CN103382217B - 穿膜肽和药物组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种穿膜肽，其中，该穿膜肽选自由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4和SEQ ID No：5所示的氨基酸序列所组成的组中，及其在制备进入细胞中的药物中的应用。本发明还公开了一种药物组合物，其中，该药物组合物含有本发明提供的穿膜肽和siRNA；以及一种药物组合物的制备方法，其中，该方法包括：将本发明提供的穿膜肽与siRNA在pH值为7.0-8.5的缓冲液中进行接触。还提供了按照本发明的制备方法制备得到的药物组合物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一种穿膜肽、该穿膜肽的应用、一种药物组合物、一种药物组合物的制备方法以及该药物组合物的应用。
背景技术
细胞穿膜肽（CPP）通常由5-30个氨基酸组成，能够介导大分子物质穿过细胞膜进入细胞质和细胞核内。CPP因其在介导大分子物质穿过细胞膜进入细胞质和细胞核内的过程中用量低、转运所需时间短、无毒副作用而受到国内外学者的广泛关注。近年来，CPP广泛应用于体内及体外转运多肽、蛋白、寡核苷酸、DNA质粒、脂质体和金属离子等，其中许多CPP甚至已被应用到临床领域。
尽管CPP具有良好的转运载体的功能，但仍然存在其他的问题。例如，肽段本身过长，容易形成二级结构，从而无法对所携带的物质进行有效的转运；或肽段本身过短，其穿膜效率显著降低。
因此，亟需开发一种长度短且转运效率高的穿膜肽。
发明内容
本发明的目的在于克服现有穿膜肽肽段过长时容易发生二级结构无法对所携带的物质进行有效的转运；或肽段本身过短时，其穿膜效率显著降低的缺点，提供一种长度短且转运效率高的穿膜肽及其应用，以及一种药物组合物及其制备方法。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种穿膜肽，其中，该穿膜肽选自由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4和SEQ ID No：5所示的氨基酸序列所组成的组中。
优选地，所述穿膜肽选自由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ IDNo：3所示的氨基酸序列所组成的组中。
第二方面，提供了本发明的穿膜肽在制备进入细胞中的药物中的应用。
第三方面，本发明提供了一种药物组合物，其中，该药物组合物含有本发明提供的穿膜肽和siRNA。
第四方面，本发明提供了一种药物组合物的制备方法，其中，该方法包括：将本发明提供的穿膜肽与siRNA在pH值为7.0-8.5的缓冲液中进行接触。
第五方面，本发明还提供了根据本发明提供的方法制备得到的药物组合物。
由实施例和对比例可以看出，本发明提供的穿膜肽（实施例1）长度短且转运效率与公认的穿膜肽的转运效率无显著性差异。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1显示了空白对照、现有的药物组合物、本发明提供的药物组合物以及阳性对照对甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）表达的抑制程度。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
第一方面，本发明提供了一种穿膜肽，其中，该穿膜肽选自由SEQ IDNo：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4和SEQ ID No：5所示的氨基酸序列所组成的组中。
优选地，所述穿膜肽选自由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ IDNo：3所示的氨基酸序列所组成的组中。
根据本发明，所述穿膜肽的来源没有特别的限制。例如，可以从现有蛋白序列中进行截取得到；也可以由编码该穿膜肽的DNA转录并翻译得到；也可以按照常规的方法合成得到，例如，合成方法可以参照Systemicscreening of milk protein-derived ACE inhibitors through a chemicallysynthesised tripeptide library（Ren F.Z.et al,Food Chemistry,2011,128(3),761-768）中公开的方法；还可以委托合成公司进行合成，例如，可以委托北京恒宇视野生物技术有限公司。
第二方面，提供了本发明的穿膜肽在制备进入细胞中的药物中的应用。
根据本发明，所述药物可以为本领域常规的各种药物，例如，所述药物可以包括siRNA、脂质体、多肽、蛋白、质粒和金属离子中的任意一种。
小干扰RNA（siRNA）可以激发与之互补的目标mRNA的沉默。因此，近年来，小干扰RNA技术广泛用于肿瘤、心血管治疗等临床和科研领域，而CPP作为良好的转运载体，在转运siRNA中得到了广泛的关注。二者可以通过非共价的静电作用结合实现转运，也可以通过对CPP和siRNA的末端进行二硫键等官能团的修饰，从而利用共价结合的方式实现连接及转运。后者虽然在转运过程中更加稳定，但进入细胞后却存在无法将CPP与siRNA切断，使siRNA发挥活性的问题。因此，越来越多的学者倾向于利用前者的结合方式实现siRNA的转运，但同时也对CPP的长度、电荷量等性质提出了更高的要求。
本发明提供的穿膜肽的转运效率高，因此，可以对siRNA实现高效率的转运；另外，本发明提供的穿膜肽带有大量的正电荷，可实现在细胞外与siRNA很好的静电结合，在细胞内环境中容易与siRNA分离；并且本发明提供的穿膜肽长度短，进入细胞后对细胞产生的副作用小。因此，本发明提供的穿膜肽特别适用于对siRNA的转运。
根据本发明穿膜肽的以上特性，第三方面，本发明提供了一种药物组合物，其中，该药物组合物含有本发明提供的穿膜肽和siRNA。
优选地，所述穿膜肽与siRNA的摩尔比可以为20-100:1。
根据本发明，所述siRNA可以为针对任意目标基因设计的siRNA，例如，以人血管内皮生长因子受体、肌动蛋白为靶点的siRNA，均可以按照一定的摩尔比同本发明提供的穿膜肽进行结合。
另外，本发明对所述药物组合物的形式也没有特别的限制，例如，可以为溶液的形式，也可以为胶囊的形式，还可以为片剂的形式。
此外，根据需要，所述药物组合物还可以选择性的含有药学上可接受的佐剂、防腐剂或稳定剂。其中，佐剂、防腐剂或稳定剂的种类和含量为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
根据本发明，药物组合物中穿膜肽与siRNA的总量并没有特别的限制，只要保证穿膜肽与siRNA的摩尔比在上述优选范围内即可。例如，以药物组合物的总重量为基准，所述穿膜肽与siRNA的总量可以为20-100重量%。
第四方面，根据本发明一种优选的实施方式，提供了一种药物组合物的制备方法，其中，该方法包括：将本发明提供的穿膜肽与siRNA在pH值为7.0-8.5的缓冲液中进行接触。
优选地，所述穿膜肽与siRNA的摩尔比为20-100:1。
根据本发明，所述穿膜肽与siRNA加入的总量可以根据反应的效率以及对所述药物组合物的实际需要量进行适应性的调整，优选情况下，相对于每毫升所述pH值为7.0-8.5的缓冲液，所述穿膜肽与siRNA加入的总量为30-70μmol。
根据本发明，所述缓冲液为本领域人员所熟知的能用于药物组合物的各种缓冲液，例如，Tris-盐酸缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液、超纯水，优选情况下，所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
根据本发明，所述siRNA的长度可以为18-25bp。
根据本发明，所述穿膜肽与siRNA接触的条件没有特别的限制，只要保证穿膜肽与siRNA能够结合即可。综合结合效率和时间考虑，优选情况下，所述接触的条件包括：接触的温度为25-37℃，接触的时间为20-60min。
根据本发明，所述制备的药物组合物可以直接进行使用，也可以将其进行干燥制备成干粉，并根据需要制备成各种不同的剂型进行使用。所述干燥的方法为本领域技术人员所公知，例如，可以利用真空冷冻干燥的方法。
第五方面，本发明还提供了根据本发明提供的方法制备得到的药物组合物。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。其中，以下实施例和对比例中的“穿膜率”是指荧光标记的穿膜肽处理一定量的细胞后，通过流式细胞仪检测到的细胞内有荧光信号的细胞占总细胞数的百分比。
实施例1-5
本实施例用于说明本发明提供的穿膜肽
委托北京恒宇视野生物技术有限公司分别合成SEQ ID No：1（RRWQWR）、SEQ ID No：2（RRWQWRMKKL）、SEQ ID No：3（FKCRRWQWRMKKL）、SEQ ID No：4（RRWQWRMKKLGAPSITCVRR）和SEQ ID No：5（FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF）所示的氨基酸序列，分别记为bLfcin1、bLfcin2、bLfcin3、bLfcin4和bLfcin5。
取少量的上述5条穿膜肽进行质谱鉴定，质谱所得分子量与按照序列得到的计算值相符，证明所述5条穿膜肽为本发明提供的穿膜肽。
对比例1-3
本实施例用于说明现有的穿膜肽
委托北京恒宇视野生物技术有限公司分别合成SEQ ID No：6（RKKRRQRRR）、SEQ ID No：7（RLRWR）和SEQ ID No：8（PFVYLI）所示的氨基酸序列。其中，该三条穿膜肽为报道最广泛的穿膜肽，分别记为TAT，CPP5和CPP6。
取少量的上述3条穿膜肽进行质谱鉴定，质谱所得分子量与按照序列得到的计算值相符，证明所述3条穿膜肽为现有的穿膜肽。
测试例1-5
本测试例用于说明本发明提供的穿膜肽的穿膜率
（1）穿膜肽的的异硫氰酸荧光素（FITC）标记
将实施例1-5中的穿膜肽按照1:5的摩尔比分别与FITC（购自Sigma）混合得到穿膜肽与FITC的混合物，分别将所述混合物溶于1mL的N,N'-二甲基甲酰胺（DMF，购自南京康满林化工实业有限公司）中，并在70Hz，避光条件下超声反应10h，得到FITC标记的穿膜肽。
（2）穿膜率的测定
将步骤（1）中经FITC标记的5条穿膜肽分别以不同浓度（浓度分别为1.0μM、5.0μM、7.5μM、10.0μM、15.0μM和20.0μM）与肿瘤细胞Hela（购于中国科学院细胞库）中进行共培养，共培养的条件为：共培养的温度为37℃，5体积%的CO2浓度，共培养的时间为2h。培养结束后使用流式细胞仪（FACSCalibur，BecktonDickson,USA）检测肿瘤细胞Hela内的荧光信号，其中，荧光信号越强表明穿膜率越高，并计算穿膜率。表1中显示了实施例1-5中的5条穿膜肽在不同浓度下的穿膜率。
测试对比例1-3
按照测试例1-5中的方法分别对对比例1-3中的穿膜肽进行FITC标记，以及穿膜率的测定。表1中显示了对比例1-3中的3条穿膜肽在不同浓度下的穿膜率。
表1
通过表1可以看出，本发明提供的穿膜肽均具有穿膜能力，bLfcin1的穿膜能力最强，并且具有同广泛报道的TAT类似的穿膜率，但本发明最优的穿膜肽bLfcin1与其相比含有的氨基酸数目更少，同序列相似的CPP5和CPP6相比，其穿膜活性更强。
测试例6-10
本测试例用于说明本发明提供的药物组合物及其制备方法以及其应用
（1）将实施例1-5中的穿膜肽按照摩尔比80:1，将公认的阳离子载体Lipofectamine 2000（invitrogen公司）作为阳性对照，按照其说明书中7.5μl的量，与50μmol siRNA（以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为靶点，其中，正义链的序列如SEQ ID No ：13（5′-GGCGCUGCCAAGGCUGUGGGCAAGGUC-3′）所示，反义链的序列如SEQ ID No：14（5′-GACCUUGCCCACAGCCUUGGCAGCGUC-3′）所示）进行混合得到穿膜肽与siRNA的混合物，并将所述混合物分别于37℃下反应30min使穿膜肽与siRNA充分结合。空白对照为等量的siRNA。
（2）将待处理细胞按照1×105个/孔的浓度接种于6孔板（3506，Corning）中，细胞培养基为含10重量%的新生牛血清（Gibco）的高糖DMEM培养基，37℃培养24h后，将步骤（1）中穿膜肽与siRNA充分结合的混合物加入到上述含有细胞的培养基中，使得siRNA的终浓度为50pM。将处理后的细胞于37℃，5体积%CO2的浓度下共培养5h后，更换新鲜的细胞培养基继续培养48h。
（3）沉默率的测定：利用TRIzol试剂盒（DP405，TIANGEN）分别提取步骤（2）中培养好的细胞中的RNA，然后利用PrimeScript 1st Strand cDNASynthesis Kit试剂盒（D6110A，TaKaRa）将提取的RNA进行反转录为cDNA，在利用定量PCR检测mRNA水平，从而确定GAPDH的表达量。其中，反应体系按照RealMasterMix（FP202，TIANGEN）中的说明书进行配制。之后将反应液按如下程序进行定量PCR反应；定量PCR的程序为：95℃维持5min；95℃维持15s，60℃维持30s，72℃维持1min，45个循环；80℃维持5s；从65℃加热到95℃的过程中检测荧光信号。上游引物序列如SEQ ID No：9（5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′）所示；下游引物序列如SEQ ID No：10（5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′）所示。选择因肌动蛋白内参基因（actin）作为参比，上游引物序列如SEQ ID No：11（5'-GGATCCGACTTCGAGCAAGAGATGGCCAC-3'）所示；下游引物序列如SEQ ID No：12（5'-CAATGCCAGGGTACATGGTGGTG-3'）所示。
将GAPDH的mRNA的表达量与内参基因actin的表达量的比值作为GAPDH的mRNA的相对表达量，沉默率为：（空白对照的GAPDH的相对表达量-处理后的GAPDH的相对表达量）/空白对照的GAPDH的相对表达量×100%。
计算得到本发明提供的穿膜肽对编码GAPDH的基因的沉默率分别为46%、38%、27%、17%、15%，阳性对照对编码GAPDH的基因的沉默率为50%。
（4）Western blot：利用RIPA（9806，CST公司）中的裂解液裂解步骤（2）中培养好的细胞，按照RIPA中的说明书提取所述细胞中的蛋白，并利用BCA试剂盒（23227，Pierce）对所提取的总蛋白进行定量，以总蛋白每孔上样量为10μg进行SDS-PAGE电泳（浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12.5%，电泳的条件为80V 20min，120V 100min）。电泳结束后，按照甘油醛-3-磷酸脱氢酶的分子量进行切胶，参照《分子克隆实验指南》中公开的方法对切割的胶进行电转、闭膜，洗涤、并分别与兔抗人GADPH抗体（2118，CST）和HRP标记的羊抗兔二抗（7074，CST）反应，最后利用ECL试剂盒（WBKLS0100,Millipore）进行显影、定影。图1显示了bLfcin1的Westernblot结果。
测试对比例4-6
按照测试例6-10的方法分别对对比例1-3中的穿膜肽进行相应的处理，其中，TAT对编码GAPDH的基因的沉默率为48%，CPP5对编码GAPDH的基因的沉默率为34%，CPP6对编码GAPDH的基因的沉默率为7%。Westernblot的结果见图1。
由对编码GAPDH的基因的沉默率可以看出，本发明提供的穿膜肽可有效的对目的基因进行沉默，穿膜肽bLfcin1效果最佳，基本达到了与现有穿膜肽TAT以及阳性对照的水平，但显著高于现有技术提供的穿膜肽CPP5和CPP6对基因沉默的能力。
从图1中也可以看出，穿膜肽bLfcin1可以明显降低细胞内的GAPDH水平，并且其降低能力与现有的TAT及公认的用于siRNA转运的阳离子载体Lipofectamine 2000相似，但明显优于序列类似的穿膜肽CPP5和与其长度一致的CPP6。
由于可以看出，本发明的提供的穿膜肽具有较好的穿膜的能力，并且可有效的介导siRNA进行穿膜并实现对目的基因的沉默。同时，本发明提供的穿膜肽bLfcin1的效果达到了最佳，并且其序列相对较短。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (8)
1.SEQ ID No：5所示的穿膜肽在制备进入细胞中的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述进入细胞中的药物包括siRNA、脂质体、多肽、蛋白、质粒和金属离子中的任意一种。
3.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有权利要求1所述的穿膜肽和siRNA。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，所述穿膜肽与siRNA的摩尔比为20-100:1。
5.一种药物组合物的制备方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1所述的穿膜肽与siRNA在pH值为7.0-8.5的缓冲液中进行接触。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，所述穿膜肽与siRNA的摩尔比为20-100:1，相对于每毫升所述pH值为7.0-8.5的缓冲液，所述穿膜肽与siRNA加入的总量为30-70μmol。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其中，所述siRNA的长度为18-25bp。
8.权利要求5-7所述的制备方法制备得到的药物组合物。
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