CN109415731A - 呈递用于特异性敲低白介素17受体mRNA的反义寡核苷酸(ASO)的脂质体球形核酸(SNA)构建体 - Google Patents

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Abstract

本发明的方面涉及针对白介素17受体(IL‑17R)和其它靶标的反义寡核苷酸。还提供了反义寡核苷酸的球形核酸制剂或组合物和相关的治疗方法。

Description

呈递用于特异性敲低白介素17受体mRNA的反义寡核苷酸 (ASO)的脂质体球形核酸(SNA)构建体
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2016年5月6日提交的美国临时申请序列号62/333,082的权益，所述申请的完整内容通过引用并入本文。
发明背景
炎症(其可分类为急性或慢性)涉及免疫系统响应于有害刺激(诸如例如病原体、感染、刺激物或对细胞的损伤)的激活。急性炎症由粒细胞介导，而慢性炎症由单个核细胞诸(mononuclear cell)如单核细胞(monocyte)和淋巴细胞介导。
急性炎症的过程由细胞诸如巨噬细胞、树突细胞、组织细胞、库普弗细胞、肥大细胞、血管内皮细胞和血管平滑肌细胞起始。在有害刺激开始时，这些细胞经历活化并释放炎性调节和致敏分子，诸如例如促炎细胞因子、促炎前列腺素、白三烯、组胺、血清素、中性蛋白酶、缓激肽和一氧化氮。这些炎性分子调节复杂系列的生物事件，其涉及局部血管系统、免疫系统和受损组织部位的细胞和无细胞组分，以使炎性反应传播和成熟。
严重或长期的刺激导致慢性炎性反应，其导致组织损伤部位处存在的细胞类型的进行性转变。慢性炎症可以表征为由于炎症过程的组织的同时破坏和愈合，其净结果是激发损伤而不是调节修复。由于炎性反应可以发生在体内的任何地方，所以慢性炎症已经牵涉于广泛范围的看似无关的病症的病理生理学，所述病症是大且不同组的人类疾病的基础。例如，慢性炎症涉及多种疾病，如银屑病、心血管疾病、癌症、过敏、肥胖、糖尿病、消化系统疾病、退行性疾病、自身免疫性疾病和阿尔茨海默氏病。
发明概述
在一些方面，本公开包括经修饰的单链寡核苷酸或其药学上可接受的盐，所述经修饰的单链寡核苷酸由10-30个连接的核苷组成且具有：由2至8个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；由连接的核苷组成的5’翼区段；和由连接的核苷组成的3’翼区段；其中所述缺口区段位于5'翼区段和3'翼区段之间；其中每个翼区段的至少一些核苷包含修饰的核苷酸；其中所述缺口区段内的核苷间键和将缺口区段连接至3'翼区段的键都是硫代磷酸酯键(*)；且连接5'和3'翼区段两者的其余核苷的核苷间键是磷酸二酯键；且其中所述寡核苷酸的核碱基序列由与SEQ ID NO:302的等长部分互补的10-30个连续核碱基组成。
在一些实施方案中，所述经修饰的单链寡核苷酸由17-21个连接的核苷组成。在其它实施方案中，所述缺口区段由6个连接的脱氧核苷组成。在还有其它实施方案中，其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的核苷酸。在其它实施方案中，所述修饰的核苷酸是2'O-甲基核糖核苷(m)。在其它实施方案中，所述寡核苷酸具有12个2'O-甲基核糖核苷。在一些实施方案中，所述寡核苷酸的核碱基序列由与SEQ ID NO:302的等长部分互补的17-21个连续核碱基组成。
在一个实施方案中，所述寡核苷酸的核碱基序列是GCUUGGGCAGGTGGUGAA(SEQ IDNO:225)。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸的核碱基序列是CCCACAGGGGCATGUAGU(SEQID NO:288)。一个额外实施方案包括具有GUAGGGCGUGTGTGGGUC(SEQ ID NO:291)的核碱基序列的寡核苷酸。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸的核碱基序列是mGmCmUmUmGmGG*C*A*G*G*T*mGmGmUmGmAmA(SEQ ID NO:225)。在一个进一步实施方案中，所述寡核苷酸的核碱基序列是mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU(SEQ ID NO:288)。在又另一个实施方案中，所述寡核苷酸的核碱基序列是mGmUmAmGmGmGmCmGmUG*T*G*T*G*G*mGmUmC(SEQ IDNO:291)。
在一些实施方案中，所述化合物长度为20个核苷酸。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸进一步在一端包含分子种类。在另一个实施方案中，所述化合物进一步在两端都包含分子种类。
在一些实施方案中，所述分子种类选自：间隔物、脂质、固醇、胆固醇、N乙酰半乳糖胺(GalNAc)、修饰的GalNAc、衍生或取代的GalNAc、硬脂基、C16烷基链、胆汁酸、胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸盐、油烯基石胆酸(oleyl litocholic acid)、油酰基胆烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、类异戊二烯诸如类固醇、维生素诸如维生素E、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、脂肪酸酯诸如甘油三酯、芘、卟啉、德卟啉(Texaphyrine)、金刚烷、吖啶、生物素、香豆素、荧光素、罗丹明、德克萨斯红(Texas-Red)、洋地黄毒苷、二甲氧基三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花青染料(例如，Cy3或Cy5)、Hoechst 33258染料、补骨脂素和布洛芬。
在其它实施方案中，所述分子种类选自：亲脂性部分；叶酸基团；类固醇基团；碳水化合物基团；维生素A基团；维生素E基团；或维生素K基团。
在一些实施方案中，所述分子种类通过选自磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和酰胺键的键与所述化合物直接连接。
在另一个实施方案中，所述分子种类通过接头与所述化合物间接连接。在一些实施方案中，所述接头是选自以下的非核苷酸接头：无碱基残基(dSpacer)；低聚乙二醇(oligoethyleneglycol)，诸如三乙二醇(间隔物9)或六乙二醇(间隔物18)，和烷二醇，诸如丁二醇。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸的3’末端连接至2个连续的接头，所述接头为六乙二醇(间隔物18)，第一个六乙二醇连接至所述寡核苷酸的3’末端，第二个六乙二醇连接至第一个六乙二醇，且第二个六乙二醇连接至胆固醇。
本公开的另一个方面包括包含mGmCmUmUmGmGG*C*A*G*G*T*mGmGmUmGmAmA/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:225)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸长度为20个核苷酸，其中m是2’O甲基，且其中*是硫代磷酸酯修饰。
本公开的一个额外方面包括包含mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:288)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸长度为20个核苷酸，其中m是2’O甲基，且其中*是硫代磷酸酯修饰。
本公开的一个进一步方面包括包含mGmUmAmGmGmGmCmGmUG*T*G*T*G*G*mGmUmC/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:291)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸长度为20个核苷酸，其中m是2’O甲基，且其中*是硫代磷酸酯修饰。
本公开的另一个方面包括稳定的自组装纳米结构，其包含具有寡核苷酸壳的核，所述寡核苷酸壳由靶向位于核外部的白介素17受体(IL-17R，IL-17RA)的长度为18至21个连接的核苷的反义寡核苷酸构成。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸长度为18个核苷酸。在其它实施方案中，IL-17RA具有SEQ ID NO:302的序列。
在另一个实施方案中，少于所有的核苷间键是磷酸二酯。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸具有硫代磷酸酯核苷间键。在其它实施方案中，少于所有的核苷间键是硫代磷酸酯。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸具有至少一个立体富集的核苷间硫代磷酸酯键。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸具有所有立体富集的核苷间硫代磷酸酯键。立体富集的硫代磷酸酯键可以是Rp非对映异构体或Sp非对映异构体。
在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸具有2’O甲基修饰。在其它实施方案中，少于所有的核苷酸包括2’O甲基修饰。
在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸具有2’O烷基修饰。在其它实施方案中，少于所有的核苷酸包括2’O烷基修饰。
在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸具有17个核苷间键，且6个中心核苷间键是硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸具有与包含SEQ ID NO:302中所示序列的至少8个连续核碱基的序列互补的核碱基序列。在其它实施方案中，所述反义寡核苷酸选自mGmCmUmUmGmGG*C*A*G*G*T*mGmGmUmGmAmA/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:225)；mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:288)；和mGmUmAmGmGmGmCmGmUG*T*G*T*G*G*mGmUmC/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:291)，其中–是指磷酸二酯键，*是指硫代磷酸酯键，且m是指O甲基。
在一些实施方案中，所述纳米结构包括2-1,000个拷贝的反义寡核苷酸。在其它实施方案中，所述纳米结构包括至少两种不同的反义寡核苷酸。
在一些实施方案中，核是实心核或空心核。在其它实施方案中，核是实心核并且进一步包含围绕核的脂质双层。在另一个实施方案中，实心核包含由以下构成：贵金属，包括金和银，过渡金属，包括铁和钴，金属氧化物，包括二氧化硅，聚合物或其组合。在一些实施方案中，核是聚合物核，且其中聚合物核由以下构成：两亲性嵌段共聚物、疏水聚合物包括聚苯乙烯、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(乙醇酸)、聚(己内酯)和其它生物相容性聚合物。
在其它实施方案中，核是脂质体核。在一些实施方案中，脂质体核由一种或多种选自以下的脂质构成：1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)，1,2-二肉豆蔻酰基-sn-磷脂酰胆碱(DMPC)，1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-磷脂酰胆碱(POPC)，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DSPG)，1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)，1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)，1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和1,2-双十六烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)，鞘脂诸如鞘氨醇，磷酸鞘氨醇，甲基化鞘氨醇和二氢鞘氨醇，神经酰胺，神经酰胺磷酸酯，1-0酰基神经酰胺，二氢神经酰胺，2-羟基神经酰胺，鞘磷脂，糖基化鞘脂，硫苷脂，神经节苷脂，磷鞘脂和各种长度和饱和状态的植物鞘氨醇及其衍生物，磷脂诸如磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰胆碱，磷脂酸，溶血磷脂酸，环状LPA，磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰甘油，溶血磷脂酰甘油，磷脂酰丝氨酸，溶血磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，肌醇磷酸盐，LPI，心磷脂，溶血心磷脂，双(单酰基甘油)磷酸盐，(二酰基甘油)磷酸盐，醚脂质，二植烷基醚脂质和各种长度和饱和状态的缩醛磷脂，以及它们的衍生物，固醇诸如胆固醇，2，4-脱氢胆固醇，豆固醇，羊毛固醇，7-烯胆甾烷醇，薯蓣皂苷配基，谷固醇，酵母固醇，zymostenol，14-脱甲基-羊毛固醇，胆固醇硫酸盐，DHEA，DHEA硫酸盐，14-脱甲基-14-脱氢羊毛固醇，二氢谷固醇，菜油固醇，醚阴离子脂质，醚阳离子脂质，镧系螯合脂质，A-环取代氧化固醇，B-环取代氧化固醇，D-环取代氧化固醇，侧链取代氧化固醇，双取代氧化固醇，胆石酸衍生物，氟化固醇，荧光固醇，磺化固醇，磷酸化固醇和不同长度、饱和状态的多不饱和固醇，及其衍生物。
在一些方面，本公开包括多重反义寡核苷酸球形核酸(mASO-SNA)，其包含具有寡核苷酸壳的核，所述寡核苷酸壳由靶向第一基因的长度为10至30个连接的核苷的反义寡核苷酸和靶向第二基因的长度为10至30个连接的核苷的反义寡核苷酸构成，其中所述核是由脂质双层围绕的固体或是脂质体或脂质(lipoplex)复合物核，且所述寡核苷酸壳位于核的外部。
在一些实施方案中，第一基因和第二基因与疾病相关。在一个实施方案中，所述疾病是炎性病症。在另一个实施方案中，所述疾病是银屑病。
在一些实施方案中，第一基因和第二基因与靶途径相关。
在另一个实施方案中，mASO-SNA进一步包含靶向第三基因的长度为10至30个连接的核苷的反义寡核苷酸。在一些实施方案中，第一基因是白介素17受体(IL-17RA)。在其它实施方案中，第二基因是TNF。在一些实施方案中，第一基因和第二基因以近似等摩尔量存在于寡核苷酸壳中。
在另一个实施方案中，mASO-SNA包含靶向四种或更多种基因的长度为10至30个连接的核苷的反义寡核苷酸。
在一些方面，本公开提供了用于治疗病症的方法，其包括：以有效治疗病症的量向具有病症的受试者施用多重反义寡核苷酸球形核酸(mASO-SNA)，其包含具有寡核苷酸壳的核，所述寡核苷酸壳由靶向第一基因的长度为10至30个连接的核苷的反义寡核苷酸和靶向第二基因的长度为10至30个连接的核苷的反义寡核苷酸构成，其中所述核是由脂质双层围绕的固体或是脂质体或脂质(lipoplex)复合物核，且所述寡核苷酸壳位于核的外部。
在一些实施方案中，所述病症是炎性病症。
在其它实施方案中，所述mASO-SNA产生第一和第二基因的同时mRNA敲低。在另一个实施方案中，第一基因和第二基因与靶途径相关。在一些实施方案中，所述mASO-SNA产生靶途径的累加敲低。
在其它实施方案中，所述病症是银屑病。
本公开的另一个方面提供了用于治疗炎性病症的方法，其包括以有效治疗炎性病症的量向具有炎性病症的受试者施用包含本文所述的寡核苷酸或纳米结构的组合物。
在一些实施方案中，炎性病症选自：自身免疫性疾病、感染性疾病、移植排斥或移植物抗宿主病、恶性肿瘤、肺病症、肠道病症、心脏病症、败血症、脊椎关节病、代谢病症、贫血、疼痛、肝脏病症、皮肤病症、指甲病症、类风湿性关节炎、银屑病、伴随银屑病关节炎的银屑病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、血管炎、白塞氏病、强直性脊柱炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、再狭窄、糖尿病、贫血、疼痛、克罗恩氏病相关病症、青少年类风湿性关节炎(JRA)、丙型肝炎病毒感染、银屑病关节炎和慢性斑块性银屑病。
在其它实施方案中，炎性病症选自：类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎、痛风性关节炎、过敏、多发性硬化症、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和肾炎综合征。
本公开的一个额外方面包括用于降低体内IL-17受体的表达水平的方法，其包括以有效降低体内IL-17受体水平的量向受试者施用包含本文所述的寡核苷酸或纳米结构的组合物。
在一些实施方案中，第一基因、第二基因和第三基因与靶途径相关。在一些实施方案中，第一基因和第二基因与不同的靶途径相关。在一些实施方案中，第一基因、第二基因和第三基因与不同的靶途径相关。在一些实施方案中，第一基因是白介素-4受体(IL-4R)。在一些实施方案中，第二基因是白介素-1β(IL-1β)。在一些实施方案中，第三基因是结缔组织生长因子(CTGF)。
在一些实施方案中，第一基因、第二基因和第三基因以近似等摩尔量存在于寡核苷酸壳中。
根据另一个方面，本文提供了药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物包括稳定的自组装纳米结构，其中所述自组装纳米结构包含具有寡核苷酸壳的核，所述寡核苷酸壳由位于核的外部的靶向白介素17受体(IL-17R)的长度为18至21个连接的核苷的反义寡核苷酸构成。
在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸长度为18个核苷酸。在一些实施方案中，IL-17R具有SEQ ID NO:302的序列。
在一些实施方案中，少于所有的核苷间键是磷酸二酯。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸具有硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，少于所有的核苷间键是硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸具有2’O甲基修饰。在一些实施方案中，少于所有的核苷酸包括2’O甲基修饰。
在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸具有17个核苷间键，且其中6个中心核苷间键是硫代磷酸酯。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸具有与包含SEQ ID NO:302中所示序列的至少8个连续核碱基的序列互补的核碱基序列。
在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸选自mGmCmUmUmGmGG*C*A*G*G*T*mGmGmUmGmAmA/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:225)；mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:288)；和mGmUmAmGmGmGmCmGmUG*T*G*T*G*G*mGmUmC/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:291)，其中–是指磷酸二酯键，*是指硫代磷酸酯键，且m是指O甲基。
在一些实施方案中，所述药物组合物包括凝胶媒介物。在一些实施方案中，所述药物组合物包括1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、二乙二醇单乙醚(TranscutolP)、甘油、羟乙基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、EDTA二钠、偏亚硫酸氢钠和水中的一种或多种。在某些实施方案中，所述药物组合物包括至少0.00007％mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU/isp18//i sp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:288)、至少0.0003801％DOPC、至少25％二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、至少5％甘油、至少1％羟乙基纤维素、至少0.15％对羟基苯甲酸甲酯、至少0.05％对羟基苯甲酸丙酯、至少0.1％EDTA二钠、至少0.2％偏亚硫酸氢钠和至少68.5％水。
在一些实施方案中，所述药物组合物包括至少0.007％mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:288)、至少0.03801％DOPC、至少25％二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、至少5％甘油、至少1％羟乙基纤维素、至少0.15％对羟基苯甲酸甲酯、至少0.05％对羟基苯甲酸丙酯、至少0.1％EDTA二钠、至少0.2％偏亚硫酸氢钠和至少68.45％水。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含至少0.01419％mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:288)、至少0.2655％DOPC、至少25％二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、至少5％甘油、至少1％羟乙基纤维素、至少0.15％对羟基苯甲酸甲酯、至少0.05％对羟基苯甲酸丙酯、至少0.1％EDTA二钠、至少0.2％偏亚硫酸氢钠和至少68.2％水。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含至少0.1419％mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:288)、至少2.655％DOPC、至少25％二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、至少5％甘油、至少1％羟乙基纤维素、至少0.15％对羟基苯甲酸甲酯、至少0.05％对羟基苯甲酸丙酯、至少0.1％EDTA二钠、至少0.2％偏亚硫酸氢钠和至少65.7％水。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含至少1.419％mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:288)、至少26.55％DOPC、至少25％二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、至少5％甘油、至少1％羟乙基纤维素、至少0.15％对羟基苯甲酸甲酯、至少0.05％对羟基苯甲酸丙酯、至少0.1％EDTA二钠、至少0.2％偏亚硫酸氢钠和至少40.5％水。
在一些实施方案中，所述药物组合物包括本文所述的寡核苷酸。
在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包括凝胶媒介物。在一些实施方案中，所述药物组合物包括1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、甘油、羟乙基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、EDTA二钠、偏亚硫酸氢钠和水中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述药物组合物包括本文所述的mASO-SNA。
在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包括凝胶媒介物。在一些实施方案中，所述药物组合物包含1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、甘油、羟乙基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、EDTA二钠、偏亚硫酸氢钠和水中的一种或多种。
根据另一个方面，本文还公开了用于使用药物组合物治疗病症的方法。在一些实施方案中，用于治疗病症的方法，其包括以有效治疗病症的量向具有病症的受试者施用包括多重反义寡核苷酸球形核酸(mASO-SNA)的药物组合物，所述多重反义寡核苷酸球形核酸(mASO-SNA)包括具有寡核苷酸壳的核，所述寡核苷酸壳由靶向第一基因的长度为10至30个连接的核苷的反义寡核苷酸和靶向第二基因的长度为10至30个连接的核苷的反义寡核苷酸构成，其中所述核是由脂质双层围绕的固体或是脂质体或脂质(lipoplex)复合物核，且所述寡核苷酸壳位于核的外部。
在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含凝胶媒介物。在一些实施方案中，所述药物组合物包含1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、甘油、羟乙基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、EDTA二钠、偏亚硫酸氢钠和水中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述病症是炎性病症。
在一些实施方案中，所述mASO-SNA产生第一和第二基因的同时mRNA敲低。在一些实施方案中，第一基因和第二基因与靶途径相关。在一些实施方案中，所述mASO-SNA产生靶途径的累加敲低。
在一些实施方案中，所述病症是银屑病。
根据另一个方面，本文还公开了用于使用药物组合物治疗炎性病症的方法。在一些实施方案中，用于治疗炎性病症的方法包括以有效治疗炎性病症的量向具有炎性病症的受试者施用包括本文所述的寡核苷酸、纳米结构或mASO-SNA的药物组合物。
在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包括凝胶媒介物。在一些实施方案中，所述药物组合物包括1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、甘油、羟乙基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、EDTA二钠、偏亚硫酸氢钠和水中的一种或多种。
在一些实施方案中，炎性病症选自：自身免疫性疾病、感染性疾病、移植排斥或移植物抗宿主病、恶性肿瘤、肺病症、肠道病症、心脏病症、败血症、脊椎关节病、代谢病症、贫血、疼痛、肝脏病症、皮肤病症、指甲病症、类风湿性关节炎、银屑病、伴随银屑病关节炎的银屑病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、血管炎、白塞氏病、强直性脊柱炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、再狭窄、糖尿病、贫血、疼痛、克罗恩氏病相关病症、青少年类风湿性关节炎(JRA)、丙型肝炎病毒感染、银屑病关节炎和慢性斑块性银屑病。
在一些实施方案中，炎性病症选自：类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎、痛风性关节炎、过敏、多发性硬化症、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和肾炎综合征。
根据另一个方面，本文提供了用于降低体内IL-17受体的表达的方法。在一些实施方案中，用于降低体内IL-17受体的表达水平的方法包括以有效降低体内IL-17受体水平的量向受试者施用包括本文所述的寡核苷酸、纳米结构或mASO-SNA的药物组合物。
在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者是人。
在一些实施方案中，使所述药物组合物与受试者中的细胞接触至少24小时。
在一些实施方案中，所述药物组合物是局部药物组合物。
根据另一个方面，本文提供了用于降低体外IL-17受体(IL-17R)的表达水平的方法。
在一些实施方案中，用于降低体外IL-17R的表达水平的方法包括使细胞与有效降低体外IL-17R水平的量的本文所述的寡核苷酸、纳米结构或mASO-SNA接触。
在一些实施方案中，所述细胞是人包皮角质形成细胞(HFK)。
在一些实施方案中，使所述细胞与浓度为1nM、10nM、100nM或1000nM的寡核苷酸、纳米结构或mASO-SNA接触。
在一些实施方案中，使所述细胞与所述寡核苷酸、纳米结构或mASO-SNA接触24小时。
本发明的每个限定可涵盖本发明的多个实施方案。因此，预期本发明涉及任何一种要素或要素组合的每个限定都可以包括在本发明的每个方面中。本发明在其应用方面不限于以下描述中所述或附图中所示结构细节和组件布置。本发明能够具有其它实施方案并且能够以多种方式实践或实施。
附图简述
附图不旨在按比例绘制。在附图中，各个附图中所示的每个相同或几乎相同的组件由类似的数字表示。为了清楚的目的，可以不在每个附图中标出每个组件。在附图中：
图1描绘使用靶向的SNA的体外IL-17RA mRNA敲低。在用呈递靶向IL-17RA的ASO序列的SNA处理的HFK细胞中，IL-17RA mRNA表达降低。用对照SNA处理的细胞未表明IL-17RAmRNA表达的明显降低。
图2显示在人皮肤等效物EpiDerm-FTTM中使用局部应用的靶向的SNA的IL-17RAmRNA敲低。在用呈递ASO IL17RA_219或ASO IL17RA_282的SNA局部处理48小时的人皮肤等效组织中，IL-17RA mRNA表达降低。用呈递对照ASO的SNA处理的组织未表明IL-17RA mRNA表达的明显降低，如通过qRT-PCR所测量。显示的数据代表进行的两次独立实验。
图3显示在人皮肤外植体中使用局部应用的靶向的SNA的离体IL-17RA mRNA敲低。在用呈递ASO IL17RA_219或ASO IL17RA_282的SNA局部处理96小时的人皮肤外植体活检样品中，IL-17RA mRNA表达降低。用呈递对照ASO的SNA处理的活检样品未表明IL-17RA mRNA表达的明显降低，如通过qRT-PCR所测量。
图4显示使用SNA的混合物的TNF mRNA敲低。在用抗-TNF-SNA和抗-IL17RA-SNA的混合物处理的HFK细胞中，TNF mRNA表达降低。用对照-SNA处理的细胞未表明TNF mRNA水平的明显降低。显示的数据代表进行的两次独立实验。
图5显示使用SNA的混合物的IL17RA mRNA敲低。在用抗-TNF-SNA和抗-IL17RA-SNA的混合物处理的HFK细胞中，IL17RA mRNA表达降低。用对照-SNA处理的细胞未表明TNFmRNA水平的明显降低。显示的数据代表进行的两次独立实验。
图6A-6D显示多重SNA的构型。脂质体以下列构型进行表面官能化：(图6A)33％TNF-ASO(A)和66％对照(D)；(图6B)33％IL17RA-ASO(B)和66％对照(D)；(图6C)33％TNF-ASO(A)，33％IL17RA-ASO(B)，和33％对照(D)；(图6D)100％对照(D)。
图7显示使用多重SNA的TNF mRNA敲低的比较。在用抗-TNF-SNA和含有抗-TNF和抗-IL17RA ASO的多重SNA处理的HFK细胞中，TNF mRNA表达降低。用抗-IL17RA-SNA处理的细胞未表明TNF mRNA水平的明显降低。显示的数据代表进行的两次独立实验。
图8显示使用多重SNA的IL17RA mRNA敲低的比较表明累加敲低效应。在用抗-IL17RA-SNA和含有抗-TNF和抗-IL17RA ASO的多重SNA处理的HFK细胞中，IL17RA mRNA表达降低。用抗-TNF-SNA处理的细胞表明可能由于TNF和IL17RA的相关生物信号传导途径而导致的略微降低。当用抗-IL17RA-SNA处理细胞时，观察到更大的IL17RA mRNA敲低。靶向TNF和IL17RA的多重SNA具有累加效应，并且显示与当单独使用仅靶向抗-TNF或抗-IL17RA的SNA时相比IL17RA mRNA的更大敲低。显示的数据代表进行的至少两次独立实验。
图9描绘IL-17RA mRNA表达的抑制。该图显示在24小时处理后健康人皮肤外植体中的IL-17RA mRNA表达，如通过qRT-PCR所测量(未处理的百分比±SEM)。每个药物产品处理组，n＝9个样品。未处理组，n＝8个样品。单向ANOVA，31DF，p＝0.0011(相比于未处理，0.007％)和****p<0.0001，相比于0％凝胶。
图10描绘IL-17RA蛋白质表达的抑制。该图显示在用表3中描述的制剂中的IL17RA_282处理24小时后健康人皮肤外植体中的IL-17RA蛋白质表达，如通过western印迹所测量(未处理的百分比)。每组的合并样品。
图11显示IL-17RA mRNA表达的抑制。与媒介物相比，*p<0.05；**p<0.01；****p<0.0001。使用单样本t-检验。
图12A-12D显示多重SNA的构型。脂质体以下列构型进行表面官能化：单重SNA(图12A)；含有两种靶向的反义寡核苷酸的多重SNA(图12B)；含有三种靶向的反义寡核苷酸的多重SNA(图12C)；非靶向的对照SNA(图12D)。
图13显示用各种多重SNA构型处理的细胞中IL4R mRNA的抑制。脂质体是表面官能化的各种靶向的反义寡核苷酸或对照寡核苷酸。当用靶向IL4R的SNA处理细胞时，IL4RmRNA的表达显著降低。用对照SNA和非靶向寡核苷酸官能化的SNA不会在相同程度上降低IL4R mRNA表达。
图14显示用各种多重SNA构型处理的细胞中IL1b mRNA的抑制。脂质体是表面官能化的各种靶向的反义寡核苷酸或对照寡核苷酸。当用靶向IL1b的SNA处理细胞时，IL1bmRNA的表达显著降低。用对照SNA和非靶向寡核苷酸官能化的SNA不会在相同程度上降低IL1b mRNA表达。
图15显示用各种多重SNA构型处理的细胞中CTGF mRNA的抑制。将脂质体用各种靶向的反义寡核苷酸或对照寡核苷酸表面官能化。当用靶向CTGF的SNA处理细胞时，CTGFmRNA的表达显著降低。用对照SNA和非靶向寡核苷酸官能化的SNA不会在相同程度上降低CTGF mRNA表达。
详述
在一些方面，本发明涉及参与全身性炎症的细胞信号传导蛋白质受体(白介素17受体(IL-17RA))的反义抑制剂。IL-17及其靶受体IL-17RA在银屑病中起重要作用。IL-17通过结合IL-17RA引发其作用，IL-17RA几乎仅在表皮内的角质形成细胞中表达。反义技术是用于通过靶向信使RNA(mRNA)并阻止mRNA的翻译来降低特定基因产物的表达的有用手段。然而，特定治疗功能性反义寡核苷酸(ASO)的选择可能是有挑战性的。此外，当配制为纳米颗粒或其它类型的三维呈递形式时，线性形式的具有治疗活性的ASO不一定保留活性。
在本发明的方面已经发现，用具有适当结构特性的反义寡核苷酸(ASO)表面官能化的球形核酸(SNA)可以介导目的靶mRNA的高效基因敲低。例如，本文表明，通过在原代人包皮角质形成细胞(HFK)中使用靶向人IL-17RA的SNA(抗IL17RA-SNA)(参见例如GeneBank登录号NM_014339.6)mRNA，可以抑制IL-17RA表达，而没有相关的毒性或免疫刺激作用。此外，显示抗IL-17RA SNA抑制人皮肤等效模型和人皮肤外植体中的mRNA表达。在一些实施方案中，抗IL-17RA SNA的响应以剂量依赖性方式抑制IL-17RA mRNA表达。如本文所述，以SNA几何形状排列的寡核苷酸表现出增强的渗透和增加的细胞摄取。
还已经发现，具有针对不同治疗靶标的不同ASO的多重SNA可以产生显著的靶标敲低和治疗效果。能够以使得其不干扰其它ASO的活性的方式在SNA表面上装载特定量的不同ASO是出乎意料的。如实施例中所示，当抗-IL-17RA-SNA与抗-TNF-SNA混合并共同施用于细胞时，实现了每种靶向基因的同时mRNA敲低。另外，当将在相同颗粒上呈递两个或更多个ASO序列(每种靶向不同mRNA)的SNA施用于细胞时，实现了在同一细胞中使用单一颗粒靶向的每种基因的同时mRNA敲低。这些SNA被称为多重ASO-SNA(mASO-SNA)。此外，当mASO-SNA与靶向两种参与相关生物途径的基因的mRNA的ASO多重化时，观察到累加的敲低效应。两种ASO的共同呈递不仅不干扰其它共同呈递的ASO的活性，而且当靶向共同途径时，用mASO-SNA观察到的治疗效果大于仅用任一ASO-SNA观察到的治疗效果。
在一些方面，本发明涉及用于减少IL-17RA的组合物和用于使用那些组合物来治疗炎性病症的方法。根据本发明的方面，已鉴定了高度有效的IL-17RA抑制剂。IL-17RA抑制剂是基于核酸的反义组合物。术语“IL-17RA”是指细胞因子IL-17的受体。
如本文所用的“IL-17RA抑制剂”是指干扰IL-17RA活性的基于核酸的试剂。具体而言，本发明的IL-17RA反义抑制剂或IL-17RA反义寡核苷酸降低IL-17RA基因的表达。通过降低IL-17RA基因的表达，内源性IL-17不能通过其与受体的相互作用来促进细胞信号传导。当IL-17RA可用于结合IL-17时，IL17RA被活化，导致炎性趋化因子和细胞因子诸如CXCL1、CXCL8/IL8和IL6的表达的诱导。可以使用本发明的ASO-SNA阻断这些信号传导级联。
本发明的IL17RA抑制剂是反义核酸。反义核酸通常包括修饰或未修饰的RNA、DNA或混合聚合物核酸，并且主要通过特异性结合匹配序列发挥功能，导致肽合成的调节。反义核酸通过Watson Crick碱基配对结合靶RNA，并通过空间阻断或通过活化RNA酶H酶阻止结合序列的核糖体翻译来阻断基因表达。反义分子还可以通过干扰RNA加工或从细胞核至细胞质的转运来改变蛋白质合成。
在一些实施方案中，本发明涉及用于减少白介素-4受体(IL-4R)(参见例如GenBank:NM_000418(SEQ ID NO:306))的组合物和用于使用那些组合物治疗炎性疾病的方法。根据本发明的方面，已鉴定了高度有效的IL-4R抑制剂。IL-4R抑制剂是基于核酸的反义组合物。术语“IL-4R”是指细胞因子IL-4或IL-13的受体。
如本文所用的“IL-4R抑制剂”是指干扰IL-4R活性的基于核酸的试剂。具体而言，本发明的IL-4R反义抑制剂或IL-4R反义寡核苷酸降低IL-4R基因的表达。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸长度为18个核苷酸。在其它实施方案中，IL-17RA具有SEQ ID NO:302的序列。通过降低IL-4R基因的表达，内源性IL-4或IL-13不能通过其与受体的相互作用来促进细胞信号传导。当IL-4R可用于结合IL-4或IL-13时，IL-4R被活化，导致与JAK1/2/3-STAT6途径偶联。IL4应答参与促进Th2分化。IL-4/IL-13应答参与调节过敏性炎症的部位处的IgE产生和趋化因子和粘液产生。在某些细胞类型中，可以通过活化胰岛素受体底物IRS1/IRS2而信号传导。可溶性IL4R(sIL4R)抑制通过T-细胞的IL4介导的细胞增殖和IL5上调(Keegan等人,Cell(1994)76:811-820)。可以使用本发明的ASO-SNA阻断这些信号传导级联。
本发明的IL-4R抑制剂是反义核酸。反义核酸通常包括修饰或未修饰的RNA、DNA或混合聚合物核酸，并且主要通过特异性结合匹配序列发挥功能，导致肽合成的调节。反义核酸通过Watson Crick碱基配对结合靶RNA，并通过空间阻断或通过活化RNA酶H酶阻止结合序列的核糖体翻译来阻断基因表达。反义分子还可以通过干扰RNA加工或从细胞核至细胞质的转运来改变蛋白质合成。
在一些实施方案中，本发明涉及用于减少白介素-1β(IL-1β)(参见例如GenBank:NM_000576(SEQ ID NO:307))的组合物和用于使用那些组合物治疗炎性疾病的方法。根据本发明的方面，已鉴定了高度有效的IL-1β抑制剂。IL-1β抑制剂是基于核酸的反义组合物。术语“IL-1β”是指最初被发现为主要内源性热原的促炎细胞因子，其诱导前列腺素合成，中性粒细胞流入和活化，T-细胞活化和细胞因子产生，B-细胞活化和抗体产生以及成纤维细胞增殖和胶原蛋白产生。促进T-细胞的Th17分化。
如本文所用的“IL-1β抑制剂”是指干扰IL-1β活性的基于核酸的试剂。具体而言，本发明的IL-1β反义抑制剂或IL-1β反义寡核苷酸降低IL-1β基因的表达。通过降低IL-1β基因的表达，减少或不进行信号传导(Van Damme等人,Nature(1985)314:266-268；Piccioli等人,Semin Immunol(2013)25(6):425-9)。可以使用本发明的ASO-SNA阻断涉及IL-1β的信号传导级联。
本发明的IL-1β抑制剂是反义核酸。反义核酸通常包括修饰或未修饰的RNA、DNA或混合聚合物核酸，并且主要通过特异性结合匹配序列发挥功能，导致肽合成的调节。反义核酸通过Watson Crick碱基配对结合靶RNA，并通过空间阻断或通过活化RNA酶H酶阻止结合序列的核糖体翻译来阻断基因表达。反义分子还可以通过干扰RNA加工或从细胞核至细胞质的转运来改变蛋白质合成。
在一些实施方案中，本发明涉及用于减少结缔组织生长因子(CTGF)(参见例如GenBank:NM_001901(SEQ ID NO:308))的组合物和用于使用那些组合物治疗病症(例如，动脉粥样硬化、肺和肾纤维化病症和癌症)的方法。根据本发明的方面，已鉴定了高度有效的CTGF抑制剂。CTGF抑制剂是基于核酸的反义组合物。术语“CTGF”是指由细胞(例如，血管内皮细胞)分泌的结缔组织有丝分裂引诱剂，其尤其促进软骨细胞的增殖和分化；在许多细胞类型(包括成纤维细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞)中介导肝素和二价阳离子依赖性细胞粘附；和增强成纤维细胞生长因子诱导的DNA合成。
如本文所用的“CTGF抑制剂”是指干扰CTGF活性的基于核酸的试剂。具体而言，本发明的CTGF反义抑制剂或CTGF反义寡核苷酸降低CTGF基因的表达。通过减少CTGF基因的表达，不促进细胞信号传导。例如，CTGF与生长因子、表面受体和基质组分相互作用，由于其广泛表达，其在胚胎发育和维持正常细胞和结缔组织功能中具有重要作用。CTGF对于损伤后的组织修复也是重要的，并且已经牵涉于常见疾病，包括动脉粥样硬化、肺和肾纤维化病症和癌症(de Winter等人,Growth Factors(2008)26(2):80-91)。可以使用本发明的ASO-SNA阻断CTGF参与的信号传导级联。
本发明的CTGF抑制剂是反义核酸。反义核酸通常包括修饰或未修饰的RNA、DNA或混合聚合物核酸，并且主要通过特异性结合匹配序列发挥功能，导致肽合成的调节。反义核酸通过Watson Crick碱基配对结合靶RNA，并通过空间阻断或通过活化RNA酶H酶阻止结合序列的核糖体翻译来阻断基因表达。反义分子还可以通过干扰RNA加工或从细胞核至细胞质的转运来改变蛋白质合成。
如本文所用，术语“反义核酸”或“反义寡核苷酸”描述了这样的核酸：其在生理条件下与包含特定基因(在此情况下为IL17RA)的DNA或与该基因的mRNA转录物杂交，并且由此抑制该基因的转录和/或该mRNA的翻译。反义分子被设计成在与靶基因或转录物杂交之后干扰靶基因的转录或翻译。本领域技术人员将认识到，反义寡核苷酸的确切长度及其与其靶标的互补程度将取决于所选择的具体靶标，包括靶标的序列和构成该序列的具体碱基。
“抑制基因表达”是指来自靶基因(诸如IL17RA基因)的蛋白质和/或mRNA产物的水平的不存在或可观察到的降低。“特异性”是指抑制靶基因而对细胞的其它基因没有明显作用的能力。抑制的结果可通过检测细胞或生物体的外部特性或者通过生物化学技术来证实，所述生物化学技术诸如RNA溶液杂交、核酸酶保护、Northern杂交、逆转录、用微阵列进行基因表达监测、抗体结合、酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、放射免疫测定(RIA)、其它免疫测定和荧光活化细胞分析(FACS)。
本发明的反义寡核苷酸抑制IL17RA表达。根据测定，与未根据本发明处理的细胞相比，基因表达量的定量允许确定大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的抑制程度。作为实例，抑制效率可以通过评价细胞中基因产物的量来确定。
本文描述的ASO包括其生物等效化合物、盐和前药。如本文所用的术语生物等效化合物，包括药学上可接受的盐和前药，是指具有与目标反义寡核苷酸相同的一级结构的反义寡核苷酸，但包括可以被切割或修饰以具有与目标反义寡核苷酸相同类型的生物效果的盐形式或结构。这旨在涵盖任何药学上可接受的盐、酯、或此类酯的盐、或在施用于动物(包括人)后能够(直接或间接地)提供其生物活性代谢物或残余物的任何其它化合物。
“药学上可接受的盐”是本发明的核酸的生理上和药学上可接受的盐：即，保留目标化合物的期望生物活性并且不向其赋予其不期望的毒理学效应的盐。药学上可接受的盐包括但不限于：(a)与阳离子诸如钠、钾、铵、镁、钙、多胺诸如精胺和亚精胺等形成的盐；(b)与无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成盐；(c)与有机酸诸如例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等形成的盐；以及(d)由元素阴离子诸如氯离子、溴离子和碘离子形成的盐。
还可以制备本发明的化合物以便以“前药”形式递送。“前药”是以无活性形式制备的治疗剂，其在体内或细胞内通过内源性酶或其它化学品和/或条件的作用转化为活性形式(即，药物)。
本发明的反义寡核苷酸是IL17RA反义寡核苷酸。反义IL17RA寡核苷酸是指具有核苷酸碱基序列和亚基至亚基主链的化合物，其允许反义寡核苷酸通常通过Watson-Crick碱基配对与IL17RA靶mRNA序列杂交以在靶序列中形成RNA:寡聚物异源双链体。
反义寡核苷酸与其靶核酸IL17RA mRNA的特异性杂交干扰核酸IL17RA mRNA的正常功能。与靶核酸特异性杂交的化合物对靶核酸功能的这种调节通常被称为“反义的”。待干扰的DNA功能包括复制和转录。待干扰的RNA功能包括所有重要功能，诸如例如RNA向蛋白质翻译位点的转位、由RNA翻译蛋白质、RNA剪接以产生一个或多个mRNA种类、以及可以涉及RNA或由RNA促进的催化活性。这种干扰靶核酸功能的总体效果是调节IL17RA蛋白质的表达。在本发明的上下文中，“调节”意指降低或抑制基因的表达。
如果寡核苷酸在生理条件下与IL17RA靶标杂交，则该反义寡核苷酸与靶多核苷酸“特异性杂交”，其中热解链温度(Tm)基本上大于37℃、优选至少45℃并且通常为50℃至80℃或更高。这种杂交优选地对应于选择为与特定序列在确定的离子强度和pH下的Tm相比低约10℃并且优选低约50℃的严格杂交条件。在给定的离子强度和pH下，Tm是靶序列的50％与互补多核苷酸杂交时的温度。
当两个单链多核苷酸之间以反向平行构型发生杂交时，多核苷酸被描述为与彼此“互补”。如果在第一多核苷酸和第二多核苷酸的一条链之间发生杂交，则双链多核苷酸可与另一多核苷酸”互补”。根据普遍接受的碱基配对规则，互补性(一个多核苷酸与另一多核苷酸互补的程度)可根据预期与彼此形成氢键的相对链中碱基的比例来定量。即使两条碱基序列不是100％互补的，反义化合物也可以与靶转录物的靶区域互补，只要化合物与转录物之间形成的异源双链体结构具有期望的Tm稳定性即可。
鉴定靶向特定核酸的反义寡核苷酸可以是多步骤过程。该过程通常开始于鉴定其功能待被调节的核酸序列。这可以是例如其表达与特定炎性病症或疾病状态相关的细胞基因(或由该基因转录的mRNA)。靶向过程还包括确定该IL17RA基因内用于发生反义相互作用使得将导致期望效果(例如，检测或调节蛋白质的表达)的位点。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸被设计为靶向人白介素17受体(IL-17RA)，例如，SEQ ID NO:302的核苷酸序列，对应于下文所示的白介素17受体A(IL-17RA)。人IL-17RAcDNA序列已经公开于Genbank登录号NM_014339中。
在一些实施方案中，IL-17RA ASO与编码以下蛋白质序列的核酸互补：
MGAARSPPSAVPGPLLGLLLLLLGVLAPGGASLRLLDHRALVCSQPGLNCTVKNSTCLDDSWIHPRNLTPSSPKDLQIQLHFAHTQQGDLFPVAHIEWTLQTDASILYLEGAELSVLQLNTNERLCVRFEFLSKLRHHHRRWRFTFSHFVVDPDQEYEVTVHHLPKPIPDGDPNHQSKNFLVPDCEHARMKVTTPCMSSGSLWDPNITVETLEAHQLRVSFTLWNESTHYQILLTSFPHMENHSCFEHMHHIPAPRPEEFHQRSNVTLTLRNLKGCCRHQVQIQPFFSSCLNDCLRHSATVSCPEMPDTPEPIPDYMPLWVYWFITGISILLVGSVILLIVCMTWRLAGPGSEKYSDDTKYTDGLPAADLIPPPLKPRKVWIIYSADHPLYVDVVLKFAQFLLTACGTEVALDLLEEQAISEAGVMTWVGRQKQEMVESNSKIIVLCSRGTRAKWQALLGRGAPVRLRCDHGKPVGDLFTAAMNMILPDFKRPACFGTYVVCYFSEVSCDGDVPDLFGAAPRYPLMDRFEEVYFRIQDLEMFQPGRMHRVGELSGDNYLRSPGGRQLRAALDRFRDWQVRCPDWFECENLYSADDQDAPSLDEEVFEEPLLPPGTGIVKRAPLVREPGSQACLAIDPLVGEEGGAAVAKLEPHLQPRGQPAPQPLHTLVLAAEEGALVAAVEPGPLADGAAVRLALAGEGEACPLLGSPGAGRNSVLFLPVDPEDSPLGSSTPMASPDLLPEDVREHLEGLMLSLFEQSLSCQAQGGCSRPAMVLTDPHTPYEEEQRQSVQSDQGYISRSSPQPPEGLTEMEEEEEEEQDPGKPALPLSPEDLESLRSLQRQLLFRQLQKNSGWDTMGSESEGPSA(SEQ ID NO:305)。
在一些实施方案中，本文使用的ASO包括以下IL-17RA ASO中的任何一种或多种：
mGmCmUmUmGmGG*C*A*G*G*T*mGmGmUmGmAmA/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ IDNO:225)；
mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ IDNO:288)；
mGmUmAmGmGmGmCmGmUG*T*G*T*G*G*mGmUmC/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ IDNO:291)；mGmCmUmUmGmGG*C*A*G*G*T*mGmGmUmGmAmA(SEQ ID NO:225)；
mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU(SEQ ID NO:288)；
mGmUmAmGmGmGmCmGmUG*T*G*T*G*G*mGmUmC(SEQ ID NO:291)；
GCUUGGGCAGGTGGUGAA(SEQ ID NO:225)；CCCACAGGGGCATGUAGU(SEQ ID NO:288)；或GUAGGGCGUGTGTGGGUC(SEQ ID NO:291)或其盐。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸被设计为靶向如下所示的对应于IL-4R的核苷酸序列。人IL-4R cDNA序列已经公开于Genbank登录号NM_000418中。
在一些实施方案中，IL-4R ASO与编码以下蛋白质序列的核酸互补：
在一些实施方案中，反义寡核苷酸被设计为靶向如下所示的对应于IL-1β的核苷酸序列。人IL-1βcDNA序列已经公开于Genbank登录号NM_000576中。
在一些实施方案中，IL-1βASO与编码以下蛋白质序列的核酸互补：
在一些实施方案中，反义寡核苷酸被设计为靶向如下所示的对应于CTGF的核苷酸序列。人CTGF cDNA序列已经公开于Genbank登录号NM_001901中。
在一些实施方案中，CTGF ASO与编码以下蛋白质序列的核酸互补：
在一些方面，本发明涉及用于降低多种基因靶标的表达的多重ASO-SNA。在一些实施方案中，mASO-SNA包括靶向IL-17RA和TNFα的ASO。这些特定mASOs-SNA尤其可用于治疗炎性疾病。如本文所用的“TNFα反义寡核苷酸”或“TNF-αASO”是指干扰TNFα活性的基于核酸的试剂。具体而言，本发明的TNFα反义抑制剂或TNFα反义寡核苷酸降低TNFα基因的表达。
TNF-α(肿瘤坏死因子-α)是由活化的巨噬细胞/单核细胞和淋巴细胞产生的多效细胞因子，其通常促进导致各种疾病的炎性应答。TNF-α从巨噬细胞、单核细胞和天然杀伤细胞释放并在炎性和免疫应答中发挥重要作用，包括在细菌及其它微生物感染期间以及在用炎性物质刺激之后向受损组织募集白细胞。当以过量存在时，已知TNF-α引起组织损伤，并且已牵涉于与炎性疾病和自身免疫性疾病相关的病理状况。
TNF-α通过序列和分子量不同的两种不同膜蛋白质受体TNF-RI和TNF-RII来介导生物作用。TNF-RI被报道在大多数(如果不是全部的话)人细胞类型中以低水平存在，并且人中TNF-RI基因的表达可以通过感染、干扰素和第二信使调节剂(诸如佛波酯)而上调。两种TNF受体的胞外部分也以可溶性形式存在，其由受体的膜结合形式通过在细胞表面处的蛋白水解切割衍生而来。可溶性TNF受体保留在溶液中结合TNF-α的能力。已经在来自健康个体的尿液和血清中鉴定到可溶性TNF受体，并且已经显示其在一些慢性疾病中和在用诱导TNF-α的试剂接种之后升高。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸被设计为靶向人TNFα，例如，下文所示的SEQ IDNO:304的核苷酸序列。人TNF-αcDNA序列已经由Nedwin,G.E.等人(Nucleic AcidsRes.1985,13,6361-6373)公布；并且公开于Genbank登录号X02910和NM_000594中。
本文所述的纳米结构可以是稳定的自组装纳米结构。例如，所述纳米结构可以是具有本文所述的序列的长度为18-21个核苷酸的反义寡核苷酸，其中3’或5’末端的疏水性基团在水或其它合适的溶剂中自缔合以形成纳米结构的核。如本文所用的疏水性基团可以包括胆固醇、胆固醇基或修饰的胆固醇基残基、金刚烷、二氢睾酮、长链烷基、长链烯基、长链炔基、油烯基石胆酸、胆烯酸、油酰基-胆烯酸、棕榈基、十七烷基、肉豆蔻基(myrisityl)、胆汁酸、胆酸或牛磺胆酸、脱氧胆酸盐、油烯基石胆酸、油酰基胆烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、类异戊二烯诸如类固醇、维生素诸如维生素E、饱和或不饱和脂肪酸、脂肪酸酯诸如甘油三酯、芘、卟啉、德卟啉、金刚烷、吖啶、生物素、香豆素、荧光素、罗丹明、德克萨斯红、洋地黄毒苷、二甲氧基三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花青染料(例如，Cy3或Cy5)、Hoechst 33258染料、补骨脂素或布洛芬。
反义寡核苷酸通常具有10-30或15-20个碱基的长度，其通常足够长以在哺乳动物基因组中具有一个互补序列。另外，具有至少12个核苷酸的长度、通常长度为至少15个核苷酸的反义化合物与其靶mRNA充分杂交。因此，本发明的反义寡核苷酸通常在8-100个核苷酸的大小范围内，更优选地长度为12-50个核苷酸。在本发明的一些实施方案中，反义寡核苷酸长度为18-19个核苷酸。反义寡核苷酸可以在该寡核苷酸的5’和/或3’末端包括另外的核苷酸。然而，长度限于18个核苷酸的反义寡核苷酸例如在分子的5’或3’末端不具有任何额外的核苷酸。其它非核苷酸分子可以被共价或非共价连接至那些寡核苷酸的5’和/3’末端。
术语“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，意指多个核苷酸(即，包含与磷酸基团并与可互换有机碱基连接的糖(例如，核糖或脱氧核糖)的分子，所述有机碱基是取代的嘧啶(例如，胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))或取代的嘌呤(例如，腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)))。如本文所用，术语“核酸”和“寡核苷酸”是指寡核糖核苷酸以及寡脱氧核糖核苷酸。术语“核酸”和“寡核苷酸”还应当包括多核苷(即，去掉磷酸酯的多核苷酸)和任何其它含有机碱基的聚合物。核酸分子优选地是合成的(例如，通过核酸合成产生)。寡核苷酸可以是可用于产生反义效应的任何大小。在一些实施方案中，其长度为18至23个核苷酸。在其它实施方案中，反义寡核苷酸长度为18个核苷酸。
术语“核酸”和“寡核苷酸”还可以涵盖具有取代或修饰(诸如在碱基和/或糖中)的核酸或寡核苷酸。例如，其包括具有以下主链糖的核酸，所述主链糖在2’位与除羟基之外的低分子量有机基团共价连接且在5’位与除磷酸基团或羟基之外的低分子量有机基团共价连接。因此，修饰的核酸可以包括2’-O-烷基化的核糖基团。此外，修饰的核酸可以包括例如己糖、2’-F己糖、2’-氨基核糖、CEt-LNA、阿拉伯糖或2’-氟阿拉伯糖的糖而不包括核糖。因此，核酸在主链组成方面可以为异质的，由此含有连接在一起的聚合物单元的任何可能的组合，诸如肽-核酸(其具有含有核酸碱基的氨基酸主链)。另一些实例在下文中更详细地描述。
寡核苷酸可以是DNA、RNA、PNA、LNA、ENA或包括其任何化学或天然修饰的杂合体。化学和天然修饰是本领域众所周知的。此类修饰包括例如设计用于以下的修饰：增加与靶链的结合(即，增加其解链温度)、帮助鉴定寡核苷酸或寡核苷酸-靶标复合物、增加细胞渗透、针对降解或干扰寡核苷酸的结构或活性的核酸酶及其它酶而稳定化、一旦与靶标序列特异性结合就提供破坏模式(终止事件)、以及改善寡核苷酸的药代动力学特性。
修饰包括但不限于：例如，(a)末端修饰，例如5’末端修饰(磷酸化去磷酸化、缀合、反向连接等)、3’末端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；(b)碱基修饰，例如用修饰的碱基、稳定碱基、去稳定碱基、或与配偶体的扩增集合碱基配对的碱基、或缀合的碱基进行替换；(c)糖修饰(例如，在2’位或4’位)或糖的替换；以及(d)核苷间键修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替换。在此类修饰干扰翻译的程度(即，例如在体外翻译测定中，相对于缺乏修饰，导致翻译降低50％、60％、70％、80％或90％或更多)上，所述修饰对于本文所述的方法和组合物而言可能不是最佳的。
修饰的核苷间键的非限制性实例包括：具有正常3’-5’连接的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯)以及手性膦酸酯、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯(thionophosphoramidate))、硫羰烷基磷酸酯、硫羰烷基磷酸三酯以及硼烷磷酸酯，这些的2’-5’连接的类似物，以及其中相邻的核苷单元对以3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’连接的具有反向极性的那些。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。
在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸是经修饰的单链寡核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的单链寡核苷酸由10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90、10-100或多于100个连接的核苷组成且具有缺口区段。在一些实施方案中，缺口区段是指一种或多种连接的核酸，其由位于修饰的寡核苷酸(诸如经修饰的单链寡核苷酸)的中心处或中心附近的脱氧核苷组成。在一些实施方案中，缺口区段由2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-20、2-30、2-40、2-50、10-20、10-30、10-40或10-50个连接的脱氧核苷组成。
5'翼区段对应于从修饰的寡核苷酸的5'-末端至在缺口区段的5'-末端的第一核酸之前的核酸的连接的核酸(例如，核苷)。3'翼区段对应于在缺口区段的3'末端的最后一个核酸之后至修饰的寡核苷酸的3'末端的最后一个核酸的连接的核酸(例如，核苷)。
所述缺口区段位于5'翼区段和3'翼区段之间。在一些实施方案中，5'翼区段的至少一个核苷和/或3'翼区段的至少一个核苷包含修饰的核苷。在一些实施方案中，所述缺口区段内的核苷间键和将缺口区段连接至3'翼区段和/或5'翼区段的键都是硫代磷酸酯键(*)。在一些实施方案中，连接5'和3'翼区段两者的其余核苷的核苷间键是磷酸二酯键。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸中的核苷用2’O-甲基基团修饰。修饰的寡核苷中的核苷也可以用本文所述的任何其它修饰进行修饰。
在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸的核碱基序列由10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90、10-100或多于100个连接的核苷组成并且具有与IL-17R(诸如IL-17RA(例如，IL-17RA的cDNA序列由SEQ ID NO:302所示)、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD或IL-17RE)(参见例如，Johansen等人,Br J Dermatol(2009)160(2):319-24)的编码序列(例如，cDNA)的等长部分互补的缺口片段，或其药学上可接受的盐。
不包括磷原子的修饰的核苷间键具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的核苷间键。这些包括具有以下的那些：吗啉代键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其它主链。
取代的糖部分包括但不限于在2’位的以下之一：H(脱氧核糖)；OH(核糖)；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。
化学或天然修饰的寡核苷酸可以包括例如至少一个在糖的2’位修饰的核苷酸，最优选2’-O-烷基、2’-O-烷基-O-烷基或2’-氟修饰的核苷酸或端帽。在其它实施方案中，RNA修饰包括在RNA的3’末端的嘧啶的核糖上的2’-氟、2’-氨基和2’O-甲基修饰、无碱基残基或反向碱基。
根据本发明可用的寡核苷酸可以包括单一修饰的核苷。在其它实施方案中，寡核苷酸可以包括至少两个修饰的核苷、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个核苷，最多达寡核苷酸的整个长度。
核苷或核碱基包括天然嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核苷包括其它的合成和天然核碱基，诸如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素(nubularine)、异鸟苷(isoguanisine)、杀结核菌素(tubercidine)、2-(卤代)腺嘌呤、2-(烷基)腺嘌呤、2-(丙基)腺嘌呤、2(氨基)腺嘌呤、2-(氨基烷基)腺嘌呤、2(氨基丙基)腺嘌呤、2(甲硫基)N6(异戊烯基)腺嘌呤、6(烷基)腺嘌呤、6(甲基)腺嘌呤、7(去氮杂)腺嘌呤、8(烯基)腺嘌呤、8-(烷基)腺嘌呤、8(炔基)腺嘌呤、8(氨基)腺嘌呤、8-(卤代)腺嘌呤、8-(羟基)腺嘌呤、8(硫代烷基)腺嘌呤、8-(巯基)腺嘌呤、N6-(异戊基)腺嘌呤、N6(甲基)腺嘌呤、N6，N6(二甲基)腺嘌呤、2-(烷基)鸟嘌呤、2(丙基)鸟嘌呤、6-(烷基)鸟嘌呤、6(甲基)鸟嘌呤、7(烷基)鸟嘌呤、7(甲基)鸟嘌呤、7(去氮杂)鸟嘌呤、8(烷基)鸟嘌呤、8-(烯基)鸟嘌呤、8(炔基)鸟嘌呤、8-(氨基)鸟嘌呤、8(卤代)鸟嘌呤、8-(羟基)鸟嘌呤、8(硫代烷基)鸟嘌呤、8-(巯基)鸟嘌呤、N(甲基)鸟嘌呤、2-(硫代)胞嘧啶、3(去氮杂)5(氮杂)胞嘧啶、3-(烷基)胞嘧啶、3(甲基)胞嘧啶、5-(烷基)胞嘧啶、5-(炔基)胞嘧啶、5(卤代)胞嘧啶、5(甲基)胞嘧啶、5(丙炔基)胞嘧啶、5(丙炔基)胞嘧啶、5(三氟甲基)胞嘧啶、6-(偶氮)胞嘧啶、N4(乙酰基)胞嘧啶、3(3氨基-3-羧丙基)尿嘧啶、2-(硫代)尿嘧啶、5(甲基)2(硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-2(硫代)尿嘧啶、4-(硫代)尿嘧啶、5(甲基)4(硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-4(硫代)尿嘧啶、5(甲基)2，4(二硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-2，4(二硫代)尿嘧啶、5(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-(烷基)尿嘧啶、5-(炔基)尿嘧啶、5-(烯丙基氨基)尿嘧啶、5(氨基烯丙基)尿嘧啶、5(氨基烷基)尿嘧啶、5(胍烷基)尿嘧啶、5(1，3-二唑-1-烷基)尿嘧啶、5-(氰基烷基)尿嘧啶、5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶、5(二甲基氨基烷基)尿嘧啶、5-(卤代)尿嘧啶、5-(甲氧基)尿嘧啶、尿嘧啶-5氧基乙酸、5(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、5(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶、5(丙炔基)尿嘧啶、5(丙炔基)尿嘧啶、5(三氟甲基)尿嘧啶、6(偶氮)尿嘧啶、二氢尿嘧啶、N3(甲基)尿嘧啶、5-尿嘧啶(即，假尿嘧啶)、2(硫代)假尿嘧啶、4(硫代)假尿嘧啶、2，4-(二硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-4(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-4(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-2，4(二硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2，4(二硫代)假尿嘧啶、1取代的假尿嘧啶、1取代的2(硫代)-假尿嘧啶、1取代的4(硫代)假尿嘧啶、1取代的2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1，3-(二氮杂)-2-(氧代)吩嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩嗪-1-基、1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、1-(氮杂)2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)2-(硫代)-3-(氮杂)-吩嗪-1-基、7-取代的1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(氮基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)吩嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩嗪-1-基、7-(胍烷基-羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)吩噻嗪-1-基、1，3，5-(三氮杂)-2，6-(二氧杂)-萘、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素、杀结核菌素、异鸟苷、肌苷基、2-氮杂-肌苷基、7-去氮杂-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯并嘧啶基、3-(甲基)异喹诺酮基、5-(甲基)异喹诺酮基、3-(甲基)-7-(丙炔基)异喹诺酮基、7-(氮杂)吲哚基、6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基、咪唑并吡啶基、9-(甲基)-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基(pyrrolopyrizinyl)、异喹诺酮基、7-(丙炔基)异喹诺酮基、丙炔基-7-(氮杂)吲哚基、2，4，5-(三甲基)苯基、4-(甲基)吲哚基、4，6-(二甲基)吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、茋基、并四苯基(tetracenyl)、并五苯基(pentacenyl)、二氟甲苯基(diiluorotolyl)、4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)苯并咪唑、6-(偶氮)胸腺嘧啶、2-吡啶酮、5硝基吲哚、3硝基吡咯、6-(氮杂)嘧啶、2(氨基)嘌呤、2，6-(二氨基)嘌呤、5取代的嘧啶、N2-取代的嘌呤、N6-取代的嘌呤、O6-取代的嘌呤、经取代的1，2，4-三唑、吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、对位取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、邻位取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、双邻位取代的-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、对-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、双-邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基、或其任意O-烷基化或N-烷基化的衍生物。
本发明的反义寡核苷酸可以是嵌合寡核苷酸。本发明的嵌合反义化合物可以形成为如上所述的两个或更多个寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、寡核苷酸和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。此类化合物在本领域中也被称为杂合体或混合主链或嵌合或缺口体(gapmer)。具体而言，缺口体是具有至少三个离散部分的寡核苷酸，所述离散部分中有两个是相似的(即，包含一个或多个主链修饰)并且包围独特的区域(即，不包含主链修饰)。
寡核苷酸可以在一端或两端(即在3’和/或5’末端)包括分子种类。如本文所用的分子种类是指不是天然存在的核苷酸或是非天然存在的核苷酸的任何化合物。分子种类包括但不限于：间隔物、脂质、固醇、脂质部分诸如胆固醇部分、胆酸、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇、硫代胆固醇、脂肪族链例如十二烷二醇或十一烷基残基、磷脂例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯、多胺或聚乙二醇链、或金刚烷乙酸、棕榈基部分、十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分、硬脂基、C16烷基链、胆汁酸、胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸、油烯基石胆酸、油酰基胆烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、类异戊二烯诸如类固醇、维生素诸如维生素E、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、脂肪酸酯诸如甘油三酯、芘、卟啉、德卟啉、金刚烷、吖啶、生物素、香豆素、荧光素、罗丹明、德克萨斯红、洋地黄毒苷、二甲氧基三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花青染料(例如，Cy3或Cy576)、Hoechst 33258染料、补骨脂素或布洛芬。
分子种类可以连接在寡核苷酸的各个位置。如上所述，所述分子种类可以与寡核苷酸的2’-末端、3’-末端或5’-末端连接，其中其还用于增强寡聚物针对3’-或5’-外切核酸酶的稳定性的目的。或者，其可以连接至内部核苷酸或分支上的核苷酸。所述分子种类可以连接至核苷酸的2’-位。所述分子种类还可以连接至核苷酸的杂环碱基。
所述分子种类可以通过接头部分连接至寡核苷酸。任选地，所述接头部分是非核苷酸接头部分。非核苷酸接头是例如无碱基残基(dSpacer)；低聚乙二醇，诸如三乙二醇或六乙二醇；或烷二醇，诸如丁二醇。间隔物单元优选地通过磷酸二酯、二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯键连接。接头单元可以在分子中仅出现一次，或者可以并入数次，例如经由磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或酰胺键并入数次。
本发明的寡核苷酸(独立于使核苷酸与分子种类连接的接头)还可以含有非核苷酸接头，特别是无碱基接头(dSpacer)、三乙二醇单元或六乙二醇单元。进一步优选的接头是烷基氨基接头，诸如C3、C6、C12氨基接头；以及烷基硫醇接头，诸如C3或C6硫醇接头。
IL-17RA和TNFα在各种各样炎性病症中发挥作用。如本文所用的炎性病症是指其中IL-17或TNFα活性不利于受试者中的特定生理功能的病症。如本文所用的术语“其中IL-17或TNFα活性不利的病症”旨在包括这样的疾病和其它病症：其中患有病症的受试者中表达的这些细胞因子的水平在该病症的病理生理学中发挥作用或者作为导致该病症的恶化或维持的因素发挥作用。因此，其中IL-17或TNFα活性不利的病症是预期抑制IL-17/IL-17RA或TNFα活性减轻该病症的至少一种症状和/或进展或恶化的病症。此类病症可以例如通过患有该病症的受试者的生物流体中IL-17或TNFα浓度的增加(例如，该受试者的血清、血浆、滑液等中IL-17或TNFα浓度的增加)来证明，其可例如使用分别用于检测IL-17或TNFα信息或蛋白质的探针或抗体来检测。
炎性病症包括但不限于败血症、感染、自身免疫性疾病、癌症、移植排斥和移植物抗宿主病、移植排斥、恶性肿瘤、肺病症、肠道病症、心脏病症、败血症、脊椎关节病、代谢病症、贫血、疼痛、肝脏病症、皮肤病症、指甲病症、类风湿性关节炎、银屑病、伴随银屑病关节炎的银屑病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、血管炎、白塞氏病、强直性脊柱炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、再狭窄、糖尿病、贫血、疼痛、克罗恩氏病相关病症、青少年类风湿性关节炎(JRA)、丙型肝炎病毒感染、银屑病关节炎和慢性斑块性银屑病。
IL-17或TNFα在这些疾病中发挥的生物学作用是已知的。抑制这些疾病中的IL-17RA和/或TNFα表达为该病症提供了治疗性治疗。
ASO-SNA和mASO-SNA可以单独施用或者与用于治疗炎性病症的另一种治疗剂联合施用。可与本发明的ASO-SNA和mASO-SNA组合的治疗剂的非限制性实例包括以下：非甾体抗炎药(NSAID)；细胞因子抑制性抗炎药(CSAID)；CDP-571/BAY-10-3356(人源化抗TNFα抗体；Celltech/Bayer)；cA2/英夫利昔单抗(嵌合抗TNFα抗体；Centocor)；75kd TNFR-IgG/依那西普(75kD TNF受体-IgG融合蛋白质；Immunex；55kd TNF-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白质；Hoffmann-LaRoche)；IDEC-CE9/SB 210396(非消耗性灵长类源化的抗-CD4抗体；IDEC/SmithKline；DAB 486-IL-2和/或DAB 389-IL-2(IL-2融合蛋白质；Seragen；抗Tac(人源化抗IL-2Rα；Protein Design Labs/Roche)；IL-4(抗炎性细胞因子；DNAX/Schering)；IL-10(SCH 52000；重组IL-10、抗炎性细胞因子；DNAX/Schering)；IL-4；IL-10和/或IL-4激动剂(例如，激动剂抗体)；IL-1RA(IL-1受体拮抗剂；Synergen/Amgen)；阿那白滞素(Kineret/Amgen)；TNF-bp/s-TNF(可溶性TNF结合蛋白质)；R973401(磷酸二酯酶IV型抑制剂)；MK-966(COX-2抑制剂)；伊洛前列素；甲氨蝶呤；沙利度胺和沙利度胺相关药物(例如，Celgen)；来氟米特(抗炎和细胞因子抑制剂)；氨甲环酸(纤溶酶原激活抑制剂)；T-614(细胞因子抑制剂)；前列腺素E1；替尼达普(非甾体抗炎药)；萘普生(非甾体抗炎药)；美洛昔康(非甾体抗炎药)；布洛芬(非甾体抗炎药)；吡罗昔康(非甾体抗炎药)；双氯芬酸(非甾体抗炎药)；吲哚美辛(非甾体抗炎药)；柳氮磺吡啶；硫唑嘌呤；ICE抑制剂(酶白介素-1-β-转化酶的抑制剂)；zap-70和/或Ick抑制剂(酪氨酸激酶zap-70或Ick的抑制剂)；VEGF抑制剂和/或VEGF-R抑制剂(血管内皮细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子受体的抑制剂；血管发生抑制剂)；皮质类固醇抗炎药(例如，SB203580)；TNF-转化酶抑制剂；抗IL-12抗体；抗IL-18抗体；白介素-11；白介素-13；白介素-17抑制剂；金；青霉胺；氯喹；羟氯喹；苯丁酸氮芥；环孢素；环磷酰胺；全淋巴照射；抗胸腺细胞球蛋白；抗CD4抗体；CD5毒素；经口施用的肽和胶原；氯苯扎利二钠；细胞因子调节剂(CRA)HP228和HP466(Houghten Pharmaceuticals，Inc.)；ICAM-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶性补体受体1(TP10；T Cell Sciences，Inc.)；泼尼松；奥古蛋白；糖胺聚糖多硫酸盐；米诺环素；抗IL2R抗体；海洋和植物脂质(鱼和植物种子脂肪酸)；金诺芬；保泰松；甲氯灭酸；氟灭酸；静脉内免疫球蛋白；齐留通；阿扎立平；霉酚酸(RS-61443)；他克莫司(FK-506)；西罗莫司(雷帕霉素)；氨普立糖(therafectin)；克拉屈滨(2-氯脱氧腺苷)；甲氨蝶呤；抗病毒剂；和免疫调节剂。
本发明的预防和/或治疗方案的毒性和效力可以在细胞培养物或实验动物中通过标准药物程序来测定，例如用于测定LDs0(对群体中的50％致死的剂量)和ED50(在群体中的50％中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且其可以表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的预防剂和/或治疗剂是优选的。尽管可以使用表现出毒性副作用的预防剂和/或治疗剂，但应当小心以设计将此类试剂靶向至受影响组织的部位的递送系统以使对未受感染细胞的潜在损害最小化并且由此降低副作用。
在配制用于人中使用的预防剂和/或治疗剂的一系列剂量中可使用由细胞培养测定和动物研究获得的数据。此类试剂的剂量优选地落在包括ED50且具有很少毒性或没有毒性的循环浓度的范围内。根据所采用的剂型和所利用的施用途径，剂量可以在该范围内变化。对于本发明的方法中使用的任何试剂，可以最初由细胞培养物测定估计治疗有效剂量。可以在动物模型中制定剂量以实现包括IC50(即，实现症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围，如在细胞培养物中所测定。这种信息可用于更精确地确定在人中的可用剂量。血浆中的水平可以例如通过高效液相色谱来测量。许多研究已检验了反义寡核苷酸的最佳剂量。
在某些实施方案中，药物组合物可以包含，例如，至少约0.000001％(w/w)的活性化合物。在其它实施方案中，所述活性化合物可以占约2％至约75％单位重量(w/w)，或例如约25％至约60％，和其中可推导的任何范围。在一些实施方案中，本文所述的活性化合物(例如，寡核苷酸或纳米结构)占0.000001％至0.00001％，0.00001％至0.0001％，0.0001％至0.001％，0.001％至0.01％，0.01％至0.1％，0.1％至1％，1％至5％，5％至10％，10％至15％，15％至20％，20％至25％，25％至30％，30％至40％，40％至50％(w/w)，和其之间可推导的任何范围。在一些实施方案中，本文所述的活性化合物(例如，寡核苷酸或纳米结构)占0.00007％、0.007％、0.01％、0.1％、1％(w/w)。
本文所述的化合物的受试者剂量通常范围为约0.1μg至10,000mg，更通常为约1μg/天至8000mg，且最通常为约10μg至100μg。就受试者体重而言，典型剂量范围为每次施用约1微克/kg/体重，约5微克/kg/体重，约10微克/kg/体重，约50微克/kg/体重，约100微克/kg/体重，约200微克/kg/体重，约350微克/kg/体重，约500微克/kg/体重，约1毫克/kg/体重，约5毫克/kg/体重，约10毫克/kg/体重，约50毫克/kg/体重，约100毫克/kg/体重，约200毫克/kg/体重，约350毫克/kg/体重，约500毫克/kg/体重，至约1000mg/kg/体重或更多，和其中可推导的任何范围。在从本文所列数字的可推导范围的非限制性实例中，基于上述数字，可以施用约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围。绝对量将取决于多种因素，包括并行治疗、剂量数量和个体患者参数(包括年龄、身体状况、体型大小和体重)。这些是本领域普通技术人员众所周知的因素并且仅用常规实验即可解决。通常优选的是，使用最大剂量，即，根据合理医学判断的最高安全剂量。
也考虑多个剂量的本发明的分子。在一些情况下，当本发明的分子与另一种治疗剂(例如抗炎剂)一起施用时，在治疗具有炎性病症或处于发展炎性病症的风险的受试者中使用所述分子或其它试剂的亚治疗剂量或两者的亚治疗剂量。当两类药物一起使用时，可以以亚治疗剂量施用其它试剂以产生期望的治疗结果。如本文所用的“亚治疗剂量”是指小于如果在其它试剂不存在的情况下施用在受试者中产生治疗结果的剂量的剂量。因此，治疗剂的亚治疗剂量是在不存在本发明的分子的施用的情况下在受试者中不产生期望的治疗结果的剂量。可用于治疗炎性病症的试剂的治疗剂量是医学领域中众所周知的。这些剂量已广泛地描述于参考文献诸如Remington’s Pharmaceutical Sciences，以及医务人员所依据的作为用于治疗感染性疾病、癌症和自身免疫性疾病的指导的许多其它医学参考文献。寡核苷酸的治疗剂量也已在本领域中描述。
给药方案可以是一天数次、每天、每隔一天、每周、每两周、其之间的任何时间或更低频率。如本文所用的术语“每两周给药”是指每两周一次地将物质(例如，抗IL-17RA核酸)施用于受试者的时间进程。可以例如每7-20天、每11-17天或每13-15天施用所述寡核苷酸。
在一些实施方案中，在给药时间方案中，将本文所述的化合物(例如，寡核苷酸、纳米结构等)按每个剂量4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、72、96、120、240、480小时或其之间的任何范围施用。
寡核苷酸以有效量施用。本发明的化合物在治疗本文所述的疾病中的有效量可以根据所使用的具体化合物、化合物的递送模式以及其是单独使用还是组合使用而变化。用于任何特定应用的有效量也可以根据诸如所治疗的疾病、所施用的具体化合物、受试者的体型大小或疾病或病况的严重程度等因素而变化。本领域普通技术人员可以根据经验确定本发明的具体分子的有效量，而不需要过度实验。结合本文提供的教导，通过在各种活性化合物中选择并权衡诸如效力、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的严重程度和优选施用模式的因素，可以计划不引起显著毒性并且仍对治疗特定受试者完全有效的有效预防性或治疗性治疗方案。
在一些实施方案中，使细胞与浓度为至少0.001nM、至少0.01nM、至少0.1nM、至少1nM、至少10nM、至少100nM、至少1000nM、至少10μM、至少100μM、至少1000μM或高于1000μM的本文所述的寡核苷酸、纳米结构或mASO-SNA接触。在一些实施方案中，使细胞与浓度范围为0.001nM至0.01nM、0.01nM至0.1nM、0.1nM至1nM、1nM至10nM、10nM至100nM、100nM至1000nM、1000nM至10μM、10μM至100μM或100μM至1000μM的本文所述的寡核苷酸、纳米结构或mASO-SNA接触。在一些实施方案中，使细胞与浓度为0.001nM、0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、100nM、1000nM、10μM、100μM、1000μM或高于1000μM的本文所述的寡核苷酸、纳米结构或mASO-SNA接触。
本文所述的寡核苷酸在本发明的检测和治疗方法中可单独使用或与其它分子(诸如检测剂或细胞毒剂)结合使用，如本文中更详细描述。
寡核苷酸可以例如与可检测的标记物偶联或缀合。可检测的标记物是可以直接或间接确定其存在的部分。通常，标记物的检测涉及标记物的能量发射。标记物可通过其发射和/或吸收特定波长的光子或其它原子粒子(例如放射性、发光、光学或电子密度等)的能力来直接检测。标记物可通过其结合、募集和在一些情况下切割自身可以发射或吸收特定波长的光的另一部分(例如，表位标签诸如FLAG表位、酶标签诸如辣根过氧化物酶等)的能力来间接检测。间接检测的一个实例是使用将底物切割成可见产物的第一酶标记物。标记物可以具有化学、肽或核酸分子性质，尽管其不限于此。其它可检测的标记物包括放射性同位素诸如P32或H3、发光标志物诸如荧光染料、光学或电子密度标志物等，或表位标签诸如FLAG表位或HA表位，生物素，抗生物素蛋白，以及酶标签(诸如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶等)。所述标记物可以在寡核苷酸的合成期间或之后与其结合。存在本领域普通技术人员已知的许多不同的标记物和标记方法。可用于本发明中的标记物类型的实例包括酶、放射性同位素、荧光化合物、胶体金属、化学发光化合物和生物发光化合物。本领域普通技术人员将知道用于本文所述的寡核苷酸的其它合适标记物，或者将能够使用常规实验来确定此类标记物。此外，这些标记物与本发明的寡核苷酸的偶联或缀合可使用本领域普通技术人员常用的标准技术来进行。
除了别的之外，寡核苷酸与可检测标记物的缀合还有利于在诊断测定中使用此类试剂。另一类别的可检测标记物包括诊断和成像标记物(通常被称为体内可检测标记物)，诸如，例如磁共振成像(MRI)：Gd(DOTA)；对于核医学：201Tl，γ发射放射性核素99mTc；对于正电子发射断层摄影(PET)：正电子发射同位素、(18)F-氟脱氧葡萄糖((18)FDG)、(18)F-氟化物、铜-64、钆双胺和Pb(II)的放射性同位素(诸如203Pb)；111In。在此类情况下，当寡核苷酸提供反义效应时，可观察到寡核苷酸的使用。
本文描述的缀合或修饰采用常规化学，所述化学不构成本发明的一部分并且所述化学是化学领域技术人众所周知的。保护基和已知接头(诸如单-和异-双官能接头)的使用在文献中充分记载，并且在此不重复。
如本文所用，“缀合的”意指通过任何物理化学方式与彼此稳定结合的两个实体。重要的是，连接的性质是使得其不会显著损害任一实体的有效性。考虑到这些参数，可以采用本领域普通技术人员已知的任何共价或非共价连接。在一些实施方案中，优选共价连接。非共价缀合包括疏水相互作用、离子相互作用、高亲和力相互作用诸如生物素-抗生物素蛋白和生物素-链霉抗生物素蛋白复合以及其它亲和力相互作用。此类连接的方式和方法是本领域普通技术人员众所周知的。根据标记物和其它测定组分的性质，可以使用多种方法来检测标记物。
本发明的药物组合物包含有效量的溶解或分散在药学上可接受的载体中的一种或多种试剂。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当施用于动物(诸如，例如人)(适当时)时不产生不利的、过敏性的或其它不良反应的分子实体和组合物。此外，对于动物(例如，人)施用，应当理解，制剂应当满足如FDA生物标准局(FDA Office of BiologicalStandards)所要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。该化合物通常适合于施用于人。该术语要求，化合物或组合物无毒且足够纯，使得在施用于人之前不需要化合物或组合物的进一步操作。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、诸如此类的材料及其组合，如本领域普通技术人员所知。
试剂可以包含不同类型的载体，这取决于其是否将以固体、液体、凝胶、乳膏或气雾剂形式施用，以及其是否需要是无菌的(对于例如注射这样的施用途径)。本发明可如下施用：静脉内、皮内、动脉内、病灶内、瘤内、颅内、鞘内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、局部(topically)、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、囊内(intravesicularlly)、经粘膜、心包内、脐内、眼内、经由滴眼剂、经口、局部(topical ly)、局部(locally)、吸入(例如，气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注、直接浸浴靶细胞的局部灌注、经由导管、经由灌洗、在乳膏中、在凝胶中、在脂质组合物(例如，脂质体)中、或通过其它方法或前述的任何组合，如本领域普通技术人员所知。
在任何情况下，所述组合物均可以包含各种抗氧化剂以延缓一种或多种组分的氧化。另外，可通过防腐剂来实现防止微生物的作用，所述防腐剂诸如各种抗细菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。
试剂可以被配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如，与蛋白质组合物的游离氨基形成的那些，或者与无机酸诸如例如盐酸或磷酸或者与有机酸诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的酸加成盐。与游离羧基形成的盐还可来自于无机碱诸如例如钠、钾、铵、钙或铁氢氧化物，或者有机碱诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。
在组合物呈液体形式的实施方案中，载体可以是溶剂或分散介质，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、脂质(例如，甘油三酯、植物油、脂质体)及其组合。可以例如通过以下来维持适当的流动性：通过使用包衣剂，诸如卵磷脂；通过分散在载体(诸如，例如液体多元醇或脂质)中来维持所需的颗粒尺寸；通过使用表面活性剂(诸如，例如羟丙基纤维素)；或者此类方法的组合。在许多情况下，将优选地包括等张剂，诸如例如糖、氯化钠或其组合。
本发明的化合物可直接施用于组织。直接组织施用可以通过直接注射、表面应用或局部应用来实现。化合物可以施用一次，或者可替代地其可以以多次施用来施用。如果多次施用，可以经由不同的途径来施用化合物。例如，第一次(前几次)施用可直接针对受影响的组织，而后续施用可以是全身性的。
本发明的制剂以药学上可接受的溶液施用，所述溶液可以常规地包含药学上可接受的浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体、辅料和任选地其它治疗性成分。
根据本发明的方法，化合物可以以药物组合物施用。一般来说，药物组合物包含本发明的化合物和药学上可接受的载体。如本文所用，药学上可接受的载体意指不干扰活性成分的生物活性的有效性的无毒材料。
药学上可接受的载体包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂以及本领域众所周知的其它材料。此类制剂可以常规地含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体和任选地其它治疗剂。当用于药物中时，盐应当是药学上可接受的，但非药学上可接受的盐可以方便地用于制备其药学上可接受的盐并且不被排除在本发明的范围之外。此类药理学上和药学上可接受的盐包括但不限于由以下酸制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。另外，可将药学上可接受的盐制备为碱金属或碱土金属盐，诸如钠、钾或钙的盐。
本发明的化合物可以被配制成固体、半固体、液体或气态形式的制剂，诸如片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、储库(depository)、吸入剂和注射剂，以及用于经口、肠胃外或外科手术施用的常用方式。本发明还涵盖配制用于局部施用(诸如通过植入物)的药物组合物。
适用于经口施用的组合物可以作为各自包含预定量活性剂的离散单元(诸如胶囊剂、片剂、锭剂)提供。其它组合物包括在水性液体或非水性液体中的混悬剂，诸如糖浆剂、酏剂或乳剂。
对于经口施用，可以通过将活性化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体组合来容易地配制化合物。此类载体使得能够将本发明的化合物配制成用于待治疗的受试者经口摄取的片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体、凝胶剂、热可逆水凝胶诸如普朗尼克F-127、糖浆剂、浆体、混悬剂等。用于经口使用的药物制剂可如下作为固体赋形剂获得：在添加合适的助剂(如果需要的话，获得片剂或糖衣丸核的合适助剂)之后，任选地研磨所得混合物，并对颗粒混合物进行加工。合适的赋形剂尤其是填充剂，诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，诸如例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以添加崩解剂，诸如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或者藻酸或其盐(诸如藻酸钠)。任选地，经口制剂还可以在盐水或缓冲剂中配制用于中和内部酸性条件或者可以在无任何载体的情况下施用。
糖衣丸核被提供有合适的包衣。出于该目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、和/或二氧化钛、漆溶液、以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加至片剂或糖衣丸包衣用于识别或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以经口使用的药物制剂包括由明胶制成的推入式胶囊剂，以及由明胶和增塑剂(诸如甘油或山梨醇)制成的软的密封胶囊剂。推入式胶囊剂可以含有与填充剂(诸如乳糖)、粘合剂(诸如淀粉)和/或润滑剂(诸如滑石或硬脂酸镁)以及任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊剂中，活性化合物可以溶解或混悬在合适的液体(诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇)中。另外，可以添加稳定剂。还可以使用配制用于经口施用的微球。此类微球已在本领域中充分定义。用于经口施用的所有制剂均应当呈适于此类施用的剂量。
对于经颊施用，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过吸入施用，根据本发明使用的化合物可以方便地通过使用合适的抛射剂以由加压包装或喷雾器提供的气雾喷雾剂的形式递送，所述抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀以递送计量量来确定。用于吸入器或吹入器中使用的(例如明胶的)胶囊和药筒可以被配制成含有化合物和合适粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。用于制备气雾剂递送系统的技术是本领域技术人员众所周知的。
化合物当期望将其全身递送时可以被配制成用于通过注射(例如通过推注或连续输液)肠胃外施用。注射用制剂可以以单位剂量形式呈现，例如呈现于其中添加有防腐剂的安瓿或多剂量容器中。组合物可以采用诸如在油性或水性媒介物中的混悬剂、溶液剂或乳剂的形式，并且可以包含配制剂，诸如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外施用的制剂包括无菌的水性或非水性溶液剂、混悬剂和乳剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或混悬液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格氏液或不挥发油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其它添加剂，诸如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。其它施用形式(诸如静脉内施用)将导致较低的剂量。如果在施用的初始剂量下受试者中的应答不足，则可以在患者耐受性允许的程度上采用更高的剂量(或通过不同的更局部化的递送途径的有效更高剂量)。考虑每天多个剂量以实现化合物的适当的全身水平。
本发明的组合物可以配制在用于施用于皮肤或体腔的局部组合物中。合适的局部媒介物和媒介物组分是化妆品和制药领域中众所周知的，并且包括媒介物(或媒介物组分)诸如水；热可逆水凝胶诸如普朗尼克F-127，有机溶剂，诸如醇(特别是能够容易从皮肤中蒸发的低级醇，诸如乙醇)、二醇(诸如丙二醇、丁二醇和甘油)、脂肪族醇(诸如羊毛脂)；水和有机溶剂的混合物(诸如水和醇)，以及有机溶剂的混合物(诸如醇和甘油)(任选地还有水)；基于脂质的材料，诸如脂肪酸、酰基甘油(包括油，诸如矿物油、以及天然或合成来源的脂肪)、磷酸甘油酯、鞘脂和蜡；基于蛋白质的材料，诸如胶原和明胶；基于硅酮的材料(非挥发性和挥发性两者)，诸如环甲硅脂、聚二甲基硅氧烷醇(demethiconol)和聚二甲基硅氧烷共聚多元醇(dimethicone copolyol)(Dow Corning)；基于烃的材料，诸如矿脂和角鲨烷；阴离子、阳离子和两性表面活性剂和皂；缓释媒介物，诸如微海绵和聚合物基质；稳定剂和混悬剂；乳化剂；以及适合施用于皮肤的其它媒介物和媒介物组分，以及如上鉴定或本领域另外已知的局部媒介物组分的混合物。媒介物可以进一步包括适于改善所施用制剂的稳定性或有效性的组分，诸如防腐剂、抗氧化剂、皮肤渗透增强剂、缓释材料等。
合适媒介物的选择将取决于制剂要实现的具体物理形式和递送模式。合适形式的实例包括液体(例如，含漱剂和漱口剂，包括锶阳离子的溶解形式以及混悬剂、乳剂等)；固体和半固体，诸如凝胶剂、泡沫剂、糊剂、乳膏剂、软膏剂、“棒剂(stick)”(如唇膏或腋下除臭剂棒)、散剂等；含有脂质体或其它递送囊泡的制剂；直肠或阴道栓剂、乳膏剂、泡沫剂、凝胶剂或软膏剂；以及其它形式。典型的递送模式包括使用手指涂敷；使用物理涂敷器诸如布、纸巾、拭子、棒或刷子施加(如通过在临涂敷之前用制剂浸泡涂敷器，或者通过将准备的已含有制剂的涂敷器涂敷或附着至皮肤，所述涂敷器诸如经处理或预润湿的绷带、擦拭物、毛巾或棒)；喷雾(包括雾、气雾剂或泡沫喷雾)；滴管(dropper)施加(例如用滴耳液)；撒布(如用制剂的合适粉末形式)；以及浸泡。
局部制剂还包括用于直肠和阴道施用的制剂。用于直肠施用的制剂可以作为具有包含例如可可脂的合适基质的栓剂提供。适于阴道施用的制剂可以作为片剂、阴道托(pessary)、棉塞(tampon)、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂提供，所述制剂除了活性成分之外还含有如本领域已知的适当的此类载体。
在还有其它实施方案中，递送媒介物是生物相容性的微粒或适于植入到哺乳动物接受者中的植入物。其它递送系统可以包括时间释放、迟释或缓释递送系统。此类系统可避免重复施用化合物，增加受试者和医生的便利性。许多类型的释放递送系统均是可得的并且是本领域普通技术人员已知的。其包括聚合物基质系统，诸如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯/盐(copolyoxalate)、聚己内酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酐。
在一些实施方案中，将本发明的反义核酸配制为稳定的自组装纳米结构。所述纳米结构包括IL-17RA反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸与核缔合。所述核可以是实心或空心的核，诸如脂质体核。实心核是不具有空心中心的球形材料。如本文所用的术语球形是指一般形状并且不意指或不限于完美的球体或圆形。其可以包括缺陷。
实心核可以由本领域技术人员已知的各种各样的材料构建，所述材料包括但不限于：贵金属(金、银)、过渡金属(铁、钴)和金属氧化物(二氧化硅)。此外，这些核可以是惰性的、顺磁性的或超顺磁性的。这些实心核可以由所述材料的纯组合物构建、或以任何数量的材料的混合物的组合构建、或构建于材料的分层组合物中。此外，实心核可以由聚合物核构成，所述聚合物核诸如两亲性嵌段共聚物，疏水性聚合物诸如聚苯乙烯、聚(乳酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚(乙醇酸)、聚(己内酯)，以及本领域技术人员已知的其它生物相容性聚合物。
或者，核可以是空心核，其在壳材料的中心区域中具有至少一些空间。空心核包括脂质体核和泡囊。如本文所用的脂质体核是指由形成脂质双层的脂质或磷脂组分形成的位于中心的核隔室。“脂质体”是各种尺寸和结构的人造的自封闭的囊状结构，其中一个或数个膜包封水性核。最典型地，脂质体膜由脂质双层膜形成，其中亲水性头基朝向水性环境取向，而脂质链嵌入亲脂性核中。脂质体也可以由其它两亲性单体和聚合物分子(诸如聚合物，如嵌段共聚物或多肽)形成。单层囊泡是由包围水性空间的单膜限定的脂质体。相比之下，寡-或多层囊泡由数个膜构建。通常，膜为约4nm厚并且由天然或合成来源的两亲性脂质(诸如磷脂)构成。任选地，可通过并入其它脂质(诸如固醇或胆酸衍生物)来改良膜特性。
脂质双层由两层脂质分子构成。层中的每个脂质分子基本上与相邻的脂质双层平行取向，并且形成双层的两个层具有其分子暴露于水相的极性末端和彼此相邻的非极性末端。脂质体核的中心水性区域可以是空的或者完全或部分填充有水、水性乳剂、寡核苷酸或者其它治疗剂或诊断剂。
泡囊是由在双层中取向的非离子表面活性剂形成的囊泡。泡囊通常添加胆固醇作为赋形剂，但也可以包括其它基于脂质和基于非脂质的成分。用于制备泡囊的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，在泡囊制备期间或之后包括聚乙二醇(PEG)。泡囊囊泡在结构和功能上类似于脂质体，但基于非离子表面活性剂而不是脂质作为主要成分。常用的非离子表面活性剂包括脱水山梨糖醇(spans)或聚山梨醇酯(tween)；然而，各种各样的非离子表面活性剂可用于制备泡囊。
“脂质”是指其作为通用术语的常规意义，涵盖不溶于水的脂肪、脂质、原生质的醇-醚可溶性成分。脂质通常由亲水性和疏水性部分组成。在水中，脂质可以自组织以形成双层膜，其中亲水性部分(头基)朝向水相取向，而亲脂性部分(酰基链)嵌入双层核。脂质也可以包含两个亲水性部分(双头基两亲物(bola amphiphile))。在该情况下，膜可以由单个脂质层而不是双层形成。当前背景下的脂质的典型实例是脂肪、脂肪油、精油、蜡、类固醇、固醇、磷脂、糖脂、硫脂、氨基脂质、色脂和脂肪酸。该术语涵盖天然存在和合成的脂质两者。与本发明有关的优选脂质是：类固醇和固醇，特别是胆固醇、磷脂(包括磷脂酰、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺以及鞘磷脂)。在存在脂肪酸的情况下，其长度可以是约12-24个碳链，含有多至6个双键。脂肪酸与可衍生自甘油的主链连接。一种脂质中的脂肪酸可以是不同的(不对称的)，或者可以仅存在1个脂肪酸链，例如，溶血卵磷脂。混合制剂也是可能的，特别是当非阳离子脂质衍生自天然来源，诸如从卵黄、牛心脏、脑、肝或大豆纯化的卵磷脂(磷脂酰胆碱)时。
所述脂质体核可以由本领域技术人员已知的一种或多种脂质构建，所述脂质包括但不限于：1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)，1,2-二肉豆蔻酰基-sn-磷脂酰胆碱(DMPC)，1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-磷脂酰胆碱(POPC)，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DSPG)，1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)，1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)，1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和1,2-双十六烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)，鞘脂诸如鞘氨醇，磷酸鞘氨醇，甲基化鞘氨醇和二氢鞘氨醇，神经酰胺，神经酰胺磷酸酯，1-0酰基神经酰胺，二氢神经酰胺，2-羟基神经酰胺，鞘磷脂，糖基化鞘脂，硫苷脂，神经节苷脂，磷鞘脂和各种长度和饱和状态的植物鞘氨醇及其衍生物，磷脂诸如磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰胆碱，磷脂酸，溶血磷脂酸，环状LPA，磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰甘油，溶血磷脂酰甘油，磷脂酰丝氨酸，溶血磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，肌醇磷酸盐，LPI，心磷脂，溶血心磷脂，双(单酰基甘油)磷酸盐，(二酰基甘油)磷酸盐，醚脂质，二植烷基醚脂质和各种长度和饱和状态的缩醛磷脂，以及它们的衍生物，固醇诸如胆固醇，去氢胆固醇，豆固醇，羊毛固醇，7-烯胆甾烷醇，薯蓣皂苷配基，谷固醇，酵母固醇，zymostenol，14-脱甲基-羊毛固醇，胆固醇硫酸盐，DHEA，DHEA硫酸盐，14-脱甲基-14-脱氢羊毛固醇，二氢谷固醇，菜油固醇，醚阴离子脂质，醚阳离子脂质，镧系螯合脂质，A-环取代氧化固醇，B-环取代氧化固醇，D-环取代氧化固醇，侧链取代氧化固醇，双取代氧化固醇，胆石酸衍生物，氟化固醇，荧光固醇，磺化固醇，磷酸化固醇和不同长度、饱和状态的多不饱和固醇，及其衍生物。
在某些实施方案中，核的直径为平均直径1nm至约250nm，平均直径约1nm至约240nm，平均直径约1nm至约230nm，平均直径约1nm至约220nm，平均直径约1nm至约210nm，平均直径约1nm至约200nm，平均直径约1nm至约190nm，平均直径约1nm至约180nm，平均直径约1nm至约170nm，平均直径约1nm至约160nm，平均直径约1nm至约150nm，平均直径约1nm至约140nm，平均直径约1nm至约130nm，平均直径约1nm至约120nm，平均直径约1nm至约110nm，平均直径约1nm至约100nm，平均直径约1nm至约90nm，平均直径约1nm至约80nm，平均直径约1nm至约70nm，平均直径约1nm至约60nm，平均直径约1nm至约50nm，平均直径约1nm至约40nm，平均直径约1nm至约30nm，或平均直径约1nm至约20nm，或平均直径约1nm至约10nm。
寡核苷酸可以位于核的外部、核的壁中和/或核的中心。位于核上的寡核苷酸通常被称为与核偶联。偶联可以是直接或间接的。在一些实施方案中，至少5、10、15、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000或10,000种寡核苷酸或其任何范围的组合在核的外部上。在一些实施方案中，在表面上存在1-1000、10-500、50-250或50-300种寡核苷酸。
寡核苷酸壳的寡核苷酸可以以多个方向取向。在一些实施方案中，寡核苷酸径向向外取向。这些寡核苷酸的取向可以是相对于核的5’远端/3’末端，或者相对于核的3’远端/5’末端，或者围绕核侧向取向。在一个实施方案中，在单一SNA的相同表面上存在一种或多种不同的寡核苷酸。在所有情况下，在表面上存在至少1种寡核苷酸，但可以存在多至10,000种。
寡核苷酸可以直接地或通过接头间接地与核或与彼此和/或与其它分子(诸如活性剂)连接。寡核苷酸可以经由5’末端或3’末端与接头缀合，例如，[序列，5’-3’]-接头或接头-[序列，5’-3’]。纳米结构的一些或全部寡核苷酸可以通过共价或非共价键与彼此直接或间接地连接。一个寡核苷酸与另一寡核苷酸的连接可以是该寡核苷酸与脂质体核的连接的替代或补充。
寡核苷酸壳可以通过一个或多个接头分子锚定至核的表面，所述接头分子包括但不限于：含有一个或多个硫醇的任何化学结构，诸如各种链长的烷烃硫醇、环状二硫醇、硫辛酸或本领域技术人员已知的其它硫醇接头。
在含有脂质体核的一个实施方案中，所述寡核苷酸壳可以通过与一个或多个接头分子缀合而锚定至脂质体核的表面，所述接头分子包括但不限于：生育酚，鞘脂诸如鞘氨醇，磷酸鞘氨醇，甲基化鞘氨醇和二氢鞘氨醇，神经酰胺，神经酰胺磷酸酯，1-0酰基神经酰胺，二氢神经酰胺，2-羟基神经酰胺，鞘磷脂，糖基化鞘脂，硫苷脂，神经节苷脂，磷鞘脂和各种长度和饱和状态的植物鞘氨醇及其衍生物，磷脂诸如磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰胆碱，磷脂酸，溶血磷脂酸，环状LPA，磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰甘油，溶血磷脂酰甘油，磷脂酰丝氨酸，溶血磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，肌醇磷酸盐，LPI，心磷脂，溶血心磷脂，双(单酰基甘油)磷酸盐，(二酰基甘油)磷酸盐，醚脂质，二植烷基醚脂质和各种长度和饱和状态的缩醛磷脂，以及它们的衍生物，固醇诸如胆固醇，去氢胆固醇，豆固醇，羊毛固醇，7-烯胆甾烷醇，薯蓣皂苷配基，谷固醇，酵母固醇，zymostenol，14-脱甲基-羊毛固醇，胆固醇硫酸盐，DHEA，DHEA硫酸盐，14-脱甲基-14-脱氢羊毛固醇，二氢谷固醇，菜油固醇，醚阴离子脂质，醚阳离子脂质，镧系螯合脂质，A-环取代氧化固醇，B-环取代氧化固醇，D-环取代氧化固醇，侧链取代氧化固醇，双取代氧化固醇，胆石酸衍生物，氟化固醇，荧光固醇，磺化固醇，磷酸化固醇和不同长度、饱和状态的多不饱和固醇，及其衍生物。
寡核苷酸还可以通过嵌入核(脂质体核)中与核缔合，或者其可以间接地(即，通过其它分子(诸如接头)非共价地或共价地)或直接地(即，共价地)附接或连接。
本发明还包括涉及任何一种组分或组分集合的物品。在一些实施方案中，所述物品是试剂盒。所述物品包括在一个或多个容器中的本发明的药物或诊断级化合物。所述物品可以包括推广或描述本发明的化合物的使用的说明书或标签。
如本文所用，“推广”包括与治疗炎性病症相关的与本发明的组合物相关的所有商业方法，包括教育方法、医院和其它临床指导、制药行业活动(包括药物销售)，以及任何广告或其它推广活动，包括任何形式的书面、口头和电子通信。
“说明书”可以定义推广的组件并且通常涉及在本发明的组合物的包装上或与其有关的书面说明书。说明书还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明书。
因此，在一些实施方案中，本文所述的试剂可以组装成药用或诊断或研究试剂盒以促进其在治疗、诊断或研究应用中的使用。试剂盒可以包括容纳本发明的组分的一个或多个容器和使用说明书。具体地，此类试剂盒可以包括本文所述的一种或多种试剂，以及描述这些试剂的预期治疗应用和适当施用的说明书。在某些实施方案中，试剂盒中的试剂可以为适于特定应用和适于试剂施用方法的药物制剂或药物组合物和剂量。
试剂盒可以被设计成有利于医师使用本文描述的方法并且可以采用多种形式。在适用的情况下，试剂盒的每种组合物可以以液体形式(例如，在溶液中)或以固体形式(例如，干粉)提供。在某些情况下，一些组合物可以是可构成的或以其它方式可加工的(例如，加工成活性形式)，例如，通过添加合适的溶剂或其它物类(例如，水或细胞培养基)，其可以与或可以不与试剂盒一起提供。如本文所用，“说明书”可以限定说明和/或推广的组分，并且通常涉及在本发明的包装上或与其有关的书面说明书。说明书还可以包括以使得使用者将清楚地认识到说明书与该试剂盒有关的任何方式提供的任何口头或电子说明书，例如，音像(例如，录像带、DVD等)、因特网和/或基于网络的通信等。书面说明书可以是由管理药品或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式，所述说明书还可以反映机构对用于人施用的制造、使用或销售的许可。
试剂盒可以在一个或多个容器中含有本文所述的任何一种或多种组分。作为实例，在一个实施方案中，试剂盒可以包括用于混合试剂盒的一种或多种组分和/或分离和混合样品并施用于受试者的说明书。试剂盒可以包括容纳本文所述的试剂的容器。所述试剂可以无菌制备，包装在注射器中并冷藏运送。或者，其可以被容纳于小瓶或其它用于储藏的容器中。第二容器可以具有无菌制备的其它试剂。或者，试剂盒可以包括在注射器、小瓶、管或其它容器中预混合并运送的活性剂。
试剂盒可以具有多种形式，诸如泡罩袋(blister pouch)、收缩包装袋(shrinkwrapped pouch)、真空可密封袋、可密封的热成型盘或类似的袋或盘形式，其中附件松散地包装在袋、一个或多个管、容器、盒或包中。在添加附件之后，可以对试剂盒进行灭菌，由此允许容器中的各个附件以其它方式解开。可以将试剂盒使用任何合适的灭菌技术(诸如辐射灭菌、热灭菌或本领域已知的其它灭菌方法)来灭菌。根据具体应用，试剂盒还可以包括其它组分，例如，容器、细胞培养基、盐、缓冲剂、试剂、注射器、针、用于涂敷或去除消毒剂的织物(诸如纱布)、一次性手套、施用前的试剂载体等。
试剂盒的组合物可以作为任何合适的形式提供，例如，作为液体溶液或经干燥的粉末提供。当提供的组合物是干粉末时，可以通过添加合适的溶剂(其也可以被提供)来重构粉末。在要求组合物的液体形式的一些实施方案中，液体形式可以是浓缩的或即用的。溶剂将取决于化合物和使用或施用模式。用于药物组合物的合适溶剂是众所周知的并且可在文献中获得。所述溶剂将取决于化合物和使用或施用模式。
在一组实施方案中，试剂盒可以包括被隔室化以封闭限制的方式接受一个或多个容器装置(诸如小瓶、管等)的载体装置，每个容器装置包含待用于所述方法中的一个单独元件。例如，容器之一可以包含用于测定的阳性对照。另外地，试剂盒可以包括用于可用于测定的其它组分(例如，缓冲剂)的容器。
本发明还涵盖成品的包装和标记的药物产品。该制品包括在适当器皿或容器(例如玻璃小瓶或其它密封容器)中的适当的单位剂型。在适于肠胃外施用的剂型的情况下，活性成分是无菌的并且适于作为不含颗粒的溶液施用。换言之，本发明涵盖肠胃外溶液和冻干粉末两者，每种都是无菌的，并且后者适于在注射前重构。或者，单位剂型可以是适于经口、经皮、局部或粘膜递送的固体。
在一个优选实施方案中，单位剂型适于静脉内、肌内或皮下递送。因此，本发明涵盖适于每种递送途径的溶液，优选无菌溶液。
与任何药物产品一样，包装材料和容器被设计用于在储存和运输期间保护产品的稳定性。此外，本发明的产品包括建议医师、技术人员或患者如何适当地预防或治疗炎性疾病或病症的使用说明书或其它信息材料。换言之，制品包括指示或建议给药方案(包括但不限于实际剂量)、监测程序和其它监测信息的说明装置。
更具体地，本发明提供了制品，其包括包装材料，诸如盒、瓶、管、小瓶、容器、喷雾器、吹入器、静脉内(i.v.)袋、封套(envelope)等；以及包含在所述包装材料中的药物试剂的至少一种单位剂型。本发明还提供了制品，其包含包装材料，诸如盒、瓶、管、小瓶、容器、喷雾器、吹入器、静脉内(i.v.)袋、封套等；以及包含在所述包装材料中的每种药物试剂的至少一种单位剂型。本发明还提供了制品，其包含包装材料，诸如盒、瓶、管、小瓶、容器、喷雾器、吹入器、静脉内(i.v.)袋、封套等；以及包含在所述包装材料中的每种药物试剂的至少一种单位剂型。本发明进一步提供了制品，其包含用于注射制剂的针或注射器(优选以无菌形式包装的)，和/或包装的醇垫。
本发明在其应用方面不限于以下描述中所述或附图中所示结构细节和组件布置。本发明能够具有其它实施方案并且能够以多种方式实践或实施。另外，本文中使用的措辞和术语是出于描述目的并且不应被视为限制。本文中“包括”、“包含”、或“具有”、“含有”、“涉及”及其变形的使用意指涵盖其后所列出的项目及其等同物以及额外的项目。
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。此类等同方案旨在涵盖于所附权利要求书中。
本文公开的所有参考文献，包括专利文献，均以其整体通过引用并入本文。
实施例
实施例1.呈递用于特异性敲低白介素17受体mRNA的反义寡核苷酸(ASO)的脂质体 球形核酸(SNA)构建体
结果
实验1.使用靶向的SNA的体外IL-17RA mRNA敲低
将HFK细胞用294种呈递一种ASO序列的SNA处理(所述序列各自在表1中)，并且通过qRT-PCR测量人IL-17RA mRNA表达。这进行两次，并且选择在多次测定中显示IL-17RAmRNA的最大抑制且具有低脱靶效应的三种SNA，用于通过化学修饰进一步优化。将HFK细胞用呈递IL17RA_219、IL17RA_282、IL17RA_285或非互补对照的一种ASO序列的SNA以较大剂量范围进行处理。靶向的SNA表明剂量依赖性方式的靶标特异性mRNA抑制，而非互补对照SNA在所有测试浓度下都没有相当大的抑制(图1)。靶向的SNA在HEKa细胞中表明类似的IL-17RA mRNA抑制。将剂量-响应数据分析为非线性拟合和计算半数最大抑制浓度(IC50)导致IL17RA_285、IL17RA_219和IL17RA_282的IC50值分别为124.2、9.57和34.64nM。这些结果表明，靶向IL-17RA mRNA的SNA可以在HFK细胞中以特异性方式有效地抑制基因表达。
实验2.在人皮肤等效物EpiDerm-FTTM中使用局部应用的靶向的SNA的IL-17RAmRNA敲低
用呈递靶向人IL-17RA mRNA的ASO序列IL17RA_219或IL17RA_282的SNA局部处理的人皮肤等效模型导致靶mRNA特异性抑制。在考虑实验1中收集的效力数据之后，选择IL17RA_219和IL17RA_282作为用于进一步测试的先导候选化合物。ASOs IL17RA_219和IL17RA_282表现出IC50值的最佳组合、与其它人mRNA序列(如通过BLAST测定)的同源性和跨物种保守性。在用呈递ASO IL17RA_219或ASO IL17RA_282的SNA局部处理48小时的人皮肤等效组织中，IL-17RA mRNA表达降低。用呈递对照ASO的SNA处理的组织未表明IL-17RAmRNA表达的明显降低，如通过qRT-PCR所测量(图2)。此外，在多至20μM DNA浓度，IL17RA_219和IL17RA_282在HFK中没有表现出毒性，并且在HFK、HEKa细胞和来自四个不同供体的PBMC中没有表现出细胞因子诱导。由于这些原因，选择IL17RA_219和IL17RA_282用于进一步测试。显示局部递送的靶向IL-17RA的SNA特异性抑制人皮肤等效模型中的mRNA表达。
实验3.在人皮肤外植体中使用局部应用的靶向的SNA的离体IL-17RA mRNA敲低
用呈递靶向人IL-17RA mRNA的ASO序列IL17RA_219或ASO序列IL17RA_282的SNA局部处理的人皮肤外植体导致靶mRNA特异性抑制。在用呈递ASO IL17RA_219或ASO IL17RA_282的SNA局部处理96小时的人皮肤外植体活检样品中，IL-17RA mRNA表达降低。用呈递对照ASO的SNA处理的活检样品未表明IL-17RA mRNA表达的明显降低，如通过qRT-PCR所测量(图3)。局部递送的靶向IL-17RA的SNA可以特异性抑制人皮肤外植体中的mRNA表达。
实验4.使用SNA的混合物的TNF mRNA敲低
将呈递抗-TNF或抗-IL17RA ASO序列的SNA混合在一起并共同施用于HFK细胞。混合SNA表明对应于ASO序列同一性的靶mRNA特异性敲低(图4，图5)。
图4显示用抗-TNF-SNA和抗-IL17RA-SNA的混合物处理的HFK细胞中降低的TNFmRNA表达。图5显示IL17RA mRNA表达在用抗-TNF-SNA和抗-IL17RA-SNA的混合物处理的HFK细胞中降低。用对照-SNA处理的细胞未表明TNF mRNA水平的明显降低。
这些结果表明，靶向多于一种mRNA的SNA的混合物可以共同施用，并且对每种靶标进行基因敲低。
实验5.比较使用多重SNA的TNF mRNA敲低和IL17RA敲低
呈递一种、两种或三种ASO序列的SNA表明对应于ASO序列同一性的HFK细胞中的靶mRNA特异性敲低。只有使用与两种ASO序列多重化的SNA获得数据。显示SNA充当能够呈递多种治疗模式的平台。这些结果表明，靶向多于一种mRNA的ASO序列可以在同一SNA颗粒上共同递送，并且对每种靶标进行基因敲低(图7，图8)。
当两种基因靶标在相关的生物途径中时，对于下游靶标可以观察到累加敲低效应(图8)。已显示TNF和IL17A细胞因子信号传导在其促炎特性中具有累加和协同效应(3)。这种关系表明共有或高度相关的信号传导途径，尽管确切的关系还不完全理解(4)。靶向TNF细胞因子的mRNA以及IL17A的受体，即IL17RA。分泌的TNF细胞因子的减少可能对IL17RA受体转换和表达具有影响。
材料和方法
反义序列设计.靶向人IL-17RA mRNA(GeneBank登录号NM_014339.6)的长度为18个核苷酸的反义序列基于以下参数确定：Sfold算法(2)、％GC含量、与起始密码子的接近度和CpG基序的排除(表1)。除非另有说明，否则反义寡核苷酸序列被分成3个区域：内部的硫代磷酸酯连接的“缺口”区域，其侧接两个外部的2′-O-甲基“翼”。该‘缺口体’序列在3′末端用两个连续的六(乙二醇)间隔物和末端胆固醇修饰。
反义寡核苷酸合成.在Bioautomation MerMade 48寡核苷酸合成仪上采用通用UnyLinker Support (ChemGenes)以1μmol规模合成所有寡核苷酸。DNA、RNA、2′-O-Me单体、六(乙二醇)间隔物和胆固醇修饰剂获得自ChemGenes Corporation。标准DNA碱基的偶联时间为1分钟，且修饰碱基的偶联时间为3分钟。键是标准磷酸二酯或用以1:1二甲基吡啶:ACN中的0.2M苯基乙酰基二硫化物(PADS)作为硫化剂的硫代磷酸酯。以5′至3′方向去除DMT进行合成。在合成之后，将寡核苷酸从支持物裂解，并使用氢氧化铵和乙醇的4:1混合物在55℃下脱保护16小时。经由高效液相色谱(HPLC)技术纯化寡核苷酸。使用IDTOligoAnalyzer测定分子量和消光系数。使用基质辅助激光解吸/电离(MALDI)进行寡核苷酸分子量的验证。通过微量读板器(BioTek)上的260nm处的UV-吸光度以及来自IDTOligoAnalyzer的计算的消光系数测定寡核苷酸浓度。将所有寡核苷酸使用0.2μm注射器过滤器(VWR)无菌过滤。寡核苷酸序列列于表1中。
脂质体合成.通过使用具有50nm孔的47mm直径聚碳酸酯膜(Sterlitech)挤出在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)(137mM NaCl，10mM磷酸盐，2.7mM KCl，pH 7.4，Hyclone)中水合的1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)合成脂质体。使用Malvern Zetasizer Nano(Malvern Instruments)，使用动态光散射测量脂质体直径。使用磷脂测定试剂盒(Sigma)测定脂质浓度。
细胞培养.将人新生儿包皮角质形成细胞(HFK)和成人表皮角质形成细胞(HEKa)在补充有人角质形成细胞生长补充剂(Life Technologies)、0.07mM CaCl2、10μg/mL庆大霉素和0.25μg/mL两性霉素B的M154培养基(Life Technologies)中培养。将细胞在5％CO2湿化培养箱中在37℃下维持。将来自四个不同供体的新鲜原代人外周血单核细胞(PBMC)(Zenbio)在补充有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50mg/mL链霉素的RPMI中培养。将细胞在5％CO2湿化培养箱中在37℃下维持。
EpiDerm-FTTM人皮肤等效培养.人皮肤等效模型EpiDerm-FTTM(Mattek)组织根据制造商的说明培养。简言之，在接受后，将组织与供应的维持培养基在5％CO2湿化培养箱中在37℃下孵育过夜。第二天，以及在此后每天(持续实验的期间)，用新鲜培养基替换培养基。在整个实验期间中，将组织在5％CO2湿化培养箱中在37℃下维持。
人皮肤外植体培养.在接受后，清洁新鲜的人皮肤外植体(Zenbio)。从外植体取出8mm冲压活检样品并置于trans-well支架中用于培养。将补充有2％FBS、10μg/mL庆大霉素和0.25μg/mL两性霉素B的DMEM供应至活检样品的下侧，并且持续实验的期间每天更换。在整个实验期间中，将活检样品在5％CO2湿化培养箱中在37℃下维持。
SNA合成.通过将100X摩尔过量(除非另有说明)的胆固醇修饰的寡核苷酸混合成PBS中的脂质体悬浮液并将其在4℃下避光储存过夜来配制SNA。将294种不同的寡核苷酸(表1)(尤其靶向人IL-17RA mRNA)和具有相同长度和与已知人基因没有任何互补性(通过BLAST证实)的‘缺口体’化学方案的对照寡核苷酸用于合成过程。
多重SNA合成.通过将200X摩尔过量(除非另有说明)的胆固醇修饰的寡核苷酸混合成PBS中的脂质体悬浮液并将其在4℃下避光储存过夜来配制SNA。四种不同的寡核苷酸用于合成过程：靶向人IL-17RA的反义寡核苷酸，靶向人TNF的反义寡核苷酸，靶向人IL22RA1的反义寡核苷酸，以及与已知基因没有任何互补性(通过BLAST证实)的相同长度对照寡核苷酸。对于单重SNA，寡核苷酸群体由33％靶向的反义寡核苷酸和66％对照寡核苷酸组成。对于含有两种不同靶向的反义寡核苷酸的多重SNA，寡核苷酸群体由33％的每种靶向的反义寡核苷酸和剩余的33％对照寡核苷酸组成(图6)。对于含有三种不同靶向的反义寡核苷酸的多重SNA，寡核苷酸群体由33％的每种靶向的反义寡核苷酸组成。对照SNA由100％的对照寡核苷酸组成(图6D)。
细胞培养研究.将HFK在第5代在96孔组织培养板中以17,000个细胞/孔的细胞密度接种。将HEKa细胞在第5代在96孔组织培养板中以17,000个细胞/孔的细胞密度接种。新鲜PBMC通过离心从细胞悬浮液分离，并在96孔组织培养板中以200,000个细胞/孔的细胞密度接种。在铺板后，使细胞在培养箱中静置过夜。在新鲜维持培养基中，将细胞用IL-17RA靶向的反义SNA或非互补对照SNA(通过NCBI Blast证实)(包含相同的‘缺口体’设计和3'-化学修饰)处理。除非另有说明，否则所有处理都持续24小时。
对于人皮肤等效模型EpiDerm-FTTM和人皮肤外植体组织，以生物学一式三份应用处理。将组织用呈递IL17RA_219ASO的SNA、呈递IL17RA_282ASO的SNA、呈递非互补对照ASO的SNA局部处理或未处理。将EpiDerm-FTTM组织处理48小时，并将人皮肤外植体组织处理96小时。
对于多重SNA实验，将HFK在第5代在96孔组织培养板中以17,000个细胞/孔的细胞密度接种。在铺板后，使细胞在培养箱中静置过夜。在新鲜维持培养基中，将细胞用IL-17RA靶向的反义SNA、TNF靶向的反义SNA、靶向多于一种转录物的多重SNA或非互补对照SNA(通过NCBI Blast证实)(包含相同的‘缺口体’设计和3'-化学修饰)以1000、100、10和1nM的浓度一式三份处理。
活力测定.对于活力研究，将HFK在第5代在96孔组织培养板中以15,000个细胞/孔的细胞密度接种。在铺板后，使细胞在培养箱中静置过夜。将细胞用IL-17RA靶向的反义SNA或非互补对照(通过NCBI Blast证实)(包含相同的‘缺口体’设计和3'化学修饰)以20、10、2和1μM的浓度一式三份处理24小时。简言之，除去处理并用试剂于M154维持培养基中的10％溶液替换。将细胞在5％CO2湿化的培养箱中在37℃下孵育3小时，然后用微量读板器(BioTek)测量每个孔的荧光(激发570nm，发射585nm)。通过比较每种处理的荧光值与未处理细胞的那些来计算百分比活力。
细胞因子Q-Plex阵列.在处理24小时之后，通过离心沉淀96孔组织培养板中的细胞；将上清液转移至新板并在-80℃下储存。使用Q-Plex化学发光阵列(Quansys)遵循制造商的说明书进行上清液的细胞因子定量。每个板都是定制的，以允许检测每个孔内的IL-12p40、TNF、IP-10、IL-6、RANTES、IL-4、IL-5、IL-10、IL-17、IL-22和MCP-1。简言之，使用已知浓度的细胞因子储备物并将其如所示稀释来制备标准曲线。将细胞培养上清液使用提供的样品缓冲液1:2稀释。将细胞培养物样品和标准曲线样品添加至96孔Q-plex板中并在室温下振荡孵育1小时。然后将板用提供的洗涤缓冲液洗涤三次。然后将50μL提供的检测混合物添加至每个孔中，并将板在室温下再次振荡孵育1小时。再次，将板用洗涤缓冲液洗涤三次，随后与50μL提供的链霉抗生物素蛋白-HRP溶液在室温下振荡孵育15分钟。最后，将板在洗涤缓冲液中洗涤六次，并将50μL制备的底物添加至每个孔中。在15分钟内，将板使用Bio-Rad ChemiDoc XRS+成像仪成像，并使用Q-view软件(Quansys)分析。对于每种个别细胞因子，将所有数据拟合至标准曲线，并与未处理的细胞相比作图。
RNA提取和定量逆转录酶聚合酶链反应(qRT-PCR).在转染后24小时，将HFK和HEKa细胞在RLT缓冲液(Qiagen)中裂解。在处理48和96小时时，将EpiDerm-FTTM组织和人皮肤外植体组织分别在RLT缓冲液中珠粒均质化。使用RNEasy 96孔试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明从裂解物分离RNA。然后使用cDNA High Capacity逆转录试剂盒(Life Technologies)从RNA分离物合成cDNA。将样品在热循环仪上在25℃下运行10分钟，在37℃下运行90分钟，在85℃下运行5分钟并保持在4℃下以产生cDNA。384孔光学反应板(Roche)的每个反应孔使用6μL合成的cDNA、4.66μL LightCycler480探针主混合物(Roche)、0.47μL靶标特异性FAM-标记的探针和引物和0.37μL人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)特异性HEX-标记的探针和引物进行qPCR。IL-17RA的引物和探针组购自ThermoFisher Scientific(目录号Hs01064648_m1)。TNF和GAPDH的引物和探针组使用已知的人类基因组序列(分别为NCBI参考序列NM_000594.3和NM_002046.5)设计，并通过“blastn”分析(NCBI)发现是特异性的。用于TNF的寡核苷酸序列是：正向5′-GCT GCA CTT TGG AGT GAT CG-3′(SEQ ID NO:1)，反向5′-GTT TGCTAC AAC ATG GGC TAC AG-3′(SEQ ID NO:2)，探针5′-FAM-CCC AGG CAG TCA GAT CAT CTTCTC GA-BHQ1-3′(SEQ ID NO:3)。用于GAPDH的寡核苷酸序列是：正向5′-CAA GGT CAT CCATGA CAA CTT TG-3′(SEQ ID NO:4)，反向5′-GGG CCA TCC ACA GTC TTC T-3′(SEQ ID NO:5)，探针5′-HEX-ACC ACA GTC CAT GCC ATC ACT GCC A-BHQ1-3′(SEQ ID NO:6)。FAM是6-荧光素亚酰胺，HEX是六氯-荧光素，且BHQ1是黑洞猝灭剂1。技术上一式两份的qPCR反应在Roche Lightcycler 480上在以下条件下进行：在95℃下初始变性10分钟，且然后50个循环的在95℃下变性10秒，在60℃下退火30秒和在72℃下延伸1秒。通过二阶导数法分析来获得Cp值。通过用管家基因(GAPDH)归一化和ΔΔ-Ct方法来确定相对基因表达。将每种处理与其各自的浓度对照进行比较。
表1.寡核苷酸序列
寡核苷酸中使用的特殊碱基如下：mN＝2′O-甲基RNA，/iSp18/＝六(乙二醇)间隔物，*＝硫代磷酸酯，/3CholTEG/＝3′胆固醇
表2.寡核苷酸序列
寡核苷酸中使用的特殊碱基如下：mN＝2′O-甲基RNA，/iSp18/＝六(乙二醇)间隔物亚磷酰胺，*＝硫代磷酸酯，/3CholTEG/＝3′胆固醇
实施例2.使用在凝胶媒介物中配制的SNA在人皮肤中的IL-17RA mRNA敲低
方法和材料
组织培养.在实验开始当天接受从单个供体新鲜获取的健康人离体皮肤并立即制备。在使用前，检查皮肤，注意除去广泛妊娠纹或疤痕的任何区域和具有可见孔或损伤的任何切片。使用皮区来从供体样品切除全厚度皮肤。所得组织含有完整的角质层、表皮和真皮。没有剩余来自外科外植体的皮下组织。将皮肤小心地切成适当尺寸，并且当将皮肤置于Franz室中时小心不要拉伸皮肤。然后将皮肤夹至Franz室中。接下来，将搅拌棒和已经预温热至37℃的接受介质添加至每个Franz室中。接受培养基由以下组成：Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基，其补充有2％胎牛血清、50U/mL青霉素、50mg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B和10μg/mL庆大霉素。使Franz室、外植体和接受介质平衡最少30分钟，其后每个室中培养基的温度被验证为37±1℃。除去在组装细胞期间引入的任何气泡。在开始研究前通过倒置细胞来证实皮肤的完整性。如果鉴定到泄漏，则重新定位皮肤和供体室，直至泄漏不存在。在实验过程中，将皮肤在环境湿度和32℃的表皮表面温度下维持，其使用含有接触外植体的真皮部分的细胞培养基的受体室的37℃水-外套进行调节。
SNA合成.采用标准UniLinker支持物(ChemGenes)以1毫摩尔规模合成寡核苷酸。DNA、2′-O-Me RNA单体和六(乙二醇)间隔物获得自ChemGenes Corporation。胆固醇修饰剂获得自Glen Research。键是标准磷酸二酯或用0.2M苯基乙酰基二硫化物(PADS)于1:1二甲基吡啶:ACN的混合物中的溶液制备的硫代磷酸酯。以3′至5′方向去除DMT进行合成。在合成之后，将寡核苷酸从支持物裂解，并使用氢氧化铵和乙醇的4:1混合物在55℃下脱保护16小时。经由高效液相色谱(HPLC)技术纯化寡核苷酸。使用IDT OligoAnalyzer计算分子量和消光系数。使用电喷雾电离质谱(ESI-MS)进行寡核苷酸产物分子量的验证。最后，在微量读板器(BioTek)上通过260nm处的UV吸光度测定寡核苷酸浓度。
通过首先将250mg 1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)溶解于氯仿中至50mg/mL的最终浓度来配制脂质体。然后在氮气下除去溶剂以形成薄脂质膜。将膜冻干过夜以确保除去所有溶剂。随后将脂质膜用10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)水合，并使用超声/冷冻-破裂来形成大的单层囊泡。然后将这些囊泡通过微流化器以多至25kpsi连续均质化，直至达到20nm的期望平均数直径。使用胆碱定量测定法测定脂质体浓度，并通过动态光散射(DLS)测量粒径和分散度。
通过将30倍摩尔过量的胆固醇修饰的寡核苷酸SEQ ID NO:288混合成PBS中的脂质体悬浮液、随后在4℃下孵育过夜来配制靶向人IL-17RA的SNA(即化合物IL17RA_282)。
药物应用于皮肤.使用凝胶媒介物来将IL17RA_282应用于皮肤。将预配制的SNA混合到凝胶媒介物中，导致0、0.00007和0.007％w/w(寡核苷酸重量)的三种药物产品强度。这些药物产品的组成可以在表3中找到。
然后将这些药物产品局部应用于皮肤外植体。在使用移液管尖端给药前将药物产品短暂混合。使用正排量移液管将40μL每种药物产品局部给药至每个Franz室。使用移液管尖端均匀地涂覆药物产品，覆盖皮肤的整个暴露表面区域(1.0cm2)。在给药之后，将取样口堵塞以防止在研究期间的溶剂蒸发。记录实际的给药时间，并将外植体在环境湿度和32℃的表皮表面温度下维持24小时。
RNA提取和qRT-PCR.在24小时孵育时段结束时，拆开Franz室并从每个室中小心地取出皮肤。用PBS润湿的棉拭子用于除去药物产品，且然后将应用区域印干。使用4mm活检冲压器从1.0cm2给药区域切下三个样品。在取活检冲压的同时，没有拉伸皮肤。然后用珠粒匀浆器在RLT缓冲液(Qiagen)中裂解活检冲压物。使用RNEasy 96孔试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明从裂解物分离RNA。然后使用cDNA high capacity逆转录试剂盒(LifeTechnologies)从RNA分离物合成cDNA。在热循环仪上用以下温度程序制备cDNA：25℃持续10分钟，37℃持续90分钟，85℃持续5分钟，随后4℃保持。将所得cDNA用无核酸酶的水稀释8倍。384孔光学反应板(Roche)的每个反应孔使用6μL稀释的cDNA、4.66μL LightCycler480探针主混合物(Roche)、0.47μL人IL-17RA特异性FAM-标记的探针和引物和0.37μL人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)特异性HEX-标记的探针和引物进行qPCR。IL-17RA的引物和探针组是商业购买的(Hs01064648_m1,Thermo Fisher Scientific)。GAPDH的引物和探针组使用已知的人类基因组序列(NCBI参考序列NM_002046.5)设计，并通过“blastn”分析(NCBI)发现是特异性的。用于GAPDH的寡核苷酸序列是：正向5′-CAA GGT CAT CCA TGA CAA CTTTG-3′(SEQ ID NO:4)，反向5′-GGG CCA TCC ACA GTC TTC T-3′(SEQ ID NO:5)，探针5′-HEX-ACC ACA GTC CAT GCC ATC ACT GCC A-BHQ1-3′(SEQ ID NO:6)。技术上一式两份的qPCR反应在Roche Lightcycler 480上在以下条件下进行：在95℃下初始变性10分钟，且然后50个循环的在95℃下变性10秒，在60℃下退火30秒和在72℃下延伸1秒。通过二阶导数法分析来获得Cp值。通过用管家基因(GAPDH)归一化和ΔΔ-Ct方法来确定相对基因表达。通过进行单向ANOVA完成统计分析。
蛋白质分离和Western印迹.用丙酮沉淀从活检裂解物中分离总蛋白质。合并来自每个处理组的裂解物，然后分离蛋白质以增加蛋白质产量。简言之，将四体积的冰冷丙酮添加至裂解物中并在-20℃下孵育30分钟。将样品离心并倾析，并将沉淀用一体积冰冷乙醇洗涤。再次，将样品离心并使沉淀风干。将沉淀重悬浮于一个体积含有1％β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液中。为了确保完全溶解样品，将它们在95℃下煮沸10分钟，且随后离心以除去任何未溶解的碎片。
将蛋白质分离物上样至10％SDS-PAGE凝胶中，运行并过夜转移(22V)至ImmobilonPSQ PVDF膜(ISEQ00010,Millipore)。将膜用含有Tween 20的tris缓冲盐水(所得缓冲液被称为TBST)中的5％奶粉封闭1小时，随后在TBST中洗涤5分钟。靶向IL-17RA或β-肌动蛋白蛋白质的人特异性抗体用于探测那些特定蛋白质的存在。IL-17RA蛋白质使用抗IL-17RA兔单克隆一抗检测，并显示检测到具有150kDa的预测分子量的蛋白质(12661,CellSignaling)。在使用前，将该抗体以1:500的比率稀释于封闭缓冲液(TBST中的5％奶粉)中。β-肌动蛋白蛋白质使用抗β-肌动蛋白兔单克隆一抗检测，并显示检测到具有45kDa的预测分子量的蛋白质(4970,Cell Signaling)。在使用前，将该抗体以1:1000的比率稀释于封闭缓冲液中。一抗孵育在4℃下发生过夜。
在孵育时段之后，将膜用TBST冲洗两次，随后连续两次用TBST洗涤15分钟和5分钟。接下来，在使用前将膜与以1:1000的比率稀释于封闭缓冲液中的抗-兔HRP二抗(7074,Cell Signaling)孵育。二抗孵育在室温下发生90分钟。然后，将膜用TBST冲洗两次，随后连续两次用TBST洗涤15分钟和5分钟。然后，将膜用蒸馏水进一步洗涤两次，持续5分钟。随后，将GE Amersham Prime ECL试剂(RPN2232)添加至膜中并在室温下孵育5分钟。然后，将膜在BioRad GelDoc成像仪上使用20秒的曝光间隔成像多至2分钟。最后，通过光密度测定法分析图像，并将IL-17RA信号针对β-肌动蛋白信号归一化，以比较处理间的表达水平。
表3.药物产品组成
结果
在凝胶媒介物中配制为药物产品的IL-17RA mRNA靶向的SNA(化合物IL17RA_282)显示在仅24小时处理之后IL-17RA mRNA在健康人皮肤外植体中的剂量依赖性敲低(图9)。当与未处理的皮肤和0％强度药物产品相比时，观察到敲低。通过单向ANOVA，与未处理的(p＝0.0011)和0％强度药物产品(p<0.0001)相比，用0.007％强度药物产品处理导致统计学显著的IL-17RA mRNA抑制。在凝胶媒介物中配制为药物产品的IL-17RA mRNA靶向的SNA(化合物IL17RA_282)显示在仅24小时处理之后在健康人皮肤外植体中IL-17RA蛋白质表达的抑制(图10)。当与未处理的皮肤和0％强度药物产品相比时，观察到敲低。该图代表从western印迹收集的分析的密度测定数据(插图)。对于用0.0007％凝胶处理的皮肤样品，没有足够材料来进行蛋白质-水平分析。
讨论和结论
临床数据表明IL-17信号传导途径在维持银屑病疾病状态中起重要作用。尽管目前的单克隆抗体疗法，如布罗达单抗(brodalumab)，提供了非常有效的治疗选择，但它们也呈现令人不安的副作用概况。这呈现对更安全的替代方案的治疗需求。反义技术可以降低细胞中mRNA的表达；然而，反义寡核苷酸通常至细胞和皮肤中的摄取较差。相反，已发现当寡核苷酸以SNA几何形状排列时，它们表现出皮肤渗透概况和增加的细胞摄取。鉴于这些优点和对于银屑病治疗的治疗需求，在皮肤中靶向人IL-17RA的基于反义SNA的疗法可以证明是治疗银屑病的有效治疗。
此处已经显示，当将在凝胶媒介物中配制为药物产品的IL-17RA mRNA靶向的SNA(化合物IL17RA_282)局部应用于健康的人皮肤外植体时，存在在IL-17RA mRNA和蛋白质的水平上都观察到药效动力学效果。增加药物产品的强度导致IL-17RA表达降低。
在该研究中观察到的响应仅代表24小时处理。预期用多个剂量的更长治疗将进一步增强观察到的抑制。鉴于IL-17信号传导在维持银屑病中观察到的疾病状态中的重要性，呈现了用于治疗银屑病的强烈局部药物候选物。
实施例3.使用在凝胶媒介物中配制的SNA在人银屑病皮肤中的IL-17RA mRNA敲低
方法和材料
组织培养.从8名具有轻度至中度斑块状银屑病的不同患者中的每一名获得四个皮肤活检样品(3mm直径)。活检样品直接取自银屑病斑块。由于可以从单个患者获取的活检样品的数量有限，每个个体仅取4个活检样品。以约45分钟间隔从志愿者获取活检样品并运输至实验室(卷在潮湿的无菌纱布中)。在取活检样品和开始孵育之间的时间为5至7.5小时。将活检样品定位于插入孔的膜中，并在32℃下在环境CO2和湿度下在12孔板中孵育。将膜浸入1mL细胞培养基(Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基、1％胎牛血清、1.25μg/mL两性霉素B、50μg/mL庆大霉素和0.1U/mL青霉素/链霉素)中，使得真皮接触孔中的培养基并将表皮暴露于空气。每孔存在1个活检样品。使用两个无菌1mL移液器尖端升高12孔板的盖子以限制水分积聚。药物产品处理的皮肤的总孵育时间为21小时15分钟。
SNA合成.寡核苷酸SEQ ID NO:288经由标准固相亚磷酰胺化学合成。用连续循环的脱保护、单体添加、加帽和氧化来合成该分子。DNA和2′-O-Me RNA单体获得自SigmaAldrich Biochemie(Germany)。六(乙二醇)间隔物和胆固醇修饰剂获得自ChemGenesCorporation。键是标准磷酸二酯或用0.2M苯基乙酰基二硫化物(PADS)于1:1二甲基吡啶:ACN的混合物中的溶液制备的硫代磷酸酯。以3′至5′方向去除DMT进行合成。在合成之后，将寡核苷酸从支持物裂解，并使用氢氧化铵和乙醇的3:1混合物在65℃下脱保护17小时。经由阴离子交换高效液相色谱(AX-HPLC)技术纯化寡核苷酸。然后将寡核苷酸溶液完全冻干成干粉。使用电喷雾电离质谱(ESI-MS)进行寡核苷酸产物分子量的验证，并进行双重-MS测序以证实寡核苷酸序列。通过260nm处的UV吸光度测定寡核苷酸浓度。
通过Avanti Polar Lipids(Alabama,USA)配制脂质体。首先，将500g 1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)溶解于氯仿中至50mg/mL的最终浓度。然后在氮气下除去溶剂以形成薄脂质膜。将膜冻干过夜以确保除去所有溶剂。随后将脂质膜用Hyclone无菌、无核酸酶的水(SH30538.03,GE)以100mg/mL的浓度水合，并使用超声/冷冻-破裂来形成大的单层囊泡。然后将这些囊泡通过微流化器以多至25kpsi连续均质化，直至达到20nm的平均数直径。将脂质体溶液通过切向流过滤(TFF)进一步浓缩至208mg/mL的最终脂质浓度。使用胆碱定量测定和核磁共振光谱学测定脂质浓度。通过动态光散射(DLS)测量粒径和分散度。
通过将30倍摩尔过量的胆固醇修饰的全长寡核苷酸混合成Hyclone无菌、无核酸酶的水(SH30538.03,GE)中的脂质体悬浮液、随后在4℃下孵育过夜来配制靶向人IL-17RA的SNA。
药物应用于皮肤.将预配制的靶向人IL-17RA的SNA混合到凝胶媒介物中，导致0、0.01、0.1和1.0％w/w(全长寡核苷酸重量)的四种IL17RA_282凝胶强度。这些药物产品的组成可以在表4中找到。
然后将IL17RA_282凝胶局部应用于皮肤外植体，重复8次。在样品处理期间，1.0％组中的一个样品丢失，导致该组仅重复7次。每个重复取自不同的患者，用于准确代表和比较患者特异性响应。在使用移液管尖端给药前将IL17RA_282凝胶短暂混合。使用正排量移液管将10μL每种药物产品局部给药至每个3mm活检样品。使用移液管尖端均匀地涂覆药物产品，覆盖皮肤的整个暴露表面区域。记录实际的给药时间，并将外植体在32℃和环境湿度下维持21小时。
在21小时孵育时段结束时，从每个膜除去活检样品。用PBS润湿的棉拭子用于除去药物产品，且然后将应用区域印干。将活检冲压物用珠粒均质器在RLT缓冲液(Qiagen)中裂解，并在-80℃下冷冻储存，直至在干冰上运送至研究设施。
RNA提取和qRT-PCR.使用RNEasy 96孔试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明从裂解物分离RNA。然后使用cDNA high capacity逆转录试剂盒(Life Technologies)从RNA分离物合成cDNA。在热循环仪上用以下温度程序制备cDNA：25℃持续10分钟，37℃持续90分钟，85℃持续5分钟，随后4℃保持。将所得cDNA用无核酸酶的水稀释8倍。384孔光学反应板(Roche)的每个反应孔使用6μL稀释的cDNA、4.66μL LightCycler480探针主混合物(Roche)、0.47μL人IL-17RA特异性FAM-标记的探针和引物和0.37μL人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)特异性HEX-标记的探针和引物进行qPCR。IL-17RA的引物和探针组是商业购买的(Hs01064648_m1,Thermo Fisher Scientific)。GAPDH的引物和探针组使用已知的人类基因组序列(NCBI参考序列NM_002046.5)设计，并通过“blastn”分析(NCBI)发现是特异性的。用于GAPDH的寡核苷酸序列是：正向5′-CAA GGT CAT CCA TGA CAA CTT TG-3′(SEQ ID NO:4)，反向5′-GGG CCA TCC ACA GTC TTC T-3′(SEQ ID NO:5)，探针5′-HEX-ACC ACA GTCCAT GCC ATC ACT GCC A-BHQ1-3′(SEQ ID NO:6)。技术上一式两份的qPCR反应在RocheLightcycler 480上在以下条件下进行：在95℃下初始变性10分钟，且然后50个循环的在95℃下变性10秒，在60℃下退火30秒和在72℃下延伸1秒。通过二阶导数法分析来获得Cp值。通过用管家基因(GAPDH)归一化和ΔΔ-Ct方法来确定相对基因表达。通过进行单样本t-检验完成统计分析。
表4.药物产品组成
结果
IL17RA_282凝胶显示在处理21小时之后人银屑病皮肤活检样品中IL-17RA mRNA的剂量依赖性敲低(图11)。当比较含有IL17RA_282的凝胶与0％凝胶强度制剂时，观察到敲低。用IL17RA_282凝胶处理导致IL-17RA mRNA的统计学显著性降低。
讨论和结论
此处显示，当将IL17RA_282凝胶局部应用于离体人银屑病皮肤活检样品时，存在在IL-17RA mRNA的水平上观察到药效动力学效果。在该研究中观察到的响应仅代表21小时处理。预期用多个剂量的更长治疗将进一步增强观察到的抑制。鉴于IL-17信号传导在维持银屑病中观察到的疾病状态中的重要性，呈现了用于治疗银屑病的强烈局部药物候选物。
实施例4.靶向三种不同mRNA的多重SNA
材料和方法
多重SNA合成.通过将100X摩尔过量(除非另有说明)的胆固醇修饰的寡核苷酸混合成PBS中的脂质体悬浮液并将其在4℃下避光储存过夜来配制SNA。四种不同的寡核苷酸用于合成过程：靶向人IL-4R的反义寡核苷酸，靶向人IL-1β的反义寡核苷酸，靶向人CTGF的反义寡核苷酸，以及与已知基因没有任何互补性(通过BLAST证实)的相同长度对照寡核苷酸。对于单重SNA，寡核苷酸群体由33％靶向的反义寡核苷酸和66％对照寡核苷酸组成。对于含有两种不同靶向的反义寡核苷酸的多重SNA，寡核苷酸群体由33％的每种靶向的反义寡核苷酸和剩余的33％对照寡核苷酸组成(图12)。对于含有三种不同靶向的反义寡核苷酸的多重SNA，寡核苷酸群体由33％的每种靶向的反义寡核苷酸组成。对照SNA由100％的对照寡核苷酸组成(图9)。
细胞培养研究.将原代人包皮角质形成细胞(HFK)在第5代在96孔组织培养板中以17,000个细胞/孔的细胞密度接种。在铺板后，使细胞在培养箱中静置过夜。在新鲜维持培养基中，将细胞用IL-4R靶向的反义SNA、IL-1β靶向的反义SNA、CTGF靶向的反义SNA、靶向多于一种转录物的多重SNA或非互补对照SNA(通过NCBI Blast证实)(包含相同的‘缺口体’设计和3'-化学修饰)以1000、100、10和1nM的浓度一式三份处理。除非另有说明，否则所有处理都持续24小时。
RNA提取和定量逆转录酶聚合酶链反应(qRT-PCR).在转染后24小时，将HFK细胞在RLT缓冲液(Qiagen)中裂解。使用RNEasy 96孔试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明从裂解物分离RNA。然后使用cDNA High Capacity逆转录试剂盒(Life Technologies)从RNA分离物合成cDNA。将样品在热循环仪上在25℃下运行10分钟，在37℃下运行90分钟，在85℃下运行5分钟并保持在4℃下以产生cDNA。384孔光学反应板(Roche)的每个反应孔使用6μL合成的cDNA、4.66μL LightCycler480探针主混合物(Roche)、0.47μL靶标特异性FAM-标记的探针和引物和0.37μL人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)特异性HEX-标记的探针和引物进行qPCR。IL-4R、IL-1β和CTGF的引物和探针组购自ThermoFisher Scientific(目录号分别为Hs00166237_m1、Hs01555410_m1和Hs01026927_g1)。GAPDH的引物和探针组使用已知的人类基因组序列(NCBI参考序列NM_002046.5)设计，并通过“blastn”分析(NCBI)发现是特异性的。用于GAPDH的寡核苷酸序列是：正向5′-CAA GGT CAT CCA TGA CAA CTT TG-3′(SEQ IDNO:4)，反向5′-GGG CCA TCC ACA GTC TTC T-3′(SEQ ID NO:5)，探针5′-HEX-ACC ACA GTCCAT GCC ATC ACT GCC A-BHQ1-3′(SEQ ID NO:6)。技术上一式两份的qPCR反应在RocheLightcycler 480上在以下条件下进行：在95℃下初始变性10分钟，且然后50个循环的在95℃下变性10秒，在60℃下退火30秒和在72℃下延伸1秒。通过二阶导数法分析来获得Cp值。通过用管家基因(GAPDH)归一化和ΔΔ-Ct方法来确定相对基因表达。将每种处理与其各自的浓度对照进行比较。
结果
制备七种不同的SNA构型以测试是否可以使用单一SNA构建体靶向三种不同的mRNA。选择三种mRNA，其表达在功能上彼此不依赖于并且不在单一已知途径中。在某些情况下，靶向作为相同途径的一部分的mRNA(例如，TNF、IL17、IL22)以控制特定途径可能是有利的。合成SNA，其靶向单独的每种个别mRNA、三对mRNA和一种可以靶向所有三种mRNA的SNA构型。对照寡核苷酸用于确保每种SNA构型具有相同数量的靶向和非靶向的寡核苷酸。
来自细胞培养实验的结果表明，可以配制单一SNA，其靶向三种不同的mRNA。选择的mRNA是白介素4受体(IL4R)、白介素1β(IL1b)和结缔组织生长因子(CTGF)。选择这些靶标，因为在其它实验中注意到敲低这些mRNA中的任一种并未显著降低其它两种mRNA的水平。结果显示，当靶向任何单一mRNA的反义寡核苷酸存在于SNA上时，该mRNA的表达以剂量依赖性方式降低(对于IL4R，图13，对于IL1b，图14，对于CTGF，图15)。可以延展这种构型以靶向多于三种mRNA。每种SNA的总反义加载量可以是对可以用单一SNA构型靶向的mRNA数量的理论限制。
参考文献
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等同方案
仅仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或者能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等同方案。下列权利要求旨在涵盖此类等同方案。
本文公开的所有参考文献，包括专利文献，都以其整体通过引用并入。
序列表
<110> 埃克西奎雷股份有限公司
<120> 呈递用于特异性敲低白介素17受体mRNA的反义寡核苷酸(ASO)的脂质体球形核酸(SNA)构建体
<130> A1107.70015WO00
<140> 尚未分配
<141> 同时于此
<150> US 62/333,082
<151> 2016-05-06
<160> 311
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的多核苷酸
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<213> 人工序列
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<221> misc_feature
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<223> 用O甲基修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(13)
<223> 用硫代磷酸酯键修饰
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<221> misc_feature
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<223> 用O甲基修饰
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<221> misc_feature
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ctgggcccgg gctggaagcc ggaagcgagc aaagtggagc cgactcgaac tccaccgcgg 60
aaaagaaagc ctcagaacgt tcgttcgctg cgtccccagc cggggccgag ccctccgcga 120
cgccagccgg gccatggggg ccgcacgcag cccgccgtcc gctgtcccgg ggcccctgct 180
ggggctgctc ctgctgctcc tgggcgtgct ggccccgggt ggcgcctccc tgcgactcct 240
ggaccaccgg gcgctggtct gctcccagcc ggggctaaac tgcacggtca agaatagtac 300
ctgcctggat gacagctgga ttcaccctcg aaacctgacc ccctcctccc caaaggacct 360
gcagatccag ctgcactttg cccacaccca acaaggagac ctgttccccg tggctcacat 420
cgaatggaca ctgcagacag acgccagcat cctgtacctc gagggtgcag agttatctgt 480
cctgcagctg aacaccaatg aacgtttgtg cgtcaggttt gagtttctgt ccaaactgag 540
gcatcaccac aggcggtggc gttttacctt cagccacttt gtggttgacc ctgaccagga 600
atatgaggtg accgttcacc acctgcccaa gcccatccct gatggggacc caaaccacca 660
gtccaagaat ttccttgtgc ctgactgtga gcacgccagg atgaaggtaa ccacgccatg 720
catgagctca ggcagcctgt gggaccccaa catcaccgtg gagaccctgg aggcccacca 780
gctgcgtgtg agcttcaccc tgtggaacga atctacccat taccagatcc tgctgaccag 840
ttttccgcac atggagaacc acagttgctt tgagcacatg caccacatac ctgcgcccag 900
accagaagag ttccaccagc gatccaacgt cacactcact ctacgcaacc ttaaagggtg 960
ctgtcgccac caagtgcaga tccagccctt cttcagcagc tgcctcaatg actgcctcag 1020
acactccgcg actgtttcct gcccagaaat gccagacact ccagaaccaa ttccggacta 1080
catgcccctg tgggtgtact ggttcatcac gggcatctcc atcctgctgg tgggctccgt 1140
catcctgctc atcgtctgca tgacctggag gctagctggg cctggaagtg aaaaatacag 1200
tgatgacacc aaatacaccg atggcctgcc tgcggctgac ctgatccccc caccgctgaa 1260
gcccaggaag gtctggatca tctactcagc cgaccacccc ctctacgtgg acgtggtcct 1320
gaaattcgcc cagttcctgc tcaccgcctg cggcacggaa gtggccctgg acctgctgga 1380
agagcaggcc atctcggagg caggagtcat gacctgggtg ggccgtcaga agcaggagat 1440
ggtggagagc aactctaaga tcatcgtcct gtgctcccgc ggcacgcgcg ccaagtggca 1500
ggcgctcctg ggccgggggg cgcctgtgcg gctgcgctgc gaccacggaa agcccgtggg 1560
ggacctgttc actgcagcca tgaacatgat cctcccggac ttcaagaggc cagcctgctt 1620
cggcacctac gtagtctgct acttcagcga ggtcagctgt gacggcgacg tccccgacct 1680
gttcggcgcg gcgccgcggt acccgctcat ggacaggttc gaggaggtgt acttccgcat 1740
ccaggacctg gagatgttcc agccgggccg catgcaccgc gtaggggagc tgtcggggga 1800
caactacctg cggagcccgg gcggcaggca gctccgcgcc gccctggaca ggttccggga 1860
ctggcaggtc cgctgtcccg actggttcga atgtgagaac ctctactcag cagatgacca 1920
ggatgccccg tccctggacg aagaggtgtt tgaggagcca ctgctgcctc cgggaaccgg 1980
catcgtgaag cgggcgcccc tggtgcgcga gcctggctcc caggcctgcc tggccataga 2040
cccgctggtc ggggaggaag gaggagcagc agtggcaaag ctggaacctc acctgcagcc 2100
ccggggtcag ccagcgccgc agcccctcca caccctggtg ctcgccgcag aggagggggc 2160
cctggtggcc gcggtggagc ctgggcccct ggctgacggt gccgcagtcc ggctggcact 2220
ggcgggggag ggcgaggcct gcccgctgct gggcagcccg ggcgctgggc gaaatagcgt 2280
cctcttcctc cccgtggacc ccgaggactc gccccttggc agcagcaccc ccatggcgtc 2340
tcctgacctc cttccagagg acgtgaggga gcacctcgaa ggcttgatgc tctcgctctt 2400
cgagcagagt ctgagctgcc aggcccaggg gggctgcagt agacccgcca tggtcctcac 2460
agacccacac acgccctacg aggaggagca gcggcagtca gtgcagtctg accagggcta 2520
catctccagg agctccccgc agccccccga gggactcacg gaaatggagg aagaggagga 2580
agaggagcag gacccaggga agccggccct gccactctct cccgaggacc tggagagcct 2640
gaggagcctc cagcggcagc tgcttttccg ccagctgcag aagaactcgg gctgggacac 2700
gatggggtca gagtcagagg ggcccagtgc atgagggcgg ctccccaggg accgcccaga 2760
tcccagcttt gagagaggag tgtgtgtgca cgtattcatc tgtgtgtaca tgtctgcatg 2820
tgtatatgtt cgtgtgtgaa atgtaggctt taaaatgtaa atgtctggat tttaatccca 2880
ggcatccctc ctaacttttc tttgtgcagc ggtctggtta tcgtctatcc ccaggggaat 2940
ccacacagcc cgctcccagg agctaatggt agagcgtcct tgaggctcca ttattcgttc 3000
attcagcatt tattgtgcac ctactatgtg gcgggcattt gggataccaa gataaattgc 3060
atgcggcatg gccccagcca tgaaggaact taaccgctag tgccgaggac acgttaaacg 3120
aacaggatgg gccgggcacg gtggctcacg cctgtaatcc cagcacactg ggaggccgag 3180
gcaggtggat cactctgagg tcaggagttt gagccagcct ggccaacatg gtgaaacccc 3240
atctccacta aaaatagaaa aattagccgg gcatggtgac acatgcctgt agtcctagct 3300
acttgggagg ctgaggcagg agaattgctt gaatctggga ggcagaggtt gcagtgagcc 3360
gagattgtgc cattgcactg cagcctggat gacagagcga gactctatct caaaaaaaaa 3420
aaaaaaaaaa gatggtcacg cgggatgtaa acgctgaatg ggccaggtgc agtggctcat 3480
gcttgtaatc ccagcacttt gggaaggcga ggcaggtgga ttgcttgagc tcaggagttc 3540
aagaccagcc tgggcgacat agtgagacct catctctacc taaatttttt tttagtcagt 3600
catggtggca catgcctgta gtcccagcta ctcgggaggc tgatgccaga tgatcacttg 3660
agcccaggag gtagaggctg cagtgagcta taatggtacc attgcaatcc agcctgggca 3720
gcagagtgag accctgtctc aaaaaaaata aaaaagtaga aagatggagt ggaagcctgc 3780
ccagggttgt gagcatgcac gggaaaggca cccaggtcag gggggatccc cgaggagatg 3840
cctgagctga aggattgtgg ttggggaaag cgtagtccca gcaaggaagc agtttgtggg 3900
taagtgctgg gaggtgagtg gagtgagctt gtcagggagc tgctggtgga gcctggaggg 3960
gaaggaggga ggcagtgaga gagatcgggg tggggggtgg ggggatgtcg ccagagctca 4020
ggggtgggga cagccttgtg cgcatcagtc ctgaggcctg gggcaccttt cgtctgatga 4080
gcctctgcat ggagagaggc tgagggctaa acacagctgg atgtcacctg agttcattta 4140
taggaagaga gaaatgtcga ggtgaaacgt aaaagcatct ggcaggaagg tgagtctgaa 4200
gccctgcacc cgcgttccga ctatcagtgg ggagctgtta gcacgtagga ttcttcagag 4260
cagctgggct ggagctcccc tgagctcagg aagccccagg gtgcaagggc aaggaaatga 4320
ggggtggtgg gtcagtgaag atctgggcag accttgtgtg gggaaggggt gctgctgtga 4380
cttcagggtc tgaggtccaa agacagcatt tgaaaagagg ctctgaagcc agtgtttgaa 4440
gaatttgttc ctgaagtacc tcctgggggt aggctagagg cttctggctt cagggtcctg 4500
aagaacacat tgaggtgccg tctgacactg gaatagggtg cccttcattc ctatgcctga 4560
gtccttaact atatttccaa cctccagtga ggaggagaag attcggaaat gtgacaggag 4620
agcaaacagg acagtttgca tgtgtgtgtg cgcacacata catgtgcgtg aaagattatc 4680
aataaaagtg cataaatttg ttgatctggt aagagtttct agcaggaagg tcgagccact 4740
tactgtaggt caagaagttg ctagttgcgg agttttttct tgcagttaga ctttacctag 4800
tggtagcagg gccaccaaag ctctgtgtcc cagatggtgt atggcccata atccacccaa 4860
cagcagcaaa ggaccaggca aaggagaaca ggagcagaag cctcccagcc actagccttt 4920
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gcattctgtg acctttccct agcttccaat aaataactgt ttgacgccca gagtacagga 5040
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cacttaccat acaatccaca attgaccctg cacaatttga tgccggttta gtatagtcac 5280
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ctgtttcttc tttaatgtca ttccctgttt ctcctcacat tccctcccca tttcctgggc 5520
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gtgtttgctg tccgctgaat gccaagagct tcaagagtgt gtgtaaataa agccacacct 5640
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ctttgattca aaaccagttt ctcttttctg cataggaagg tccttgaagg tgtttagggt 6000
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cactgcagcc tcgacctccc aggctcaagc catctttcca cctcagcctg ccagtggcta 6240
gaactacagg cgtgcaccac tgtgcccggc taatttgtgt gtatatattt tgtagaaatg 6300
gggtttcacc atgttgtcca ggctggtcac gaactcctgg gctcaagcca tctgcccgcc 6360
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gggcacctga ggacagagtg agatggaggg ccgctgctcc agcagccggg cctgcatccc 6660
acaagtcaac tgtgtcggac agaggatcct tacaaagaag aggcagcagg gttgggggct 6720
ggccagctgc tcgtccgccc taggtagctt gctcatctgt aaagtgggtg gggcaggagt 6780
tcccacctca tggggtcctg gcaagcctgc agtatccccg agtggcacca gcctgcttct 6840
ggggcagagc agtttgtgcc ccctgaggta ccactgatcc tctttccctg ctattaggta 6900
ttgctctctt cctccggtgt ttgccttttc agattataga agtaatatgt gttcccatat 6960
ttggcgtctc tcaggagctc aggaagtact tggctgagtg aacatgtcca ttgtggaaaa 7020
atggcaacaa tatggattcc atgggtatat tttatagaag aatatgaaga aaagcagcta 7080
cccctaaacc cattgcacaa gctgttcatg ttaattctgt acccgacgct ttccccacgg 7140
ggcctcccct cactctgaaa tggcatccag gtccatcttg ccctccacct ctgcatggct 7200
ctccatgccc catcgcctct cccagatcct agcactgggt ccacactctc gccctgtcca 7260
tttaggttga tgaaagcagg cagtcacccg ggtgggccag tcttgcctgt gggaggaaca 7320
tgcagtctcc tgtctcatgg tttgaagtgt gccaggaagc ctggcccagc ccacctcccc 7380
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actggatcct tcctctctga tgagacagga agaaggtaca cagtgaccag gtaggaggag 7500
gagagggagt agaaaggagg gatgcgggtg gctggtccct gcatttgcct gcttccctgc 7560
acgggtgtcc cactggccgc ctctgctcac cagtgtcatg ggattctctc agaagatgaa 7620
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gcaacagccg actaccgaag gttgcctgga gcagtgcaga tgtgggagga agaagggcct 7740
tggtgcacac tggcttttct tcctgactgc aatgtggcat tgtgccagct acctcctctt 7800
tctcggcctc aggaaaatgg agagaaagca gccctgaagg tggctgtgac gagggaaggg 7860
gcagagggcc tgacagtcaa ccacgcgcta tattttcctg ttcttcctta gggcaagaac 7920
tgcatggcca gactcaggca aggcctaggt gtgggctggg cattgcctac acgtgaagag 7980
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gctcaaatca atcaccttat tttacatccg ctccagggag aaatgaagac atggtcctac 8160
gttgttctgt aattattttc tatgtaaatt ttgttccttg ttacaattat atatgtctta 8220
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ggcagagaga gctcaggctc ccaggagctt ccactctcag accttgcctc ccgggctgcc 8400
ctgagtgaaa cgcctgctta gcatttggca cagccagaag cagcaagcta gggtcacaac 8460
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gtgtttgttt attttggtgc aggcccagtg ttcttgctta gacttaatac tacccttcat 8580
gttaaaataa aaccaaacaa aaacccat 8608
<210> 303
<400> 303
000
<210> 304
<211> 3634
<212> DNA
<213> 智人
<400> 304
gaattccggg tgatttcact cccggctgtc caggcttgtc ctgctacccc acccagcctt 60
tcctgaggcc tcaagcctgc caccaagccc ccagctcctt ctccccgcag gacccaaaca 120
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ttgttggcac acccagccag cagacgctcc ctcagcaagg acagcagagg accagctaag 660
agggagagaa gcaactacag accccccctg aaaacaaccc tcagacgcca catcccctga 720
caagctgcca ggcaggttct cttcctctca catactgacc cacggcttca ccctctctcc 780
cctggaaagg acaccatgag cactgaaagc atgatccggg acgtggagct ggccgaggag 840
gcgctcccca agaagacagg ggggccccag ggctccaggc ggtgcttgtt cctcagcctc 900
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ggagataagg agagaagaag atagggtgtc tggcacacag aagacactca gggaaagagc 1440
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tgttaaccat tctccttctc cccaacagtt ccccagggac ctctctctaa tcagccctct 1620
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<210> 305
<211> 866
<212> PRT
<213> 智人
<400> 305
Met Gly Ala Ala Arg Ser Pro Pro Ser Ala Val Pro Gly Pro Leu Leu
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Pro Gly Gly Ala Ser
20 25 30
Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Leu Val Cys Ser Gln Pro Gly Leu
35 40 45
Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His
50 55 60
Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln Leu
65 70 75 80
His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His Ile
85 90 95
Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Arg
115 120 125
Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Arg Arg Trp Arg Phe
130 135 140
Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Asp Gln Glu Tyr Glu Val Thr
145 150 155 160
Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln
165 170 175
Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu His Ala Arg Met Lys Val
180 185 190
Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr
195 200 205
Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu Trp
210 215 220
Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met
225 230 235 240
Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro Arg
245 250 255
Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu Arg Asn
260 265 270
Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln Pro Phe Phe Ser
275 280 285
Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr Val Ser Cys Pro
290 295 300
Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp Tyr Met Pro Leu Trp
305 310 315 320
Val Tyr Trp Phe Ile Thr Gly Ile Ser Ile Leu Leu Val Gly Ser Val
325 330 335
Ile Leu Leu Ile Val Cys Met Thr Trp Arg Leu Ala Gly Pro Gly Ser
340 345 350
Glu Lys Tyr Ser Asp Asp Thr Lys Tyr Thr Asp Gly Leu Pro Ala Ala
355 360 365
Asp Leu Ile Pro Pro Pro Leu Lys Pro Arg Lys Val Trp Ile Ile Tyr
370 375 380
Ser Ala Asp His Pro Leu Tyr Val Asp Val Val Leu Lys Phe Ala Gln
385 390 395 400
Phe Leu Leu Thr Ala Cys Gly Thr Glu Val Ala Leu Asp Leu Leu Glu
405 410 415
Glu Gln Ala Ile Ser Glu Ala Gly Val Met Thr Trp Val Gly Arg Gln
420 425 430
Lys Gln Glu Met Val Glu Ser Asn Ser Lys Ile Ile Val Leu Cys Ser
435 440 445
Arg Gly Thr Arg Ala Lys Trp Gln Ala Leu Leu Gly Arg Gly Ala Pro
450 455 460
Val Arg Leu Arg Cys Asp His Gly Lys Pro Val Gly Asp Leu Phe Thr
465 470 475 480
Ala Ala Met Asn Met Ile Leu Pro Asp Phe Lys Arg Pro Ala Cys Phe
485 490 495
Gly Thr Tyr Val Val Cys Tyr Phe Ser Glu Val Ser Cys Asp Gly Asp
500 505 510
Val Pro Asp Leu Phe Gly Ala Ala Pro Arg Tyr Pro Leu Met Asp Arg
515 520 525
Phe Glu Glu Val Tyr Phe Arg Ile Gln Asp Leu Glu Met Phe Gln Pro
530 535 540
Gly Arg Met His Arg Val Gly Glu Leu Ser Gly Asp Asn Tyr Leu Arg
545 550 555 560
Ser Pro Gly Gly Arg Gln Leu Arg Ala Ala Leu Asp Arg Phe Arg Asp
565 570 575
Trp Gln Val Arg Cys Pro Asp Trp Phe Glu Cys Glu Asn Leu Tyr Ser
580 585 590
Ala Asp Asp Gln Asp Ala Pro Ser Leu Asp Glu Glu Val Phe Glu Glu
595 600 605
Pro Leu Leu Pro Pro Gly Thr Gly Ile Val Lys Arg Ala Pro Leu Val
610 615 620
Arg Glu Pro Gly Ser Gln Ala Cys Leu Ala Ile Asp Pro Leu Val Gly
625 630 635 640
Glu Glu Gly Gly Ala Ala Val Ala Lys Leu Glu Pro His Leu Gln Pro
645 650 655
Arg Gly Gln Pro Ala Pro Gln Pro Leu His Thr Leu Val Leu Ala Ala
660 665 670
Glu Glu Gly Ala Leu Val Ala Ala Val Glu Pro Gly Pro Leu Ala Asp
675 680 685
Gly Ala Ala Val Arg Leu Ala Leu Ala Gly Glu Gly Glu Ala Cys Pro
690 695 700
Leu Leu Gly Ser Pro Gly Ala Gly Arg Asn Ser Val Leu Phe Leu Pro
705 710 715 720
Val Asp Pro Glu Asp Ser Pro Leu Gly Ser Ser Thr Pro Met Ala Ser
725 730 735
Pro Asp Leu Leu Pro Glu Asp Val Arg Glu His Leu Glu Gly Leu Met
740 745 750
Leu Ser Leu Phe Glu Gln Ser Leu Ser Cys Gln Ala Gln Gly Gly Cys
755 760 765
Ser Arg Pro Ala Met Val Leu Thr Asp Pro His Thr Pro Tyr Glu Glu
770 775 780
Glu Gln Arg Gln Ser Val Gln Ser Asp Gln Gly Tyr Ile Ser Arg Ser
785 790 795 800
Ser Pro Gln Pro Pro Glu Gly Leu Thr Glu Met Glu Glu Glu Glu Glu
805 810 815
Glu Glu Gln Asp Pro Gly Lys Pro Ala Leu Pro Leu Ser Pro Glu Asp
820 825 830
Leu Glu Ser Leu Arg Ser Leu Gln Arg Gln Leu Leu Phe Arg Gln Leu
835 840 845
Gln Lys Asn Ser Gly Trp Asp Thr Met Gly Ser Glu Ser Glu Gly Pro
850 855 860
Ser Ala
865
<210> 306
<211> 3710
<212> DNA
<213> 智人
<400> 306
gggtctccgc gcccaggaaa gccccgcgcg gcgcgggcca gggaagggcc acccaggggt 60
cccccacttc ccgcttgggc gcccggacgg cgaatggagc aggggcgcgc agataattaa 120
agatttacac acagctggaa gaaatcatag agaagccggg cgtggtggct catgcctata 180
atcccagcac ttttggaggc tgaggcgggc agatcacttg agatcaggag ttcgagacca 240
gcctggtgcc ttggcatctc ccaatggggt ggctttgctc tgggctcctg ttccctgtga 300
gctgcctggt cctgctgcag gtggcaagct ctgggaacat gaaggtcttg caggagccca 360
cctgcgtctc cgactacatg agcatctcta cttgcgagtg gaagatgaat ggtcccacca 420
attgcagcac cgagctccgc ctgttgtacc agctggtttt tctgctctcc gaagcccaca 480
cgtgtatccc tgagaacaac ggaggcgcgg ggtgcgtgtg ccacctgctc atggatgacg 540
tggtcagtgc ggataactat acactggacc tgtgggctgg gcagcagctg ctgtggaagg 600
gctccttcaa gcccagcgag catgtgaaac ccagggcccc aggaaacctg acagttcaca 660
ccaatgtctc cgacactctg ctgctgacct ggagcaaccc gtatccccct gacaattacc 720
tgtataatca tctcacctat gcagtcaaca tttggagtga aaacgacccg gcagatttca 780
gaatctataa cgtgacctac ctagaaccct ccctccgcat cgcagccagc accctgaagt 840
ctgggatttc ctacagggca cgggtgaggg cctgggctca gtgctataac accacctgga 900
gtgagtggag ccccagcacc aagtggcaca actcctacag ggagcccttc gagcagcacc 960
tcctgctggg cgtcagcgtt tcctgcattg tcatcctggc cgtctgcctg ttgtgctatg 1020
tcagcatcac caagattaag aaagaatggt gggatcagat tcccaaccca gcccgcagcc 1080
gcctcgtggc tataataatc caggatgctc aggggtcaca gtgggagaag cggtcccgag 1140
gccaggaacc agccaagtgc ccacactgga agaattgtct taccaagctc ttgccctgtt 1200
ttctggagca caacatgaaa agggatgaag atcctcacaa ggctgccaaa gagatgcctt 1260
tccagggctc tggaaaatca gcatggtgcc cagtggagat cagcaagaca gtcctctggc 1320
cagagagcat cagcgtggtg cgatgtgtgg agttgtttga ggccccggtg gagtgtgagg 1380
aggaggagga ggtagaggaa gaaaaaggga gcttctgtgc atcgcctgag agcagcaggg 1440
atgacttcca ggagggaagg gagggcattg tggcccggct aacagagagc ctgttcctgg 1500
acctgctcgg agaggagaat gggggctttt gccagcagga catgggggag tcatgccttc 1560
ttccaccttc gggaagtacg agtgctcaca tgccctggga tgagttccca agtgcagggc 1620
ccaaggaggc acctccctgg ggcaaggagc agcctctcca cctggagcca agtcctcctg 1680
ccagcccgac ccagagtcca gacaacctga cttgcacaga gacgcccctc gtcatcgcag 1740
gcaaccctgc ttaccgcagc ttcagcaact ccctgagcca gtcaccgtgt cccagagagc 1800
tgggtccaga cccactgctg gccagacacc tggaggaagt agaacccgag atgccctgtg 1860
tcccccagct ctctgagcca accactgtgc cccaacctga gccagaaacc tgggagcaga 1920
tcctccgccg aaatgtcctc cagcatgggg cagctgcagc ccccgtctcg gcccccacca 1980
gtggctatca ggagtttgta catgcggtgg agcagggtgg cacccaggcc agtgcggtgg 2040
tgggcttggg tcccccagga gaggctggtt acaaggcctt ctcaagcctg cttgccagca 2100
gtgctgtgtc cccagagaaa tgtgggtttg gggctagcag tggggaagag gggtataagc 2160
ctttccaaga cctcattcct ggctgccctg gggaccctgc cccagtccct gtccccttgt 2220
tcacctttgg actggacagg gagccacctc gcagtccgca gagctcacat ctcccaagca 2280
gctccccaga gcacctgggt ctggagccgg gggaaaaggt agaggacatg ccaaagcccc 2340
cacttcccca ggagcaggcc acagaccccc ttgtggacag cctgggcagt ggcattgtct 2400
actcagccct tacctgccac ctgtgcggcc acctgaaaca gtgtcatggc caggaggatg 2460
gtggccagac ccctgtcatg gccagtcctt gctgtggctg ctgctgtgga gacaggtcct 2520
cgccccctac aacccccctg agggccccag acccctctcc aggtggggtt ccactggagg 2580
ccagtctgtg tccggcctcc ctggcaccct cgggcatctc agagaagagt aaatcctcat 2640
catccttcca tcctgcccct ggcaatgctc agagctcaag ccagaccccc aaaatcgtga 2700
actttgtctc cgtgggaccc acatacatga gggtctctta ggtgcatgtc ctcttgttgc 2760
tgagtctgca gatgaggact agggcttatc catgcctggg aaatgccacc tcctggaagg 2820
cagccaggct ggcagatttc caaaagactt gaagaaccat ggtatgaagg tgattggccc 2880
cactgacgtt ggcctaacac tgggctgcag agactggacc ccgcccagca ttgggctggg 2940
ctcgccacat cccatgagag tagagggcac tgggtcgccg tgccccacgg caggcccctg 3000
caggaaaact gaggcccttg ggcacctcga cttgtgaacg agttgttggc tgctccctcc 3060
acagcttctg cagcagactg tccctgttgt aactgcccaa ggcatgtttt gcccaccaga 3120
tcatggccca cgtggaggcc cacctgcctc tgtctcactg aactagaagc cgagcctaga 3180
aactaacaca gccatcaagg gaatgacttg ggcggccttg ggaaatcgat gagaaattga 3240
acttcaggga gggtggtcat tgcctagagg tgctcattca tttaacagag cttccttagg 3300
ttgatgctgg aggcagaatc ccggctgtca aggggtgttc agttaagggg agcaacagag 3360
gacatgaaaa attgctatga ctaaagcagg gacaatttgc tgccaaacac ccatgcccag 3420
ctgtatggct gggggctcct cgtatgcatg gaacccccag aataaatatg ctcagccacc 3480
ctgtgggccg ggcaatccag acagcaggca taaggcacca gttaccctgc atgttggccc 3540
agacctcagg tgctagggaa ggcgggaacc ttgggttgag taatgctcgt ctgtgtgttt 3600
tagtttcatc acctgttatc tgtgtttgct gaggagagtg gaacagaagg ggtggagttt 3660
tgtataaata aagtttcttt gtctctttaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3710
<210> 307
<211> 1498
<212> DNA
<213> 智人
<400> 307
accaaacctc ttcgaggcac aaggcacaac aggctgctct gggattctct tcagccaatc 60
ttcattgctc aagtgtctga agcagccatg gcagaagtac ctgagctcgc cagtgaaatg 120
atggcttatt acagtggcaa tgaggatgac ttgttctttg aagctgatgg ccctaaacag 180
atgaagtgct ccttccagga cctggacctc tgccctctgg atggcggcat ccagctacga 240
atctccgacc accactacag caagggcttc aggcaggccg cgtcagttgt tgtggccatg 300
gacaagctga ggaagatgct ggttccctgc ccacagacct tccaggagaa tgacctgagc 360
accttctttc ccttcatctt tgaagaagaa cctatcttct tcgacacatg ggataacgag 420
gcttatgtgc acgatgcacc tgtacgatca ctgaactgca cgctccggga ctcacagcaa 480
aaaagcttgg tgatgtctgg tccatatgaa ctgaaagctc tccacctcca gggacaggat 540
atggagcaac aagtggtgtt ctccatgtcc tttgtacaag gagaagaaag taatgacaaa 600
atacctgtgg ccttgggcct caaggaaaag aatctgtacc tgtcctgcgt gttgaaagat 660
gataagccca ctctacagct ggagagtgta gatcccaaaa attacccaaa gaagaagatg 720
gaaaagcgat ttgtcttcaa caagatagaa atcaataaca agctggaatt tgagtctgcc 780
cagttcccca actggtacat cagcacctct caagcagaaa acatgcccgt cttcctggga 840
gggaccaaag gcggccagga tataactgac ttcaccatgc aatttgtgtc ttcctaaaga 900
gagctgtacc cagagagtcc tgtgctgaat gtggactcaa tccctagggc tggcagaaag 960
ggaacagaaa ggtttttgag tacggctata gcctggactt tcctgttgtc tacaccaatg 1020
cccaactgcc tgccttaggg tagtgctaag aggatctcct gtccatcagc caggacagtc 1080
agctctctcc tttcagggcc aatccccagc ccttttgttg agccaggcct ctctcacctc 1140
tcctactcac ttaaagcccg cctgacagaa accacggcca catttggttc taagaaaccc 1200
tctgtcattc gctcccacat tctgatgagc aaccgcttcc ctatttattt atttatttgt 1260
ttgtttgttt tattcattgg tctaatttat tcaaaggggg caagaagtag cagtgtctgt 1320
aaaagagcct agtttttaat agctatggaa tcaattcaat ttggactggt gtgctctctt 1380
taaatcaagt cctttaatta agactgaaaa tatataagct cagattattt aaatgggaat 1440
atttataaat gagcaaatat catactgttc aatggttctg aaataaactt cactgaag 1498
<210> 308
<211> 2358
<212> DNA
<213> 智人
<400> 308
aaactcacac aacaactctt ccccgctgag aggagacagc cagtgcgact ccaccctcca 60
gctcgacggc agccgccccg gccgacagcc ccgagacgac agcccggcgc gtcccggtcc 120
ccacctccga ccaccgccag cgctccaggc cccgccgctc cccgctcgcc gccaccgcgc 180
cctccgctcc gcccgcagtg ccaaccatga ccgccgccag tatgggcccc gtccgcgtcg 240
ccttcgtggt cctcctcgcc ctctgcagcc ggccggccgt cggccagaac tgcagcgggc 300
cgtgccggtg cccggacgag ccggcgccgc gctgcccggc gggcgtgagc ctcgtgctgg 360
acggctgcgg ctgctgccgc gtctgcgcca agcagctggg cgagctgtgc accgagcgcg 420
acccctgcga cccgcacaag ggcctcttct gtgacttcgg ctccccggcc aaccgcaaga 480
tcggcgtgtg caccgccaaa gatggtgctc cctgcatctt cggtggtacg gtgtaccgca 540
gcggagagtc cttccagagc agctgcaagt accagtgcac gtgcctggac ggggcggtgg 600
gctgcatgcc cctgtgcagc atggacgttc gtctgcccag ccctgactgc cccttcccga 660
ggagggtcaa gctgcccggg aaatgctgcg aggagtgggt gtgtgacgag cccaaggacc 720
aaaccgtggt tgggcctgcc ctcgcggctt accgactgga agacacgttt ggcccagacc 780
caactatgat tagagccaac tgcctggtcc agaccacaga gtggagcgcc tgttccaaga 840
cctgtgggat gggcatctcc acccgggtta ccaatgacaa cgcctcctgc aggctagaga 900
agcagagccg cctgtgcatg gtcaggcctt gcgaagctga cctggaagag aacattaaga 960
agggcaaaaa gtgcatccgt actcccaaaa tctccaagcc tatcaagttt gagctttctg 1020
gctgcaccag catgaagaca taccgagcta aattctgtgg agtatgtacc gacggccgat 1080
gctgcacccc ccacagaacc accaccctgc cggtggagtt caagtgccct gacggcgagg 1140
tcatgaagaa gaacatgatg ttcatcaaga cctgtgcctg ccattacaac tgtcccggag 1200
acaatgacat ctttgaatcg ctgtactaca ggaagatgta cggagacatg gcatgaagcc 1260
agagagtgag agacattaac tcattagact ggaacttgaa ctgattcaca tctcattttt 1320
ccgtaaaaat gatttcagta gcacaagtta tttaaatctg tttttctaac tgggggaaaa 1380
gattcccacc caattcaaaa cattgtgcca tgtcaaacaa atagtctatc aaccccagac 1440
actggtttga agaatgttaa gacttgacag tggaactaca ttagtacaca gcaccagaat 1500
gtatattaag gtgtggcttt aggagcagtg ggagggtacc agcagaaagg ttagtatcat 1560
cagatagcat cttatacgag taatatgcct gctatttgaa gtgtaattga gaaggaaaat 1620
tttagcgtgc tcactgacct gcctgtagcc ccagtgacag ctaggatgtg cattctccag 1680
ccatcaagag actgagtcaa gttgttcctt aagtcagaac agcagactca gctctgacat 1740
tctgattcga atgacactgt tcaggaatcg gaatcctgtc gattagactg gacagcttgt 1800
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tgtgtgtgtg tgtgtgtata tatatatata tgtacagtta tctaagttaa tttaaagttg 1920
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tgaacaaatg gcctttatta aaaactgagt gactctatat agctgatcag ttttttcacc 2220
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gtgaccaaaa gttacatgtt tgcacctttc tagttgaaaa taaagtgtat attttttcta 2340
taaaaaaaaa aaaaaaaa 2358
<210> 309
<211> 825
<212> PRT
<213> 智人
<400> 309
Met Gly Trp Leu Cys Ser Gly Leu Leu Phe Pro Val Ser Cys Leu Val
1 5 10 15
Leu Leu Gln Val Ala Ser Ser Gly Asn Met Lys Val Leu Gln Glu Pro
20 25 30
Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met
35 40 45
Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu
50 55 60
Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly
65 70 75 80
Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met Asp Asp Val Val Ser Ala
85 90 95
Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys
100 105 110
Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn
115 120 125
Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser
130 135 140
Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala
145 150 155 160
Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn
165 170 175
Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys
180 185 190
Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr
195 200 205
Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Thr Lys Trp His Asn Ser
210 215 220
Tyr Arg Glu Pro Phe Glu Gln His Leu Leu Leu Gly Val Ser Val Ser
225 230 235 240
Cys Ile Val Ile Leu Ala Val Cys Leu Leu Cys Tyr Val Ser Ile Thr
245 250 255
Lys Ile Lys Lys Glu Trp Trp Asp Gln Ile Pro Asn Pro Ala Arg Ser
260 265 270
Arg Leu Val Ala Ile Ile Ile Gln Asp Ala Gln Gly Ser Gln Trp Glu
275 280 285
Lys Arg Ser Arg Gly Gln Glu Pro Ala Lys Cys Pro His Trp Lys Asn
290 295 300
Cys Leu Thr Lys Leu Leu Pro Cys Phe Leu Glu His Asn Met Lys Arg
305 310 315 320
Asp Glu Asp Pro His Lys Ala Ala Lys Glu Met Pro Phe Gln Gly Ser
325 330 335
Gly Lys Ser Ala Trp Cys Pro Val Glu Ile Ser Lys Thr Val Leu Trp
340 345 350
Pro Glu Ser Ile Ser Val Val Arg Cys Val Glu Leu Phe Glu Ala Pro
355 360 365
Val Glu Cys Glu Glu Glu Glu Glu Val Glu Glu Glu Lys Gly Ser Phe
370 375 380
Cys Ala Ser Pro Glu Ser Ser Arg Asp Asp Phe Gln Glu Gly Arg Glu
385 390 395 400
Gly Ile Val Ala Arg Leu Thr Glu Ser Leu Phe Leu Asp Leu Leu Gly
405 410 415
Glu Glu Asn Gly Gly Phe Cys Gln Gln Asp Met Gly Glu Ser Cys Leu
420 425 430
Leu Pro Pro Ser Gly Ser Thr Ser Ala His Met Pro Trp Asp Glu Phe
435 440 445
Pro Ser Ala Gly Pro Lys Glu Ala Pro Pro Trp Gly Lys Glu Gln Pro
450 455 460
Leu His Leu Glu Pro Ser Pro Pro Ala Ser Pro Thr Gln Ser Pro Asp
465 470 475 480
Asn Leu Thr Cys Thr Glu Thr Pro Leu Val Ile Ala Gly Asn Pro Ala
485 490 495
Tyr Arg Ser Phe Ser Asn Ser Leu Ser Gln Ser Pro Cys Pro Arg Glu
500 505 510
Leu Gly Pro Asp Pro Leu Leu Ala Arg His Leu Glu Glu Val Glu Pro
515 520 525
Glu Met Pro Cys Val Pro Gln Leu Ser Glu Pro Thr Thr Val Pro Gln
530 535 540
Pro Glu Pro Glu Thr Trp Glu Gln Ile Leu Arg Arg Asn Val Leu Gln
545 550 555 560
His Gly Ala Ala Ala Ala Pro Val Ser Ala Pro Thr Ser Gly Tyr Gln
565 570 575
Glu Phe Val His Ala Val Glu Gln Gly Gly Thr Gln Ala Ser Ala Val
580 585 590
Val Gly Leu Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Tyr Lys Ala Phe Ser Ser
595 600 605
Leu Leu Ala Ser Ser Ala Val Ser Pro Glu Lys Cys Gly Phe Gly Ala
610 615 620
Ser Ser Gly Glu Glu Gly Tyr Lys Pro Phe Gln Asp Leu Ile Pro Gly
625 630 635 640
Cys Pro Gly Asp Pro Ala Pro Val Pro Val Pro Leu Phe Thr Phe Gly
645 650 655
Leu Asp Arg Glu Pro Pro Arg Ser Pro Gln Ser Ser His Leu Pro Ser
660 665 670
Ser Ser Pro Glu His Leu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Lys Val Glu Asp
675 680 685
Met Pro Lys Pro Pro Leu Pro Gln Glu Gln Ala Thr Asp Pro Leu Val
690 695 700
Asp Ser Leu Gly Ser Gly Ile Val Tyr Ser Ala Leu Thr Cys His Leu
705 710 715 720
Cys Gly His Leu Lys Gln Cys His Gly Gln Glu Asp Gly Gly Gln Thr
725 730 735
Pro Val Met Ala Ser Pro Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly Asp Arg Ser
740 745 750
Ser Pro Pro Thr Thr Pro Leu Arg Ala Pro Asp Pro Ser Pro Gly Gly
755 760 765
Val Pro Leu Glu Ala Ser Leu Cys Pro Ala Ser Leu Ala Pro Ser Gly
770 775 780
Ile Ser Glu Lys Ser Lys Ser Ser Ser Ser Phe His Pro Ala Pro Gly
785 790 795 800
Asn Ala Gln Ser Ser Ser Gln Thr Pro Lys Ile Val Asn Phe Val Ser
805 810 815
Val Gly Pro Thr Tyr Met Arg Val Ser
820 825
<210> 310
<211> 269
<212> PRT
<213> 智人
<400> 310
Met Ala Glu Val Pro Glu Leu Ala Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser
1 5 10 15
Gly Asn Glu Asp Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Lys Gln Met
20 25 30
Lys Cys Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly Ile
35 40 45
Gln Leu Arg Ile Ser Asp His His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gln Ala
50 55 60
Ala Ser Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro
65 70 75 80
Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe
85 90 95
Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn Glu Ala
100 105 110
Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp
115 120 125
Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala
130 135 140
Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met
145 150 155 160
Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu
165 170 175
Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp
180 185 190
Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys
195 200 205
Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn
210 215 220
Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr
225 230 235 240
Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly
245 250 255
Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
260 265
<210> 311
<211> 349
<212> PRT
<213> 智人
<400> 311
Met Thr Ala Ala Ser Met Gly Pro Val Arg Val Ala Phe Val Val Leu
1 5 10 15
Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Ala Val Gly Gln Asn Cys Ser Gly Pro
20 25 30
Cys Arg Cys Pro Asp Glu Pro Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly Val Ser
35 40 45
Leu Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu
50 55 60
Gly Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu
65 70 75 80
Phe Cys His Phe Gly Ser Pro Ala Asn Arg Lys Ile Gly Val Cys Thr
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Ala Pro Cys Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr Arg Ser
100 105 110
Gly Glu Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys Leu Asp
115 120 125
Gly Ala Val Gly Cys Met Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro
130 135 140
Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys
145 150 155 160
Cys Glu Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Gln Thr Val Val Gly
165 170 175
Pro Ala Leu Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr Phe Gly Pro Asp Pro
180 185 190
Thr Met Ile Arg Ala Asn Cys Leu Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala
195 200 205
Cys Ser Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp
210 215 220
Asn Ala Ser Cys Arg Leu Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg
225 230 235 240
Pro Cys Glu Ala Asp Leu Glu Glu Asn Ile Lys Lys Gly Lys Lys Cys
245 250 255
Ile Arg Thr Pro Lys Ile Ser Lys Pro Ile Lys Phe Glu Leu Ser Gly
260 265 270
Cys Thr Ser Met Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Val Cys Thr
275 280 285
Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Val Glu
290 295 300
Phe Lys Cys Pro Asp Gly Glu Val Met Lys Lys Asn Met Met Phe Ile
305 310 315 320
Lys Thr Cys Ala Cys His Tyr Asn Cys Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe
325 330 335
Glu Ser Leu Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala
340 345

Claims (117)

1.经修饰的单链寡核苷酸或其药学上可接受的盐，所述经修饰的单链寡核苷酸由10-30个连接的核苷组成且具有：由2至8个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；由连接的核苷组成的5’翼区段；和由连接的核苷组成的3’翼区段；其中所述缺口区段位于5'翼区段和3'翼区段之间；其中每个翼区段的至少一些核苷包含修饰的核苷酸；其中所述缺口区段内的核苷间键和将缺口区段连接至3'翼区段的键都是硫代磷酸酯键(*)；且连接5'和3'翼区段两者的其余核苷的核苷间键是磷酸二酯键；且其中所述寡核苷酸的核碱基序列由与SEQ IDNO.:302的等长部分互补的10-30个连续核碱基组成。
2.权利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的核碱基序列是GCUUGGGCAGGTGGUGAA(SEQ ID NO:225)。
3.权利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的核碱基序列是CCCACAGGGGCATGUAGU(SEQ ID NO:288)。
4.权利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的核碱基序列是GUAGGGCGUGTGTGGGUC(SEQ ID NO:291)。
5.权利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的核碱基序列是mGmCmUmUmGmGG*C*A*G*G*T*mGmGmUmGmAmA(SEQ ID NO:225)。
6.权利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的核碱基序列是mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU(SEQ ID NO:288)。
7.权利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的核碱基序列是mGmUmAmGmGmGmCmGmUG*T*G*T*G*G*mGmUmC(SEQ ID NO:291)。
8.权利要求1-7中任一项的寡核苷酸，其中所述化合物长度为20个核苷酸。
9.权利要求1-7中任一项的寡核苷酸，其进一步在一端包含分子种类。
10.权利要求1-7中任一项的寡核苷酸，其中所述化合物进一步在两端包含分子种类。
11.权利要求9-10中任一项的寡核苷酸，其中所述分子种类选自间隔物、脂质、固醇、胆固醇、硬脂基、C16烷基链、胆汁酸、胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸盐、油烯基石胆酸、油酰基胆烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、类异戊二烯诸如类固醇、维生素诸如维生素E、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、脂肪酸酯诸如甘油三酯、芘、卟啉、德卟啉、金刚烷、吖啶、生物素、香豆素、荧光素、罗丹明、德克萨斯红、洋地黄毒苷、二甲氧基三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、花青染料(例如，Cy3或Cy5)、Hoechst 33258染料、补骨脂素和布洛芬。
12.权利要求9-10中任一项的寡核苷酸，其中所述分子种类选自亲脂性部分；叶酸基团；类固醇基团；碳水化合物基团；维生素A基团；维生素E基团；或维生素K基团。
13.权利要求9-10中任一项的寡核苷酸，其中所述分子种类通过选自磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和酰胺键的键与所述化合物直接连接。
14.权利要求9-10中任一项的寡核苷酸，其中所述分子种类通过接头与所述化合物间接连接。
15.权利要求14的寡核苷酸，其中所述接头是选自以下的非核苷酸接头：无碱基残基(dSpacer)；低聚乙二醇，诸如三乙二醇(间隔物9)或六乙二醇(间隔物18)，和烷二醇，诸如丁二醇。
16.权利要求15的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的3’末端连接至2个连续的接头，所述接头为六乙二醇(间隔物18)，第一个六乙二醇连接至所述寡核苷酸的3’末端，第二个六乙二醇连接至第一个六乙二醇，且第二个六乙二醇连接至胆固醇。
17.权利要求1和9-16中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸由17-21个连接的核苷组成。
18.权利要求1和9-17中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有由6个连接的脱氧核苷组成的缺口区段。
19.权利要求1和9-18中任一项的寡核苷酸，其中每个翼区段的所有核苷都包含修饰的核苷酸。
20.权利要求1和9-19中任一项的寡核苷酸，其中每个翼区段的每个核苷包含2'O-甲基核糖核苷(m)。
21.权利要求20的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有最多至12个2'O-甲基核糖核苷。
22.权利要求1和9-21中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的核碱基序列由与SEQID NO:302的等长部分互补的17-21个连续核碱基组成。
23.包含mGmCmUmUmGmGG*C*A*G*G*T*mGmGmUmGmAmA/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQID NO:225)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸长度为20个核苷酸，其中m是2’O甲基，且其中*是硫代磷酸酯修饰。
24.包含mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQID NO:288)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸长度为20个核苷酸，其中m是2’O甲基，且其中*是硫代磷酸酯修饰。
25.包含mGmUmAmGmGmGmCmGmUG*T*G*T*G*G*mGmUmC/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQID NO:291)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸长度为20个核苷酸，其中m是2’O甲基，且其中*是硫代磷酸酯修饰。
26.稳定的自组装纳米结构，其包含
具有寡核苷酸壳的核，所述寡核苷酸壳由靶向位于所述核外部的白介素17受体(IL-17RA)的长度为18至21个连接的核苷的反义寡核苷酸构成。
27.权利要求20的纳米结构，其中所述反义寡核苷酸长度为18个核苷酸。
28.权利要求26或27的纳米结构，其中IL-17RA具有SEQ ID NO:302的序列。
29.权利要求28的纳米结构，其中少于所有的核苷间键是磷酸二酯。
30.权利要求26或27的纳米结构，其中所述反义寡核苷酸具有硫代磷酸酯核苷间键。
31.权利要求30的纳米结构，其中少于所有的核苷间键是硫代磷酸酯。
32.权利要求26-31中任一项的纳米结构，其中所述反义寡核苷酸具有2’O甲基修饰。
33.权利要求32的纳米结构，其中少于所有的核苷酸包括2’O甲基修饰。
34.权利要求26的纳米结构，其中所述反义寡核苷酸具有17个核苷间键，且其中6个中心核苷间键是硫代磷酸酯。
35.权利要求26-34中任一项的纳米结构，其中所述反义寡核苷酸具有与包含SEQ IDNO:302中所示序列的至少8个连续核碱基的序列互补的核碱基序列。
36.权利要求35的纳米结构，其中所述反义寡核苷酸选自：mGmCmUmUmGmGG*C*A*G*G*T*mGmGmUmGmAmA/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:225)；
mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:288)；和
mGmUmAmGmGmGmCmGmUG*T*G*T*G*G*mGmUmC/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:291)，
其中–是指磷酸二酯键，*是指硫代磷酸酯键，且m是指O甲基。
37.权利要求26-36中任一项的纳米结构，其中所述纳米结构包括2-1,000个拷贝的所述反义寡核苷酸。
38.权利要求37的纳米结构，其中所述纳米结构包括至少两种不同的反义寡核苷酸。
39.权利要求26-38中任一项的纳米结构，其中所述核是实心核或空心核。
40.权利要求26-38中任一项的纳米结构，其中所述核是实心核并且进一步包含围绕所述核的脂质双层。
41.权利要求40的纳米结构，其中所述实心核包含由以下构成：贵金属，包括金和银，过渡金属，包括铁和钴，金属氧化物，包括二氧化硅，聚合物或其组合。
42.权利要求40的纳米结构，其中所述核是聚合物核，且其中所述聚合物核由以下构成：两亲性嵌段共聚物、疏水聚合物，包括聚苯乙烯、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(乙醇酸)、聚(己内酯)和其它生物相容性聚合物。
43.权利要求26-38中任一项的纳米结构，其中所述核是脂质体核。
44.权利要求43的纳米结构，其中所述脂质体核由一种或多种选自以下的脂质构成：1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)，1,2-二肉豆蔻酰基-sn-磷脂酰胆碱(DMPC)，1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-磷脂酰胆碱(POPC)，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DSPG)，1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)，1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)，1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和1,2-双十六烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)，鞘脂诸如鞘氨醇，磷酸鞘氨醇，甲基化鞘氨醇和二氢鞘氨醇，神经酰胺，神经酰胺磷酸酯，1-0酰基神经酰胺，二氢神经酰胺，2-羟基神经酰胺，鞘磷脂，糖基化鞘脂，硫苷脂，神经节苷脂，磷鞘脂和各种长度和饱和状态的植物鞘氨醇及其衍生物，磷脂诸如磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰胆碱，磷脂酸，溶血磷脂酸，环状LPA，磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰甘油，溶血磷脂酰甘油，磷脂酰丝氨酸，溶血磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，肌醇磷酸盐，LPI，心磷脂，溶血心磷脂，双(单酰基甘油)磷酸盐，(二酰基甘油)磷酸盐，醚脂质，二植烷基醚脂质和各种长度和饱和状态的缩醛磷脂，以及它们的衍生物，固醇诸如胆固醇，去氢胆固醇，豆固醇，羊毛固醇，7-烯胆甾烷醇，薯蓣皂苷配基，谷固醇，酵母固醇，zymostenol，14-脱甲基-羊毛固醇，胆固醇硫酸盐，DHEA，DHEA硫酸盐，14-脱甲基-14-脱氢羊毛固醇，二氢谷固醇，菜油固醇，醚阴离子脂质，醚阳离子脂质，镧系螯合脂质，A-环取代氧化固醇，B-环取代氧化固醇，D-环取代氧化固醇，侧链取代氧化固醇，双取代氧化固醇，胆石酸衍生物，氟化固醇，荧光固醇，磺化固醇，磷酸化固醇和不同长度、饱和状态的多不饱和固醇，及其衍生物。
45.权利要求26-38中任一项的纳米结构，其中所述核是泡囊。
46.多重反义寡核苷酸球形核酸(mASO-SNA)，其包含
具有寡核苷酸壳的核，所述寡核苷酸壳由靶向第一基因的长度为10至30个连接的核苷的反义寡核苷酸和靶向第二基因的长度为10至30个连接的核苷的反义寡核苷酸构成，其中所述核是由脂质双层围绕的固体或是脂质体或脂质(lipoplex)复合物核，且所述寡核苷酸壳位于所述核的外部。
47.权利要求46的mASO-SNA，其中所述第一基因和所述第二基因与疾病相关。
48.权利要求46或47的mASO-SNA，其中所述疾病是炎性病症。
49.权利要求46或47的mASO-SNA，其中所述疾病是银屑病。
50.权利要求46-49中任一项的mASO-SNA，其中所述第一基因和所述第二基因与靶途径相关。
51.权利要求46-50中任一项的mASO-SNA，其进一步包含靶向第三基因的长度为10至30个连接的核苷的反义寡核苷酸。
52.权利要求46-51中任一项的mASO-SNA，其中所述第一基因是白介素17受体(IL-17RA)。
53.权利要求46-52中任一项的mASO-SNA，其中所述第二基因是TNF。
54.权利要求46-53中任一项的mASO-SNA，其中所述第一基因和所述第二基因以近似等摩尔量存在于所述寡核苷酸壳中。
55.用于治疗病症的方法，其包括：
以有效治疗所述病症的量向具有病症的受试者施用多重反义寡核苷酸球形核酸(mASO-SNA)，其包含具有寡核苷酸壳的核，所述寡核苷酸壳由靶向第一基因的长度为10至30个连接的核苷的反义寡核苷酸和靶向第二基因的长度为10至30个连接的核苷的反义寡核苷酸构成，其中所述核是由脂质双层围绕的固体或是脂质体或脂质(lipoplex)复合物核，且所述寡核苷酸壳位于所述核的外部。
56.权利要求55的方法，其中所述病症是炎性病症。
57.权利要求55的方法，其中所述mASO-SNA产生所述第一和第二基因的同时mRNA敲低。
58.权利要求55的方法，其中所述第一基因和所述第二基因与靶途径相关。
59.权利要求58的方法，其中所述mASO-SNA产生靶途径的累加敲低。
60.权利要求55-59中任一项的方法，其中所述病症是银屑病。
61.用于治疗炎性病症的方法，其包括：
以有效治疗所述炎性病症的量向具有炎性病症的受试者施用包含权利要求1-25中任一项的寡核苷酸或权利要求26-44中任一项的纳米结构的组合物。
62.权利要求61的方法，其中所述炎性病症选自自身免疫性疾病、感染性疾病、移植排斥或移植物抗宿主病、恶性肿瘤、肺病症、肠道病症、心脏病症、败血症、脊椎关节病、代谢病症、贫血、疼痛、肝脏病症、皮肤病症、指甲病症、类风湿性关节炎、银屑病、伴随银屑病关节炎的银屑病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、血管炎、白塞氏病、强直性脊柱炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、再狭窄、糖尿病、贫血、疼痛、克罗恩氏病相关病症、青少年类风湿性关节炎(JRA)、丙型肝炎病毒感染、银屑病关节炎和慢性斑块性银屑病。
63.权利要求61的方法，其中所述炎性病症选自类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎、痛风性关节炎、过敏、多发性硬化症、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和肾炎综合征。
64.用于降低体内IL-17受体的表达水平的方法，其包括：
以有效降低体内IL-17受体水平的量向受试者施用包含权利要求1-25中任一项的寡核苷酸或权利要求26-44中任一项的纳米结构的组合物。
65.权利要求46-54中任一项的mASO-SNA，其中所述第一基因、所述第二基因和所述第三基因与靶途径相关。
66.权利要求46-54中任一项的mASO-SNA，其中所述第一基因和所述第二基因与不同的靶途径相关。
67.权利要求46-54中任一项的mASO-SNA，其中所述第一基因、所述第二基因和所述第三基因与不同的靶途径相关。
68.权利要求46-51中任一项的mASO-SNA，其中所述第一基因是白介素-4受体(IL-4R)。
69.权利要求46-53中任一项的mASO-SNA，其中所述第二基因是白介素-1β(IL-1β)。
70.权利要求46-54中任一项的mASO-SNA，其中所述第三基因是结缔组织生长因子(CTGF)。
71.权利要求46-54中任一项的mASO-SNA，其中所述第一基因、所述第二基因和所述第三基因以近似等摩尔量存在于所述寡核苷酸壳中。
72.药物组合物，其包含稳定的自组装纳米结构，其中所述自组装纳米结构包含具有寡核苷酸壳的核，所述寡核苷酸壳由位于核的外部的靶向白介素17受体(IL-17R)的长度为18至21个连接的核苷的反义寡核苷酸构成。
73.权利要求72的药物组合物，其中所述反义寡核苷酸长度为18个核苷酸。
74.权利要求72或73的药物组合物，其中IL-17RA具有SEQ ID NO:302的序列。
75.权利要求72-74中任一项的药物组合物，其中少于所有的核苷间键是磷酸二酯。
76.权利要求72-74中任一项的药物组合物，其中所述反义寡核苷酸具有硫代磷酸酯核苷间键。
77.权利要求76的药物组合物，其中少于所有的核苷间键是硫代磷酸酯。
78.权利要求72-77中任一项的药物组合物，其中所述反义寡核苷酸具有2’O甲基修饰。
79.权利要求78的药物组合物，其中少于所有的核苷酸包括2’O甲基修饰。
80.权利要求72的药物组合物，其中所述反义寡核苷酸具有17个核苷间键，且其中6个中心核苷间键是硫代磷酸酯。
81.权利要求72-80中任一项的药物组合物，其中所述反义寡核苷酸具有与包含SEQ IDNO:302中所示序列的至少8个连续核碱基的序列互补的核碱基序列。
82.权利要求81的药物组合物，其中所述反义寡核苷酸选自：mGmCmUmUmGmGG*C*A*G*G*T*mGmGmUmGmAmA/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:225)；
mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:288)；和
mGmUmAmGmGmGmCmGmUG*T*G*T*G*G*mGmUmC/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:291)，
其中–是指磷酸二酯键，*是指硫代磷酸酯键，且m是指O甲基。
83.权利要求72-82中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物包含凝胶媒介物。
84.权利要求72-82中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物包含1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、甘油、羟乙基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、EDTA二钠、偏亚硫酸氢钠和水中的一种或多种。
85.权利要求84的药物组合物，其中所述药物组合物包括至少0.00007％的mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:288)、至少0.0003801％的DOPC、至少25％的二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、至少5％的甘油、至少1％的羟乙基纤维素、至少0.15％的对羟基苯甲酸甲酯、至少0.05％的对羟基苯甲酸丙酯、至少0.1％的EDTA二钠、至少0.2％的偏亚硫酸氢钠和至少68.5％的水。
86.权利要求84的药物组合物，其中所述药物组合物包括至少0.007％的mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:288)、至少0.03801％的DOPC、至少25％的二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、至少5％的甘油、至少1％的羟乙基纤维素、至少0.15％的对羟基苯甲酸甲酯、至少0.05％的对羟基苯甲酸丙酯、至少0.1％的EDTA二钠、至少0.2％的偏亚硫酸氢钠和至少68.45％的水。
87.权利要求84的药物组合物，其中所述药物组合物包括至少0.01419％的mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:288)、至少0.2655％的DOPC、至少25％的二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、至少5％的甘油、至少1％的羟乙基纤维素、至少0.15％的对羟基苯甲酸甲酯、至少0.05％的对羟基苯甲酸丙酯、至少0.1％的EDTA二钠、至少0.2％的偏亚硫酸氢钠和至少68.2％的水。
88.权利要求84的药物组合物，其中所述药物组合物包括至少0.1419％的mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:288)、至少2.655％的DOPC、至少25％的二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、至少5％的甘油、至少1％的羟乙基纤维素、至少0.15％的对羟基苯甲酸甲酯、至少0.05％的对羟基苯甲酸丙酯、至少0.1％的EDTA二钠、至少0.2％的偏亚硫酸氢钠和至少65.7％的水。
89.权利要求84的药物组合物，其中所述药物组合物包括至少1.419％的mCmCmCmAmCmAmGG*G*G*C*A*T*mGmUmAmGmU/isp18//isp18//3CholTEG/(SEQ ID NO:288)、至少26.55％的DOPC、至少25％的二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、至少5％的甘油、至少1％的羟乙基纤维素、至少0.15％的对羟基苯甲酸甲酯、至少0.05％的对羟基苯甲酸丙酯、至少0.1％的EDTA二钠、至少0.2％的偏亚硫酸氢钠和至少40.5％的水。
90.药物组合物，其包含权利要求1-25中任一项的寡核苷酸。
91.权利要求90的药物组合物，其中所述药物组合物进一步包含凝胶媒介物。
92.权利要求90或91的药物组合物，其中所述药物组合物包含1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、甘油、羟乙基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、EDTA二钠、偏亚硫酸氢钠和水中的一种或多种。
93.药物组合物，其包含权利要求46-54中任一项的mASO-SNA。
94.权利要求93的药物组合物，其中所述药物组合物进一步包含凝胶媒介物。
95.权利要求93或94的药物组合物，其中所述药物组合物包含1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、甘油、羟乙基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、EDTA二钠、偏亚硫酸氢钠和水中的一种或多种。
96.用于治疗病症的方法，其包括：
以有效治疗所述病症的量向具有病症的受试者施用包含多重反义寡核苷酸球形核酸(mASO-SNA)的药物组合物，所述多重反义寡核苷酸球形核酸包含具有寡核苷酸壳的核，所述寡核苷酸壳由靶向第一基因的长度为10至30个连接的核苷的反义寡核苷酸和靶向第二基因的长度为10至30个连接的核苷的反义寡核苷酸构成，其中所述核是由脂质双层围绕的固体或是脂质体或脂质复合物核，且所述寡核苷酸壳位于所述核的外部。
97.权利要求96的方法，其中所述药物组合物进一步包含凝胶媒介物。
98.权利要求96的方法，其中所述药物组合物包含1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、甘油、羟乙基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、EDTA二钠、偏亚硫酸氢钠和水中的一种或多种。
99.权利要求96-98中任一项的方法，其中所述病症是炎性病症。
100.权利要求96-99中任一项的方法，其中所述mASO-SNA产生所述第一和第二基因的同时mRNA敲低。
101.权利要求96-100中任一项的方法，其中所述第一基因和所述第二基因与靶途径相关。
102.权利要求101的方法，其中所述mASO-SNA产生靶途径的累加敲低。
103.权利要求96-102中任一项的方法，其中所述病症是银屑病。
104.用于治疗炎性病症的方法，其包括：
以有效治疗所述炎性病症的量向具有炎性病症的受试者施用包含权利要求1-25中任一项的寡核苷酸、权利要求26-44中任一项的纳米结构或权利要求46-54中任一项的mASO-SNA的药物组合物。
105.权利要求104的方法，其中所述药物组合物进一步包含凝胶媒介物。
106.权利要求104的方法，其中所述药物组合物包含1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、二乙二醇单乙醚(Transcutol P)、甘油、羟乙基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、EDTA二钠、偏亚硫酸氢钠和水中的一种或多种。
107.权利要求104-106中任一项的方法，其中所述炎性病症选自自身免疫性疾病、感染性疾病、移植排斥或移植物抗宿主病、恶性肿瘤、肺病症、肠道病症、心脏病症、败血症、脊椎关节病、代谢病症、贫血、疼痛、肝脏病症、皮肤病症、指甲病症、类风湿性关节炎、银屑病、伴随银屑病关节炎的银屑病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、血管炎、白塞氏病、强直性脊柱炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、再狭窄、糖尿病、贫血、疼痛、克罗恩氏病相关病症、青少年类风湿性关节炎(JRA)、丙型肝炎病毒感染、银屑病关节炎和慢性斑块性银屑病。
108.权利要求104-106中任一项的方法，其中所述炎性病症选自类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎、痛风性关节炎、过敏、多发性硬化症、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和肾炎综合征。
109.用于降低体内IL-17受体的表达水平的方法，其包括：
以有效降低体内IL-17受体水平的量向受试者施用包含权利要求1-25中任一项的寡核苷酸、权利要求26-44中任一项的纳米结构或权利要求46-54中任一项的mASO-SNA的药物组合物。
110.权利要求109的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
111.权利要求109的方法，其中所述受试者是人。
112.权利要求109-111的方法，其中使所述药物组合物与受试者中的细胞接触至少24小时。
113.权利要求109-112中任一项的方法，其中所述药物组合物是局部药物组合物。
114.用于降低体外IL-17受体(IL-17R)的表达水平的方法，其包括：
使细胞与有效降低体外IL-17R水平的量的权利要求1-25中任一项的寡核苷酸、权利要求26-44中任一项的纳米结构或权利要求46-54中任一项的mASO-SNA接触。
115.权利要求114的方法，其中所述细胞是人包皮角质形成细胞(HFK)。
116.权利要求114或115的方法，其中使所述细胞与浓度为1nM、10nM、100nM或1000nM的寡核苷酸、纳米结构或mASO-SNA接触。
117.权利要求114-116中任一项的方法，其中使所述细胞与所述寡核苷酸、纳米结构或mASO-SNA接触24小时。
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