CN109266731A

CN109266731A - Tim-3与NF90的相互作用在预防或治疗病毒感染产品中的应用

Info

Publication number: CN109266731A
Application number: CN201810964373.9A
Authority: CN
Inventors: 窦帅杰; 韩根成; 李葛; 李国贤; 张艳玲; 张嘉诚; 刘艺琼
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-08-23
Filing date: 2018-08-23
Publication date: 2019-01-25

Abstract

本发明提供了Tim‑3和NF90基因或蛋白在制备检测或治疗病毒感染性疾病产品中的应用，所述Tim‑3与NF90存在相互作用；本发明还提供了一种Tim‑3抑制剂以及一种表达外源的NF90或NF90‑DZF‑Domain结构域的载体在制备预防或治疗病毒感染的药物中应用。本发明利用标记物Tim‑3与其相互作用的NF90可以对病毒感染进行预防或治疗，不仅对病毒感染的治疗和医疗成本的节约有重要意义，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

Description

Tim-3与NF90的相互作用在预防或治疗病毒感染产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术和免疫学领域，具体涉及Tim-3蛋白与NF90的相互作用在预防或治疗病毒感染产品中的应用。

背景技术

近年来，感染性疾病包括病毒、细菌的感染日益增多，严重危害人们的生命健康。尤其是近年来各种新发、突发病毒性传染病如流感病毒、埃博拉病毒、SARS病毒以及近几年在非洲流行的寨卡病毒的感染流行给人民的生命安全带来了巨大的威胁，同时也给社会及家庭带来了沉重的经济负担。如流感病毒感染是最常见和最常发生的病毒感染，而且近几年出现爆发周期缩短、感染性增强、死亡率上升的特点。基于病毒感染的危害，阐明病毒感染的分子机制，探索新的免疫策略成为迫切需要解决的问题。

固有免疫是生物抵抗病毒感染的第一道防线。在抵御病毒入侵过程中模式识别分子发挥重要的功能。如Toll样受体(Toll-like receptors)，RLR样受体(RIG-I-likereceptors)是重要的病毒模式识别分子(Pattern recognition receptors)。两种模式识别分子通过不同信号通路识别病毒从而启动先天性免疫信号通路，最终都通过诱导炎症反应及Ⅰ型干扰素等来抑制病毒复制或杀灭病毒；同时病毒感染宿主细胞也能够引起胞质颗粒的聚集，其成分大多为核糖核蛋白、RNA结合蛋白、翻译起始因子等，这个聚集区域被称之为应激颗粒(stress granules,SG)。先天性免疫信号通路和SG都是机体抵御病原感染形成的自我保护机制，而在特定的情况下机体的抗感染应答机制可以被病毒等病原体滥用。

Tim-3(T-cell-Ig-mucin-3，T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3)是最初发现表达于活化的Th1细胞上的免疫负调控分子，与其配体Gal-9结合能够诱导T细胞的凋亡及免疫耐受。随后研究发现Tim-3也表达在活化的Th17、Tc1等效应性T细胞上，其高表达可导致效应细胞内IFN-γ、IL-2等表达降低，使细胞处于失能或耗竭(exhaustion)状态而形成抗感染免疫耐受。鉴于Tim-3高表达与T细胞耐受的关系，靶向Tim-3抗体或Tim-3融合蛋白被认为是治疗HIV、HCV等感染性疾病中T细胞耐受的新手段。Kuchroo VK教授等发现Tim-3可能通过Bat3以及CEACAM-1等转录因子抑制T细胞的功能，近年来发明人发现Tim-3也表达在巨噬细胞、NK细胞等天然免疫细胞上，并且发现Tim-3在维持天然免疫稳态中发挥重要作用，但到目前Tim-3在天然免疫上发挥免疫耐受功能的分子机制尚不十分清楚，需进一步阐明。

NF90是一种能够结合病毒双螺旋RNA结构的蛋白，在RNA复制方面发挥重要作用。NF90由人白细胞介素增强结合因子3(Interleukin enhancer binding factor 3,ILF3)基因编码，因为选择性剪接导致在转录后翻译形成多种同型异构体，它们能够通过共同的结构-双螺旋RNA结合基序与双螺旋RNA相互作用，从而发挥对RNA的不同调控作用。研究发现，NF90在抗病毒感染中也发挥重要的作用，如有研究报道，NF90在病毒感染中通过促进PKR/eIF2α磷酸化通路进而促进SG的形成，从而抑制病毒的翻译起始，最终发挥抗病毒感染免疫作用。NF90在参与病毒复制或感染的进程中，自身是如何被调控的，其发挥抗病毒感染的功能变化如何，这方面的研究尚有很多的空白。

发明内容

本发明的目的在于寻找能够用于预防或治疗病毒感染的生物标志物：Tim-3和NF90，并提供其相关的应用；本发明的另一个目的在于阐明Tim-3调控NF90抗病毒感染免疫的分子机制，寻找预防或治疗病毒感染的新途径：Tim-3抑制剂以及外源NF90或NF90-DZF-Domain结构域表达载体。

基于此，发明人通过免疫共沉淀和质谱筛选技术，发现了一种新的与病毒感染相关的分子-核因子90(Nuclear Factor 90,NF90)可以与免疫调控分子Tim-3相互作用。并利用水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)作为病毒感染模型，先后感染稳定敲低Tim-3的RAW264.7巨噬细胞，以及全基因敲除的C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞，并以相应的野生型RAW264.7巨噬细胞和小鼠腹腔巨噬细胞作为对照，发现在VSV病毒感染状态下：1)敲低或敲除Tim-3后NF90基因和蛋白水平都明显上升；2)敲低或敲除Tim-3后VSV的复制受到了抑制；以上结果提示在病毒感染刺激下，Tim-3可能通过抑制NF90介导感染耐受，同时证明Tim-3参与并促进病毒的感染。然后发明人对Tim-3抑制NF90抗病毒感染的分子机制进行更深入的研究，通过实验发现了NF90功能调控的新机制，即存在泛素化修饰。发明人通过在细胞系高表达Tim-3，以及利用Tim-3转基因小鼠腹腔巨噬细胞等多个实验体系证明Tim-3能够促进NF9-Ub-K48的泛素化修饰；并且进一步实验发现NF90-DZF-Domain是发生泛素化修饰的结构域，并证明了Tim-3能够与DZF-Domain发生免疫共沉淀并促进其泛素化修饰；通过免疫共沉淀技术初步确认Tim-3-IC胞内段是发挥免疫负调控作用的结构域。在发现NF90的泛素化修饰这一新的修饰功能后，本发明进一步筛选调控NF90翻译后修饰的E3泛素连接酶，并通过基因芯片和RT-PCR以及免疫沉淀等技术发现TRIM16、TRIM47是调控NF90泛素化修饰的E3泛素连接酶。

首先，本发明提供了Tim-3和NF90基因或蛋白在制备检测、预防或治疗病毒感染性疾病产品中的应用。

优选的，所述产品包括试剂盒、试剂或药物。

优选的，所述Tim-3能够促进病毒的感染；所述Tim-3通过抑制NF90基因和蛋白水平的表达，进而抑制NF90的抗病毒感染免疫应答。

优选的，所述Tim-3蛋白在病毒感染体系中表达水平呈现先增多后下降的趋势。

优选的，所述NF90具有一种新的泛素化修饰功能，其在抗病毒感染免疫中通过泛素化修饰发挥抗病毒感染免疫的作用。

优选的，所述Tim-3能够促进NF90的泛素化修饰，进而促进NF90降解；所述NF90的泛素化修饰的形式为泛素-蛋白酶体降解途径。

病毒感染启动信号分子的感染免疫有两种形式：一种是信号分子识别病毒结构后通过K63链接的泛素化使信号分子激活从而启动抗病毒感染的下游信号分子，从而增强抗病毒感染免疫反应；另一种是信号分子在感染过程中已经处于高度活化状态，在病毒感染中，通过介导胞内某些E3连接酶将泛素分子转移到信号分子对应的赖氨酸位点上，以此促进信号分子的K48泛素化修饰，从而启动泛素-蛋白酶体途径，最终导致信号分子的大量快速降解，使得抗病毒感染效应的下降。泛素化修饰在抗感染免疫中是常见的重要调控方式。

优选的，所述NF90发生泛素化的结构域为DZF-Domain；所述Tim-3胞内段IC结构域通过与DZF-Domain结构域相互作用，从而促进NF90的泛素化使其蛋白降解，进而抑制NF90的抗病毒感染免疫应答。

优选的，所述Tim-3胞内段IC是抑制NF90蛋白功能的结构域。

优选的，所述Tim-3是通过E3泛素连接酶发挥重要调控作用促进NF90泛素化修饰。

优选的，所述E3泛素连接酶为TRIM16，TRIM47。

泛素化修饰是一个环状通路，它是由E1(泛素活化酶)，E2(泛素转移酶)和E3(泛素连接酶)三种泛素酶组成，而发挥泛素修饰关键的酶是E3连接酶，它具有携带泛素分子的功能，在泛素信号激活的状态下能够将其转移到靶分子特定赖氨酸位点上，从而使靶分子发生相应的泛素化修饰，进而使其活化或降解。

优选的，所述病毒为单链RNA病毒，所述单链RNA病毒包括(但不限于)流感病毒、埃博拉病毒、SARS病毒、水疱性口炎病毒以及寨卡病毒。

进一步地，本发明提供了一种Tim-3抑制剂，所述抑制剂包括：Tim-3的抗体或其抗原的结合片段、Tim-3核酸的反义RNA、microRNA、siRNA、shRNA以及Tim-3的活性抑制剂。

优选的，所述Tim-3抑制剂为siRNA，所述siRNA核酸序列为SEQ ID NO.19～20。

优选的，所述Tim-3抑制剂为Tim-3抗体，所述Tim-3抗体包括针对Tim-3胞内段IC结构域的抗体，所述Tim-3胞内段IC结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

进一步地，本发明还提供了Tim-3抑制剂在制备预防或治疗病毒感染药物中的应用，所述Tim-3抑制剂抑制Tim-3功能，促进NF90表达，从而NF90发挥抗病毒感染免疫作用。

优选的，所述的药物包括Tim-3抑制剂作为活性成分，和药学上可接受的载体。

优选的，所述药学上可接受的载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。

更进一步地，本发明提供了一种表达外源的NF90或NF90-DZF-Domain结构域的载体的用途，其用于制备预防或治疗病毒感染性疾病的药物。

优选的，所述载体包括质粒、病毒载体。

优选的，所述病毒载体可以是腺病毒、慢病毒等载体。

再进一步地，本发明还提供了一种用于预防或治疗病毒感染的药物组合物，所述的药物组合物含有(i)药学上可接受的载体；(ii)Tim-3抑制剂，和/或表达外源的NF90或NF90-DZF-Domain结构域的载体；(iii)任选的不同于组分(ii)的其他抗病毒活性成分。

本发明还提供了所述病毒感染的药物组合物在制备抗病毒感染药物中的应用。

有益效果

1、发明人通过免疫共沉淀结合质谱筛选技术，发现了一种新的与病毒感染相关的分子-核因子90(NuclearFactor 90,NF90)，可以与免疫调控分子Tim-3相互作用；

2、发明人发现在VSV病毒感染刺激下，所述Tim-3能够促进病毒的感染；所述Tim-3能够抑制NF90基因和蛋白水平的表达，进而抑制NF90的抗病毒感染免疫应答；

3、进一步，发明人发现了NF90一种新的潜在的修饰功能-泛素化修饰，并通过实验证明Tim-3能够促进NF90的这一新功能，进而促进NF90降解；

4、发明人找到了NF90发生泛素化的结构域DZF-Domain，并且发现Tim-3胞内段IC结构域通过与DZF-Domain发生免疫共沉淀，从而促进NF90的泛素化使其蛋白降解，进而抑制NF90的抗病毒感染免疫应答；

5、发明人初步研究显示E3泛素连接酶TRIM16，TRIM47在Tim-3促进NF90泛素化修饰进程中发挥重要调控作用。

本发明将Tim-3和NF90共同作为标志物用于检测病毒感染性疾病以及筛选预防和/或治疗病毒感染性疾病的药物；并阐明了Tim-3抑制NF90抗病毒感染免疫的分子机理。进一步，本发明提供了Tim-3和NF90在制备检测、预防或治疗病毒感染性疾病产品中的应用。此外，本发明还提供了一种Tim-3抑制剂以及一种表达外源的NF90或NF90-DZF-Domain结构域的载体可作为在制备预防或治疗病毒感染性疾病的药物，为病毒感染性疾病提供一种新的治疗途径。

附图说明

图1Tim-3与NF90发生免疫共沉淀；图中，A.显示293T细胞转染Tim-3质粒成功，以及与Tim-3相互作用的蛋白条带；B.与NF90匹配的序列信息；C&D.Tim-3与NF90免疫共沉淀验证；E.内源Tim-3与NF90发生免疫共沉淀。

图2Tim-3促进VSV病毒mRNA的转录并抑制NF90mRNA的转录；图中，A.Tim-3敲低效果的验证；B&C.RT-PCR检测VSV、NF90基因水平的差异，结果使用GraphPad Prism 6软件进行统计分析(x±s，n＝3)，*p<0.05，**p<0.01；D.在基因敲除小鼠(Tim-3^-/-)的肺中观察到较少的炎症细胞浸润。

图3Tim-3抑制NF90蛋白的表达；图中，A.流式细胞术检测Tim-3在Jurkat细胞的表达情况；B.PMA+PHA刺激T细胞12h，WB检测NF90蛋白表达；C.293T细胞转染Tim-3质粒，对照组转染空载体PcDNA3.1(+)，WB检测NF90蛋白水平差异；D.收集野生型(WT)及Tim3-TG转基因小鼠腹腔巨噬细胞，WB检测NF90蛋白水平差异；E&F.VSV感染敲除Tim-3的C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞，对照为野生小鼠(WT)，8小时后收集细胞进行WB检测NF90蛋白表达；G.VSV感染敲除Tim-3的C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞，对照为野生小鼠，16h后收集细胞，检测Tim-3的动态表达；H&I.VSV感染稳定敲低Tim-3的RAW264.7细胞(Tim-3-si)，对照组为Nc，8h后收集细胞，WB检测NF90蛋白水平差异。

图4NF90存在翻译后修饰功能，并且Tim-3促进这一新功能进程；图中，A.Tim-3抑制N90蛋白合成；B&C.NF90发生泛素化，Tim-3促进NF90泛素-蛋白酶体降解。

图5Tim-3调控NF90-DZF-Domain的K48位泛素化；图中，A.NF90氨基酸序列及结构域分布；B.NF90-DZF发生泛素化修饰；C&D.Tim-3胞内段IC结构域与NF90-DZF发生免疫沉淀；E.Tim-3促进NF90-DZF-Ub-K48修饰。

图6TRIM16/TRIM47促进NF90泛素化修饰；图中，A.稳定敲低Tim-3的RAW264.7细胞的基因芯片检测结果；B&C.RAW264.7稳定敲低Tim-3细胞株和Jurkat稳定过表达Tim-3细胞株，TR-PCR分析TRIM16，TRIM47基因转录水平差异；D&E.TRIM16，TRIM47促进NF90泛素化修饰；IP使用抗Flag-标签抗体，IB使用抗HA-标签质粒检测NF90泛素化水平差异。注：n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01。

图7小鼠感染VSV后检测小鼠死亡率变化。其中，Tim-3^-/-代表基因敲除小鼠，Tim-3^+/+代表野生对照小鼠。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用的试剂可以商业购买得到。

本发明通过质谱分析技术发现Tim-3与NF90存在相互作用。在此基础上，发明人建立了经典的VSV感染模型，因为VSV病毒的复制不依赖其他核输出信号，可以在胞浆内独立合成蛋白并进行加工。本发明利用VSV发明人重点对二者相互作用的分子机制进行了初步的研究。期望能对全面认识Tim-3的病毒免疫调控机制，探索新的疾病干预策略提供新的理论及实验依据。

本发明所用的主要仪器试剂和材料如下：

1、小鼠、细胞、质粒及VSV病毒

C57BL/6来源的Tim-3转基因小鼠以及Tim-3基因敲除小鼠，由广州赛业生物科技有限公司合作构建；RAW264.7鼠源巨噬细胞、293T细胞、Jurkat细胞株(属急性T细胞白血病细胞系)均购自ATCC。

稳定敲低Tim-3基因的RAW264.7细胞株及对照组细胞株的构建方法是参照《Li Y,Feng J,Geng S,et al.The N-and C-terminal carbohydrate recognition domains ofgalectin-9contribute differently to its multiple functions in innate immunityand adaptive immunity[J].Molecular Immunology,2011,48(4):670-677.》文献；

泛素质粒：WT-Ub-HA，Ub-K48-HA参照《Zha,Zhengyu,Han,et al.ANon-CanonicalFunction ofGβas a Subunit ofE3Ligase in Targeting GRK2Ubiquitylation[J].Molecular Cell,2015,58(5):794-803.》文献构建。

VSV病毒制备参照《Chen W,Han C,Xie B,et al.Induction ofSiglec-GbyRNAviruses inhibits the innate immune response by promoting RIG-I degradation[J].Cell,2013,152(3):467-478.》文献。本发明制备的VSV病毒的滴度为1*10^{^10}pfu/mL。本发明实施例中，是将VSV病毒稀释1万倍后感染刺激细胞(小鼠的腹腔巨噬细胞、RAW264.7细胞)，之后进行相关实验检测。

构建稳定高表达Tim-3的Jurkat细胞株；Tim-3不带标签质粒：WT全长，Y265/272F双位点突变，ΔIC缺失胞内段构建；Tim-3带标签质粒：WT-HA，WT-Falg，Y265/272F-Flag，ΔIC-Flag；Tim-3带荧光标签融合质粒：PEGFP-Tim-3，PdsRed-Tim-3；以及NF90带Flag，V5，GFP全长质粒及带Flag标签的突变体质粒：DZF-Flag，ΔDZF-Flag；TRIM16-V5，TRIM47-V5全长质粒构建，上述质粒构建方法，以PEGFP-Tim-3质粒为例说明构建方法：

1)根据PDsRed1-N1荧光表达载体和Tim-3基因全长CDS序列选择合适的酶切位点即上游酶切位点NheI和下游酶切位点HindⅢ。

2)根据序列及酶切位点设计上下游引物并送公司合成:

利用合成的引物以及高保真PFU酶，以及人源细胞Jurkat细胞cDNA中调取Tim-3全长基因，PCR扩增，经过琼脂糖凝胶及胶回收，利用T载体将基因片段连接到T载体上，转化大肠杆菌Top10，途LB培养基平板，预先加入Amp抗性，长出单克隆进行基因测序，将测序正确的单克隆质粒进行双酶切，得到具有特异酶切没位点的基因片段；酶切的同时将PEGFP1-N1空质粒进行同样的双酶切，得到线性Tim-3基因具有相同的酶切位点的质粒，酶链体系将质粒与Tim-3进行连接，转化大肠杆菌Top10，并作阳性对照，长出单克隆后，挑取单克隆提取基因并进行双酶切及琼脂凝胶验证，如酶切后出现与Tim-3基因大小相似的条带说明克隆成功，将菌液进行扩增并大提质粒，最终得到携带GFP绿色荧光的Tim-3融合表达载体。

其他质粒采用相同方法操作，构建带特定标签及荧光的质粒，包括NF90相关标签质粒的构建。

质粒转染细胞的方法：以稳定过表达Tim-3的Jurkat细胞株(Jurkat^Tim-3-high)为例，将质粒PEGFP-Tim-3转染到Jurkat细胞株，所述转染试剂盒：LONZA Amaxa^TM Cell LineNucleofector^TMKit V Solution Box(Cat.No.VCA-1003Lot No.F-11281)，Jurkat细胞转染方法严格按照以上试剂盒说明书，采用电转法进行转染，筛选使用G418抗性，采用多梯度抗性进行细胞筛选，直到筛选到稳定表达Tim-3蛋白的细胞株，使用流式细胞术进行筛选验证，直到Tim-3表达效率>＝98％，之后按照细胞增殖状态及Tim-3表达的效率，使用800μg/mL的G418进行稳定株的保持，使细胞正常增殖并高效率表达Tim-3。

2、主要试剂及试剂盒

DMEM，RPIM640，Opti-MEM培养基购自北京凯诺春天生物技术有限公司；胎牛血清FBS购自天津康源生物技术有限公司；JetPRIM Buffer转染试剂购自北京达科为生物技术有限公司； Reagent购自Invitrogen；First Strand cDNA synthesis kit购自北京全式金生物技术有限公司；UltraSYBR Mixture，HA、Myc、Flag、V5WB抗体，ProteinA/GAgarose，β-Actin抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司；GAPDH抗体购自天津三箭生物技术有限公司；Tim-3抗体购自Abclonal；Tim-3抗体(只适用于鼠源蛋白)购自Cellsignaling technology；NF90(ILF3)抗体，Ubiquitin抗体，HA、Myc、V5、GFP IP抗体购自Abcam；Flag IP抗体购自Sigma；K48-Ubiquitin抗体购自CST；hTim-3-PE流式抗体、IgG2aκIsotype购自eBioscience；IgG mouse/rabbit Isotype购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；二抗购自北京西美杰生物科技有限公司；消重链二抗购自北京艾德生物科技有限公司；BSA，PVDF膜，透明塑料膜，50*TAE琼脂糖凝胶缓冲液购自北京凯诺春天生物技术有限公司；脱脂奶粉购自BD；β-巯基乙醇购自Amresco；BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo；ECL发光显影液购自GE Healthcare；各种限制性内切酶T4连接酶购自NEB；快速琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；无内毒素质粒大提试剂盒，2*PFUPCRMixture购自北京天根生物科技有限公司；Top10大肠杆菌感受态细菌购自北京天一辉远生物有限公司；氨苄西林钠，卡那霉素购自华北制药有限公司；CHX，MG132购自Selleck公司。

3、主要试剂及配制

(1)RIPA弱裂解液：25mM Tris-HCl(PH7.4)，150mMNaCl，1％NP40，0.25％(W/V)脱氧胆酸钠。

(2)RIPA强裂解液：25mM Tris-HCl(PH7.4)，150mMNaCl，1％NP40，0.25％(W/V)脱氧胆酸钠。

(3)IP洗液(低盐)1L：1M Tris-HCl(PH＝7.5)20mL，5MNaCl 24mL，甘油100mL，Triton×10010mL，500mM EDTA(PH＝8.0)4mL。

(4)IP洗液(高盐)1L：1M Tris-HCl(PH＝7.5)20mL，5M NaCl 100mL，甘油100mL，Triton×10010mL，500mM EDTA(PH＝8.0)4mL。

(5)WB蛋白裂解液：20mM Tris-HCl(PH8.0)，250mM NaCl，0.5％NP40，3mM EDTA(PH8.0)，3mM EGTA(PH8.0)，最终调PH至7.6。

(6)TBST(PVDF)膜洗液1L：NaCl 8.5g，1M PH 8.0Tris-Hcl 20mL，吐温-200.5mL于800mL双蒸水充分溶解后定容至1L。

(7)一抗孵育液：称量3g BSA粉末加入到TSBT洗液中，充分溶解后成为3％的一抗孵育液，使用时按照抗体稀释比例使用。

(8)二抗孵育液：5％牛奶封闭液中按抗体稀释比例加入对应的二抗。

4、主要仪器设备

Q-PCR仪iQ-5、流式细胞仪FACS caliber，Bio-Rad公司；低温低速离心机，Thermo；酶标仪，Thermo Cycler；PVDF膜蛋白成像仪，上海勤翔科学仪器有限公司。

本发明涉及Tim-3胞内段IC结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，NF90-DZF-Domain结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

本发明所述Tim-3和NF90是在本发明之前的已知基因，其基本信息如下：

Tim-3：NCBI中Gene ID:84868，来源于人类基因组；NCBI中Gene ID:171285，来源于小鼠基因组。

NF90：NCBI中Gene ID:3609，来源于人类基因组；NCBI中Gene ID:16201，来源于小鼠基因组。

实施例1Tim-3与NF90发生免疫共沉淀

本发明利用免疫共沉淀联合质谱分析技术对Tim-3的下游信号分子进行筛选。

免疫共沉淀：

293T细胞复苏传代2次后铺于75cm²培养瓶，每瓶铺2×10⁶个细胞，DMEM完全培养液体积为12mL，48h后转染Tim-3质粒，对照组转染PcDNA3.1(+)空质粒；转染4h后更换DMEM完全培养基，24后收细胞做免疫共沉淀，具体操作步骤如下：

(1)蛋白裂解：RIPA弱解液中按比例加入DTT和Na₃VO₄两种还原剂，以及蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，每个样品加入2mL裂解液裂解，4℃旋转裂解细胞30min；分装到1.5mL进口EP管中，12000rpm/min，离心15min，取100μL做Input，证明转染体系成功与否，剩下上清置于冰上备用；

(2)同型对照制备：Tim-3抗体是发明人参照《侯春梅,郎小玲,肖燕,等.Tim-3抗体的生物学活性及应用研究[J].军事医学,2014(8):617-620.》制备克隆号为L3D，其亚型属于mouse IgG 2aκ；在细胞裂解过程中发明人同时制备同型对照实验组；取一1.5mL进口EP管加入1mL RIPA裂解液，200μL Protein A/G Agarose，25μg anti IgG 2aκ同型对照，4℃，旋转孵育30min；分装到1.5mL进口EP管中，4℃，7200rpm/min，离心2min，分别用IP高盐和低盐洗液洗涤3次，条件：4℃旋转孵育，5min/次，7200rpm/min，离心1min，真空吸泵抽取上清；最后一遍离心2min，尽量吸干净上清但避免吸到沉淀，放冰上备用；

(3)IgG 2aκ对照组孵育蛋白：将步骤(1)中的蛋白转移到步骤(2)中的EP管中，4℃，旋转孵育1h；4℃，7200rpm/min，离心2min，将上清小心转移到一新的1.5mL进口EP管中，沉淀先后用IP高盐和低盐洗液洗涤3遍，条件同步骤(2)；

4)IP实验组制备：将上一步中转移出来的上清加入IP抗体，即Tim-3(L3D)抗体，每组实验加25μg，4℃旋转孵育过夜，第二天加入200μL Protein A/GAgarose，孵育3h后先后用IP高盐和低盐洗液洗涤3次，条件同上；

(5)将步骤(3)和步骤(4)中洗涤后的沉淀中加入200μL 2×Loading Buffer，沸水煮10min，冰上冷却后于-20℃冰箱保存备用；

(6)进行SDS-PAGE凝胶分离蛋白，以及蛋白银染，选择与对照组泳道具有差异的条带区域进行质谱分析。

结果如图1A所示，利用转染Tim-3的293T细胞使用Tim-3抗体进行免疫共沉淀，挑选出与Tim-3相互作用的蛋白条带以备质谱分析。

通过HD-MS高分率串联质谱仪分析样品中的氨基酸序列，并通过与蛋白质库中的蛋白序列进行比对并打分，样品中氨基酸序列比对匹配蛋白库中蛋白序列越多，则筛选出的蛋白打分越高，越说明是目的蛋白。质谱分析发现，NF90的氨基酸肽段序列匹配最多，得分最高。其中，图1B显示的是与NF90匹配的序列信息。最终筛选出与Tim-3相互作用的胞内蛋白为NF90。本发明质谱分析以及质谱样品制备均由中国人民解放军军事医学科学院生物医学分析中心完成。

发明人进一步通过免疫共沉淀验证Tim-3与NF90互相作用蛋白。

将293T细胞转染全长的Tim-3-HA、NF90-Flag的质粒，同时转染全长的Tim-3-Myc、NF90-Flag，分别使用HA标签和Flag标签抗体沉淀Tim-3-HA和NF90-Flag蛋白，Westernblot分析结果，如图1C和1D所示，Tim-3与NF90互相作用蛋白。

将RAW264.7巨噬细胞系在VSV病毒感染刺激6h后收取蛋白，Tim-3抗体免疫沉淀Tim-3蛋白，检测内源NF90蛋白，证明内源Tim-3与NF90发生免疫共沉淀，进一步证明Tim-3与NF90在抗病毒感染免疫中存在联系，如图1E所示。

所述蛋白银染实验方法如下：

(1)固定：将250mL甲醇，25mL乙酸(冰醋酸)，225mL三蒸水混匀，将胶置于玻璃皿对胶上的蛋白进行固定，固定时间为20min；

(2)洗脱：将250mL甲醇溶于250mL三蒸水中，将胶上的固定液成分进行洗脱，时间为10min；

(3)水洗：甲醇溶液洗脱后使用三蒸水再次进行洗脱，使膜上的甲醇洗脱干净，利于下游的蛋白染色，时间为3h；

注：以下步骤避光

(4)敏化：预先称取0.1g硫代硫酸钠溶解于500mL三蒸水中，避光保存；将步骤(3)中水洗后的胶用硫代硫酸钠溶液进行敏化处理，使蛋白对银离子染色敏感，增强银染效果；

(5)水洗：用三蒸水洗胶2次，1min/次；

(6)银染：预先称取0.5g硝酸银固体，溶解于500mL三蒸水中，避光保存；将水洗后的胶用硝酸银溶液染色，染色时间为20min；

(7)水洗：同样使用三蒸水洗胶2次，1min/次；

(8)显色：量取100μL甲醛(现用现加)，称取5g无水碳酸钠，量取250mL三蒸水，三者充分混匀避光，将显色液加入玻璃皿中，开始计时并观察胶上条带显色的时间和染色强弱，大约显色5min后终止；

(9)终止：量取10mL乙酸，溶解于190mL三蒸水中，倒掉显色液后加入终止液以终止显色。

实施例2Tim-3促进VSV病毒的复制并抑制NF90的转录

本发明利用Tim-3稳定敲低(Tim-3-si)的RAW264.7细胞系模型来进行实验。

本发明所述敲低Tim-3的siRNA序列如下所示，序列合成由Biomics公司完成，对照siRNA(NC)由公司提供。

F:5'-AAAAGATGGTTATAAGGTTGAGG-3'，SEQ ID NO.19；

R:5'-AAAACCTCAACCTTATAACCATC-3'，SEQ ID NO.20；

首先，通过Western Blot验证Tim-3稳定敲低情况，如图2A所示。然后，将稳定敲低Tim-3细胞株Tim-3-si，对照组细胞株为Tim-3-Nc接种于12孔板中，8×10⁵/well，过夜培养后，吸出旧的培养基，PBS将细胞洗一遍，加入新的无血清DMEM培养基，然后，将VSV病毒(滴度1*10^{^10}/mL)稀释1万倍后感染细胞0-8h后，收集细胞，提取RNA并进行RT-PCR检测VSV、NF90基因水平的差异，内参使用18S。

结果显示，Tim-3敲低后，VSV病毒的复制水平明显降低，在感染的4-8h转录出现明显的差异(图2C)；同时检测发现NF90基因水平也出现明显差异，即Tim-3敲低后NF90转录水平明显上升(图2B)。而静息状态下，两组细胞间无差异，其可能原因是静息状态NF90结构处于自我抑制状态，病毒感染后NF90识别病毒信号导致结构域发生变化从而暴露其调控结构域，导致转录迅速激活转录水平上升；而8h也无差异可能与NF90在不同时间发挥不同调控作用有关，NF90调控基因转录发生在胞核，时间短，一旦转录结束NF90就通过出核信号携带编辑的基因出核，进入胞浆后在蛋白水平调控目的基因的转录后翻译以及翻译修饰功能，而病毒感染启动自身复制又是一个快速激活的过程。

上述结果说明Tim-3能够促进VSV病毒的感染，介导靶细胞的免疫耐受；同时Tim-3在VSV病毒感染刺激下能够抑制NF90基因的转录，进而提示Tim-3可能通过抑制NF90发挥耐受诱导功能。

进一步，本发明以全基因敲除Tim-3小鼠的腹腔巨噬细胞为研究模型，在VSV病毒刺激下，VSV病毒转录水平的差异。

本发明所述小鼠腹腔巨噬细胞的抽取及培养方法：将淀粉肉汤注射到C57BL/6小鼠下腹中，800μL/只，间隔24h注射第二次，四天后处死小鼠，超净台无菌操作，抽取Tim-3^-/-小鼠(基因敲除)和对照组小鼠Tim-3^+/+(野生型)腹腔灌洗液，将灌洗液离心换上加入双抗和10％FBS的RPIM640培养基冲洗一遍，离心后换上新的培养基并转移到100mm培养皿中，37℃恒温孵箱孵育4h，贴壁的即为小鼠腹腔巨噬细胞，PBS冲洗细胞2次，并将细胞刮起转移到离心管，培养基重悬计数后，以8*10^{^5}/well，铺于12孔板中，培养48h待95％细胞形态呈不规则梭形后加VSV病毒感染细胞2h、4h、8h，用PBS做对照；收取细胞，提取RNA并进行RT-PCR实验，进一步在体内实验验证了Tim-3能够促进VSV病毒的复制。

检测小鼠感染VSV后肺炎症浸润差异(非致死剂量)：取同窝体重相近6-8周龄的雄性Tim-3^-/-小鼠10只，平均分成两组，体重相似雄性野生对照小鼠Tim-3^+/+10只，平均分成2组，将病毒(滴度1*10^{^10}pfu/mL)稀释五倍后，将病毒注入小鼠下腹部腹腔，计量为800μL/只，实验组注射五只，另外五只注射PBS做对照。感染24h后取肺组织做HE染色，观察小鼠肺部炎症浸润程度差异。结果如图2D所示，在Tim-3^-/-小鼠的肺中观察到较少的炎症细胞浸润。

本发明中所述RT-PCR方法如下：

使用 Reagent提取细胞总RNA，First strand cDNA Synthesis Kit反转RNA为cDNA，最后使用UltraSYBR Mixture进行RT-PCR反应，严格参照说明书操作。所述RT-PCR所用的引物由上海生工公司设计合成，所述cDNA扩增引物序列如下：

18S：F:5’-TTGACGGAAGGGCACCACCAG-3’，SEQ ID NO.1；

R:5’-GCACCACCACCACGGAATCG-3’，SEQ ID NO.2。

mouseNF90：F:5’-CTGACCACAGCTGTACCACTT-3’，SEQ ID NO.3；

R:5’-GTCTGGAAATCAGTCTTGGCT-3’，SEQ ID NO.4。

humaNF90：F:5’-CACATGACCAGAACCTGTCGG-3’，SEQ ID NO.5；

R:5’-CACCAGCTCCAGATCCAAGTC-3’，SEQ ID NO.6。

VSV：F:5’-ACGGCGTACTTCCAGATGG-3’，SEQ ID NO.7；

R:5’-CTCGGTTCAAGATCCAGGT-3’，SEQ ID NO.8。

实施例3Tim-3抑制NF90蛋白的表达

在明确Tim-3对NF90基因转录水平的调控后，发明人继续对Tim-3是否影响NF90的蛋白水平进行了探究。

发明人通过构建稳定过表达Tim-3的Jurkat细胞株(Jurkat^Tim-3-high)进行相关实验。

通过流式细胞术验证Tim-3稳定过表达情况，如图3A所示。将Jurkat和Jurkat ^Tim ^-3-high细胞株通过PMA+PHA刺激活化后，采用Western Blot分别检测NF90蛋白水平的差异。

所述活化细胞株的条件参照文献如下：

《Pei Y,Zhu P,Dang Y,et al.Nuclear export of NF90to stabilize IL-2mRNAis mediated by AKT-dependent phosphorylation at Ser647in response toCD28costimulation[J].Journal ofImmunology,2008,180(1):222-229.》和《Zhu P,JiangW,Cao L,et al.IL-2mRNA stabilization upon PMA stimulation is dependent onNF90-Ser647phosphorylation by protein kinase CbetaI.[J].Journal ofImmunology,2010,185(9):5140-5149.》。

结果显示，Jurkat ^Tim-3-high细胞株在PMA+PHA刺激下，随着刺激时间的延长NF90蛋白呈现出逐渐降低的趋势，在刺激的3-12h下降趋势更明显(图3B)。结果表明Tim-3在蛋白水平抑制NF90的表达。

为了进一步证明Tim-3对NF90蛋白的抑制作用，发明人分别利用瞬转Tim-3质粒的293T细胞(图3C)以及Tim-3转基因(Tim-3-TG)小鼠的腹腔巨噬细胞(图3D)为模型，检测Tim-3对NF90蛋白水平的影响。结果发现过表达Tim-3后NF90蛋白水平下降。利用稳定敲低Tim-3的RAW264.7细胞株以及全基因敲除Tim-3(Tim-3-KO)小鼠的腹腔巨噬细胞作为研究模型，VSV分别感染8h和16h后蛋白裂解液收取细胞蛋白，Western Blot检测NF90蛋白水平的变化。

结果显示，在稳定敲低Tim-3的RAW264.7细胞株以及全基因敲除Tim-3小鼠的腹腔巨噬细胞中(图3H、3E)，在VSV病毒感染的状态下，NF90蛋白表达水平要高于对照组(图3F、I、G)。在野生小鼠腹腔巨噬细胞VSV感染体系中发现，在病毒刺激的0-16h内，Tim-3蛋白表达水平呈现先增多后下降的趋势(图3G)，这也进一步验证Tim-3在免疫活化状态下出现动态变化。

以上结果说明，在静息状态及VSV病毒感染状态下Tim-3都能够抑制NF90蛋白水平的表达，为进一步研究Tim-3抑制NF90抗病毒感染免疫的机制提供了重要的线索和依据。

本发明所述WesternBlot步骤如下：

收取细胞时，弃掉上清，PBS洗一遍细胞，加入预先配制好的蛋白裂解液，100μL/well，置于冰盒，摇床上震荡消化15-20min；将裂解液转移至1.5mL进口EP管中并置于冰上，12000rpm/min，离心15min；取一新的1.5mL进口EP管，将离心好的蛋白上清转移至新EP管里，并置于冰上；取2μL蛋白使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，向剩余蛋白中加入5×Loading Buffer并于沸水煮10min，冰上冷却后放-20℃保存。样品制备好以后进行SDS-PAGE凝胶分离蛋白，配胶及跑胶孵育抗体操作如下：

(1)分离胶配置：对于分子量在30-180kD之间的蛋白，配置浓度为10％的分离胶，灌胶至小胶板上沿1cm处，用双蒸水均匀地进行水封，分离胶凝固时间为40-60min为宜；

(2)浓缩胶配置：倒掉分离胶上层水，按比例加入浓缩胶各成分，充分混匀后加入胶板中，将提前准备好的梳子插入浓缩胶，避免产生气泡，凝固时间同分离胶；

(3)上样及电泳：蛋白样品从冰箱取出溶解后放于沸水煮3-5min并常温冷却，常温12000rpm/min，离心1min后方可上样，按照蛋白定量计算的值上样，一般上样20μg；加好样品和蛋白Marker后接通电源，浓缩胶条件为恒压80V；分离胶为恒压120V；

(4)转印：当指示带跑至距离胶板下方1cm左右位置时停止电泳开始转印：转印液提前放4℃预冷，PVDF膜大小按照长×宽＝8.5cm×5.5cm剪裁，电泳结束后预先放甲醇浸润，转印在冰盒内进行，转印条件：恒压60V，3h；

(5)封闭：转印结束后将PVDF膜先放入TBST洗液里讲膜上的甲醇洗涮干净后再转移到5％牛奶封闭液里进行封闭，时间1h，封闭液用TBST做溶剂；

(6)孵一抗：封闭结束后，开始孵育一抗，一抗按稀释比例预先加入到浓度为3％的BSA封闭液中，裁剪好膜并标记分子和Marker条带后将PVDF膜用一抗封闭到塑料膜中，将膜放入盒子中于旋转混合仪上，4℃温和旋转过夜孵育，BSA使用TBST溶解；

(7)洗膜：将膜取出放入TBST洗液中洗涤，5min/次，重复三次；

(8)孵二抗：用第一天封闭膜的牛奶按比例稀释二抗，将膜放入同种属来源的二抗中，常温孵育1h；同样用TBST洗液洗涤3次，时间相同；

(9)显影：膜洗涤完毕，使用显影仪显影，显影液为ECL显影液。

实施例4Tim-3促进NF90-K48链接的泛素化修饰

为了探究Tim-3对NF90转录后翻译及翻译后修饰的影响，发明人使用Tim-3-KO小鼠腹腔巨噬细胞作为研究模型，使用VSV病毒预先感染细胞2h后加入核糖体抑制剂CHX(10μg/mL)刺激8h后收取蛋白，采用Western Blot检测NF90蛋白翻译水平的差异。如图4A，与Tim-3-KO小鼠腹腔巨噬细胞相比，野生小鼠腹腔巨噬细胞随着CHX作用时间的延长，NF90的蛋白水平明显降低，说明Tim-3抑制NF90蛋白合成，提示NF90可能存在翻译后修饰，Tim-3可能参与了NF90的降解。

为了证明Tim-3是否促进了NF90的泛素化降解，本发明分别以Tim-3过表达体系以及Tim-3-TG转基因小鼠腹腔巨噬细胞感染VSV为研究模型对NF90的泛素化修饰进行研究。

发明人将WT-NF90-Flag质粒，K48-Ub-HA质粒，以及WT-Tim-3全长质粒转入293T细胞中，转染24h后加入MG132(20μg/mL)阻断蛋白酶体功能，12h后使用RIPA强裂解液裂解细胞收取蛋白并使用Flag(M2，Sigma)标签抗体做免疫沉淀，HA标签抗体检测NF90-Ub-K48泛素化修饰水平。结果如图4B，Input结果显示质粒成功转染进入细胞，免疫印迹(ImmunoBlot，IB)结果显示NF90存在泛素化修饰，并且Tim-3能够促进NF90的泛素化修饰；另外，在Tim-3-TG转基因小鼠腹腔巨噬细胞中，提前8h加入MG132后再用VSV刺激4h后使用相同的RIPA裂解液收取蛋白，免疫沉淀抗体使用抗NF90的抗体沉淀NF90蛋白后，相同浓度胶上样免疫沉淀的样品和Input组样品。IB分别使用抗Ubiquitin(泛素)和抗K48-Ubiquitin的抗体检测NF90是否存在泛素化修饰以及不同组间泛素化修饰的差异。结果如图4C，与野生小鼠腹腔巨噬细胞结果相比，转基因组小鼠泛素化修饰增强，并且病毒感染刺激后泛素化修饰程度进一步增强，与体外过表达体系结果一致。

本发明中免疫沉淀与免疫共沉淀的区别在于使用的是强RIPA裂解液，蛋白裂解后先用物理超声法打断分子间非特异性结合，然后再进行后面的操作，同时显影时蛋白翻译后修饰(泛素化)的条带是一条黑柱子而非单个条带，出现黑柱子条带是因为蛋白翻译后修饰带上泛素分子，而蛋白的泛素化修饰水平又有所差异，导致不同的蛋白结合的泛素分子出现差异，因此导致条带从上到下是一条黑柱子而不是单个条带。

通过以上实验发明人发现了NF90的一种新的翻译后修饰功能即泛素化修饰，并证明其在病毒感染免疫中的修饰形式为经典的泛素-蛋白酶体降解途径，也就是常见的Ub-K48修饰形式。同时实验也发现Tim-3能够促进NF90-Ub-K48泛素化修饰从而使得NF90蛋白水平降低。

实施例5Tim-3调控NF90泛素化相互作用位点的鉴定

本发明对NF90发生泛素化修饰的分子机制进一步进行探究。

首先，发明人分析了NF90的氨基酸序列并对序列中的相关结构域进行了初步了解。如图5A，NF90的全长有706个氨基酸，N-端分别包括一个核输出信号(NES)和核定位信号(NLS)，以及一个锌指结构域(DZF-Domain)；其C-端包含两个双螺旋RNA结合区域(dsRBMD1，2)以及一个含四肽序列的NVKQ-结构和一个与RNA结合相关的结构域(RGG-Domain)。

发明人将NF90全长质粒WT-NF90-Flag、锌指结构域突变质粒NF90-DZF-Flag，缺失锌指结构域突变质粒NF90-ΔDZF-Flag，以及泛素质粒HA-Ub-K48，空质粒PcDNA3.1(+)转染293T细胞中；与实施例4中转染时间和加MG132时间相同，使用Flag标签抗体免疫沉淀蛋白，HA标签抗体检测发生泛素化的结构域，探究NF90发生泛素化修饰的结构域。结果如图5B，IP组显示NF90的泛素化修饰主要发生在DZF-Domain，至此本发明对NF90的泛素化修饰结构域进行了定位。

本发明进一步探讨Tim-3哪部分结构域与NF90的哪部分结构域发生免疫共沉淀，从而促进NF90的泛素化修饰最终使得NF90蛋白降解。

发明人将前期构建的WT-Tim-3全长质粒，双突变质粒Tim-3-Y265/272F质粒，缺失胞内段的Tim-3-ΔIC质粒与NF90全长质粒WT-NF90-Flag共转染；同时将NF90的全长质粒WT-NF90-Flag及突变体质粒NF90-DZF-Flag，与WT-Tim-3全长质粒共转染293T细胞，转染24h后RIPA弱裂解液裂解细胞，收取蛋白，两个实验都是用使用抗Flag标签抗体免疫沉淀NF90-Flag蛋白，10％浓度分离胶跑胶，IB检测两者的免疫共沉淀。结果显示，Tim-3胞内缺失的质粒不能与NF90发生免疫共沉淀；双突变的质粒依旧能与NF90免疫共沉淀(图5C)，说明Tim-3胞内段IC是抑制NF90蛋白功能的结构域，但Tim-3胞内段Y265、Y272两个酪氨酸位点的突变不足以发挥负调控NF90的功能，更精确的调控位点需要进一步进行研究。Tim-3能与NF90-DZF-Domain发生免疫共沉淀(图5D)。

发明人进一步研究Tim-3促进NF90-K48位泛素化修饰是否发生在DZF-Domain上？发明人将NF90全长质粒和突变体质粒DZF-Domain及NF90-ΔDZF-Flag分别转到293T细胞中，并将泛素K48质粒和Tim-3全长质粒一并转入细胞，对照组转染PcDNA3.1(+)空质粒，转染时间及加入MG132的量与上述实验相同，使用RIPA强裂解液收取蛋白，使用抗Flag标点的抗体免疫沉淀各实验组的NF90蛋白，IP组使用7％浓度的分离胶跑胶，IB分析Tim-3对NF90-K8位泛素化修饰的影响。结果如图5E所示，在验证质粒成功转染到细胞后，发明人分析了不同实验组的NF90-K48泛素修饰水平，发现Tim-3能够明显促进NF90-DZF结构域的泛素化水平。

本发明人对NF90泛素化修饰的结构域进行了确认，并且也初步明确Tim-3胞内段IC结构域能与NF90-DZF-Domain发生免疫共沉淀从而促进NF90-K48位点的泛素化修饰，进而导致NF90通过泛素-蛋白酶体途径降解，使得蛋白水平下降，以上实验结果为本发明继续研究NF90泛素化修饰更精密的分子机制提供了强有力的证据。

实施例6NF90泛素化修饰分子机制的初步探究

靶信号分子的泛素化修饰都是通过相应的E3连接酶将泛素分子转移至靶分子对应的赖氨酸残基上，进而使得信号分子的泛素化修饰启动发挥对靶细胞的免疫调控作用。

NF90能够发生泛素化修饰，那么Tim-3与NF90之间是否存在中间E3连接酶分子，Tim-3是否通过调控E3连接酶的功能进而导致了NF90的泛素化修饰呢？

发明人通过基因芯片检测稳定敲低Tim-3基因的RAW264.7细胞系，所述芯片检测由上海康成生物工程有限公司完成。通过分析芯片数据发现，与对照组细胞结果相比，在敲低Tim-3组中有二种上调的E3连接酶基因(图6A)，它们分别是：TRIM16，TRIM47。发明人使用实施例2中稳定敲低Tim-3的RAW264.7细胞系(Tim-3-si)作为细胞研究模型，使用VSV刺激细胞一定时间，收取细胞并提取总RNA进行RT-PCR检测细胞中TRIM16，TRIM47基因转录水平的差异。结果如图6C所示，TRIM16和TRIM47基因在敲低Tim-3组中明显下降，与芯片结果基本相符。利用实施例3中稳定高表达Tim-3的Jurkat细胞株(Jurkat^Tim-3-high)，使用PMA+PHA刺激细胞一定时间，同样检测了这二种基因的转录水平，结果如图6B所示，在活化刺激条件下二种基因在Tim-3高表达的细胞株中明显高表达，与敲低Tim-3的RAW64.7细胞株实验结果相同。所述PCR引物如下：

MouseTRIM16：F:5’-TCTTGGGGCCAGCAGAGTAA-3’，SEQ ID NO.9；

R:5’-CTCACAGTAGTTCACCATGCAG-3’，SEQ ID NO.10。

humanTRIM16：F:5’-CCAGGCCAATGTGATGCTCT-3’，SEQ ID NO.11；

R:5’-TCCATCTCGGCACTCCTGTA-3’，SEQ ID NO.12。

MouseTRIM47：F:5’-CAGAAACTCGGCTCAGAAGCA-3’，SEQ ID NO.13；

R:5’-ACGATGTAGGCAAACTTGAGGA-3’，SEQ ID NO.14。

HumanTRIM47：F:5’-GTCCAAAGTCCTGAGCGCC-3’，SEQ ID NO.15；

R:5’-GCTACGGCTGCACTCTTGAT-3’，SEQ ID NO.16。

因此，发明人怀疑这二种E3连接酶很可能是Tim-3-NF90-Ub-K48泛素化调节轴上的E3连接酶？发明人首先构建了带V5-标签的TRIM16、TRIM47全长质粒；并将V5-标签的TRIM16、TRIM47全长质粒，WT-NF90-Flag质粒，WT-Ub-HA质粒转染到293T细胞，对照组转染PcDNA3.1(+)空质粒，转染条件与实施例5中实验相同，MG132加入时间也相同，RIPA强裂解液裂解细胞收取蛋白，用抗Flag标签的抗体免疫沉淀NF90-Flag蛋白，7％分离胶跑IP组样品。结果如图6D、E所示，进一步验证NF90存在泛素化的基础上，TRIM16、TRIM47两组中，NF90的泛素化修饰增强，体现在第二、三道泛素HA-Ub条带比第一道粗(图6D)。

本实验通过生物信息学的分析和文献理论的支持对NF90泛素化修饰的分子机制进行了更深入的探究，通过RT-PCR和免疫沉淀技术手段初步认为TRIM16、TRIM47可能是调控NF90泛素化修饰的E3泛素连接酶。

实施例7Tim-3敲除后对小鼠具有保护作用

发明人通过Tim-3基因敲除(Tim-3^-/-)小鼠为研究模型，在VSV病毒感染小鼠后，检测小鼠存活率，从而证明Tim-3敲除后对小鼠具有保护作用。

取同窝体重相近6-8周龄的Tim-3^-/-小鼠10只，体重相似野生对照小鼠Tim-3^+/+10只，将病毒按照2*10^{^8}pfu/g的滴度一次性注入小鼠下腹部腹腔，然后将两组小鼠放于相同环境条件下饲养，给予小鼠相同的鼠粮和饮用水，追踪7天(144h)，每间隔12小时观察小鼠死亡情况，并记录小鼠死亡的时间，直到144h结束观察，并最终统计每组小鼠的死亡数量及死亡时间，GraphPadPrism 6软件分析两组小鼠死亡率差异。

结果显示，Tim-3^-/-小鼠对vsv感染的抵抗力也比较强，如图7所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 窦帅杰

<120> Tim-3与NF90的相互作用在预防或治疗病毒感染产品中的应用

<130> p18070

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgacggaag ggcaccacca g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcaccaccac cacggaatcg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgaccacag ctgtaccact t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtctggaaat cagtcttggc t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cacatgacca gaacctgtcg g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caccagctcc agatccaagt c 21

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acggcgtact tccagatgg 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctcggttcaa gatccaggt 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcttggggcc agcagagtaa 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctcacagtag ttcaccatgc ag 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccaggccaat gtgatgctct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tccatctcgg cactcctgta 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cagaaactcg gctcagaagc a 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acgatgtagg caaacttgag ga 22

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtccaaagtc ctgagcgcc 19

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gctacggctg cactcttgat 20

<210> 17

<211> 78

<212> PRT

<213> Tim-3-IC

<400> 17

Phe Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu

1 5 10 15

Ile Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala

20 25 30

Glu Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val

35 40 45

Tyr Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg

50 55 60

Gln Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro

65 70 75

<210> 18

<211> 374

<212> PRT

<213> NF90-DZF-Domain

<400> 18

Arg Ile Phe Val Asn Asp Asp Arg His Val Met Ala Lys His Ser Ser

1 5 10 15

Val Tyr Pro Thr Gln Glu Glu Leu Glu Ala Val Gln Asn Met Val Ser

20 25 30

His Thr Glu Arg Ala Leu Lys Ala Val Ser Asp Trp Ile Asp Glu Gln

35 40 45

Glu Lys Gly Ser Ser Glu Gln Ala Glu Ser Asp Asn Met Asp Val Pro

50 55 60

Pro Glu Asp Asp Ser Lys Glu Gly Ala Gly Glu Gln Lys Thr Glu His

65 70 75 80

Met Thr Arg Thr Leu Arg Gly Val Met Arg Val Gly Leu Val Ala Lys

85 90 95

Gly Leu Leu Leu Lys Gly Asp Leu Asp Leu Glu Leu Val Leu Leu Cys

100 105 110

Lys Glu Lys Pro Thr Thr Ala Leu Leu Asp Lys Val Ala Asp Asn Leu

115 120 125

Ala Ile Gln Leu Ala Ala Val Thr Glu Asp Lys Tyr Glu Ile Leu Gln

130 135 140

Ser Val Asp Asp Ala Ala Ile Val Ile Lys Asn Thr Lys Glu Pro Pro

145 150 155 160

Leu Ser Leu Thr Ile His Leu Thr Ser Pro Val Val Arg Glu Glu Met

165 170 175

Glu Lys Val Leu Ala Gly Glu Thr Leu Ser Val Asn Asp Pro Pro Asp

180 185 190

Val Leu Asp Arg Gln Lys Cys Leu Ala Ala Leu Ala Ser Leu Arg His

195 200 205

Ala Lys Trp Phe Gln Ala Arg Ala Asn Gly Leu Lys Ser Cys Val Ile

210 215 220

Val Ile Arg Val Leu Arg Asp Leu Cys Thr Arg Val Pro Thr Trp Gly

225 230 235 240

Pro Leu Arg Gly Trp Pro Leu Glu Leu Leu Cys Glu Lys Ser Ile Gly

245 250 255

Thr Ala Asn Arg Pro Met Gly Ala Gly Glu Ala Leu Arg Arg Val Leu

260 265 270

Glu Cys Leu Ala Ser Gly Ile Val Met Pro Asp Gly Ser Gly Ile Tyr

275 280 285

Asp Pro Cys Glu Lys Glu Ala Thr Asp Ala Ile Gly His Leu Asp Arg

290 295 300

Gln Gln Arg Glu Asp Ile Thr Gln Ser Ala Gln His Ala Leu Arg Leu

305 310 315 320

Ala Ala Phe Gly Gln Leu His Lys Val Leu Gly Met Asp Pro Leu Pro

325 330 335

Ser Lys Met Pro Lys Lys Pro Lys Asn Glu Asn Pro Val Asp Tyr Thr

340 345 350

Val Gln Ile Pro Pro Ser Thr Thr Tyr Ala Ile Thr Pro Met Lys Arg

355 360 365

Pro Met Glu Glu Asp Gly

370

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aaaagatggt tataaggttg agg 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aaaacctcaa ccttataacc atc 23

Claims

1.Tim-3和NF90基因或蛋白在制备检测、预防或治疗病毒感染性疾病产品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Tim-3蛋白与NF90蛋白相互作用；所述Tim-3能够促进病毒的复制；所述Tim-3通过抑制NF90基因和蛋白水平的表达，进而抑制NF90的抗病毒感染免疫应答。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述Tim-3能够促进NF90的泛素化修饰；所述NF90的泛素化修饰的形式为泛素-蛋白酶体降解途径。

4.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述NF90发生泛素化的结构域为DZF-Domain；所述Tim-3胞内段IC结构域通过与DZF-Domain结构域相互作用，从而促进NF90的泛素化使其蛋白降解，进而抑制NF90的抗病毒感染免疫应答。

5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述Tim-3通过E3泛素连接酶发挥重要调控作用促进NF90泛素化修饰；所述E3泛素连接酶为TRIM16，TRIM47。

6.如权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述病毒为单链RNA病毒，所述单链RNA病毒包括流感病毒、埃博拉病毒、SARS病毒、水疱性口炎病毒以及寨卡病毒。

7.一种Tim-3抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包括：Tim-3的抗体或其抗原的结合片段、Tim-3核酸的反义RNA、microRNA、siRNA、shRNA以及Tim-3的活性抑制剂。

8.Tim-3抑制剂在制备预防或治疗病毒感染药物中的应用，所述Tim-3抑制剂抑制Tim-3功能，促进NF90表达，从而NF90发挥抗病毒感染免疫作用。

9.一种表达外源的NF90或NF90-DZF-Domain结构域的载体的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗病毒感染的药物。

10.一种用于预防或治疗病毒感染的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有(i)药学上可接受的载体；(ii)Tim-3抑制剂，和/或表达外源的NF90或NF90-DZF-Domain结构域的载体；(iii)不同于组分(ii)的其他抗病毒活性成分。