La artritis reumatoide es una enfermedad que es preferiblemente diagnosticada después de haber evaluado el índice de puntuación de actividad de enfermedad (Das) o el DAS28 relativo (van Riel P.L.C.M., (2001), Best Practice Research Clinical Rheumatology, 15: 67-76) con las mediciones de diferentes parámetros y síntomas en un sujeto. La evaluación de dichos índices se puede realizar por un médico al examinar a un sujeto. En una forma de realización más preferida, dicho medicamento es capaz de aliviar uno o más síntoma(s) a partir de un paciente tratado ylo una o más característica(s) o parámetro(s) de una célula o tejido a partir de un paciente tratado eslson mejorado(s) utilizando una molécula o una composición de la invención o divulgación cuando dicho medicamento es capaz de inducir un cambio significativo en el DAS o DAS28. Otras vías de evaluar la artritis reumatoide están también descritas en (van Riel P. L.C.M., (2001), Best Practice Research Clinical Rheumatology, 15: 67-76 y en Gester A.M., (1999), Bailliére's Clinicallmmunology, 13: 629-644).

Un medicamento tal y como se define aquí es capaz de mejorar un parámetro si después de al menos una semana, un mes, seis meses, un año o más de tratamiento utilizando una molécula capaz de alterar el empalme de un pre ARNm que codifica una es para reducir la cantidad de una eSa y/o capaz de alterar el empalme de un pre-ARNm que codifica un IL-1RAcP para aumentar la cantidad de un IL-1RAcP soluble, el valor de dicho parametro ha sido mejorado de al menos 1%, 2%, 5%, 10% o más por comparación del valor de dicho parámetro antes de la aparición del tratamiento. Un medicamento tal y como se define aquí es capaz de aliviar un síntoma o una característica de un paciente o de una célula, tejido u órgano o dicho paciente si después de al menos una semana, un mes, seis meses, un año o más de tratamiento utilizando una molécula capaz de alterar el empalme de un pre-ARNm que codifica una es para reducir la cantidad de una eSa y/o capaz de alterar el empalme de un pre-ARNm que codifica un IL-1RAcP para aumentar la cantidad de un IL-1RAcP soluble, dicho sintoma o caracteristica ya no es detectable.

[0075] Un oligonucleótido como se define aquí para uso segun la invención o divulgación puede ser adecuado para la administración a una célula, tejido yfo un órgano in vivo de individuos afectados por o en riesgo de desarrollar un trastorno inflamatorio, y puede ser administrado in vivo, ex vivo o in vitro. Dicho oligonucleótido puede ser administrado directa o indirectamente a una célula, tejido y/o un órgano in vivo de un individuo afectado por o en riesgo de desarrollar un trastorno inflamatorio, y se puede administrar directamente o indirectamente in vivo, ex vivo o in vitro. Un oligonucleótido de la invención o divulgación debería ser capaz de ser entregado en todas partes donde se expresa o produce C5 , IL 1 RAcP. Ya que es y IL-1 RAcP soluble se expresan principalmente o se producen en el hígado de cualquier sujeto se prefiere que un oligonucleótido de la invención o divulgación pueda ser entregado a una célula hepática, y/o a un tejido hepático y/o a un hígado. Preferiblemente dichas células son las celulas de un individuo que sufre de un trastorno inflamatorio. Preferiblemente dicho tejido es un tejido de un individuo que sufre de un trastorno inflamatorio. Preferiblemente dicho hígado es un hígado de un individuo que sufre de un trastorno inflamatorio.

[0076J Un oligonucleótido de la invención o divulgación se puede administrar indirectamente usando medios adecuados conocidos en la técnica. Un oligonucleótido puede por ejemplo ser proporcionado a un individuo o una célula, tejido u órgano de dicho individuo en forma de un vector de expresión donde el vector de expresión codifica una transcripción que comprende dicho oligonucle6tido. El vector de expresión es preferiblemente introducido en una célula, tejido, órgano o individuo por medio de un vehículo de entrega de genes. En una forma de realización preferida de la divulgación, se proporciona un vector de expresión con base vírica que incluye un casete de expresión o un casete de transcripción que conduce expresión o transcripción de una molécula como se identifica aquí. Un vehículo de entrega preferido es un vector vírico tal como un vector de virus adeno-asociado (AAV), o un vector retrovírico tal como un vector de lentivirus (24-26) y similar. También plásmidos, cromosomas artificiales, plásmidos adecuados para recombinación homóloga prevista e integración en el genoma humano de células pueden ser adecuadamente aplicados para la entrega de un oligonucleótido tal y como se define aquí. Preferido para la divulgación actual son aquellos vectores donde la transcripción es conducida por promotores PolIlI, yfo donde los transcritos están en la forma de fusiones con transcritos U1 o U7, que producen buenos resultados para entregar transcritos pequeños. Es competencia del técnico diseñar los transcritos adecuados. Son preferidos los transcritos conducidos por PolIl!. Preferiblemente en forma de una transcripción de fusión con un transcrito U1 o U7 (24-26). Tales fusiones se pueden generar como se describe (27,28). El oligonucleótido se puede entregar como está. Sin embargo, el oligonudeótido también se puede codificar por el vector vírico. Típicamente este está en forma de una transcripción de ARN que comprende la secuencia del oligonucleótido en una parte de la transcripción .

[0077] Mejoras en los medios para proporcionar a un individuo o una célula, tejido, órgano de dicho individuo, un oligonucleótido y/o un equivalente del mismo, son anticipados considerando el progreso que ya se ha conseguido. Tales mejoras futuras pueden por supuesto ser incorporadas para conseguir el efecto mencionado en la reestructuración de ARNm usando un método de la divulgación. Un oligonucleótido y/o un equivalente del mismo se puede entregar como está a un individuo, una célula, tejido u órgano de dicho individuo. Cuando se administra un oligonucleótido y/o un equivalente del mismo, se prefiere que un oligonucle6lido y/o un equivalente del mismo sea disuelto en una solución que sea compatible con el método de entrega. Para administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, intratecal y/o intraventricular se prefiere que la solución sea una solución salina fisiológica. Particularmente preferido en la invención o divulgación es el uso de un excipiente que ayudará en la entrega de cada uno de los constituyentes tal y como se define aquí a una célula y/o en una célula, preferiblemente una célula hepática.

Preferidos son excipientes capaces de formar complejos, nanopartículas, micelas, vesículas y/o liposomas que entregan cada constituyente tal y como se define aquí, en complejo o retenidos en una vesicula o liposoma a través de una membrana celular. Muchos de estos excipientes se conocen en la técnica. Excipientes adecuados comprenden polietilenimina (PEI), o polímeros catiónicos similares, incluyendo polipropilenimina o copolímeros de polietilenimina (PEC) y derivados, anfifilos sintéticos (SAINT-18), lipofectina TM, proteinas cápsidas DOTAP y/o viricas que son capaces de autoensamblarse en partículas que pueden entregar cada constituyente tal y como se define aqui a una célula, preferiblemente una célula hepática. Tales excipientes han sido mostrados para entregar eficazmente un oligonucleótido tal como ácidos nucleicos antisentido a una amplia variedad de células cultivadas, incluyendo células hepáticas. Su alto potencial de transfección se combina con una baja a moderada toxicidad exceptuada en cuanto a supervivencia de la célula en general. La facilidad de modificación estructural puede utilizarse para permitir otras modificaciones y el análisis de sus otras características de transferencia de ácidos nucleicos (in vivo) y toxicidad.

[0078J La lipofectina representa un ejemplo de un agente de transfección liposómica. Consiste en dos componentes lipídicos, un lípido catiónico cloruro de N-[1-(2,3 dioleoiloxi)propil)-N,N,N trimetilamonio (DOTMA) (cp. DOTAP que es la sal de metilsulfato) y una dioleoilfosfatidiletanolamina de lípido neutra (DOPE). El componente neutro media la liberación intracelular. Otro grupo de sistemas de entrega son nanoparticulas poliméricas.

[0079J Policationes tales como dietilaminoetilaminoetilo (DEAE)-dextrano. que son bien conocidos como reactivo de transfección de ADN se pueden combinar con butilcianoacrilato (PBCA) y hexilcianoacrilato (PHCA) para formular nanoparticulas catiónicas que pueden entregar cada constituyente tal y como se define aquí, preferiblemente un 0li90nucleótido a través de membranas celulares en células.

[0080J Además de estos materiales de nanoparticulas comunes, la protamina de péptido catiónico ofrece un método alternativo para formular un 0li90nucleótido con coloides. Este sistema de nanopartícula coloidal puede formar los llamados proticles, que se pueden preparar por un proceso de autoensamblaje simple para empaquetar y mediar la liberación intracelular de un oligonucleótido. La persona experta puede seleccionar y adaptar cualquiera de los anteriores u otros excipientes alternativos dispon ibles comercialmente y sistemas de entrega para empaquetar y entregar un ol igonucleótido para usar en la presente invención o divulgación para entregarlo para el tratamiento de un trastorno inflamatorio en seres humanos.

[0081J En otra forma de realización, un oligonucleótido podría ser enlazado de manera covalente o no convalente a una molécula. Una molécula preferida es un ligando tal y como se define abajo y/o una molécula que allera la estabilidad y/o farmacocinética y/o farmacodinámica de dicho oligonucleótido. Cada uno de estos parámetros (es decir estabilidad y/o farmacocinética y/o farmacodinámica) podrían ser evaluados usando ensayos conocidos por la persona experta.

[0082] Un oligonucleótido podría ser enlazado de manera covalente o de manera no covatente a un ligando específicamente diseñado para facilitar la absorción en la célula, citoplasma y/o su núcleo. Tal ligando podría comprender (i) un compuesto (incluyendo pero no limitado a estructuras (tipo) peptídicas) que reconoce elementos específicos de célula, tejido u órgano que facilitan la absorción celular y/o (ii) un compuesto químico capaz de facilitar la absorción en células y/o la liberación intracelular de un oligonucleótido de veslculas, por ejemplo endosomas o liso somas.

[0083J Por lo tanto, en una forma de realización preferida, un oligonucleótido se formula en una composición o un medicamento o una composición que está provista de al menos un excipiente y/o un ligando para la entrega y/o un dispositivo de entrega del mismo a una célula y/o aumentando su entrega intracelular. Por consiguiente, la invención también abarca una composición farmacéuticamente aceptable que incluye un oligonucleótido y además que comprende al menos un excipiente y/o un ligando para la entrega y/o un dispositivo de entrega de dicho oligonucleótido a una célula y/o aumentando su entrega intracelular. Dependiendo de su identidad, la persona experta sabré qué tipo de formulación es la más apropiada para cada constituyente tal y como se define aquí. En una forma de realización preferida, la invención proporciona una composición o una preparación que está en forma de un equipo de partes que incluyen un oligonucleótido y otro compuesto complementario como se define aquí más adelante.

[00841 Un oligonucleótido preferido tal y como se define aquí es para prevenir o tratar un trastorno inflamatorio en un ind ividuo. Un individuo que se puede tratar utilizando un oligonucleótido de la invención puede ya haber sido diagnosticado por tener un trastorno inflamatorio.

Alternativamente un ind ividuo que se puede tratar utilizando un oligonucleótido de la invención o divulgación puede no haber sido aún diagnosticado por tener un trastorno inflamatorio pero puede ser un individuo con un riesgo aumentado de desarrollar un trastorno inflamatorio en el futuro dados sus antecedentes genéticos. Un individuo preferido es un ser humano.

Composición

[0085] En otro aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende una molécula, preferiblemente un oligonucle6tido tal y como se define aquí. Preferiblemente, dicha composición comprende al menos dos oligonucleótidos diferentes tal y como se define aquí; uno diseñado para poder alterar el empalme de un pre-ARNm de una C5 para reducir la cantidad de C5a y el otro siendo capaz de alterar el empalme de un pre-ARNm que codifica un IL-1RAcP para aumentar la cantidad de IL1RAcP soluble y/o reducir la activación de NF-KB y/o reducir la liberación de IL-6/ICAM-1 y/o reducir la cantidad de IL-1 Iibre. Alternativamente en esta divulgación, estos dos oligonucleótidos diferentes se diseñan para saltar dos o más exones diferentes de una C5, respectivamente pre-ARNm de IL-1RAcP como se ha definido en la presente anteriormente para salto de multi-exón. En una forma de realización preferida, dicha composición es preferiblemente una composición farmacéutica dicha composición farmacéutica comprende un portador, diluyente yfo excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal composición farmacéutica puede comprender cualquier portador, relleno, conservante, solubilizador, diluyente yfo excipiente farmacéutica mente aceptable es también proporcionado. Tal portador farmacéulicamente aceptable, relleno, conservante, solubilizador, diluyente y/o excipiente puede por ejemplo encontrarse en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 208 edición. Baltimore, MD: Lippincott Wil1iams & Wilkins, 2000. Cada característica de dicha composición ha sido definida anteriormente aquí. Si se usan varios oligonucleótidos, concentración o dosis ya definidas aquí pueden referirse a la concentración total

o dosis de todos los oligonucleótidos usados o la concentración o dosis de cada oligonucleótido usado o añadido. Por lo tanto, en una forma de realización, se proporciona una composición donde cada oligonucleótido o la cantidad total usada se dosifica en una cantidad que oscila entre 0,5 mgfkg y 60 mgfkg.

[0086J En otro aspecto, se proporciona el uso de un oligonucle6tido o de una composición tal y como se define aquí para la producción de un medicamento para prevenir o tratar un trastorno inflamatorio en un individuo. Cada característica de dicho uso ha sido definida anteriormente aquí. Un tratamiento en un uso o en un método según la invención es al menos una semana, al menos un mes, al menos varios meses, al menos un año, al menos 2, 3, 4, 5, 6 años o mas. Cada molécula u oligonucleótido o equivalente del mismo tal y como se define aquí para el uso según la invención puede ser adecuado para dirigir la administración a una célula, tejido yfo un órgano in vivo de individuos afectados por un trastorno inflamatorio o en riesgo de desarrollarlo, y se puede administrar directamente in vivo, ex vivo o in vitro. La frecuencia de administración de un oligonucleótido, composición, compuesto de la invención puede depender de diferentes para metros como la edad del paciente, la mutación del paciente, el número de moléculas (es decir dosis), la formulación de dicha molécula. La frecuencia puede ser a dia rio, semanalmente u oscilar entre al menos una vez en dos semanas, o tres semanas o cuatro semanas o cinco semanas o un período de tiempo mas largo.

[0087] En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un método para el alivio de uno o mas síntoma(s) de un trastorno inflamatorio en un individuo, en una célula, tejido u órgano de dicho individuo o el alivio de una o más característica(s) o síntoma(s) de una célula, tejido u órgano de dicho individuo, el método comprendiendo la administración a dicho individuo de un oligonucleótido o una composición tal y como se define aquí. Además se proporciona un método para el aumento, inducción o promoción de un salto de un exón a partir de una C5 respectivamente pre-ARNm de IL-1 RAcP en una célula que expresa dicho pre-ARNm en un individuo que sufre de un trastorno inflamatorio, el método comprendiendo la administración a dicho individuo de un oligonucleótido o una composición tal y como se define aquí. Se proporciona también un método para aumentar la producción de un IL-1 RAcP soluble y/o disminuir la producción de una C5a en una célula, dicha célula comprendiendo un pre-ARNm de un gen que codifica un IL-1RAcP respectivamente una CS, el método comprendiendo proveer dicha célula con un oligonucleótido o composición de la invención y permitir la traducción de ARNm producido a partir del empalme de dicho pre-ARNm. En una forma de realización de la invención dicho método es realizado in vitro, por ejemplo utilizando un cultivo celular. Preferiblemente en la divulgación, dicho método es in vivo. Cada característica de estos métodos ha sido ya definida aquí. En un método de la invención, un oligonucleótido se puede combinar con un compuesto adicional conocido por usarse para tratar un trastorno inflamatorio en un individuo.

Tal compuesto puede ser un anticuerpo, un DMARD (farmacos antirreumaticos modificadores de la enfermedad), un NSAID (agentes antiinflamatorios no esteroideos) yfo un AON diferente o distinto. Alternativamente o en combinación con el aumento de la producción de un IL-1RAcP soluble, un AON puede reducir la activación de NF-KB y/o reducir la liberación de IL-6I1CAM-1 y/o reducir la cantidad de IL-1 libre como se ha definido en la presente anteriormente.

[0088] En toda la aplicación, cuando uno se refiere a un IL-1, un IL-1RAcP, una C5, una eSa, un IL-6, uno se refiere a la proteína o péptido a menos que se indique lo contrario. Por lo tanto, un IL-1 se puede sustituir con una proteina IL-1. A menos que se indique lo contrario cada forma de realización como se describe en este caso se puede combinar con otra forma de realización como se describe en este caso.

[0089] En este documento y en sus reivindicaciones, la palabra "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para significar que los elementos después de la palabra estan incluidos, pero los elementos no específicamente mencionados no estan excluidos. Ademas la palabra "consistir" se puede sustituir por "consistir esencialmente de" que significa que una molécula o un oligonucleótido tal y como se define aquí puede comprender componente(s) adicional(es) a aquellos específicamente identificados, dicho(s) componente(s) adicional(es) no alterando la característica única de la invención.

[0090J Ademas, la referencia a un elemento por el articulo indefinido "un" no excluye la posibilidad de que mas de uno del elemento esta presente, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. El articulo indefinido "un" así normalmente significa "al menos un".

[0091] La palabra "aproximadamente" cuando se usa en asociación con un valor numérico (aproximadamente 10) preferiblemente significa que el valor puede ser el valor dado de 10 mas o menos 1% del valor.

[0092J La invención es posteriormente explicada en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no limitan el ambito de la invención, sino Que sirven simplemente para clarificar la invención.

Breve descripción de los dibujos

[0093] Figura 1. AON dirigidos al exón 17 de pre-ARNm de C5 de ratón con inlrones flanqueantes Figura 2. Células L929 fueron transfectadas con AON indicados a una concentración final de 500 nM. Después de 24 horas ARN fue aislado para sallar exones y analizados por RT-PCR Figura 3. AON dirigidos al exón 9 de pre-ARNm de IL-1RAcP de ratón con intrones flanqueantes. Figura 4. Células NIHf3T3 fueron transfectadas con AON indicados a una concentración final de 500 nM. Después de 24 horas el ARN fue aislado para saltar exones y analizados por RT-PCR. Figura 5: AON dirigidos al exón 17 de pre-ARNm de C5 humano. Figura 6: AON dirigidos al exón 9 de pre-ARNm de IL-1RAcP humano con intrones flanqueantes Figura 7: Células HEP-G2 fueron transfectadas con AON ind icados a una concentración fi nal de 500 nM. Después de 24 horas el ARN fue aislado para saltar exones y analizado por RT-PCR. Figura 8:

[0094J 1-30; resultados RT-PCR de células NIH-3T3 tratadas con AON diferentes en concentraciones diferentes para saltar el exón 9 de IL-1RAcP.

1: 300-21 meros 20 nM

2: 300-21 meros 50 nM

3: 300-21 meros 100 nM

4: 300-21 meros 200 nM

5: 300-21 meros 500 nM

6: 300-25 meros 20 nM

7: 300-25 meros 50 nM

8: 300-25 meros 100 nM

9: 300-25 meros 200 nM

10: 300-25 meros 500 nM

11: 327-21 meros 20 nM

12: 327-21 meros 50 nM

13: 327-21 meros 100 nM 14:327-21 meros200nM

15: 327-21 meros 500 n M

16: 327-25 meros 20 nM

17: 327-25 meros 50 nM

18: 327-25 meros 100 nM

19: 327-25 meros 200 n M

20: 327-25 meros 500 n M

21 : 300-LNA 10 nM

22: 300-LNA 20 nM

23: 300-LNA 50 nM

24: 300-LNA 100 nM

25: 300-LNA 200 nM

26: 300-LNA 500 nM

27: control positivo

28: control negativo

29: No transfectado

30: Mock-transfectado

Marcador M

[0095] 31-55; resultados RT-PCR de células L929 tratadas con AON diferentes en concentraciones diferentes para salto de exón 17 de C5 .

31 : 329-21 mero 20 nM

32: 329-21 mero 50 nM

33: 329-21 mero 100 nM

34: 329-21 mero 200 nM

35: 329-21 mero 500 nM

36: 329-25 mero 20 nM

37: 329-25 mero 50 nM

38: 329-25 mero 100 nM

39: 329-25 mero 200 nM

: 40 : 329-25 mero 500 nM

: 41 : 329-LNA 10 nM

: 42 : 329-LNA 20 nM

: 43 : 329-LNA 50 nM

: 44 : 329-LNA 100 nM

: 45 : 329-LNA 200 nM

46: 329-LNA 500 nM

: 47 : 354-25 mero 20 nM

: 48 : 354-25 mero 50 nM

: 49 : 354-25 mero 100 nM

50: 354-25 mero 200 nM

51 : 354-25 mero 500 nM

52: No transfectado

53: Mock-transfectado

54: Control positivo

55: Control negativo

[0096J Figura 9: Comparación de eficacias de saltos de diferentes AON para IL-1RAcP en concentraciones diferentes con qPCR.

[0097J Figura 10: Resultados de RT-PCR de muestras de hígado tratadas con cantidad diferente de AON PS-300 y resultados de secuenciación.

a) 50 mg/kg IP durante 8 días para AON de IL-1 RAcP . Sacrificados en el día 1 post-inyección b) 100 mg/kg IV durante 4 o 3 días. Sacrificados en el día 1 post-inyección c) análisis de secuencias de la banda inferior.

[0098J Figura 11 : resultados de RT-PCR de muestras de hígado tratadas con cantidad diferente de PS-329 de AON y resultados de secuenciación.

a) inyección IV de C5-AON durante 4 días 100mg/kg Sacñ. Día 1 post-inyección, AON de control (4 días 50mglkg) b) IV CS AON durante 3 días con 100mg/kg AON. mi Sacñ. Día 1 post-inyección m2 Sacrf. Día 5 post-inyección c) resultados de secuenciación

Ejemplos

Ensayo de complemento hemolítico

[0099] AONc de CS y C5?17 (sin exón 17) fueron sintetizados y ligados al vector de pcONA 3.1 (-). Células de riñón embrionario humano (HEK 293) seran transfectadas con bien CS o CS?17 que contienen el vector de expresión, y cultivadas en medio que contiene G-418 para seleccionar colonias positivas. Las colonias positivas luego creceran en condiciones sin suero y el medio de cultivo sera recogido, purificado y evaluado para la presencia de CS y CSÓ17 por Westem blol. Los sobrenadantes purificados que seran sometidos a ensayo de complemento hemolílico que mostraran si CSb intacto está presente o no. En este ensayo funcional ambos sobrenadantes sera n tratados con suero carente de CS que esta solución sera incubada con células de glóbulos rojos. El grado de lisis med iada por CSb-9 será determinado por la lectura de 00 a 41Snm .

Materiales & Métodos (para todos los ejemplos)

Diseño de AON y química:

[0100J AON fueron diseñados basados en el criterio previamente discutido en Aartsma-Rus et al., 2009 (.Aartsma Rus el al., Guidelines for antisense oligonucleotide design and insight in splice modulating mechanisms, Mol Ther. 2009 Mar; 17(3):548-53). Las ubicaciones de potenciador de empalme exónico (ESE) potenciales o para secuencias de sitios de empalme 5'/3' fueron predichas usando ESE finder 3.0 (http://rulai.cshl.edu/tools/ESEI). la estructura secundaria del pre-ARNm como se predice por M-FOlD (http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applicationsfmfoldf) fue también considerada. AON fueron 21-2Smeros con moléculas de 2'O-metil ribosa y un esqueleto de fosforotioato completo (Prosensa). Las secuencias de los AON se proporcionan en el listado de secuencias. AON de control del marcador S'FAM fue usado para probar la eficiencia de transfección en células diana. Adicionalmente, AON seleccionados fueron bien modificados mediante el aumento de su longitud a 2Smeros y/o por incorporación de algunas modificaciones (LNA) de acido nucleico bloqueado para aumentar sus eficacias para los objetivos. Para diseñar estos AON, los criterios en http:f{www.exigon.comfcuslom-antisense-oligonucleotides fueron usados.

Cultivo celular:

[0101] Líneas celulares L929 (tejido conjuntivo de ratón), NIH-3T3 (fibroblasto embrionario de ratón) y HEPG2 (carcinoma de higado hepatocelular humano) fueron mantenidas en DMEM + 2mM l-glutamina + 10% FCS+ 1x Pen-Strep a 37C en 5% C02. Se usaron para probar el salto de exón usando AON para mIL-1RAcP, mCS y h1L-1 RAcP/hCS, respectivamente.

Entrega de AON en el cultivo celular:

[0102J Células L929 y NIH-3T3 crecieron en medio que contenía DMEM +10%FBS+ 1%Pen-Strep y pasadas cuando se acercaban a confluencia con 0,25% de tripsina para proporcionar cultivos experimentales en placas de 6 pocillos. En el dia de transfección de las células (0,5-1 106 célulasfpocillo de una placa de 6 pocillos) fueron cultivadas en OMEM+ 10% de FCS (en ausencia de antibióticos). Después de 3-4 a 5-6 horas, las células fueron transfectadas con mezclas de Lipofectamine 2000 + AON preparadas según el procedimiento del fabricante (Invitrogen). La concentración final de AON fue ajustada a SOOnM, 200nM o 100nM en experimentos diferentes. Cada AON ha sido evaluado 3 veces para determinar la eficiencia de salto. Solución de transfección para un pocillo de una placa de seis pocillos fue preparada de la siguiente manera: AON fueron diluidas en medio reducido de suero Optimem de 2S0jJI (concentración final de AON cuando se añade a células fueron 100nM, 200nM, 100nM, SOnM, 20nM o 10nM, dependiendo del propósito del experimento). Ademas SjJl de Lipofectamine fueron diluidos en 2S0jJI de Optimem y ambas diluciones fueron incubadas durante 5 min a temperatura ambiente. Luego las dos diluciones fueron mezcladas (volumen total 500 ¡JI), incubadas durante 20 mino y añadidas a las placas de células fueron agitadas hacia atrás y hacia adelante unas pocas veces e incubadas a 37" C con 5% COz. El medio de transfección se cambió después de 6-8 horas con DMEM +10%FBS y las células fueron preparadas para aislamiento de ARN despuéS de 18-24 horas.

Aislamiento de ARN y PCR de transcripción inversa:

[0103J 24 horas después de transfección del AON de 106 células el ARN total fue aislado utilizando el reactivo de Trizol (Invitrogen). ADNc fue sintetizado con Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit usando cebadores de hexamero aleatorio según el procedimiento del fabricante (Rache). 2 IJl de ADNc fueron usados en reacción de PCR con la concentración final de 50 IJL. Secuencias de cebador son de 5' a 3' mC5 F(orward): aaacgcagatgactcccatt, mC5 R(everse): acgcgatgaatttcccatag, mll-1RAcP F: gaggatctcaggcgcaacta, mll-1RAcP R: tcagcagcacaaattcctctt, hC5 F: ttctcaggccaagaagaacg, hC5 R: gggcaaactgcaactgtttt, hll-l RAcP F: caagcgcagctatgtctgtc, hll-1RAcP R: tctcggtcaaagatgcacag. Gen de Beta Actina (ACTB) fue usado como control positivo, ACTB F: actgctctggctcctagcac, ACTB R:ccaccgatccacacagagta. Estos cebadores se identifican por SEQ ID NO: 43-52 en el listado de secuencias. Productos de PCR fueron analizados en 1,5% de gel de agarosa manchado con EtBr. Para la secuenciación, los productos de PCR fueron purificados con NucleoSpin Extract 11 Kit (Macherey-Nagel). El analisis de secuencias de los productos fue hecho por lGTC (leiden). Para aislamiento de ARN de hígado, 15-30 mg de higado de ratón fueron transferidos a un tubo Magnalyzer Green Beads (Rache). 500ul de PBS conteniendo 5ul de 2-Mercaptoetanol fueron añadidos y las muestras fueron homogeneizadas 20sec a 7000 r.p.m. en MagnaLyzer, seguido de otros 10seg. a 7000 r.p.m. Entremedias se mantuvo en hielo. 200 !JI del tejido homogeneizado se añad ió a 800 !JI de reactivo de Trizol y el aislamiento de ARN fue realizado según el procedimiento del fabricante.

Análisis de PCR en tiempo real:

[OI04J 2,5 IJL ADNc (20x diluido), 5 IJL 2x FastStarl Universal SYBR Green Master (ROX.; Roche), 0,25!JL 10 pmol de cebadores fueron usados en mezcla reactiva con el volumen total de 10!JL. Secuencias de cebador son de 5' a 3' de la siguiente manera; mIL-1RAcP F: tggtagtggttctcattgtggt, mIL-RAcP R: tccaaagtgagctcggtaaaa , mC5 F: aaagcccccataaacctgtc, mC5 R: tcggatatctgccttcatca. Todos los datos de PCR cuantitativa fueron normalizados a la expresión de genes housekeeping ACTB y citocromo c-l.(Cycl); ACTB F: actgctctggctcctagcac, ACTB R:ccaccgatccacacagagta, Cycl F: tgctacacggaggaagaagc, Cycl R: catcatcattagggccatcc. LightCycler 480 Real-Time PCR System (Rache) fue usado para ejecutar las reacciones y los datos fueron analizados por el programa de software qBase (Biogazelle NV, Bélgica). Estos cebadores se identifican por SEQ ID NO: 53-60 en el listado de secuencias.

Detección In-v ivo del salto a nivel de ARNm

[0105] Ratones C57Bl/6 machos de seis semanas fueron comprados a Jackson Laboratory y se inyectaron IV o IP con 50 o 100 mg/kg de AON usando jeringas de insulina Myjector U-100 durante 3 o 4 días consecutivos. En el día 1 o día 5 post-inyección, hígados fueron cosechados y mantenidos en N2 hasta el aislamiento de ARN para preven ir la degradación de ARN. El aislamiento de ARN y procedimientos de RT-PCR fueron realizados tal como se ha mencionado anteriormente.

Aislamiento de proteínas de las células

[0106] El medio de cultivo se eliminó de las células y 1 mI de tampón RIPA frío (incluyendo inhibidor de mini proteasa completa de Rache) se añad ió en 5xl06 células en matraz de 75cm2, y se mantuvo en hielo durante 5 min mientras se agitaba. Ellisado celular fue reunido utilizando el raspador celular y transferido a un tubo microcentrifugador. Las muestras fueron centrifugadas a 14.000 x 9 durante 15 min hasta el granulado del desecho celular. El sobrenadante fue transferido a un tubo nuevo y la concentración de proteínas fue determinada usando Quanti-it Protein Assay kit.

SDS-PAGE

[0107]10 % de gel de separación de gel se preparó mediante la mezcla 7.9 mI agua, 5 mI 1.5 M pH Tris-Hd 8.8,6.70 mi acrilamida, 200 1J110 % SOS, 8 !JI TEMED Y 200 !JI 10% APS. Inmediatamente después de añadir TEMED y APS, el gel fue vertido (7.2 mI/gel) y 1 mI isopropanol/Miliq (SO/50) fue puesto encima del gel para dejar que se polimerizara. El gel debería polimerizarse en aproximadamente 30 mino Luego el gel acumulador se preparó por mezlca; 5.5 mi agua, 1 ml1 M tris-HCI pH 6.8, 1.33 mi de acrilamida, 80 !JI de SOS al 10%, 8 !JI de TEMED y 80 !JI de APS al 10 % fueron mezclados y pipetados en el gel de separación, puestos en peines y dejados polimerizar. Las muestras de proteínas fueron preparadas (15 !JI de muestra + 5!J1 de tampón de carga, en la tapa) y las muestras hervidas 5 min a 95 oC, enfriadas en hielo. Cuando el gel acumulador fue dispuesto ejecutando el tampón de desplazamiento establecido se añadió a las camaras superiores e inferiores de la unidad de gel y se cargaron 15 !JI en cada ranura. El gel fue ejecutado a 80V hasta que las muestras alcanzaron el gel de separación , y aumentó a 120V hasta que el color azul apareció en el gel.

Método de Western blot

[0108]2 almohadillas de fibra y tres papeles de Whatman de 3MM precortadas fueron preparadas y saturadas en el tampón de transferencia. Membranas de PVDF fueron mojadas brevemente en 100% metanol, enjuagadas con agua destilada doble e incubadas en PBS. El sistema fue ensamblado en el casete en el siguiente orden: 1 almohad illa de fibra, 3 papeles de filtro Whatman, gel, membrana PVDF, 3 papel de filtro Whatman, 1 almohadilla de fibra. Los cassetes fueron insertados en el módulo de electrodo y colocados en el tanque de transferencia de manera que la membrana esta entre el gel y el anodo y las muestras fueron ejecutadas en una camara fría (4 oC) durante 1 hora a 100V. Las membranas fueron bloqueadas en el Odyssey Blocking Buffer durante 1 hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4 "c en una plataforma de agitación con agitación suave. El anticuerpo primario fue diluido en el Odyssey Blocking Buffer y para reducir los antecedentes, 0.2% Tween-20 se añadió al anticuerpo diluido y se incubÓ durante toda la noche con agitación suave en una plataforma de cohete (tiempos de incubación óptima varia n para anticuerpos primarios diferentes). El anticuerpo anti-humano de conejo IL-1RAcP (AbD serotec, número de producto AHP549) y anticuerpo de actina beta de policlonol de pollo (Abcam, número de producto Ab 13822) fueron usados. Las membranas fueron lavadas 4 veces durante 5 minutos a temperatura ambiente en PBS + 0.1<>;0 Tween-20 con agitación suave e incubadas con el anticuerpo secundario marcado fluorescentemente diluido en el tampón de bloqueo de Odisea (mas 0.2% Tween-20 y 0.01% -0.02% SDS) durante 1 h a temperatura ambiente, protegidos de la luz durante la incubación. El segundo anticuerpo fue el anticonejo de cabra Ab (Licor, número de producto 926-32211) Y anti-pollo de asno Ab (Licor, número de producto 926-32228). Las membranas fueron lavadas 4 veces durante 5 minutos a temperatura ambiente en PBS + 0.1% Tween-20 con agitación suave (protegidas de luz) y luego las membranas fueron escaneadas en Li-cor Odyssey Imaging System.

Ensayo de activación NF-ICB

[0109] Células NIH-3T3 fueron sembradas en placas de cultivo de 24 pocillos a 40.000 células / pocillo. Al dia siguiente, células fueron transfectadas con el control y AON de prueba según el procedimiento mas arriba. Las células fueron incubadas durante toda la noche y transfectadas con plásmidos pNFICB-Luc y pRL-CMV con Lipofectamine 2000. A la mañana siguiente, las células fueron estimuladas con mlL-1p durante 4 horas. Los reactivos de ensayo indicador Dual-Luciferase (Promega) fueron preparados según el manual del fabricante. El medio cultivado fue quitado y las células lavadas con 1ml PBS. 250 ¡J11X tampón de lisis pasiva fue añadido en las células y rascado. El lisado celular fue transferido a un tubo microcentrifugador y centrifugado durante 5 min, a 13,000 g a 4°C hasta granular el detrito. 30 ¡JI dellisado se añadió a cada placa de 96 pocillos. 100 ¡JI de LAR 11 se añadió a cada pocillo y la actividad de luciferasa de luciémaga fue medida en un luminómetro. Luego 100 ¡JI de reactivo IX Stop & Glo se añadió a cada pocillo y la actividad luciferasa de renilla fue medida. La actividad PNFICB-Luc fue normalizada a pRL CMV.

Ensayo de producción de citocina inducida por IL-1

[0110] Células NIH-3T3 fueron cultivadas en DMEM suplementadas con 10% FBS en plato de cultivo de 6 pocillos a una densidad de 0,5x1 06 células/pocillo. Células fueron transfectadas con 50nM de AON PS-300LNA como se describe previamente. Después de 16 horas las células fueron estimuladas con 1ng/ml ratón IL-1 p durante 4-5 horas. Luego aislamiento de ARN total y síntesis de ADNc fueron realizados como se ha descrito antes. La inducción mediada por IL-1 de citocinas tal como IL-6 y ICAM-1 fue determinada mediante la realización de un ensayo qPCR tal y como se ha descrito anteriormente usando los siguientes conjuntos de cebadores; ratón IL-6 Cebador directo CCGGAGAGGAGACTTCACAG, IL-6 Cebador inverso TCCACGATTTCCCAGAGAAC; ratón ICAM1 Cebador directo GGCA TTGTTCTCT AATGTCTCCG, ICAM-1 Cebador inverso GCTCCAGGTATATCCGAGCTTC. Todos los datos fueron normalizados a la expresión de la beta-actina de gen house keeping; cebador directo de beta-actina de ratón ACTGGGACGACATGGAGAAG, cebador inverso GGTCATCTTTTCACGGTTGG. Estos cebadores fueron identificados en el listado de secuencias por SEO ID NO:66-71

Ejemplo 1: salto del ex6n 17 de la proteína e5a o salto del ex6n 9 de la proteína sll-1RAcP para tratar una enfermedad inflamatoria.

Ejemplo de referencia

Salto del exón 17 de la proteína eSa para tratar una enfermedad inflamatoria

[0111] El propósito es reducir la cantidad de C5a mientras se mantiene C5b intacta. C5 se produce por el hígado de modo que el órgano objetivo para AON específicos de CS es el hígado.

[0112J El exón 17 de CS de ratón ha sido elegido como el exón objetivo. Codifica el dominio de anafilotoxina de CSa. Después de las inyecciones IV o IP, la mayoría de los AON va al hígado y se absorbe facilmente por las células hepaticas. Allí, se hibridan a su ARN objetivo sin causar degradación del objetivo por ribonucleasa H. Tras la unión al exón 17, este exón no se puede reconocer por la maquinaria de empalme y se quitara con los intrones flanqueantes mientras se mantiene el marco de lectura abierto intacto. La proteína truncada resultante, CS617, sera convertida por CS convertasa en CSb que todavía se puede incorporar en MAC y la porción restante pequeña no funcional de CSa probablemente se degradara. Un ensayo funcional ha sido diseñado y realizado para revelar si la molécula de CSb funcional se puede producir o

oo.

AON para cubrir sitios de unión de ESE diferentes o sitios de empalme 5'·3' han sido diseñados (Fig. 1) y evaluados (tabla 1) Y los resultados se muestran en Fig.2. AON diseñados que cubren todos los sitios posibles en el exón (e intrones f1anqueantes) que se pueden usar en el salto del exón 17 y seleccionados aquellos eficaces para ser evaluados adicionalmente por analisis qPCR. Para aumentar eficacias de salto de los AON seleccionados, su longitud fue extendida a 2Smeros o un número restringido de 5-6 modificaciones de LNA fueron añadidas. Se evaluó in vitro si esto resultó en caracteristicas de hibridación mejoradas. (Fig.8 31-55).

Tabla 1. Lista de AON para CS Nombre de AON Gen objetivo Exón objetivo Química Exitoso en el salto PS-295 mC5 Exón 17 2'O-metil PS + PS-296 MCS Exón 17 2'O-metil PS + PS-329 MCS Exón 17 2'O-metil PS + PS-330 mCS Exón 17 2'O-metil PS + PS-348 mCS Exón 17 2'O-metil PS +PS-349 mC5 Exón 17 2'O-metil PS +PS-3S0 mCS Exón 17 2'O-metil PS +PS-3S1 mCS Exón 17 2'O-metil PS +PS-352 mC5 Exón 17 2'O-metil PS PS-353 mC5 Exón 17 2'O-metil PS + PS-3S4 mCS Exón 17 2'O-metil PS +

PS-377 he5 Exón 17 2'O-metil PS + PS-378 he5 Exón 17 2'O-metil PS + PS-379 he5 Exón 17 2'O-metil PS + PS-329-2Smero me5 Exón 17 2'O-metil PS + PS-329-LNA me5 Exón 17 2'O-metil+LNA PS +

Salto del exón 9 de la proteína sll-1RAcP para tratar una enfermedad inflamatoria

[0113] El fin es aumentar la cantidad de IL·1RAcP soluble por el desplazamiento de la forma ligada de membrana de éste en la forma soluble. Se produce por el hígado de modo que el órgano objetivo para los AON específicos de IL·1RAcP soluble es el hígado.

[0114] Exón 9 de IL-1RAcP de ratón ha sido elegido como el exón objetivo porque codifica el dominio de transmembrana de IL-1RAcP. Ya que el salto del exón 9 no interrumpe el marco de lectura abierto proponemos que la forma soluble, llamada IL1 RAcPl!.9, pueda ser obtenida. Después de las inyecciones IV o IP, los AON van al hígado y seran facilmente absorbidos por las células hepaticas. Alli, se hibridan a su ARN objetivo sin causar degradación del objetivo por RNasa H. Tras la unión al exón 9, este exón puede no ser reconocido por la maquinaria de empalme y sera n quitados con los intrones f1anqueantes.

[0115] Los AON para cubrir sitios de unión ESE diferentes o sitios de empalme 5'-3' han sido diseñados (Fig. 3) y evaluados.( Tabla 2) y los resultados se muestran en Fig.4. Diseñamos AON que cubren todos los sitios posibles en el exón (e intrones flanqueantes) que se pueden usar en el salto de exón 9 y seleccionamos aquellos eficaces para ser evaluados adicionalmente por analisis qPCR. Para aumentar las eficacias de salto de AON seleccionados, su longitud fue extendida a 25meros o un número restringido de 5 modificaciones de LNA fueron añadidas. Se evaluó in vitro si esto resultó en caracteristicas de hibridación mejoradas. Los resultados se muestran en Fig.8 (1-31). Las eficacias de salto de diferentes AON en concentraciones diferentes fueron también comparadas con qPCR. (Fig.9).

Tabla 2. Lista de AON para IL-1RAcP PS-299 MIL-1RAcP Exón 9 2'0-metil PS + PS-300 MIL-1RAcP Exón 9 2'O-metil PS + PS-325 MIL-1RAcP Exón 9 2'0-metil PS + PS-326 MIL-1RAcP Exón 9 2'0-metil PS + PS-327 MIL-1RAcP Exón 9 2'0-metil PS + PS-328 MIL-1RAcP Exón 9 2'0-metil PS +PS-355 MIL-1RAcP Exón 9 2'0-metil PS + PS-356 MIL-1RAcP Exón 9 2'0-metil PS + PS-357 MI L-1RAcP Exón 9 2'0-metil PS + PS-358 MIL-1RAcP Exón 9 2'0-metil PS + PS-359 MIL-1RAcP Exón 9 2'0-metil PS +PS-360 MIL-1RAcP Exón 9 2'0-metil PS + PS-361 MIL-1RAcP Exón 9 2'0-metil PS +PS-372 hIL-1RAcP Exón 9 2'0-metil PS + PS-373 hIL-1RAcP Exón 9 2'0-metil PS + PS-374 h1L-1 RAcP Exón 9 2'0-metil PS +PS-375 h1L-1 RAcP Exón 9 2'0-metil PSPS-376 hIL-1RAcP Exón 9 2'0-metil PS +PS-300LNA MIL-1RAcP Exón 9 2'O-metil+LNA PS ++ PS-300-25mero MIL-1RAcP Exón 9 2'0-metil PS + PS-327 -25mero MIL-1RAcP Exón 9 2'0-metil PS +

Ejemplo 2: confirmación de la funcionalidad de los oligonucleótidos en una linea celular

Resultados:

Ejemplo de referencia

Salto es del exon-17

[0116] Para reducir el nivel de e5a, una serie de AON ha sido diseñada dirigiéndose a murino o exon-17 humano (véase ejemplo 1). Ellos fueron seleccionados en líneas celulares L929 y HepG2, respectivamente. Las lineas celulares fueron transfectadas con AON en Lipofectamine 2000 y las eficacias de transfección promed io fueron determinadas usando AON fluorescente . Desde la pantalla de 11 AON para murino y 3 AON para exones de objetivo humano, PS329 y PS377 de AON han sido seleccionados como los AON más exitosos en el salto del exón 17. Los AON eficaces fueron previstos para producir fragmentos de transcripción más cortos con tamaños alrededor de 178bp y 155bp para objetivos murinos y humanos, respectivamente (Fig.2&7). El análisis de secuencias también mostró que los fragmentos más cortos carecían del exón 17. Los AON PS-329, 329-25mero, 354, 329-LNA fueron evaluados extensivamente en concentración diferente para comparar las eficiencias en el salto. PS-329-LNA fue un poco más eficaz que los otros basado en una comparación de las densidades de la banda en el gel de agarosa de los fragmentos más cortos (Fig.8 31-55). PS-329 de AON fue evaluado también y encontrados funcionales in-vivo en un experimento piloto. 100mgfkg AON fue inyectado IV durante 3 o 4 días y muestras de hígado fueron analizadas con RT-PCR para detectar salto de exón. El producto saltado tiene el tamaño correcto y el análisis de secuencias confirmó que era el producto correcto.

Salto de exon-9 de IL-1 RAcP

[0117] Para inducir la producción de IL-l RAcP soluble (IL-1 RAcP( 9), una serie de AON han sido diseñados dirigidos a murino y exon-9 humano (véase ejemplo 2). Estos fueron seleccionados en lineas celulares NIH-3T3 y HepG2, respectivamente. Las lineas celulares fueron transfectadas con AON en Lipofectamine 2000 y las eficacias de transfección promedio fueron determinadas usando AON fluorescente. De la filtración de 13 AON para exones de objetivo murino y 5 AON para exones de objetivo humano, PS300 y PS373 de AON han sido seleccionados como los AON más exitosos en el sallo del exón 9. Los AON eficaces fueron previstos para producir fragmentos de transcripción más cortos con tamaños alrededor de 150bp Y 200bp para objetivos murinos y humanos, respectivamente (Fig.4& 7). El análisis de secuencias también mostró que los fragmentos más cortos carecen del exón 9. PS-300, 300-25mero, 300-LNA, 327 Y 327-25mero de AON fueron evaluados extensivamente en una concentración diferente para comparar eficacias de salto. PS-300-LNA fue mucho más eficaz en el salto (alrededor de 85%) que los otros AON especialmente en la concentración de 50nM (Fig.8 1-31).

Los resultados fueron confirmados también por análisis qPCR (Fig.9). PS-300 de AON fue también evaluado in-vivo en un experimento piloto. 50-100mg/kg de AON fue inyectado IP o IV durante 3 o 4 días y muestras de higado fueron analizadas para el salto de exón con RT-PCR. Hubo producto sanado con tamaño correcto que fue confirmado por análisis de secuencias.

5 La eficacia de salto in-vivo fue comparable con la eficacia de salto in vitro (Fig.10).

Ejemplo 3: otras vías para evaluar la funcionalidad de los oligonucleótidos de la invención

[0118J La eficacia de los oligonucleótidos de la invención también se puede evaluar en el nivel de proteína por la

10 cuantificación de sIL-1RAcP, IL-1 ; C5a o C5b por el método de Western blot por ejemplo: un aumento de sIL-1RAcP soluble yfo una reducción de IL-1libre y/o una reducción de C5a. La eficacia de los oligonucleótidos de la invención también se puede evaluar por ensayos funcionales para 11-1RAcP por la evaluación de la presencia o el nivel de actividad de moléculas o vías inducidas o activadas por IL-1. 11-1 induce la activación de NF-KB.

15 Por lo tanto, la eficacia de los oligonucleótidos de la invención también se puede evaluar por la evaluación de la activación de NF-KB: reducción de la activación de NF-KB. IL-1 Induce la producción de algunas quimiocinas y citocinas proinnamatorias a partir de las células tales como IL-6 0ICAM-1. Por lo tanto, la eficacia de los oligonucleótidos de la invención también se puede evaluar por la evaluación de la

20 presencia de IL-6 o ICAM-1: reducción de IL-6 yfo ICAM-1 .

[0119J La eficacia de los oligonucleótidos de la invención también se puede evaluar por un ensayo funcional para C5 tal como un ensayo hemolítico como se describe en Van Dijk H. Et al, (1980), J. Immunol. Meth. 39: 257-268.

Tabla 4: lista de AQN preferido

AON mIL-1RAcP: Secuencia (-3')

PS300 mC5: AAAACCACAGGCGAGUUCUAC

PS329 h IL-RAcP: ACUUACGGAUCCUUCCCAGUU

373 hC5: UUUCAUCUGUUCCAAAAUGAG

377: GCUCGCUGCUCACAGGUUUCA

Tabla 5: identificación de las regiones dirigidos por cada oligonucleótida usado

AON mIL-1RAcP PS299 PS300 PS 325 PS 326 PS 327 PS 328 PS355 PS356 PS357 PS358 PS359 PS360 PS361

me.

PS29S PS296 PS329 PS 330 PS348 PS349 PS350 PS351 PS352 PS353 PS354 h IL-RAcP

372 373

37. 375 376 hC. 377 378 379

Referencias

[0120J

Región

Exón 9 Exón 9 Intron8-exon9 Exón 9 Exon9-inlron 9 Exon9-inlron 9 Intron8-exon9 Intron8-exon9 Exón 9 Exón 9 Exón 9 Exón 9 Exon9-inlron 9

Exón 17 Exón 17 Exón 17-intron 17 Exón 17-intron 17 Intrón 16-exon17 Exón 17 Exón 17 Exón 17 Exón 17 Exón 17 Exón 17-intron 17

Exón 9-intron 9 Exón 9 Exón 9 Exón 9 Intrón 8-exon 9

Exón 17 Exón 17 Exón 17

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Academisch ziekenhuis Leiden h.o.d.n. LUMC Prosensa Technologies BV

<120> Molécula para lartar un trastorno inflamalorio

<130> P6027114PCT

<150> EP 09180760.2

<151> 2009-12-24

<150> US 61 /290,102

<15 1> 2009-12-24

<160> 71

<170> Palentln version 3.3

<210> 1

<211> 198

<212> RNA

<2 13> artificial

<220>

<223> murine exon 17 C5

<400> 1

cuqcuaagua caaacauaqu quqccaaaqa aauqcuqcua uqacqqaqcc cqaguqaacu 60

ucuacqaaac cuguqaqqaq cqaquqqccc qqguuaccau aqqcccucuc uqcaucaqqq 120

ccuucaacqa guqcuquacu auuqcqaaca aqauccqaaa aqaaaqcccc cauaaaccuq 180

uccaacuqqq aaqqaucc 198

<210> 2

<211> 198

<212> RNA 5 <213> artificial

<220>

<223> human exon 17 CS

<400> 2 cuqcuaaaua uaaacauuca quaquqaaqa aauquuquua cgauqqaqcc uqcguuaaua 60

auqauqaaac cuquqaqcaq cqaqcuqcac qqauuaquuu agqqccaaqa uqcaucaaaq 120

cuuuc acuqa auquuququc qucqcaaqcc aqcuccquqc uaauaucucu cauaaaqaca 180

uqcaauuqqq aaqgcuac 198 10 <210> 3

<211> 1396

<212> RNA

<213> artificial

<220> 15 <223> mutine pte-mRNA intron 17 CS

<400> 3 quaaguauqa quuuuccuac caqaauccua ucugauauqq qagauucuau quaaauuaqu 60

gcugcuaaga aagquagcuu ugaugcuuca aucuquaucc aaauacuucc auuguucuug aguuugaauc cagauccagu guaacuugaa quuuauccug ugaqccucaa gcaggaaccu cucuaaaauu cuaugugaca ucauacccgu gcuuacacug accaaauaca gcaaaagacu guqacuqggg gacuuauuuc aguuucagcc ucaquuuuag gaaaagaagc aaaagcgaaa uuagcgququ aucuuaagug uugucuaucu acugcaauuu aaaaaacaug cuauuaggga gccucccagu uucugcuucu ccaaguguaa ucacugccca guuuuucaac uagcauccuc ucqacqqccc uuccucccuq cuqaqucuac aqucucaucu quqcaqccac cagccuucag cgggaguugg gacaggucag agccggcuug aauqucuggg agucacuguu ucccauagug ugguaaaucc acaqucccua uuaguacauc uuaguggaaa uagaaauuaa caagccagaa aaaucuaacu gucaaaauca caaaauuaua aaaaucucag cuauccccuu gcucuuucgu ucaqucauaa aaccauuaag caaugccuuc gaugaauggu uuuacauaaa aauucaccug aaauauauuu cuacag

<210> 4

<211> 5374

<212> RNA 5 <213> artificial

<220>

<223> human pre-mRNA intron 17 e5

<400> 4

guaaguauga cauuuucuau cagaauucug qcuqcuaaqa aaqgcaquuu ucauqaucua uaaaugucca uaagaaaaaa aaauccuuca agcaqaquac acuaggccag aquuaaqacc

guuaaaaacu agaaguggaa gggccauugg aaugguacag agccaacuca uccccaaagc uuqcuuagau aacuguauua gacaucauac cuauugaaaa ccuaaaauga gcaagucauu aacaauguga cuuuuagaau uggcaucuac ccuuuucuac caauggauac auucuauaga ucauuuugcc auaacuaggu uucugaugaa uaaucuagca caquuggcuu uagcuacaug uccccauucu aqacaqcguq ggcugugugu agcucccugc cuuagcucag ggaucuaggu gaaucugguu uuuagguuuc ucagauggag cagagauucc aucacagaaa acguccaugu aauaauuuua uagacccacu caquauagga auaugcuaag cugaccccuu uuggagacag aaagcagaac uaauauuggu

cucaauaugg ggaauuuugu uuuagaauuq aaaquaqaaa uuuuugggca uccqaagagg uqqcauaacc uuaaaqccaa

aagagaccuc ugcccaguca uugagugaug caugcuugaa ugaaguuugu aaquuuacuu cacuuaugca ucuquuuugc cauaaauggu acauuaaguu cauauuuuuu guacccacca qccuccccac cugaccuqqu ccauacugcu ugagacucag auccaccuua uuucugauau gauguugugu gucuaaaaac quagqucaua uucuauaacu

guaauuuuau aqauaacuuq uacaguacaq qucaucccau

120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1396

60 120 180 240

aaacuugaau gauuauuuau ccucucuqag ccucaugcaa uccaauaugc cuqugaquuc uacaagucua cgcuuuugug ucugucuaua ucuacauuga ugaaauaaag cagaauauuu aguguacuua uauaaaagcu gauqucuuau uucaguuuca aauuuauaga acucucauua acauguuuuc agaacuuuua uuuuuuuuuu uuuucaguag gaaucuggcu cugucaccca aucuuqgcuu acugcaaccu cugccucugq guucaagcga gaguaacugq gauuaaaggc gccugccacc acaccugguu qqacaqqquu ucaccauauu qqccaqgcuq qucuugaacu ccaccucggc cucccaaagu gcugagauua caggcgugag auaqucuuua acaaaacaaq caaaagcaaa auqacagcuu cugcguaaug acauuuucau caaugaugga ccacaugugc auaauaccgu auuuuuucug uaccuuuccu guguuuagau uuaucauugc auuacaquuq ucugcaguau ucuquucaqu agccuaggag aaauagqcua uacuauauag ucuagaucug auuaguquaa quacgcucca uqaugguuac acaacaaaau agaacauagc ccuauuquua agcaauaucu aauaaccaua aauuuauguu uguagaaaua uauucauuga gauquacagu uccaauauuu quuuugcuuu quuuquuuqu uuguuugaga gcccaggcug gagugcaaug gcgcagucuc agcucacugc aagcaauucu ccugccucaq ccucccaaqu agcugggauu cuggcuaaua auauuugcuu auuauaagca gaauuuuaau uquuuuucuu uuuqqaqqqa qqauuugqcu uuuuuuucuc aauuuauqug gguaaauagu auuuacgqqg uacacgagau uaaquaacaa ucauaucauq gaaaaugggq uaucuauccc uuuauaaaca auccaauuau acucuuuuag uuauuuuuaa ugacuguagu cacccuguug uqcugucaag uacuaagucu uquacccaua aaccaucccc acaucccccu cauccuccua cucuauaucu ccauaaguua aauuguuuug auuuuuagca ugugaauuuu gucuuucugu gccugacuua uuucacuuaa uccauauugu uqcaaaugac aqqaucucau ucuuuucauq guauaugcac cacauuuucu uuauccauuu aucuguugau aauccugacu auuuuuaaca gugcagcaac aaacauqggc ggaqcuucga ccagauccuc auauuacaac cauuaaaaau cuaaaucuag ccuaagguua accacaauac auguuuccaq ggacuuuaua uauagucuuu ggcuggagug caguggugca uucuccuqcc ucagccuccu aauuuuugua uuuuuaguag ccuqaccuca qquqauccqu ccacuqugcc cagccuaugu cuquuuuaua cuuauquguq aacggugauc cuauaggauu augcuuaqau acacaaauac aacaugcuqu acagquuuqu uaguaaguua uaccaucuaq caucuaacaa cauauuucuc auuuugguaa auggccacaa gucuaagauu cagauuguuu gacagaguuu uquuuuuguu aaccuccqcc ucccqgguuc acauqcaccu qccaccau9c aaacaqucua guccauaugu uuaauuuuuu uuaauuuuua acuuuqauac aqgaaugcaa cuqaqguauu ucuccuuuqu auguacaauu aaauuauuau uauucauucu uucuauuuuu cuacccuucc caqccuucua cccacaaaua agugagaaca cauaaugacc uccaguucca qcuqaguaqu acuccauuqu ggacauuuaq guugcuucca gugcagauau cucuucqaug

300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220

uacugauuuu cuuucuuuug gguauauacc cagcaguggq auugccagau cauaugguag 2280 cucuauucuu uguuuuuuaa ggaaccucca aacuguucuc cauaguguau aguaauuuac 2340 auuccccacu aacaququac aagaquuccc uuuucuccac auccccucca gcauuuQUua 24 00 uugccugucu uuugaauaaa agccauuuua acugagauga qaugauauuu cauuguagcu 2460 u ugauuqcau uucucuggug auuacugaug uugagcaccu uuucacaugc uuuuuugcca 2520 uuuguauguc uucuuuagag aaaugucuau ucaaaucuuu ugcccauuuu uaagugggau 2580 uauuacauuu uuuccuquag aquuquuuga acuccuuaua uauucuuquu auuaaucucu 2640 ugucagaugg guagcugcaa guauuuucuc ccauucugua gguugucugc uuacuuuauu 2700 qauuccuuug cuguacaqaa gcucuuuaac uugaugugau cccauuuquc cauuuuggcu 2760 uugguugucu guguaguggg guauuacuca agaaacuuuu gcccagacca auguccuaga 2820 qaguuuuccc aguguuuucc uauaqcaguu uuauaguuag aggucuuaga guuaaaucuu 2880 uaaucaauuu uuauuuqaqu uuuquauauq qcaaqaqaua aqqqucacqu uucauucuuc 2940 ugcaugaaug ggauaaccag uuuucccagc accauuaauu gaagagacuq uccuuccucc 3000 aauguauguu cuuggcaccu uugucaaaaa ugcguucacu auaggugugu ggauuugucu 3060 qqguuuucua uucuquucca uaggucuaua ugucuqcuuu uaugccacua ccauqcuguu 3120 uuqaauuaua cuauaquaua auuuqaaquc aqquaauquq auuccuccaq uuuuuuucuu 3180 uuugcucggg auugcuuugg cuauucuggu cuuuuguagu uccauaugaa uuuuaggauu 3240 uuuuuucuau uucugcaaag aauguuauug guguuuucau agagauugca uugaaucagu 3300 agauugcuuu ggguauuaag gcguuuuaac aauauugauu cuuccaaucc augaauaugg 3360 aauaacuuuc cauuuuuuug aguguccucu ugaauuucuu ucauuggugu uuuauaguuu 3420 ucauuguaga aaucuuuuac uucuuugquu aauuuaauuc cuagguauuu aauuuuauuu 3480 quqqcuauuq uaaauqquau uacuuuuuaa auuucuuuuu cacauuQUuc auuauuqaca 3540 uauagaaaug cuacugauuu uuguauguug auuuuauauc cugcaacuuu auugaauuca 3600 uuuagcaguu cuaauaguuu uuugguggag uccucagguu uuuccaaaua ugugaucaua 3660 ucauuugcau acaagqauaa cuuqacuucu uqcuuucuaq uuugqauqac cuuuauuucc 3720 uucucuuguc uaauuquucu ggcuagqacu uccaquqcac uaggacuuqc cuagaaauuq 3780 caguccuugu ggccuaqacu gccccucaag uuaaccuagq gcccuagaqc acuccagccc 3840 auggugggga ggcuugcugg aacucaagcu cCllaccacug ggauqagcga ugccccucuq 3900 gcuagggcca quccaaaugc ucccuccaug ggcagacacc agcugaguac agccugguuc 3960 ugcuuuccac cgugacaqug caacacugag uucaaugcaa agccacagaa ugacugcacu 4020 c ucccucucc caacacagag auucuccaug c ugcacaguc acugcuaggg gaugugggag 4080 qaguggcauu ggugcuucaa gacuaucuuu ccugcccucu ucaaugucuc uuucagugau 4140

quaaaqucaa aaccaqquac uqugauuqcu uuuuquququ aquuaquuqu uaaaauuuaq cuucuauuca qccaucuuqc ucuccccucu cuauaaucau cuggcuuggc uucagcugga cuqqaacucu cccucauucc agacaaguuq aaqucuucaa aaucaucaqq cucuqcuuqu ccucuaqqca quaaqcuggq qcaauuuuaq qaucacaquc uugcuuauqc ucuaauqucu uuuucuauua aggcaucuua uaugaaaaca auaaacaaau uaccaaquua aaqaaqqcag auaaacacaa uuauuacaau uauauauaua ucuuquauaa ucucaggaau acuaaacauu auuuaaugcu uuguuuuqcc aauqcuauua uuuquuuquu uquuuquuug uuugugacaq aquqquqcaa ucucggcuca cugcaaccuc ucagccuccu gaguagcugg gacuauagac uuuuuaquag agacqqqquu ucaacauquu gqugaucugc ccaccucggc cucccaaaqu cuqccuauaa uucuauuuug gaagcauuaa gcuuaaquua cagauuaaug gccauauuuu uuuuuccaua auugaauaug auuuuuuuqu

<210> 5

<211> 150

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<220>

<223> murine pre-mRNA exon 9 IL 1 RAcP

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ucauaccacc aaqguacaca quagaacucq uaqugquucu cauuquqquu uaccauquuu

cucacuuuqq aacagaugaa acaauucuug 10 <210> 6

<211> 150

<212> RNA

<213> artificial

<220> 15 <223> human pre-mRNA exon 9 IL 1 RAcP

<400> 6

caccuqauuu ucgquucucu uquaccaaca qqaaaqacaa cauauauuuu uucquuuuuc uaqaaqucuc ucucugcagc qccuuqcaaa acucccauca auuccucucc cuqcccuaqu quuucaccua auuquuuccu qaaaacuquu auuuuqcaua qaaquucaqu ccauuuuuau aqaaccauau aaaqccuccu aquqcaaaua acuuuauaga uagcaauuua agaaaaaaau quqqaaaaau ccuaaqqccu aqucucucuc uquuacccaq uaccucccag quucaaquqa acccqccacc augcccagcu qqccaqqcuq aucucgaauu qcugggauua caggcaugag acaaaauquu uuauuuaccu aaaauucacc uauaaquaga

ccaq

ccuguqquuu uqqaqccacq acuqgcuqqa qaugquccuc

uqauqquqcu augququaqq

aauuuuucaa ccccuccuuc quguugccac cuguaaacuq uucucuuaqa ucauquuuuq uaaaquaaau uuuuucuaau cugaucgaua cauuaaagau uuauaquuuq qcuggaqugc uucuuqugcc aauuuuuquq ccuqaccuca ccacugcacc uucagaaaau auuuauauug

qucuuucuqq uuuuaccgag

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ucauaccacc aagguacaca quagaacucg ccugugquuu uggagccacg qucuuucugg 60

uagugguucu cauugugguu uaccauguuu acuggcugga gaugguccuc uuuuaccgag 120

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<212> RNA

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gccgcuacca gccauggguc uuuggggaau acuuugucuu uuaauuuucc uggacaaaac 60 uugggqacag gaacaaaccu acgucauuuc agcacccaaa auccuccqqq ucqgcucguc 120 ugaaaaugug guaauucaaq uccauqqcua cacugaaqca uuugaugcaa cucuuucucu 180 aaaaaqcuau ccuqacaaaa aaqucaccuu cucuucaqqc uauguuaauu uquccccgqa 240 aaacaaauuc caaaacgcgg cacuguuqac acuacagccc aaucaaguuc cuagagaaga 300 aagcccaquc ucucacguqu aucuggaaqu uququcaaaa cacuuuucaa aaucaaagaa 360 aauaccaauu accuauaaca auggaauucu cuucauccau acagacaaac cuguuuacac 420 gccggaccag ucaguaaaga ucagagucua uucucugggu gacgacuuga agccagccaa 480 acgggagacu gucuuaacuu ucauagaccc cgaaggauca gaaguugaca uuguagaaga 540 aaaugauuac accggaauua ucucuuuucc ugacuucaag auuccaucua aucccaagua 600 ugguguuugg acaauuaaag cuaacuauaa gaaggauuuu acaacaacug gaacugcaua 660 cuuuqaaauu aaagaauaug ucuuqccacq auucucuguu ucaauaqaac uaqaaagaac 720 cuucauuqgc uauaaaaacu uuaaqaacuu ugaaaucacu gugaaagcaa gauauuuuua 780 uaauaaaqug quaccuqauq cugaaqugua ugccuuuuuu qqauugaqaq agqacauaaa 840 agaugaggag aaqcaqauga ugcacaaaqc cacacaagcc gcaaaguugg uugacgqaqu 900 ugcucagauc ucuuuugauu cugaaacagc aguuaaagag cuguccuaca acagucuaga 960 agacuuaaac aacaaguacc uuuauauuqc aguaacaguc acagaaucuu cagguggauu 1020 uucagaagag gcagaaaucc cuggaqucaa auauquccuc ucucccuaca cacugaauuu 1080 ggucgcuacu ccucuuuucg ugaagcccgg gauuccauuu uccaucaagg cacagguuaa 1140 agauucacuc gagcagqcgg uaggaggqqu cccaguaacu cugauggcac aaacaqucga 1200 ugugaaucaa gagacaucug acuuggaaac aaagaggagc aucacucaug acacugaugg 1260 aquaqcuqug uuuguqcuga accucccauc aaauqugacg qugcuaaaqu uugagaucag 1320 aacugaugac ccagaacuuc ccgaagaaaa ucaagccagc aaagaguacg aagcaguugc 1380 quacucqucu cucagccaaa guuacauuua caucgcuuqg acugaaaacu acaagcccau 1440 qcuuguqqqa gaauaccuqa auauuauqqu uacccccaaq aqcccauaua ucqacaaaau 1500

aacucacuau aauuacuuga uuuuauccaa aggcaaaauu g444CUUUUC UCCUC44CUU 4UC4444U4.U iliS4UiSUUCC4 uucaqcacq3 cuccuqqucu auuacauaqu cacaqqqqaq uqacqcaquc uqqauaaaua uuqaqqaqaa ququgqcaac uccagllugaa uauququauu cuccaggcca aacuququcc agacucaugg quagcacuau cagcaqugga cagagcuqug caaaaqqqcc auqcaaaqaq ucuuucaaqc uuuQqauqaa ggcagguqqu ggccaugaca augcaqauqu auuccaucua caacqcaaac gcagaugacu cccauuaucg ugaugacucu aaagagaaac cugcaucucc uaaggcag4.a aauagaagaa uaquguqcca aaqaaaugcu qcuaugacgg aqcccqaqug ggagcqa9UQ qcccqgquua ccauaqqccc ucucuqcauc uacuauugcg aacaagaucc gaaaagaaag cccccauaaa ccacauuaag acccuquuac caqugaugaa qgcagauauc cuggcuaugg gaaauucauc gcguucccaa aagaaaacaq cucacuaacg acuugggaaa uucaaqgcau ugqcauuuca ugauacacuc aaggcaaagg uguucaaaga ilgucuuccug uquugugcga ggagaacaga uccaauugaa aggaacuquu gacaaaguuc uquguuaaaa ugucugcugu ggaggggauc ugcuagccuu cacaccucca ggcccuccag auguguguuc cagucacuug qugaccuuca cccuqcuucc ucuggaaauu cucacua9ag accucauuu9 Q9aaaqacau cuuaguaaag ilggagucaag agqgaaagcu augccqgcgu gauucugqac uguUllaCllga cqllllaqqllllU ucccaUllcaq qauCCCIlUUIl a9uuqaaaQ9 auuuugaquq ucaaaqqacu qcuuquaqqq gaquaaggaa ggcaucaaca uccuaaccca ccuccccaag caugaqcaua gcuccgququ ucuauquuuu ccacuaccug uaUUUUCUIlU ccuqauaCIlC ugagUllllaag Ilcllqagccuq qqugquqaqc qucauguccu acaqaaacqc uqacuauucc gagcqcuagu accuggcuga cagcuuuuqc ucugagaqug uquaaaacaq qauqaaaacu caauuuquaa cucuuuqcua qcuggaaaac ggcucuuuca aqqaaaauuc ccaauaucua

quacaquacg gcacaagaga 9UgilC4CiSg4 4C4UgquUCC caaacaqcaq alluuaqugqc caqcuccaqq uccaucuquc cuugacaugg ugacugaagc uauaaaqucc agggaaacgc aaqaquqacc uqqqcuquqq qcuqggcuca ccuuccucac uguaaaqaaa uucucagguc caagcugcua aquacaaaca aacuucuacg aaaccuquga agqqccuuca acqaquqcuq ccuguccaac ugggaaggau cgaagcuacu uuccaqagaq cuqcagquca cgcugccuga qacaauqqua uauququuqc gagilugaaca uaccauauuc uacaacuaua ugaccucagg ugcacuucag gaagcucagc cagaggauag agggcucquc qqccuucacu ccauaaacuu acauuacq99 uagu9ccaqa ccullagqgall uucgugqullU qlluuugqucc ccallqllCCll1l gaquucuuqu ccacqquucu ggcaguqcag aggcagagcu qaaqcaqqaa accauuqgaa gllgllallllaaa uaallllcaaqg uacaqcauqu qgaagggqgc cuuggacagg uggccaagua uqgcugquuq agaaququca ccaauaaaau uacaggquac

1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420

uuuqccuqcu qaaqcccaaq aqaaaacuuu uagallaggca guugacauau gccccaccau cuccuuccug cuugaaaaca cccugccauc cuaugcucuu ucccuaqgaq acagaaccca gaggaaggaa gcuuuuguua aaggugaucc caaacgucca gacagcucug uqcccagcaq c uauqcuuuq cucqccagcc uqaaacuqaa guggcuaucu gaagagoaga gquauggagg uqccaucqaq qqccuqac aq aauauucacu caucaauquc gccuacaaac acqaaqquqa uuuccuqqqq aqqccaquqq aqquaucucu c agcaguggc uuqgccacag uauauquaaa gqaauuuugc agcuuuuacu uqaaaauuga caggcucagu gacucuggau ucaagcgcau gqilggaqucil ilciluccgggu ccucccaugc cggagcaaac gaggaagauu uaoggqcucu uuaccagauc aaagauggcc auqucauucu ccucuguguc cgquuccgga uauuugaacu cuucacgguq uacgaguauc a caga ccaga ugacaccagg cuucagaaag ucugugaagq ugcgcaacuq caqgcagaag uagaccuagc c uquaaacca qaqacuqcau auqcuuauaa Uquuuuuquc aaquacacuq cqacucuuCU uqaqaauucq qaqqucaccu ucauuaaaaa agggaagcag uauuuaauca ugggcaaaga c aaguauaua uacccucuag auuccuccac ququccaucc uqucaaqcau uuquaqaqaa aaacagcugu gaaugaaaag uucugcugca uccuccucuq gcuuggaaac cuaqccuaqa aaqcugauqa quuacqacuu uquqaaauqq cccaaggcua ucagauguca gugccaauaq gggguquugg uU999gcc9g aagaagagac uauccuugcu ugaaagaaaa auaccaagga

cuc

<210> 8

<21 1> 5031

<212> RNA

<213> homo sapiens

<400> 8

guaucuuaca qccuuuucuq gaaaauccac acagcgcuag caagagcacc uucacacugg cccqaqguuu cgucuaauug gcccauuuac cguuacugga cggcacagca gguaugguug qqauauqaau uacqccaacc oggcuuuuau uocacccagg ccuquuaaaa caaauucauu cuuccacaaq uauaagouqa caauqauqac cuuquuquca aacugugquu cacaaaauua uacccaagau auuqaagcau aauagcaugu gccagcuaca ilquililuggilu auauca.cugc uguggaagqa guggaucaac gcaacugaau ucgauccccu uuuccaaguu ggquuuc uga uaagcagugc accaugauuu agcagcuugc acaugugugg caucucugca gacuccagaa aqucaqqauc acaucaqcca qqucacuuac a.aaacaqqgg qauqaqcuqu accaauqcca gguucugcag aucaaacaca cuggauugaa uauugqccca uuuqaauaac uuuqcuqaaq cgaagauucc uccugcggcg aucaqauaca c uuucuuuaq auaqccuuqa gqqqaqqcga acugaaacaa gucuguaaag ccacugaaac uguagccccu caga aaaugc cauaaaaucu

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augggccuuu ugggaauacu uuguuuuuua aucuuccugg caaacauaug ucauuucagc accaaaaaua uuccguguug auucaaguuu auggauacac ugaagcauuu gaugcaacaa gauaaaaaau uuaguuacuc cucaggccau quucauuuau aacucugcaa ucuuaacaau acaaccaaaa caauugccug uauguguauu uggaaguugu aucaaagcau uuuucaaaau uaugacaaug gauuucucuu cauucauaca gacaaaccug guaaaaguua gaguuuauuc guugaaugac gacuugaagc uuaacuuuca uagauccuga aggaucagaa guugacaugg ggaauuaucu cuuuuccuga cuucaagauu ccgucuaauc aucaaggcua aauauaaaga ggacuuuuca acaacuggaa gaauaugucu ugccacauuu uucugucuca aucgagccag aaqaacuuua aqaauuuuqa aauuacuaua aaaqcaaqau acugaggcug acguuuauau cacauuugga auaagagaag gaaaugaugc aaacagcaau gcaaaacaca auguugauaa uuugauucug aaacagcagu caaagaacug ucauacuaca aaguaccuuu auauugcugu aacagucaua gagucuacag gaaauaccug gcaucaaaua uguccucucu cccuacaaac cuuuuccuga agccugggau uccauauccc aucaaggugc caguugguag gaggaguccc aguaacacug aaugcacaaa acaucugacu uggauccaag caaaagugua acacguguug gugcuuaauc ucccaucugg agugacggug cuggaguuua gaucuuccag aagaaaauca ggccagggaa gguuaccgag agccaaaguu accuuuauau ugauuggacu gauaaccaua caucugaaua uuauuguuac ccccaaaagc ccauauauug uacuugauuu uauccaaggg caaaauuauc cacuuuggca gcaucuuauc aaaguauaaa cauuccagua acacagaaca cugqucuauu acaucgucac aggagaacag acagcagaau

ggaaaaccug gggacaggag gagcaucuga aaauauugug ucucuauuaa aaguuauccu ccucagagaa uaaauuccaa gaggacaaaa cccaguuucu caaaaagaau gccaauaacc uuuauacucc agaccaguca cagccaaaag agaaacuguc uagaagaaau ugaucauauu cuagauaugg uauguggacg ccgcauauuu ugaaguuaaa aauauaauuu cauugguuac auuuuuauaa uaaaquaquc acuuaaaaga ugaucaaaaa auggaauugc ucaagucaca guuuagaaga uuuaaacaac guggauuuuc ugaagaggca ugaauuuggu ugcuacuccu agquuaaaga uucgcuugac caauugaugu aaaccaagag augauggagu agcuuccuuu augucaaaac ugaugcucca caauagcaua cucaucucuc aggcuuugcu agugggagaa acaaaauaac ucacuauaau cgagggagaa auuuucagau ugguuccuuc aucccgacuu uaqugucuga uucagucugg

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680

UUllllllUllUUg 1l1lgllllllllllUg UggCllllCCllg CUCCllgquUC gcauauucuc caggccaaac uququcucuu aauauggcaa gcauuagcag caquggacag uqcuququau ggaquccaaa gaaagaquau uuC!aauucuu aqagaagaqu gaucugggeu aacaaugcca auguguucca cC!uagcugga cuuaccuuec gacucccaaq aaaauqauqa accuuguaaa qaaauucuea aagallgauag aagaaauagc uqcuaalluau aaacauucag gauggagccu gcguuaauaa uqaugaaacc ugugagcagc gggccaagau gcaucaaagc uuucacugaa uguuguqueg aauaucucuc auaaagacau gcaauuggga aggcuacaca agcaagccag aaauucggag uuauuuucca gaaagcugqu cccaaaaaaa aacaquuaca Q'Uuuqcccua ccuqauucuc qqcguuqqca uuucaaacac uqguauaugu quuqcuqaua allagaugucu uccuggaaau gaauauacca uauucuquug uuqallaqqaa cuguuuacaa cuauaqqacu ucuqqqa uqc qcuguqqagq gaaucugcac uucqqaaaqc ccaqucauuq uccaaaugug ugcqccagaa aquagagggc uccuccaguc cuuccucugg aaauuggccu ucacaacauc aauuuuucac gaaauc uuag uaaaaacauu acgaquqquq ccaqaaqquq gguguuacuu ugqauccuag gqguauuuau qquaccauua uacaggauac ccuuagauuu gquccccaaa acaqaaauca ggacugcuug uaggugagau cuuqucugca quucuaaguc acccaccucc ccaaagggag ugcagaggcg gagcugauga guuuuucacu accuggaaac aggaaaucau uggaacauuu gaaaaqcaqa aacugaagaa aaaauuaaaa qaaqqqaugu aaugcugacu acucuuacag uquguggaag gguggaagug uuugcuuuaa gaguacuugg acaaguaaau aaauacguag uquaauucuu uauuqugqcu aguugagaau uaucaauuag aauucacagu aucaaccaau aaaauuacag gquaccuugc agcuuauauc uuacagccuu uacugugauu ggaauuagaa cuggugaaaa ucgacacagc ucuaauuaaa gcugacaacu ccagcccaga gcaccuuuac auuggccauu ucugcquaug llUCUquCUCC UgllUgCllgllU cuggaaugga uuccugggug qagqagccaa aaaqcccuuq quggggC!agg ugquggccuC! ucacuaaugc aaaugcagau gqccaaqaaq aacqcuqcaa uaqugaagaa auquuquuac gagcugcacg gauuaguuua ucgcaagcca gcuccgugcu ugaagacccu guuaccagua ugugggaagu ucaucuuguu uaaccaccuq qqaaauucaa cugucaaqqc aaaqquguuc uacgaggaga acagauccaa llguUCUgugu uallaaugucu aucaucagqq cacaaagucc acuugqugac auucacugug uggagacuug quuuggaaaa ucaaaaqgqa aagcuauucu gcagacgaaa gqaguuccca aaaggauuuu qaguguaaaa aggaaggcau caauauccua qcguuguccc aguauucuau uucauucuga cccauuaauu uqaqcauuau quccuacaqa cuagcacuug guuaacagcu agcagaacca aaauucaauu auaaugqauc uuucaaqgaa cuguugaagc ccgagagaac aggcuuucga uauaugcccc uucugcuuga aaauacacug cucuuucccu gggagauaaa

1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600

acucacccac aquuucquuc aauuquuuca aauccaccca uuuaucquuu uuqgaaaqac aacacuqqua cqqcacquau gquagaaaca uuqaaaqaua uaaauuauqu uaacccaquc qqaqquqqcu uuuauucaac ccaggacaca ucacuccugg uuaaacaacu ccgcuugaqu gqugccuuac auaauuauaa aaugacagac cuucucaaug augaccucau uqucaquaca quaacaacug uaquucacaa aaccaquacc aucgauacuc aggauauuga agcaucccac cqcauaquaq cauquqccaq cuacaaqccc caugcqquqa uqgacaucuc cuugccuacu gcccuuqugg aagqqquqqa ucaacuauuc auucuqcaac uqaauucqau ucccuccaqu gaacucuuug aaquuggquu ucucaquccu ccaqauaaac aququaccau quuuuauaqc gaaggagccg cqugcaaqug uquagaagcu cugacaaucu cugcagagac aagaaaacaa uauaaaquua qcaucacauc caucacuqua cuucuggaua ucuacaaaac uggggaagcu auuaaaaagg uaaccuguac uaacgcugag qquaaaqaaq cccuccagau aaaauacaau uccuugaccu ggauugaaua cuggccuaga uuaqcuaauu uaqaugaauu ugccgaaqau

<210> 9

<211> 1713

<212> RNA

<213> murine

<400> 9

qcuuuqaaqa qaqaaqcuuu aaucuucaqc auaaaqacaq acuqccuaug cuuuacucac aucaaauqqc uaucaqaaqa aucaauqcca uugagggccu auqgacaucg auguuucuua aagaauuucc uugggaggcc ggauuuggca quggcuuggc ucugaggaag uuugcagcuu uacagaggcu acggaaacuc aqcaqqqaaq aaucaucauc qqaaucaquq caaaugaaga acugauuacc aaaucaaaga gauuuccuuu ququacqauu gccacuuuca caququacga acuuccaaua ucaaaauuca gauuqugggc aaaugcagga acagcauqua aaccagagau qaaaauquuu uuqucaaqua guugcugaga aagacucuga cugguaaaag gaagacaqua uucaguuuca qguacaucua gacacaacau guucaucgug aucuuuuuaa auqqauqcua

qquuaaaqqu

cucuquaccu caqucugaac qcaqagquau gacqqaauau caagcauaaa aquagagqug uacaquacau uuauuugaaa ugauuacaaa

uqgauccucu aqacuuaaaa uggacauquu ccggauauuu auaccacaga qaaagucuqu agaauuggau ugcauaugcu caaqgcaacc gauuaccuuc cuuaauuaug cccuuuaqau ucaagcauuu a

3660 3720 3780 3B40 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 49BO 5031

auqqqacuuc uqugquauuu gauqaqucug uccuucuaug qqauccugca gag ucauqcu ucqqaqcqcu quqaugacug qqqacuagau accaugcgac aaauccaaqu quuuqaaqau qaqccqqcuc qaaucaaqug cccccucuuu gaacacuucc uqaaquacaa cuacaqcacu gcccauuccu cuggccuuac ccugaucuqq uacuqqacca ggcaaqaccq qqaccuggag gagcccauua acuuccqccu cccagaqaau cgcaucaqua aggagaaaga ugugcucugg

uuccggccca cccuccucaa ugacacgggc aauuacaccu gcauguugag gaacacaacu 360

uacugcagca aaguugcauu uccccuggaa quuquucaga aggacagcug uuucaauucu 420

gccaugagau ucccaqugca caagauguau auugaacaug gcauucauaa gaucacaugu 480

ccaaauquag acqgauacuu uccuuccaqu qucaaaccau cgqucacuug quauaaggqu 540

uquacugaaa uaqugqacuu ucauaauqua cuacccgagg gcaugaacuu gagcuuuuuc 600

auccccuuqg uuucaaauaa cggaaauuac acauququgg uuacauaucc ugaaaacgga 660

cgucucuuuc accucaccag gacugugacu guaaaggugg ugggcucacc aaaggaugca 720

uugccacccc agaucuauuc uccaaaugac cququuqucu augagaaaqa accaggagaq 780

gaacugquua uucccugcaa aqucuauuuc aguuucauua uggacuccca caaugagquc 840

ugguqgacca uugauqgaaa gaagccugau gacqucacag ucgacaucac uauuaaugaa .00

aguguaaguu auucuucaac ggaagaugaa acaaggacuc agauuuugag caucaagaaa .60

qucaccccqg agqaucucag qcgcaacuau qucuqucaug cucgaaauac caaaggggaa 1020

gcugagcagg cugccaaggu gaaacagaaa gucauaccac caagguacac aguagaacuc 1080

qccuqugquu uuqgagccac qqucuuucug quaqugquuc ucauuqugqu uuaccauquu 1140

uacuggcugg agaugguccu cuuuuaccga gcucacuuug gaacagauqa aacaauucuu 1200

gaugqaaaqg aquauqauau uuauquuucc uaugcaaqaa auquggaaqa agaggaauuu 1260

gugcugcuga cgcugcgugg aguuuuggag aaugaguuug gauacaagcu gugcaucuuc 1320

qacagagaca gccugccugg qggaauuquc acaqaugaqa cccugagcuu cauucagaaa 1380

agcagacgac uccugguugu ccuaaguccc aacuacqugc uccagggaac acaagcccuc 1440

cuggagcuca aggcuqgccu agaaaauaug gccucccggg gcaacaucaa cqucauuuua 1500

gugcaguaca aagcugugaa ggacaugaag qugaaagagc ugaagcgggc uaagacgqug 1560

cucacgguca uuaaauggaa aggagagaaa uccaaguauc cucagggcag guucuggaag 1620

caguuqcaqg uqqccaugcc aqugaagaag agucccaqqu qqucuagcaa uqacaaqcaq 1680

ggucucuccu acucaucccu gaaaaacgua uoa 1713

<210> 10

<211> 1714

<212> RNA

<213> horno sapiens

<400> 10

E1 0807401

60 120 1 80 240 300

auqacacuuc uqugquququ aqugaqucuc uacuuuuauq ucaqaacqcu qcqaugacuq qqgacuaqac accauqaqqc qaqccaqcuc qcaucaaquq cccacucuuu qaacacuucu gcccauucag cuggccuuac ucugaucuqq uauuqqacua gagccaauua acuuccgccu ccccgagaac cqcauuaqua uuccqqccca cucuccucaa uqacacuqqc aacuauaccu uauuqcaqca aaguugcauu ucccuuggaa quuquucaaa cccauqaaac ucccaquqca uaaacuquau auaqaauauq ccaaauquag auggauauuu uccuuccaqu qucaaaccqa uquuauaaaa uacaqaauuu uaauaauqua auacccqaaq auugccuuaa uuucaaauaa uggaaauuac acauququuq cquacquuuc aucucaccaq gacucuqacu quaaaqquaq quqcccccug ugauccauuc accuaaugau cauguqgucu gagcuacuca uucccuguac ggucuauuuu aguuuucuqa ugguggacca uugauggaaa aaaaccugau gacaucacua aquauaaquc auaguaqaac aqaaqaugaa acaaqaacuc quuaccucuq aqqaucucaa qcqcaqcuau gucugucauq guugccaaag cagccaaggu gaagcagaaa gugccagcuc gcuugugguu uuggagccac aguccugcua guggugauuc uacuqqcuaq aqauqguccu auuuuaccqq qcucauuuuq qauqgaaaag aquaugauau uuauguaucc uauqcaagga quauuacuqa cccuccqugg aquuuuqqaq aauqaauuug gaccgagaca qucugccugg gggaauuguc acaqauqaqa aqcagacgcc uccugquuqu ucuaagcccc aacuacgugc cuqqaqcuca aqqcuqqccu aqaaaauauq qccucucqqq

quacaquaca aagcugugaa ggaaacgaag gugaaagagc cucacgguca uuaaauggaa aggggaaaaa uccaaguauc cagcugcagg uggccaugcc agugaagaaa aqucccaggc ggccucucgu auucaucuuu gaaaaaugua ugaa

<210>1 1

<211 > 24

<212> RNA 41

qaauccuqca aaguqauqcc aaauccaaqu quuuqaaqau uqaaauucaa cuacaqcaca ggcagqaccq qqaccuugag aggagaaaqa uqugcuqugg qcauquuaaq qaacacuaca aagacagcug uuucaauucc qcauucaqaq qaucacuuqu cuaucacuug quauaugggc quaugaacuu gaguuuccuc uuacauaucc agaaaaugga uagqcucucc aaaaaaugca augagaaaga accaqqaqaq uggauucucg caaugagguu uugaugucac cauuaacgaa aqauuuuqaq caucaaqaaa cuaqaaquqc caaaqqcqaa caagauacac aquggaacug ucauuguugu uuaccauguu qaacaqauqa aaccauuuua augcggaaga agaagaauuu qauacaaqcu qugcaucuuu cuuugagcuu cauucaqaaa uccagggaac ccaagcccuc gcaacaucaa cqucauuuua

ugaagagggc uaagacggug cacagggcag guucuggaag gqucuagcag ugaugagcag

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1714

<213> artificial

<220>

<223> murine es oligonucleolide

<400> 11

5: cagguuucgu agaaguucac ucgg 24

<210> 12

<211> 20

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> murine es oligonucleotide

<400> 12

acagcacucg uugaaggccc 20

<210> 13

15: <211>21

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> murine es oligonucleotide

<400> 13

acuuacggau ccuucccagu u 21

<210> 14

<211> 20

<212> RNA

25: <213> artificial

<220>

<223> murine es oligonucleotide

<400> 14

ggaaaacuca uacuuacgga 20

<210> 1S

<211> 2S

<212> RNA

<213> artificial

<220>

35: <223> murine es oligonucleolide

<400> 1S

guacuuagca gcugaaaugg uggca: 25

<210> 16

<211> 2S

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> murine es oligonucleotide

<400> 16

45: cucgggcucc gucauagcag cauuu 25

<210> 17

<211> 2S

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> murine es oligonucleotide

<400> 17

cacagguuuc guagaaguuc acucg: 25

<210> 18

55: <211> 25

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> murine es oligonucleolide

<400> 18

gguaacccgg gccacucgcu ccuca: 25

<210> 19

<211> 25

<212> RNA

65: <213> artificial

<220>

42

<223> murine es oligonucleolide

<400> 19

cucguugaag gcccugaugc agaga: 25

<210> 20

5: <211> 25

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> oligonucleolide

<400> 20

ccuucccagu uggacagguu uaugg: 25

<210> 21

<211> 25

<212> RNA

15: <213> artificial

<220>

<223> murine es olignucleolide

<400> 21

aaacucauac uuacggaucc uuccc: 25

<210> 22

<211>21

<212> RNA

<213> artificial

<220>

25: <223> human es oligonucleolide

<400> 22

gcucgcugcu cacagguuuc a: 21

<210> 23

<211> 23

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> human es oligonucleotide

<400> 23

35: acacaacauu cagugaaagc uuu 23

<210> 24

<211>21

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> human es oligonucleotide

<400> 24

caggcuccau cguaacaaca u: 21

<210> 25

45: <211> 22

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> murine IL-1 RAcP oligonucleolide

<400> 25

cuccagccag uaaacauggu aa: 22

<210> 26

<211>21

<212> RNA

55: <213> artificial

<220>

<223> murine IL-1 RAcP oligonucleolide

<400> 26

aaaaccacag gcgaguucua c: 21

<210> 27

<211> 20

<212> RNA

<213> artificial

<220>

65: <223> murine IL-1 RAcP oligonucleotide

<400> 27

43

augacuacag caaaugacaa 20

<210> 28

<211>21

<212> RNA

5: <213> artificial

<220>

<223> murine IL-1 RAcP oligonucleolide

<400> 28

ccaaagugag cucgguaaaa 9 21

<210> 29

<211> 20

<212> RNA

<213> artificial

<220>

15: <223> murine IL-1 RAcP oligonucleolide

<400> 29

gcacacuucc aauacuuacc 20

<210> 30

<211> 17

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> murine IL-1 RAcP oligonucleolide

<400> 30

25: uacuuaccaa gaauugu 17

<210> 31

<211> 25

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> murine IL-1 RAcP oligonuGleolide

<400> 31

gguaugacua cagcaaauga caaaa 25

<210> 32

35: <211> 25

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> murine IL-1 RAcP oligonucleolide

<400> 32

guaccuuggu gguaugacua cagca 25

<210> 33

<211> 25

<212> RNA

45: <213> artificial

<220>

<223> murine IL-1 RAcP oligonucleotide

<400> 33

aaaaccacag gcgaguucua cugug 25

<210> 34

<211> 25

<212> RNA

<213> artificial

<220>

55: <223> murine IL-1 RAcP oligonucleotide

<400> 34

caguaaacau gguaaaccac aauga 25

<210> 35

<211> 25

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> murine IL-1 RAcP oligonucleolide

<400> 35

65: aagaggacca ucuccagcca guaaa 25

<210> 36

44

<211> 25

<212> RNA

<213> artificial

<220>

5: <223> murine IL-1 RAcP oligonucleotide

<400> 36

caaagugagc ucgguaaaag aggac 25

<210> 37

<211> 25

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> murine IL-1 RAcP oligonucleotide

<400> 37

15: agcacacuuc caauacuuac caaga 25

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<211> 23

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> human IL-1 RAcP oligonucleotide

<400> 38

uguuacuuac cuaaaauggu uuc 23

<210> 39

25: <211>21

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> human IL-1 RAcP oligonucleotide

<400> 39

uuucaucugu uccaaaauga 9 21

<210> 40

<211> 23

<212> RNA

35: <213> artificial

<220>

<223> human IL-1 RAcP oligonucleotide

<400> 40

uagccaguaa acaugguaaa caa 23

<210> 41

<211> 23

<212> RNA

<213> artificial

<220>

45: <223> human IL-1 RAcP oligonucleotide

<400> 41

agaaucacca cuagcaggac ugu 23

<210> 42

<211>21

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> human IL-1 RAcP oligonucleotide

<400> 42

55: ucuuggagcu ggcacuggaa u 21

<210> 43

<211> 20

<212> ONA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 43

aaacgcagat gactcccatt 20

<210> 44

65: <211>20

<212> ONA

45

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 44 5 acgcgatgaa tttcccatag

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 45 gaggatctca ggcgcaacta

<210> 46 15 <211>21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 46 tcagcagcac aaattcctct t

<210> 47

<211> 20

<212> DNA 25 <213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 47 ttctcaggcc aagaagaacg

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220> 35 <223> primer

<400> 48 gggcaaactg caactgtttt

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 49 45 caagcgcagc tatgtctgtc

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 50 tctcggtcaa agatgcacag

<210> 51 55 <211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 51 actgctctgg ctcctagcac

<210> 52

<211> 20

<212> DNA 65 <213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 52 ccaccgatcc acacagagla

<210> 53 5 <211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 53 tgglaglggl tclcattglg gl

<210> 54 <211>21

<212> DNA 15 <213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 54 tccaaagtga gctcgglaaa a

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220> 25 <223> primer

<400> 55 aaagccccca laaacclglc

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 56 35 tcggatalcl gccttcatca

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 57 actgctctgg clcclagcac

<210> 58 45 <211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 58 ccaccgatcc acacagagla

<210> 59

<211> 20

<212> DNA 55 <213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 59 tgclacacgg aggaagaage

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220> 65 <223> primer

<400> 60

catcatcatl agggccatcc 20

<210> 61

<211> 20

<212> DNA 5 <213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 61

aaacgcagat gactcccatt 20 10 <210> 62

<211> 14749

<212> RNA

<213> artificial

<220> 15 <223> human intron 8 pre-mRNA IL-1RAcP

<400> 62

quaauagaug cggucaquga ugaaucucuc acaaaaggag agauugagaa caagagagcu uaguaaugaa ucaaacuuaa augaaaaaua aauauuquuu cugauauugu uaguaccqua gaguacagug agacacaauu uugugucugu uauucaaagc uaccaaagau agaaaaaacu aagacccuuu uaaaaaucau ucaugguaga cuqaccuaaq acuuucggaa uuuuuccuqa uuaauauuau uagaagcauu aucuquaquu uguaugcaac uaauuaaggu auugaauguu auuuuaaaca cuauguauca auauuuaagc cuaaaaugaa aaucauuuaa auuaugauuu uaguacuaua uuauucuaca auaaauggaa uccuaaauca gacuququcu aaaacuuucu aaaaucccuu caaggauguu uucaaugguc ugaaaucaug aaaucagguc auucagaauc uauuucuuca aaagugaaua acauagcaca uuuuuuaaaq cuqaugaaaa acaggauuca aauagcaaag gccugaaaug uauaugcugc aauucauugc uucugcuccu cagaagccag uaagqcaguu ucccaaauug aguucucggg augcauuauu quacucuaga aucagagcac uaacucugug aaaaguaaau cucucugagc agcuccaaau uaacauuqug ccaqcaccua gcccgacggc ugaaaquuuu caucuaugua augcccaaau guagcuaaaa acaauuauga aaaauuaaaa gguagagcca cauauuguug cuucaagagu cauaaaaaag acaaauaaca qaaaqqqaau quaaaacauu auuaauagca uauuuuccaa aaaugcauaa agquuuauaa uauaccagca uaaaugquau aaacaugauu auuauaaagc cuucuuguca uugugucucu caccuaacac uugagaaaag uaaugaugag cuccuggcuc cuagucuaua uaauuguuac auuuuacaga ccucaaacuu ucauuacaac guaugaagua cuaqugaauc uqugaaaaqq aaaqacuqaa aacacuacua aqaaucaqua cuguguugaa auucugquuu cuuaauuucc uuauauuuaa

qugaauaagg aucuaaccca agauacucaa aaaucgacgu acaaagaaaa gugaauuauu auugcaucau uauauaccuu gccauccaau uuauaauauu gccacaauug ucuauquuga gaagugcugc agaaucccag uuaucacaca gaguguguaa gacuuaaugc uuuaaaacua aguucaggqu quacauqaug uuguccugca cugcacaucc aguagacaca

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380

auaauaccac uaccuuauaa 99Uuguuuua aagugcucag cacaguuauu ggcauauaua 1440 ccuauauauq aaauqcucaa uaaauauqaa cucauuauuu ccuuaaqauu uucauaqquq 1500 uuauuugaca aaqgcuuuua ucaucaaaua aguaucauuu auqucuqqau uuuaaaaaau 1560 caaucaaquu acuuuaquua qgacccauuc aaguauuuaa uaugugaaca uuugauggga 1620 auaucugcgg gaaquuggau uauaguggca ggauguuuuc auauguauuu gacuccagau 1680 uucuuaagua uqqagcuuuu uguqqggauc aucuucuqag gqauquaucc ugqggaauaa 1740 uuauqqaagg ugacauaaau uaauaacuua uuqucaaauq aauaqqauca qaacaaucaa 1800 agcaagguqu aauquaggag ugaagcacaa quuugccucc cagagcgacc agaquaqcuc 1860 cccuuuuaca gaagccccug cucuaaaugg uquaauaagg acaququcag gaauqugaag 1920 ugacaggugg auccucuaga cuagaugauc ugugcugaaa gcugauauaa aaucacuquu 1980 uggucacacc uguguauuuc cggugquacc agaggaguug ugguuuucuu cacuugqcuu 2040 cuauucuqgq ccaqcuaauq cuqaaauuca qaqguuauau cuqaquucac auucauacau 2100 uacauquaug ggacuacucu aaauuuauua gcaaagcauu auaugaacuu ccucaaaagg 2160 acaucaagaa aagacuaagg ccuggaauga gagaaagaca cugququagg ucuuauugac 2220 agcaaaauuu cauuauaguc aguuaaagcu aa9Uauuaaa gagga9gca9 uuguuuuauu 2280 uauauuuuau quauuuauuu uuauuuauuu uuuauuuuuq aqacacaquu uuacucuuqu 2340 caccuaggcu gaaqugcaqu ggcaugaucu cggcucacug caaccacugc cuccuggguu 2400 caagugauuc uccugccuca gccucccaag uagcugggac uacacaggca ugugccacca 2460 cgccuqgcua auuuuuguau uuuugcuaga gacaggauuu caccauquuq gccaggcuqg 2520 ucucaaacuc cuqaccucag quqauccucc uqccucaqcc ucccaaaguq cuqqqauuac 2580 agququgagc caccacgccc agcucauugu uuuauaauaa cagcaugaaa aggacuaagg 2640 caagquaucu quuuaacuuu qugagaaacu gccaaaccug uuuccaaaga gauuguacca 2700 uuuuaccugu ccucuagcaa uguucacaaa uuccaggcgc ucuauuuccu caccaauuuu 2760 uggagcuquc aaacuuucaa auuuuagcca uacugaugga ugcauaquuu uauuacauug 2820 ugcuuuaaau uuqcauuuau uqqauacuaa uqauquuqga caauuuuuca uaqccuuauu 2880 ugucauuagc uaauauaucu uuuugugaag uaucuguuaa aauguuuagc ucauuuuugu 2940 uacugqucau uuquuuuuaa auuuaauqua uquuaggaua uagacacaga cgcauauaua 3000 ucucaaauaa aaquccugug ucagauauau gaauuguuaa uauuaucacc caguuuguga 3060 auucauuuuc uuuuaaacag aaucuuuaaa acuuugauqq cauuuauugu aucaauuuau 3120 ucuaugcuua gugguuucua aauucaguau uagcaaucuu ugccuaaagu uagaaaggua 3180 uucagquuag aaagquaucc uucuguquuu ucuucuggaa gacuqquaga uuuuucuuuu 3240 agaguuaqgc cuaugaucca uuuuuuuaau acucugagqu acuggquuaa uquuuaguqu 3300 49

uuuquuuuuc cacauaqaua accaguuguu cucauaucau auugaaaaau c uuuccuuug 3360 uuuquuqaau uguucaqaaa aqaqcccaaa aaauuaauuc uauqaauaua gaucuauuuc 3420 ugcauucccu gcucuguuca ucuquuuauc uaucuuuagu ccaaugccac uuuauccuqq 3480 uuaacauagu uuuaaaauuu aaaguaaguc aUQaaaucac auacuauauQ ucuucccccu 3540 uuuuucuuuu ugaagauuga uucaacuauu uuaggaacca uauauuuuuu uucguauaqa 3600 ucauaguauc aguuuqucca uuucuacaua aaggccugau gauauuuuga uuquauuuaa 3660 uuuauaaauc agucuqqaga aaauuqaaau cuuaacaaua cuquauuuuc caguccauqq 3720 auauaauaua ucucuccauu uauuuaqauc uuaacuuuuu ucaqcauuuu uucuuuuaqa 3780 uuuQaguqua caQQccuugc auauauauuQ uuaaauquau gccuaaauau u uuguuuuuq 3840 auqcuauugu aauaguacuu uuauuuaaau uuauuuuuga gacaqaqucu cacuqucacu 3900 uaqqcuqcaq uqcaguqqcq uqaucucqqc ucacuqcaau cuccaccucc uqaguu caaq 3960 caauucuccu qccucaqccu ccaqaquagc uqcqauuaca gquccccacu accauacccq 4020 gcuaauuuuu auaguuuuaq uaqagacqgq guuucuccau guuqgccaqq c uugucucaa 4080 acuccuqacc ucaqauqauc cacccuccuc aqccucccuc ccaaaqugcu gqqauuauaq 4140 ucqugaqcca ccaugcccgg ccuquaauaq uacuuuuuaa auuuucauuu uccaquuQuu 4200 cauugaaaau gcaauuaauu ga uuuguaua uauugaucuu ga ccuuuuga acuuuagggu 4260 gggguuuquu uguuuaquuu guuagqauuu uccauaugcu uqauuquguc acccaucauc 4320 aaacagauuu uuacuucuuc cuuucuaaau uucauaacuu uaauaacuuu uuacuquccq 4380 uuucacucuu uuqqaccucc aquacaaugu ucuquaqaaq uuuuqaqaqc aqccaucuuu 4440 gcaul.lguuuc caaauuuaga gggcaagccu ucagguuuuu auauacagga u uuuuuugua 4500 gauqaccuuu auuuucauga qcaauuuuuu cauuuucaqu uuqccqaqaa uuuuuuuquq 4560 ugaquauquu qaquuuuquu gaauacuuaa cuqqaucuau uqaqaqaauu auauquuuuu 4620 auuuuuaauc ugucaququq auqauuuaua cuuacuqauu uuqaaauguu cauccaauuu 4680 uqcaugucca qaauaaaccc ucauauuguc auqauuuauu guccuuuuua uauauuacuq 4740 qauuugauuu acuaauauuu uqucacaqau uuuuquucau guuaaqaauu uuuuuuuuuu 4800 uuuul.luuqaq acaqaquuuc ccucuuquuq cccagqcuqq aquacaquqq cqcgaucucq 4860 qcucaguqca accuccaccu ccuqgquuca aauqauucuc cuqccucaqc cuccuqaqua 4920 qcuqqgauua qaqqcacccq ccaccauacc aqcqaauuuu uuuuuucuuu ucaguaqaqa 4980 uuqgquuuca ccaaauuuuq uucauaucuu uguucauqaa gqauauuggu uuquuuqguu 5040 uguaguauuc uuuucuugua auqcuqugac uaauquqaqq guuauqcuqq ucucauuaca 5100 uqaqcugggu aauquucccu cuuuugugau uaugugaaaq ccuaugggua aaacugguau 5160 uauul.lcuugc ucaaaaqaau uacucauaua acuaucugqq ccuguuququ uu uuuuuuuu 5220

quuquuquuu uuuuuqagaa gqaqucucgc ucuuucqccc aqqcuqqaqu gcaguqqcqc 5280

gaucucggcu cacugcaagc ucggccuccc ggguucacgc cauucuccug ccucagccuc 5340 ccgaguagcu gggacuacag gcguccgccu ccacggccgg cuaauuuuuu guauuuuci:lg 5400 uaqa<¡acg'qq quuucacuqu quuaaccaqq au<¡qucucga ucuccugacc uU9Ugauccg 5460 C!C!C!gC!C!uagg C!C!uC!C!C!aaag uqC!uqgqauu aC!aggC!guga qC!C!aC!C!guqC! C!C!qqC!C!guug 5520 uuuuC!uuuuu gqgaaagC!uu uuaauuauga auuC!aquguC! C!uuuuuaquu auugagauuu 5580 uC!uguuucuu C!uuguggC!a<¡ uuuuggC!uuu caaggcauuu uuuuccauuu caucuaaquu 5640 qucacauuau uqqcauacuu uucuuuagau uauuuccuau uauccuuuua auqucugci:lg 5700 gauuuuuaqu gauquuccac uqucacuccu gauauuaqua auugguquuu ugccuuuuuu 5760 uquccuucau caqucaagau aaggguuucu caauuuugcu aauuuuuuca augaacauau 5820 uuuuauuqau uuuucucuqu uquuuauaua uuuauuuacu uuauucauau acuuauuuuc 5BBO cucuuuuugc auacuuugca cuucauuuuc uuuuugucag ucauccuaaa auguaagcug 5940 uaucac uaau uuuuaaguaa uucuucuuuu ccaauauaaa uauucugagc uauququuuu 6000 ccucauagga uuaguuuaac uaaauccaac aaauguugaa augucgaquu uuuguuauua 6060 uuaaguucaa aauacuuucu aauuucuguu uucauuucuu uuugaccuaa qgquuauuuc 6120 aguguguguu uuuuaauul.la aacaugcuuq gaauuuucca qauoguuuua cuacauuaua 6180 uaugaaaauu cauuugaauu uuagaquugg cuuuauquuc acucuugaua quuauuuqua 6240 acauuucaua uugucauuua aquuuagcua auguaaaaaa uuagaaaaaa agucugqgaq 6300 cagguaucuc caacuuagaa cuaccugaga gaacuacauu acggagugga gaaacauagq 6360 uuuuuquucu aqauagaccu gqguucaaqu uccqqacuca quqcuqqcug uquauauqaa 6420 cuaguacaaq ccuuccuuuu cuuauccuuc agguucaauu uccaggquau cugugaaaac 6480 cgagggaaug gggaaugaga gcuuugccac agugcugcac acuugauucu aauuucuaau 6540 cuuuuauuua auucugauqu guccaaagaa cauacuuugc augauuuuau ucuuuuuaag 6600 cuuauugqua cuuaaaaaaa aaquauuugc agacugccua ucuugguaaa uquuugauau 6660 gcauuugaaa aagacauaua uuuuguaguu ucgaguggug uccaguaaau gucaacuaag 6720 aaaauuQ9UQ ucaququuqu ucauqucuuc aauauccuuc uQauuuuucc aauauacuuu 6780 quuauucaqu uauuaaaaga gagaauqguq uugaaaucuu uacauauaau auqqauuuuu 6B40 ccaauucucu cuucaquucu qccaquauuu gucucaugua uuuuqqaacu quqauauuua 6900 auacauQcuu auuuaQqauu Qacaaqucuu uuucaugaau ugacucuuaa auugugaaau 6960 guccguuuuu ucucuquuaa uacucuqugu cuaauaugaa uguagccauu ccagcuuucu 7020 uuuuuuuuac uuuuuuaauu aauuaauuuu uuuuugquaq agggacqgaq ucuugcucuq 7080 ucqcccaggc uqqaqugcag uqguqcqauc ucaqcucacu qccagcuuuc uuauaauuaq 7140 uauauguuuu uuccauuauu uuauuuuacc uaucagcauc uuuaugcuuu uauacuuaua 7200

cuuuauacuu aauquau gua aucauuu cuq qcuuuua acu qccuuuaaqu uuaccaucuu qacuaauuqq uauuuucauu uuuuuguuuq qgqcuuquuu uuaucaquug aucuugaauu uuuccauuuc uucccuccca auuacaqugu accaacaugu uuaagaacuq aucuuuuuuu

cuugguaaca uuuuaaucug aagaacuauu auucucucag c uuuquuuua aucugaaaau aaacuuuacu aagaaaquuu ucaaauauau quaauacagc c uaccuaqau ccuaccauua uauuc.auucu ucugccagua uaucaaucca gcaqacauca guaaacauuu aagcuccuua

qquuucuuuu uuqauaauuu

aauauuacca accuucccca uuuuuauaua uguaccuuca uuucuccuuu qaaugauuuq ucuulluqaau ucuuauuuac uqaauguuua gcuauuuquu quauuuuauu uguuuuquuu aaucacuuua uccuuuqugu auuquqaaaq aaauuuauuu

cuagquaaaa uuugcauaaa uuqagaaauq cauauauaua ucaccagaaa guaacauucu ccuccccaaa caauacaacu uucuaqaacu cuqu<~uauqu c ucagcaaau guucuugaua uguuuqccau qqaquqquuu uuuauucauu cucuQqquQq aaagcuucug Ilqa.acuuucu

aqcauauuau uqqguauuqq auccauuuuu cuuuaauuau guccaccugu cuuuauuuuu uuaucacuuu uuuqaqcuuu ccucuaqagu uuauaauauu cauauuuuau gagaaacuua uquqcuauaa uacauuuuqq uuuqqcuuua aauaacuguc Qcuuauuuuu uauuucuQac uaauQuuucu gquacaucug QUccuauuuc auuuuaauuu ggaaqauuuu aagqaauuac acauuqquua ucuuuqcuuu ucuuauuuuc ugauacauuu ucauuaucag uguuuuaaua quaacaaauu gcauaauuca uqcauuaccu aauauccuau uccccuuauc agucaauccu guuuuuauuu ccuuuuuuag qqacccaull.c lI.qll.lI.uqcqcu uucacccaug cuquugugug uguuuuquuu uuquuuuguu uqaacauuuq Qquuquuauc ua.ucca.aQUu ucuua.a.ugqa. aauuacugac uuaquuuuau ucauuccaua uuccaccauc uuuquuuuag caauuauagq uucccugaug ucucaaaaua guauuuuuuq auquqacugu uauuqaaucu uaqcuquucu uuqcaaauac uuuuccccaq uqaqcaqaqq uucucauuuu uaauuucugu guucuaagaa

uacullcucug agaugaauac cuaugaqugg uaqaccuuuu uuuuucccca aguggcuqua caucuuaagq auuugququu qucagccuuc quqquaucuu acuquaquuu aauucuucau acaccucauq ugcuuauugq ccaucuquau uguucauuuu auaaauaquu uquauuuuau ugqallaccag uccuuuquca gacacauquu qacaauuugu uuuuucquga aguquuuuaa uaauuuauua acuucuucuu uaaugauuau

a uccaaucuq uaauaugacu aucuccucua uqqcucuucc u uuccuaaac cuauqqcgua uuuuqcauqa u ucuauuaaq acuauccauu cugQUgacaa uuauauuuca acaguqaqca aucacauguc caaaguagau uuuauuugua aguguaccau uaagauauaq uucuaccccc aauaguuuuu acuqull.ull.lI.c uaucaggcau uaagaauqca aquuuuqQqq cuaccqcuuu cagaaacuqu aacauauuu a ugaguquaug cugagcacuu uca aa cauuu ucaucuqucc ucuguugcau uuauqaqauq agcuuugcuu

7260 7320 7380 7440 7500 7560 7620 7680 7740 7800 7860 7920 7980 8040 8100 8160 8220 8280 8340 8400 8460 8520 8580 8640 8700 8760 8820 8880 8940 9000 9060 9120 9180

acccauaguc aggaagquuc accuuuguuu aggccuauag uccaucucuu uucuuuuuuu 9240 ucaugaaugg uquguaguag aaauugaaqu ucaguuuucc uuucauaccg auauccaguu 9300 quuccaQcac aauuaauuQQ aaaQauuuuu acuuucucau uauguuucuc uQguQccuuu 9360 gucaauauuu ucacaggaua uguugaaagu guaucuauuu cuuuucuuuc agcccuuuaa 9420 gguauuccau ugucuccugg cuaauauuau uuaaaaugca aacggggcag uuuuuguugc 9480 ugcuguuguu cuuguuuauu uuugugcccu uuauguauuu guuauquuuu ucuuuQgcag 9540 auuuuaagau ca ccuuuucu uuauuqauuu ugaaaaucaa auuauqaugq ccugugququ 9600 ccuuugugug uguquguuuc uuacuuagag uuuauuaaac uucucaguuc uauguguuua 9660 uauuuuuccu uuacugugaa caauuuucag ccauuuucuu uucaaauaug ucuagcuuuc 9720 ccccucacuc uuucucuucu uuuaguacuc cagcugaaau uaggauagac cacugcuauc 9780 caauuaguag ugccccacag aucacugauc ucguuauuuu uauuucuucc uuuuucaucc 9840 uuuucccugc ucuQUguuuQ uguaguuucc aauguaugcu ggccauuuuc uuuguQaugu 9900 cuaaucgaua gcauuuucuu uauuucagaa uuguaucuuu uagcuuuuga auuuccauau 9960 cuucauugaa aggucccuau ugauauuuuc uauuugcugu ucacaauguu caugguuuua 10020 aaaaaauuga acaaauacac auagaauacu cauuuuuagg uguuuaucug auaauuccl:lc 10080 cacuuuuguc aauuuuuguu cuquuuuQau uagcuaucuu uuuauuagcu aauauagacu 10140 uuuuugcuuu uuuauauagc uuuuuaaaaa uuauaugcug gauauuaugg auguuacaau 10200 uuugaguucu gaauuucgua agacaguguu aaauuuuguu cuagagggua auuaaauuac 10260 uugcauaacu gcuugcuuuu aaaaaagcau cuuaucuuug uuaaagcagg ucuaaaauag 10320 ccuuuucugu aagguuagau uqgaccuacu ucuaaagcau gucauaccug aagucucuaa 10380 uuaauacugg ggagcuaaac acagucucuu cacucugagu ggccuguacc caacugucuc 10440 acagcccuuc augugcuccu agaguugauc uguucccagc uauucuuugc cuaaccuuuu 10500 aaaquauucc cccaaauaug uguagcuuug uauuuggccg aagacucgag auaauccugu 10560 gcagauuucu agaguuccau cucuaaauag uucucuucuc uauaaaugca aucugacuca 10620 acaQcaQccu uqaacucuca uuucuaucuc uuuaqcucaq uguqaccacu uucucauuuu 10680 ggcuuucccu ucucugugcc a caguuuaaa aggugccuuu aaucgaaaag ccagagugau 10740 cguagcauuu accucuuuuu ugucuuuucu cucacagauc acauuccugu guuaccaguu 10800 guccaacuuu uuacaaacuq uauuuuaQau auggaaggaa ggcuagucca ggacuaquua 10860 cuccuuuaag aacagaagcu gaaguccaaa gugcacaugu uuuaacacac uauaauagcc 10920 aaaucaguaa caucugcgag uuaauuuagu cauaggucuc ugauuuauca uaauuuuaau 10980 aaagcauucc cuuuguuuac aacucaggag aaugqucauu accacaguuc caaaaauuau 11040 ccaucaqucc caauaauuua gaacqgagua gccauqqguu cuquggcaqg qaacacuugg 11100

agqugcaagc agcuggcauu uaquugggi!l.c uaauaaagau gacggaaauc acucagauuu ucaaaacagg gaaaauqcca agaqcuaacc aqccaguuau uuacauugaa cuacaaaagg aaccaucaag gagcuaaauc llggcuacauc agaaguuuag qaquccaguu uqqucquacu uuuuauuuuu auuuuuauuu uuuugagaca gcaaugquqc aaucuuqqcu cacuqcaacc ccucagccuc ccqaouaqcu oqqauuacaq auuuuuaquu qaqacaqQ9U uucuccauqu agquqaucca ccqqucuugq ccucccaaaq ccg'qccucug auagqaaauu cuuuagucug aaacaccuga ggquccaqcu aqqcaqucaq quaaqccaqc acuqcuuuac cuqaaaqccc uauul.lagaaa auccagcuag uagauuauuu acuccuuuuu aucaagauug cucuacaaaa ugacacaaaa caqaauuaaa auqccccauu gaggcagggg aaauuuauqa ggc¡uaauuga gcauuuaaca aaaauccauu ucagguacgu aaaa uquuCll. uccaqaqaqa qccaaaauaa uuacccuquu guacuguuaa cauaacquac uqccagcuau ccaaauaqau cuua9Uaaac aauuuauqau qoaquuuucu uquuuuaaQq accuqquaau aauul.luqcac I.Iqcuaaqucc ccaquuuagq auaauaaaau caaaacucua uucaqcucca qqcuqcuuac cauuuucuqc uccuqgaugu qaaqcugauc uqccuqcaac uucaqcuuau cuqqcuqqcu aaqcggqugu ccuucccgaa gcugcgcacu caquggaaga ucuuu'Uquca aqgqua'Uaqg aquaqcug..g caagquucau aaacguqauu cuauuucaac ugaugguguu caaagauccc cgcacuuugg uggaaugaga uucuucuaag cugugucuca

augcaqugga uggcaaggcu ccuagagaaa cqugauuqua aaqguqguua ccuqqaaauu gauqgaaaaa. auacugalluu cugaaucaga auauuaquaa acaucauguc uuucuqauaq gaquuuugcu cuuguugcca uccqccuccc aqquucaaqc ocauqcqcca ccacacccqq llqqucaqQcu Q9Ucucaaac u9Uuqqqguu acaqqcquqa qcauugcauc agaqugaaau caaauquaqu cuqagqguca uquaqaqaac cucuuqcauq aaqaguucq... uacquuaagu llacaquCl.lgu aaauaugaca aqaaauaaaa. uqqqcaquaq ucucucgguc auuaagcagg gcagccagca. acaaccucca cuqaqcaaau aauqaaaaua ucagaaauac caaggacaca uuucaqcaac uqcacuaaca uqccauuauu cauqqaaoqa caqqcual.lac cuquqqcaqq uqauucaccc uuuaauaaqa uuuqaauaga ugccuuuuua aucuqucacc ccauuqauca ccccuuccuc ccucacuquu ggacgaccau cugcaauaga cuccccugcu agaaccucca llguugual.lga ucaauaalluq agucagqgaq ccucuacagc gcaaacauuu aacaucuaca

ccaacugcaa gagcaagaac uqqgcuuuqa aaqgacuaac aaucaaugag gaaauucuuu aqqcuqqaqu gauucuccuq cuaauuuuqu ucccqaccuc qccacuqcqc cuuuuuquca CUCllUUCCCU uqacuuaaqc aqcauuaauq aaugacuqua uaaaauqaau cucllcuauug cccccauuac acaquqqaaa gugauuuuca caqcuucuqq quaQaaqaqu auuaauaucc gaacuucagq aaaagugauu ccagqquaqa ucacgugacu gggggacugg aacaagcucu aqcllucaucq aaullccagcu auquucuaqq

11160 11220

1 1340 11400 11460 11520 11580 1 1640

11700 11760

11880 11940

12000 12060

1 2120

12180 1 2240 1 2300 12360 12420 1 2480

12540 12600

12660 12720

12840 12900

1 3020 13080

ugcuuacaga agccuucccu caccaccuua ccuucaauca ccucuaucac auuaccaugg uaaaauuaac cagcuqauuu auuucuuuac cacaaaaggq cagaqacccu uuccgucuua aaaugquaga ugucaauaga uaauaaucaa gcuucagacc caguaaauau acuquuccuc cuaauaaagc aacuaaauaa aauugugaaa cagaagugua aaaucuuaua uguggaaaug ucauggaaga aaaagacaua aucucuaccu ggagugaaga agcugaccug uagacaaauu gauaaacaaa gggaaqaqua aaaauuucua uauucuauaa aagcuuauau aaaauaauga aqaaaqqacu uccaqccaqa aqucacaqca gauguuuuug augaaaaagc aaugguaaau guugugacag accuugauua uagggcuaau aauuaccuca cucuauuucu gauacuucca aaauaaguag auaaugcaga aaucuguuca uauguacuga agaacuguga acaugggaaa ugguggaugu ccuuuqcuuu uqcacaguga agaaaggaaa gacaauuaaa uuccuuucau uggaaaaaua uugagauuuu uacucaaauc accguggacu ucuucaggua qcaaugagaa augauaauuu ucaaaaauau uuguaaggag augaccuucu aagcccuucc ugauguuaug cuauucaaau aaaaaacacc uucuaugcca cagucuagua uuuuaaaaua gugcuaaacu aggcaggugc auagcuaagc ugcuuggcuu uguggucacc acacagaaau caauucuguu

<210> 63

<211 > 1301

<212> RNA

<213> artificial

<220>

ugcaguacac cgcccuugcc uuuauuucuc uuauaqcacu auauuuacuq cccuqaauua uucaccauug uauccccaga auugacuaau acacaauuua cuucaaacac uuaaacuuca cauaauuuag uaauagacuu uucauugaga uacuaggcau gaaagacugu aaagguauag acaauauaau aaguaaugcu cacgggaqag ccagquuuca uauucgagca uagacuugga uqaqaaacqq qcaucauauu gagaaaggaa ggaagguggu gaguuaagau cugguuuuua aagaaacugc aaagqugccu caaucagaua uugcaaguuc uaacuuccag aaccaagcau aaauaauguu uuugaqqccg acuacacuag acaagagaau aqcugcauca acaauuaaaa cuccauccca agauauggac

guuuaggugu caaauuguga auucuguuuu aauuuauaua ggugcuggaa acaaaaagau cuacaauguu aucucugauu auccagcuau uugccgggau ucuuuguugu ucauuccag

ccagucccac aaucacuauu qaauauuaqc aqcuucugqc agccacuccu uuaucacaag cuaaauaucc ucuagggaua uuaaugagag guaaucaaau auaaaaauuu aacuaaaaag aaaucuuccu uaguaauuug aguacuggag aaaauauaaa accucuagaa auucagcauc auuuccaagu gaaacuauag uucuaccaau cqaggaugqa cuugaauuug uugucaaaga aaacauaaca guucauacau ggugggucac

13140 13200 13260 13320 13380 13440 13500 13560 13620 13680 13740 13800 13860 13920 13980 14040 14100 14160 14220 14280 14340 14400 14460 14520 14580 14640 14700 14749

<223> human intron 9 pre-mRNA IL-1RAcP

<400> 63

quaaquaaca gaaauuugac auaaaccucu ucuacuquca aaaaaaagaa aaaagaaaac auquugauuu gaaaaaccua cagauuaacu uuaauuucaa ccquugcuau uagaaaucuu uuucuuggau uaauuaguqa gucggucuaa auuaacaccc gagccacuua ccuacuuaaa auuucccaqu gaccacauua quaaaaauaa cgaauugacu aaauauauuu auaauacuau uuaaaaagcu aauqagauau uuuaguquuu ucuuugguac aauguauucu acuuuauccu uauaqcacau cucaauucaa gcaauagacu cquqacucqu qqcuqcuqua uuqgacaqug ucaqauaqaq aucuquqaac caqcaqcaac auaucacqug cuuaqaccua gccccuacug acucagaauc uacauuuaaa uquguacquu aacaucugaa aagcacagcu cuagugcaaa gagcauuuaa acauacaaau ucauaggucc accccauaaa auggaagaaa cacggaaucg auaguuuuua augagaugug ucqugaaaga uugguccauu aaaucuaauu auauuuuuaa aaauaauuca ggcaguuuca caagquuuua cucaauuugu ugauaggcuu ggacaggaag uugaaauuuu cucuacagug uuuaccuucu qqcuuuquua auuuacaquu gaaugggaca quaaagcaac cuguaagaug agaguugagg auauaucaga ucaaauaquc quuuugcqug gagacuuquu qcaaguaqaa cauaaugaaa augucuaaua ugcagaaguu agauuuaaga aacuuuccua auuuacauug uaucuguguu ccuuuuqcua

<210> 64 5 <211>47

<212> RNA

<213> artificial

<220>

<223> human intron 8 -exon 9 IL-1RAcP pre-mRNA

10 <400> 64 ucuguuucuu uguuguucau uccagugcca gcuccaagau acacagu 47

<210> 65

<211> 65

<212> RNA 15 <213> artificial

<220>

<223> human exon 9 -intron 9 IL-1RAcP pre-mRNA

<400> 65

ucuuuagaac auauquuqua gauuaacugg aagauuuaag uccgaagauu auuauucuau uccaaauaga aauauaauqc guaaaaquaa aaagaaacaa uuuuuagcau gcaauuaaua uaaaaauquu caaaauquaa accagccaca uuucgaguga cugauccaca cuccuuquac uagcuuauua gaagaagaau ccauauuccc aagugauuca uuugcuuaqu gaaaagaaua gauuuuaauu caguaggcuu auuuuucuaa uuaagcaacu uuuuaquucu uuucagauau aauuuuaaga uauuaaugag uuaauugcca quaccuauga aaccucacuc uuuuuccacu uaacauucaa aauuacaucu aaucgcacug gaaucuguca aaaauguaau gguauugaga

q

1020 1080 1140 1200 1260 1301

uuuua ccggg c ucauuuugg: a acaga ugaa acca uuuuag guaaguaaca gaa auuuga c 60

auaaa: 65

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

5: <213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 66

ccggagagga gacttcacag 20

10: <210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

15: <223> primer

<400> 67

tccacgattt cccagagaac 20

<210> 68

<211> 23

20: <212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 68

25: ggcattgttc tctaatgtct ccg 23

<210> 69

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

30: <220>

<223> primer

<400> 69

gctccaggta tatccgagct tc 22

<210> 70

35: <211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

40: <400> 70

actgggacga catggagaag 20

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

45: <213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 71

ggtcatcttt tcacggttgg 20

50

Claims

REIVINDICACIONES

1. Oligonudeótido que es capaz de alterar el empalme de un pre-ARNm que codifica un IL-1RAcP para aumentar la cantidad de un IL-1RAcP soluble donde dicho oligonudeótido es capaz de inducir el salto del exón que codifica el

5 dominio de transmembrana de IL-1RAcP y no interrumpe el marco de lectura abierto de IL-1RAcP, donde dicho oligonucleótido comprende o consiste en una secuencia que es complementaria de una extensión contigua de al menos 8 nucleótidos de SEO ID NO: 5, 64 o 65.
2. Oligonucleótido según la reivindicación 1, donde dicho oligonucleótido inhibe la inclusión de exón 9 de pre-ARNm 10 que codifica IL-1RAcP.
3. Oligonucleótido según la reivindicación 1 o 2, donde dicho oligonucleótido comprende una secuencia que es complementaria o se enlaza a un sitio de empalme o a una secuencia intrónica de un pre-ARNm de IL-1 RAcP.

15 4. Oligonucleótido según la reivindicación 4, donde la extensión contigua comprende 8 -50 nucleótidos, preferiblemente 14 -25 nucleótidos, de ARN de un exón del pre-ARNm de IL-1RAcP.
5.

Oligonucleótido según la reivindicación 3 o 4, donde dicho oligonucleótido es complementario o se enlaza a un exón del pre-ARNm de IL-1 RAcP representado por SEO ID NO:5.
6.

Oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho oligonucleótido comprende o consiste en las secuencias siguientes: SEO ID NO: 25-42.
7.

Oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el oligonucleótido tiene un

25 esqueleto, una modificación de azúcar y/o de base en comparación con un oligonucleótido basado en ARN, preferiblemente donde el oligonucle6tido comprende o consiste en uno o más 2'-O-metil fosforotioato, más preferiblemente donde el oligonucle6tido comprende una modificación oligorribonucleótida de 2'-O-metil fosforotioato y un monómero de ácido nuc!eico bloqueado.

30 8. Oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho oligonucleótido comprende al menos una inosina y/o una base capaz de formar un par de bases wobble.
9. Oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso como un medicamento, preferiblemente para prevenir o tratando un trastorno inflamatorio en un individuo, más preferiblemente artritis

35 reumatoide (RA), artritis reumatoide juvenil, psoriasis, artritis psoriática, espondilitis anquilosa, enfermedad inflamatoria intestinal incluyendo enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, hepatitis, sepsis, enfermedad hepática alcohólica, y esteatosis no alcohólica.
10. Composición que comprende al menos un oligonucleótido tal y como se define en cualquiera de las

40 reivindicaciones anteriores, donde la composición es preferiblemente una composición farmacéutica dicha composición farmacéutica que comprende un portador farmacéutica mente aceptable, adyuvante, diluyente yfo excipiente.
11. Composición según la reivindicación 10, donde al menos dos oligonucle6tidos están presentes; uno siendo como

45 se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y el segundo siendo capaz de alterar el empalme de un preARNm que codifica C5 para reducir la cantidad de C5a.
12. Uso del oligonucleótido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o de la composición tal y

como se define en la reivindicación 10 o 11 para la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar un trastorno 50 inflamatorio en un ind ividuo.
13. Método in vitro para aliviar uno o más síntoma(s) y/o característica(s) y/o para mejorar un parámetro de un trastorno inflamatorio en una célula, el método comprendiendo la administración a dicha célula de un oligonucleótido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o una composición tal y como se define en la

55 reivindicación 10 o 11.