MX2008008548A

MX2008008548A - Peptidos utiles como petidos penetradores de celulas.

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Publication number: MX2008008548A
Application number: MX2008008548A
Authority: MX
Inventors: Roland Brock; Rainer Fischer; Mariola Fotin-Mleczek; Hansjoerg Hufnagel; Norbert Windhab
Original assignee: Evonik Roehm Gmbh
Priority date: 2005-12-30
Filing date: 2006-10-25
Publication date: 2008-09-10
Also published as: JP2009521908A; KR101317100B1; JP5264502B2; CA2646833C; EP1966240B3; EP1966240B1; ES2361621T7; ATE501169T1; EP1966240A1; AU2006332193A1; WO2007076904A1; BRPI0620806B8; CN101395180B; IL192131A; BRPI0620806A2; US20160151504A1; ES2361621T3; CN101395180A; US20130108662A1; CA2646833A1

Abstract

La presente invención está re1acionada con un péptido que tiene una secuencia de aminoácido, que comprende por lo menos 8 aminoácidos consecutivos de la proteína lactoferrina humana a de la proteína lactoferrina bovina, por medio del cual el péptido es adecuado para actuar como péptido penetrador de célula.

Description

PÉPTIDOS ÚTILES COMO PÉPTIDOS PENETRADORES DE CÉLULAS La presente invención trata de un péptido que es adecuado para ser usado como péptido penetrador de células, complejos que comprenden el mismo y el uso del mismo. Los péptidos penetradores de células (CPPs) tales como penetratin derivado de antenapedia (Derossi y colaboradores, J. Biol . Chem. , 269, 10444-10450, 1994) y el péptido Tat (Vives y colaboradores, J. Biol. Chem., 272, 16010-16017, 1997) son herramientas ampliamente utilizadas para la entrega de moléculas de carga tales como los péptidos, las proteínas y los oligonucleótidos (Fischer y colaboradores, Bioconjug. Chem., 12, 825-841, 2001) a las células. Las áreas de aplicación varían desde la investigación biológica puramente celular a la biomédica (Dietz y B hr, Mol. Cell . , Neurosci, 27, 85-131, 2004). Inicialmente se creía que la recolección celular ocurría por permeación directa de la membrana del plasma (Prochiantz, Curr. Opin. Cell Biol., 12, 400-406, 2000). En años pasados, se acumuló evidencia de que para varios CPP la endocitosis contribuye por lo menos de manera considerable a la recolección celular para varios CPPs (para una revisión, véase Fotin-Mleczek y colaboradores, Curr. Pharm. Design, 11, 3613-3628, 2005) . Dados estos resultados recientes, la especificación del péptido como CPP no implica por lo tanto un mecanismo de importación celular específico, sino más bien hace referencia a una función como un péptido que, cuando se conjuga con una carga, ya sea covalente o no covalentemente, aumenta la recolección celular de la molécula carga. Aunque estos CPPs han demostrado en principio que son adecuados para la distribución de péptidos, proteínas y oligonucleótidos hacia las células, todavía existe una necesidad de proporcionar otros CPPs que permitan la distribución de dichas moléculas como moléculas carga. En particular, existe una necesidad de CPPs que (i) permitan una liberación rápida de la molécula de carga desde la vía endolisosómica y (ii) eviten reacciones inmunológicas al momento de aplicación en el hombre. El problema subyacente en la presente invención se soluciona en un primer aspecto por un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos 8 aminoácidos consecutivos de la proteína lactoferrina humana o de la proteína lactoferrina bovina, por lo que el péptido es adecuado para actuar como péptido penetrador de células. En una forma de realización del primer aspecto el péptido comprende por lo menos 4 aminoácidos catiónicos. En una forma de realización de la primera proteína lactoferrina humana tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ.ID.No. 1 y la proteína lactoferrina bovina tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ.ID.No.

En una forma de realización del primer aspecto el péptido comprende por lo menos dos residuos Cis o análogos del mismo. En una forma de realización preferida del primer aspecto el péptido comprende un enlace de disulfuro creado por dos residuos Cis o un enlace analógico formado por los análogos de cisteína. En una forma de realización del primer aspecto el péptido comprende una mitad que tiene una conformación helicoidal alfa de más o menos 12 a 20 aminoácidos de largo, y una mitad que tiene una conformación laminar beta de más o menos 8 a 12 aminoácidos de largo. En una forma de realización del primer aspecto el péptido comprende más o menos de 8 a más o menos 60 residuos de aminoácidos. En una forma de realización preferida del primer aspecto el péptido comprende más o menos de 20 a más o menos 45 residuos de aminoácidos. En una forma de realización del primer aspecto el péptido tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a las posiciones de aminoácidos 20 a 64 de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ.ID.No.l. En una forma de realización del primer aspecto el péptido tiene una secuencia de aminoácidos, en la cual el extremo de terminal N del péptido es un aminoácido que corresponde a las posiciones de aminoácidos 20 a 64 de la secuencia de aminoácidos acorde con SEQ.ID.No. 1 ó SEQ.ID.No. 2. En una forma de realización del primer aspecto el péptido se selecciona a partir del grupo del compuesto de un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos KCFQ QRNMRKVRGPPVSCIKR (SEQ.ID.No. 3), un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos CFQWQRNMRKVRGPPVSC (SEQ.ID.No. 4); un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos FQ QRNMRKVRGPPVS (SEQ.ID.No. 5); un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos FQ QRNMRKVR (SEQ . ID . No . 6 ) ; un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos KCRRWQWRMKKLGAPSITCVRR (SEQ.ID.No. 29), y un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos CRRWQWRMKKLGAPSITC (SEQ.ID.No. 30), y derivados de los mismos. En una forma de realización preferida de la presente invención los péptidos penetradores de células comprenden una secuencia de aminoácidos acorde con SEQ.ID.No. 3, SEQ.ID.No. 4, SEQ.ID.No. 29 ó SEQ.ID.No. 30 ó una secuencia con una identidad de por lo menos 40%, de preferencia de por lo menos 50% en particular de preferencia de por lo menos 75% ó por lo menos 90% con dichas secuencias.

Los péptidos compuestos de SEQ.ID.No. 3, SEQ.ID.No. 4, SEQ.ID.No. 29 ó SEQ.ID.No. 30, con por lo menos 40% de identidad se caracterizan de preferencia por la sustitución o eliminación de 1 a 13 aminoácidos de SEQ.ID.No. 3 ó SEQ.ID.No. 29 respectivamente 1 a 10 aminoácidos de SEQ.ID.No. 4 ó SEQ.ID.No. 30. En donde las secuencias con una sustitución de uno o más aminoácidos con aminoácidos homólogos son de interés creciente. Los péptidos compuestos de una secuencia de aminoácidos acorde con SEQ.ID.No. 3, SEQ.ID.No. 4, SEQ.ID.No. 29 ó SEQ.ID.No. 30 ó una secuencia de con por lo menos 40% de identidad comprenden por lo menos 8 aminoácidos (péptidos derivados de SEQ.ID.No. 4 ó SEQ.ID.No. 30) respectivamente 9 aminoácidos (péptidos derivados de SEQ.ID.No. 3 ó SEQ.ID.No. 29) . Los citados péptidos de preferencia se encuentran entre 10 y 45 aminoácidos y de preferencia entre 14 y 25 aminoácidos . Los péptidos preferidos que comprenden una secuencia de aminoácidos acorde con SEQ.ID.No. 3, SEQ.ID.No. 4, SEQ.ID.No. 29 ó SEQ.ID.No. 30 representan una carga catiónica, en particular de por lo menos cuatro aminoácidos catiónicos localizados en SEQ.ID.No. 3, SEQ.ID.No. 4, SEQ.ID.No. 29 ó SEQ.ID.No. 30. Otra característica preferida de dichos péptidos es la presencia de por lo menos dos cisteínas o análogos de cisteína que pueden formar un puente disulfúrico o un puente análogo. Ambas cisteínas o sus análogos encierran por lo menos 6 aminoácidos, de preferencia entre 12 y 43 aminoácidos. En una forma de realización preferida del primer aspecto el péptido es un derivado de los péptidos conforme a cualquiera de SEQ.ID.No. 2 a 5, por lo que los residuos de metionina se sustituyen por un aminoácido seleccionado del grupo que comprende valina, isoleucina, norvalina, leucina y norleucina . En una forma de realización de mayor preferencia del primer aspecto el péptido es un péptido que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que comprende: KCFQWQRNVRKVRGPPVSCIKR (SEQ.ID.No. 7) KCFQWQRNIRKVRGPPVSCIKR (SEQ.ID.No. 8) KCFQWQRNXRKVRGPPVSCIKR (SEQ.ID.No. 9), por lo X es norvalina, KCFQWQRNLRKVRGPPVSCIKR (SEQ.ID.No. 10) KCFQWQRNXRKVRGPPVSCIKR (SEQ.ID.No. 28), por lo X es norleucina, CFQWQRNVRKVRGPPVSC (SEQ.ID.No. 11), CFQWQRNIRKVRGPPVSC (SEQ.ID.No. 12), CFQWQRNXRKVRGPPVSC (SEQ.ID.No. 13), por lo X es norvalina, CFQWQRNLRKVRGPPVSC (SEQ.ID.No. 14), CFQWQRNXRKVRGPPVSC (SEQ.ID.No. 15), por lo X es norleucina, FQWQRNVRKVRGPPVS (SEQ.ID.No. 16), FQWQRNIRKVRGPPVS (SEQ.ID.No. 17), FQWQR XRKVRGPPVS (SEQ.ID.No. 18), por lo X es norvalina, FQ QRNLRKVRGPPVS (SEQ.ID.No. 19), FQWQRNXRKVRGPPVS (SEQ.ID.No. 20), por lo X es norleucina, FQWQRNVRKVR (SEQ.ID.No. 21), FQWQRNIRKVR (SEQ.ID.No. 22), FQWQRNXRKVR (SEQ.ID.No. 23), por lo X es norvalina, FQWQRNLRKVR (SEQ.ID.No. 24), y FQWQRNXRKVR (SEQ.ID.No. 25), por lo X es norleucina. En una forma de realización del primer aspecto los derivados tienen un grupo de enlace de preferencia se selecciona del grupo compuesto de tioéteres, por lo que el compuesto de enlace sustituye a la enlace de disulfuro formada por estos residuos Cis. En una forma de realización del primer aspecto, el péptido es radioactivamente marcado, de preferencia por tener incorporado un aminoácido radioactivamente marcado, por lo que mucha mayor preferencia el aminoácido radioactivamente marcado es un aminoácido marcado con tritio. En una forma de realización del primer aspecto, el péptido además comprende una mitad que es adecuada para detección utilizando un método para detección, por lo que dicha mitad de preferencia se selecciona del grupo compuesto de fluoróforos, trazadores radioactivos y haptenos, por lo que de preferencia el hapteno es biotina. El problema subyacente de la presente invención también se soluciona en un segundo aspecto mediante un complejo compuesto de un péptido seleccionado del grupo compuesto de un péptido acorde con el primer aspecto, la lactoferrina humana y la lactoferrina bovina y una molécula de carga. En una forma de realización el segundo aspecto la molécula de carga se une de manera covalente o no covalente al péptido. En una forma de realización del segundo aspecto la molécula de carga se selecciona del grupo compuesto de ácido nucleico, ácidos aminos, péptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos y pequeñas moléculas y mezclas de cualquiera de los mismos . En una forma de realización del segundo aspecto la molécula de carga está presente como o es parte de una estructura, por lo que la estructura se selecciona a partir del grupo compuesto de nanopartículas , micropartículas , liposomas y micelo. En una forma de realización preferida del segundo aspecto el ácido nucleico es un ácido nucleico seleccionado del grupo compuesto de moléculas ADN, moléculas ARN, moléculas de APN, moléculas de ARNsi, moléculas antisentido, ribocimas, aptámeros, espiegélmeros y moléculas señuelo. En una forma de realización alternativa preferida del segundo aspecto el péptido es seleccionado del grupo compuesto de péptidos para vacunación. En otra forma de realización alternativa preferida del segundo aspecto el ácido nucleico es una vacuna con base en ácido nucleico. En otra forma de realización alternativa preferida del segundo aspecto, las nanopartículas y/o micropartículas comprenden o constan de un compuesto farmacéuticamente activo . El problema subyacente de la presente invención también se soluciona en un tercer aspecto por una composición compuesta por lo menos un péptido seleccionado del grupo compuesto de un péptido de acuerdo con el primer aspecto, lactoferrina humana y lactoferrina bovina y una molécula de carga . El problema subyacente de la presente invención también se selecciona en un cuarto aspecto mediante una composición compuesta de un compuesto conforme al segundo aspecto . El problema subyacente de la presente invención también se selecciona en un quinto aspecto por una codificación de ácidos nucleicos para un péptido conforme al primer aspecto, de preferencia con una secuencia de ácido nucleico acorde con SEQ.ID.No. 26 ó SEQ.ID.No. 27. El problema subyacente de la presente invención también se soluciona en un sexto aspecto por una composición compuesta de un ácido nucleico conforme al quinto aspecto y una molécula de carga. En una forma de realización preferida del sexto aspecto la molécula de carga es un ácido nucleico y más particularmente o un ARN adecuado para vacunación. En una forma de realización preferida del sexto aspecto la molécula de carga es una codificación de ácido nucleico para un péptido. En una forma de realización preferida de sexto aspecto el ácido nucleico de acuerdo con el quinto aspecto se vincula operativamente con la codificación del ácido nucleico para un péptido. En una forma de realización preferida del sexto aspecto el ácido nucleico de acuerdo con el quinto aspecto y la codificación del ácido nucleico para un péptido se enlazan en armazón. En una forma de realización del sexto aspecto, el péptido es un agente farmacéuticamente activo. El problema subyacente de la presente invención, también se soluciona en un séptimo aspecto mediante el uso de un péptido conforme al primer aspecto como un péptido penetrador de células. El problema subyacente de la presente invención también se soluciona en un octavo aspecto por un uso de lactoferrina humana o un derivado funciona de la misma o de lactoferrina bovina o un derivado funcional de la misma como un péptido penetrador de células. En una forma de realización del octavo aspecto la lactoferrina humana tiene una secuencia de aminoácidos compuesta de posiciones de aminoácidos de 20 a 711 de la secuencia de aminoácidos acorde con SEQ.ID.No. 1 ó derivado funcional del mismo y/o lactoferrina bovina tiene una secuencia de aminoácidos compuesta de posiciones de aminoácidos 20 a 708 de la secuencia de aminoácidos conforme a SEQ.ID.No. 2 ó un derivado funcional de la misma. El problema subyacente de la presente invención también se soluciona en un noveno aspecto por el uso de un péptido de acuerdo con el primer aspecto como un agente de transfeccion . El problema subyacente de la presente invención también se soluciona en un décimo aspecto por el uso de lactoferrina humana o un derivado funcional de la misma o de lactoferrina bovina o un derivado funcional de la misma como un agente de transfeccion. En una forma de realización del décimo aspecto la lactoferrina humana tiene una secuencia de aminoácidos que comprende posiciones de aminoácidos 20 a 711 de la secuencia de aminoácidos conforme a SEQ.ID.No. 1 y/o la lactoferrina bovina tiene una secuencia de aminoácidos que comprende posiciones de aminoácidos 20 a 708 de la secuencia de aminoácidos acorde con SEQ.ID.No. 2 ó un derivado funcional de la misma. El problema subyacente de la presente invención también se solución en un onceavo aspecto por el uso de una composición conforme al tercero, cuarto y el sexto aspecto para la elaboración de un medicamento. En una forma de realización del onceavo aspecto la molécula de carga es un agente farmacéuticamente activo. El problema subyacente de la presente invención también se selecciona en un doceavo aspecto por el uso de una composición de acuerdo con el tercero, cuarto y el sexto aspecto para la elaboración un agente de diagnóstico. En una forma de realización el doceavo aspecto la molécula de carga es un marcador de diagnóstico. El presente inventores encontraron sorprendentemente que la lactoferrina humana y la bovina y más específicamente los péptidos de las mismas, que también se denominan en el presente, como los péptidos conforme a la presente invención, son adecuadas para actuar como péptidos penetradores de célula (CPP) y de ese modo pueden distribuir moléculas de carga al citoplasma de una células. Un CPP de preferencia es cualquier péptido o proteína que es adecuada para penetrar una membrana celular, más preferiblemente la membrana del plasma de una célula de mamífero. Sin embargo, debe entenderse que el término CPP no implica un mecanismo de importación celular específico, más específicamente, los presentes inventores se dieron cuenta que los péptidos específicos derivados de lactoferrina humana son liberados desde compartimientos endolisosómicos de manera altamente eficiente que a su vez va acompañada con una derivación altamente eficiente de cualquier molécula de carga. Una vez que las moléculas de carga están disponibles en el citoplasma éstas pueden ejercer cualquier efecto asociado con las mismas. Hasta el momento los polipéptidos de acuerdo con la invención proporcionan un medio eficiente para influir en los mecanismos biológicos y las vías de unas células que pueden ser utilizadas tanto para investigación como para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Como se usa en el presente y si no se indica en contrario, el término péptido de acuerdo con la presente invención de preferencia también comprende lactoferrina humana y bovina como se define de manera preferible en el presente. Los péptidos de acuerdo con la presente invención, en principio, son fragmentos de lactoferrina humana o bovina, o un derivado de las mismas. Debido a este origen, los péptidos de acuerdo con la presente invención demuestran, además de que son adecuados para distribuir moléculas de carga al citoplasma, un perfil inmunológico benéfico en la medida en que los péptidos respectivos no provoquen una respuesta inmunitaria en un anfitrión humano o bovino expuesto a los péptidos respectivos de acuerdo con la presente invención. La lactoferrina humana (hLF) es una glicoproteína con enlace de hierro de 77 kDa de 692 aminoácidos que constituye 15% de la cantidad de la proteína contenida en la leche materna humana y también puede encontrarse en bajas concentraciones en el plasma de la sangre (Nemet y Smonovits, Haematologia (Budap.) 18, 3-121985). El homólogo bovino (bLF) consta de 688 aminoácidos y comparte 68% de aminoácidos con hLF (Crichton, Adv. Protein Chem. 40, 281-363, 1990) . Sin embargo, solamente 0.5-1% de proteína de leche de bovino es de bLF. Para ambas proteínas se han reportado propiedades antimicrobianas (Orsi, Biometals 17, 189-196, 2004; Ward y Conneely, Biometals 17, 203-208, 2004), antifúngicas , de enlace de LPS (Vogel y colaboradores, Biochem. Cell Biol . 80, 49-63, 2002) y antivirales (Berkhout y colaboradores, Biometals 17, 291-294, 2004) así como también varias actividades enzimáticas como actividad de DNasa, RNasa, ATPasa y fosfatasa (Kanyshkova y colaboradores, Eur. J. Biochem. 270, 3353-3361, 2003) . Las proteínas de Lactoferrina (LF) también actúan como factores de transcripción (He y Furmanski, Nature 373, 721-724, 1995) y tienen un impacto en la regulación inmunitaria induciendo la secreción de interleucinas (Sorimachi y colaboradores, Biochem. Mol. Biol Int. 43, 79-87, 1997; Vogel y colaboradores, 2002).

Los péptidos de acuerdo con la presente invención de preferencia son fragmentos de la región de la terminal N de lactoferrina humana o bovina. Otras características estructuras que ya sea de manera individual o en cualquier combinación pueden realizarse mediante los péptidos de acuerdo con la presente invención se divulgan más adelante a continuación . De preferencia, tal fragmento y de ese modo un péptido de acuerdo con la presente invención contiene por lo menos cuatro residuos de aminoácidos catiónicos. De mayor preferencia, estos fragmentos son catiónicos, es decir tienen una carga positiva general en los valores pH fisiológico. Los péptidos de acuerdo con la presente invención pueden compartir una combinación de estructuras secundarias tales como una forma helicoidal alfa y una forma laminar beta. En particular dicha conformación helicoidal y dicha conformación laminar forman mitades individuales de los péptidos. Prefiriéndose más que los péptidos estén compuestos de una estructura de hélice-giro-lámina. La longitud de tales metales típicamente varía de 12 a 20 aminoácidos y 8 a 12 aminoácidos de largo para las mitades con conformación helicoidal alfa y laminar beta, respectivamente. Otra característica inherente para las formas de realización preferidas de los péptidos de acuerdo con la presente invención es la presencia de por lo menos dos residuos Cis. Dicho residuos Cis están separados uno de otro por un número de aminoácidos intermitentes. De preferencia el número de tales aminoácidos intermitentes varía entre 8 y 200 aminoácidos, de mayor preferencia 14 y 18 y de mucho preferencia 16. En otra forma de realización adicional los dos residuos Cis se localizan en el extremo de terminal N y en el extremo, terminal C del péptido de acuerdo con la presente invención. Dentro de la presente invención es que los respectivos residuos Cis, ya sea de manera individual o en combinación, se localizan en o cerca de los extremos del péptido, es decir forman el extremo de la terminal N y la terminal C del péptido. Alternativamente, uno o ambos de dichos extremos Cis no forman el extremo respectivo del péptido, sino que el péptido comprende otros aminoácidos ascendentes del residuo Cis respectivo en el caso del extremo terminal N, o descendente del residuo Cis respectivo en caso del extremo de terminal C. En otra forma de realización más preferida los dos residuos Cis forman un enlace de disulfuro intramolecular, por lo que dicha enlace de disulfuro de preferencia existe bajo condiciones existentes cuando se aplica o utiliza los péptidos de acuerdo con la presente invención como CPPs . Los expertos en la técnica saben como generar dicha enlace de disulfuro al momento de o durante la síntesis del péptido respectivo. En una forma de realización alternativa, los dos residuos Cis forman un enlace de disulfuro intramolecular. En otra forma de realización más el enlace de disulfuro, si hubiese, es sustituido por una mitad que estructural y funcionalmente sustituye el enlace de disulfuro, sin embargo, no es sometido a segmentación reductiva. Dicha mitad es simplificada por, pero no limitada a un grupo metileno (JACS, 1985, 107, 2986-2987, Bioorg. Med. Chem Letter 1999, 9, 1767-1772, J. Med. Chem, 2002, 45, 1767-1777) , un puente tioéter (Yu y colaboradores Tetrahedron Lett, 1998, 39, 6633-6636) , un puente carbonilo (Pawlak y colaboradores J. Pept . Sci . 2001, 7, 128-140), y una cadena alifática más larga (Tetrahedron Leff. 2001, 42, 5804-5804), por lo que cada dicha mitad sustituye la enlace de disulfuro. Dependiendo del protocolo específico y la mitad utilizada para conectar los dos residuos de aminoácidos, la sustitución de los residuos de cisteína por otros componentes básicos, por ejemplo homoserina, pueden ser necesarios (Yu y colaboradores Tetrahedron Lett. 1998, 39, 6633-6636) como lo reconocerán los expertos en la técnica. De preferencia la longitud de la cadena linfática más larga es de más o menos 2 a más o menos 10 átomos de carbono, por lo que este rango comprende cualquier longitud entera intermedia. La longitud de los péptidos de acuerdo con la presente invención de preferencia varía entre más o menos 8 residuos de aminoácidos y más o menos 60 residuos de aminoácidos. De mayor preferencia la longitud varía de 15 a 45 residuos de aminoácidos, de mayor preferencia de 18 a 22 residuos de aminoácidos. Sin embargo, los expertos en la técnica reconocerán que la longitud de los péptidos no necesariamente se limita a los mismos y los derivados de los mismos pueden ser creados por los expertos en la técnica utilizando la orientación técnica proporcionada en el presente. Cualquier modificación en la medida que se encuentra dentro del alcance de la presente invención que todavía proporciona péptidos que actúan o pueden actuar como CPPs. En otra forma de realización preferida los péptidos de acuerdo con la presente invención son fragmentos de la lactoferrina humana o bovina. Preferiblemente la lactoferrina humana tiene el aminoácido de acuerdo con SEQ.ID.No. 1, y la lactoferrina bovina la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ.ID.No. 2. De mayor preferencia, los péptidos de acuerdo con la presente invención corresponden en su secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos compuesta de o definida por posiciones de aminoácidos 20 a 64 de la secuencia de acuerdo con la SEQ.ID.No. 1 ó la secuencia de acuerdo con la SEQ.ID.No. 2. Sin embargo, también dentro de la presente invención solamente parte de los péptidos de acuerdo con la presente invención se localizan dentro del rango antes definido de la secuencia de aminoácidos de lactoferrina humana o bovina. En una forma de realización más preferida, los péptidos de acuerdo con la presente invención se derivan de lactoferrina humana o bovina como se especifica en los párrafos anteriores y comparten uno o varios, de preferencia, todas las demás características estructuradas divulgadas en el presente. En otras formas de realización los péptidos de acuerdo con la presente invención se derivan de cualquiera de los péptidos de acuerdo con la presente invención descritos en el presente y en particular como se divulgan en los párrafos anteriores. Los expertos en la técnica reconocerán que la secuencia de aminoácidos de dichos péptidos puede cambiarse sin que dichos péptidos pierdan la característica de funcionar como un CPP . De preferencia tales cambios se realizan a la secuencia de aminoácidos. De mayor preferencia dicho cambio comprende la sustitución de un aminoácido de una categoría distinta por otro aminoácido de la misma categoría. Dichas categorías de preferencia son aminoácidos neutrales, aminoácidos hidrófobos (en particular incluyendo aminoácidos alifáticos) , aminoácidos catiónicos, aminoácidos aniónicos, aminoácidos con contenido de tiol, aminoácidos aromáticos y aminoácidos heterocíclicos . Los aminoácidos hidrófobos (que incluyen los aminoácidos alifáticos) de preferencia se seleccionan a partir del grupo compuesto de glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, los aminoácidos aromáticos de preferencia se seleccionan del grupo que consta de fenilalmina, tirosina y triptófano, los aminoácidos iónicos de preferencia se seleccionan del grupo de aminoácidos catiónicos como lisina, arginina, histidina y los aminoácidos aniónicos como aspartate y glutamato, los aminoácidos neutrales de preferencia se seleccionan del grupo serina, treonina, asparaginas, glutamina y metionina, los aminoácidos con contenido de tiol de preferencia son cisteína y metionina y los aminoácidos heterocíclicos de preferencia son prolina e histidina. En especial el residuo de petionina en la posición 46 puede intercambiarse por un residuo alifático tal y como, por ejemplo, pero sin limitarse a valina, norvalina, leucina o norvalina. Como los péptidos pueden obtenerse por protocolos de síntesis orgánica, las sustituciones de aminoácidos no se limitan a aquellos de los aminoácidos proteinógenos . Cualquier componente básico que incluye, pero no se limita a, aminoácidos no proteinógenos y aminoácidos beta, que pueden incorporarse por procedimientos químicos adecuados pueden incluirse en el péptido. Particularmente preferidos los péptidos de acuerdo con la presente invención son aquellos que tienen una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ.ID.No. 3 y de acuerdo con SEQ.ID.No. 4 y los derivados respectivos de los mismos.

Dentro de la presente invención si un péptido de acuerdo con la presente invención es la lactoferrina humana o bovina, tal péptido, en una forma de realización preferida, también comprende fragmentos de la proteína de lactoferrina humana o bovina de longitud completa. Dichos fragmentos de preferencia son fragmentos funcionalmente activos. Como se usa en el presente un fragmento funcionalmente activo de la lactoferrina humana o bovina es o comprende una parte de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ.ID.No. 1 ó SEQ.ID.No. 2 bajo la condición de que dicho fragmento será mostrado una actividad de CPP, preferiblemente una actividad de CPP como se define en el presente. De preferencia la actividad de dicho péptido como un CPP, ó actividades CPP puede ser determinada por la conjugación del péptido respectivo con un fluorocromo o hapteno que en este caso sirve tanto como grupo reportador como una molécula de carga y permite la detección y cuantificación de recolección celular por método conocidos para aquellos familiarizados con la técnica. Tales métodos incluyen pero no se limitan a (i) citometría de flujo y microscopía fluorescente para fluoróforos que sirven como un grupo reportador, o (ii) la fijación y permeabilización de células seguido por incubación con un agente reactivo adecuado para la detección de haptenos que sirven como un grupo reportador. Alternativamente, el CPP puede marcarse radioactivamente, por ejemplo mediante la incorporación de aminoácidos radioactivamente marcados y la recolección celular puede ser determinada por radiografía. El último método permite la determinación de recolección y distribución sólo de péptidos, sin ninguna carga. Se entiende que en el medida que el método respectivo lo permita, la recolección y distribución también pueden ser determinadas y cuantificadas para tejidos y organismos enteros. Alternativamente, la recolección puede determinarse de manera indirecta por medio de la actividad biológica de una molécula de carga conjugada con el CPP siendo que la molécula de carga ejerce su actividad biológica solamente si la molécula entra a la célula y llega a una ubicación subcelular particular tal y .como el citoplasma o el núcleo. En otras formas de realización los péptidos de acuerdo con la presente invención comprenden además una mitad que es adecuada para detección. De manera más específica, dicha mitad permite la detección del péptido. La mitad puede ser cualquier grupo adecuado para dicho fin. Mitades respectivas son conocidas para los expertos en la técnica y comprende, sin embargo, sin limitarse a, fluoróforos, tales como por ejemplo carboxifluoresceína o biotina. De preferencia la detección ocurre por medio de fluorescencia. Alternativamente, la detección también puede ocurrir por medio de radioactividad, por ejemplo después de la incorporación de yodol25 por protocolos conocidos para aquellos expertos en la técnica. La detección puede ocurrir al nivel de una célula individual, un tejido, un órgano o un animal. De preferencia el animal es un mamífero y de mayor preferencia se selecciona del grupo que comprende un perro, un gato, una oveja, una cabra, una rata, un ratón, una vaca, un caballo y un ser humano. En otro aspecto de la presente invención, los péptidos de acuerdo con la presente invención forman un complejo junto con una molécula de carga. Dicha molécula de carga puede ser cualquier molécula de carga como se define en el presente. El complejo puede ser ya sea un complejo covalente o un complejo no covalente compuesto de por lo menos un péptido de acuerdo con la presente invención y por lo menos una molécula de carga. También dentro de la presente invención el complejo comprende más de un péptido de acuerdo con la presente invención, es decir una pluralidad de dichos péptidos, por lo que la pluralidad de los péptidos puede comprende una pluralidad de los mismos o de diferentes péptidos. Además, el complejo de acuerdo con la presente invención también puede comprender más de una molécula de carga, por lo que la pluralidad de las moléculas de carga puede comprender una pluralidad de las mismas o de diferentes moléculas de carga. En una forma de realización, el complejo entre los péptidos de acuerdo con la presente invención y las moléculas de carga se forman por enlaces covalentes. Dichos enlaces covalentes de preferencia se forman entre ya sea el grupo reactivo adecuado del péptido y la carga y de mayor preferencia entre una terminal del péptido de acuerdo con la presente invención y la molécula de carga. Dependiendo de la naturaleza química de las moléculas de carga, la mitad, el grupo o el radical con el cual dicho enlace covalente se forma varía y se encuentra dentro de la capacidad de un experto en la técnica crear dicho enlace. En una forma de realización, el enlace covalente puede ser un enlace de amida formado entre el grupo carboxi del aminoácido de terminal C de un péptido de acuerdo con la presente invención y el grupo amino alfa del aminoácido de terminal N de un péptido que constituye una molécula de carga. Alternativamente, el complejo puede ser formado con base en enlaces no covalentes. Dichos enlaces no covalentes pueden ser enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno o interacción hidrófoba o una combinación de dichos enlaces. En una forma de realización esos enlaces no covalentes pueden ser formados una expansión de los residuos de lisina, unidos por enlaces covalentes a un péptido de acuerdo con la presente invención y el esqueleto de fosfato de un oligonucleótido . De preferencia la expansión de la lisina consta de más o menos 5 a 15 residuos de lisina. Las moléculas de carga son, en principio, no limitadas con respecto al tamaño, naturaleza química y/o función. De acuerdo con lo mismo la molécula de carga puede seleccionarse del grupo que comprende ácido nucleicos, péptidos, moléculas, lípidos, carbohidratos, nano y partículas y combinaciones de los mismos. En una forma de realización preferida las moléculas de carga se encuentran dentro de los enlaces establecidos por aplicaciones en biología celular o aplicaciones terapéuticas. En una forma de realización el ácido nucleico es cualquier polímero que comprende por lo menos dos nucleotidos que están covalentemente enlazados. En una forma de realización, un ácido nucleico puede ser una molécula de ADN ó una molécula de AR ó una mezcla de las mismas. También dentro de la presente invención se encuentra que el ácido nucleico comprende nucleotidos tipo L, nucleotidos tipo D ó mezclas. En otra forma de realización, la mitad base, la mitad de azúcar y/o la mitad de fosfato del nucleótido individual puede modificarse de manera individual e independiente para cada uno y cualquiera de los nucleotidos que forman el ácido nucleico o el análogo respectivo. Mitades de azúcar modificadas particularmente preferidas son aquellas que tienen un grupo metilo, metoxi, etilo o etoxi en el átomo 2' de la mitad de azúcar. Las mitades de fosfato modificadas particularmente preferidas son fosfotiatos. En otra forma de realización preferida, los ácidos nucleicos de péptidos se emplean.

En otra forma de realización preferida la molécula de carga es un aminoácido, que se origina del grupo aminoácidos tipo L ó tipo D. El aminoácido puede ser cualquier aminoácido, ya sea de origen natural o no natural. En otra forma de realización preferida la molécula de carga es un péptido, que está compuesto de por lo menos dos aminoácidos que están covalentemente enlazados, de preferencia a través de un enlace de péptido. En una forma de realización el péptido está compuesto de aminoácidos tipo L, aminoácidos tipo D ó mezclas de los mismos. Los aminoácidos puede ser cualquier aminoácido, ya sea de origen natural o no natural. En una forma de realización preferida el término péptido también comprende péptidos y proteínas como se entienden en forma general en la técnica. Los péptidos o proteínas pueden ser purificados desde fuentes naturales, obtenidos a través de síntesis orgánica u obtenidos por conjugación de aminoácidos sintéticos o para péptidos o proteínas obtenidos de fuentes naturales mediante protocolos familiares para aquellos expertos en la técnica y ejemplificados aunque no limitados a ligación química natural. De preferencia, los péptidos tendrán una longitud de 2 a 40 aminoácidos, de mayor preferencia de 2 a 20 aminoácidos y de mayor preferencia aún de 4 a 15 aminoácidos. Como se usa en el presente, el término proteína de preferencia hace mención de un polipéptido que contiene estructura secundaria y de mayor preferencia estructura terciaria . En otra forma de realización preferida la molécula de carga de una molécula pequeña, que por lo que una molécula péquela de preferencia es una molécula que tiene un peso molecular de 1000 D ó menos y prefiriéndose más que representa un medicamento o un posible medicamento. Una clase particularmente preferida de moléculas pequeñas son las moléculas heterocíclicas pequeñas. En otra forma de realización preferida la molécula de carga es un lípido o una estructura de un lípido tal y como una mitad del mismo. De preferencia, una molécula de esta clase ejercerá una función particular una vez que actúa en la célula ya sea dentro o en la membrana del plasma. Un ejemplo para lo anterior es el diacilglicerol . Este ejemplo ilustra que un lípido que ejerce dicha función particular se selecciona de preferencia del grupo que está compuesto de mensajeros intracelulares . Un ejemplo para el posterior y de ese modo que representa una posible molécula de carga es un lipopéptido, de preferencia de un lipopéptido con mitad S-[2, 3 -bis (palmitoiloxi) - (2RS) -propil] -N- palmitoil- (R) -cisteinil- (S) - seril-tetra- (S) -Usina y de mayor preferencia un péptido con una S-[2,3-bis (palmitoiloxi) - (2RS) -propil] -N-palmitoil - (R) -cisteinil - (S) -seril-tetra- (S) -Usina que actúa como un agonista o un antagonista de un receptor tipo Toll . En otra forma de realización preferida la molécula de carga es un carbohidrato.

En otra forma de realización preferida la carga es un agente de contraste que se utiliza para resonancia magnética. Dichos agentes de contrastes son por ejemplos aunque no se limitan gadolinio (III)-DTPA (ácido de dietilentriamina-pentaacético) ó gadolinio (III) -DOTA (ácido 1 , 4 , 7 , 10-tetraazaciclododecano- 1 , 4 , 7 , 10 -tetraacético) En otra forma de realización preferida, la molécula de carga es una partícula, una partícula puede ser una partícula polimérica, que consta, por ejemplo, de poliestireno reticulado, N- (2-hidroxipropil) metacrilamida reticulada, dextrano reticulado, un liposoma o un micelo. De preferencia, la partícula sirve como portador o contenedor para una molécula funcional . La molécula funcional puede ser cualquier molécula que ejerce una función dentro de las células, por ejemplo química-terapéuticas y oligonucleotidos y preferiblemente aquellas que también pueden servir como moléculas de carga para los péptidos de acuerdo con la presente invención. En acoplamiento general de la molécula funcional con la partícula, la carga respectiva de las moléculas funcionales en la partícula sirve para mejorar las propiedades farmacocinéticas de la molécula funcional, por ejemplo prolongando su circulación en el organismo mientras el acoplamiento de los péptidos de acuerdo con la presente invención transmite la entrega de estas moléculas funcionales a las células. Además de los péptidos de acuerdo con la presente invención, las partículas pueden además modificarse a través de una mitad o una molécula que media una selección objetivo de las partículas para células específicas. Un ejemplo para dicha selección de objetivo son los anticuerpos dirigidos contra las proteínas enriquecidas en la superficie de células cancerígenas. En una forma de realización la partícula puede tener un núcleo ferromagnético . Dichas partículas pueden ser utilizadas en aplicaciones tales como hipertermia con líquido magnético (Jordán y colaboradores, In J Hyperthermia, 12, 705-722, 1996). En otra forma de realización preferida la molécula de carga es un punto quantum. El acoplamiento de los péptidos de acuerdo con la presente invención con el punto quantum puede lograrse por acoplamiento covalente, por ejemplo por formación de enlace de amidas entre funcionalidades adecuadas en el péptido y el punto quantum o por interacciones no covalentes, por ejemplo entre una mitad de biotina y una molécula de estreptavidina se enlazó covalentemente a un punto quantum por alargamiento del péptido penetrador de células con un residuo de cisteína y acoplamiento con puntos quantums aminofuncionalizados utilizando un enlazador heterobifuncional (S. Santra y colaboradores, ChemComm, 2005, 3144-3146) . En otra forma de realización las moléculas de carga se pueden definir en términos funcionales, en una forma de realización particular la molécula de carga es una molécula ANRsi . Las moléculas ARNsi son pequeñas ARNs de interferencia dirigidas a un ácido nucleico objetivo, de preferencia ARNm, que codifica la molécula objetivo. El ARNsi es un ARN de doble filamento que tiene típicamente un longitud de más o menos 21 a más o menos nucleótidos. La secuencia de uno de los dos filamentos de ARN corresponde a la secuencia del ácido nucleico objetivo que va a ser degradado. En otras palabras, saber la secuencia de ácido nucleico de la molécula objetivo, de preferencia la secuencia de ARNm, se puede diseñar un ARN de doble filamento con uno de los dos filamentos siendo el complemento para el citado ARNm de la molécula objetivo y, a la aplicación del citado ARNsi a un sistema que contiene el gen, ADN genómico, ARNhn ó ARNM que codifica la molécula objetivo, el ácido nucleico objetivo correspondiente respectivo será degradado y de ese modo el nivel de la proteína respectiva reducido. Los principios básicos para diseñar, construir utilizar dicho ARNsi como medicamento y agente de diagnóstico, respectivamente, entre otros, se describe en las solicitudes de patente internacionales WO 00/44895 y WO 01/75164. En una forma de realización particular la molécula de carga es una ribocimas. Las ribocimas son ácidos nucleicos catalíticamente activos que de preferencia constan de ARN que básicamente comprenden dos mitades . La primera mitad muestra una actividad catalítica en tanto que la segunda mitad es responsable de la interacción específica con el ácido nucleico objetivo. Al momento de la interacción entre el ácido nucleico objetivo y la segunda mitad de la ribocima, típicamente por hibridación y el emparejamiento de base Watson-Crick de estiramientos esencialmente complementarios de las bases en los dos filamentos hibridizadores , la mitad catalíticamente activa puede volverse activa lo que significa que cataliza, ya sea de manera intramolecular o intermolecular, el ácido nucleico objetivo, en caso de que la actividad catalítica del ribocima es una actividad fosfodiesterasa . Posteriormente, puede haber más degradación del ácido nucleico objetivo que al final resulta en la degradación del ácido nucleico objetivo así como también de la proteína derivada del citado ácido nucleico objetivo debido a la falta de proteína recientemente sintetizada correspondiente al ácido nucleico objetivo y renovación de proteína anterior respectiva existente. Las ribocimas, su uso y principios de diseño son conocidos para el experto en la técnica y, por ejemplo se describen en Doherty y Doudna (estructuras y mecanismos de ribocimas. Annu ref. Biophys. Biomolstruct , 2001; 30: 475-75) y Lewin y Hauswirth (Terapia Genética con Ribocimas: aplicaciones para medicinas molecular. 2001 7:221-8). En una forma de realización particular la molécula de carga es una molécula antisentido. El uso de oligonucleótidos antisentido para la elaboración de un medicamento y como un agente de diagnóstico respectivamente, se basa en un modo similar de acción como el de las moléculas ARNsi y las ribocimas. Básicamente los oligonucleótidos antisentido se hibridizan con base en complementabilidad base con un ARN objetivo, de preferencia con ARNm, por lo que activa RNasa H. RNasa H se activa tanto por ADN de fosfodiéster como ADN acoplado con fosforotioato . Sin embargo, el ADN acoplado con fosfodiéster, se degrada rápidamente por nucleosas celulares con la excepción del ADN acoplado con fosforotioato . Estos derivados de ADN resistentes que no se presentan naturalmente no inhiben la RNasa H al momento de hibridación con ARN. En otras palabras, los polinucleótidos antisentido son sólo objetivos como complejos híbrido de ADN ARN. Ejemplos de esta clase oligonucleótidos antisentido se describen, entre otros, en la patente de Estados Unidos US 5,849,915 y US 5,989,912 en otras palabras, con base en la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula objetivo respetivo, ya sea a partir de la proteína objetivo de la cual una secuencia de ácidos nucleicos respectiva puede en principio deducirse, o por saber la secuencia de ácidos nucleicos como tales, particularmente el AR m, los oligonucleótidos antisentido adecuados pueden diseñarse con base en el principio de la complementabilidad base. Particularmente preferidos son los oligonucleótidos antisentido que tiene un estiramiento corto de ADN de fosforotioato (3 a 9 bases) . Un mínimo de 3 bases de ADN se requiere para la activación de la RNasa H bacteriana y un mínimo de 5 bases se requiere para activación de RNasa H de mamífero. En estos oligonucleótidos quiméricos existe una región central que forma un sustrato para RNasa H que está flanqueado por o mediante la hibridación de "brazos" compuestos de nucleótidos modificados que no forman los sustratos para RNasa H. Los brazos hibridizadores de los oligonucleótidos quiméricos pueden modificarse tal y como por 2'-0-metil ó 2 '-flúor. Enfoques alternativos utilizaron enlaces de metilfosfonato o fosforamidato en tales brazos. Otras formas de realización del oligonucleótido antisentido útiles en la práctica de la presente invención son P-metoxioligonucleótidos , P-metoxioligodeoxiribonucleótidos parciales ó P-metoxioligonucleótidos parciales.

Qwrfw gqehbadedgqwergm, . afsdnkdklewjwsmnde carta es un aptámero o un espiegelmero. Los aptámeros son ácidos D-nucleicos que tienen un solo filamento o doble filamento y que interactúan específicamente con una molécula objetivo. La elaboración o selección de aptámeros, por ejemplo, se describen en la Patente Europea EP 0 533 838. Básicamente los siguientes pasos se realizan. Primero, una mezcla de ácidos nucleicos, es decir aptámeros potenciales, se proporciona por lo que ácido nucleico comprende típicamente un segmento de varios, de preferencia por lo menos 8 nucleótidos aleatoriamente subsiguientes. Esta mezcla entra en contacto posteriormente con la molécula objetivo por lo que los ácidos nucleicos se unen a la molécula objetivo, de manera que con base en una afinidad creciente hacia el objetivo o con una fuerza mayor a la misma, en comparación con la mezcla candidato. Los ácidos nucleicos de enlace son posteriormente separados del resto de la mezcla. Opcionalmente , los ácidos nucleicos así obtenidos se amplifican . utilizando, por ejemplo reacción en cadena de polimerasas. Estos pasos pueden repetirse varias veces dando al final una mezcla que tiene un aumento en proporción de ácidos nucleicos específicamente vinculantes al objetivo a partir de lo que el ácido nucleico vinculante final se selecciona opcionalmente. Estos ácidos nucleicos específicamente vinculantes se denominan aptámeros. Es obvio que en cualquier etapa del método para la generación o identificación de los aptámeros muestra de las mezcla de ácidos nucleicos son individuales pueden tomarse para determina la secuencia de las mismas utilizando técnicas estándar. Dentro de la presente invención es que los aptámeros pueden estabilizarse tal y como, por ejemplo, introduciendo grupos químicos definidos que son conocidos para el experto en la técnica de generar aptámeros . Tal modificador puede por ejemplo recibir en la introducción de un grupo amino en la posición 2' en la mitad de azúcar de los nucleotidos. Los aptámeros actualmente se utilizan como agentes terapéuticos. Sin embargo, también es dentro de la presente invención que los aptámeros seleccionados o generados de ese modo pueden usarse para validación objetivo. La generación o elaboración de espiegélmeros que pueden ser usados o generados de acuerdo con la presente invención dirigidos contra una molécula objetivo, se basan en un principio similar. La elaboración de espiegélmeros en la solicitud de patente internacional WO 98/08856. Los espiegélmeros son ácidos nucleotidos tipo L, lo que significan que están compuestos de nucleotidos tipo L más que de aptámeros que están compuestos de nucleotidos tipo D como lo están los aptámeros. Los espiegélmeros se caracterizan por el hecho de que tienen una estabilidad muy alta en el sistema biológico y, en comparación con los aptámeros, interactúan específicamente con la molécula objetivo contra la cual están dirigidos. Con el fin de generar espiegélmeros , una población heterogénea de ácidos nucleotidos tipo D se crea y está población se pone en contacto con la antípoda óptica de la molécula objetivo, es decir con el enantiómero tipo D de los enantiómero tipo L de origen natural de la molécula objetivo. Posteriormente, esos ácidos nucleicos tipo D se separan sin que interactúan con la antípoda óptica de la molécula objetivo. No obstante, esos ácidos nucleicos tipo D que interactúan con la antípoda óptica de la molécula objetivo se separan, determinados y/o secuenciados opcionalmente y posteriormente los ácidos nucleicos tipo L correspondiente se sintetizan con base en la información de secuencia de ácidos nucleicos obtenida a partir de los ácidos nucleotidos tipo D. Estos ácidos nucleicos tipo L que son idénticos en términos de secuencia con los ácidos nucleicos tipo D antes mencionados que interactúan con la antípoda óptica de la molécula objetivo, interactuarán específicamente con la molécula objetivo de origen natural más que con la antípoda óptica de la misma. Similar al método para la generación de los aptámeros también es posible repetir los diversos pasos varias veces y de ese modo enriquecer a esos ácidos nucleicos que específicamente interactúan con la antípoda óptica de la molécula objetivo. En una forma de realización particular la molécula de carga es un oligodesoxinucleotido corto de doble filamento que actúa como una molécula señuelo uniéndose específicamente a los factores de transcripción dentro de la célula. Estas moléculas señuelo se dice que son eficientemente captadas por células sin necesidad de portadores específicos. Se espera que la eficiencia y la distribución citoplásmica pueda mejorarse más mediante la conjugación con un CPP de acuerdo con la presente invención. En una forma de realización particular la molécula de carta es un anticuerpo. La elaboración de un anticuerpo es conocida para un experto en la técnica y, por ejemplo, se describe en Harlow, E., and Lañe, D., "Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988) . De preferencia, los anticuerpos monoclonales pueden utilizarse en conexión con la presente invención que pueden ser elaborados de acuerdo con el protocolo de Kóhler y Milstein y otros desarrollados basados en los mismos. Los anticuerpos como s usan en el presente, incluye, pero no se limitan a, anticuerpos completos, fragmentos de anticuerpo o derivados tales como fragmentos Fab, fragmentos Fe y anticuerpos de un solo filamento, siempre y cuando sean adecuados y capaces de unirse a la proteína quinasa N beta. Además de los anticuerpos monoclonales también se pueden usar anticuerpos policlonales y/o generarse. La generación de anticuerpos policlonales también es conocida para el experto en la técnica y, por ejemplo, se describen en Harlow, E., and Lañe, D., "Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988) . De preferencia, los anticuerpos que se utilizan con fines terapéuticos son anticuerpos de humano o humanizados como se define anteriormente. Los anticuerpos que pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención pueden tener uno o dos marcadores o etiquetas. Tales marcadores o etiquetas pueden ser útiles para detectar el anticuerpo ya sea en su aplicación de diagnóstico o su aplicación terapéutica. De preferencia los marcadores y etiquetas se seleccionan a partir del grupo que comprenden avidina, estreptavidina, biotina, oro y fluoresceína y se usan, por ejemplo, en método ELISA. Estos y otros marcadores así como también los métodos, se describen, por ejemplo en Harlow, E., and Lañe, D., "Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold 'Spring Harbor, NY (1988) . También dentro de la presente invención vemos que la etiqueta o el marcador muestra una función adicional además de la detección, tal y como la interacción con otras moléculas. Dicha interacción puede por ejemplo, ser interacción específica con otros compuestos. Estos otros compuestos pueden ser ya sea aquellos inherentes al sistema donde el anticuerpo se utiliza tal y como anticuerpo humano o animal o la muestra que se analiza utilizando el anticuerpo respectivo. Los marcadores apropiados pueden, por ejemplo, ser biotina o fluoresceína con los socios de interacciones específicos de los mismos tales como avidina y estraptevidina y similares presentes en el compuesto o estructura respectivos para interactuar con el anticuerpo así marcado o etiquetado . En una forma de realización particular la molécula de carga es un péptido vinculante objetivo específico. Dichos péptidos pueden generarse utilizando métodos de acuerdo con la técnica avanzada como la demostración de fagos. Básicamente, una biblioteca de péptidos se genera, tal y como en la forma de fagos y esta clase de bibliotecas se pone en contacto con la molécula objetivo respectiva. Esos péptidos que se unen a la molécula objetivo se retiran posteriormente, de preferencia como un complejo con la molécula objetivo, desde la reacción respectiva. Un experto en la técnica sabe que las características vinculantes, por lo menos hasta cierto punto, dependen de la configuración experimental particularmente realizada como la concentración de sales y similares. Después de separar estos péptidos que se unen a la molécula objetivo con una mayor afinidad o una mayor fuerza, desde los elementos no vinculantes de la biblioteca, y opcionalmente también después de la remoción de la molécula objetivo del complejo de la molécula objetivo y el péptido, los péptidos respectivos se pueden caracterizar posteriormente. Con anterioridad a la caracterización opcionalmente un paso de amplificación se lleva a cabo tal y como, por ejemplo, propagando los fagos codificadores de péptidos. Esta caracterización de preferencia comprende la secuenciación de los péptidos vinculantes objetivo. Básicamente, los péptidos no se limitan en sus longitudes, sin embargo, de preferencia los péptidos que tienen longitudes de más o menos 8 a 20 aminoácidos son los que se obtienen de preferencia en los métodos respectivos. El tamaño de las bibliotecas puede ser de más o menos 102 a 1018, preferiblemente 108 a 1015 péptidos diferentes, sin embargo, no están limitados a los mismos. Una forma particular de péptidos vinculantes objetivos son los denominados "anticalinos" que entre otros, se describen en la solicitud de Patente Alemana DE 197 42 706. En un aspecto más la invención se relaciona con un ácido nucleico que codifica un péptido de acuerdo con la presente invención. Dicho ácido nucleico puede ser fácilmente derivado por los expertos en la técnica con base a la secuencia de aminoácidos del péptido y el código genético. Será reconocido que dependiendo del organismo anfitrión la secuencia particular puede adaptarse al uso de codones del organismo anfitrión respectivo. La secuencia de ácidos nucleicos para la mayoría de los péptidos preferidos de acuerdo con la presente invención se pueden tomar de SEQ.ID.No. 6 y SEQ.ID.No. 27. En otro aspecto la invención se relaciona con un ácido nucleico que codifica un péptido, por lo que dicho péptido consta de un péptido de acuerdo con la presente invención y otro péptido o proteína, y por lo que dicha proteína generalmente se denomina como péptidos/proteínas de fusión. De acuerdo con los protocolos que conocen los expertos en la técnica este ácido nucleico puede servir ya sea como expresión y purificación de proteínas recombinantes que como una parte comprenden los péptidos de acuerdo con la presente invención o pueden ser usados en combinación con portadores adecuados en estrategias terapéuticas denominadas generalmente como terapia genética. En una forma de realización preferida el ácido nucleico que codifica el péptido adicional fusionado con el ácido nucleico que codifica el péptido de acuerdo con la presente invención, codifica un péptido que sirve como péptido para vacunación. En otra forma de realización preferida, el ácido nucleico codifica un péptido, por lo que el péptido de preferencia actúa como un inhibidor competitivo de las interacciones monoculares dentro de la célula. En otra forma de realización preferida el ácido nucleico codifica un péptido, por lo que el péptido de preferencia actúa como un sustrato para una reacción enzimática dentro de la célula. En otra forma de realización preferida el ácido nucleico codifica el dominio de una proteína, por lo que de preferencia actúa como un inhibidor competitivo de las interacciones moleculares dentro de la célula. En otra forma de realización preferida el ácido nucleico codifica un enzima, por lo que el enzima de preferencia es del grupo de hidrolasas. En otro aspecto más la invención trata de una proteína de fusión como se define en el presente y más particularmente de una proteína de fusión codificada por un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención. En otro aspecto la presente invención trata una composición que comprende ya sea un complejo de acuerdo con la presente invención, una composición que comprende un péptido de acuerdo con la presente invención, una composición que comprende un ácido nucleico que codifica un péptido de acuerdo con la presente invención, una composición que comprende un péptido de acuerdo con la presente invención y una molécula de carga, una composición que comprende una proteína de fusión de acuerdo con la presente invención, una composición que comprende un ácido nucleico que codifica dicha proteína de fusión y una composición que comprende lactoferrina humana y una molécula de carga. Dentro de las capacidades del experto en la técnica está la de las composiciones de acuerdo con la presente invención que pueden comprender uno o varios de los péptidos de acuerdo con la presente invención, uno o varios de los ácidos nucleicos de la presente invención y/o una o varios de las moléculas de carga. En relación con lo mismo se prefiere que el término "varios" signifique varias especies diferentes de los compuestos o moléculas respectivas. Será muy bien reconocido por los expertos en la técnica que la composición típicamente comprende una multitud de las especies individuales del péptido de la presente invención, del ácido nucleico que codifica a dicho péptido y/o la molécula fuera de la carga. En relación con lo mismo debe entenderse que cualquiera de las moléculas de carga descritas en el presente pueden utilizarse. En otro aspecto de la presente invención se trata de usar cualquiera de las composiciones o constituyentes de la misma que se describen en el presente como agente de transfección, como un medicamento, como un agente de diagnóstico. En caso de que la composición se utiliza como medicamento o como una composición farmacéutica, de preferencia la molécula de carga es un agente farmacéuticamente activo. Tales agentes farmacéuticamente activos pueden ser quimioterapéuticos como por ejemplo daunorubicina o péptidos que interfieren con las interacciones moleculares dentro de la célula, o cualquiera de las moléculas que se describen en el presente como moléculas de carga, por lo que de preferencia dichas moléculas de carga son farmacéuticamente activas o preformas de dichas moléculas farmacéuticamente activas. En caso de que la composición se use como un agente de diagnóstico, de preferencia la molécula de carga es un marcador de diagnóstico. Dicho marcador de diagnóstico puede ser un sustrato fluorogénico para detectar la actividad de una proteasa patológicamente pertinente, por ejemplo una caspasa que participa en el inicio y la ejecución de apoptosis dentro de la célula. Está dentro de la presente invención que los péptidos de acuerdo con la presente invención se distribuyan de preferencia a un tipo específico de células o tejido u órgano que comprenden dicho tipo específico de células. En una forma de realización preferida dicha distribución específica es mediada a través de una mitad objetivo o molécula objetivo que son, en su totalidad, también mencionadas en el presente como la entidad objetivo. En una forma de realización más preferida, dicha mitad objetivo es o por la parte del péptido de acuerdo con la presente invención o la parte de la molécula de carga. De manera alternativa o adicional, dicha mitad objetivo es parte del complejo o la composición de acuerdo con la presente invención . La entidad objetivo de preferencia se selecciona a partir del grupo que comprende péptidos, proteínas, incluyendo anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de cadena sencilla, aptámeros, espiegélmeros y ligandos que se unen a receptores superficiales de célula. Es bien conocido por los expertos en la técnica que en principio una mitad socio o molécula de acuerdo combinación de socios de interacción pueden utilizarse para proporcionar un objetivo, como una entidad objetivo. Esto incluye el uso de ligando con receptores que se expresan y de manera más particular se sobreexpresan en un tipo distinto de célula o ligando son moléculas que se expresan y más particularmente sobreexpresan en un tipo de célula distinto. En el último caso un socio de interacción particularmente prominente del mismo que actúa como una entidad objetivo se selecciona del grupo que comprende anticuerpos, aptámeros, espiegélmeros, péptidos vinculantes altamente específicos y anticalinos. Esta clase de socios de interacción y su especificidad por un tipo particular de célula es conocida para los expertos en la técnica. Entre otros la proteína ErbB2 es específica para células de cáncer de mama. En consecuencia, un anticuerpo dirigido contra las mismas es una entidad objetivo adecuada. En una forma de realización preferida, la mitad objetivo se incluye en o sobre las partículas descritas en el presente que pueden ser usadas como moléculas de carga. Debido al tamaño de dichas partículas, el uso de una entidad objetivo más voluminosa tal y como un anticuerpo es preferible en relación con dicha forma de realización. En otra forma de realización preferida, el CPP, es decir, un péptido de acuerdo con la presente invención, es acoplado a una mitad que oculta intramolecular el CPP y evita que el CPP actúe como un CPP. Un enlace enzimáticamente dividido se incorpora entre el CPP y la mitad de ocultamiento . Dicho enfoque de enmascaramiento molecular ha sido descrito para el objetivo de un fluoróforo conjugado con el CPP nonarginina. El CPP nonarginina se enlazó a un estiramiento de ácido hexaglutámico a través de un enlazador de péptidos que corresponde al sitio de escisión para metaloproteinasas 2 y 3 de matriz. Estas proteasas son secretadas por células tumorales en altas concentraciones . La secreción de las proteasas divide selectivamente la construcción de máscara de CPP en la cercanía de las células cancerosas, permitiendo por lo mismo la recolección eficiente de la construcción de carga de CPP a las células cancerosas ((T. Jiang y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci, USA 101, 17867-17872, 2004) . Hasta el momento, esta forma de realización, representa un medio objetivo o de distribución efectivo para selección de objetivos y/o distribución específicas de tumores.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden elaborarse mediante procesos bien conocidos en la técnica; por ejemplo por medio de procesos convencionales de mezclar, disolver, granular, elaborar grageas, levigar, emulsionar, encapsular, atrapar o liofilizar . Las composiciones farmacológicas para uso de acuerdo con la presente invención pueden de ese modo formularse de manera convencional utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden ser utilizadas farmacéuticamente. La formulación correcta depende la vía de administración elegida. Para la inyección, los compuestos de la invención pueden formularse en soluciones líquidas, de preferencia en soluciones amortiguadoras fisiológicamente compatibles tales como la solución de Hanks, la solución de Ringer o la solución amortiguadora fisiológica salina. Para administrar transmucosal , los penetrantes apropiados para la barrera que va a ser permeada se utilizan en la formulación. Tales penetrantes generalmente se conocen en la técnica. La formulación que promueve la penetración de la epidermis es conocida en la farmacología y puede encontrar uso en el tratamiento de muchas condiciones en la piel, tales como, pero sin limitarse a, psoriasis e infecciones fúngicas. Las formulaciones que promueven la penetración de la epidermis y las capas subyacentes de la piel también son conocidas, y pueden ser utilizadas para aplicar composiciones de la presente invención para, por ejemplo, músculos o articulaciones subyacentes. En algunas formas de realización terapéuticas preferidas, la formulación comprende composiciones de la presente invención que distribuyen compuestos para alivio de artritis reumatoide u osteoartritis que pueden ser administradas aplicando una crema, ungüento o gel a la piel que se encuentra encima de la articulación afectada . La administración oral parenteral puede utilizarse cuando el péptido y/o complejo se hace lo suficiente estable para humedecer el ambiente protiolítico difícil de las entrañas. Si es así, la composición de acuerdo con la presente invención puede ser formulada rápidamente combinando los compuestos activos con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales portadores permiten que los compuestos de la invención se formulan como comprimidos, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para ingestión oral por un paciente que va a recibir tratamiento. Las preparaciones farmacológicas de uso oral pueden hacerse con el uso de un excipiente sólido, opcionalmente triturando la mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos después de agregar auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos de núcleos de grageas . Los excipientes adecuados son, en particular, rellenos tales como azúcares, que incluye lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; las preparaciones de celulosa, tales como, por ejemplo almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, tragacanto de goma, celulosa de metilo, hidroxipropilmetil celulosa, carboximetil celulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona (PVP) . Si se desea, los agentes desintegradores pueden agregarse tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, o ácido algínico o una sal de los mismos tales como alginato de sodio. Los núcleos de gragea se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este objetivo, se pueden soluciones concentradas de azúcar, que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, solución de laca y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solvente. Los tintes o pigmentos pueden agregarse a las tabletas o a los recubrimientos de gragea para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos. Las composiciones farmacéuticas que pueden utilizarse oralmente incluyen cápsulas de ajuste a presión hechas de gelatina, así como cápsulas suaves, selladas, hechas de gelatina y un plastificante , tales como glicerol o sorbitol . Las cápsulas a presión pueden contener los ingredientes activos en el aditivo con un relleno tal y como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como alcohol o estearato de magnesio y, opcionalmente , estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, los estabilizadores pueden agregarse. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosis adecuadas para tal administración. Para administración bucal, las composiciones pueden tomarse en la forma de comprimidos o pastillas formulados de manera convencional. Para los péptidos y complejos pequeños de la invención, esto puede ser útil. Para administración por inhalación, la composición de acuerdo con la presente invención se administran conveniente en la forma de una presentación de aerosol o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dicloro-tetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso del aerosol presurizado la dosis unitaria puede determinarse proporcionando una válvula para distribuir una cantidad debida. Las cápsulas y cartuchos por ejemplo de gelatina para uso de un inhalador o insuflador pueden formularse de manera que contengan una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal y como lactosa o almidón. La composición de acuerdo con la presente invención puede formularse para administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección de bolo o infusión continua. En esta forma también es posible seleccionar como objetivo un órgano en particular, tejido, sitio de tumor, sitio de inflamación, etc. Las formulaciones para infección pueden presentare en la forma de dosis unitaria, por ejemplo, en ampolletas o en recipientes de múltiples dosis con la adición de un conservador. Las composiciones también pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes formuladores tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de las composiciones en forma soluble en agua. Además, las suspensiones de las composiciones pueden prepararse como suspensiones de inyección aceitosa apropiadas. Los solventes lipofílicos adecuados o vehículos incluyen aceites grasos tales como de ajonjolí o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como el oleato de etilo o triglicéridos o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como el carboximetil celulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también pueden contener estabilizadores adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de las composiciones para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas . Alternativamente, uno o más componentes de la composición pueden tener forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo el pirógeno estéril libre de agua, antes de usar. Las composiciones también pueden estar formuladas en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorios convencionales tales como mantequilla de cacao u otros glicéridos . Además de las formulaciones descritas anteriormente, la composición de acuerdo con la presente invención puede también formularse como una preparación en el lugar. Dichas formulaciones de larga actividad pueden administrarse por implantación (por ejemplo subcutánea o intramuscularmente) , o por inyección intramuscular. De ese modo, por ejemplo, las composiciones pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) , o como parte de un implante sólido o semisólido que no puede autodegradarse en el cuerpo, o resinas de intercambio de iones, o una más de los componentes de la composición se pueden formular como derivados escasamente solubles, por ejemplo como la sal escasamente soluble. Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender portadores adecuados en fase sólida o gel o excipientes. Ejemplos de tales portadores o excipientes incluyen pero no se limitan al carbonato de calcio, fosfato de calcio, azúcares diversos, almidones, celulosas, derivados, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles . Las composiciones farmacéuticas adecuada para uso en la presente invención incluyen composiciones en las cuales los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr su objetivo deseado. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad de compuesto efectivo, aliviar, o moderar los síntomas de enfermedades o prolongar la supervivencia del individuo que está siendo tratado. La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está dentro de la capacidad de aquellos expertos en la técnica, en especial a la luz de la divulgación detallada que se proporciona en el presente. Para cualquier compuesto utilizado en los métodos de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva o dosis puede estimarse inicialmente a partir de los ensayos de cultivos con células. Por ejemplo, una dosis puede formularse en modelos de animal para lograr un rango de concentración de circulación que incluye el IC50 como se determina en el cultivo de células (cuando se trata de moléculas inhibidoras) . Tal información se puede usar para determinar con mayor exactitud las dosis útiles en humanos. La toxicidad y la eficacia terapéutica de una composición de la presente invención se puede determinar mediante procedimiento farmacéuticos estándar en cultivos de células o animales experimentales, por ejemplo, para determinar LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) . La proporción de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede ser expresado como la proporción entre LD50 y ED50. Los compuestos que muestran altos índices terapéuticos son los preferidos. Los datos obtenidos de estos ensayos con cultivos de células y estudios de animales se pueden usar para formular un rango de dosis para uso en seres humanos. La dosis puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma farmacéutica empleada y •la vía de administración utilizada. La formulación exacta, vía de administración y dosis pueden ser elegidas por el médico en vista de la condición del paciente (Véase por ejemplo Fingí, y colaboradores, 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics" Ch. 1 p. 1) . La cantidad de la composición administrada dependerá por supuesto del sujeto que está siendo tratado, con base al peso del sujeto, la gravedad de la aflicción, la manera de administración y el juicio del médico que prescribe . Una composición farmacéutica que comprende un péptido de una composición de acuerdo con la presente invención puede suministrarse de manera que el péptido y una o más moléculas de carga se encuentran en el mismo recipiente, ya sea en solución, suspensión o en forma de polvo. El péptido de acuerdo con la presente invención también se puede proporcionar por separado desde una o más moléculas de carga, y puede mezclarse con una o más de las moléculas de carga con anterioridad a la administración. Varias opciones de presentación son posibles y conocidas para los expertos en la técnica, dependiendo, entre otros, de la vía y el mecanismo de administración. Por ejemplo, cuando el péptido de acuerdo con la presente invención se suministra por separado de una o más de las moléculas de carga, las composiciones pueden, si se desea, presentarse en un empaque que tiene más de una cámara, y en el cual una barrera puede romperse, desgarrarse para proporcionar mezcla del péptido de acuerdo con la presente invención con la molécula de carga.

Alternativamente, dos elementos proporcionados por separados se pueden mezclar en un recipiente separado, opcionalmente con la adición de uno o más portadores, soluciones, etc. Uno o más de las dosis unitarias que contienen la molécula de carga pueden proporcionarse en el paquete. El paquete o dispositivo distribuir pueden ir acompañados por instrucciones para la administración. Las composiciones que comprenden un compuesto de la invención formulada en un portador farmacéutico compatible también se puede preparar, colocar en un recipiente apropiado y etiquetar para tratamiento de una condición indicada. La condiciones adecuadas indicadas en la etiqueta pueden incluir cualquier enfermedad que pueda ser tratada o evitada o diagnosticada utilizando las composiciones de acuerdo con la presente invención. En particular, la invención se adapta idealmente a la terapia genética. En otro aspecto la presente invención se relaciona con un método para el tratamiento o prevención de un paciente que comprende la administración de una composición de acuerdo con la presente invención. En otro aspecto la presente invención trata de un método para diagnosticar a un paciente que comprende la administración o el uso de una composición de acuerdo con la presente invención. Esta dentro de la presente invención que dicho ácido nucleico que codifica un péptido de acuerdo con la presente invención puede ser usado como una vacuna o parte de una vacuna. De preferencia, la vacuna comprende un ácido nucleico, más preferiblemente un ARN, que codifica un antígeno que es adecuado para provocar una respuesta inmunitaria en un organismo anfitrión, por lo que el ácido nucleico, codificador de un péptido de acuerdo con la presente invención y el ácido nucleico que codifica dicho antígeno se administra a dicho organismo anfitrión. Tal administración puede hacerse por separado o en una forma combinada. En otra forma de realización, el ácido nucleico respectivo puede estar contenido o comprendido en un vector, de mayor preferencia un vector de expresión que permite la expresión del ácido nucleico en el organismo anfitrión mencionado. Los otros elementos de tal vector y en particular de dicho vector de expresión son conocidos para los expertos en la técnica y están compuestos entre otras cosas de uno o varios de los siguientes elementos: un promotor, un mejorador y un terminador. El antígeno de preferencia es un antígeno que se relaciona con la enfermedad que va a ser tratada o evitada por la vacuna de acuerdo con la presente invención. Además, la vacuna también pueden contener constituyentes que ejercen un efecto llamado auxiliar y aquellos que actúan como iniciadores de las respuestas de células de ayuda en tipo T. En otra forma de realización más, la presente invención trata de un kit para transfección, para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad que comprende una composición de acuerdo con la presente invención y, opcionalmente uno o varios elementos seleccionados del grupo que comprende . La presente invención ahora será ilustrada adicionalmente por referencia a las siguientes figuras y ejemplos desde los cuales otras características, formas de realización y ventajas pueden tomarse. En particular, Figura 1 Muestra un diagrama que describe la recolección dependiente de concentración de diversos CPPs etiquetados con carboxifluoresceína en su terminal N, expresada como la medida de la fluorescencia asociada con las células; el péptido hLF se refiere a un péptido que consta de 38 a 59 aminoácidos de acuerdo con SEQ.ID.No. 1, el péptido bLF hace mención de un péptido que consiste en 33 a 50 aminoácidos de acuerdo con SEQ.ID.No. 2; la fluorescencia asociada con células se determinó por citometría de flujo. Figura 2 Muestra una serie de microfotografías obtenidas por microscopía de escaneo láser confocal que indica la dependencia de concentración de la distribución intracelular del péptido derivado de lactoferrina y el péptido derivado de lactoferrina bovina (véase figura 1) en varias concentraciones. Figura 3A Es un diagrama que muestra el impacto de varios inhibidores de endocitosis en la recolección de un péptido hLF etiquetado con fluoresceína (secuencia de péptido de acuerdo con la Figura 1) siendo la concentración de hLF de fluoresceína 5 µ? (EIPA, 5- (N-Etil-N-isopropil) amilorida; MpCD, Metil-ß- ciclodextrina , CPZ, Cloropromazina) ; la recolección se determinó por citometría de flujos. Las barras de errores representan la desviación promedio de los triplicados. Figura 3B Es un diagrama que muestra el impacto de varios inhibidores de endocitosis en la recolección de un péptido de hLF etiquetado con fluoresceína (secuencia de péptido de acuerdo con la Figura 1) siendo la concentración de hLF 20 µ?. Figura 4 Muestra fotografías obtenidas por microscopía por escaneo de láser confocal que indican las influencias de los inhibidores de endocitosis en la recolección del péptido de hLF etiquetado con fluoresceína en una concentración de péptido de 2 ó 20 µ? en células HeLa. Figura 5 Es un diagrama que muestra la extensión de la recolección del péptido hLF marcado con fluoresceína que corresponde a 38 a 59 aminoácidos de acuerdo con SEQ.ID.No. 1 en comparación con las formas truncadas del mismo que ilustran la relación estructura-actividad que corresponde de 40 a 55 aminoácidos de acuerdo con SEQ.ID.No. 1 (péptido LF1) y 40 a 50 que corresponde a SEQ.ID.No. 1 (péptido LF2) ; y Figura 6 Es un diagrama que describe la citotoxicidad del péptido hLF expresado como viabilidad celular en porcentaje en diversas concentraciones del péptido hLF etiquetado con fluoresceína para células HeLa incubadas durante diferentes tiempos de incubación; para cada par de columnas, la primer columna hace referencia a células incubadas con el péptido por 6 horas y la segunda columna a células incubadas con el péptido durante 0.5 horas.

Ejemplo 1: Procedimientos Experimentales Células y Agentes Reactivos: La línea celular carcinoma cervical humano HeLa fue obtenido a partir de la recolección de Cultivos Tipo Americano (Manassas, VA) Las células HeLa se mantuvieron en el medio RP I 1640 con glutamina estabilizada y 2.0 g/L NaHC03 (PAN Biotech, Aidenbach, Alemania) suplementada con 10% suero de becerro fetal (PAN Biotech) . Cloropromazina provino de Calbiochem (Bad Soden, Alemania) , 5- (N-etil -N- isopropil ) amilorida (EIPA) , metil-p-ciclodextrina (?ß??) y MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2 , 5 -difeniltetrazolio bromuro] se obtuvieron de Sigma (Deisenhofen, Alemania) . Síntesis de Péptido. Los péptidos se compraron de microcolecciones de EMC (Tübingen, Alemania) . La pureza de todos los péptidos se determinó por HPLC analítico. La identidad de los péptidos fue confirmada por espectrometría de masas de MALDI-TOF. Los péptidos con una pureza de menos de 85% fueron purificados mediante HPLC preparativo. La pureza de todos los péptidos utilizados fue > 95% (214 nm HPLC) . Los péptidos se marcaron con la termina N con cargo carboxifluoresceína como se describe (Fischer y colaboradores, Bioconjugate Chem. 14, 653-660, 2003) . Soluciones de reserva de péptidos. Los péptidos se disolvieron en DMSO para concentraciones de 10 mM. Estas soluciones madre se diluyeron adicionalmente en PBS o medio. Las concentración de péptidos de las soluciones madre de DMSO se determinaron con base en la absorción de carboxifluoresceína por espectroscopia UV/VIS de 1:100 dilución en solución amortiguadora en 0.1 M Tris/HCl (pH 8.8) con absorciones medidas en 492 nm y suponiendo un coeficiente de extensión molar de carboxifluoresceína de 75,000 L(mol cm) . Citometría de Flujos. Para determinar la eficiencia de la carga de péptidos, las células HeLa se cultivaron en una densidad de 50,000 por pocilio en placas de 24 pocilios (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania) en suero que contenía RPMI 1640. Un día después, las células se lavaron con el medio y se incubaron en 300 ??? RPMI 1640, que contuvo péptidos en las concentraciones apropiadas durante 30 minutos. Cada condición se examinó por triplicado. Después de la incubación, las células se lavaron con el medio, se desprendieron por tripsinización durante 5 minutos, se suspendieron en PBS enfriado con hielo que contenía 0.1% (p/v) BSA, y se midieron de inmediato por citometría de flujo (BD FACS Calibur System, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania) . En cada caso, la fluorescencia de 7,000 células vitales se adquirió. Las células vitales son recibidas con base en dispersión hacia los lados y hacia delante. Ejemplo 2: Eficiencia de recolección de los péptidos derivados de lactoferrina humana y bovina Los péptidos derivados de lactoferrina humana y bovina se sintetizaron a través de síntesis de péptido de fase sólida. Para detectar la recolección y la distribución subcelular en las células activas, ambos péptidos se marcaron con carboxifluoresceína en la terminal N. A fin de determinar si los péptidos derivados de lactoferrina poseían actividad como péptidos penetradores de células, la fluorescencia asociada con la célula en las células incubadas con el péptido bLF ó el péptidos hLF se determinó por citometría de flujo. El péptido Antp y el Tat fueron seleccionados como CPPs bien establecidos para la comparación. Para los cuatro péptidos, la fluorescencia celular, medida por citometría de flujos aumentó con la concentración de los péptidos como se describe en la Figura 1. Ejemplo 3: Relación Estructura actividad Con 22 aminoácidos, el péptido hLF es un CPP de longitud intermedia. La Nonarginina solamente tiene nueve aminoácidos, el popular CPP transporta 27. Cuatro de los siete aminoácidos catiónicos y los aminoácidos aromáticos se localizaron en la secuencia anidada dentro de los residuos de cisteína. En la proteína de longitud completa, estos residuos de cisteína forman un puente disulfuro que restringe el dominio en una conformación de bucle. Además, la recolección celular de péptidos truncados (LF1 y LF2 , Tabla 1) que carece de los residuos de cisteína terminal se examinaron y compararon con aquellos que contenían los residuos de cisteína . Tabla 1 Estructuras primarias de los péptidos utilizados en este estudio. Todos los péptidos se sintetizaron como amidas de péptido. El Fluo representa 5 (6) -carboxifluoresceína, C0NH2 la terminal C amidatada del péptido. Entrada Péptido Secuencia 1 Péptido Tat Fluo-YGRKKRRQRRR-CONH2 2 Péptido Antp Fluo-RQIKIWFQNRRMKWKK-CONH2 Péptido hLF Fluo-KCFQWQRNMRKV GPPVSCIKR- CONH2 Péptido bLF Fluo-PEWFKCRRWQWRMKKLGA- CONH2 Péptido LF1 Fluo-FQWQRNMRKVRGPPVS- CONH2 Péptido LF2 Fluo-FQWQRNMRKVR- CONH2 Los resultados se describen en la Figura 5. La recolección de ambos péptidos que carecen de cisteínas solamente fue de más o menos de un décimo de la recolección del péptido hLF que contenían los dos residuos de cisteína . Ejemplo 4: Citotoxicidad del Péptido hLF En los experimentos antes descritos, utilizando un rango de concentración del péptido de hLF de hasta 40 µ?, ningún efecto citotóxico pudo observarse. Sin embargo, para la microscopía de células activas de recolección de péptidos fueron empleados en tiempos más bien cortos de incubación de una hora. Por lo tanto también se examinó si para tiempos de incubación más largo y concentraciones superiores, el péptido afectaba la viabilidad celular. Las células HeLa se incubaron con el péptido hLF en concentraciones que variaban desde 1.25 µ? hasta 160 µ para 6 ó 0.5 horas. Después de eso la viabilidad celular se determinó utilizando una prueba de MTT. El resultado del mismo se describe en la Figura 6. Cuando las células se incubaron con el péptido por solamente 30 minutos, ninguna citotoxicidad se observó para concentraciones hasta de 40 µ?. Después de 6 horas, las viabilidad celular se redujo ligeramente para las concentraciones de péptidos superiores a 5 µ . En concentraciones superiores que 40 µ? todas las células fueron exterminadas Las características de la presente invención divulgadas en la especificación, la lista de secuencias, las reivindicaciones y/o los dibujos pueden ser material para realizar la invención en diversas formas de la misma por separado y por cualquier combinación de las mismas.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende por lo menos 8 aminoácidos consecutivos de la proteína de lactoferrina humana o de la proteína lactoferrina bovina por lo que el péptido es adecuado para actuar como un péptido penetrador de células. 2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, por lo que el péptido comprende por lo menos cuatro aminoácidos catiónicos. 3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, por lo que la proteína lactoferrina humana tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ.ID.No. 1 y la proteína de lactoferrina bovina tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ.ID.No.2. . El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, por lo que el péptido comprende por lo menos dos residuos de Cis o análogos de los mismos. 5. El péptido de acuerdo con la reivindicación 4, por lo que el péptido comprende un enlace de disulfuro creado por dos residuos de Cis o un enlace análogo formado por los análogos de cisteína. 6. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, por lo que el péptido comprende una mitad que tiene una conformación helicoidal alfa de más o menos 12 a 20 aminoácidos en longitud y una mitad que tiene conformación laminar beta de más o menos de 8 a 12 aminoácidos de longitud. 7. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, por lo que el péptido comprende residuos de más o menos 8 a más o menos 60 aminoácidos. 8. El péptido de acuerdo con la reivindicación 7, por lo que el péptido comprende residuos desde más o menos 20 a más o menos 45 aminoácidos. 9. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, por lo que el péptido tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde las posiciones de aminoácidos 20 a 64 de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ.ID.No. 1. 10. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, por lo que el péptido tiene una secuencia de aminoácidos, por lo que el extremo de terminal N del péptido es un aminoácido que corresponde a las posiciones de aminoácidos 20 a 64 de la secuencia de aminoácido de acuerdo con SEQ.ID.No. 1 ó SEQ.ID.No. 2. 11. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, por lo que el péptido se selecciona a partir del grupo que comprende: un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos KCFQ QRNMRKVRGPPVSCIKR (SEQ.ID.No. 3), un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos CFQWQRN RKVRGPPVSC (SEQ . ID . o . 4 ) ; un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos FQWQRNMR VRGPPVS (SEQ . ID . No . 5) ; un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos FQWQRNMRKVR (SEQ. ID. No. 6) ; un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos KCRRWQ RMKKLGAPSITCVRR (SEQ. ID. No. 29), y un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos CRRWQWRMKKLGAPSITC (SEQ. ID. No. 30) y derivados de los mismos. 12. El péptido de acuerdo con la reivindicación 11, por lo que el péptido comprende una secuencia SEQ. ID. o. 3, SEQ. ID.No. 4, SEQ. ID. No. 29, SEQ. ID. No. 30 ó un derivado de dichas secuencias con una entidad de secuencia de por lo menos 40%. 13. El péptido de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, por lo que el péptido es un derivado de los péptidos con cualquiera de SEQ. ID. No. 2 a 5, por lo que los residuos de metionina se sustituyen por un aminoácido seleccionado del grupo compuesto de valina, isoleucina, norvalina, leucina y norleucina . 14. El péptido de acuerdo con la reivindicación 13, por lo que el péptido es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende: KCFQ QRNVRKVRGPPVSCIKR (SEQ.ID.No. 7) KCFQWQR IRKVRGPPVSCIKR (SEQ.ID.No. 8) KCFQWQRNXRKVRGPPVSCIKR (SEQ.ID.No. 9), por lo X es norvalina, KCFQWQRNLRKVRGPPVSCIKR (SEQ.ID.No. 10) KCFQWQRNXRKVRGPPVSCIKR (SEQ.ID.No. 28), por lo X es norleucina, CFQWQRNVRKVRGPPVSC (SEQ.ID.No. 11), CFQWQRNIRKVRGPPVSC (SEQ.ID.No. 12), CFQWQRNXRKVRGPPVSC (SEQ.ID.No. 13), por lo X es norvalina, CFQWQRNLRKVRGPPVSC (SEQ.ID.No. 14), CFQWQRNXRKVRGPPVSC (SEQ.ID.No. 15), por lo X es norleucina, FQWQRNVRKVRGPPVS (SEQ.ID.No. 16), FQWQRNIRKVRGPPVS (SEQ.ID.No. 17), FQWQRNXRKVRGPPVS (SEQ.ID.No. 18), por lo X es norvalina, FQWQRNLRKVRGPPVS (SEQ.ID.No. 19), FQWQRNXRKVRGPPVS (SEQ.ID.No. 20), por lo X es norleucina, FQWQRNVRKVR (SEQ.ID.No. 21), FQWQRNIRKVR (SEQ.ID.No. 22), FQWQRNXRKVR (SEQ.ID.No. 23), por lo X es norvalina, FQWQRNLRKVR (SEQ.ID.No. 24), y FQWQRNXRKVR (SEQ.ID.No. 25), por lo X es norleucina. 15. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, por lo que los derivados tienen un grupo de enlace preferiblemente seleccionado del grupo compuesto de tioéteres, por lo que el grupo de enlace sustituye el enlace de disulfuro formado por estos residuos Cis . 16. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, por lo que el péptido se marca radioactivamente, de preferencia al hacer que se le incorpore un aminoácido radioactivamente marcado por lo que el aminoácido radioactivamente marcado de mayor preferencia es un aminoácido marcado con tritio. 17. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, por lo que el péptido además comprende además es adecuada para la detección utilizando un método de detección, por lo que dicha mitad de preferencia se selecciona del grupo compuesto de fluoróforos, trazadores radioactivos y haptenos, por lo que de preferencia el hapteno es biotina. 18. Un complejo que comprende un péptido seleccionado del grupo compuesto de un péptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 17, lactoferrina humana y lactoferrina bovina y molécula de carga. 19. El complejo de acuerdo con la reivindicación 18, por lo que la molécula de carga se enlaza covalente o no covalentemente al péptido. 20. El complejo de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19, por lo que la molécula de carga se selecciona del grupo compuestos de ácidos nucleicos, ácidos aminoácidos, péptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos y pequeñas moléculas y mezclas de cualquiera de los mismos. 21. El complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, por lo que la molécula de carga se presenta como una parte o una estructura, por lo mismo la estructura se selecciona del grupo compuesto de nanopartículas , micropartículas , liposomas y micelos. 22. El complejo de acuerdo con la reivindicación 20, por lo que el ácido nucleico seleccionado del grupo compuesto de moléculas de ADN, moléculas de ARN, moléculas de APN, moléculas de ARNsi, moléculas antisentido, ribocimas, aptámeros, espiegélmeros y moléculas señuelo. 23. El complejo de acuerdo con la reivindicación 20, por lo que el péptido se selecciona del grupo compuesto de péptidos para vacunación. 24. El complejo de acuerdo con la reivindicación 20, por lo que el ácido nucleico es una vacuna con base en ácido nucleico. 25. El complejo de acuerdo con la reivindicación 20, por lo que las nanopartículas y/o micropartículas comprenden o consisten de un compuesto farmacéuticamente activo . 26. Un compuesto que comprende por lo menos un péptido seleccionado del grupo compuesto de un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, lactoferrina humana y lactoferrina bovina y una molécula de carga . 27. Una composición que comprende un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25. 28. Un ácido nucleico que codifica un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, de preferencia con una secuencia de ácido nucleico SEQ.ID.No.26 ó SEQ.ID.No.27. 29. Una composición que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 28 y una molécula de carga . 30. La composición de acuerdo con la reivindicación 29, por lo que la molécula de carga es un ácido nucleico y más particularmente un ARN adecuado para vacunación . 31. La composición de acuerdo con la reivindicación 29, por lo que la molécula de carga es un ácido nucleico que codifica un péptido. 32. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 31, por lo que el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 28 se enlaza de manera operativa al ácido nucleico que codifica un péptido. 33. La composición de acuerdo con la reivindicación 31, por lo que el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 28 y el ácido nucleico que codifica un péptido están enlazados en el bastidor. 34. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, por lo que el péptido es un agente farmacéuticamente activo. 35. Uso de un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, como péptido penetrador de células . 36. Uso de lactoferrina humana o un derivado funcional de la misma o de lactoferrina bovina o un derivado funcional de la misma como un péptido penetrador de células. 37. Uso de acuerdo con la reivindicación 36, por lo que la lactoferrina humana tiene una secuencia de aminoácidos que comprende las posiciones de aminoácidos 20 a 711 de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ.ID.No. 1 ó derivado funcional de la misma y/o la lactoferrina bovina tiene una secuencia de aminoácidos que comprende posiciones de aminoácidos 20 a 708 de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ.ID.No. 2 ó un derivado funcional de la misma. 38. Uso de un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, como agente de transfección. 39. Uso de una lactoferrina humana o un derivado funcional de la misma o de lactoferrina bovina o un derivado funcional de la misma como un agente de transfección. 40. Uso de acuerdo con la reivindicación 39, por lo que la lactoferrina humana tiene una secuencia de aminoácidos que comprende posiciones de aminoácidos 20 a 711 de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ.ID.No. 1 y/o la lactoferrina bovina tiene una secuencia de aminoácidos que comprende posiciones de aminoácidos 20 a 708 de la secuencia de acuerdo con SEQ.ID.No. 2 ó un derivado funcional de la misma. 41. Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 34, para la elaboración de un medicamento. 42. Uso de acuerdo con la reivindicación 41, por lo que la molécula de carga es un agente farmacéuticamente activo . 43. Uso de la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 34 para la elaboración de un agente de diagnóstico. 44. Uso de acuerdo con la reivindicación 43, por lo que la molécula de carga es un marcador de diagnóstico.