CN103382218B - 一种穿膜肽和药物组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种穿膜肽，所述穿膜肽的序列包括特异性识别肿瘤的识别序列、穿膜序列以及识别序列和穿膜序列之间的连接序列，其中，识别序列选自由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：8和SEQ ID No：9所示的氨基酸序列所组成的组中，连接序列为1-3个氨基酸组成的序列；及其在制备进入细胞中的药物中的应用。本发明还公开了一种药物组合物以及一种药物组合物的制备方法。还提供了本发明提供的穿膜肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本发明提供的穿膜肽对肿瘤细胞具有良好的特异性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一种穿膜肽、该穿膜肽在制备进入细胞中的药物中的应用、一种药物组合物及其制备方法，以及该穿膜肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
背景技术
穿膜肽为一类具有介导大分子物质直接主动地穿过细胞的细胞膜进入细胞质和细胞核内的功能氨基酸序列。因细胞穿膜肽可以在很短的时间内进入细胞内，且具有惊人的携带大分子物质进入细胞质和细胞核内的功能，以及对细胞无毒害的特性而受到国内外学者的广泛关注。
近年来，穿膜肽在分子生物学、药学、细胞生物学以及疫苗上表现出了广泛的应用前景。并且因其可以将具有治疗功效的蛋白质、多肽、小干扰RNA等物质携带进入细胞而发挥疗效的功能，因此，穿膜肽在肿瘤的治疗中表现出了极大的潜力。
虽然穿膜肽具有无毒、高效转运多种生物活性物质的优势，但当其协助例如抗肿瘤等治疗药物进入细胞时，由于穿膜肽不能对肿瘤细胞和正常细胞进行区分，不能够选择性的发挥转运作用，因此会产生严重的副作用。
因此，亟需开发一种具有肿瘤特异性的穿膜肽。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术穿膜肽不能对肿瘤细胞和正常细胞进行区分的缺陷，提供一种具有肿瘤特异性的穿膜肽及其应用，以及一种药物组合物及其制备方法以及它们的应用。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种穿膜肽，所述穿膜肽的序列包括特异性识别肿瘤的识别序列、穿膜序列以及识别序列和穿膜序列之间的连接序列，其中，所述识别序列选自由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：8和SEQ ID No：9所示的氨基酸序列所组成的组中；所述连接序列为1-3个氨基酸组成的序列。
第二方面，提供了本发明的穿膜肽在制备进入细胞中的药物中的应用。
第三方面，本发明提供了一种药物组合物，其中，该药物组合物含有本发明提供的穿膜肽和siRNA。
第四方面，本发明提供了一种药物组合物的制备方法，其中，该方法包括：将本发明提供的穿膜肽与siRNA在pH值为7-8.5的缓冲液中进行接触。
第五方面，本发明还提供了所述穿膜肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
通过本发明的实施例和对比例可以看出，本发明提供的穿膜肽与现有的穿膜肽相比，其对肿瘤细胞具有良好的特异性，并且其可以有效的将药物转运进肿瘤细胞中而发挥疗效。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1（A）为在穿膜序列1存在下肿瘤细胞HepG2和正常细胞L02共培养的激光共聚焦显微镜图；图2（B）为在穿膜肽1存在下肿瘤细胞HepG2和正常细胞L02共培养的激光共聚焦显微镜图；其中，（1）为FITC标记的穿膜肽在测定FITC的绿色荧光通道下检测到的荧光信号，（2）碘化丙啶荧光染料在其对应的红色荧光通道下检测到的信号，（3）为同时在FITC和碘化丙啶的荧光采集通道下测定的荧光信号。
图2为空白对照、由识别序列1、穿膜序列1以及本发明提供的穿膜肽1制备的药物组合物对甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）表达的抑制程度。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
第一方面，本发明提供了一种穿膜肽，所述穿膜肽的序列包括特异性识别肿瘤的识别序列、穿膜序列以及识别序列和穿膜序列之间的连接序列，其中，所述识别序列选自由SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：8和SEQ ID No：9所示的氨基酸序列所组成的组中；所述连接序列为1-3个氨基酸组成的序列。
根据本发明，所述穿膜序列和连接序列可以为本领域常规的各种穿膜序列和连接序列。为了增加所述穿膜肽对肿瘤细胞的选择性以及穿膜能力，所述连接序列优选为1个甘氨酸；所述穿膜序列优选选自由SEQ ID No：10、SEQ ID No：11和SEQ ID No：12所示的氨基酸序列所组成的组中，更优选具有SEQ ID No：10所示的氨基酸序列。
本发明中，为了进一步增加所述穿膜肽对肿瘤细胞的选择性以及穿膜能力，所述穿膜肽的序列优选选自由SEQ ID No：13、SEQ ID No：14和SEQID No：15所示的氨基酸序列所组成的组中。
根据本发明，所述穿膜肽的来源没有特别的限制。例如，可以从现有蛋白序列中进行截取得到；也可以由编码该穿膜肽的DNA转录并翻译得到；也可以按照常规的多肽的合成方法合成得到，例如，合成方法可以参照Systemic screening of milk protein-derived ACE inhibitors through a chemicallysynthesised tripeptide library（Ren F.Z.et al,Food Chemistry,2011,128(3),761-768）中公开的方法；还可以委托合成公司进行合成，例如，可以委托北京恒宇视野生物技术有限公司。
第二方面，提供了本发明的穿膜肽在制备进入细胞中的药物中的应用。
根据本发明，所述药物可以为本领域常规的各种药物，例如，所述药物可以选自siRNA、脂质体、多肽、蛋白、质粒和金属离子中的至少一种。
小干扰RNA（siRNA）可以激发与之互补的目标mRNA的沉默。因此，近年来，小干扰RNA技术广泛用于肿瘤、心血管治疗等临床和科研领域，而穿膜肽（CPP）作为良好的转运载体，在转运siRNA中得到了广泛的关注。二者可以通过非共价的静电作用结合实现转运，也可以通过对CPP和siRNA的末端进行二硫键等官能团的修饰，从而利用共价结合的方式实现连接及转运。后者虽然在转运过程中更加稳定，但进入细胞后却存在无法将CPP与siRNA切断，使siRNA发挥活性的问题。因此，越来越多的学者倾向于利用前者的结合方式实现siRNA的转运。
本发明提供的穿膜肽在肿瘤细胞和正常细胞同时存在的情况下，优先选择进入肿瘤细胞；并且本发明的穿膜肽带有大量的正电荷，可实现在细胞外与siRNA很好的静电结合，在细胞内环境中容易与siRNA分离；而且本发明提供的穿膜肽进入细胞后对细胞产生的副作用小。因此，本发明提供的穿膜肽特别适用于对siRNA的转运，并用于肿瘤的治疗。
根据本发明提供的穿膜肽的以上特性，第三方面，本发明提供了一种药物组合物，其中，该药物组合物含有本发明提供的穿膜肽和siRNA。
本发明中，所述穿膜肽与siRNA的用量的摩尔比没有特别的限制，综合考虑结合效率和成本，优选地，所述穿膜肽与siRNA的摩尔比为20-100:1。
根据本发明，所述siRNA可以为针对任意目标基因设计的siRNA，例如，以人血管内皮生长因子受体、肌动蛋白为靶点的siRNA，均可以按照一定的摩尔比同本发明提供的穿膜肽进行结合。
另外，本发明对所述药物组合物的形式也没有特别的限制，例如，可以为溶液的形式，也可以为胶囊的形式，还可以为片剂的形式。
此外，根据需要，所述药物组合物还可以选择性的含有药学上可接受的佐剂、防腐剂或稳定剂。其中，佐剂、防腐剂或稳定剂的种类和含量为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
根据本发明，药物组合物中穿膜肽与siRNA的总量并没有特别的限制，只要保证穿膜肽与siRNA的摩尔比在上述优选范围内即可。例如，以药物组合物的总重量为基准，所述穿膜肽与siRNA的总量可以为20-100重量%。
第四方面，根据本发明一种优选的实施方式，提供了一种药物组合物的制备方法，其中，该方法包括：将本发明提供的穿膜肽与siRNA在pH值为7-8.5的缓冲液中进行接触。
优选地，所述穿膜肽与siRNA的摩尔比为20-100:1。
根据本发明，所述穿膜肽与siRNA的用量的总量可以根据反应的效率以及对所述药物组合物的实际需要量进行适应性的调整，优选情况下，相对于每毫升所述pH值为7-8.5的缓冲液，所述穿膜肽与siRNA的用量的总量为30-70μmol。
根据本发明，所述缓冲液为本领域人员所熟知的能用于药物组合物的各种缓冲液，例如，Tris-盐酸缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液、超纯水，优选情况下，所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
根据本发明，所述siRNA的长度可以为18-25bp。
根据本发明，所述穿膜肽与siRNA接触的条件没有特别的限制，只要保证穿膜肽与siRNA能够结合即可。综合结合效率和时间考虑，优选情况下，所述接触的条件包括：接触的温度为25-37℃，接触的时间为20-60min。
根据本发明，所述制备的药物组合物可以直接进行使用，也可以将其进行干燥制备成干粉，并根据需要制备成各种不同的剂型进行使用。所述干燥的方法为本领域技术人员所公知，例如，可以利用真空冷冻干燥的方法。
第五方面，本发明还提供了所述穿膜肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1-9
本实施例用于说明本发明提供的穿膜肽
委托北京恒宇视野生物技术有限公司分别合成SEQ ID No：13（WFLITMGYGRKKRRQRRR）、SEQ ID No：14（WFILTMGYGRKKRRQRRR）、SEQ ID No：15（WFIITMGYGRKKRRQRRR）、SEQ ID No：23（EWYSWAGRKKRRQRRR）、SEQ ID No：24（SWVIHERKKRRQRRR）、SEQ ID No：16（SWVTHAERRWQWR）、SEQ ID No：25（QIMRIAGEYGRKKRRQRRR）、SEQ ID No：26（WVIHGGGRKKRRQRRR）和SEQ ID No：27（HIGEMRRKKRRQRRR）所示的氨基酸序列，分别记为穿膜肽1、穿膜肽2、穿膜肽3、穿膜肽4、穿膜肽5、穿膜肽6、穿膜肽7、穿膜肽8穿和膜肽9。
取少量的上述9条穿膜肽进行质谱鉴定，质谱所得分子量与按照序列得到的计算值相符，证明所述9条穿膜肽为本发明提供的穿膜肽。
对比例1和2
本对比例用于说明现有的穿膜序列和识别肿瘤的识别序列
委托北京恒宇视野生物技术有限公司分别合成SEQ ID No：10（YGRKKRRQRRR）（公认的穿膜序列）所示的穿膜序列和SEQ ID No：1（WFLITM）所示的识别序列，分别记为穿膜序列1和识别序列1。
取少量的上述2条序列进行质谱鉴定，质谱所得分子量与按照序列得到的计算值相符，证明所述2条序列为所要合成的穿膜序列1和识别序列1。
测试例1-9
本测试例用于说明本发明提供的穿膜肽对肿瘤细胞的选择性
（1）穿膜肽的异硫氰酸荧光素（FITC）标记
将实施例1-9中的穿膜肽按照1:5的摩尔比分别与FITC（购自Sigma）混合得到穿膜肽与FITC的混合物，分别将所述混合物溶于1mL的N,N'-二甲基甲酰胺（DMF，购自南京康满林化工实业有限公司）中，并在70Hz，避光条件下超声反应10h，得到FITC标记的穿膜肽。
（2）对肿瘤细胞选择性的测试
将肿瘤细胞HepG2（购于中国科学院细胞库）和正常细胞L02（购于中国科学院细胞库）按照5×103个细胞/孔的浓度分别加入到含有包被了多聚赖氨酸的玻璃片（Fisher，12-545-83，购于上海桑戈生物技术有限公司）的24孔板（3524，Corning）中培养，其中，用于培养肿瘤细胞HepG2的培养基为10重量%胎牛血清的高糖DMEM（购于Gibco公司），用于培养待正常细胞L02的培养基为1640培养基（购于Gibco公司）。细胞完全贴壁后，将两块分别长有HepG2和L02的玻璃片取出，共同放置到6孔板（3506，Corning）中，6孔板中的培养基为按照体积比为1：1的比例混合的含有10重量%胎牛血清的高糖DMEM和1640培养基。
将步骤（1）中经FITC标记的9条穿膜肽分别以1.0μM的浓度加入如上所述的混合培养基中，在37℃，5体积%的CO2中共培养为30min。培养结束后除去培养基，用磷酸盐缓冲液（10mM，pH7.4）洗涤5遍，吸干后每孔加入1ml4重量%多聚甲醛（购于华奥中生生物技术有限公司），在4℃下固定15min。固定后除去多聚甲醛，用磷酸盐缓冲液（10mM，pH7.4）洗涤5遍后，将固定细胞后的玻璃片取出，用中性树胶固定在载玻片上。然后对固定的细胞分别进行碘化丙啶染色，染色时间为5min。染色结束后分别使用激光共聚焦显微镜（Leica，TCS，SP5）的绿色荧光通道、红色荧光通道以及绿色和红色荧光信号的共同通道下测定HepG2和L02这两个细胞中的FITC发射的绿色荧光信号、碘化丙啶发射的红色荧光信号以及两种荧光信号，绿色荧光信号越强表明进入该细胞的穿膜肽越多。与穿膜肽1共培养的肿瘤细胞HepG2和正常细胞L02内的荧光信号的结果见图1。
测试对比例1和2
按照测试例1-9中的方法分别对对比例1和2中的穿膜序列和识别序列进行FITC标记，以及对肿瘤细胞选择性的测试，与对比例1中的穿膜序列1共培养的肿瘤细胞HepG2和正常细胞L02内的荧光信号的结果见图1，识别序列1几乎没有穿膜的能力。
图1中，（1）为FITC标记的穿膜肽在测定FITC的绿色荧光通道下检测到的荧光信号；（2）为能够特异性结合细胞核的碘化丙啶荧光染料在其对应的红色荧光通道下检测到的信号，通过标定细胞核的位置来证明（1）中检测到的信号是在细胞内；（3）为同时在FITC和碘化丙啶的荧光采集通道下测定的荧光信号，可以对FITC标记的穿膜肽在细胞内的分布定位到细胞质和细胞核中。
通过以上可以看出，本发明提供的含有穿膜序列、识别序列和连接序列的穿膜肽能够进入肿瘤细胞并且在肿瘤细胞和正常细胞同时存在的条件下对肿瘤细胞具有良好选择性。而单独的穿膜序列对肿瘤细胞不具有选择性，单独的识别序列几乎不具有穿膜的能力。
测试例10-18
本测试例用于说明本发明提供的药物组合物及其制备方法以及其应用
（1）将实施例1-9中的穿膜肽按照摩尔比60:1的量分别与50μmolsiRNA（以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为靶点，其中，正义链的序列如SEQ ID No：17（5′-GGCGCUGCCAAGGCUGUGGGCAAGGUC-3′）所示，反义链的序列如SEQ ID No：18（5′-GACCUUGCCCACAGCCUUGGCAGCGUC-3′）所示）进行混合得到穿膜肽与siRNA的混合物，并将所述混合物分别于37℃下反应30min使穿膜肽与siRNA充分结合。空白对照为等量的siRNA。
（2）将待处理的肿瘤细胞HepG2按照1×105个/孔的浓度接种于6孔板（3506，Corning）中，细胞培养基为含10重量%的新生牛血清（Gibco）的高糖DMEM培养基，37℃培养24h后，分别将步骤（1）中穿膜肽与siRNA充分结合的混合物加入到上述含有细胞的培养基中，使得siRNA的终浓度为50pM。将处理后的细胞于37℃，5体积%CO2的浓度下共培养5h后，更换新鲜的细胞培养基继续培养48h。
（3）沉默率的测定：利用TRIzol试剂盒（DP405，TIANGEN）分别提取步骤（2）中培养好的细胞中的RNA，然后利用PrimeScript1st Strand cDNASynthesis Kit试剂盒（D6110A，TaKaRa）将提取的RNA进行反转录为cDNA，在利用定量PCR检测mRNA水平，从而确定GAPDH的表达量。其中，反应体系按照RealMasterMix（FP202，TIANGEN）中的说明书进行配制。之后将反应液按如下程序进行定量PCR反应；定量PCR的程序为：95℃维持5min；95℃维持15s，60℃维持30s，72℃维持1min，45个循环；80℃维持5s；从65℃加热到95℃的过程中检测荧光信号。上游引物序列如SEQ ID No：19（5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'）所示；下游引物序列如SEQ ID No：20（5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'）所示。选择因肌动蛋白内参基因（actin）作为参比，上游引物序列如SEQ ID No：21（5'-GGATCCGACTTCGAGCAAGAGATGGCCAC-3'）所示；下游引物序列如SEQ ID No：22（5'-CAATGCCAGGGTACATGGTGGTG-3'）所示。
将GAPDH的mRNA的表达量与内参基因actin的表达量的比值作为GAPDH的mRNA的相对表达量，沉默率为：（空白对照的GAPDH的相对表达量-处理后的GAPDH的相对表达量）/空白对照的GAPDH的相对表达量×100%。
计算得到本发明提供的穿膜肽对编码GAPDH的基因的沉默率分别为80%、77%、74%、66%、64%、63%、59%、56%和55%。
（4）Western blot：利用RIPA（9806，CST公司）中的裂解液裂解步骤（2）中培养好的细胞，按照RIPA中的说明书提取所述细胞中的蛋白，并利用BCA试剂盒（23227，Pierce）对所提取的总蛋白进行定量，以总蛋白每孔上样量为10μg进行SDS-PAGE电泳（浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12.5%，电泳的条件为80V20min，120V100min）。电泳结束后，按照甘油醛-3-磷酸脱氢酶的分子量进行切胶，参照《分子克隆实验指南》中公开的方法对切割的胶进行电转、闭膜，洗涤、并分别与兔抗人GADPH抗体（2118，CST）和HRP标记的羊抗兔二抗（7074，CST）反应，最后利用ECL试剂盒（WBKLS0100,Millipore）进行显影、定影。图2显示了穿膜肽1的Westernblot结果。
测试对比例3和4
按照测试例10-18的方法分别对对比例1和2中的穿膜序列1和识别序列进行相应的处理，其中，经对比例的穿膜序列1和识别序列1携带的siRNA对编码GAPDH的基因的沉默率为79%和5%。Western blot的结果见图2。
由对编码GAPDH的基因的沉默率可以看出，由本发明提供的穿膜肽制备的药物组合物可有效的对目的基因进行沉默，其中，穿膜肽1、穿膜肽2和穿膜肽3基本达到了由现有穿膜序列1（对比例1）制备的药物组合物的水平。
从图2中也可以看出，由本发明提供的穿膜肽制备的药物组合物可以明显降低细胞内的GAPDH水平，并且其降低能力与由现有的穿膜序列制备的药物组合物相似。
由于可以看出，本发明的提供的穿膜肽对肿瘤细胞具有良好的选择性和较好的穿膜的能力，并且可有效的介导siRNA进行穿膜并实现对目的基因的沉默。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (8)
1.一种穿膜肽，其中，所述穿膜肽的序列选自由SEQ ID No：13、SEQID No：14和SEQ ID No：15所示的氨基酸序列所组成的组中。
2.权利要求1所述的穿膜肽在制备进入细胞中的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述进入细胞中的药物含有siRNA、脂质体、多肽、蛋白、质粒和金属离子中的至少一种。
4.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有权利要求1所述的穿膜肽和siRNA。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，所述穿膜肽与siRNA的摩尔比为20-100:1。
6.一种药物组合物的制备方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1所述的穿膜肽与siRNA在pH值为7-8.5的缓冲液中进行接触。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，所述穿膜肽与siRNA接触的摩尔比为20-100:1，相对于每毫升所述pH值为7-8.5缓冲液，所述穿膜肽与siRNA加入的总量为30-70μmol。
8.权利要求1所述的穿膜肽在制备治疗肝癌的药物中的应用。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: CHINA AGRICULTURAL UNIVERSITY Free format text: FORMER OWNER: REN FAZHENG Effective date: 20150527 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Ren Fazheng Inventor after: Fang Bing Inventor after: Zhang Ming Inventor after: Guo Huiyuan Inventor after: Jiang Lu Inventor before: Fang Bing Inventor before: Zhang Ming Inventor before: Guo Huiyuan Inventor before: Jiang Lu Inventor before: Ren Fazheng |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: FANG BING ZHANG MING GUO HUIYUAN JIANG LU REN FAZHENG TO: REN FAZHENG FANGBING ZHANG MING GUO HUIYUAN JIANG LU |
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| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20150527 Address after: 100083 Haidian District Qinghua East Road, No. 17, Beijing Applicant after: China Agricultural University Address before: 100083 Haidian District Qinghua East Road,, China Agricultural University, No. 303, Beijing Applicant before: Ren Fazheng |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |