ES2565498T3 - Inhibidores de aminotransferasa-1 de cadena ramificada (BCAT1) para el tratamiento de tumores cerebrales - Google Patents

Inhibidores de aminotransferasa-1 de cadena ramificada (BCAT1) para el tratamiento de tumores cerebrales Download PDF

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Abstract

Un compuesto capaz de reducir o inhibir (a) la actividad biológica de la aminotransferasa-1 de cadena ramificada (BCAT1) o (b) la expresión del gen que codifica BCAT1 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un tumor cerebral, en el que el tumor cerebral es un glioma o glioblastoma.

Description

DESCRIPCION
Inhibidores de aminotransferasa-1 de cadena ramificada (BCAT1) para el tratamiento de tumores cerebrales
La presente invention proporciona un compuesto capaz de reducir o inhibir (a) la actividad biologica de la aminotransferasa-1 de cadena ramificada (BCAT1) o (b) la expresion del gen que codifica BCAT1 para su uso en un 5 procedimiento de tratamiento de un tumor cerebral, en el que el tumor cerebral es un glioma o glioblastoma.
Los glioblastomas humanos malignos representan la mayona de los tumores cerebrales humanos malignos. Hasta ahora, el tratamiento de los gliomas incluye tecnicas neuroquirurgicas (resection o procedimientos estereotacticos), terapia de radiation y quimioterapia. El estandar de atencion actual para, por ejemplo, tumores astrodticos, implica reseccion quirurgica del tumor que puede ser seguida por quimioterapia con el agente alquilante oral Temozolamide (TMZ) y 10 radioterapia. Sin embargo, los glioblastomas se consideran como incurables, ya que no responden a la radiacion ionizante, la quimioterapia y la reseccion quirurgica. En otras palabras, con estas terapias solo pueden conseguirse una prolongation muy limitada de la esperanza de vida de los pacientes. Esto significa que, a pesar de estas terapias, el promedio de esperanza de vida despues del diagnostico de cancer es solamente de entre 12 y 16 meses. Sin embargo, algunos avances en la terapia para el glioblastoma han sido descritos por Jennifer Clarke et al. (Arch. Neurol. 2010, 67 15 (3), p. 279-283).
De esta manera, el problema tecnico subyacente en la presente invencion es el de proporcionar medios para la terapia de tumores cerebrales, glioblastomas o gliomas, que superen las desventajas de las terapias actuales y mejoren la supervivencia de los pacientes.
La solucion de dicho problema tecnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las 20 reivindicaciones.
Durante los experimentos que han dado lugar a la presente invencion se encontro que los inhibidores de BACT1 conocidos, tales como la gabapentina, que han sido usados hasta ahora por ejemplo como farmacos anticonvulsivos, representan una novedosa option de tratamiento para la terapia contra el cancer, es decir, una terapia eficaz para neoplasias en general y para el tratamiento de los tumores cerebrales, tales como tumores cerebrales astrocfticos, en 25 particular. Potencialmente, actuan apuntando una ruta molecular que no es blanco de ninguna quimioterapia establecida.
Breve descripcion de las figuras
Figura 1: Los gliomas astrocfticos IDHw se caracterizan por una alta expresion de BCAT1.
(a) Representation esquematica del catabolismo BCAA. BCAAs, aminoacidos de cadena ramificada. BCKAs, cetoacidos de cadena ramificada. (b, c) Expresion de ARN de BCAT1 (b) y BCAT2 (c) en 70 gliomas astrocfticos (41 IDHwt y 29 30 IDHmut) normalizada a la expresion en un cerebro normal (lmea discontinua). Los datos se expresan como media ± s. d.
(test t de Student de dos colas). *, P < 0,05; *** P < 0,001. (d) Transferencia Western que muestra la expresion de la protema BCAT1 en gliomas astrocfticos con genes IDH1 e IDH2 de tipo salvaje (carriles 1-5), diferentes mutaciones en los genes IDH2 (carriles 6-7) o TDH1 (carriles 8-12), y un cerebro normal (carril 13). AII, astrocitoma difuso grado OMS II; AAIII, astrocitoma anaplasico grado OMS III; sGBIV, glioblastoma secundario grado OMS IV; pGBIV, glioblastoma 35 primario grado OMS IV; AOIII, oligodendroglioma anaplasico grado OMS III. (e-h) tinciones inmunohistoqmmicas de BCAT1 en un glioblastoma IDHwt primario (e), un glioblastoma primario con mutation IDH1-R132H (f), un astrocitoma difuso con mutacion IDH1-R132C (g), y un oligodendroglioma anaplasico con mutacion IDH2-R172K (h). (i, j) Tincion inmunohistoqmmica de IDH1-R132H en los mismos tumores que en los paneles b y c, respectivamente, que demuestra la complementariedad de la tincion BCAT1 e IDH1-R132H. Barras de escala: 50 pm. (k) Tabla de dos por dos que muestra 40 la correlation significativa de la expresion de la protema BCAT1 y el estado de mutacion de los genes IDH1 e IDH2 en 81 gliomas (p < 0,0001; test exacto de Fisher).
Figura 2: BCAT1 muestra una expresion dependiente de sustrato en lineas celulares de glioblastoma.
(a) Transferencia Western que muestra la expresion de protema BCAT1 en lmeas celulares de glioma IDHwt. (b-d) Efectos de hipoxia y alfa-KG sobre la expresion de BCAT1. Las expresiones de ARN y de protema se muestran en la parte inferior 45 y la parte superior de cada panel. Los numeros sobre las transferencias Western indican las relaciones de multiplication de la expresion con relation a las celulas control. Los valores de expresion de ARNm representan la media ± s. d. de muestras triplicadas. (b) BCAT1 esta regulada positivamente bajo condiciones hipoxicas (1% O2). (c) La expresion de BCAT1 es inducida por la suplementacion del medio de cultivo con dimetil-alfa KG permeable a las celulas. (d) El silenciamiento genico por dos ARNhcs diferentes del IDH1 citoplasmatico productor de alfa-KG conduce a regulacion 50 negativa de la expresion de BCAT1.
Figura 3: Los niveles de expresion de los tres transcritos de BCAT1 estan asociados con una diferencia de metilacion de dos promotores alternativos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
(a) Dibujo esquematico de los exones 1 a 4 de BCATIque muestra la estructura exon de los tres transcritos T1, T4 y T6. Los dos promotores 1 y 2 alternativos se muestran en las secciones ampliadas en la parte inferior izquierda y la parte inferior derecha, respectivamente. (b) Cuantificacion qRT-PCR de la expresion de ARN de los transcritos T1, T4 y T6 en gliomas astrodticos y un conjunto de ARN a partir de tejidos cerebrales normales (n = 23). Los valores representan la media ± s. d. de muestras triplicadas. (c) Los patrones de metilacion de ADN detectados en los promotores 1 (izquierda) y 2 (derecha) mediante analisis MassArray de amplicones A1 a A8 tratados con bisulfito-PCR en el cerebro normal y gliomas astrocfticos grado OMS II-IV. *, astrocitoma anaplasico IDHwt. (d-f), Grado de metilacion del ADN en el cerebro normal (Nbr), tumores IDHw y IDHmut en (d) promedio de todos los CpG en el promotor 2 (prueba t de Student de dos colas, p < 0,0001) (e) CpG4,5 (P = 0,0003) y (f) CpG6 en el promotor 1 (p < 0,0001). (g) Correlacion del grado de metilacion de CpG6 y la expresion de BCAT1 T1. (h, i) El silenciamiento genico de HEY1 en celulas HEK293T (h) resulta en la regulacion positiva de la expresion de BCAT1 (i). Los valores representan la media ± s. d. (n = 3). (j, k) Ensayos ChIP que muestran la union preferente de HEY1 a DMR (amplicon c1) en comparacion con los amplicones de control en el promotor 1 (c2), aproximadamente 5 kb aguas arriba de BCAT1, y controles positivo (BHLH15) y negativo (PTPRD) no relacionados. (j) Constructo Flag-HEY1. (k) Constructo HEY1-Flag. La qRT-PCR se realizo por triplicado y las relaciones union a entrada se muestran como promedio ± s. d.
Figura 4: La supresion de BCAT1 reduce la liberacion de glutamato por las celulas de glioma y afecta a las concentraciones de acidos grasos de la membrana.
(a, b) Espectros de RMN de celulas U-87MG (a) y U-373MG (b) despues del tratamiento con control (-) o gabapentina 20 mM (+) durante 20 horas. Los espectros de diferencia se muestran en la parte superior de los paneles. Tras un tratamiento inhibidor, los niveles de valina (Val), leucina (Leu) e isoleucina (Ile) aumentaron en factores 1,09, 1,38, 1,19, respectivamente, en las celulas U-87MG y en factores de 1,83, 2,18% y 2,32, respectivamente, en celulas U- 373MG. (c) Liberacion de glutamato por las celulas de glioma a las 6 y 12 horas despues del inicio del tratamiento con control (-) o con inhibicion de BCAT1 (+) por gabapentina 20 mM (n = 3). (d) Analisis tandem-MS de las concentraciones de aminoacidos en medios de cultivo de celulas U-87MG con silenciamiento genico BCAT1 y control 8 dfas despues de la transduccion lentiviral. Los valores se muestran como la diferencia con las concentraciones de partida de los medios. Los valores positivos y negativos indican la liberacion y la absorcion de aminoacidos, respectivamente (n = 6). (e) Concentraciones de aminoacidos intracelulares de las mismas celulas que en (d) (n = 6). (f) Transferencia Western que muestra la regulacion negativa de HADH tras el silenciamiento BCAT1. (g) Agotamiento relativo de colesterol y acidos grasos de cadena muy larga en celulas U-87MG con silenciamiento genico BCAT1 vs. control (n = 3). Los datos se expresan como promedio ± s. d. *, P < 0,05; **, P <0,01; *** P < 0,001.
Figura 5: El silenciamiento genico BCAT1 limita el potencial de invasion de celulas de glioblastoma.
(a, b) marcado de inmunofluorescencia de alfa-tubulina en celulas U-87MG de control (a) y silenciamiento genico BCAT1
(b) . azul: DAPI; barra de escala: 50 pm. (c) Imagenes secuenciales que muestran la permeacion de una celula U-87MG a traves de un microcanal de 5x11x300 pm durante un penodo de 9 horas; barra de escala: 50 pm. (d) El silenciamiento BCAT1 inhibe significativamente el potencial de invasion de las celulas U-87MG en comparacion con las celulas transducidas con ARNhc, no objetivo. Los resultados indican el promedio ± s. d. de tres experimentos independientes. P = 0,0146.
Figura 6: BCAT1 es esencial para la progresion del glioblastoma.
(a-d) Analisis de proliferacion celular y de ciclo celular de las celulas de glioma tras supresion BCAT1. La proliferacion de celulas se examino usando el ensayo de proliferacion de celulas de Click-iT® EdU. El analisis de ciclo celular se llevo a cabo despues de la tincion del ADN con yoduro de propidio. La distribucion del ADN se muestra para las celulas vivas. Los valores en los graficos representan el promedio ± s. d. para n = 3. nt, ARNhc no objetivo. *, P < 0,05; **, P < 0,01; *** P < 0,001; en comparacion con los controles respectivos. (a) El tratamiento con el inhibidor de gabapentina BCAT1 durante 20 horas suprimio la proliferacion de lmeas celulares de glioma de una manera dependiente de la concentracion con relacion a las celulas de control tratadas solo con disolvente. (b) El analisis del ciclo celular de las celulas de glioma tratadas con gabapentina mostro una acumulacion de celulas en fase G1. (c) El silenciamiento de BCAT1 causo una reduccion significativa de la proliferacion celular con relacion a las muestras tratadas con ARNhc (nt) no objetivo en las tres lmeas celulares de glioma y (d) resulto en la acumulacion del marcador de detencion G1 CDKN1B/p27KIP1. El analisis del ciclo celular mostro aumentos significativos de la proporcion de celulas en la fase G1. (e) El silenciamiento BCAT1 resulta en una menor fosforilacion de AKT. (f-i) Secciones transversales de los tumores inducidos por inyeccion intracraneal de celulas de glioblastoma U-87MG en ratones atfmicos CD-1. Se muestra la tincion de hematoxilina-eosina para ratones inyectados con (f) ARNhc no objetivo de control o (g) BCAT1-ARNhc. (h) Cuantificacion de los volumenes tumorales (n = 5 ratones para cada grupo, P = 0,0091).
Fig. 7: Transcritos BCAT1.
(a) Estructura genica de BCAT1 que muestra 11 exones y los tres transcritos T1 (ENST00000261192), T4
5
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15
20
25
30
35
40
45
50
(ENST00000539282) y T6 (ENST00000538118) que se originan en dos promotores diferentes. Las regiones alrededor de los sitios de inicio de transcripcion (SST) y el exon 5 estan ampliadas para mostrar las ubicaciones de los cebadores. (b) Imagen en gel de agarosa de los productos de PCR amplificados a partir de un glioblastoma IDHw (izquierda) y una coleccion de ARNs de cerebro normal de 23 individuos (derecha) usando el cebador inverso y los cebadores de exon 1 espedficos de transcrito. Los tamanos de las bandas coinciden con los tamanos esperados de los ARNm empalmados respectivos.
Fig. 8: Analisis de transferencia Western
Analisis Western de la protema total y fosforilada de la RPS6K objetivo mTOR en (a) tratamiento con gabapentina y (b) silenciamiento BCAT1 en las lmeas celulares U-87MG, U-373MG y Hs683.
Fig. 9: Silenciamiento BCAT1
El silenciamiento BCAT1 causa la apoptosis en un cultivo primario de esferoides de glioblastoma. (a) Reduccion de la proliferacion inducida por transduccion lentiviral de dos constructos ARNhc (n = 3, *** P < 0,0001). (b) Analisis del ciclo celular que muestra un fuerte aumento de la fraccion subG1 despues del silenciamiento BCAT1 (n = 3). LA transferencia Western en la parte superior muestra la mayor presencia del marcador CDKN1B de detencion G1 en las celulas silenciadas. (c) Ensayo AnnexinV/7AAD que confirma la muerte apoptotica de las celulas esferoides con silenciamiento BCAT1.
Figura 10: Ensayo Click-iT EdU despues de tratamiento con gabapentina 5 mM durante 23 h Vease el Ejemplo 2 para los detalles experimentales.
Figura 11: Ensayo Click-iT EdU despues de silenciamiento mediado por ARNhc Vease el ejemplo 3 para los detalles experimentales
De esta manera, la presente invention se refiere a un compuesto capaz de reducir o inhibir (a) la actividad biologica de aminotransferasa-1 de cadena ramificada (BCAT1) o (b) la expresion del gen que codifica BCAT1 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un tumor cerebral, en el que el tumor cerebral es un glioma o glioblastoma.
Los tumores cerebrales a ser tratados segun la presente invencion son aquellos que (sobre)expresan BCAT1, es decir, glioma o glioblastoma, en particular, aquellos que expresan IDH1 de tipo salvaje.
Los aminoacidos de cadena ramificada (BCAA) valina, leucina e isoleucina son aminoacidos esenciales que escapan al catabolismo hepatico y estan disponibles en la circulation general. El metabolismo BCAA proporciona un importante sistema de transporte para mover nitrogeno a traves del cuerpo para la smtesis de aminoacidos no esenciales, incluyendo el neurotransmisor glutamato en el sistema nervioso central. La desregulacion de las vfas catabolicas BCAA resulta frecuentemente en una disfuncion neuronal. La primera etapa del catabolismo BCCA implica la transferencia del grupo alfa-amino al alfa-cetoglutarato (alfa-KG) por la transaminasa citosolica de aminoacidos de cadena ramificada 1 (BCAT1) o las isoenzimas BCAT2 mitocondriales con glutamato y el respectivo cetoacido de cadena ramificada (BCKA) como productos (Ichihara et al., J. Biochem. 59, pp. 160-169, (1966); Taylor et al., J. Biol. Chem. 241, pp. 4.396-4.405, (1966)). La expresion de BCAT2 es ubicua, mientras que la expresion de BCAT1 esta limitada a un pequeno numero de tejidos, incluyendo cerebro, donde los BCAAs son una fuente importante de nitrogeno para la smtesis del neurotransmisor glutamato. Despues de la transamination, los BCKAs son catabolizados adicionalmente a acetil-CoA y succinil-CoA, que entran en el ciclo del acido tricarboxflico (TCA) (Fig. 1a). NADH y FADH2, que se generan como un subproducto del catabolismo BCKA, se usan para transferir equivalentes reductores al complejo III de la cadena respiratoria para la production de ATP.
Las mutaciones en IDH1 (isocitrato deshidrogenasa 1), detectadas originalmente en una fraccion de glioblastomas, estan presentes en la gran mayona de los gliomas de grado II y III de la Organization Mundial de la Salud (OMS) y glioblastomas secundarios, pero son raras en los glioblastomas primarios (Balss et al., Acta Neuropath. 116, pp. 597-602 (2008)). Tambien se han detectado mutaciones en IDH2, aunque con una menor frecuencia del 5-10% (Balss, Balss et al., Acta Neuropath. 116, pp. 597-602 (2008); Yan et al., N. Eng. J. Med. 360, pp. 765-773 (2009)). Las mutaciones IDH desempenan un papel central en la patogenesis del glioma (Parsons et al, Science 321, pp. 1807-1812 (2008)) y se ha demostrado que constituyen un clasificador clave que distingue dos subgrupos principales de glioma que se identificaron inicialmente en base a la expresion del ARN y los patrones de metilacion del ADN. Se ha revelado que los tumores cerebrales que muestran una mutation IDH1 (IDHmut) tienen un mejor pronostico que aquellos en los que IDH1 no esta mutado (IDHwt) (Hartmann et al., Acta Neuropathol. 120, pp. 707-718 (2010)).
Se ha comprobado que una diferencia entre los tumores cerebrales con IDHmut (que tiene la mutacion IDH1-R132H) e IDHwt es que la sobreexpresion de BCAT1 es una caractenstica altamente espedfica de los glioblastomas IDHwt, el tumor
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de cerebro adulto mas comun y mas agresivo. La metilacion espedfica observada del promotor 2 de BCAT12 en tumores IDHmut, pero no en tumores IDH" y el cerebro normal muestra claramente que la baja expresion de BCAT1 en tumores IDHmut es una consecuencia de la metilacion del ADN asociada a la mutacion IDH1, que se cree que esta mediada mediante la inhibicion de las histonas desmetilasas y la familia TET de las 5-metilcitosina hidroxilasas por el producto de enzimas IDH1 y IDH2 mutantes, el oncometabolito 2-hidroxiglutarato. Curiosamente, la regulacion de la expresion de ARNm de BCAT1 originado en el promotor 1 parece conseguirse por medio de un mecanismo epigenetico independiente de IDH, a traves de la metilacion de un sitio de union para el represor transcripcional HEY1 en los tumores IDH" pero no en los tumores IDHmut. Estos patrones de metilacion del ADN diametralmente opuestos en los dos promotores dejan claro que la supresion de BCATIno se produce como un mero subproducto de una mutacion IDH1 por medio de metilacion "passenger", sino mas bien que la regulacion diferencial del metabolismo celular en los tumores IDH"1 y IDHmut requiere un control estricto de la expresion de BCAT1 en cada grupo.
De manera similar a la tincion IDH1-R132H diagnostica usada comunmente, la tincion BCAT1 puede ayudar a distinguir entre gliomas IDH"1 y gliomas IDHmut; sin embargo, la tincion BCAT1 ofrece la ventaja anadida de distinguir tambien un glioblastoma IDH"1 primario de cerca del 10% de los astrocitomas IDHmut con mutaciones no IDH1-R132H. De manera mas importante, la presente invention muestra que los metabolismos BCAT1 y BCAA proporcionan la base para el desarrollo de nuevos enfoques basados en el metabolismo en la terapia de glioma.
Esto significa que la supresion de BCAT1 en los glioblastomas IDH"1 tiene el potencial de obstaculizar de manera significativa el crecimiento del tumor, asf como la excretion de glutamato por las celulas tumorales, lo que causa frecuentemente neurotoxicidad al tejido cerebral circundante y conduce a epilepsia asociada a tumor en pacientes con tumores cerebrales.
Ademas, los datos de la presente invencion muestran que la disponibilidad de grandes cantidades de glucosa y glutamina, los dos nutrientes considerados como los mas importantes para apoyar el crecimiento celular maligno, no es suficiente para apoyar un crecimiento rapido sostenido del glioblastoma IDH"1.
En otras palabras, en la presente invencion se ha demostrado que la sobreexpresion de BCAT1 es un rasgo altamente caractenstico del glioblastoma, en particular del glioblastoma IDH"1, y esencial para su comportamiento clmico agresivo. De esta manera, la expresion de BCAT1 y el catabolismo de BCCA son marcadores prometedores para la evaluation diagnostica y pronostica de gliomas y sirven como nuevas dianas terapeuticas. Ademas, la presente invencion representa el primer ejemplo de silenciamiento de un gen metabolico que es central para el mecanismo patogeno del glioma por la metilacion del ADN aberrante asociada a la mutacion IDH1. El silenciamiento de BCAT1 al inicio del desarrollo de tumores prevendra que los gliomas IDHmut utilicen los BCAAs como un recurso metabolico y ofrece una explication para el comportamiento del menor crecimiento maligno de los gliomas IDHmut con relation a los glioblastomas IDH"1 dependientes de BCAT1.
La reduction, silenciamiento o inhibicion de la actividad biologica puede realizarse mediante interaction o union directa de un compuesto a BCAT1 o mediante interaccion indirecta, por ejemplo, mediante interaccion con un compuesto que esta asociado con la actividad biologica de BCAT1. La reduccion o inhibicion de la actividad biologica puede conseguirse tambien mediante la aplicacion de formas alteradas, por ejemplo, inactivas, de BCAT1, preferentemente en exceso.
Los ejemplos de compuestos adecuados que reducen, silencian o inhiben la actividad biologica de BCAT1 o la expresion del gen que codifica BCAT1 con el objetivo de obtener un efecto terapeutico son:
(a) plasmidos, vectores o virus naturales/sinteticos/mutados, oligonucleotidos de diversos tipos de modification (por ejemplo, PTO, LNA, 2'F-ANA, complejos protema-nucleotido, ARNi, ARNip, micromiARN, ARNhc, Metilmetoxi-, fosforamidatos, PNA, Morfolino, Fosforamidato, Ciclohexeno (CeNA), gap-meros, ribozimas, aptameros, CpG- oligos, ADNzimas, interruptores ribosomicos o lfpidos o moleculas que contienen lfpidos;
(b) peptidos, complejos de peptidos, incluyendo todos los tipos de enlazadores,
(c) moleculas pequenas;
(d) anticuerpos y sus derivados, especialmente quimeras, fragmentos Fab, fragmentos Fc, o
(e) vehfculos, liposomas, nanopartfculas, complejos, o cualquier otro sistema de suministro que contiene los constructos nombrados anteriormente,
(f) agentes oxidantes o agentes modificadores de sulfhidrilo (grupos SH).
Otros compuestos adecuados para los propositos de la presente invencion y los procedimientos para identificar/seleccionar dichos compuestos se describen mas detalladamente a continuacion.
Preferentemente, en una composicion farmaceutica, dichos compuestos descritos anteriormente se combinan con un
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vehmulo farmaceuticamente aceptable. "Farmaceuticamente aceptable" pretende abarcar cualquier vehmulo que no interfiera con la eficacia de la actividad biologica del ingrediente activo y que no sea toxico para el huesped al que se administra. Los ejemplos de vehmulos farmaceuticos adecuados son bien conocidos en la tecnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones esteriles etc. Dichos vehmulos pueden ser formulados mediante procedimientos convencionales y el compuesto activo puede ser administrado al sujeto a una dosis eficaz.
Una "dosis efectiva" se refiere a una cantidad del ingrediente activo que es suficiente para afectar al curso y a la gravedad de los tumores cerebrales a tratar indicados anteriormente, que conduce a la reduccion o remision de dicha patologfa. Una "dosis efectiva" util para el tratamiento y/o la prevencion de gliomas o glioblastomas puede ser determinada usando procedimientos conocidos para una persona con conocimientos en la materia (vease, por ejemplo, Fingl et al., The Pharmocological Basis of Therapeutics, Goodman y Gilman, eds. Macmillan Publishing Co., Nueva York, pp. 1-46 ((1975)).
La administracion de las composiciones adecuadas puede efectuarse de diferentes maneras, por ejemplo, mediante administracion intravenosa, intraperitoneal, subcutanea, intramuscular, topica o intradermica. Por supuesto, la via de administracion depende del tipo de terapia y el tipo de compuesto contenido en la composicion farmaceutica. El regimen de dosificacion sera determinado por el medico encargado y otros factores clmicos. Tal como se conoce bien en las tecnicas medicas, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamano del paciente, la zona de la superficie corporal, la edad, el sexo, el compuesto particular a ser administrado, el tiempo y la via de administracion, el tipo de terapia, la salud general y otros farmacos que se administran al mismo tiempo.
La persona con conocimientos en la materia puede identificar facilmente o generar compuestos utiles para los tratamientos de la presente invencion en base al conocimiento de la secuencia de aminoacidos de BCAT1, y la secuencia de nucleotidos del gen que codifica esta protema. Las secuencias respectivas se encuentran en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot (P54687; BCAT1_HUMAN), en Genbank (secuencia de referencia NCBI: NM_005504) y la base de datos Human Genome Organization Gene Nomenclature Committee (HGNC) (HGNC ID: 976).
En una realization preferente adicional de la presente invencion, el compuesto util para reducir o inhibir la expresion del gen que codifica BCAT1 es un oligonucleotido antisentido, ARNhc o ARNip espedfico para BCAT1. Preferentemente, el compuesto util para silenciar la expresion de BCAT1 son constructos de ARNhc independientes Mission® dirigidos a diferentes regiones de transcritos de ARNm de BCAT1 humana (BCAT1 shRNAI NM_005504.3-1064s1c1 y BCAT1 shRNAII NM_005504.3-751s1c1) y de IDH1 humano (IDH1 shRNAI NM_005896.2-1363s1c1 e IDH1 shRNAII NM_005896.2-292s1c1).
La generacion de oligonucleotidos antisentido adecuados incluye la determinacion de un sitio o sitios dentro del gen que codifica BCAT1 para que se produzca la interaction antisentido de manera que resulte el efecto deseado, por ejemplo, la inhibition de la expresion de la protema. Un sitio intragenico preferente es (a) la region que abarca el codon de inicio o de termination de la traduction del marco de lectura abierto (ORF) del gen o (b) una region del ARNm que es un "bucle" o "bulto", es decir, que no es parte de una estructura secundaria. Si se han identificado uno o mas sitios diana, se eligen oligonucleotidos que son suficientemente complementarios con relation a la diana, es decir, que se hibridan suficientemente bien y con suficiente especificidad, para dar el efecto deseado. En el contexto de la presente invencion, "hibridacion" significa union mediante enlace de hidrogeno, que puede ser una union mediante en lace de hidrogeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertida, entre las bases nucleosidas o nucleotidas complementarias. "Complementario", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la capacidad de emparejamiento preciso entre dos nucleotidos. Por ejemplo, si un nucleotido en una position determinada de un oligonucleotido es capaz de formar enlaces de hidrogeno con un nucleotido en la misma posicion de una molecula de ADN o ARN, entonces el oligonucleotido y el ADN o ARN se consideran complementarios entre sf en esa posicion. El oligonucleotido y el ADN o ARN son complementarios entre sf cuando un numero suficiente de posiciones correspondientes en cada molecula estan ocupadas por nucleotidos que pueden formar enlaces de hidrogeno entre sf. De esta manera, "hibridable espeaficamente" y "complementario" son terminos que se usan para indicar un grado suficiente de complementariedad o emparejamiento preciso de manera que se produzca una union estable y especfica entre el oligonucleotido y el ADN o ARN diana. En la tecnica se entiende que no es necesario que la secuencia de un compuesto antisentido sea 100% complementaria a la de su acido nucleico diana para ser hibridable espedficamente. Un compuesto antisentido es hibridable espedficamente cuando la union del compuesto a la molecula de ADN o ARN diana interfiere con la funcion normal del ADN o ARN diana para causar una perdida de utilidad, y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la union no espedfica del compuesto antisentido a secuencias no diana en las condiciones en las que se desea la union especfica, es decir, en el caso de tratamiento terapeutico.
La persona con conocimientos en la materia puede generar compuestos antisentido y ARNips o ARNhcs segun la presente invencion en base a la secuencia de ADN conocida para BCAT1.
"Oligonucleotido" se refiere a un oligomero o polfmero de acido ribonucleico (ARN) o acido desoxirribonucleico (ADN) o
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mimeticos de los mismos. Este termino incluye oligonucleotidos compuestos de nucleobases de origen natural, azucares y enlaces internudeos^dicos (cadena principal) covalentes, as^ como oligonucleotidos que tienen partes que no son de origen natural que funcionan de manera similar. Dichos oligonucleotidos modificados o sustituidos son frecuentemente preferentes con respecto a las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, una mejor captacion celular, una mayor afinidad para el acido nucleico diana y una mayor estabilidad en presencia de nucleasas. Aunque los oligonucleotidos antisentido son una forma preferente del compuesto antisentido, la presente invencion abarca otros compuestos oligomericos antisentido, incluyendo pero sin limitarse a mimeticos de oligonucleotidos, tales como los descritos mas adelante. Los compuestos antisentido segun la presente invencion comprenden de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleobases (es decir, de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleosidos enlazados). Los compuestos antisentido particularmente preferentes son oligonucleotidos antisentido, incluso mas preferentemente aquellos que comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nucleobases. Los compuestos antisentido incluyen ribozimas, secuencias grna externas (EGS), oligonucleotidos (oligozimas), y otros ARNs catalfticos cortos u oligonucleotidos catalfticos que se hibridan con el acido nucleico diana e inhiben su expresion.
De manera alternativa, el compuesto de la invencion es un vector que permite transcribir un oligonucleotido antisentido de la invencion, por ejemplo, en un huesped mairftfero. Preferentemente, dicho vector es un vector util para terapia genica. Los vectores preferentes utiles para terapia genica son vectores virales, por ejemplo, adenovirus, virus del herpes, vaccinia o, mas preferentemente, un virus de ARN tal como un retrovirus. Incluso mas preferentemente, el vector retroviral es un derivado de un retrovirus murino o aviar. Los ejemplos de dichos vectores retrovirales que pueden ser usados en la presente invencion son: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus de tumor mamario murino (MuMTV) y virus del sarcoma de Rous (RSV). Mas preferentemente, se emplea un vector retroviral de primate no humano, tal como el virus de la leucemia del mono gibon (GaLV), que proporciona una gama de huespedes mas amplia en comparacion con los vectores murinos. Debido a que los retrovirus recombinantes son defectuosos, se requiere asistencia con el fin de producir partfculas infecciosas. Dicha asistencia puede ser proporcionada, por ejemplo, mediante el uso de lrneas celulares auxiliares que contienen plasmidos que codifican todos los genes estructurales del retrovirus bajo el control de secuencias reguladoras dentro del LTR. Las lrneas celulares auxiliares adecuadas son bien conocidas por las personas con conocimientos en la materia. Dichos vectores pueden contener adicionalmente un gen que codifica un marcador seleccionable de manera que las celulas transducidas puedan ser identificadas. Ademas, los vectores retrovirales pueden ser modificados de manera que se conviertan en espedficos de diana. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante la insercion de un polinucleotido que codifica un azucar, un glicoftpido o una protema, preferentemente un anticuerpo. Las personas con conocimientos en la materia conocen procedimientos adicionales para generar vectores especficos de diana. Otros vectores y procedimientos adecuados para terapia genica in vitro o in vivo se describen en la literatura y son conocidos por las personas con conocimientos en la materia; veanse, por ejemplo, los documentos WO 94/29469 o WO 97/00957.
Con el fin de conseguir la expresion solo en el organo diana, es decir, los tumores cerebrales indicados anteriormente, las secuencias de ADN para la transcripcion de los oligonucleotidos antisentido pueden estar vinculadas a un promotor especfico de tejido y pueden ser usadas para terapia genica. Dichos promotores son bien conocidos por las personas con conocimientos en la materia (vease, por ejemplo, Zimmermann et al., (1994) Neuron 12, 11-24; Vidal et al.; (1990) EMBO J. 9, 833-840; Mayford et al., (1995), Cell 81, 891-904; Pinkert et al., (1987) Genes & Dev. 1, 268-76).
Dentro de una estructura de oligonucleotido, se hace referencia comunmente a los grupos fosfato como formando la cadena principal de internucleosidos del oligonucleotido. El enlace normal o cadena principal de ARN y ADN es un enlace 3' a 5' fosfodiester. Los ejemplos especficos de compuestos antisentido preferentes utiles en la presente invencion incluyen oligonucleotidos que contienen cadenas principales modificadas o enlaces entre nucleosidos no naturales. Los oligonucleotidos que tienen esqueletos modificados incluyen aquellos que retienen un atomo de fosforo en la cadena principal y aquellos que no tienen un atomo de fosforo en la cadena principal. Las cadenas principales de oligonucleotidos modificadas que pueden resultar en una mayor estabilidad son conocidas por la persona con conocimientos en la materia, preferentemente dicha modificacion es un enlace fosforotioato.
Un mimetico de oligonucleotido preferente es un mimetico de oligonucleotido que se ha demostrado que tiene excelentes propiedades de hibridacion, y se conoce como un acido nucleico peptfdico (PNA). En los compuestos de PNA, la cadena principal de azucar de un oligonucleotido es reemplazada por una cadena principal que contiene amida, en particular una cadena principal de aminoetilglicina. Las nucleobases estan retenidas y estan unidas directa o indirectamente a atomos de nitrogeno aza de la parte amida de la cadena principal (vease, por ejemplo, Nielsen et al., Science 254 (1991), 14971500).
Los oligonucleotidos modificados pueden contener tambien uno o mas restos de azucar sustituidos o modificados. Los oligonucleotidos preferentes comprenden uno de los siguientes en la posicion 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N- alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo puede ser alquilo C1 a C10 o alquenilo y alquinilo C2 a C10 sustituido o no sustituido. Una fraccion de azucar modificada particularmente preferente es una fraccion de azucar 2'-O-metoxietilo.
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Los oligonucleotidos de la invention pueden incluir tambien modificaciones o sustituciones de nucleobases. Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sinteticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5- hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2- propilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina etc., siendo preferentes las sustituciones 5-metilcitosina ya que se ha demostrado que estas modificaciones aumentan la estabilidad del duplex de acido nucleico.
Otra modification de los oligonucleotidos de la invencion implica la union qmmica al oligonucleotido de una o mas fracciones o conjugados que mejoran la actividad, la distribution celular o la captation celular del oligonucleotido. Dichas fracciones incluyen fracciones lipfdicas tales como una fraction colesterol, acido colico, un tioeter, un tiocolesterol, una cadena alifatica, por ejemplo, residuos dodecandiol o undecilo, un fosfolfpido, una poliamina o una cadena de polietilenglicol o acido acetico adamantano, una fraccion palmitilo, o una fraccion octadecilamina o una fraccion hexilamino-carbonil-oxicolesterol.
La presente invencion incluye tambien compuestos antisentido que son compuestos quimericos. Los compuestos "quimericos" antisentido o "quimeras", en el contexto de la presente invencion, son compuestos antisentido, particularmente oligonucleotidos, que contienen dos o mas regiones qmmicamente distintas, cada una compuesta de al menos una unidad monomero, es decir, un nucleotido en el caso de un compuesto oligonucleotido. Estos oligonucleotidos contienen tfpicamente al menos una region en la que el oligonucleotido esta modificado para conferir al oligonucleotido una mayor resistencia a la degradation por nucleasas, una mayor captacion celular y/o una mayor afinidad de union para el acido nucleico diana. Una region adicional del oligonucleotido puede servir como un sustrato para enzimas capaces de escindir ARN:ADN o hfbridos ARN:ARN. A modo de ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un duplex ARN:ADN. La activation de la RNasa H, por lo tanto, resulta en la escision de la diana de ARN, mejorando de esta manera en gran medida la eficiencia de la inhibition de oligonucleotido de expresion genica. Por consiguiente, frecuentemente pueden obtenerse resultados comparables con oligonucleotidos mas cortos cuando se usan oligonucleotidos quimericos, en comparacion con fosforotioato desoxioligonucleotidos que se hibridan a la misma region diana. Los compuestos antisentido quimericos de la invencion pueden formarse como estructuras compuestas de dos o mas oligonucleotidos, oligonucleotidos modificados, oligonucleosidos y/o mimeticos de oligonucleotidos tal como se ha descrito anteriormente. Dichos compuestos se han denominado tambien en la tecnica como hfbridos o gapmeros.
En una realization preferente adicional de la presente invencion, los compuestos para su uso en un procedimiento de tratamiento de un glioma o glioblastoma son compuestos que reducen o inhiben la actividad biologica de BCAT1.
Dichos compuestos se describen en la tecnica para diferentes indicaciones medicas que difieren de la indication de la presente invencion y, preferentemente, comprenden compuestos tales como acido l-(aminometil) ciclohexano acetico (gabapentina) o un compuesto descrito en Goto et al., The Journal of Biological Chemistry 280 (44) (2005), 37246-56, Hu et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 16 (2006), 2337-40, Caballero et al., Molecular Diversity 13 (2009), 493500, la patente US N° 6.632.831, la patente US N° 6.809.119 y el documento EP-B1 1 157 000.
Otros ejemplos de compuestos capaces de reducir o inhibir la actividad biologica de BCAT1 son anticuerpos (neutralizantes) dirigidos contra BCAT1 o sus fragmentos que tienen sustancialmente la misma especificidad de union. El termino "anticuerpo", preferentemente, se refiere a anticuerpos que consisten esencialmente en anticuerpos monoclonales agrupados con diferentes especificidades epitopicas, asf como preparaciones de anticuerpos monoclonales distintos. Los anticuerpos monoclonales se forman a partir de un antfgeno que contiene, por ejemplo, un fragmento de BCAT1 mediante procedimientos bien conocidos por las personas con conocimientos en la materia (vease, por ejemplo, Kohler et al., Nature 256 (1975), 495). Tal como se usa en la presente memoria, el termino "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) pretende incluir moleculas intactas asf como fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, Fab y F(ab')2) que son capaz de unirse espedficamente a la protema. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan mas rapidamente de la circulation y pueden tener una menor union no espetifica a tejido que un anticuerpo intacto. (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)). De esta manera, estos fragmentos son preferentes, asf como los productos de una biblioteca de expresion de FAB u otra inmunoglobulina. Ademas, los anticuerpos utiles para los propositos de la presente invencion incluyen anticuerpos quimericos, de cadena sencilla, y humanizados.
De manera alternativa, los compuestos preferentes para el proposito de la invencion son versiones inactivas de BCAT1 o secuencias de acidos nucleicos que codifican versiones inactivas de BCAT1 que pueden ser introducidas segun los enfoques/vectores descritos anteriormente. Dichas versiones inactivas pueden ser generadas segun procedimientos de mutagenesis bien conocidos. Dichos compuestos pueden tener un efecto terapeutico en el cuerpo humano mediante el desplazamiento de su homologo funcionalmente activo, en particular, cuando se aplican en exceso. Los analisis de versiones potencialmente inactivas de BCAT1 pueden llevarse a cabo mediante el ensayo de la transamination (reversible) de L-aminoacidos de cadena ramificada a los alfa-cetoacidos de cadena ramificada, por ejemplo, mediante la determination de la production de glutamato. En la literatura se describen ensayos adecuados y, por ejemplo, en el Ejemplo 39 de la patente US N° 6.809.119, Hu et al. (2006), and el documento EP-B1 1 157 000.
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En una realization preferente de la presente invention, el compuesto descrito en detalle anteriormente se usa en un procedimiento de tratamiento de un glioma o glioblastoma.
La presente invencion se refiere tambien a un procedimiento para identificar un compuesto que reduce o inhibe la actividad biologica de BCAT1 y/o su expresion, que comprende las etapas de:
(a) incubar un compuesto candidato con un sistema de ensayo que comprende BCAT1 o su gen; y
(b) ensayar una actividad biologica de BCAT1;
en el que una inhibition o perdida de una actividad biologica de BCAT1, preferentemente en comparacion con un sistema de ensayo en ausencia de dicho compuesto de ensayo, es indicativo de la presencia de un compuesto candidato que tiene la propiedad deseada.
La etapa (b) puede llevarse a cabo mediante el ensayo de la transamination (reversible) de L-aminoacidos de cadena ramificada a acidos alfa-ceto de cadena ramificada usando un ensayo segun como se ha descrito anteriormente. Los ejemplos de dichas moleculas candidatas incluyen anticuerpos, oligonucleotidos, protemas o moleculas pequenas. Dichas moleculas pueden ser disenadas racionalmente usando tecnicas conocidas.
Preferentemente, dicho sistema de ensayo usado para la detection comprende sustancias de propiedades qmmicas y ffsicas similares y/o, mas preferentemente, dichas sustancias son casi identicas. Los compuestos que pueden ser preparados e identificados segun un uso de la presente invencion pueden ser bibliotecas de expresion, por ejemplo, bibliotecas de expresion de ADNc, peptidos, protemas, acidos nucleicos, anticuerpos, compuestos organicos pequenos, ligandos, hormonas, peptidomimeticos, PNAs o similares.
El documento WO 98/25146 describe procedimientos adicionales para la selection de bibliotecas de complejos para compuestos que tienen una propiedad deseada, especialmente, la capacidad de agonizar, unirse a, o antagonizar un polipeptido o su receptor celular. Los complejos en dichas bibliotecas comprenden un compuesto bajo ensayo, un marcador que registra al menos una etapa en la smtesis del compuesto, y un conector susceptible de modification por una molecula informadora. La modificacion del conector se usa para significar que un complejo contiene un compuesto que tiene una propiedad deseada. El marcador puede ser decodificado para revelar al menos una etapa en la smtesis de dicho un compuesto. Otros procedimientos para identificar compuestos que interaccionan con BCAT1 o moleculas de acido nucleico que codifican tales moleculas son, por ejemplo, el cribado in vitro con el sistema de presentation de fagos asf como los ensayos de union a filtro o de medicion en "tiempo real" de la interaction.
La persona con conocimientos en la materia sabe tambien que es posible disenar, sintetizar y evaluar mimeticos de compuestos organicos pequenos que, por ejemplo, pueden actuar como sustrato o ligando para BCAT1. Por ejemplo, se ha descrito que los mimeticos de D-glucosa de hapalosina exhibieron una eficiencia similar a la hapalosina para antagonizar protemas asociadas a asistencia a la resistencia a multiples farmacos en citotoxicidad; vease Dinh, J. Med. Chem. 41 (1998), 981-987.
Todos estos procedimientos pueden sr usados segun la presente invencion para identificar un compuesto reduce o inhibe la actividad biologica de BCAT1 o su expresion.
El gen que codifica BCAT1 puede servir tambien como una diana para la seleccion de inhibidores. Los inhibidores pueden comprender, por ejemplo, protemas que se unen al ARNm de los genes que codifican BCAT1, desestabilizando de esta manera la conformation nativa del ARNm y obstaculizando la transcription y/o traduction. Ademas, en la literatura se describen procedimientos para la identification de moleculas de acido nucleico, tales como un fragmento de ARN que imita la estructura de una molecula de ARN diana definida o no definida al cual se une un compuesto dentro de una celula resultando en el retraso del crecimiento celular o la muerte celular; vease, por ejemplo, el documento WO 98/18947y las referencias citadas en el mismo. Estas moleculas de acido nucleico pueden ser usadas para identificar compuestos desconocidos de interes farmaceutico, y para identificar dianas de ARN desconocidas para su uso en el tratamiento de una enfermedad. Estos procedimientos y composiciones pueden ser usados para la identificacion de compuestos utiles para reducir los niveles de expresion de BCAT1.
Los compuestos que pueden ser ensayados e identificados segun el procedimiento de la invencion pueden ser bibliotecas de expresion, por ejemplo, bibliotecas de expresion de ADNc, peptidos, protemas, acidos nucleicos, anticuerpos, compuestos organicos pequenos, hormonas, peptidomimeticos, PNAs o similares (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell 79 (1994), 193-198 y las referencias citadas supra). Ademas, los genes que codifican un regulador putativo de BCAT1 y/o que ejercen sus efectos aguas arriba o aguas abajo de BCAT1 pueden ser identificados usando, por ejemplo, mutagenesis de insertion usando, por ejemplo, vectores de reconocimiento genico conocidos en la tecnica. Dichos compuestos pueden ser tambien derivados funcionales o analogos de inhibidores conocidos. Dichos compuestos utiles pueden ser por ejemplo factores transactivadores que se unen a BCAT1 o secuencias reguladoras del gen que lo codifica. La identificacion de factores transactivadores puede llevarse a cabo
usando procedimientos estandar en la tecnica. Para determinar si una protema se une a la propia protema o a secuencias reguladoras, pueden llevarse a cabo analisis estandar de desplazamiento en gel nativo. Con el fin de identificar un factor transactivador que se une a la protema o secuencia reguladora, la protema o secuencia reguladora puede ser usada como un reactivo de afinidad en procedimientos de purificacion de protemas estandar o como una sonda para el cribado de una 5 biblioteca de expresion. La identificacion de moleculas de acido nucleico que codifican polipeptidos que interaction con BCAT1 puede conseguirse tambien, por ejemplo, tal como se describe en Scofield (Science 274 (1996), 2063-2065) mediante el uso del denominado "sistema de dos Idbridos" de levadura. En este sistema, BCAT1 es unido al dominio de union al ADN del factor de transcripcion GAL4. Una cepa de levadura que expresa este polipeptido de fusion y que comprende un gen indicador lacZ accionado por un promotor apropiado, que es reconocido por el factor de transcripcion 10 GAL4, es transformado con una biblioteca de ADNcs que expresaran las protemas vegetales o sus peptidos fusionados a un dominio de activacion. De esta manera, si un peptido codificado por uno de los ADNcs es capaz de interactuar con el peptido de fusion que comprende un peptido de BCAT1, el complejo es capaz de dirigir la expresion del gen informador. De esta manera, BCAT1 y el gen que codifica BCAT1 pueden ser usados para identificar peptidos y protemas que interaction con BCAT1. Es evidente para la persona con conocimientos en la materia que entonces este y otros sistemas 15 pueden ser aprovechados adicionalmente para la identificacion de inhibidores.
Los ejemplos siguientes explican la invention mas detalladamente pero no debenan interpretarse como una limitation de la invencion.
Ejemplo 1
Procedimientos generales
20 (a) Aislamiento de ARN y PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
El ARN total se extrajo usando el Kit AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit (Qiagen) segun las instrucciones del fabricante. ARN total de cerebro humano de referencia FirstChoice® de Ambion sirvio como conjunto de ARN de cerebro normal (n = 23 donantes). El ARN total (500 ng) fue sometido a transcripcion inversa usando cebadores aleatorios y Superscript II (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) segun las instrucciones del fabricante. Cada muestra de ADN complementario se 25 analizo por triplicado con el Sistema Applied Biosystems Prism 7900HT Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.), usando una mezcla Absolute SYBR Green ROX Mix (ABgene, Epsom, Reino Unido). La cantidad relativa de ARNm espedfico se normalizo a ARF, B2My TBP. Las secuencias de los cebadores se proporcionan en la Tabla 1A siguiente.
Tabla 1A
Cebador de expresion
BCAT1 (todas las isoformas)
Directo CAACTATGGAGAATGGTCCTAAGCT
Inverso
TGTCCAGTCGCTCTCTTCTCTTC
BCAT1 T1 (ENST00000261192)
Directo GCTACGACCCTTGGGATCT
BCAT1 T4 (ENST00000539282)
Directo GTGCCACTGCCGCTCTCT
BCAT1 T6 (ENST00000538118)
Directo TGGTTGTCTGAGCCTCCTTT
BCAT1 Exon 2
Inverso AAGTCCCCACCACCTCTTTT
BCAT1 Exon 5
Inverso CCCATTCTTGATCCAATTTCA
HEY
Directo CGAGCTGGACGAGACCAT
Inverso
GAGCCGAACTCAAGTTTCCA
ARF
Directo GACCACGATCCTCTACAAGC
Inverso
TCCCACACAGTGAAGCTGATG
5
10
15
20
25
30
35
40
45
(Cont.)
B2M
Directo ACTGAATTCACCCCCACTGA
Inverso
CCTCCATGATGCTGCTTACA
Directo GAACCACGGCACTGATTTTC
TBP
Inverso CCCCACCATGTTCTGAATCT
Inverso AAATAACTTAACACCCCAATCTAAAC
(b) Analisis de transferencia Western
Todos los experimented que implican el uso de tejidos humanos se llevan a cabo segun las directrices de la junta de revision institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad Heinrich Heine de Dusseldorf. Las muestras de tejidos tumorales humanos frescas congeladas y una muestra de tejido cerebral no neoplasico se lisaron en solucion de isotiocianato de guanidina (4M) usando un dispositivo Ultra-Turrax (IKA, Staufen, Alemania) y se sometieron a CsCl- ultracentrifugacion. La diafiltracion de las fracciones de protema obtenidas se realizo usando los dispositivos de filtro centrffugo 0,5 Amicon Ultra (Millipore, Schwalbach, Alemania; corte 3kDa) esencialmente tal como se describe45. La protema total de las lmeas de celulas se extrajo usando el kit AllPrep DNA/RNA/Protein Mini kit (Qiagen). Se separaron 10 |jg de protema mediante 10% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore). La membrana se bloqueo en solucion de bloqueo (5% de BSA en TBS, 0,1% de Tween 20) y se incubo con anticuerpos primarios durante la noche a 4°C. Se incubaron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rabano picante (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente antes de la deteccion quimioluminiscente de protema (kit ECL; GE Healthcare, Little Chalfont, UK).
Se usaron los anticuerpos siguientes: anticuerpo monoclonal de raton contra a-tubulina (1:2000, #T9026, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, EE.UU.), anticuerpo monoclonal de raton contra BCAT1 (1:2000, ECA39, clon 51, #611270, BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.), antisuero monoclonal de rata contra IDH1 (1:1, proporcionado por A. von Deimling, DKFZ, Heidelberg, Alemania; disponible comercialmente en Dianova, Hamburgo, Alemania), anticuerpo monoclonal de raton contra HADHSC (1:500, #H00003033-M01, Abnova), anticuerpo monoclonal de conejo contra CDKN1B (1:1000, p27 Kip1, #3686, Cell Signaling Technology), anticuerpo monoclonal de conejo contra Akt (1:1000, #9272, Cell Signaling Technology), anticuerpo monoclonal de conejo contra fosfo-Akt (Ser473) (1:1000, #193H12, Cell Signaling Technology), anticuerpo policlonal de conejo contra p70 S6 quinasa (1:1000, #9202, Cell Signaling Technology), anticuerpo policlonal de conejo contra fosfo-p70 S6 quinasa (Thr389) (1:1000, #9205, Cell Signaling Technology), IgG anti-rata conjugada con HRP (1:10000, proporcionada por A. von Deimling, DKFZ, Heidelberg, Alemania), IgG de caballo anti-raton conjugada con HRP (1:5000, #7076, Cell Signaling Technology), IgG de cabra anti-conejo conjugada con HRP (1: 2000, # 7074, Cell Signaling Technology).
(c) Tincion mmunohistoqmmica
Las secciones del tumor se desparafinaron usando silol y se rehidrataron en concentraciones decrecientes de etanol. La recuperacion de antfgeno se llevo a cabo calentando durante 40 min en un vaporizador en tampon citrato de sodio 10 mM (pH 6,0). La peroxidasa endogena se inactivo mediante la incubacion de las secciones tumorales en peroxido de hidrogeno al 3%. Las secciones se incubaron durante la noche con anticuerpo monoclonal de raton anti-BCAT1 primario (ECA39), clon 51 (BD Biosciences, San Jose, CA) diluido 1:500 o anticuerpo de raton anti-IDH1 R132H humano (Dianova, Hamburgo, Alemania) diluido 1:20 en diluyente de anticuerpo Dako REAL™ (Dako, Glostrup, Dinamarca). La tincion para la deteccion de los anticuerpos unidos se realizo segun los protocolos estandar usando el sistema de deteccion EnVision™ (peroxidasa/DAB+, conejo/raton) (Dako, Glostrup, Dinamarca), la contra-tincion posterior se realizo usando hematoxilina.
(d) analisis de la metilacion del ADN
La metilacion de ADN se analizo mediante la tecnica MassARRAY. Brevemente, 500 ng de ADN genomico se modificaron qmmicamente con bisulfito de sodio usando el kit de metilacion EZ (Zymo Research) segun las instrucciones del fabricante. El ADN tratado con bisulfito se amplifico mediante PCR con cebadores que generan cuatro amplicones (A1- A4) desde -990 pb a 612 pb alrededor de TSS del transcrito 1 de BCAT1 (T1, ENST00000261192), y tres amplicones (A5- A7) del promotor del transcrito 4 de BCAT1 (T4, ENST00000539282) y 6 (T6, ENST00000538118) desde -198 pb a +63 pb. Los amplicones fueron transcritos mediante polimerasa T7, seguido de escision RNAasaA espedfica de T. Los fragmentos digeridos fueron cuantificados mediante espectrometrfa de masas. Las secuencias de los cebadores se proporcionan en la Tabla 1B. Se usaron estandares de metilacion de ADN (ADN genomico 0%, 20%, 40%, 60%, 80% y 100% metilado) para confirmar la amplificacion imparcial de los amplicones.
5
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20
25
30
Tabla 1B
Cebador para el analisis de metilacion
A1 *
Directo AAGTTTTTGTTGTGGAAGTTGTTTT
Inverso
CACCTAACCAACAATCATTAAACACTA
A2 *
Directo TTTGTTTGAGGGTATTGGAAGTAAT
Inverso
TAACTCCTACCCACCTCCCTACTAT
* CO <
Directo ATAGTAGGGAGGTGGGTAGGAGTTA
Inverso
AAACACTAAAACTACTCCCCCAAAC
A4 *
Directo GTTTGGGGGAGTAGTTTTAGTG
Inverso
CTCCCTACCAACTATATTTCTTA
A5 *
Directo ATTTATGAGGGTGTTAGATTTGGGT
Inverso
TTAAAAACTCCTCCCCAAAAAATAC
A6 *
Directo TTGTTTAGGTTTAGTATTTTTATGGG
Inverso
ACCATTTATAAAAAAATCTCCAAAA
A7 *
Directo AAATTATTATTAAGTAAATGTAGGTGGG
(e) Cultivo de celulas
Las lmeas celulares de glioma humano U-87MG (HTB-14), LN-229 (CRL-2611), Hs683 (HTB-138) y U-373MG (HTB-17) se cultivaron en medio esencial mmimo de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bobino fetal y 1% de mezcla penicilina/estreptomicina. Las lmeas celulares se autenticaron mediante analisis de repeticion corta en tandem (STR). Las celulas madre cancerosas de cerebro NCH421k se establecieron a partir de pacientes con glioblastoma primario sometidos a reseccion quirurgica segun las propuestas de investigacion aprobadas por la junta de revision institucional de la Facultad de Medicina, Universidad de Heidelberg. Se caracterizaron genotipica y fenotipicamente en un estudio previo (Campos, B., et al. Differentiation therapy exerts antitumor effects on stem-like glioma cells. Clin Cancer Res 16, 2715-2728 (2010)). Las celulas NCH421k se cultivaron como agregados flotantes (neuroesferas) en placas de cultivo de tejido no recubiertas en medio DMEM/F-12 que contema 20% de suplemento libre de suero BIT, factor de crecimiento de fibroblastos basico y factor de crecimiento epidermico a una concentracion de 20 ng/ml cada uno (todos de Provitro, Berlin, Alemania). Las celulas HEK293T y HEK293 se mantuvieron como cultivos monocapa en DMEM que contema suero bobino fetal al 10% sin antibioticos.
Todas las lmeas celulares se cultivaron a 37°C en un incubador humidificado con 5% de CO2. Para los experimentos de hipoxia, las celulas se cultivaron con 1% de O2 en una incubadora de hipoxia C16 suministrada con nitrogeno (Labotect, Goettingen, Alemania).
(f) Immunoprecipitacion de cromatina (ChIP)
La ChIP se realizo en celulas HEK293 que sobreexpresan HEY1 marcado con Flag, ya que los anticuerpos disponibles en la actualidad contra HEY1 no eran espedficos para los ensayos ChIP. Los constructos para la sobreexpresion HEY1 se prepararon usando vectores “Gateway compatible” marcados con FLAG; pDest26 (etiqueta C-terminal) y pDest11 (etiqueta N-terminal). 1 |jg del vector de control o los vectores de expresion HEY1 se transfectaron en 2,5x106 celulas HEK293 por placa de 15 cm usando TransIT®-LT1 (Mirus Bio LLC, Madison, WI 53711, EE. UU.) segun las instrucciones del fabricante ligeramente modificadas. Las celulas de dos placas se recogieron 48 horas despues de la transfeccion. La cromatina se preparo usando tampones de cizallamiento no ionicos con Covaris S2, segun el protocolo del fabricante (Covaris Inc.). La ChIP se llevo a cabo usando anticuerpos anti-FLAG (Cell Signaling #2368). El ADN se recupero despues de la ChIP se uso para qRT-PCR con cromatina de entrada e inmunoprecipitacion “mock” (anticuerpo anti-IgG, Diagenode, Kch-803-015) que sirve como control. La qRT-PCR se realizo por triplicado con deteccion SYBR verde usando los cebadores indicados en la Tabla 2. Se indican las relaciones de las senales de union y de entrada.
5
10
15
20
25
30
Tabla 2
Cebador promotor
PTPRD
Directo GAGGAGGAGGAGAAAGAGCA
Inverso
GACAGAGCCTCGCCTCCT
BCAT1 neg
Directo TCCCTAGTCCTCCGTTCTGA
Inverso
ATTCCAAGGAGCATTTGTGC
BCAT1 DMR(c1)
Directo GAGGGTGACTAAGGAACTCTGG
Inverso
ATTGCCATTCCGTCATCACT
BCAT1 c2
Directo GCTACGACCCTTGGGATCT
Inverso
TCGATTCACGCACACATTTT
BHLHA15
Directo CCGAGGGCTCATTTGCAT
Inverso
CACCCGAGTTCCCAGCTC
(g) Transfeccion transitoria de ARNip
Las celulas HEK293T fueron transfectadas con duplex de ARNip de Ambion (HEY1: s23868-70) o Dharmacon (control no diana: D-001810-10) usando DhamaFect1 siguiendo pequenas modificaciones a las instrucciones del fabricante (Dharmacon). En pocas palabras, cada grupo de ARNip se diluyo en tampon 1X ARNip (Dharmacon), se mezclo con RPMI y, a continuacion, se distribuyo en 6 pocillos de placas de 96 pocillos. Se sembraron 1,2x104 celulas HEK293 o 9x103 celulas HEK293T en la parte superior de la mezcla ARNip/DharmaFECT (el volumen era de 150 pl/pocillo y 20 nM de ARNips al final). Despues de 48 horas de incubacion a 37°C, se aislaron los ARNs de los pocillos para su posterior analisis.
(h) La produccion y transduccion de virus
Los vectores lentivirales se produjeron mediante co-transfeccion de celulas HEK293T con el psPAX2 (Addgene 12260, Didier Trono, vector de empaquetamiento), PMD2.G (Addgene 12259, Didier Trono, plasmido de envoltura), y constructos pLKO.1 ARNhc (Sigma-Aldrich). Las transfecciones se llevaron a cabo usando TransIT®-LT1 (Mirus Bio LLC) y el virus se recogio a las 48 y 72 horas despues de la transfeccion y se combino.
La infeccion de las celulas de glioma con virus a una M.O. I. de 2 se llevo a cabo en presencia de 8 pg/ml de polibreno (Chemicon, Billerica, MA, EE. UU.). El sobrenadante que contema virus se retiro despues de 24 horas y las celulas se dividieron en los dfas 3, 5 y 7 despues de la transduccion. Se usaron dos constructos Mission® ARNhc independientes dirigidos a diferentes regiones de las transcripciones ARNm de BCAT1 humana (BCAT1 shRNAI NM_005504.3-1064s1c1 y BCAT1 shRNAII NM_005504.3-751s1c1) e IDH1 humana (IDH1 shRNAI NM_005896.2-1363s1c1 e IDH1 shRNAII NM_005896.2-292s1c1). Se uso ARNhc no diana (Mission SHC002) como control. La cuantificacion del silencionamiento BCAT1 e IDH1 se evaluo por PCR cuantitativa en tiempo real y transferencia Western.
(i) Tratamiento con dimetil-a-cetoglutarato y gabapentina
Se sembraron 5x104 celulas /pocillo en placas de 24 pocillos en un volumen total de 500 pl medio de cultivo celular. El medio se retiro 16 horas despues de la siembra de las celulas, y se reemplazo con 500 pl de medio que contema dimetil- a-cetoglutarato 5 mM o 10 mM (dimetil 2-oxoglutarato; Sigma-Aldrich) o gabapentina 5 mM, 10 mM o 20 mM (1 - (aminometil)-ciclohexano; Sigma-Aldrich). Los volumenes correspondientes de tampon HEPES 200 mM (pH 7,4) se anadieron a los pocillos de control respectivos.
(j) Analisis de ciclo celular y deteccion de apoptosis
El analisis del ciclo celular se llevo a cabo 20 horas despues del tratamiento con gabapentina y 6 dfas despues de la transduccion lentiviral. Se anadio tampon Nicoletti (0,1% de citrato de sodio, pH 7,4, 0,05% de Triton X-100, 50 pg ml-1 de yoduro de propidio) a los pocillos que conteman tanto celulas muertas como vivas. Despues de 4 horas en la oscuridad a 4°C, el contenido de ADN se analizo mediante citometna de flujo usando FACS Canto II (BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.). Se uso el software Diva FACS para cuantificar la distribucion de celulas en cada fase del ciclo celular: sub-G1
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(celulas muertas), G1, S y G2/M. Para la investigacion de la actividad apoptotica despues del silenciamiento lentiviral, las celulas NCH421k se incubaron con anexina V-PE (ficoeritrina) y 7-AAD (7-aminoactinomicina D, BD Biosciences) durante 15 minutos en la oscuridad, seguido inmediatamente por citometrfa de flujo.
(k) Analisis de proliferacion
Para evaluar la proliferacion de las celulas de glioma despues del tratamiento con gabapentina o despues del silenciamiento lentiviral, se uso el ensayo de proliferacion celular Click-iT® EdU (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las celulas se incubaron con 10 pM del analogo de nucleosido EdU (5-etinil- 2'desoxiuridina) durante 16 horas. La cuantificacion de las celulas que incorporaron EdU se realizo usando FACS Canto II (BD Biosciences).
(l) Cuantificacion de glutamato
La concentracion de glutamato en el sobrenadante de celulas tratadas con gabapentina se determino usando el kit de determinacion de glutamina/glutamato (GLN-1; Sigma-Aldrich) segun las instrucciones del fabricante. Los volumenes de reaccion se redujeron a 100 pl de volumen total y la absorbancia se midio por triplicado en una microplaca (microplaca de fondo plano, transparente a UV, de 96 pocillos, Corning®) usando un lector de placas Tecan Infinite M200 (Tecan, Austria). Los datos se normalizaron para el numero de celulas por pocillo.
(m) Tincion de inmunofluorescencia
Las celulas se sembraron en cubreobjetos de vidrio cinco dfas despues de la transduccion lentiviral. Las celulas se fijaron en formaldehido al 4%, se enjuagaron dos veces en 1 x PBS, y se permeabilizaron en PBS que contema 0,2% de Triton. Tras el aclarado con 1 x PBS, las celulas se incubaron en suero de cabra al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se incubaron 1 hora con el anticuerpo primario (anticuerpo de raton anti a-tubulina, 1:200, #T9026, Sigma-Aldrich) y 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario (anticuerpo de cabra anti raton conjugado con FITC, 1:100, ab6785, Abcam) despues del montaje con medio de montaje Vectashield que contema DAPI (vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.). Para obtener imagenes de fluorescencia, se tomaron imagenes usando una lente objetivo 40 x en un microscopio Zeiss Axioplan.
(n) Ensayo de migracion en microcanal 3D
Los chips de microcanales basados en Poli(dimetilsiloxano) (PDMS) fueron proporcionados amablemente por el Dr. Ralf Kemkemer Max Planck Institute for Intelligent Systems, Alemania). Las estructuras con canales microfabricados con las dimensiones de 5 x 11 x 300 pm (Anchura x Altura x Longitud) se bio-funcionalizaron mediante incubacion con una solucion de 50 pg/ml de fibronectina antes de su uso. El chip se fijo sobre un soporte de teflon y se sembraron 2x105 celulas en el chip en estrecha proximidad a los canales. Tras fijar las celulas sobre el chip, se obtuvieron imagenes de las celulas vivas durante 25 horas. Durante los experimentos, no se aplico ningun gradiente qmmico o flujo dentro de los canales. Se capturaron imagenes de contraste de fase, lapso de tiempo, de multiples posiciones cada 10 minutos con un microscopio invertido automatizado (Zeiss Cell Observer; Carl Zeiss) equipado con una camara de aire humidificado y calentada. Las imagenes se grabaron y procesaron con Zeiss AxioVision y el software ImageJ. Los comportamientos celulares se analizaron y se categorizaron tal como se ha indicado anteriormente (Bai, A. H., et al. MicroRNA-182 promotes leptomeningeal spread of non-sonic hedgehog-medulloblastoma. Acta Neuropathol (2011);Rolli, C.G., Seufferlein, T., Kemkemer, R. & Spatz, J.P. Impact of tumor cell cytoskeleton organization on invasiveness and migration: a microchannel-based approach. PLoS One 5, e8726 (2010)).
(o) Experimentos con animales
El trabajo con animales fue aprobado por las autoridades gubernamentales (Regierungspraesidium Karlsruhe, Alemania) y fue supervisado por oficiales institucionales para la proteccion de los animales segun National Institutes of Health guidelines Guide for the Care and Use of Laboratory Animals..
(p) Modelo de tumor cerebral ortotopico
Un total de 2x105 celulas U-87MG con silenciamiento shRNAI BCAT1 o ARNhc no dirigido se implantaron estereotacticamente en el cerebro de seis ratones atfmicos de 7-9 semanas de edad (CD1 nu/nu; Charles River Laboratories, Wilmington, MA, EE. UU.), respectivamente. Cuatro semanas despues de la implantacion, se sacrificaron los animales, se retiraron los cerebros y se crio-seccionaron. Las secciones de cerebro se tineron con hematoxilina y eosina y el volumen del tumor se calculo usando ImageJ.
(q) Extraccion de celulas con acido perclorico y espectroscopia de RMN
Las celulas se recogieron mediante tripsinizacion, se lavaron una vez con PBS enfriado en hielo, y el sedimento celular se congelo a -80°C. Tfpicamente 1 x 108 celulas recogidas se sometieron a extraccion con acido perclorico seguido de
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neutralizacion con KOH segun los protocolos publicados50 Brevemente, se anadieron 2 ml de 1 N HCIO4 enfriado con hielo a un sedimento congelado de celulas recogidas. El sedimento se interrumpio usando un mortero de teflon y un homogeneizador de vidrio. Se anadio 1 ml de agua enfriada con hielo al lisado, se sometio a agitacion vorticial durante 90 segundos y se centrifugo a 10. 000 x g durante 10 min a 4°C. El sedimento se volvio a extraer y se combinaron los sobrenadantes. El extracto se neutralizo con KOH y el pH se ajusto a 6,5-7,0. El KClO4 precipitado se sedimento a 25.000 x gramopor 20 minutos y el sobrenadante se liofilizo.
Los residuos de extracto liofilizados se disolvieron en 0,5 ml de un tampon D2O (99,9% D) que contema fosfato de sodio 30 mM y azida de sodio 0,1 mM (pH 7,02). Para el analisis cuantitativo, un capilar de referencia (1,5 mm OD, 0,99 mm ID) se lleno con una solucion de acido trimetilsilil-2,2,3,3-tetradeuteropropanoico (TSP, sal de sodio) 11 mM en el tampon D2O descrito anteriormente. Posteriormente, el capilar se sello en la llama de un mechero Bunsen. Se preparo una solucion de calibracion colocando cantidades pesadas de glucosa y acido dtrico en el tampon D2O para dar las concentraciones calculadas de glucosa 10,49 mM y de glucosa 4, 95 mM. Se adquirieron espectros 1H-NMR de la solucion de calibracion + capilar a 600 MHz (Avance AV-600, Bruker BioSpin GmbH) usando un tubo de RMN de 5 mm estandar y una sonda inversa de triple resonancia en las mismas condiciones a ser usadas para los extractos (20°C, pre- saturacion de senal HDO residual, tiempo de repeticion TR = 7 s, angulo de inclinacion 30°). Las integrales de senal de citrato y glucosa se ajustaron a los valores correspondientes a las concentraciones proporcionadas anteriormente, y se encontro que la integral de la senal de metilo TSP era equivalente a 4,60 ± 0,10 mM protones. Los extractos celulares se midieron con el capilar de referencia calibrado insertado (512 transitorios en 1 hora), y las senales 1H-RMN para los aminoacidos de cadena ramificada, varios metabolitos y la referencia TSP se integraron. La integral TSP se definio como 4,60 mM de manera que las integrales de senal de metabolito proporcionaron directamente las concentraciones de metabolito en mM (pmol/ml) de los volumenes de 0,5 ml usados. A continuacion, estos datos se convirtieron a femtomol/celula usando los recuentos de celulas determinados antes de la extraccion.
(r) Preparacion de homogeneizados de celulas
Los sedimentos celulares se diluyeron en 100 pl de agua y se homogeneizaron mediante tratamiento con ultrasonidos (dispositivo ultrasonico, 3-5 x 20 ciclo, salida 80%, Branson Sonifier 450, Dietzenbach, Alemania). La protema se determino segun Lowry (Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. y Randall, R Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193, 265-275 (1951) con las modificaciones de Helenius y Simons (Helenius, A. y Simons, K. The binding of detergents to lipophilic and hydrophilic proteins. J Biol Chem 247, 3656-3661 (1972)) usando albumina de suero bovino como estandar. Las concentraciones de protema final de los homogeneizados debenan estar comprendidas en un intervalo de 2-4 mg/ml. Estas diluciones se usaron para todos los analisis.
(s) Analisis estadistico
La relacion entre el estado de mutacion de IDH1/IDH2 y la expresion de la protema BCAT1 (Fig. 1k) se ensayo con el test exacto de Fisher. El test t de Student (de dos colas, no emparejado) se uso para las demas comparaciones estadfsticas. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001.
Ejemplo 2
Inhibicion de la proliferacion celular por Gabapentina
Las lmeas celulares de glioblastoma humano U87-MG (HTB-14), HS683 (HTB-138) y U373-MG (HTB-17; LGC Standards, Teddington TW11 OLY, Reino Unido) se cultivaron en medio esencial mmimo de Dulbecco suplementado con 10% suero bobino fetal y 1% de mezcla de penicilina /estreptomicina. Se sembraron 5x104 celulas/pocillo en placas de 24 pocillos en un volumen total de 500 pl de medio de cultivo celular. El medio se retiro 4 horas despues de la siembra de las celulas, y se reemplazo con 500 pl de medio que contema acido 1-(aminometil)-ciclohexano acetico (Gabapentina, disuelta en tampon HEPES 200 mM a una concentracion de 500 mM) a concentraciones finales de 5 mM, 10 mM y 20 mM, respectivamente. Se anadieron volumenes correspondientes de HEPES 200 mM a los pocillos de control respectivos. 5 horas despues de intercambiar el medio, se anadio 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU Carlsbad, CA 92008, EE. UU.) con el fin de medir la proliferacion celular usando el kit Click-iT® de proliferacion de Invitrogens (Carlsbad, CA 92008, EE. UU.). Las celulas se recogieron 16 horas despues de la aplicacion EdU y la proliferacion se midio segun las instrucciones del fabricante, usando un citometro de flujo BD Biosciences FACS Canto II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ 07417 EE. UU.). Se obtuvieron tres mediciones repetidas para cada tratamiento. En todas las lmeas celulares se observo una reduccion significativa dependiente de la concentracion de la proliferacion celular de aproximadamente el 20-55% en las celulas tratadas con gabapentina en comparacion con las celulas tratadas “mock”. Los resultados se muestran en la Figura 10.
Ejemplo 3
Inhibicion de la proliferacion celular por oligonucleotidos antisentido BCAT1
Se produjeron vectores lentivirales mediante co-transfeccion de celulas HEK293T con constructos psPAX2 (Addgene 12260, Didier Trono, vector de empaquetamiento), pMD2.G (Addgene 12259, Didier Trono, plasmido de envoltura) y pLKO.1 ARNhc (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, EE. UU.). Las transfecciones se llevaron a cabo usando TransIT®- LT1 (Mirus Bio LLC, Madison, WI 53711, EE. UU.) y el virus se recogio a las 48 y 72 horas despues de la transfeccion. Se 5 usaron dos constructos ARNhc independientes dirigidos a regiones diferentes del transcrito de ARNm BCAT1: MISSION shRNA TRCN0000005907 NM_005504.3-1064s1c1 (shRNA1) y TRCN0000005909 NM_005504.3-751s1c1 (shRNA2); todos de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, EE. UU.. Se uso ARNhc no dirigido como control.
Las lmeas celulares de glioblastoma humano U87-MG (HTB-14), HS683 (HTB-138) y U373-MG (HTB-17; LGC Standards, Teddington TW11 OLY, Reino Unido) se sembraron en placas de 24 pocillos (5x104 celulas /pocillo) en un 10 volumen total de 500 pl de medio de cultivo celular. Despues de 24 horas, las celulas fueron transducidas con virus en presencia de 8 pg/ml de polibreno. El sobrenadante que contema virus se retiro despues de 24 horas y las celulas se dividieron los dfas 3 y 5 despues de la transduccion. Se detecto una menor expresion de ARNm BCAT1 y de protema usando PCR cuantitativa en tiempo real y transferencia Western (anticuerpo ECA39, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA 92121, EE. UU.). Se llevo a cabo un ensayo de proliferacion en el dfa 6 usando el kit de proliferacion celular 15 Click-iT® EdU despues de incubar las celulas con EdU 10 pM durante 16 horas. En todas las celulas transducidas con ARNhc BCAT1 se observo una reduccion de la proliferacion en el intervalo 20-80% dependiendo de la lmea celular. Estos resultados se muestran en la Figura 11.
Ejemplo 4
Determinacion de la sobreexpresion de BCAT1 en glioblastomas IDH”1
20 Los analisis de prediccion de micromatrices con relacion a los datos de expresion genica de gliomas astrodticos de grados OMS II, III y IV identificaron la BCAT1 como el mejor clasificador que distingue el glioblastoma primario de otros astrocitomas, tal como puede observarse en la Tabla 3 siguiente:
Rango
Sfmbolo de gen Puntuacion AII_AAIII_sGBIV Puntuacion pGBIV
1
BCAT1 -0,530 0,435
2
CHI3L1 -0,503 0,413
3
TIMP1 -0,492 0,404
4
IGFBP2 -0,453 0,372
5
PDPN -0,448 0,368
6
SERPINE1 -0,442 0,363
7
EMP3 -0,436 0,358
8
ADM -0,413 0,338
9
PTX3 -0,403 0,331
10
COL6A2 -0,399 0,327
11
NNMT -0,396 0,325
12
LIF -0,393 0,323
13
STEAP3 -0,371 0,304
14
COL6A2 -0,371 0,304
15
POSTN -0,361 0,296
16
KCNE4 -0,359 0,295
17
ABCC3 -0,348 0,286
(Cont.)
18
FABP5 -0,343 0,282
19
LOX -0,342 0,281
20
RANBP17 0,339 -0,278
21
MOXD1 -0,337 0,276
22
ADAM12 -0,336 0,276
23
RBP1 -0,331 0,272
24
OCIAD2 -0,330 0,270
25
SAA2 -0,320 0,263
26
FMOD -0,319 0,262
27
PBEF1 -0,317 0,260
28
ATP7B -0,316 0,259
29
SOCS3 -0,315 0,259
30
PLAT -0,314 0,258
31
RARRES2 -0,312 0,256
32
RAB34 -0,305 0,250
33
VEGF -0,304 0,249
34
RBP1 -0,303 0,249
35
SAA1 -0,302 0,248
36
NA 0,300 -0,246
37
PCDH15 0,296 -0,243
38
AL354720.14 -0,293 0,240
39
PBEF1 -0,291 0,239
40
EFEMP2 -0,291 0,238
41
IL8 -0,288 0,236
42
UPP1 -0,284 0,233
43
ANXA2 -0,282 0,231
44
TNFRSF12A -0,279 0,229
45
ANGP72 -0,273 0,224
46
ANXA2 -0,272 0,224
47
EMILIN2 -0,272 0,223
48
TMEM158 -0,268 0,220
49
VEGF -0,262 0,215
50
PHYHIPL 0,262 -0,215
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50
55
Cuando se clasificaron los tumores en base al estado de mutacion IDH, los niveles de expresion de ARNm BCAT1 fueron significativamente mayores para los gliomas IDH"1 con relacion a los gliomas IDHmut (Fig. 1b;. P < 0,0001; test t de Student de dos colas), mientras que no se observaron niveles comparativamente mejorados para la expresion de BCAT2 (Fig. 1c; P = 0,0301). Un analisis de vfas mostro que, ademas de BCAT1, la expresion de ARN de diversos otros genes de la ruta catabolica BCAA se regulo positivamente en tumores IDH"1 en comparacion con tumores IDHmut (Fig. 7). En consonancia con los resultados de expresion de ARN, un analisis de transferencia Western mostro que la expresion de la protema BCAT1 era alta en tumores IDH"1, pero estaba esencialmente ausente en tumores IDHmut, independientemente de la mutacion espedfica en cualquiera de entre IDH1 e IDH2 (Fig. 1d). La secuenciacion tanto de las regiones de promotor como las de codificacion de para 20 gliomas no revelo mutaciones putativas sin sentido ni activadoras. La estrecha correlacion observada entre la mutacion IDH1o IDH2 y la expresion de BCAT1 se confirmo adicionalmente mediante tincion inmunohistoqmmica de secciones de 81 gliomas humanos primarios (77 astrocitomas, 4 oligodendrogliomas), de entre los cuales 45 de 46 de tumores IDH"1 mostraron una fuerte tincion BCAT1 (Fig. 1e.), mientras que 35 de 35 tumores con mutaciones en IDH1 (30 R132H, 1 R132C, 1 R132S) o IDH2 (3 R172K) eran negativos para BCAT1 (Fig. 1f-h.); (P < 0,0001; test exacto de Fisher; Fig. 1k). Por lo tanto, el patron de tincion BCAT1 es en gran medida complementario al patron obtenido con el anticuerpo ampliamente usado contra la protema mutante IDH1-R132H (Fig. 1i, j). Sin embargo, a diferencia de la tincion IDH1-R132H, el anticuerpo BCAT1 distingue tambien los tumores IDH1 (Fig. 1e) de los tumores con mutaciones IDH1 y IDH2 menos comunes que no son reconocidos por los anticuerpos anti-IDH1-R132H (Fig. 1g-h). Estos datos muestran que la alta expresion de BCAT1 es un rasgo caractenstico de los gliomas IDH"1 que puede ser usado para identificar positivamente estos tumores en un entorno de diagnostico.
Ejemplo 5
Determinacion de la expresion dependiente de sustrato de BCAT1
Se encontro que BCAT1 se expresa fuertemente en las lmeas celulares de glioblastoma LN-229, U-87MG, U-373MG y en menor medida en A172 (Fig. 2a), todas las cuales se confirmo que teman los genes IDH1 y IDH2 de tipo salvaje. La expresion de BCAT1 se elevo tambien en la lmea celular HS683, derivada originalmente de un oligodendroglioma, pero sin embargo muestra un genotipo IDH"t. De esta manera, todas estas lmeas celulares pueden considerarse como modelos adecuados para el estudio de la funcion de BCAT1. La expresion de ARN BCAT1 y de protemas se regulo positivamente bajo condiciones hipoxicas, que estan presente frecuentemente en el glioblastoma (Fig. 2B). La expresion de BCAT1 estaba correlacionada con la concentracion del sustrato alfa-KG y se regulo positivamente despues de aumentar la concentracion de sustrato dimetil-alfa-KG permeable a las celulas en el medio de cultivo (Fig. 2c). Por el contrario, el silenciamiento de IDH1 mediado por ARNhc, una fuente importante de alfa-KG en el citoplasma, condujo a una fuerte regulacion negativa de la expresion de BCAT1 (Fig. 2d).
Ejemplo 6
Expresion de BCAT1 regulada de manera diferencial mediante metilacion de ADN en dos promotores alternativos
Para aclarar adicionalmente la regulacion diferencial de la expresion de BCAT1 en gliomas IDH"t y gliomas IDHmut, se cuantifico la expresion del transcrito en muestras de pacientes. Usando RT-PCR y secuenciacion, se confirmaron la expresion de tres transcritos BCAT1 codificadores de protema que figuran en la base de datos Ensembl en tumores IDH"t primarios astrocfticos, asf como en un grupo de 23 tejidos de cerebros normales (Fig. 9). Estos tres transcritos (T1, T4 y T6) codifican protemas de 386, 398, y 385 aminoacidos, la totalidad de los cuales corresponden a la banda de protema unica de 43 kD segun se identifica mediante analisis de transferencia Western. Estos transcritos se originan a partir de dos promotores alternativos (Fig. 3a) y se diferencian solo en sus primeros exones, que codifican 2, 14 y 1 aminoacidos en T1, T4 y T6, respectivamente. Una qRT-PCR especfica de transcrito identifico T6 como el transcrito predominante que representa el 73% de todos los ARNm BCAT1 en tumores primarios (Fig. 3b). En particular, la expresion de todos los transcritos BCAT1 fue significativamente mas alta en los tumores IDH"1 en comparacion con los tumores IDHmut.
Para investigar los posibles mecanismos de regulacion transcripcional de BCAT1, se realizaron analisis cuantitativos de la metilacion del ADN sobre los astrocitomas de todos los grados usando un analisis MassARRAY de productos de PCR amplificados a partir de ADN tratado con bisulfito que cubre los dos promotores alternativos (Fig. 3c). Se observaron diferentes patrones de metilacion para los tumores IDH"1 y los tumores IDHmut. El principal promotor (promotor 2) estaba hiper-metilado en los tumores IDHmut, pero principalmente no metilado en los tumores IDH"1 y el cerebro normal (Fig. 3c, panel derecho). El grado medio de metilacion de los amplicones A6 y A7 esta fuertemente asociado con el estado de mutacion de IDH1 (Fig. 3d). Estos datos muestran la supresion de los transcritos T4 y T6 por la metilacion del promotor-2 en los tumores IDHmut. El promotor 1 (Fig. 3c, panel izquierdo) estaba principalmente no metilado en todas las muestras tumorales, asf como en el cerebro normal, con la exception de un tramo de secuencias hiper-metiladas inmediatamente aguas arriba de la isla CpG. Dentro de esta region aguas arriba, se identificaron tres dinucleotidos CpG metilados de manera diferencial entre los tumores IDH"1 y los tumores IDHmut en las posiciones -699/-697 (CpG4;5) y -660 (CpG6) en el amplicon A2. En contraste con el patron de metilacion en el promotor 2, CpG4;5 (Fig. 3e) y CpG6 (Fig. 3f) mostraron una metilacion significativamente menor en los tumores IDHmut que en los tumores IDH"1. El grado de metilacion en esta
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region metilada de manera diferencial (DMR) estaba correlacionado con la expresion del transcrito T1 BCAT1 en los tumores IDH'"1, apoyando su relevancia funcional (Fig. 3g). El patron de metilacion especfica de CpG observado es consistente con la union del represor al DMR que conduce a la regulacion negativa de T1. Los datos ChIPseq hadan sugerido previamente la union del represor HEY1 al promotor 1 BCAT1 pero no al promotor 2 (Fig. 3a). El analisis de los datos de expresion de ARN confirmo la sobreexpresion del represor HEY1 en tumores astrodticos en comparacion con el cerebro normal. De manera consistente con la actividad del represor HEY1, el silenciamiento de HEY1 mediado por ARNip en celulas HEK293T aumento la expresion del transcrito T1 (Fig. 3 h,i). El analisis ChIP demostro que, en comparacion con una region de control aguas arriba y una region cerca del sitio de inicio de traduccion, la union mas fuerte de dos constructos HEY1 diferentes se produce en el DMR (Fig. 3j,k). En conjunto, estos datos muestran fuertemente que la expresion diferencial de transcritos BCAT1 en astrocitomas esta regulada por la metilacion del ADN que implica una amplia metilacion del promotor 2 en los tumores IDHmut y metilacion especfica de sitio CpG en un sitio de union de represor HEY1 en el promotor 1 de los tumores IDH"1.
Ejemplo 7
Reduccion de la liberacion de glutamato por las celulas de glioblastoma mediante la supresion de BCAT1
Para comprender mejor el papel funcional de la BCAT1 en glioblastomas, lmeas celulares U-87MG y lmeas celulares U- 373MG se trataron con gabapentina, un analogo de leucina que inhibe espedficamente BCAT1, pero no BCAT2. La espectroscopia 1H-NMR de los extractos de celulas tratadas con gabapentina 20 mM durante 20 horas demostro la acumulacion intracelular de BCAAs, consistente con la inhibicion de BCAT1 (Fig. 4ab). El glioblastoma libera altas concentraciones de glutamato, que conduce a la muerte neuronal por un mecanismo excitotoxico. La liberacion de glutamato se redujo significativamente con la inhibicion de BCAT1 con gabapentina (Fig. 4c), que indica que BCAT1 es un contribuyente principal a la produccion de glutamato a traves de catabolismo BCAA en el glioma IDH"1.
Para confirmar independientemente estos hallazgos, se llevo a cabo un silenciamiento de BCAT1 mediado por ARNhc en celulas U-87MG, U-373MG y HS683 usando dos ARNhcs dirigidos a los tres transcritos BCAT1. Un analisis tandem-MS de los medios de cultivo de celulas U-87MG despues de una incubacion de 24 horas revelo que la liberacion de glutamato, asf como la captacion de BCAA, se redujeron en las celulas con silenciamiento BCAT1 en comparacion con las celulas de control (Fig. 4d). Tambien se observo un aumento significativo en la liberacion de alanina, glicina y treonina. La cuantificacion de las concentraciones de aminoacidos intracelulares revelo acumulaciones significativas de aspartato, glicina y treonina (Fig. 4e). Se observo tambien una pequena pero significativa acumulacion de glutamato despues del silenciamiento de BCAT1; sin embargo, teniendo en cuenta la alta relacion de volumen de los medios al volumen intracelular, la concentracion total de glutamato no se ve afectada de manera significativa por esta pequena acumulacion intracelular. En los ratones con silenciamiento BCAT2, la inhibicion del catabolismo de BCAA resulta en altas concentraciones de BCAA y tasas mas altas de smtesis de protemas en los tejidos perifericos actuando mecanicamente sobre la ruta de senalizacion de rapamicina (mTOR) y un aumento compensatorio de la degradacion de protemas (aumento del recambio de protemas).
El silenciamiento de BCAT1 condujo a una fuerte regulacion negativa de 3-hidroxiacil CoA deshidrogenasa (HADH), una enzima que participa en el catabolismo de valina e isoleucina aguas abajo de BCAT1 (Fig. 4f, g). Debido a que HADH es muy importante en el metabolismo del acido graso, el silenciamiento de BCAT1 alterana tambien la smtesis o degradacion de acidos grasos esenciales para la smtesis de membrana.
Ejemplo 8
Limitacion de la migracion de glioblastoma en microcanales mediante el silenciamiento de BCAT1
El silenciamiento de BCAT1 afecto fuertemente a la morfologfa celular, resultando en una apariencia redondeada, menos extendida (Fig. 5a-b). Para probar si estos cambios de morfologfa podnan afectar a la capacidad de las celulas tumorales de invadir tejidos adyacentes, se uso un chip de migracion con microcanal para simular un entorno tridimensional (Fig. 5c). Despues del silenciamiento de BCAT1, la mayona de las celulas U-87MG (55%) penetro distancias cortas en los microcanales, pero no fueron capaces de deformarse activamente con el fin de invadir completamente los microcanales mientras que la mayona de las celulas de control (78%) invadieron completamente los canales (Fig. 5d). Esta menor invasividad de las celulas con silenciamiento BCAT1 podrfa ser debida a la composicion de membrana alterada causada por la menor abundancia observada de acidos grasos de cadena larga y las diferencias en el metabolismo del colesterol (Fig. 4g); dichos cambios podnan afectar suficientemente a la disponibilidad general de los componentes de membrana, asf como a la elasticidad de la membrana para impedir la invasion de celulas.
Ejemplo 9
BCAT1 es esencial para el crecimiento del glioblastoma
Se llevaron a cabo experimentos para evaluar el impacto de la BCAT1 sobre la proliferacion, inhibicion y silenciamiento de
celulas tumorales. Se observo una reduccion dependiente de la concentracion de la proliferacion de hasta el 56%, estimada en base a la incorporacion de EdU, tras el tratamiento con el inhibidor gabapentina (Fig. 6a). Los analisis del ciclo celular sugirieron que el tratamiento con gabapentina indujo la detencion parcial, indicada por un aumento de la fraccion de celulas en la fase G1 con disminuciones concurrentes de las fracciones G2 y S (Fig. 6b). El silenciamiento de 5 BCAT1 mediado por ARNhc provoco efectos similares (Fig. 6c, d). El silenciamiento de BCAT1 redujo la proliferacion un 20-70% en las tres lmeas celulares (Fig. 6c) y condujo a la detencion G1 y fuertes incrementos en CDKN1B /p27KIP1 celular. En particular, el grado de acumulacion de CDKN1B/p27KIP1 mostro una correlacion positiva con el tamano de la fraccion G1 (Fig. 6d). La muerte celular, indicada por la fraccion de celulas en la fase sub-G1, se mantuvo por debajo del 5%, excepto en el caso de Hs683, que mostro un aumento moderado tal como se muestra en la Tabla 4 siguiente.
Lmea celular
Tratamiento Promedio sub-G1 [%] STDEV sub-G1
U87-MG
ARNhc nt 2,1 0,241
ARNhcl BCAT1 1,4 0,100
ARNhcll BCAT1 1,9 0,058
Gabapentina 20 mM 2,4 0,354
Control (HEPES) 1,4 0,707
U373-MG
ARNhc nt 2,4 0,283
ARNhcl BCAT1 1,1 0,045
ARNhcll BCAT1 2,7 0,141
Gabapentina 20 mM 2,8 0,283
Control (HEPES) 1,4 0,212
HS683
ARNhc nt 13,3 1,344
ARNhcl BCAT1 21,4 0,424
ARNhcll BCAT1 16,7 2,263
Gabapentina 20 mM 10,1 0,849
Control (HEPES) 2,2 0,424
10
Se observaron reducciones comparables de proliferacion celular tras el silenciamiento de BCAT1 en cultivos de esferoides primarios de glioblastoma en medio libre de suero, excepto que estas celulas mostraron una mayor tasa de apoptosis tal como se determina mediante tincion Anexina V/7AAD (Fig. 9). De manera consistente con la reduccion observada en la proliferacion, el silenciamiento de BCAT1 condujo a una disminucion de la fosforilacion del homologo de oncogen viral 15 timoma murino v-akt (AKT) en celulas U-87MG, U-373MG y Hs683 (Fig. 6e).
El efecto del silenciamiento de BCAT1 sobre el crecimiento tumoral en vivo se evaluo mediante un trasplante intracerebral de celulas U-87MG en ratones CD-1 atfmicos (Fig. 6f-h). Cuatro semanas despues del trasplante de igual numero de celulas vivas, los 6 ratones de control, pero solo 1 de 6 ratones trasplantados con celulas transducidas ARNhc BCAT1 mostraron smtomas neurologicos tales como letargo o actividades motoras no coordinadas. La tincion con hematoxilina y 20 eosina de secciones de cerebro de raton revelo grandes tumores en los ratones trasplantados con celulas de control (Fig. 6f) mientras que se encontraron tumores significativamente menores en los ratones trasplantados con celulas con silenciamiento BCAT1 (Fig. 6g). Un analisis cuantitativo confirmo diferencias significativas en el volumen del tumor entre los grupos (Fig. 6h, P = 0,0091).

Claims (10)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto capaz de reducir o inhibir (a) la actividad biologica de la aminotransferasa-1 de cadena ramificada (BCAT1) o (b) la expresion del gen que codifica BCAT1 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un tumor cerebral, en el que el tumor cerebral es un glioma o glioblastoma.
  2. 2. Compuesto para el uso segun la reivindicacion 1, en el que dicho compuesto es un oligonucleotido antisentido o ARNip que reduce o inhibe la expresion del gen que codifica BCAT1.
  3. 3. Compuesto para el uso segun la reivindicacion 1, en el que dicho compuesto es un compuesto que reduce o inhibe la actividad biologica de BCAT1.
  4. 4. Compuesto para el uso segun la reivindicacion 3, en el que dicho compuesto es acido l-(aminometil) ciclohexano acetico.
  5. 5. Compuesto para el uso segun la reivindicacion 3, en el que dicho compuesto es un anticuerpo dirigido contra BCAT1 o un fragmento de la misma.
  6. 6. Compuesto para el uso segun la reivindicacion 1, en el que dicho compuesto es una version inactiva de BCAT1.
  7. 7. Compuesto para el uso segun la reivindicacion 1, en el que el tumor cerebral a tratar muestra (sobre)expresion de BCAT1.
  8. 8. Compuesto para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el tumor cerebral es un glioblastoma IDH*1.
  9. 9. Un procedimiento de identificacion de un compuesto que reduce o inhibe la actividad biologica de BCAT1 o la expresion del gen que codifica BCAT1 para su uso en el tratamiento de un tumor cerebral, en el que el tumor cerebral es un glioma o glioblastoma, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
    (a) incubar un compuesto candidato con un sistema de ensayo que comprende BCAT1 o el gen que codifica BCAT1;
    y
    (b) ensayar una actividad biologica de BCAT1;
    en el que una inhibicion o una perdida de la actividad biologica de BCAT1 es indicativa de la presencia de un compuesto candidato que tiene la propiedad deseada.
  10. 10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, en el que la inhibicion o la perdida de la actividad biologica de BCAT1 se determina mediante una comparacion con un sistema de ensayo caracterizado por la ausencia de dicho compuesto de ensayo.
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