CN108101966B - 基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽及其在疫苗载体中的应用 - Google Patents

基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽及其在疫苗载体中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽及其在疫苗载体中的应用。该多肽的序列如SEQ ID NO：1所示。该多肽可以与带负电荷的抗原先发生静电相互作用，之后半胱氨酸的巯基之间发生交联，将抗原紧紧地包裹，形成稳定的多肽/抗原纳米复合物。在纳米复合物中，半胱氨酸的巯基自发氧化形成二硫键，多肽间发生交联构建成更致密的肽/抗原缩合物。本发明结合了细胞穿膜肽和氧化还原响应型的双硫键交联剂的优势，采用新的细胞穿膜肽介导的氧化还原响应型多肽作为疫苗佐剂，克服传统免疫佐剂无法诱导机体产生强烈的抗原特异性细胞免疫的缺点，有望用于临床疫苗治疗。

Description

基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽及其在疫苗载体中的 应用
技术领域
本发明属于生物医用材料及免疫治疗领域，特别涉及一种基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽及其在疫苗载体中的应用。
背景技术
在免疫治疗中，通过接种疫苗诱导机体产生强大的细胞免疫对治疗细胞内传染疾病和肿瘤是至关重要的。目前，传统的疫苗佐剂，例如铝佐剂和弗氏佐剂主要是促进抗体的产生，诱导体液免疫，但是体液免疫无法有效的抵抗细胞内传染疾病和肿瘤。而细胞免疫会产生CD8+T细胞可以直接杀死病毒感染的细胞或者癌变细胞。因此，诱导强大的细胞免疫引起越来越多的关注。为了诱导细胞免疫，有很多策略已经被研究，例如利用pH敏感的疫苗递送材料实现溶酶体逃逸；利用氧化还原响应的的疫苗载体实现抗原的胞浆递送等。
细胞穿膜肽是一种寡肽，可以以一种友好的方式搬运大分子货物穿过细胞膜，且不会对细胞膜造成伤害，是一种理想的胞浆递送载体。在基因治疗领域，利用细胞穿膜肽递送siRNAs到靶细胞的胞浆中已经被广泛研究。在疫苗治疗领域，细胞穿膜肽也被证实了可以递送抗原到抗原递呈细胞的胞浆内。
氧化还原响应型载体材料已经被广泛应用于抗原的胞浆递送，可以促进交叉递呈和细胞免疫。通常，氧化还原响应的疫苗载体材料中包含双硫键，氧化还原敏感的双硫键可以在细胞内较高谷胱甘肽浓度下降解。随着双硫键的降解，抗原被释放到胞浆内，通过交叉递呈诱导细胞免疫。在这些氧化还原响应的疫苗载体材料中，双硫键可以通过各种方式引入，如用主链上含有双硫键的高分子；用侧链上有双硫键的高分子；用含有双硫键的交联剂；或者直接将抗原或者抗原决定簇通过双硫键链接到载体材料上。
综上，传统的疫苗佐剂如铝佐剂和弗氏佐剂在促进体液免疫方面有显著的效果，但是不能引起强烈的细胞免疫，一直是疫苗治疗的瓶颈所在。因此，设计一种多肽疫苗载体，以克服传统免疫佐剂无法诱导机体产生强烈的抗原特异性细胞免疫的缺点具有重要意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽。
本发明的另一目的在于提供所述基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽，该多肽包括2个色氨酸，4个半胱氨酸和24个精氨酸，其序列为：Cys-Trp-Trp-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys(SEQ ID NO：1)(半胱氨酸-色氨酸-色氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-半胱氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-半胱氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸--精氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-半胱氨酸)。
所述的基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽作为药物运输载体的应用。
所述的药物运输载体可携带核酸、糖类、脂质、和/或小分子物质进入细胞。
所述的基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽在制备疫苗载体中的应用。
所述的基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽作为疫苗载体在制备疫苗中的应用。
一种疫苗制剂，包括所述的基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽。
所述的疫苗制剂，还包括抗原，其中，所述的基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽与抗原的质量比为1:2～2:1；优选为1:2；该多肽过物理吸附或者共价交联的方式与抗原结合，能增强抗原递呈细胞对抗原的摄取，促进抗原特异性免疫应答，包括促进抗体(IgG、IgG2a和IgG1)和细胞因子(INF-γ、IL-12、IL-4和IL-10)的分泌；促进脾细胞快速增值，免疫记忆功能和DC的激活。
所述的疫苗制剂，优选为通过如下方法获得：将基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽与抗原在室温下孵育2h左右。
所述的抗原优选为卵清蛋白。
所述的疫苗制剂在治疗过程中免疫接种途径包含多种，如皮下注射、皮内注射、肌肉注射、黏膜免疫等。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)根据大量文献报道，将外源性抗原递送至胞浆内，才能发生交叉递呈，引起细胞免疫；而细胞穿膜肽作为一种良好的胞浆递送载体，已经被证明可以将蛋白抗原输送至胞浆内。此外，氧化还原响应型材料可以在细胞浆内较高的谷胱甘肽浓度下实现智能降解，可以快速释放抗原。本发明结合了细胞穿膜肽和氧化还原响应型的双硫键交联剂的优势，采用新的细胞穿膜肽介导的氧化还原响应型多肽作为疫苗佐剂，克服传统免疫佐剂无法诱导机体产生强烈的抗原特异性细胞免疫的缺点。
(2)本发明设计多肽(Cys-Trp-Trp-Arg8-Cys-Arg8-Cys-Arg8-Cys)可以与带负电荷的抗原先发生静电相互作用，之后半胱氨酸的巯基之间发生交联，将抗原紧紧地包裹，形成稳定的多肽/抗原纳米复合物。在纳米复合物中，半胱氨酸的巯基自发氧化形成二硫键，多肽间发生交联构建成更致密的肽/抗原缩合物。该纳米复合物可以引起较强的细胞免疫，有望用于临床疫苗治疗。
(3)本发明的多肽与高分子材料载体相比，多肽载体具有确定的分子量和化学组成，可以控制合成，因此在不同批次间具有良好的重现性，有利于大规模生产。
(4)本发明的多肽可以显著地提高抗原递呈细胞对抗原的摄取，明显增强了抗原的胞浆递送。
(5)本发明的多肽能够诱导更高水平的抗原特异性免疫应答，特别是细胞免疫。
附图说明
图1为DC2.4细胞对抗原摄取情况和细胞内定位图；其中，图A为DC2.4细胞对抗原OVA-Cy5.5摄取量的流式结果代表图，图B为与图A对应的OVA-Cy5.5的平均荧光强度，图C为OVA-Cy5.5在DC2.4细胞中的定位。
图2为免疫组织化学染色结果图。
图3为血清中抗体效价结果图；其中，图A为抗原特异性IgG，图B为抗原特异性IgG1，图C为抗原特异性IgG2a，图D为IgG2a和IgG1的比值。
图4为脾细胞的体外增殖实验结果图。
图5为脾细胞分泌细胞因子水平结果图；其中，图A为IL-4，图B为IL-10，图C为INF-γ，图D为IL-12。
图6为ELISApot法测脾细胞中INF-γ或IL-4分泌型细胞结果图；其中，图A和B为斑点形成细胞数量，图C为γ-干扰素或IL-4斑点形成细胞图。
图7为记忆T细胞检测结果图；其中，图A为CD4阳性中心记忆T细胞，图B为CD4阳性效应记忆T细胞，图C为CD8阳性中心记忆T细胞，图D为CD8阳性效应记忆T细胞，图E和F为A-D各组代表性百分比图。
图8为体内DC激活结果图；其中，图A为DC细胞中CD86分子的百分比，图B为与图A对应的CD86分子的平均荧光强度，图C为DC细胞中MHC-II分子的百分比，图D为与图C对应的MHC-II分子的平均荧光强度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：多肽的设计：
在本发明中结合了细胞穿膜肽和氧化还原响应型的双硫键交联剂的优势，设计了一种多肽疫苗载体用于抗原递送。多肽的具体结构为：Cys-Trp-Trp-Arg8-Cys-Arg8-Cys-Arg8-Cys(包括2个色氨酸，4个半胱氨酸和24个精氨酸：Cys-Trp-Trp-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys)。带正电荷的多肽载体可以通过静电吸引与带负电荷的抗原蛋白结合，形成纳米复合物，就像一个笼子来包裹抗原分子。在纳米复合材料中，半胱氨酸的巯基自发氧化形成二硫键，多肽间发生交联构建成更致密的多肽/抗原缩合物。整体带正电荷的多肽/抗原缩合物能与带负电的细胞膜发生静电相互作用，将有利于抗原递呈细胞对抗原的摄取。同时在多肽链中引入了疏水的色氨酸可以增强多肽/抗原缩合物与细胞膜之间的疏水相互作用，同样也可以促进内吞。(多肽是委托上海吉尔生化有限公司，采用Fmoc固相合成法，采用反相高效液相色谱法纯化，纯度>98％。)
实施例2：多肽与卵清蛋白OVA(购于Sigma-Aldrich)的配比
表1 不同质量比的多肽/OVA的粒径和电位
多肽和OVA的质量比 粒径(nm) PDI(多分散系数) 电位(mV)
0.0625:1 65.055±1.209 0.218±0.006 -12.9±1.556
0.125:1 131.25±1.202 0.14±0.038 -11.75±0.354
0.25:1 8228.5±485.631 0.551±0.064 6±0.283
0.5:1 119.75±0.495 0.048±0.013 13.9±0.990
1:1 93.785±0.431 0.042±0.001 16.35±0.212
2:1 81.12±2.263 0.085±0.040 18.45±0.212
实施例3：疫苗制剂的制备
以卵清蛋白OVA(购于Sigma-Aldrich)为模型抗原，不同配方的疫苗按以下表格进行配制，皮下注射所用的疫苗制剂分别如表2所示。
表2 皮下注射所用的不同疫苗制剂
Figure BDA0001524609930000051
注：使用前多肽与抗原(卵清蛋白OVA)需要在室温下孵育2h。
实施例4：免疫前的准备研究
1.抗原在DC2.4细胞中的内吞和共定位：
将DC2.4细胞(小鼠树突状细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司)以每孔1×105的细胞密度加入到24孔板中，在37℃和5％CO2的细胞培养箱中培养24h。弃掉培养基，用PBS缓冲液洗三次。用OVA浓度为5μg/mL的Cy5.5-OVA溶液(用Cy5.5标记的OVA)和Peptide/Cy5.5-OVA(Peptide为实施例1中的多肽)悬浮液孵育细胞4h。之后，将细胞消化下来，用流式细胞仪检测Cy5.5阳性DC2.4细胞。
将DC2.4细胞以每孔1×105的细胞密度加入激光共聚焦专用培养皿，在37℃和5％CO2的细胞培养箱中培养24h。弃掉培养基，用PBS缓冲液洗三次。用OVA浓度为5μg/mL的Cy5.5-OVA溶液和Peptide/Cy5.5-OVA悬浮液孵育细胞4h后，弃液。用溶酶体染色试剂LysoTracker-green DND-99孵育30min，之后用4％多聚甲醛固定细胞，用激光共聚焦显微镜观察。
结果如图1A所示，单独OVA组只有10％的Cy5.5阳性的DC2.4细胞，相同条件下Peptide/OVA纳米复合物组，Cy5.5阳性的DC2.4细胞有85％。在图1B中，Peptide/OVA纳米复合物组的Cy5.5平均荧光强度也显著的高于单独OVA组。以上结果表明，多肽可以显著的提高DC细胞对OVA抗原的摄取。如图1C所示，在单独OVA组，Cy5.5-OVA主要定位在溶酶体中，而Peptide/OVA纳米复合物组中，有大量的Cy5.5-OVA出现在细胞浆中。
2.免疫组化试验：
将6-8周的雌性Balb/c小鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司)随机分为4组，每组4只。在腹股沟皮下注射实施例3中制备的疫苗制剂。在免疫后的2天或者7天，对小鼠实施安乐死，取出脾脏，用组织固定液固定，之后做免疫组化分析。
结果如图2所示，在免疫后的第二天，每一组中都有大量的抗原出现在脾脏中。但是在免疫后的第七天，只有Peptide/OVA纳米复合物组和弗氏佐剂组还有大量的抗原出现在脾脏中，而单独OVA组在脾脏中几乎看不到抗原。结果表明，Peptide/OVA纳米复合物可以有效的延长抗原的递送，有利于引起更强的免疫应答。
实施例5：疫苗制剂在皮下免疫的应用：
一、小鼠免疫方案
将6-8周的雌性Balb/c小鼠随机分为4组，每组5只。分别于第0、7、14天，在腹股沟皮下注射实施例3中制备的疫苗制剂。第三次免疫8天后，取血，分离血清，在-20℃条件下保存备用；取小鼠脾脏，研磨、重悬制备不同浓度的脾细胞悬浮液，备用。
二、各项免疫指标的测定
1.IgG抗体效价的测定
血清IgG及其亚型抗体效价是通过ELISA法间接测定。简单来说，用100μL包被液(0.05M碳酸盐缓冲液，10μg/mL OVA，pH＝9.6)在4℃条件下包被96孔板16h。然后用200μLPBS-T洗液(含0.05％吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液)洗板3次，之后加入200μL封闭液在37℃的摇床上封闭1h。用200μL PBS-T洗液洗板3次，加入100μL稀释过的血清样品，在37℃的摇床上孵育1h。用200μL PBS-T洗液洗板3次，每孔加入50μL HRP标记了的抗小鼠IgG(IgG1或IgG2a)二抗，37℃的摇床上孵育30min。用200μL PBS-T洗液洗板4次之后，每孔加入100μLTMB显色液，在室温下孵育10min。随后每孔加入100μL终止液，用酶标仪测定在450nm波长处的吸光度。
结果如图3所示，与单独OVA组相比，Peptide/OVA纳米复合物组可以引起更高的IgG、IgG2a、IgG1分泌，说明peptide/OVA纳米复合物组可以引起更强的体液免疫。IgG的亚型IgG2a与Th1细胞相关，IgG1与Th2细胞相关。peptide/OVA纳米复合物组中IgG2a和IgG1的比值显著地高于其他两组，说明peptide/OVA纳米复合物诱导的免疫反应向Th1极化。
2.脾细胞增殖实验
将100μL上述脾细胞悬液按照每孔1x105的细胞密度加入到96孔板中，分别加入100μL OVA溶液(20μg/mL)或者RPMI-1640培养基。培养72h之后，每孔加入20μL CCK-8试剂，在继续培养4h之后，用酶标仪检测每个孔在450nm波长处的吸光度。
如果免疫后的小鼠的脾细胞被相同的抗原刺激，可以迅速的做出增殖反应，这与由免疫产生的特异性免疫反应密切相关。如图4所示，Peptide/OVA纳米复合物组的脾增殖系数显著地高于单独OVA组，说明Peptide/OVA纳米复合物可以引起更强的特异性免疫应答。
3.ELISA测定脾细胞分泌的细胞因子水平
将2mL上述脾细胞悬液按照每孔1x107的细胞密度加入到12孔板中，并加入2mLOVA溶液(20μg/mL)，培养60h。之后，离心收集上清液，保存在-80℃条件下，之后通过ELISA法测定脾细胞分泌的细胞因子(INF-γ、IL-4、IL-10、IL-12)。
如图5A和5B所示，与单独OVA组相比，Peptide/OVA纳米复合物组可引起更高的Th2型细胞因子(IL-4和IL-10)分泌。如图5C和5D所示，与单独OVA组相比，Peptide/OVA纳米复合物组可引起更高的Th1型细胞因子(INF-γ和IL-12)分泌。以上结果表明，Peptide/OVA纳米复合物既可以增强体液免疫也可以增强细胞免疫。
4.ELISpot实验(酶联免疫斑点法)
在96孔ELISpot板每孔中加入200μL含10％(v/v)的血清的RPMI-1640培养基在室温下孵育30min。弃液，按照每孔4x105的细胞密度，将100μL上述脾细胞悬液加入到96孔板中，并在每个空中加入100μL OVA溶液(20μg/mL)刺激。在一定的培养时间后(IFN-γ：18h，IL-4：36h)，弃液，每孔加入200μL PBS缓冲液，洗板5次。然后每个孔加入100μL二抗，室温下孵育2小时。弃液，每孔加入200μL PBS缓冲液，洗板5次。用PBS-0.5％FCS(含有0.5％(v/v)胎牛血清的的PBS缓冲液)按1:1000稀释Streptavidin-ALP(链霉亲和素-碱性磷酸酶)，每孔加入100μL稀释液，室温下孵育1h。弃液，洗板5次。每孔加入100μL显色液，斑点出现后用自来水终止反应。用ELISpot Reader观察和计数。
结果如图6所示，与细胞因子分泌结果一致，Peptide/OVA纳米复合物组中的INF-γ和IL-4分泌细胞显著的高于单独OVA组。表明Peptide/OVA纳米复合物既可以增强体液免疫也可以增强细胞免疫。
5.流式细胞术测定记忆T细胞反应
将2mL上述脾细胞悬液按照每孔1x107的细胞密度加入到12孔板中，并加入2mLOVA溶液(20μg/mL)，培养60h后，收集细胞，用抗体(FITC-anti-CD4，Cy5.5-anti-CD8a，PE-anti-CD44and APC-anti-CD62L)在4℃避光条件下孵育30min，之后用流式细胞仪检测。
免疫的最终目的是产生免疫记忆功能，当机体再次受到相同抗原刺激后迅速的做出免疫应答。记忆T细胞在免疫记忆中起重要作用。根据细胞表型，分布和生物学功能的差异，将记忆T细胞归类为CD4记忆T细胞和CD8记忆T细胞。每种记忆T细胞又分为中心记忆T细胞(CD44+CD62L+)和效应T细胞(CD44+CD62L-)。如图7所示，与单独OVA组相比，Peptide/OVA纳米复合物组的中心记忆T细胞和效应T细胞更高。结果表明Peptide/OVA纳米复合物可以显著的增强免疫记忆功能。
6.体内DC活化检测
取上述脾细胞悬液，收集脾细胞，用抗体(APC-anti-CD11c，Cy5.5-anti-CD86和PE-anti-MHC II.)(购于Biolegend(San Diego,CA,USA)在4℃避光条件下孵育30min，之后用流式细胞仪检测DC活化情况。
激活DC细胞在抗原递呈过程中起重要作用。与未成熟的DC细胞相比，成熟的DC细胞高表达MHC分子(MHC-I和MHC-II)和共刺激分子(CD40、CD80和CD86)。如图8所示，与单独OVA组相比，Peptide/OVA纳米复合物组可以显著提高MHC-II和CD86分子。结果表明Peptide/OVA纳米复合物可以显著激活DC细胞。
综上所述，本发明结合了细胞穿膜肽和氧化还原响应性的双硫键交联剂的优势，设计了一种多肽疫苗载体(Cys-Trp-Trp-Arg8-Cys-Arg8-Cys-Arg8-Cys)用于抗原递送。在与模型抗原OVA复合后形成peptide/OVA纳米复合物，可以显著的提高抗原递呈细胞对抗原的摄取，同时能够将抗原输送至细胞浆中。皮下免疫的实验结果表明，使用多肽作为疫苗载体可以显著地促进抗原特异性免疫应答，包括促进抗体(IgG、IgG2a和IgG1)和细胞因子(INF-γ、IL-12、IL-4和IL-10)的分泌；促进脾细胞快速增值，免疫记忆功能和DC的激活。总之，用多肽作为疫苗载体可以引起更强的体液免疫和细胞免疫。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽及其在疫苗载体中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 多肽
<400> 1
Cys Trp Trp Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys
20 25 30

Claims (4)

1.一种基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽作为疫苗载体在制备疫苗中的应用，其特征在于：所述的多肽的序列如SEQ ID NO ：1所示；
所述的疫苗由抗原和基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽组成；其中，所述的基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽与抗原的质量比为1:2～2:1；
所述的抗原为卵清蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽与抗原的质量比为1:2。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述 的 疫苗 通过如下方法获得：将基于细胞穿膜肽的氧化还原敏感多肽与抗原在室温下孵育2 h。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于：所述的疫苗的免疫接种途径为皮下注射、皮内注射、肌肉注射或黏膜免疫。
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