KR20080079264A

KR20080079264A - 고안압증／녹내장을 치료하기 위한 ＲＨＯ 키나아제의ＲＮＡｉ-매개 억제

Info

Publication number: KR20080079264A
Application number: KR1020087014716A
Authority: KR
Inventors: 존 이. 차테르톤; 애보트 에프. 클라크
Original assignee: 알콘 리서치, 리미티드
Priority date: 2005-12-27
Filing date: 2006-12-19
Publication date: 2008-08-29
Also published as: US20070149473A1; CA2631840A1; JP2009532325A; WO2007076367A2; EP2592144A1; RU2432165C2; JP2012193210A; US20120178794A1; RU2011124528A; TW200731979A; WO2007076367A3; AR057252A1; US20090275641A1; CN101326285A; AU2006330606A1; ZA200805599B; BRPI0621264A2; US20110245319A1; RU2008130855A; CA2821393A1

Abstract

눈 장애, 특히 안압, 고안압증 및 녹내장을 갖는 환자를 치료하기 위한 Rho 키나아제 mRNA 억제용 RNA 간섭이 제공된다. Rho 키나아제 mRNA 표적은 ROCK1 및ROCK2를 위한 mRNA를 포함한다.

Description

고안압증／녹내장을 치료하기 위한 ＲＨＯ 키나아제의 ＲＮＡｉ-매개 억제{RNAi-MEDIATED INHIBITION OF RHO KINASE FOR TREATMENT OF OCULAR HYPERTENSION/GLAUCOMA}

본 발명은 안구 장애, 특히 고안압증 및 녹내장의 치료에서 안압을 줄이기 위하여 Rho 키나아제 mRNA 표적의 발현을 억제하기 위한 간섭 RNA 조성물 분야에 관한 것이다.

녹내장은 특정한 임상적 특징을 공유하는 시신경병증의 이질적 그룹이다. 녹내장에서의 시력 손실은 시야에서의 특징적 변화, 신경 섬유층 결손 및 시신경유두(optic nerve head; ONH)의 점진적 함몰에 의해 임상적으로 진단되는 신경 망막에서의 망막 신경절 세포의 선택적 죽음에 기인한다. 녹내장의 진행을 위한 주요 위험 인자 중 하나는 고안압증(OHT), 이를 테면 증가된 안압, IOP의 존재이다. 적당한 IOP는 눈의 모양을 유지하며, 무혈관 각막 및 수정체로 안방수(aqueous humor)의 흐름을 위한 압력 구배를 제공하기 위하여 필요하다. 또한 IOP 수준은 IOP 저하 약제로부터 효과를 얻은 환자가 증명하듯이, 정상 안압 녹내장(normal tension glaucoma; NTG)의 발병기전과도 관련있다. NTG 환자에서 중심 각막 두께의 조정이 IOP로 판독되는 경우, 이러한 환자의 다수가 고안압증으로 밝혀졌다.

녹내장과 관련된 증가된 IOP는 안구 전방 챔버의 홍채-각막 각에 위치하는 특수화된 작은 조직인, 소주망(trabecular meshwork; TM)에서 증가된 안방수 유출에 대한 저항에서 기인한다. TM에 대한 녹내장성 변화는 TM 세포 손실 및 단백질성 플라그 유사물질을 포함하는 세포외 파편의 침착 및 축적을 포함한다. 더불어, 녹내장성 ONH에서 발생하는 변화가 존재한다. 녹내장성 눈에서는 ONH 아교 세포에서의 형태학적 및 이동성 변화가 있다. 증가된 IOP 및/또는 일과성 허혈 발작에 대응하여, ONH 세포외 기질 조성의 변화 및 아교 세포 및 망막 신경절 세포 엑손 형태학에서의 변질이 있다.

일차성 녹내장은 해부학적 또는 생리학적 근거를 갖는 안구액 흐름의 방해로부터 기인한다. 이차성 녹내장은 눈에 대한 상처 또는 외상, 또는 앞서 존재했던 질환의 결과로 기인한다. 또한 만성적 또는 단순한 녹내장으로 알려진 일차성 개방우각 녹내장(Primary open-angle glaucoma; POAG)은 모든 일차성 녹내장의 대부분을 나타낸다. POAG는 소주망의 변성에 의해 특정지어 지며, 이러한 소주망의 변성은 눈으로부터의 액체 분비에 대한 비정상적 저항을 초래한다. 이러한 저항의 결과로 IOP가 증가되고, 증가된 저항에 대하여 눈에서는 정상적으로 생산된 액체가 요구된다.

Rho 키나아제 또는 ROCK로도 알려진 Rho-관련된 코일드 코일(coiled-coil) 함유 단백질 키나아제는 작은 GTP-결합 단백질의 Rho 패밀리(Rho GTPase)의 작용자이다. Rho GTPase 신호 경로는 예를 들어, 소주망(TM) 및/또는 섬모체근(CM) 세포의 세포 골격 형성을 변경하여 안방수 유출을 조절하는 데 역할을 수행하는 것으로 나타난다. Rho 키나아제의 소분자 억제제는 TM 세포 형태 및 세포 골격 형성에서 가역적인 변화를 유발하며, 분리된 CM 조직의 수축성을 감소시키고 기관 배양에서 안방수 유출능을 증가시킨다 (Waki M. et al, Curr Eye Res. 22:470-4 (2001); Honjo M. et al, Invest Ophthalmol Vis ScL 42:137-44 (2001); Rao PV. et al., MoI Vis. 11 :288-97 (2005); Rao PV. et al., Invest Ophthalmol Vis ScL 42:1029-37 (2001)). 우성의 음성 Rho-결합 도메인의 발현에 의하여 유사 효과가 생성된다. 그러나, Rho 키나아제의 소분자 억제제로의 치료는 또한 혈관 확장 및 결막의 충혈을 유발한다. 또한, 소분자-기초의 요법의 효능은 상대적으로 매일 반복된 투여가 요구되며 반감기가 짧고, 일부 경우에, 시간에 따라 효능이 감소한다.

이전 치료 방법의 부작용 및 녹내장에서 고안압증의 중요성의 측면에서, 고안압증을 치료하는 개선된 방법을 갖는 것이 바람직할 것이다.

본 발명의 요약

본 발명은 Rho 키나아제 mRNA 발현을 침묵시키고, 이에 따라, 고안압증 또는 녹내장이 있거나, 고안압증 또는 녹내장이 발생할 위험에 있는 환자에서 안압을 낮추는 간섭 RNA에 관한 것이다. Rho 키나아제 표적은 ROCK1 (ROCKI, ROKβ, 또는 p160ROCK로도 알려짐) 및 ROCK2 (ROCKII 또는 ROKα로도 알려짐)를 포함한다. 본 발명의 간섭 RNA는 고안압증 또는 녹내장, 이를 테면 정상 안압 녹내장 및 개방각 녹내장이 있는 환자를 치료하는 데 유용하다.

본 발명의 일구체예는 대상에서 Rho 키나아제 mRNA의 발현을 약화시키는 방 법을 제공한다. 상기 방법은 19개 내지 49개 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 인간에서 고안압 표적의 발현을 약화시키기 위하여 대상의 눈에 투여된다.

본 발명의 일 구체예에서, 간섭 RNA는 센스 뉴클레오티드 가닥, 안티센스 뉴클레오티드 가닥 및 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 포함한다. 더욱이, 안티센스 가닥은 생리적 조건 하에서 각각 ROCK1 및 ROCK2를 암호화하는 센스 cDNA 서열인 서열 번호 1 또는 서열 번호 2(각각 GenBank 수탁 번호 NM_005406 및 NM_004850)에 상응하는 mRNA의 부분에 혼성화한다. 안티센스 가닥은 각각 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는다. 그러한 조성물의 투여는 대상에서 Rho 키나아제의 발현을 약화시킨다.

본 발명의 일 구체예에서, 간섭 RNA는 뉴클레오티드 605, 653, 659, 1248, 1562, 1876, 2266, 2474, 2485, 2740, 2808, 2834, 3007, 3146, 3199, 3245, 3379, 3453, 3511, 3513, 3519, 3781, 3782, 998, 1132, 1200, 1648, 1674, 1708, 또는 2077을 포함하는 서열 번호 1에 상응하는 mRNA를 표적으로 하도록 설계된다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 간섭 RNA는 뉴클레오티드 1102, 1865, 2000, 2229, 2514, 2584, 2738, 3305, 4111, 4652, 5184, 5187, 5255, 5315, 5439, 5450, 5578, 5579, 5611, 5625, 5795, 6000, 6228, 6264, 584, 1337, 1678, 2773, 2814, 2941, 3357, 3398, 3481, 3633, 3644, 3645, 3767, 3836, 4023, 4097, 5202, 또는 5440을 포함하는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA를 표적으로 하도록 설계된다.

본 발명은 또한 제1 간섭 RNA 외에, 대상에 투여하기 위한 제2 간섭 RNA를 제공한다. 상기 방법은 19개 내지 49개 뉴클레오티드 길이를 가지며, 센스 뉴클레오티드 가닥, 안티센스 뉴클레오티드 가닥 및 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 영역을 포함하는 제2 간섭 RNA를 대상에 투여하는 것을 포함한다; 여기에서, 제2 간섭 RNA의 안티센스 가닥은 생리적 조건 하에서 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA의 제2 부분에 혼성화하고, 안티센스 가닥은 각각 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA의 제2 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는다. 제2 간섭 RNA는 제1 간섭 RNA로서 동일한 mRNA와 표적으로 할 수 있거나, 다른 mRNA를 표적으로 할 수 있다. 또한, 제3, 제4, 또는 제5 등의 간섭 RNA가 동일한 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 또다른 구체예는 19개 내지 49개 뉴클레오티드 길이를 갖는 단일-가닥 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하여, 대상에서 Rho 키나아제의 발현을 약화시키는 방법이다.

ROCK1의 발현을 약화시키기 위하여, 단일-가닥 간섭 RNA는 생리적 조건 하에서 뉴클레오티드 605, 653, 659, 1248, 1562, 1876, 2266, 2474, 2485, 2740, 2808, 2834, 3007, 3146, 3199, 3245, 3379, 3453, 3511, 3513, 3519, 3781, 3782, 998, 1132, 1200, 1648, 1674, 1708, 또는 2077를 포함하는 서열 번호 1에 상응하 는 mRNA의 부분에 혼성화하며, 간섭 RNA는 서열 번호 1에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는다. 이에 따라, ROCK1의 발현은 약화된다.

ROCK2의 발현을 약화시키기 위하여, 단일-가닥 간섭 RNA는 생리적 조건 하에서 뉴클레오티드 1102, 1865, 2000, 2229, 2514, 2584, 2738, 3305, 4111, 4652, 5184, 5187, 5255, 5315, 5439, 5450, 5578, 5579, 5611, 5625, 5795, 6000, 6228, 6264, 584, 1337, 1678, 2773, 2814, 2941, 3357, 3398, 3481, 3633, 3644, 3645, 3767, 3836, 4023, 4097, 5202, 또는 5440를 포함하는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA의 부분에 혼성화하며, 간섭 RNA는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분을 가지며 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는다. 이에 따라, ROCK2의 발현은 약화된다.

본 발명의 다른 구체예는 그를 필요로 하는 대상에서 고안압증 또는 녹내장을 치료하는 방법이다. 상기 방법은 19개 내지 49개 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상의 눈에 투여하는 것을 포함하며, 간섭 RNA는 센스 뉴클레오티드 가닥, 안티센스 뉴클레오티드 가닥 및 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 포함한다. 안티센스 가닥은 생리적 조건 하에서 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA의 부분에 혼성화하며, 각각 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는다. 이에 따라, 고안압증 또는 녹내장이 치료된다.

본 발명의 또다른 구체예는 그를 필요로 하는 대상에서 고안압증 또는 녹내장을 치료하는 방법이며, 이 방법은 19개 내지 49개 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상의 눈에 투여하는 것을 포함하며, 간섭 RNA는 서열 번호 3 및 서열 번호 9 내지 서열 번호 79 중 어느 하나에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째 13개 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하며, 이에 따라, 고안압증 또는 녹내장이 치료된다.

본 발명의 또다른 구체예는 19개 내지 49개 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하여, 대상에서 Rho 키나아제 표적 mRNA의 발현을 약화시키는 방법이며, 여기에서, 간섭 RNA는 다음과 같은 서열 번호 3 및 서열 번호 9 내지 서열 번호 79 중 어느 하나에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다.

Rho 키나아제 표적 mRNA가 ROCK1 mRNA인 경우, 간섭 RNA는 서열 번호 3, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 또는 서열 번호 79에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다.

Rho 키나아제 표적 mRNA가 ROCK2 mRNA인 경우, 간섭 RNA는 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 45, 서열 번호 46, 서열 번호 47, 서열 번호 48, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 서열 번호 55, 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 64, 서열 번호 65, 서열 번호 66, 서열 번호 67, 서열 번호 68, 서열 번호 69, 서열 번호 70, 서열 번호 71, 또는 서열 번호 72에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 인접 뉴클레오티드 영역은 서열 식별자의 서열에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째 14개 뉴클레오티드와 적어도 85% 서열 상보성 또는 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드 영역이다. 본 발명의 또다른 구체예에서, 인접 뉴클레오티드 영역은 서열 식별자에 의해 확인된 표적 서열에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째의 각각 15, 16, 17 또는 18 뉴클레오티드와 적어도 80% 서열 상보성 또는 적어도 80% 서열 동 일성을 갖는 적어도 15, 16, 17 또는 18개의 인접 뉴클레오티드 영역이다.

본 발명의 다른 구체예에서, RNA 간섭을 통하여 ROCK1 또는 ROCK2 유전자의 발현을 하향 조절하는 이중 가닥 siRNA 분자를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하여, 그를 필요로 하는 대상에서 고안압증을 치료하는 방법이며, 여기에서 siRNA 분자의 각 가닥은 독립적으로 약 19개 내지 27개 뉴클레오티드 길이이며; siRNA 분자의 한 가닥은 각각 ROCK1 또는 ROCK2 유전자에 상응하는 mRNA에 실질적으로 상보성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하여, siRNA 분자는 RNA 간섭을 통하여 mRNA의 절단을 지시한다.

서열 번호 3 및 서열 번호 9 내지 서열 번호 79 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보물(complement)을 가지며 19개 내지 49개 뉴클레오티드 길이인 간섭 RNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물은 본 발명의 일 구체예이다. 일 구체예에서, 간섭 RNA는 분리된다. 용어 "분리된"은 간섭 RNA가 그의 본래 환경 전체로부터 자유로운 것을 의미한다.

본 발명의 또다른 구체예는 RNA 간섭을 통하여 ROCK1 또는 ROCK2 유전자의 발현을 하향 조절하는 이중 가닥 siRNA 분자를 포함하는 조성물이며, 여기에서, siRNA 분자의 각 가닥은 독립적으로 약 19개 내지 약 27개 뉴클레오티드 길이이며; siRNA 분자의 한 가닥은 ROCK1 또는 ROCK2 유전자에 각각 상응하는 mRNA에 실질적으로 상보성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하여, siRNA 분자는 RNA 간섭을 통하여 mRNA의 절단을 지시한다.

현재 소분자 요법의 원치 않는 부작용, 예를 들어, 충혈이 안압을 낮추는 바 람직한 효과로부터 분리될 수 있기 때문에 본 발명은 Rho 키나아제 소분자 억제제에 비해 장점을 제공한다.

ROCK1 또는 ROCK2 mRNA의 발현을 약화시키기 위한 의약의 제조에서 본원에 개시된 바와 같은 임의의 구체예의 용도도 본 발명의 일 구체예이다.

도 1은 ROCK1 siRNA #1, #2, #3 및 #4; ROCK2 siRNA #1, #2, #3 및 #4; ROCK1 siRNA 풀; 비-표적 대조군 siRNA; 및 완충액 대조군 (-siRNA)으로 형질감염된 GTM-3 세포의 ROCK1 웨스턴 블롯을 제공한다. siRNA는 100nM 농도였다. 화살표는 160-kDa ROCK1 단백질 및 42-kDa 액틴 단백질 밴드의 위치를 나타낸다.

도 2는 각각 10 nM, 1 nM 및 0.1 nM인 ROCK1 siRNA #1, #2, #3 및 #4; 비-표적 대조군 siRNA 및 완충액 대조군(-siRNA)으로 형질감염된 GTM-3 세포의 ROCK1 웨스턴 블롯을 제공한다. 화살표는 160-kDa ROCK1 단백질 및 42-kDa 액틴 단백질 밴드의 위치를 나타낸다.

도 3은 각각 100 nM인 ROCK2 siRNA #1, #2, #3 및 #4; ROCK1 풀 및 비-표적 대조군 siRNA 및 완충액 대조군(-siRNA)으로 형질감염된 GTM-3 세포의 ROCK2 웨스턴 블롯을 제공한다. 화살표는 160-kDa ROCK2 단백질 및 42-kDa 액틴 단백질 밴드의 위치를 나타낸다.

도 4는 각각 10 nM, 1 nM 및 0.1 nM인 ROCK2 siRNA #1, #2, #3 및 #4; 및 비-표적 대조군 siRNA 및 완충액 대조군(-siRNA)으로 형질감염된 GTM-3 세포의 ROCK2 웨스턴 블롯을 제공한다. 화살표는 160-kDa ROCK2 단백질 및 42-kDa 액틴 단백질 밴드의 위치를 나타낸다.

RNA 간섭(RNAi)은 이중 가닥 RNA(dsRNA)가 유전자 발현을 침묵시키기 위하여 이용되는 과정이다. 이론적인 결부없이, RNAi는 RNaseⅢ-유사 효소인 다이서(dicer)에 의해 긴 dsRNA가 작은 간섭 RNA(siRNA)로 절단되는 것으로 시작된다. siRNA는 대부분 약 19개 내지 28개 뉴클레오티드, 또는 20개 내지 25개 뉴클레오티드, 또는 21개 내지 22개 뉴클레오티드 길이의 dsRNA이며, 종종 2-뉴클레오티드 3' 오버행(overhang), 및 5' 포스페이트 및 3' 하이드록실 말단을 포함한다. siRNA의 한 가닥은 RISC(RNA-유도 침묵 복합체)로 잘 알려진 리보핵단백질 복합체로 통합된다. RISC는 통합되는 siRNA 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 mRNA 분자를 동정한 후, 이러한 표적 mRNA를 절단하거나 이들의 번역을 억제하기 위하여 이러한 siRNA 가닥을 이용한다. 그러므로, RISC로 통합되는 siRNA 가닥은 가이드(guide) 가닥 또는 안티센스 가닥으로 알려져 있다. 패신져(passenger) 가닥 또는 센스 가닥으로 알려진 다른 siRNA 가닥은 siRNA로부터 제거되며, 적어도 부분적으로 표적 mRNA와 동일성을 갖는다. 당업자들은 이론상, siRNA의 두 가닥이 RISC에 통합될 수 있으며, 가이드 가닥으로서도 기능할 수 있다는 것을 알고 있다. 그러나 siRNA 설계(예를 들면, 안티센스 가닥의 5' 말단에서 siRNA 듀플렉스 안전성 감소)는 RISC로의 안티센스 가닥의 통합을 선호할 수 있다.

RISC 매개의, 적어도 부분적으로 가이드 서열에 상보적인 서열을 갖는 mRNA의 절단은 이 mRNA에 의해 암호화되는 상응하는 단백질 및 이 mRNA의 안정된 상태의 수준 감소를 가져온다. 다른 방법으로, RISC는 또한 표적 mRNA의 절단 없이 번역의 저지를 통하여 상응하는 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다. 또한 다른 RNA 분자 및 RNA-유사 분자는 RISC와 상호작용하고, 유전자의 발현을 침묵시킬 수 있다. RISC와 상호작용할 수 있는 다른 RNA 분자의 예는 shRNA(짧은 헤어핀 RNA), 단일 가닥 siRNA, miRNA(마이크로RNA) 및 다이서-기질 27-mer 듀플렉스를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "siRNA"라는 용어는 달리 언급이 없으면, 이중 가닥 간섭 RNA를 의미한다. RISC와 상호작용할 수 있는 RNA-유사 분자의 예는 화학적으로 변형된 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 하나 또는 그 이상의 데옥시리보뉴클레오티드, 및/또는 하나 또는 그 이상의 비-포스포디에스테르 결합을 포함하는 RNA 분자를 포함한다. 본 발명의 목적을 위하여, 유전자 발현에 있어서 RISC와 상호작용할 수 있으며 RISC 매개의 변화에 관여하는 모든 RNA 또는 RNA-유사 분자를 "간섭 RNA"라고 칭하였다. 그러므로, siRNA, shRNA, miRNA 및 다이서-기질 27-mer 듀플렉스는 "간섭 RNA"의 부분집합이다.

본 발명의 구체적인 예에서 간섭 RNA는 표적 mRNA의 절단을 위하여, 촉매적 방식으로 작용하며, 즉 간섭 RNA는 근사화학량론(Substoichiometric)의 양으로 표적 mRNA의 억제에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 절단 조건하에 치료 효과를 위해서는, 안티센스 요법과 비교할 경우, 유의하게 적은 간섭 RNA가 요구된다.

본 발명은 Rho 키나아제 (ROCK) mRNA의 발현을 억제하고, 이에 따라, 녹내장을 지닌 환자에서 안압을 낮추기 위한 간섭 RNA의 용도에 관한 것이다. 두개의 Rho 키나아제 아이소폼이 존재한다: ROCK1 (ROCKI, ROKβ 또는 p160ROCK으로도 알려져있음) 및 ROCK2 (ROCKII 또는 ROKα로도 알려져 있음). 본 발명에 따라서, 외인적으로 제공되거나 내인적으로 발현된 본원에 나타낸 간섭 RNA는 특히 ROCK mRNA를 침묵시키는 데 특히 효율적이다.

ROCK의 소분자 억제제는 소주망 세포 형태 및 세포 골격 형성을 가역적으로 변화시키고, 분리된 섬모체근 조직의 수축력을 감소시키며, 기관 배양에서 안방수 유출능의 증가를 유발한다. 우성인 음성 Rho-결합 도메인의 발현으로 유사 효과가 생성된다. ROCK의 소분자 억제제로 처리하면, IOP를 낮추나, 그러한 치료는 충혈을 유발하는 것으로 보인다. ROCK의 소분자 억제제는 ROCK1 및 ROCK2 외의 다중의 키나아제의 억제에 대하여 현재까지 시험되었다. ROCK1 또는 ROCK2에 대하여 특이성을 지니는 본 발명의 간섭 RNA의 이용은 치료의 바람직하지않은 충혈 효과로부터 치료의 바람직한 IOP-강하 효과를 분리할 것으로 기대된다.

본 명세서에 기술된 핵산 서열은 달리 지적하지 않았다면, 5'에서 3'방향으로 기재되었다. 여기에서 "핵산"이라는 용어는 DNA 또는 RNA, 또는 DNA(아데닌"A," 시토신 "C," 구아닌 "G," 티민 "T") 또는 RNA(아데닌 "A," 시토신 "C," 구아닌 "G," 우라실 "U")에서 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함하는 이들의 변형된 형태를 언급하는데 이용되었다. 비록 RNA에는 자연적으로 "T" 염기가 존재할 수 없지만, 여기에서 간섭 RNA는 특별히 3' 말단에 "T" 염기를 포함할 수 있다. "핵산"은 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리올리고뉴클레오티드"의 용어를 포함하며, 단일 가닥 분자 또는 이중 가닥 분자를 말하는 것일 수도 있다. 이중 가닥 분자는 A와 T 염기, C와 G 염기 및 A와 U 염기 사이에서 왓슨-크릭 염기 쌍에 의해 형성된다. 이중 가닥 분자의 한 가닥은 서로에게 부분적으로, 실질적으로, 또는 완전하게 상보성일 수 있으며, 염기 서열 상보성의 본질 및 정도에 의해 좌우되는 결합력으로 듀플렉스 하이브리드(duplex hybrid)를 형성할 것이다.

mRNA 서열은 상응 DNA 서열의 서열에서 쉽게 추론된다. 예를 들면, 서열번호 1은 ROCK1 mRNA에 상응하는 DNA의 센스 가닥 서열을 제공한다. mRNA 서열은 "T" 염기가 "U" 염기로 대체된 DNA 센스 가닥 서열과 동일하다. 이에 따라, ROCK1의 mRNA 서열은 서열 번호 1에서 알 수 있고, ROCK2의 mRNA 서열은 서열 번호 2에서 알 수 있다.

Rho 키나아제 mRNA(ROCK1 및 ROCK2): Rho 키나아제 또는 단순히 ROCK로도 알려진 Rho-관련, 코일드 코일 함유 단백질 키나아제는 작은 GTP-결합 단백질의 Rho 패밀리(Rho GTPase)의 작용자이다. Rho GTPase 신호 경로는 예를 들어, 소주망(TM) 및/또는 섬모체근(CM) 세포의 세포 골격 형성을 변경하여, 안방수 방출을 조절하는 데에서 역할을 수행하는 것으로 보인다.

ROCK은 GTP-결합 Rho에 의해 활성화되는 세린/트레오닌 단백질 키나아제이다. ROCK 활성화는 액틴 섬유 어셈블리 및 세포 수축성에 관여하는 일부 기질, 예를 들어, 미오신 경쇄, 미오신 경쇄 포스파타제, LIM 키나아제, 어듀신(adducin), ERM의 인산화를 유발한다. 이에 따라, ROCK은 다양한 범위의 세포 과정, 예를 들어, 스트레스-섬유 형성, 수축, 부착, 이주, 식균 작용, 자멸사 및 세포질 분열을 조절한다. 두 ROCK 아이소폼은 ROCK1 (ROCKI, ROKβ, 또는 p160ROCK으로도 알려짐) 및 ROCK2 (ROCKII 또는 ROKα로도 알려짐)이다. 두 아이소폼은 특히 그의 키나아제 도메인(아미노산 수준에서 92% 동일성)에서 매우 유사하나, 그들은 조직 분화 및 세포 내 위치에서 차이점을 가져, 그들이 상이한, 중복되지 않은 작용을 가질 수 있는 것으로 제안된다. 두 ROCK1 및 ROCK2는 인간 눈 전방 구획에서 발현된다.

ncbi.nlm.nih.gov에서 생물공학적 정보를 위한 국립 기관의 GenBank 데이터 베이스는 서열 번호 1로 "서열 목록"에 제공된 수탁 번호 NM_005406으로서 ROCK1에 대한 DNA 서열을 제공한다. 서열 번호 1은 ROCK1 을 암호화하는 mRNA에 상응하는 DNA의 센스 가닥 서열을 제공한다("U"염기를 위한 "T" 염기를 제외). ROCK1에 대한 암호화 서열은 뉴클레오티드 1-4065이다.

상기 개시된 ROCK1 mRNA 서열의 등가물은 이의 대안적인 스플라이스 형태, 대립 유전자 형태, 동질 효소(isozyme) 또는 동족체(cognate)이다. 동족체는 서열 번호 1과 동족인 또다른 포유동물 종에서의 ROCK1 mRNA이다(오쏘로그(ortholog)).

GenBank 데이터 베이스는 서열 번호 2로서 "서열 목록"으로 제공된 수탁 번호 NM_004850으로 ROCK2에 대한 DNA 서열을 제공한다. 서열 번호 2는 ROCK2를 암호화하는 mRNA에 상응하는 DNA의 센스 가닥 서열을 제공한다("U"염기를 위한 "T" 염기를 제외). ROCK2에 대한 암호화 서열은 뉴클레오티드 450-4616이다.

상기 개시된 ROCK2 mRNA 서열의 등가물은 이의 대안적인 스플라이스 형태, 대립 유전자 형태, 동질 효소 또는 동족체이다. 동족체는 서열 번호 2와 동족인 또다른 포유동물 종의 ROCK2 mRNA이다(오쏘로그).

mRNA 발현의 약화: 본 명세서에서 이용된 구문 "mRNA 발현의 약화"는 mRNA의 절단 또는 번역의 직접적인 억제를 통하여 표적 mRNA가 단백질로 번역되는 것을 감소시키는 간섭 RNA(예, siRNA)의 양을 발현시키거나 투여하는 것을 의미한다. 표적 mRNA 또는 상응 단백질의 발현 감소는 보통 "녹-다운(knock-down)"이라 언급되며, 비-표적 대조군 RNA(예, 비-표적 대조군 siRNA)의 투여 또는 발현 이후 존재하는 수준과 비교하여 기록된다. 본 발명의 구체적인 예에서는 50% 내지 100% 양의 발현의 녹-다운이 고려되었다. 그러나 본 발명의 목적을 달성되는 녹-다운 수준이 필수적이지는 않다. 한 구체적인 예에서, Rho 키나아제 표적 중 하나를 표적으로 하는 단일 간섭 RNA는 IOP를 저하시키기 위하여 투여된다. 다른 구체예에서는, 같은 Rho 키나아제 표적(예를 들어, ROCK1)을 표적으로 하는 복수의 간섭 RNA가 IOP를 저하시키기 위하여 투여된다. 또다른 구체예에서, 두 Rho 키나아제 표적(예를 들어, ROCK1 및 ROCK2)을 표적으로 하는 복수의 간섭 RNA가 IOP를 저하시키기 위하여 투여된다.

녹-다운은 주로 qPCR(정량적 연쇄중합효소반응) 증폭을 이용하여 mRNA 수준을 측정하거나, 웨스턴 블롯 또는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 단백질 수준을 측정하여, 평가된다. 단백질 수준 분석은 번역 억제뿐만 아니라 mRNA 절단의 평가도 제공한다. 더 나아가 녹-다운을 측정하는 기술은 RNA 용액 혼성화, 뉴클레아제 보호, 노던 혼성화, 마이크로어레이를 통한 유전자 발현 관찰, 항체 결합, 방사선 면역 검정법 및 형광에 의해 활성화된 세포 분석을 포함한다.

또한, ROCK1 또는 ROCK2의 억제는 시험관 내에서 예를 들면, 개시된 ROCK1- 또는 ROCK2- 간섭 RNA의 형질감염 후 인간 TM 세포에서 표적 mRNA 수준 또는 표적 단백질 수준을 평가하여 결정될 수 있다.

본원에 개시된 표적의 억제는 또한, 녹내장 징후 개선, 이를 테면 안압 개선, 시야 손실 개선 또는 시신경유두 변화의 개선을 관찰하여 인간 또는 포유동물에서 추론된다.

간섭 RNA: 본 발명의 일 구체예에서, 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 가지며, 센스 및 안티센스 가닥은 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 지니며, 이 안티센스 가닥은 ROCK1 또는 ROCK2 mRNA의 표적 서열에 대하여 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 포함하며, 센스 가닥은 각각 ROCK1 또는 ROCK2 mRNA의 표적 서열을 갖는 적어도 거의-완벽하게 동일한 인접하는 적어도 19개 뉴클레오티드의 영역을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 간섭 RNA는 mRNA내에서 상응하는 표적 서열 3' 말단의 끝에서 두번째 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 뉴클레오티드

와 퍼센트의 상보성 또는 동일성 갖는 적어도 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 인접한 뉴클레오티드 영역을 포함한다.

간섭 RNA 가닥 각각의 길이는 19개 내지 49개의 뉴클레오티드를 포함하며, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49개 뉴클레오티드의 길이를 포함할 수 있다.

siRNA의 안티센스 가닥은 안티센스 가닥이 RISC에 통합하는 siRNA의 활성적인 안내제로서, RISC가 절단 또는 번역 저지를 위하여 안티센스 siRNA 가닥에 적어도 부분적인 상보성을 갖는 표적 mRNA를 동정하게 한다.

본 발명의 구체예에서, 표적 mRNA 서열 내의 간섭 RNA 표적 서열(예를 들어, siRNA 표적 서열)은 이용가능한 설계 도구를 이용하여 선택된다. ROCK1 또는 ROCK2 표적 서열에 상응하는 간섭 RNA는 표적 mRNA를 발현하는 세포의 형질 전환 후 상기 기술된 녹다운 평가로 조사된다.

siRNA의 표적 서열을 선택하는 기술은 록펠레 대학의 웹 싸이트에서 이용가능한 Tuschl 등("The siRNA User Guide" revised May 6, 2004)의 방법; 앰비온 웹 싸이트, Ambion Inc.에서 이용가능한 Technical Bulletin #506, "siRNA Design Guidelines"; 다른 웹-기초의 설계 도구 예를 들면, Invitrogen, Dharmacon, Integrated DNA Technologies, Genscript, 또는 Proligo 웹 싸이트에 의해 제공된다. 초기 조사 기준은 G/C 함량이 35% ~ 55%이며, siRNA의 길이는 19 내지 27개 뉴클레오티드인 것을 포함할 수 있다. 표적 서열은 코딩 부분 또는 mRNA의 5' 또는 3' 번역되지 않는 영역에 위치할 수 있다.

ROCK1 mRNA를 위한 19-뉴클레오티드 DNA 표적 서열의 일 구체예는 서열번호 1의 뉴클레오티드 605 내지 623에 존재한다:

본 발명의 siRNA는 서열번호 3의 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 하고, 21-뉴클레오티드 가닥 및 3' 오버행된 2-뉴클레오티드 가닥을 갖는다:

각각의 "N" 잔기는 임의의 뉴클레오티드(A, C, G, U, T) 또는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 3' 말단은 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 포함하는 많은 수의 "N" 잔기를 가질 수 있다. 다른 가닥에서 "N" 잔기는 같은 잔기(예를 들어, UU, AA, CC, GG 또는 TT)이거나, 다를 수 있다(예를 들어, AC, AG, AU, CA, CG, CU, GA, GC, GU, UA, UC 또는 UG). 3' 오버행은 같을 수도 있고 다를 수도 있다. 한 구체예에서는, 양쪽 가닥 모두 3'UU 오버행을 갖는다.

본 발명의 siRNA는 서열번호 3의 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 하고, 각각의 가닥에서 21-뉴클레오티드 가닥 및 3'UU 오버행을 갖는다:

또한, 간섭 RNA는 뉴클레오티드의 5'오버행 또는 이의 블런트 말단(blunt end)을 가질 수 있다. 본 발명의 siRNA는 서열번호 3의 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 하고, 19-뉴클레오티드 및 블런트 말단을 갖는다:

이중-가닥 간섭 RNA(예, siRNA)의 가닥은 헤어핀 또는 스템-루프구조(예, shRNA)를 형성하기 위하여 연결될 수 있다. 본 발명의 shRNA는 서열번호 2의 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 하고, 19 bp 이중 가닥 스템 영역 및 3'UU 오버행을 갖는다:

N은 뉴클레오티드 A, T, C, G, U 또는 당업자들에게 알려진 변형된 형태이다. 루프에 뉴클레오티드 N의 수는 3 내지 23, 5 내지 15, 7 내지 13, 4 내지 9 또는 9 내지 11 사이를 포함하며, 또는 뉴클레오티드 N의 수는 9이다. 루프에서 뉴클레오티드의 몇몇은 루프에서 다른 뉴클레오티드와의 염기쌍 상호작용에 관련될 수 있다. 루프의 형성을 위해 이용될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 서열은 5'-UUCAAGAGA-3'(Brummelkamp, T.R. et al. (2002) Science 296: 550) 및 5'-UUUGUGUAG-3'(Castanotto, D. et al. (2002) RNA 8:1454)를 포함한다. 단일 사슬 올리고뉴클레오티드가 RNAi 기작과 상호작용 가능한 이중 가닥 부분을 포함하는 스템-루프 또는 헤어핀 구조를 형성한 결과는 당업자들에 의해 인지될 수 있다.

상기 동정된 siRNA 표적 서열은 다이서-기질 27-mer 듀플렉스의 설계를 용이하게 하기 위하여, 3' 말단에서 연장될 수 있다. ROCK1 DNA 서열(서열 번호 1)에서 6 뉴클레오티드로 동정된 19-뉴클레오티드 DNA 표적 서열(서열번호 3)의 연장은 서열번호 1의 뉴클레오티드 605 내지 629에 존재하는 25-뉴클레오티드 DNA 표적 서열을 산출한다:

본 발명의 다이서-기질 27-mer 듀플렉스는 서열번호 10의 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 한다:

센스 가닥의 3' 말단에서 두 개의 뉴클레오티드(예를 들어, 서열번호 83의 GG 뉴클레오티드)는 처리를 증진시키기 위하여 데옥시뉴클레오티드일 수 있다. 본 명세서에서 제공된 것과 같은 19 내지 21 뉴클레오티드 표적 서열 유래의 다이서-기질 27-mer의 설계는 IDT(Integrated DNA Technologies) 웹 싸이트 및 Kim, D.-H. et al, (February, 2005) Nature Biotechnology 23:2;222-226에 의해 검토되었다.

간섭 RNA가 화학적으로 합성되어 생산될 경우, 한 가닥 또는 두 가닥 모두(존재할 경우)의 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서의 인산화는 siRNA 효능 및 결합 RISC 복합체의 특이성을 증진시킬 수 있으나, 인산화는 세포 내적으로 일어날 수 있으므로, 요구되는 것은 아니다.

표 1은 상기 나타낸 바와 같은 방식으로 본 발명의 siRNA가 설계된 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 ROCK1 및 ROCK2 DNA 표적 서열의 예를 열거한 것이다. ROCK1 및 ROCK2는 상기 나타낸 바와 같은 두 개의 Rho 키나아제 아이소폼을 암호화한다.

상기 실시예에서 개시된 바와 같이, 본 분야의 숙련자는 표 1에 제공된 표적 서열 정보를 사용하여, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에서 서열 위치를 참조하고, 각각 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상보적이거나 거의 상보적인 뉴클레오티드를 첨가하거나 제거하여, 표에 제공된 서열보다 더 짧거나 긴 길이를 갖는 간섭 RNA를 설계할 수 있다.

siRNA 및 다른 간섭 RNA 형태로 가이드된 표적 RNA의 절단 반응은 높은 서열 특이성이 있다. 일반적으로, 표적 mRNA의 부분 서열과 동일한 센스 뉴클레오티드 가닥 및 표적 mRNA에 정확하게 상보적인 안티센스 뉴클레오티드 가닥을 포함하는 siRNA는 본 명세서에서 언급한 mRNA의 억제를 위한 구체예이다. 그러나 안티센스 siRNA 가닥 및 표적 mRNA 사이 또는 안티센스 siRNA 가닥 및 센스 siRNA 가닥의 사이의 100% 서열 상보성은 본 발명을 실시하는데 요구되지 않는다. 그러므로, 예를 들면, 본 발명은 유전적 돌연변이, 균주 다형성 또는 진화적 일탈에서 기인한 것으로 여겨지는 서열 변화를 허용한다.

본 발명의 일 구체예에서, siRNA의 안티센스 가닥은 표적 mRNA를 갖는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성을 갖는다. 본 명세서에서 "거의-완벽한"이란 siRNA의 안티센스 가닥이 표적 mRNA의 적어도 한 부분에 "실질적으로 상보적인" 것을 의미하며, siRNA의 센스 가닥이 표적 mRNA의 적어도 한 부분에 "실질적으로 동일한"것을 의미한다. 당업자들에게 알려진 "동일성"은 서열 사이의 뉴클레오티드의 순서 및 동일성을 매칭하여 결정된 뉴클레오티드 서열 사이에서의 서열 관련 정도이다. 일 구체예에서, 표적 mRNA서열에 80% 및 80%에서 100%까지 상보성을 갖는, 예를 들어 85%, 90% 또는 95% 상보성을 갖는 siRNA의 안티센스 가닥이 거의 완벽한 상보성으로 간주되며, 본 발명에 이용될 수 있다. "완벽한" 인접 상보성은 근접 염기 쌍의 표준 왓슨-크릭 염기 쌍이다. "적어도 거의 완벽한" 인접 상보성은 본 명세서에서 이용된 "완벽한" 상보성을 포함한다. 동일성 또는 상보성을 결정하기 위한 컴퓨터 방법은 뉴클레오티드 서열의 최상의 매칭 정도를 동정하기 위하여 설계되었으며, 예로는 BLASTN(Altschul, S.F., et al. (1990) J. MoI. Biol. 215:403-410)이 있다.

"퍼센트 동일성"이라는 용어는 이차 핵산 분자에서 같은 길이의 인접 뉴클레오티드의 세트와 같은 일차 핵산 분자 내 인접 뉴클레오티드의 퍼센트를 의미한다. "퍼센트 상보성"이라는 용어는 이차 핵산 분자에서 인접 뉴클레오티드의 세트와 왓슨-크릭 센스에서 염기 쌍을 이룰 수 있는 일차 핵산 분자 내 인접 뉴클레오티드의 퍼센트를 의미한다.

표적 mRNA(센스 가닥)와 siRNA의 한 가닥(센스 가닥) 사이의 관계는 동일성의 관계이다. 또한 siRNA의 센스 가닥은 존재한다면 패신져 가닥이라고 불린다. 표적 mRNA(센스 가닥) 및 siRNA의 다른 가닥(안티센스 가닥) 사이의 관계는 상보성의 관계이다. 또한 siRNA의 안티센스 가닥은 가이드 가닥이라고도 불린다.

5'에서 3'방향으로 기재된 핵산 서열에서 끝에서 두번째 염기는 마지막 염기의 옆의 염기를, 즉, 3' 염기 옆의 염기를 의미한다. 5'에서 3'방향으로 기재된 핵산 서열의 끝에서 두번째 13 염기는 3' 염기 옆의 마지막 13 염기의 서열을 의미하며, 3' 염기는 포함하지 않는다. 비슷하게 5'에서 3'방향으로 기재된 핵산 서열의 끝에서 두번째 14, 15, 16, 17 또는 18 염기는 각각 3' 염기 옆의 서열의 마지막 14, 15, 16, 17 또는 18 염기를 의미하며, 3' 염기는 포함하지 않는다.

구문 "임의의 하나의(서열 식별자)에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 마지막에서 두번째 13 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성을 갖는, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개 인접 뉴클레오티드의 영역"은 하나의 뉴클레오티드 치환을 허용한다. 두 개의 뉴클레오티드 치환(예, 11/13 = 85% 서열 동일성/상보성)은 상기 구에 포함되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 인접 뉴클레오티드의 영역은 각각의 서열 식별자에 의해 동정된 서열에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째 14 뉴클레오티드와 적어도 85% 서열 상보성 또는 85% 서열 동일성을 갖는 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드의 영역이다. 두개의 뉴클레오티드 치환(예, 12/14 = 86% 동일성/상보성)은 상기 구에 포함된다.

더 나아가 본 발명의 구체예에서 인접 뉴클레오티드의 영역은 서열 식별자의 서열에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째 14 뉴클레오티드와 적어도 80% 서열 상보성 또는 80% 서열 동일성을 갖는 적어도 15, 16, 17 또는 18개의 인접 뉴클레오티드의 영역이다. 3개의 뉴클레오티드 치환은 상기 구에 포함된다.

서열번호 1 또는 서열번호 2에 상응하는 mRNA에서 표적 서열은 mRNA의 암호화 부분일 뿐만 아니라 mRNA의 5' 또는 3'의 번역되지 않은 부분일 수 있다.

이중 가닥 간섭 RNA의 한 가닥 또는 두 가닥 모두는 1개 내지 6개 뉴클레오티드의 3' 오버행을 가질 수 있으며, 이는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 오버행의 뉴클레오티드는 염기 쌍을 이루지 않는다. 본 발명의 일구체예에서, 간섭 RNA는 TT 또는 UU의 3' 오버행을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체적인 예에서, 간섭 RNA는 적어도 하나의 블런트 말단을 포함한다. 말단은 대부분 5' 포스페이트기 또는 3' 하이드록실기를 갖는다. 다른 구체적인 예에서 안티센스 가닥은 5' 포스페이트기를 가지며, 센스 가닥은 5' 하이드록실기를 갖는다. 또 다른 구체적인 예에서, 말단은 더 나아가 다른 분자 또는 작용기의 공유결합 추가에 의해 변형된다.

이중 가닥 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 상기 언급한 두개의 단일 가닥의 듀플렉스 형성일 수 있거나, 또는 상보성 영역이 염기 쌍을 이루고 단일 가닥 형성을 위한 헤어핀 루프에 의한 공유결합으로 연결된 단일 분자일 수도 있다. 헤어핀은 두개의 염기로 쌍을 이룬 RNA 분자의 간섭 RNA 형성하기 위하여 다이서라는 단백질에 의해 세포 내적으로 절단된다고 알려졌다.

간섭 RNA는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 첨가, 결실, 치환, 또는 변형에 의해 자연적으로 발생하는 RNA와 다를 수 있다. 뉴클레오티드가 아닌 물질은 5' 말단 및 3' 말단 또는 내부에서 간섭 RNA에 결합할 수 있다. 이러한 변형은 주로 간섭 RNA의 뉴클레아제 저항을 증가시키고, 세포 흡수를 증진시키며, 세포 표적을 증진시키고, 간섭 RNA 추적을 원조하고, 더 나은 안정성 또는 인터페론 경로의 활성화 가능성을 감소시키기 위하여 설계된다. 예를 들어, 간섭 RNA는 오버행의 말단에 퓨린 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 피롤리딘 링커(linker)에 의한 siRNA 분자의 센스 가닥 3' 말단에서 콜레스테롤의 접합은 또한, siRNA에 안정성을 제공한다.

다른 변형은 예를 들어, 3' 말단 비오틴 분자, 세포를 관통하는 특성을 지닌 것으로 알려진 펩티드, 나노 입자, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 형광 염료 또는 덴드리머(dendrimer)를 포함한다.

본 발명의 구체적인 예에서 뉴클레오티드는 그들의 염기 부분, 그들의 당 부분 또는 분자의 포스페이트 부분 및 작용에서 변형될 수 있다. 변형은 예를 들어, 알킬, 알콕시기, 아미노, 디아자, 할로, 하이드록실, 티올기 또는 이들의 조합을 포함한다. 뉴클레오티드는 이를 테면 리보뉴클레오티드를 데옥시뉴클레오티드로 치환하는 것과 같이 더 나은 안정성을 갖거나, 2' OH 기를 2' 아미노기, 2'O-메틸기, 2' 메톡시에틸기 또는 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿쥐(bridge)로 치환하는 것과 같이 당 변형을 갖는 유사체로 치환될 수 있다. 뉴클레오티드의 퓨린 또는 피리미딘 유사체의 예로는 크산틴, 하이포크산틴, 아자퓨린, 메틸티오아데닌, 7-데아자-아데노신 및, O- 및 N- 변형 뉴클레오티드 등이 있다. 뉴클레오티드의 포스페이트 기는 포스페이트 기의 하나 또는 그 이상의 산소를 질소 또는 황(포스포로티오에이트)을로 치환하여 변형될 수 있다. 변형은 예를 들면, 기능 증진, 안정성 또는 투과성의 증진, 또는 편재화 또는 표적을 지시하는데 유용하다.

서열번호 1 또는 서열번호 2의 부분에 상보적이지 않은 간섭 RNA 안티센스 가닥의 영역 또는 영역들이 있을 수 있다. 비-상보적인 영역은 3', 5' 또는 상보적 영역의 양쪽 말단 부분 또는 두 개의 상보적인 영역의 사이에 있을 수 있다.

간섭 RNA는 화학적 합성, 시험관 내의 전사, 또는 다이서 또는 유사한 활성을 갖는 다른 적당한 뉴클레아제에 의한 긴 이중 가닥 RNA의 절단으로 외생적으로 생성될 수 있다. 화학적으로 합성된 간섭 RNA, 전통적인 DNA/RNA 합성기를 이용하여 보호된 리보뉴클레오시드 포스포라미디트로부터 생성된 간섭 RNA는 앰비온사(Austin, TX), 인비트로젠(Carlsbad, CA) 또는 다마콘(Lafayette, CO)과 같은 상업적 공급자로부터 수득될 수 있다. 간섭 RNA는 예를 들면, 용매, 또는 레진, 침전, 전기영동, 크로마토그래피 또는 이들의 조합에 의한 추출로 정제될 수 있다. 대안적으로, 임의의 정제가 샘플 처리 과정에서 기인하는 손실을 피하기 위해서라면 간섭 RNA는 아주 소량 이용될 수 있다.

또한, 간섭 RNA는 플라스미드 또는 바이러스 발현 벡터 또는 최소 발현 카세트로부터, 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 프로모터 및 간섭 RNA를 위한 적절한 주형(들)을 포함하는 PCR 산출 단편으로부터 내생적으로 발현될 수 있다. shRNA를 위하여, 상업적으로 이용 가능한 플라스미드-기초의 발현 벡터의 예는 pSilencer 시리즈(앰비온, Austin, TX) 및 pCpG-siRNA(인비트로젠, San Diego, CA)를 포함한다. 간섭 RNA의 발현을 위한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스(예, HIV, FIV 및 EIAV) 및 허피스 바이러스를 포함하는 다양한 바이러스로부터 유래될 수 있다. shRNA 발현을 위하여, 상업적으로 이용 가능한 바이러스 벡터의 예는 pSilencer adeno(앰비온, Austin, TX) 및 pLenti6/BLOCK-iT™-DEST(인비트로젠, Carlsbad, CA)을 포함한다. 바이러스 벡터의 선택, 벡터로부터 간섭 RNA를 발현시키는 방법 및 바이러스 벡터를 이동시키는 방법은 당업계의 보통의 기술로 가능하다. PCR로 생성되는 shRNA 발현 카세트의 생산 키트의 예에는 Silencer Express(앰비온, Austin, TX) 및 siXpress(미루스, Madison, WT)이 있다. 제1 간섭 RNA는 제1 간섭 RNA를 발현할 수 있는 제1 발현 벡터로부터의 생체 내 발현을 통하여 투여될 수 있으며, 제2 간섭 RNA는 제2 간섭 RNA를 발현할 수 있는 제2 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여될 수 있거나, 두 간섭 RNA는 두 간섭 RNA들을 발현할 수 있는 단일 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여될 수 있다.

간섭 RNA는 본 분야의 숙련자에게 알려진 다양한 진핵세포 프로모터, 이를 테면 U6 또는 H1 프로모터와 같은 pol II 프로모터, 또는 사이토메갈로바이러스 프로모터와 같은 pol II 프로모터로부터 발현될 수 있다. 당업자들은 이러한 프로모터가 간섭 RNA의 발현 유도를 허용하도록 적응될 수 있는지를 인지할 것이다.

생리적 조건하의 혼성화: 본 발명의 특정 구체적인 예에서는 간섭 RNA의 안티센스 가닥이 생체 내에서 RISC 복합체의 부분으로서 mRNA와 혼성화한다.

"혼성화"는 상보적 또는 거의 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 핵산이 혼성물이라 불리는 수소-결합 복합체를 형성하기 위하여 상호작용하는 공정을 말한다. 혼성화 반응은 민감하며 선택적이다. 시험관 내에서의 혼성화 특이성(예, 엄격함)은 예를 들어, 혼성화 전 및 혼성화 용액 중 염 또는 포름아미드의 농도에 의하여, 그리고 혼성화 온도에 의하여 조절되며; 이러한 방법은 본 분야에 공지이다. 특히, 엄격함은 염 농도의 감소, 포름아미드 농도의 증가 또는 하이브리드 온도를 올림으로써 증가된다.

예를 들어, 아주 엄격한 조건은 약 50% 포름아미드, 37℃ 내지 42℃에서 발생할 수 있다. 감소된 엄격한 조건은 약 35% 내지 25% 포름아미드, 30℃ 내지 35℃에서 발생할 수 있다. 혼성화를 위한 엄격한 조건의 예는 Sambrook, J., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.에서 제공된다. 엄격한 혼성화 조건의 또 다른 예는 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50℃ 또는 70℃에서 12 ~ 16 시간 동안 혼성화 후, 세척, 또는 1× SSC, 70℃에서 또는 1× SSC, 50℃에서 50% 포름아미드로 혼성화한 후, 0.3× SSC로 70℃에서 세척, 또는 4×SSC, 70℃에서 또는 4×SSC, 50℃ 에서 50% 포름아미드로 혼성화한 후, 1× SSC로 67℃에서 세척하는 것을 포함한다. 혼성화 온도는 하이브리드의 Tm(융점)보다 약 5 ~ 10℃ 낮으며, 19 내지 49의 염기 쌍의 길이의 하이브리드의 Tm은 하기의 계산식으로 결정된다: Tm℃ = 81.5 + 16.6(log₁₀[Na+]) + 0.41 (% G+C)-(600/N)(여기에서 N은 하이브리드의 염기 수를 의미하며, [Na+]는 혼성화 용액의 나트륨 이온의 농도를 의미한다).

상기에서 상술한 시험관 내에서의 혼성화 분석은 후보 siRNA 및 표적 사이에서의 결합이 특이성이 있는지를 예상하는 방법을 제공한다. 그러나, RISC 복합체의 경우에는, 표적의 특이적 절단이 시험관 내에서 혼성화를 위하여 매우 엄격한 조건이 요구되지 않는 안티센스 가닥과 함께 일어날 수 있다.

단일 가닥 간섭 RNA: 상기에서 기술하였듯이, 간섭 RNA은 궁극적으로 단일 가닥으로 작용한다. 단일 가닥(ss) 간섭 RNA는 이중 가닥 siRNA보다 mRNA 스플라이싱에 더 작은 영향을 미친다. 그러므로, 본 발명의 구체적인 예에서는 생리적 조건하에서 서열번호 1 또는 서열번호 2의 부분과 혼성화되고, 각각의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 부분과 혼성화는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는 ss 간섭 RNA 투여를 제공한다. ss 간섭 RNA는 상기 기술한 ds 간섭 RNA를 위하여, 19개 내지 49개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. ss 간섭 RNA는 5' 포스페이트를 갖거나 5' 위치에서 인시츄(in situ) 또는 생체 내에서 인산화된다. "5' 인산화"란 용어는 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에서 당(예, 리보스, 디옥시리보스 또는 이들의 유사체)의 C5 하이드록실기에 대한 에스테르 결합을 통하여 부착된 포스페이트기를 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 기술할 경우에 이용된다.

SS 간섭 RNA는 시험관 내 전사에 의해 또는 화학적으로 합성되며, ds 간섭 RNA에 관해서는 백터 또는 발현 카세트로부터 내생적으로 발현된다. 5' 포스페이트기는 키나아제를 통해 첨가될 수 있으며, 또한, 5' 포스페이트는 뉴클레아제에 의한 RNA의 절단의 결과일 수도 있다. 전달은 ds 간섭 RNA에서와 같다. 한 구체적인 예에서, 말단이 보호되고, 뉴클레아제 저항 변형을 갖는 ss 간섭 RNA는 침묵을 위해서 투여되었다. SS 간섭 RNA는 저장을 위해 건조되거나 수용액에 용해될 수 있다. 이 용액은 어닐링 또는 안정화를 방지하기 위하여, 완충액 또는 염을 포함할 수 있다.

헤어핀 간섭 RNA : 헤어핀 간섭 RNA는 스템-루프 또는 헤어핀 구조(예, shRNA)의 간섭 RNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 모두를 포함하는 단일 분자(예, 단일 올리고뉴클레오티드 사슬)이다. 예를 들면, shRNA는 DNA 벡터로부터 발현될 수 있으며, 여기서 센스 간섭 RNA 가닥을 암호화하는 DNA 올리고뉴클레오티드는 짧은 스페이서에 의해 역 상보성 안티센스 간섭 RNA 가닥을 암호화하는 DNA 올리고뉴클레오티드에 연결된다. 선택된 발현 벡터를 위하여 필요하다면, 3' 말단의 T 및 제한 자리를 형성하는 뉴클레오티드가 첨가될 수 있다. RNA 전사물의 결과는 스템-루프 구조를 형성하기 위하여 그 자신의 뒤에 접힌다.

투여 형태: 간섭 RNA는, 예를 들어, 에어로졸, 구강, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복강내, 비강, 안구, 경구, 귀, 비경구, 패치, 피하, 혀 밑, 국소적 또는 경피 투여를 통하여 전달될 수 있다.

간섭 RNA는 눈주변, 결막, 테논낭하, 전방내, 유리체내, 안구내, 망막하, 결막하, 눈뒤 또는 시신경관내 주입과 같은 안조직 주입에 의하여; 카테터 또는 망막 펠렛, 안구내 삽입, 좌약 또는, 다공성, 비다공성 또는 젤라틴 물질을 포함하는 임플란트와 같은 다른 대체 기구의 사용으로; 국소적 점안액 또는 연고로; 또는 쿨데삭(Cul-De-Sac)의 서방성 기구 또는 공막(공막을 통하여)에 인접하거나 눈 안의 임플란트에 의해 눈에 직접 전달될 수 있다. 전방 주입은 각막에서 안구의 전방으로 약제가 소주망으로 도달하는 것을 통하여 이루어질 수 있다. 시신경관내 주입은 쉴렘관으로 방출하는 정맥 채취기 채널로 또는 쉴렘관을 통하여 이루어질 수 있다.

대상: 고안압증 치료를 필요로 하거나 고안압증 진행의 위험이 있는 대상은 고안압증을 갖거나 본원에서 기재한 바와 같이 예를 들어, ROCK1 또는 ROCK2의 원하지 않거나 부적절한 발현 또는 활성과 관련된 고안압증을 가질 위험이 있는 인간 또는 다른 포유류이다. 이러한 장애과 관련된 안구 구조는, 예를 들어, 눈, 망막, 맥락막, 렌즈, 각막, 소주망, 홍채, 시신경, 시신경유두, 공막, 전방 또는 후부 단편 또는 모양체를 포함할 수 있다. 또한 대상은 안구세포, 세포배양, 기관 또는 생채 외 기관 또는 조직일 수 있다.

제제 및 복용량: 약학적 제제는 물, 완충액, 식염수, 글리신, 히아루론산, 맨니톨 등과 같은 생리학적으로 허용되는 담체 매질과 혼합된 본 발명의 간섭 RNA 또는 이의 염을 99 중량% 이하로 포함한다.

본 발명의 간섭 RNA는 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로서 투여된다. 하기에 본 발명의 가능한 제제를 예시한다.

양(중량 %)

간섭 RNA 최대 99; 0.1-99; 0.1-50; 0.5-10.0

하이드록시프로필메틸셀룰로오스 0.5

염화나트륨 0.8

염화 벤즈알코늄 0.01

EDTA 0.01

NaOH/HCl qs pH 7.4

정제수(RNase 없음) qs 100 ㎖

양(중량 %)

간섭 RNA 최대 99; 0.1-99; 0.1-50; 0.5-10.0

인산완충식염수 1.0

염화 벤즈알코늄 0.01

폴리소르베이트 80 0.5

정제수(RNase 없음) q.s. 100%까지

양(중량 %)

간섭 RNA 최대 99; 0.1-99; 0.1-50; 0.5-10.0

일염기성인산나트륨 0.05

이염기성인산나트륨(무수) 0.15

염화나트륨 0.75

디소디움 EDTA 0.05

크레모퍼 EL 0.1

염화 벤즈알코늄 0.01

HCl 및/또는 NaOH pH 7.3-7.4

정제수(RNase 없음) q.s. 100%까지

양(중량 %)

간섭 RNA 최대 99; 0.1-99; 0.1-50; 0.5-10.0

인산완충식염수 1.0

수산화프로필-베타-사이클로덱스트린 4.0

정제수(RNase 없음) q.s. 100%까지

통상, 본 발명의 구체예의 간섭 RNA의 유효량은 100 pM 내지 1 μM, 또는 1 nM 내지 100 nM, 또는 5 nM 내지 약 50 nM, 또는 약 25 nM의 표적 세포 표면의 세포 외 농도를 유발한다. 이 국소 농도를 달성하기 위하여 요구되는 투여량은 전달 방법, 전달의 자리, 전달 자리 및 표적 세포 또는 조직 사이의 세포층의 수, 전달이 전체적인지 또는 국소적인지 등을 포함하는 매우 다양한 요소에 달려 있다. 전달 자리에서의 농도는 표적 세포 또는 조직의 표면에서보다 상당히 높을 수 있다. 국소적 조성물은 하루에 1회 내지 4회, 표적 기관의 표면에 전달되거나 또는 숙련된 임상의의 관례적인 재량에 따라서 매일, 주마다, 격주마다, 달마다 또는 그 이상으로 전달 스케쥴을 연장할 수도 있다. 제제의 pH는 약 pH 4-9 또는 pH 4.5 내지 pH 7.4이다.

ROCK1 또는 ROCK2 mRNA에 대하여 지시된 간섭 RNA을 갖는 환자의 치료는 작용 기간이 연장되는 소 분자 치료를 통한 효과가 예상되지므로, 투여량 횟수는 감소될 것이고 환자의 순응은 나아질 것이다.

제제의 유효량은 예를 들면, 대상의 연령, 종족 및 성별, 고안압증의 심각성, 표적 유전자 전사/단백질 전환율, 간섭 RNA 효능 및 간섭 RNA 안정성과 같은 요소에 달려있다. 일 구체예에서, 간섭 RNA는 표적 기관에 국소적으로 전달되며 치료적 용량으로 소주망, 망막 또는 시신경유두와 같은 ROCK1 또는 ROCK2 mRNA-함유 조직에 도달하므로, 고안압증-관련 질환 진행을 개선한다.

허용되는 담체 : 허용되는 담체로는 최대한 안구 염증이 없고, 필요하다면 적절한 보존 상태가 제공되고, 동일한 투여에서 본 발명의 하나 이상의 간섭 RNA를 전달할 수 있는 담체가 언급되어 진다. 본 발명의 구체예에서 간섭 RNA의 투여를 위하여 허용되는 담체는 양이온성 지질-기제의 형질감염제 TransIT^®-TKO(미루스 사, Madison, WI), LIPOFECTIN^®, 리포펙타민, OLIGOFECTAMINE™(인비트로젠, Carlsbad, CA) 또는 DHARMAFECT™(다마콘, Lafayette, CO); 폴리에틸렌이민과 같은 폴리양이온; Tat, 폴리아르기닌 또는 Penetratin(Antp 펩티드)과 같은 양이온 펩티드; 또는 리포좀을 포함한다. 리포좀은 표준 소낭-형성 지질 및 콜레스테롤과 같은 스테롤로부터 형성되며, 예를 들면, 내피 세포 표면 항원에 대하여 결합 친화도를 갖는 단일클론성 항체와 같은 표적 분자를 포함할 수 있다. 더 나아가 리포좀은 페길화 리포좀일 수 있다.

간섭 RNA는 용액에서, 현탁액에서 또는 생분해성 또는 비-생분해성 전달 장치에서 전달될 수 있다. 간섭 RNA는 단독으로 또는 공유 접합체로 정의된 성분으로서 전달될 수 있다. 또한, 간섭 RNA는 양이온의 지질, 양이온의 펩티드 또는 양이온의 폴리머와 복합체를 형성할 수 있으며; 단백질, 융합 단백질 또는 핵산과 결합하는 성질을 갖는 단백질 도메인(예, 프로타민)과 복합체를 형성할 수 있거나; 나노입자 또는 리포좀 중에 캡슐화될 수 있다. 조직- 또는 세포-특이적 전달은 항체 또는 항체 단편과 같은 적절한 표적 부분의 포함으로 이루어질 수 있다.

안과적 전달을 위하여, 간섭 RNA는 안과학적으로 허용되는 보존제, 공용매, 계면활성제, 점성 증진제, 침투 증진제, 완충액, 염화나트륨 또는 물과 배합되어, 멸균된 안용 수성 현탁액 또는 용액을 형성할 수 있다. 용액 제제는 생리적으로 허용되는 등장성 수성 완충액 중에 간섭 RNA를 용해시켜 제조될 수 있다. 더 나아가, 용액은 억제제제 용해를 보조하기 위하여 허용되는 계면활성제를 포함할 수 있다. 하이드록시메틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등의 점성 형성 시약은 본 발명의 조성물에 첨가되어 화합물의 보유력을 증진시킬 수 있다.

멸균 안용 연고 제제를 제조하기 위하여, 간섭 RNA는 미네랄 오일, 액체 라놀린 또는 백색 바셀린과 같은 적절한 비히클 중에서 방부제와 조합된다. 멸균 안용 젤 제제는 간섭 RNA를, 예를 들면, 당업계에 공지된 방법에 따라 CARBOPOL^®-940(BF Goodrich, Charlotte, NC) 등의 조합으로부터 제조된 친수성 기제에 현탁함으로써 제조될 수 있다. VISCOAT^®(Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, TX)는 예를 들면, 안구내 주입에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 조성물은 눈에서 간섭 RNA의 침투성이 작을 경우, 크레모폴 및 TWEEN^® 80(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, Sigma Aldrich, St. Louis, MO)과 같은 침투 증진제를 포함할 수 있다.

키트 : 본 발명의 구체예에는 세포에서 본원에서 상술한 mRNA의 발현을 약화하는 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 siRNA 또는 shRNA 발현 벡터를 포함한다. siRNA 및 비-바이러스 shRNA 발현 벡터를 위하여, 키트는 또한 형질감염 시약 또는 다른 적절한 전달 비히클을 포함할 수 있다. 바이러스 shRNA 발현 벡터를 위하여, 키트는 바이러스 벡터 및/또는 바이러스 벡터의 생산을 위해 필요한 성분(예, 바이러스 벡터 주형 및 패키지를 위한 추가적인 헬퍼 벡터를 포함하는 벡터뿐만 아니라 패키지된 세포주)을 포함할 수 있다. 또한 키트는 양성 및 음성 대조 siRNA 또는 shRNA 발현 벡터(예, 비-표적 대조 siRNA 또는 관련없는 mRNA를 표적으로 하는 siRNA)를 포함할 수 있다. 또한 키트는 관심 있는 표적 유전자(예, 웨스턴 블랏을 위하여 상응하는 단백질에 대한 표적 mRNA 및/또는 항체를 검출하기 위한 정량 PCR에 이용되는 프라이머 및 프로브)의 녹다운을 평가하는 시약을 포함할 수 있다. 대안적으로, 키트는 siRNA 서열 또는 shRNA 서열 및 사용설명서 및 시험관 내에서 전사에 의해 siRNA를 생산하거나 shRNA 발현 벡터를 작제하기 위하여 필요한 물질을 포함할 수 있다.

패키지된 조합에서, 한정된 가까운 곳에 있어서 컨테이너 수단을 받기에 적당한 담체 수단 및 간섭 RNA 조성물과 허용되는 담체를 포함하는 제1 컨테이너 수단을 포함하는 키트 형태의 약학적 조합이 추가로 제공된다. 더 나아가, 이러한 키트는 원한다면, 하나 이상의 다양한 상업적 약학적 키트 성분, 예를 들면, 당업자들이 용이하게 알 수 있는 바와 같은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 추가의 컨테이너 등을 갖는 컨테이너를 포함할 수 있다. 투여되는 성분의 양 투여 안내 및/또는 성분 혼합을 안내하는 인쇄된 사용 설명서가 삽입물 또는 라벨로서 키트에 또한 포함될 수 있다.

예를 들면, 인간 소주망 세포에서 내생적 표적 유전자 발현 레벨을 녹다운 시키기 위한 간섭 RNA의 능력은, 예를 들면, 하기와 같이 시험관 내에서 평가될 수 있다. 형질전환된 인간 TM 세포, 예를 들어, GTM-3 또는 HTM-3 (참조 Pang, LH. et ah,. 1994. Curr. Eye Res. 13:51-63)로 설계된 세포주를 표준 성장 배지(예: 10% 우태아혈청이 보충된 DMEM)에서 형질감염시키기 24 시간 전에 평판 배양하였다. 형질감염은 제조자의 지시에 따라 Dharmafect 1(Dharmacon, Lafayette, CO)을 사용하여, 0.1 nM-100 nM 범위의 간섭 RNA 농도에서 수행하였다. SiCONTROL™ Non-Targeting siRNA #1 및 siCONTROL™ Cyclophilin B siRNA (Dharmacon)을 각각 음성 및 양성 대조군으로 이용하였다. 형질감염 후 24 시간에 예를 들어, TAQMAN® 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머 및 바람직하게 표적 부위를 포함하는 프로브 세트를 이용하여 표적 mRNA 수준 및 사이클로필린(cyclophilin) B mRNA (PPIB, NM_000942) 수준을 qPCR로 평가하였다(Applied Biosystems, Foster City, CA). 형질감염 효능이 100%인 경우, 양성 대조 siRNA는 사이클로필린 B mRNA의 필수적으로 완전한 녹다운을 제공하였다. 이에 따라, 표적 mRNA 녹다운은 사이클로필린 B siRNA로 형질감염된 TM 세포 중에서 사이클로필린 B mRNA 수준을 참조로 하여 형질감염 효능을 위하여 수집하였다. 표적 단백질 수준은, 형질감염 약 72 시간 후(실제 시간은 단백질 전환율에 좌우됨), 예를 들어, 웨스턴 블랏으로 평가될 수 있다. 배양된 세포로부터의 RNA 및/또는 단백질 분리를 위한 표준 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 비-특이적인 기회, 오프 표적 효과를 감소시키기 위하여, 가능한 가장 작은 간섭 RNA 농도가 표적 유전자 발현에서 원하는 수준의 녹다운을 생산하기 위하여 사용되어야 한다.

Rho 키나아제 단백질 발현의 녹-다운 수준에 대한 본 발명의 간섭 RNA의 효능은 하기 실시예 1 및 2에서 더욱 예시된다.

실시예 1

소주망 세포에서 ROCK1 을 특이적으로 침묵시키는 간섭 RNA

본 연구에서는 배양된 인간 녹내장 소주망(TM) 세포에서 내생적 ROCK1 발현의 수준을 녹다운시키기 위한 ROCK1 간섭 RNA 효능을 실험하였다.

GTM-3 세포 (Pang, IJH., et al, 1994 Curr Eye Res. 13:51-63)의 형질감염은 표준 시험관 내 농도 (100 nM)의 ROCK1 또는 ROCK2 siRNAs, 또는 비-표적 대조 군 siRNA 및 DHARMAFECT® #1 형질감염 시약(Dharmacon, Chicago, IL)를 이용하여 수행하였다. 모든 siRNA를 1 X siRNA 완충액, 20 mM KCl의 수용액, 6 mM HEPES(pH 7.5), 0.2 mM MgCl₂ 중에 용해시켰다. 트랜스펙션 72 시간 후, 웨스턴 블롯 분석으로 ROCK1 단백질 발현을 평가하였다. ROCK1 siRNA는 다음 표적에 대하여 특이성을 갖는 이중-가닥 간섭 RNA이다: siROCK1#1은 서열 번호 23을 표적으로 하며; siROCK1#2는 서열 번호 29를 표적으로 하고; siROCK1#3은 서열 번호 10을 표적으로 하며; siROCK1#4는 서열 번호 9를 표적으로 한다. siROCK2 서열은 실시예 2에 나타내었다. 도 1의 웨스턴 블롯 데이터에서 나타낸 바와 같이, 각각의 4개의 ROCK1 siRNA는 100 nM에서 비-표적 대조 siRNA와 비교하여 ROCK1 발현이 감소되었다. 서열 번호 29를 표적으로 하는 siROCK1#2 및 서열 번호 10을 표적으로 하는 siROCK1#3가 특히 효율적인 것으로 나타났다. ROCK siRNA는 ROCK1 발현에 대한 영향을 거의 갖지 않으며, ROCK2 표적에 대한 ROCK2 siRNA의 특이성이 확인되었다.

더 낮은 농도에서 siRNA를 이용하여 다른 연구를 수행하였다. GTM-3 세포를 10nM, 1nM 및 0.1nM에서 ROCK1 또는 비-표적 대조 siRNA로 형질감염시키고, 형질감염 72 시간 후에, 웨스턴 블롯 분석으로 표적 유전자 발현을 평가하였다. 대조 샘플은 siRNA의 부피가 같은 부피의 1X siRNA 완충액(-siRNA)으로 대체된 완충액 대조군을 포함한다. 표 2의 데이터에서 나타낸 바와 같이, 각각의 4개의 ROCK1 siRNA는 10nM 및 1nM에서 ROCK1 단백질 발현을 유의적으로 감소시키나, 0.1nM에서 siROCK1#2는 ROCK1 단백질 발현을 상대적으로 효율적으로 침묵시킨다.

실시예 2

소주망 세포에서 ROCK2 를 특이적으로 침묵시키는 간섭 RNA

본 연구에서는 배양된 인간 녹내장 소주망(TM) 세포에서 내생적 ROCK2 발현의 수준을 녹다운시키기 위한 ROCK2 간섭 RNA 효능을 실험하였다.

GTM-3 세포 (Pang, IJH., et al, 1994 Curr Eye Res. 13:51-63)의 형질감염은 표준 시험관 내 농도 (100 nM)의 ROCK1 또는 ROCK2 siRNA, 또는 비-표적 대조군 siRNA 및 DHARMAFECT® #1 형질감염 시약(Dharmacon, Chicago, IL)를 이용하여 수행하였다. 트랜스펙션 72 시간 후, 웨스턴 블롯 분석으로 ROCK2 단백질 발현을 평가하였다. ROCK2 siRNA는 다음 표적에 대하여 특이성을 갖는 이중-가닥 간섭 RNA이다: siROCK2#1은 서열 번호 33을 표적으로 하며; siROCK2#2는 서열 번호 38을 표적으로 하고; siROCK2#3은 서열 번호 34를 표적으로 하며; siROCK2#4는 서열 번호 39를 표적으로 한다. 도 3의 웨스턴 블롯 데이터에서 나타낸 바와 같이, 각각의 4개의 ROCK2 siRNA는 100 nM에서 비-표적 대조 siRNA 및 ROCK1-특이적 siRNA의 풀(pool)과 비교하여 ROCK2 발현이 감소되었다. ROCK1 siRNA 풀은 ROCK2 발현에 대한 영향을 거의 갖지 않으며, ROCK1 표적에 대한 ROCK1 siRNA의 특이성이 확인된다.

더 낮은 농도에서 siRNA를 이용하여 다른 연구를 수행하였다. GTM-3 세포를 10nM, 1nM 및 0.1nM에서 ROCK2 또는 비-표적 대조 siRNA로 형질감염시키고, 형질감염 72 시간 후에, 웨스턴 블롯 분석으로 표적 유전자 발현을 평가하였다. 대조 샘플은 siRNA의 부피가 같은 부피의 1X siRNA 완충액(-siRNA)으로 대체된 완충액 대 조군을 포함한다. 표 4의 데이터에서 나타낸 바와 같이, 각각의 4개의 siRNA는 10nM 및 1nM에서 ROCK2 단백질 발현을 유의적으로 감소시키며, siROCK2#3에서는 다른 것들보다 약간 더 큰 효능을 보유하였다.

본원에 진술된 예시적인 절차 또는 다른 상세한 보충이 제공된다는 점에서 본 명세서에 인용된 참조는 특별히 참조에 의해 구체화된다.

당업자들은 본 명세서에 비추어볼 경우, 본원에 개시된 구체예의 명백한 변형은 본 발명의 의도 및 영역을 벗어나지 않고 만들어질 수 있다는 것을 식별할 수 있을 것이다. 본원에서 개시된 모든 구체예는 본 명세서에 비추어볼 경우, 불필요한 실험 없이 만들어질 수 있으며 실행될 수 있다. 본 발명의 모든 영역은 명세서 및 이와 동등한 구체예로 준비되었다. 명세서는 본 발명의 본 발명에 주어진 권리를 보호하기 위한 전체 관점에서 과도하게 좁게 해석되지 않아야 한다.

본원에서는 달리 특정되지 않으면 단수는 "하나", "적어도 하나" 또는 "하나 이상"의 의미를 갖는다.

SEQUENCE LISTING <110> Alcon Manufacturing, Ltd. Chatterton, Jon E. Clark, Abbot F. <120> RNAi-MEDIATED INHIBITION OF RHO KINASE FOR TREATMENT OF OCULAR DISORDERS <130> 45263-P013WO <150> 60/754,094 <151> 2005-12-27 <160> 84 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 4065 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgtcgactg gggacagttt tgagactcga tttgaaaaaa tggacaacct gctgcgggat 60 cccaaatcgg aagtgaattc ggattgtttg ctggatggat tggatgcttt ggtatatgat 120 ttggattttc ctgccttaag aaaaaacaaa aatattgaca actttttaag cagatataaa 180 gacacaataa ataaaatcag agatttacga atgaaagctg aagattatga agtagtgaag 240 gtgattggta gaggtgcatt tggagaagtt caattggtaa ggcataaatc caccaggaag 300 gtatatgcta tgaagcttct cagcaaattt gaaatgataa agagatctga ttctgctttt 360 ttctgggaag aaagggacat catggctttt gccaacagtc cttgggttgt tcagcttttt 420 tatgcattcc aagatgatcg ttatctctac atggtgatgg aatacatgcc tggtggagat 480 cttgtaaact taatgagcaa ctatgatgtg cctgaaaaat gggcacgatt ctatactgca 540 gaagtagttc ttgcattgga tgcaatccat tccatgggtt ttattcacag agatgtgaag 600 cctgataaca tgctgctgga taaatctgga catttgaagt tagcagattt tggtacttgt 660 atgaagatga ataaggaagg catggtacga tgtgatacag cggttggaac acctgattat 720 atttcccctg aagtattaaa atcccaaggt ggtgatggtt attatggaag agaatgtgac 780 tggtggtcgg ttggggtatt tttatacgaa atgcttgtag gtgatacacc tttttatgca 840 gattctttgg ttggaactta cagtaaaatt atgaaccata aaaattcact tacctttcct 900 gatgataatg acatatcaaa agaagcaaaa aaccttattt gtgccttcct tactgacagg 960 gaagtgaggt tagggcgaaa tggtgtagaa gaaatcaaac gacatctctt cttcaaaaat 1020 gaccagtggg cttgggaaac gctccgagac actgtagcac cagttgtacc cgatttaagt 1080 agtgacattg atactagtaa ttttgatgac ttggaagaag ataaaggaga ggaagaaaca 1140 ttccctattc ctaaagcttt cgttggcaat caactacctt ttgtaggatt tacatattat 1200 agcaatcgta gatacttatc ttcagcaaat cctaatgata acagaactag ctccaatgca 1260 gataaaagct tgcaggaaag tttgcaaaaa acaatctata agctggaaga acagctgcat 1320 aatgaaatgc agttaaaaga tgaaatggag cagaagtgca gaacctcaaa cataaaacta 1380 gacaagataa tgaaagaatt ggatgaagag ggaaatcaaa gaagaaatct agaatctaca 1440 gtgtctcaga ttgagaagga gaaaatgttg ctacagcata gaattaatga gtaccaaaga 1500 aaagctgaac aggaaaatga gaagagaaga aatgtagaaa atgaagtttc tacattaaag 1560 gatcagttgg aagacttaaa gaaagtcagt cagaattcac agcttgctaa tgagaagctg 1620 tcccagttac aaaagcagct agaagaagcc aatgacttac ttaggacaga atcggacaca 1680 gctgtaagat tgaggaagag tcacacagag atgagcaagt caattagtca gttagagtcc 1740 ctgaacagag agttgcaaga gagaaatcga attttagaga attctaagtc acaaacagac 1800 aaagattatt accagctgca agctatatta gaagctgaac gaagagacag aggtcatgat 1860 tctgagatga ttggagacct tcaagctcga attacatctt tacaagagga ggtgaagcat 1920 ctcaaacata atctcgaaaa agtggaagga gaaagaaaag aggctcaaga catgcttaat 1980 cactcagaaa aggaaaagaa taatttagag atagatttaa actacaaact taaatcatta 2040 caacaacggt tagaacaaga ggtaaatgaa cacaaagtaa ccaaagctcg tttaactgac 2100 aaacatcaat ctattgaaga ggcaaagtct gtggcaatgt gtgagatgga aaaaaagctg 2160 aaagaagaaa gagaagctcg agagaaggct gaaaatcggg ttgttcagat tgagaaacag 2220 tgttccatgc tagacgttga tctgaagcaa tctcagcaga aactagaaca tttgactgga 2280 aataaagaaa ggatggagga tgaagttaag aatctaaccc tgcaactgga gcaggaatca 2340 aataagcggc tgttgttaca aaatgaattg aagactcaag catttgaggc agacaattta 2400 aaaggtttag aaaagcagat gaaacaggaa ataaatactt tattggaagc aaagagatta 2460 ttagaatttg agttagctca gcttacgaaa cagtatagag gaaatgaagg acagatgcgg 2520 gagctacaag atcagcttga agctgagcaa tatttctcga cactttataa aacccaggta 2580 aaggaactta aagaagaaat tgaagaaaaa aacagagaaa atttaaagaa aatacaggaa 2640 ctacaaaatg aaaaagaaac tcttgctact cagttggatc tagcagaaac aaaagctgag 2700 tctgagcagt tggcgcgagg ccttctggaa gaacagtatt ttgaattgac gcaagaaagc 2760 aagaaagctg cttcaagaaa tagacaagag attacagata aagatcacac tgttagtcgg 2820 cttgaagaag caaacagcat gctaaccaaa gatattgaaa tattaagaag agagaatgaa 2880 gagctaacag agaaaatgaa gaaggcagag gaagaatata aactggagaa ggaggaggag 2940 atcagtaatc ttaaggctgc ctttgaaaag aatatcaaca ctgaacgaac ccttaaaaca 3000 caggctgtta acaaattggc agaaataatg aatcgaaaag attttaaaat tgatagaaag 3060 aaagctaata cacaagattt gagaaagaaa gaaaaggaaa atcgaaagct gcaactggaa 3120 ctcaaccaag aaagagagaa attcaaccag atggtagtga aacatcagaa ggaactgaat 3180 gacatgcaag cgcaattggt agaagaatgt gcacatagga atgagcttca gatgcagttg 3240 gccagcaaag agagtgatat tgagcaattg cgtgctaaac ttttggacct ctcggattct 3300 acaagtgttg ctagttttcc tagtgctgat gaaactgatg gtaacctccc agagtcaaga 3360 attgaaggtt ggctttcagt accaaataga ggaaatatca aacgatatgg ctggaagaaa 3420 cagtatgttg tggtaagcag caaaaaaatt ttgttctata atgacgaaca agataaggag 3480 caatccaatc catctatggt attggacata gataaactgt ttcacgttag acctgtaacc 3540 caaggagatg tgtatagagc tgaaactgaa gaaattccta aaatattcca gatactatat 3600 gcaaatgaag gtgaatgtag aaaagatgta gagatggaac cagtacaaca agctgaaaaa 3660 actaatttcc aaaatcacaa aggccatgag tttattccta cactctacca ctttcctgcc 3720 aattgtgatg cctgtgccaa acctctctgg catgttttta agccaccccc tgccctagag 3780 tgtcgaagat gccatgttaa gtgccacaga gatcacttag ataagaaaga ggacttaatt 3840 tgtccatgta aagtaagtta tgatgtaaca tcagcaagag atatgctgct gttagcatgt 3900 tctcaggatg aacaaaaaaa atgggtaact catttagtaa agaaaatccc taagaatcca 3960 ccatctggtt ttgttcgtgc ttcccctcga acgctttcta caagatccac tgcaaatcag 4020 tctttccgga aagtggtcaa aaatacatct ggaaaaacta gttaa 4065 <210> 2 <211> 6401 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 caaggcggcc ggcggcgacc atggcagcgg gccggcggcg gccgtagtgg cccaggcctg 60 ggcttcagcc tcccggggcc ccagagggcg gggcggtccg ggccgcggcg gtggcggcgc 120 cacttccctg ctcccgcccg aggactcctg cgggcactcg ctgaggacca gcggaccggc 180 ggcgcgaatc tgactgaggg gcggggacgc cgtctgttcc ccgccgctcc cggcagggcc 240 gggccgggct gggccgggct gggccgggcg ggcccctggg agcagccccc aggcggggga 300 ccgccttgga gacccgaagc cggagctaga ggcaggcggt gggcccgggt ggagtcccgg 360 ccggagctgg tggttcgggg gcggtgctag gccccgaggc tgcgggacct gagcgcgagg 420 agcctgagtg cgggtccagc ggtggcggca tgagccggcc cccgccgacg gggaaaatgc 480 ccggcgcccc cgagaccgcg ccgggggacg gggcaggcgc gagccgccag aggaagctgg 540 aggcgctgat ccgagaccct cgctccccca tcaacgtgga gagcttgctg gatggcttaa 600 attccttggt ccttgattta gattttcctg ctttgaggaa aaacaagaac atagataatt 660 tcttaaatag atatgagaaa attgtgaaaa aaatcagagg tctacagatg aaggcagaag 720 actatgatgt tgtaaaagtt attggaagag gtgcttttgg tgaagtgcag ttggttcgtc 780 acaaggcatc gcagaaggtt tatgctatga agcttcttag taagtttgaa atgataaaaa 840 gatcagattc tgcctttttt tgggaagaaa gagatattat ggcctttgcc aatagcccct 900 gggtggttca gcttttttat gcctttcaag atgataggta tctgtacatg gtaatggagt 960 acatgcctgg tggagacctt gtaaacctta tgagtaatta tgatgtgcct gaaaaatggg 1020 ccaaatttta cactgctgaa gttgttcttg ctctggatgc aatacactcc atgggtttaa 1080 tacacagaga tgtgaagcct gacaacatgc tcttggataa acatggacat ctaaaattag 1140 cagattttgg cacgtgtatg aagatggatg aaacaggcat ggtacattgt gatacagcag 1200 ttggaacacc ggattatata tcacctgagg ttctgaaatc acaagggggt gatggtttct 1260 atgggcgaga atgtgattgg tggtctgtag gtgttttcct ttatgagatg ctagtggggg 1320 atactccatt ttatgcggat tcacttgtag gaacatatag caaaattatg gatcataaga 1380 attcactgtg tttccctgaa gatgcagaaa tttccaaaca tgcaaagaat ctcatctgtg 1440 ctttcttaac agatagggag gtacgacttg ggagaaatgg ggtggaagaa atcagacagc 1500 atcctttctt taagaatgat cagtggcatt gggataacat aagagaaacg gcagctcctg 1560 tagtacctga actcagcagt gacatagaca gcagcaattt cgatgacatt gaagatgaca 1620 aaggagatgt agaaaccttc ccaattccta aagcttttgt tggaaatcag ctgcctttca 1680 tcggatttac ctactataga gaaaatttat tattaagtga ctctccatct tgtagagaaa 1740 ctgattccat acaatcaagg aaaaatgaag aaagtcaaga gattcagaaa aaactgtata 1800 cattagaaga acatcttagc aatgagatgc aagccaaaga ggaactggaa cagaagtgca 1860 aatctgttaa tactcgccta gaaaaaacag caaaggagct agaagaggag attaccttac 1920 ggaaaagtgt ggaatcagca ttaagacagt tagaaagaga aaaggcgctt cttcagcaca 1980 aaaatgcaga atatcagagg aaagctgatc atgaagcaga caaaaaacga aatttggaaa 2040 atgatgttaa cagcttaaaa gatcaacttg aagatttgaa aaaaagaaat caaaactctc 2100 aaatatccac tgagaaagtg aatcaactcc agagacaact ggatgaaacc aatgctttac 2160 tgcgaacaga gtctgatact gcagcccggt taaggaaaac ccaggcagaa agttcaaaac 2220 agattcagca gctggaatct aacaatagag atctacaaga taaaaactgc ctgctggaga 2280 ctgccaagtt aaaacttgaa aaggaattta tcaatcttca gtcagctcta gaatctgaaa 2340 ggagggatcg aacccatgga tcagagataa ttaatgattt acaaggtaga atatgtggcc 2400 tagaagaaga tttaaagaac ggcaaaatct tactagcgaa agtagaactg gagaagagac 2460 aacttcagga gagatttact gatttggaaa aggaaaaaag caacatggaa atagatatga 2520 cataccaact aaaagttata cagcagagcc tagaacaaga agaagctgaa cataaggcca 2580 caaaggcacg actagcagat aaaaataaga tctatgagtc catcgaagaa gccaaatcag 2640 aagccatgaa agaaatggag aagaagctct tggaggaaag aactttaaaa cagaaagtgg 2700 agaacctatt gctagaagct gagaaaagat gttctctatt agactgtgac ctcaaacagt 2760 cacagcagaa aataaatgag ctccttaaac agaaagatgt gctaaatgag gatgttagaa 2820 acctgacatt aaaaatagag caagaaactc agaagcgctg ccttacacaa aatgacctga 2880 agatgcaaac acaacaggtt aacacactaa aaatgtcaga aaagcagtta aagcaagaaa 2940 ataaccatct catggaaatg aaaatgaact tggaaaaaca aaatgctgaa cttcgaaaag 3000 aacgtcagga tgcagatggg caaatgaaag agctccagga tcagctcgaa gcagaacagt 3060 atttctcaac cctttataaa acacaagtta gggagcttaa agaagaatgt gaagaaaaga 3120 ccaaacttgg taaagaattg cagcagaaga aacaggaatt acaggatgaa cgggactctt 3180 tggctgccca actggagatc accttgacca aagcagattc tgagcaactg gctcgttcaa 3240 ttgctgaaga acaatattct gatttggaaa aagagaagat catgaaagag ctggagatca 3300 aagagatgat ggctagacac aaacaggaac ttacggaaaa agatgctaca attgcttctc 3360 ttgaggaaac taataggaca ctaactagtg atgttgccaa tcttgcaaat gagaaagaag 3420 aattaaataa caaattgaaa gatgttcaag agcaactgtc aagattgaaa gatgaagaaa 3480 taagcgcagc agctattaaa gcacagtttg agaagcagct attaacagaa agaacactca 3540 aaactcaagc tgtgaataag ttggctgaga tcatgaatcg aaaagaacct gtcaagcgtg 3600 gtaatgacac agatgtgcgg agaaaagaga aggagaatag aaagctacat atggagctta 3660 aatctgaacg tgagaaattg acccagcaga tgatcaagta tcagaaagaa ctgaatgaaa 3720 tgcaggcaca aatagctgaa gagagccaga ttcgaattga actgcagatg acattggaca 3780 gtaaagacag tgacattgag cagctgcggt cacaactcca agccttgcat attggtctgg 3840 atagttccag tataggcagt ggaccagggg atgctgaggc agatgatggg tttccagaat 3900 caagattaga aggatggctt tcattgcctg tacgaaacaa cactaagaaa tttggatggg 3960 ttaaaaagta tgtgattgta agcagtaaga agattctttt ctatgacagt gaacaagata 4020 aagaacaatc caatccttac atggttttag atatagacaa gttatttcat gtccgaccag 4080 ttacacagac agatgtgtat agagcagatg ctaaagaaat tccaaggata ttccagattc 4140 tgtatgccaa tgaaggagaa agtaagaagg aacaagaatt tccagtggag ccagttggag 4200 aaaaatctaa ttatatttgc cacaagggac atgagtttat tcctactctt tatcatttcc 4260 caaccaactg tgaggcttgt atgaagcccc tgtggcacat gtttaagcct cctcctgctt 4320 tggagtgccg ccgttgccat attaagtgtc ataaagatca tatggacaaa aaggaggaga 4380 ttatagcacc ttgcaaagta tattatgata tttcaacggc aaagaatctg ttattactag 4440 caaattctac agaagagcag cagaagtggg ttagtcggtt ggtgaaaaag atacctaaaa 4500 agcccccagc tccagaccct tttgcccgat catctcctag aacttcaatg aagatacagc 4560 aaaaccagtc tattagacgg ccaagtcgac agcttgcccc aaacaaacct agctaactgc 4620 cttctatgaa agcagtcatt attcaaggtg atcgtattct tccagtgaaa acaagactga 4680 aatatgatgg cccaaaattt attaaaaagc tatattttcc tgagagactg atacatacac 4740 tcatacatat atgtgttccc cttttccctg taatataaat tacaaatctg ggctcctttg 4800 aagcaacagg ttgaaccaac aatgattggt tgatagacta aggatatatg caactcttcc 4860 agacttttcc ataaagctct ctcggcagtc gctcacacta caatgcacac aaggattgag 4920 aagagttaaa ggctaaagaa aacatctttt ctagcttcaa cagagaggtt tcaccagcac 4980 atttaccaga agaatctggg aatggattcc actacagtga tattgactgc atctttaaga 5040 agtgaccatt atactgtgta tatatatata aacacacaca catatatata tatatatata 5100 gtactctaat actgcaagaa ggttttttaa acttcccact ttatttttta tacacattaa 5160 tcagatatca ttacttgctg cagttgcaac tatgcacttg tataaagcca taatgttgga 5220 gtttatatca ctcattcctg tgtacctgat ggaagttgca tgttcatgtt taagcagtta 5280 ctgtaacaag aagtttaaag ttaattatat cagtttccta atgcttcatg ataggcaact 5340 ttacccattt tgaatgcctt aatttaattt ttttcaaagt ctcagccctg tctgtattaa 5400 aaaacaaaaa aagcgtttac cagctcttag gatgtaaact agctttgtgg aagataaatc 5460 gtgcactatt tttacacata aatagttata tcaatgtcag cctattttga ttaacaaatg 5520 tttttaaagt attattggtt atagaaacaa taatggatgg tgttggaact aatatatcct 5580 tgatgtctgt ctattattca ttcaactctt tttacagacc tcagtattag tctgtgacta 5640 caaaatattt tatttgcttt aaatttgctg gctaccctag atgtgttttt attcctggta 5700 aagacatttg tgattacatt ttcacactta agattcaaaa tttttcccaa atataaagaa 5760 aactaagaca gactgtagat gcattttaaa tatttaaata tgatcctcag acatgcagct 5820 gtgtgtggca gtattttagt accgggttaa gaaaactggc aactgggaag aagtggcctc 5880 aaaggcactt aatttgattt ttatttttta aatgctgtca aagttacagt ttacgcagga 5940 cattcttgcc gtattctcat gatcccagat aagtgtgtgt tttatactgc aacaatatgc 6000 agcaatggta agcgtaaagt tttttttttg tttttgtttt tttttatatt atgaagtctt 6060 ttaacagtct ctctttatat aaatacacag agtttggtat gatatttaaa tacatcatct 6120 ggccaggcat ggtggcttac gcctgtaatc ctagcacttt gggaggccaa gacgggcgga 6180 tcacctgagg tgaggagttc aagaccagcc tgcccaacat agtgaaactc cgtctctacc 6240 aatatacaaa aattagccgg gcatgatggt ggtggcctgt aatcccagct acttgggagg 6300 ctgagacagg agaatcgctt gaacccagga gacggtggtt gcagtgagcg aagatcgagc 6360 cactgcactc cagcctgggc agctgaacaa gactccgtct c 6401 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 3 ataacatgct gctggataa 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense strand with 3'NN <220> <221> misc_RNA <222> (1)..(19) <223> ribonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> any, 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Target Sequence <400> 10 gtatgaagat gaataagga 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 11 tagctccaat gcagataaa 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 12 atcagttgga agacttaaa 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 13 gaccttcaag ctcgaatta 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 14 gaacatttga ctggaaata 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 15 tagctcagct tacgaaaca 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 16 acgaaacagt atagaggaa 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 17 tttgaattga cgcaagaaa 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 18 cactgttagt cggcttgaa 19 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 19 acagcatgct aaccaaaga 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 20 gttaacaaat tggcagaaa 19 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 21 accagatggt agtgaaaca 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 22 gtagaagaat gtgcacata 19 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 23 gcaaagagag tgatattga 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 24 gtaccaaata gaggaaata 19 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 25 gttctataat gacgaacaa 19 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 26 gataaactgt ttcacgtta 19 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 27 taaactgttt cacgttaga 19 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 28 gtttcacgtt agacctgta 19 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 29 tgtcgaagat gccatgtta 19 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 30 gtcgaagatg ccatgttaa 19 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 31 acaacatgct cttggataa 19 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 32 tgttaatact cgcctagaa 19 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 33 gaaagctgat catgaagca 19 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 34 cagctggaat ctaacaata 19 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 35 gatatgacat accaactaa 19 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 36 aggcacgact agcagataa 19 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 37 attagactgt gacctcaaa 19 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 38 gatgatggct agacacaaa 19 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 39 ctaaagaaat tccaaggat 19 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 40 tcgtattctt ccagtgaaa 19 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 41 ttgcaactat gcacttgta 19 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 42 caactatgca cttgtataa 19 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 43 gttgcatgtt catgtttaa 19 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 44 ttcctaatgc ttcatgata 19 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 45 ctagctttgt ggaagataa 19 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 46 gaagataaat cgtgcacta 19 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 47 ccttgatgtc tgtctatta 19 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 48 cttgatgtct gtctattat 19 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 49 tttacagacc tcagtatta 19 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 50 tattagtctg tgactacaa 19 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 51 taaatatgat cctcagaca 19 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 52 cagcaatggt aagcgtaaa 19 <210> 53 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 53 ctccgtctct accaatata 19 <210> 54 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 54 tgatggtggt ggcctgtaa 19 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 55 cttgctggat ggcttaaat 19 <210> 56 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 56 ggattcactt gtaggaaca 19 <210> 57 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 57 tcatcggatt tacctacta 19 <210> 58 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 58 taaatgagct ccttaaaca 19 <210> 59 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 59 gttagaaacc tgacattaa 19 <210> 60 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 60 ataaccatct catggaaat 19 <210> 61 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 61 tctcttgagg aaactaata 19 <210> 62 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 62 caatcttgca aatgagaaa 19 <210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 63 taagcgcagc agctattaa 19 <210> 64 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 64 gagaatagaa agctacata 19 <210> 65 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 65 gctacatatg gagcttaaa 19 <210> 66 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 66 ctacatatgg agcttaaat 19 <210> 67 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 67 gatgacattg gacagtaaa 19 <210> 68 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 68 tctggatagt tccagtata 19 <210> 69 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 69 gaacaatcca atccttaca 19 <210> 70 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 70 gtatagagca gatgctaaa 19 <210> 71 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 71 ataaagccat aatgttgga 19 <210> 72 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 72 tagctttgtg gaagataaa 19 <210> 73 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 73 aacgacatct cttcttcaa 19 <210> 74 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 74 gaagaaacat tccctattc 19 <210> 75 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 75 tagcaatcgt agatactta 19 <210> 76 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 76 gccaatgact tacttagga 19 <210> 77 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 77 ggacacagct gtaagattg 19 <210> 78 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 78 gagatgagca agtcaatta 19 <210> 79 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 79 gtaaccaaag ctcgtttaa 19 <210> 80 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Sense Strand <400> 80 auaacaugcu gcuggauaa 19 <210> 81 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Strand <400> 81 uuauccagca gcauguuau 19 <210> 82 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Strand <400> 82 ataacatgct gctggataaa tctgg 25 <210> 83 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Sense Strand <400> 83 auaacaugcu gcuggauaaa ucugg 25 <210> 84 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Strand <400> 84 ccagauuuau ccagcagcau guuauuu 27

Claims

센스 뉴클레오티드 가닥, 생리적 조건 하에 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA 부분에 혼성화되고 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 각각에 상응하는 mRNA 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는 안티센스 뉴클레오티드 가닥, 및 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의 완벽한 인접 상보성 영역을 포함하며, 19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하여 Rho 키나아제 mRNA의 발현을 약화시키는 것을 포함하는, 대상의 Rho 키나아제 mRNA의 발현 약화 방법.
제 1항에 있어서, 대상은 고안압증을 갖는 인간임을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 대상은 고안압증 발생의 위험이 있는 인간임을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 조성물은 국소적, 유리체내, 경공막(transcleral), 눈주변, 결막, 테논낭하, 전방내, 망막하, 결막하, 눈뒤 또는 시신경관내 경로를 통하여 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 605, 653, 659, 1248, 1562, 1876, 2266, 2474, 2485, 2740, 2808, 2834, 3007, 3146, 3199, 3245, 3379, 3453, 3511, 3513, 3519, 3781, 3782, 998, 1132, 1200, 1648, 1674, 1708, 또는 2077을 포함하는 서열 번호 1에 상응하는 mRNA를 표적으로 하도록 설계됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 1102, 1865, 2000, 2229, 2514, 2584, 2738, 3305, 4111, 4652, 5184, 5187, 5255, 5315, 5439, 5450, 5578, 5579, 5611, 5625, 5795, 6000, 6228, 6264, 584, 1337, 1678, 2773, 2814, 2941, 3357, 3398, 3481, 3633, 3644, 3645, 3767, 3836, 4023, 4097, 5202, 또는 5440을 포함하는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA를 표적으로 하도록 설계됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 센스 뉴클레오티드 가닥, 생리적 조건 하에 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA 제2 부분에 혼성화되고 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 각각에 상응하는 mRNA 제2 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는 안티센스 뉴클레오티드 가닥, 및 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의 완벽한 인접 상보성 영역을 포함하며, 19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 제2 간섭 RNA를 대상에 투여하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
센스 뉴클레오티드 가닥, 생리적 조건 하에 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA 부분에 혼성화되고 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 각각에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는 안티센스 뉴클레오티드 가닥, 및 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의 완벽한 인접 상보성 영역을 포함하며, 19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상의 눈에 투여하여 고안압증을 치료하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상에서 고안압증의 치료 방법.
19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 단일 가닥 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하여 Rho 키나아제 mRNA의 발현을 약화시키는 것을 포함하는, 대상의 Rho 키나아제 mRNA의 발현 약화 방법으로서,

상기 단일 가닥 간섭 RNA는 생리적 조건하에 뉴클레오티드 605, 653, 659, 1248, 1562, 1876, 2266, 2474, 2485, 2740, 2808, 2834, 3007, 3146, 3199, 3245, 3379, 3453, 3511, 3513, 3519, 3781, 3782, 998, 1132, 1200, 1648, 1674, 1708, 또는 2077을 포함하는 서열 번호 1에 상응하는 mRNA 부분과 혼성화되고, 서열 번호 1에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖거나;

단일 가닥 간섭 RNA가 생리적 조건하에 뉴클레오티드 1102, 1865, 2000, 2229, 2514, 2584, 2738, 3305, 4111, 4652, 5184, 5187, 5255, 5315, 5439, 5450, 5578, 5579, 5611, 5625, 5795, 6000, 6228, 6264, 584, 1337, 1678, 2773, 2814, 2941, 3357, 3398, 3481, 3633, 3644, 3645, 3767, 3836, 4023, 4097, 5202, 또는 5440을 포함하는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA 부분과 혼성화되고, 간섭 RNA는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는 방법.
19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 가지며, 서열 번호 3 및 서열 번호 9 - 서열 번호 79 중 임의의 하나에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하여 고안압증 표적 mRNA의 발현을 약화시키는 것을 포함하는, 대상의 고안압증 표적 mRNA의 발현 약화 방법.
제 10항에 있어서, 고안압증 표적 mRNA가 ROCK1 mRNA이며, 간섭 RNA는 서열 번호 3, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번 호 30, 서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 또는 서열 번호 79에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 고안압증 표적 mRNA가 ROCK2 mRNA이며, 간섭 RNA는 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 45, 서열 번호 46, 서열 번호 47, 서열 번호 48, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 서열 번호 55, 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 64, 서열 번호 65, 서열 번호 66, 서열 번호 67, 서열 번호 68, 서열 번호 69, 서열 번호 70, 서열 번호 71, 또는 서열 번호 72에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 간섭 RNA는 서열 식별자로 확인되는 서열에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 14개의 뉴클레오티드와 적어도 85% 서열 상보성 또는 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 간섭 RNA는 서열 식별자로 확인되는 서열에 각각 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 15, 16, 17 또는 18개의 뉴클레오티드와 적어도 80% 서열 상보성 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 적어도 15, 16, 17 또는 18개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 조성물은 19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 가지며 서열 번호 3 및 서열 번호 9 - 서열 번호 49 중 임의의 하나에 상응하는 제2 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 제2 간섭 RNA를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 가지며, 서열 번호 3 및 서열 번호 9 - 서열 번호 79 중 임의의 하나에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상의 눈에 투여하여 고안압증을 치료하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상에서 고안압증의 치료 방법.
제 16항에 있어서, 간섭 RNA는 서열 번호 3, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 또는 서열 번호 79에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 간섭 RNA는 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 45, 서열 번호 46, 서열 번호 47, 서열 번호 48, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 서열 번호 55, 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 64, 서열 번호 65, 서열 번호 66, 서열 번호 67, 서열 번호 68, 서열 번호 69, 서열 번호 70, 서열 번호 71, 또는 서열 번호 72에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적 어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 간섭 RNA는 서열 식별자로 확인되는 서열에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 14개의 뉴클레오티드와 적어도 85% 서열 상보성 또는 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 간섭 RNA는 서열 식별자로 확인되는 서열에 각각 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 15, 16, 17 또는 18개의 뉴클레오티드와 적어도 80% 서열 상보성 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 적어도 15, 16, 17 또는 18개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 조성물은 19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 가지며 서열 번호 3 및 서열 번호 9 - 서열 번호 79 중 임의의 하나에 상응하는 제2 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 제2 간섭 RNA를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 대상은 녹내장을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 센스 뉴클레오티드 가닥과 안티센스 뉴클레오티드 가닥은 헤어핀 루프에 의해 연결됨을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 센스 뉴클레오티드 가닥과 안티센스 뉴클레오티드 가닥은 헤어핀 루프에 의해 연결됨을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 간섭 RNA는 shRNA임을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 간섭 RNA는 siRNA임을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 간섭 RNA는 miRNA임을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 간섭 RNA는 shRNA임을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 간섭 RNA는 siRNA임을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 간섭 RNA는 miRNA임을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 조성물은 국소적, 유리체내, 경공막, 눈주변, 결막, 테논 낭하, 전방내, 망막하, 결막하, 눈뒤 또는 시신경관내 경로를 통하여 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 조성물은 간섭 RNA 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 조성물은 국소적, 유리체내, 경공막, 눈주변, 결막, 테논낭하, 전방내, 망막하, 결막하, 눈뒤 또는 시신경관내 경로를 통하여 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 조성물은 간섭 RNA 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여됨을 특징으로 하는 방법.
RNA 간섭을 통하여 ROCK1 또는 ROCK2 유전자의 발현을 하향 조절하는 이중 가닥 siRNA 분자를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상의 고안압증의 치료 방법으로서,

siRNA 분자의 각각의 가닥은 독립적으로 약 19개 내지 약 27개의 뉴클레오티드 길이이고; siRNA 분자의 하나의 가닥은 ROCK1 또는 ROCK2 유전자에 상응하는 mRNA에 실질적으로 상보성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 siRNA 분자가 RNA 간섭을 통하여 mRNA 절단을 지시하는 방법.
제 35항에 있어서, 조성물은 에어로졸, 구강, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복강내, 비강, 안구, 경구, 귀, 비경구, 패치, 피하, 혀 밑, 국소적 또는 경피 경로를 통하여 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 35항에 있어서, 간섭 RNA는 간섭 RNA의 발현이 가능한 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여됨을 특징으로 하는 방법.
제 35항에 있어서, 간섭 RNA는 miRNA임을 특징으로 하는 방법..
제 35항에 있어서, siRNA 분자의 각 가닥은 독립적으로 약 19개 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드 길이임을 특징으로 하는 방법.
제 35항에 있어서, siRNA 분자의 각 가닥은 독립적으로 약 19개 뉴클레오티드 내지 약 21개의 뉴클레오티드 길이임을 특징으로 하는 방법.
19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖고 서열 번호 3 및 서열 번호 9 - 서열 번호 79의 임의의 하나에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 간섭 RNA 또는 이의 상보물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
제 41항에 있어서, 간섭 RNA는 shRNA임을 특징으로 하는 조성물.
제 41항에 있어서, 간섭 RNA는 siRNA임을 특징으로 하는 조성물.
제 41항에 있어서, 간섭 RNA는 miRNA임을 특징으로 하는 조성물.
RNA 간섭을 통하여 ROCK1 또는 ROCK2 유전자의 발현을 하향 조절하는 이중 가닥 siRNA 분자를 포함하는 조성물로서,

siRNA 분자의 각각의 가닥은 독립적으로 약 19개 내지 약 27개의 뉴클레오티드 길이이고; siRNA 분자의 하나의 가닥은 ROCK1 또는 ROCK2 유전자에 상응하는 mRNA에 실질적으로 상보성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 siRNA 분자가 RNA 간섭을 통한 mRNA의 절단을 지시하는 방법.
제 45항에 있어서, siRNA 분자의 각 가닥은 독립적으로 약 19개 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드 길이임을 특징으로 하는 방법.
제 45항에 있어서, siRNA 분자의 각 가닥은 독립적으로 약 19개 뉴클레오티드 내지 약 21개의 뉴클레오티드 길이임을 특징으로 하는 방법.
서열 번호 3, 서열 번호 9 - 서열 번호 79의 임의의 하나에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하고, 19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체의, 대상에서 고안압증 mRNA의 발현 약화를 위한 조성물을 제조하는데 있어서 용도.
서열 번호 3, 서열 번호 9 - 서열 번호 79의 임의의 하나에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하고, 19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함함으로서 고안압증을 치료하는 조성물의, 대상의 고안압증 치료용 의약을 제조하는데 있어서 용도.
제 48 또는 49항에 있어서, 간섭 RNA는 서열 번호 3, 서열 번호 9 ~ 서열 번호 30 및 서열 번호 73 ~ 서열 번호 79의 어느 하나에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 48 또는 49항에 있어서, 간섭 RNA는 서열 번호 31 ~ 서열 번호 72의 어느 하나에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 48항 또는 제 49항에 있어서, 간섭 RNA는 서열 식별자로 확인되는 서열에 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 14개의 뉴클레오티드와 적어도 85% 서열 상보성 또는 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 48항 또는 제 49항에 있어서, 간섭 RNA는 서열 식별자로 확인되는 서열에 각각 상응하는 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 15, 16, 17 또는 18개의 뉴클레오티드와 적어도 80% 서열 상보성 또는 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 적어도 15, 16, 17 또는 18개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 48 또는 49항에 있어서, 19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 가지며, 서열 번호 3 및 서열 번호 9 - 서열 번호 79 중 임의의 하나에 상응하는 제2 mRNA 3' 말단의 끝에서 두번째의 13개의 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 제2 간섭 RNA를 추가로 포함함을 특징으로 하는 용도.
센스 뉴클레오티드 가닥, 생리적 조건 하에 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA 부분에 혼성화되고 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 각각에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는 안티센스 뉴클레오티드 가닥 및 적어도 19개의 뉴클레오티드의 적어도 거의 완벽한 인접 상보성 영역을 포함하며, 19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물의, 대상의 고안압증 치료용 의약을 제조하는데 있어서 용도.
19개 내지 49개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 단일 가닥 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체의, 대상의 Rho 키나아제 mRNA의 발현 약화를 위한 조성물을 제조하는데 있어서 용도로서,

단일 가닥 간섭 RNA가 생리적 조건하에 뉴클레오티드 605, 653, 659, 1248, 1562, 1876, 2266, 2474, 2485, 2740, 2808, 2834, 3007, 3146, 3199, 3245, 3379, 3453, 3511, 3513, 3519, 3781, 3782, 998, 1132, 1200, 1648, 1674, 1708, 또는 2077을 포함하는 서열 번호 1에 상응하는 mRNA 부분과 혼성화되고, 서열 번호 1에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖거나;

단일 가닥 간섭 RNA가 생리적 조건하에 뉴클레오티드 1102, 1865, 2000, 2229, 2514, 2584, 2738, 3305, 4111, 4652, 5184, 5187, 5255, 5315, 5439, 5450, 5578, 5579, 5611, 5625, 5795, 6000, 6228, 6264, 584, 1337, 1678, 2773, 2814, 2941, 3357, 3398, 3481, 3633, 3644, 3645, 3767, 3836, 4023, 4097, 5202, 또는 5440을 포함하는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA 부분과 혼성화되고, 간섭 RNA는 서열 번호 2에 상응하는 mRNA의 혼성화 부분을 갖는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 갖는 용도.
제 55항에 있어서, 센스 뉴클레오티드 가닥과 안티센스 뉴클레오티드 가닥은 헤어핀 루프에 의해 연결됨을 특징으로 하는 용도.
제 48, 49 또는 55항에 있어서, 간섭 RNA는 shRNA임을 특징으로 하는 용도.
제 48, 49 또는 55항에 있어서, 간섭 RNA는 siRNA임을 특징으로 하는 용도.
제 48, 49 또는 55항에 있어서, 간섭 RNA는 miRNA임을 특징으로 하는 용도.
제 49 또는 55항에 있어서, 조성물은 국소적, 유리체내, 경공막, 눈주변, 결막, 테논낭하, 전방내, 망막하, 결막하, 눈뒤 또는 시신경관내 투여를 위하여 제조됨을 특징으로 하는 용도.
제 49 또는 55항에 있어서, 조성물은 간섭 RNA의 발현이 가능한 발현 벡터를 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 49 또는 55항에 있어서, 의약은 고안압증의 치료용임을 특징으로 하는 용도.
RNA 간섭을 통하여 ROCK1 또는 ROCK2 유전자의 발현을 하향 조절하는 이중 가닥 siRNA 분자를 포함하는 조성물의, 대상의 고안압증 치료용 의약을 제조하는데 있어서 용도로서,

siRNA 분자의 각각의 가닥은 독립적으로 약 19개 내지 약 27개의 뉴클레오티드 길이이고; siRNA 분자의 하나의 가닥은 각각 ROCK1 또는 ROCK2 유전자에 상응하는 mRNA에 실질적으로 상보성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 siRNA 분자가 RNA 간섭을 통하여 mRNA를 절단하도록 지시하는 용도.
제 64항에 있어서, 조성물은 에어로졸, 구강, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복강내, 비강, 안구, 경구, 귀, 비경구, 패치, 피하, 혀 밑, 국소적 또는 경피 투여용으로 제조됨을 특징으로 하는 용도.
제 64항에 있어서, 조성물은 간섭 RNA의 발현이 가능한 발현 벡터를 포함함을 특징으로 하는 용도.
제 64항에 있어서, 간섭 RNA는 miRNA임을 특징으로 하는 용도.