CN102343091A - 一种基于ezrin磷酸化的物质及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于ezrin磷酸化的物质及其应用。本发明提供了抑制Ezrin第567位苏氨酸磷酸化的物质在制备具有抑制肿瘤功能的产品中的应用。所述抑制Ezrin第567位苏氨酸磷酸化的物质为如下1)或2)中任一一种：1)如下所述编码基因或所述的重组载体或重组腺病毒；2)抑制介导Ezrin第567位苏氨酸磷酸化的信号通路的物质。本发明的实验证明，在肝癌转移中相伴发生的Ezrin第567位苏氨酸的磷酸化受Rho激酶(ROCK)调控，敲除该激酶或者抑制其活性均可以减少肝癌转移的发生，在医学及制药领域发挥重要作用，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于ezrin磷酸化的物质及其应用。
背景技术
肝细胞肿瘤是东南亚人民一种主要的健康威胁。尤其在中国境内，其发病率同死亡率在所有恶性肿瘤中排名第三，占了全世界总病患数的42.5％。尽管经过了许多年不懈的努力，当前治疗策略的长期疗效仍不甚理想。其在肝组织内的高复发率和癌组织对远病灶组织的高转移率均导致了治愈率的大大降低。因此，针对肝细胞肿瘤的发生、发展以及转移的研究，寻求其有效的治疗手段是最首要的任务。在肿瘤治疗过程中，当今的绝大部分治疗方案都是抑制肿瘤细胞的生长，但是临床肿瘤学上的一个重要难题是：一旦肿瘤细胞扩散，任何抑制肿瘤细胞增殖的药物均告无效。因此，肝癌临床治疗的预后以及抑制或预防肿瘤细胞转移的方案在临床肿瘤治疗学中具有更为重要的作用。肿瘤的转移是一个多步骤的生物学过程，包括了癌细胞从原始癌灶解离，侵入血管或者淋巴组织，经循环系统转移，从血管浸出以及在目标器官中的增殖等。
发明内容
本发明的一个目的是提供抑制Ezrin第567位苏氨酸磷酸化的物质在制备具有抑制肿瘤功能的产品中的应用。
本发明提供了抑制Ezrin第567位苏氨酸磷酸化的物质在制备具有抑制肿瘤功能的产品中的应用。
所述抑制Ezrin第567位苏氨酸磷酸化的物质为如下1)或2)中任意一种：
1)如下所述蛋白或所述编码基因或所述重组载体或重组腺病毒载体或转基因细胞系或重组腺病毒；
2)抑制介导Ezrin第567位苏氨酸磷酸化的信号通路的物质。
所述抑制介导Ezrin第567位苏氨酸磷酸化的信号通路的物质为抑制Rho激酶表达/或活性的物质。
所述抑制Rho激酶表达和/或活性的物质为如下A)或B)：
A)Rho激酶抑制剂Y27632；
B)Rho激酶siRNA，所述siRNA的一条链的核苷酸序列为序列表中的序列1。
所述抑制肿瘤为抑制肿瘤细胞的迁移和/或扩散。
所述肿瘤为肝癌。
本发明的第二个目的是提供一种具有抑制肿瘤功能的产品。
本发明提供的具有抑制肿瘤功能的产品，其活性成分为抑制Ezrin第567位苏氨酸磷酸化的物质。
所述抑制Ezrin第567位苏氨酸磷酸化的物质为如下1)或2)中任意一种：
1)如下所述所述蛋白或所述编码基因或所述重组载体或重组腺病毒载体或转基因细胞系或重组腺病毒；
2)抑制介导Ezrin第567位苏氨酸磷酸化的信号通路的物质。
所述抑制Rho激酶表达/或活性的物质为如下A)或B)：
A)Rho激酶抑制剂Y27632；
B)Rho激酶siRNA，所述siRNA的一条链的核苷酸序列为序列表中的序列1。
Rho激酶的抑制剂Y27632购自美国Milipore公司，编号SCM075。
所述抑制肿瘤为抑制肿瘤细胞的迁移和/或扩散。
所述肿瘤为肝癌；
所述产品为药物。
本发明的第三个目的是提供一种蛋白。
本发明提供的蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：
1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将序列表中序列2氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。
所述蛋白的编码基因也是本发明保护的范围。
所述编码基因为1)、2)或3)：
1)序列表中的序列3所示的DNA分子；
2)与1)限定的DNA序列至少具有80％同源性且具有相同功能蛋白的DNA分子；
3)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且具有相同功能蛋白的DNA分子。
含有所述编码基因的重组载体或转基因细胞系或重组腺病毒也是本发明保护的范围。
所述重组载体具体为1)或2)：
1)所示的重组载体为将所述编码基因插入pShuttleCMV载体的SalI和NotI酶切位点间得到的载体；
2)所示的重组载体为将含有所述编码基因的片段插入pShuttleCMV载体的SalI和NotI酶切位点间得到的载体；
2)所示的重组载体具体按如下方法制备：以序列6和序列7所示的DNA作为引物，以CFP-Ezrin质粒为模板，进行PCR，产物经末端平端化和加磷处理后，进行自连接，产物再通过SalI+NotI酶切下5738bp片段，将该片段与同样酶切得到的pShuttleCMV载体大片段连接，得到质粒pShuttleCMV-CFP-Ezrin567A。
所述重组腺病毒载体具体为将所述重组载体与pAdeasy-1载体同源重组得到的载体；
所述重组腺病毒具体为重组腺病毒载体与HEK293细胞共培养，装配得到的腺病毒。
本发明的实验证明，本发明提供了一个在肝癌的发生和发展过程中，对其转移和/或扩散进行诊断的标志，即伴随肝癌转移而产生的Ezrin第567位苏氨酸的磷酸化。在高转移性肝癌细胞系中，具有可明显检测到的显著区别于低转移性细胞系的EzrinThr567磷酸化的发生。因而可以将Ezrin第567位苏氨酸的磷酸化水平作为诊断肝癌转移/扩散发生的标志。同时，本发明还证实，在肝癌转移中相伴发生的Ezrin第567位苏氨酸的磷酸化受Rho激酶(ROCK)调控，敲除该激酶或者抑制其活性均可以减少肝癌转移的发生；另外，外源引入的Ezrin第567位苏氨酸不可磷酸化的突变体EzrinT57A也可以竞争性的降低肝癌转移的发生。因此，可以通过抑制ROCK的活性或者利用腺病毒等外源转入过量EzrinT567A的方法制备抑制肝癌细胞转移的药物，在医学及制药领域发挥重要作用，应用前景广阔。
附图说明
图1为原位肝癌组织和转移灶癌组织样品的双向双色电泳展示
图2为肝癌组织中EzrinT567磷酸化水平的免疫染色分析
图3为EzrinT567磷酸化水平对肝癌细胞侵染能力的分析
图4为Rho激酶水平对肝癌细胞侵染能力的分析
图5为小鼠肝癌转移实验验证EzrinT567磷酸化水平对其肝肿瘤侵染能力的影响
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用引物及DNA序列均由上海Invitrogen公司合成。
实施例1、肝癌组织中Ezrin磷酸化水平的检测
一、肝组织双向双色电泳展示
1、肝组织样品制备
原位癌或者转移灶的肝脏组织样品(自第四军医大学附属西京医院获得，患者对研究知情。)分别标记Cy3和Cy5(参见美国Amersham公司的Ettan DIGE试剂盒的使用说明，货号11-0033-64)。将标记好的样品混合，用85％的乙醇沉淀并用裂解缓冲液(7M尿素，2M硫化尿素，4％CHAPS，2％DTT，2％IPG buffer，pH4-7，1mM benzamidine，2μg/ml pepstatin-A，20μg/ml leupeptin，10μg/ml aprotinin，1mM钒酸钠，1μM microcystin-LR)重溶，100000g超高速离心20分钟，以澄清样品，取上清液。
2、双向双色电泳展示
在ReadyStrip，pH3-10的胶条IPG Strips(购自美国Bio-Rad公司，货号163-2035)中加入100μg上述上清液，并于室温(25℃)溶胀18个小时。设定等电点聚焦的程序为：对胶条加以由300-3500V的梯度后保持稳定的3500V运行至总共达到80000Vh。将胶条在平衡缓冲液(6M尿素，2％SDS，0.375M Tris，pH8.8，37％甘油，先用65mM DTT还原再用243mM碘乙酰胺烷基化)平衡15分钟。将平衡好的胶条插入梯度SDS-PAGE胶(6-16％梯度，8X10cm)进行电泳。2D分离的蛋白胶谱由PhosphoImager软件进行分析。
结果如图1所示，图1A为原位灶及转移灶的肝癌样本蛋白双相电泳图，原位癌细胞的蛋白标记了Cy3(红色)，而转移灶细胞的蛋白则标记了Cy5(绿色)。两色重叠的图片展示出来自两组样本的总蛋白谱基本类似。但是也存在一些很明显的差异区域。例如，图中圈出区域标记的Ezrin不同修饰亚型，在转移灶细胞中表现为向偏酸性端的偏移。
图1B为在转移灶癌栓蛋白样品中Ezrin的亚型，可以看出，箭头所示(中间一图中两个箭头)，原位癌细胞中主要的碱性位置(0，pI约6.7)，在转移灶细胞中有明显的荧光密度的减弱，并且随着向酸性端的偏移(1，2，3，4，5；pI逐步从6.6降为62)而增强。这提示在转移灶癌细胞中Ezrin可能具有较高的磷酸化程度。Ezrin包含多种酸性亚型(图中约八个点所示)，其中四个偏碱性端的点同原位癌样本重合。取发生等电迁移的蛋白点切下用于质谱鉴定，所得数据用加州大学旧金山分校质谱中心开发的MS-Fit和MS-Tag两种软件(prospector.ucsf.edu)对质谱数据分析显示这些酸性的Ezrin亚型中主要包含了567位苏氨酸的磷酸化。上述分析表明肝细胞肝癌的转移可能与ezrin的磷酸化水平相关。
通过双向电泳展示了在肝细胞肝癌转移发生的过程中ezrin的磷酸化水平的变化。
将经双向电泳分离的靶蛋白质样本条带切割成约1mm3小块，经清洗、脱色、干燥后，用胰蛋白酶(购自Promega公司，编号为V511A)37℃消化4小时；依次用50％乙腈加5％甲酸混合溶液抽提20分钟，75％乙腈加5％甲酸抽提10分钟，95％乙腈加上5％甲酸抽提10分钟；每次抽提后，将溶液转移到同一个离心管中；加热真空干燥至溶液体积减少到5-10μl；最后按照说明书用C18zip-tip(购自Millipore公司，编号为Z720054)纯化。将经胰酶消化的肽段溶液与a-氰-4-羟基肉桂酸共结晶，然后在基质辅助激光解理-飞行时间质谱仪中进行测定和分析。测定时质谱仪设定为正电模式，并且所得到的的数据都用标准肽段混合物进行校正。
利用MS-Fit程序对肽指纹谱信息进行分析和数据库搜索以确定原样品中的蛋白成分。肽段的源后衰减数据通过MS-Tag程序处理分析，最后得到肽段的序列信息。这两个程序由加州大学旧金山分校的质谱学部研发，可登陆prospector.ucsf.edu.使用。数据搜索所用数据库有NCBI网站提供的蛋白质数据库和Swiss-Pot数据库。在搜索时，蛋白分子量和肽段分子量的容忍度参数设定为100-200ppm(Parts/million)，经鉴定结果为ezrin磷酸化的位点主要为567位。
图1C来自癌旁正常组织、原位灶、转移灶的样本蛋白经SDS-PAGE分离并转膜做westernblot实验，分别用ezrin抗体(购自美国Santa Cruz公司，编号sc-32758)，Actin抗体(购自美国Cell Signaling公司，编号4967)，以及Ezrin Thr567磷酸化特异性抗体(购自Cell Signaling公司，货号3141)，展示在转移灶细胞中，Ezrin 567位苏氨酸发生高度磷酸化。
图1D为转移性癌栓蛋白样本经双相电泳分离后转膜做免疫印迹实验图，从图中看出，分别用ezrin单抗及ezrin Thr567磷酸化特异性抗体检测发现2号及3号斑点发生Thr567的磷酸化，在分离所得的5个斑点中，2号斑磷酸化程度最高。上面的统计数据是7组样本的平均值±S.E.，2号及3号斑点的磷酸化水平较高，以2号为最(p＜0.001)。
为了鉴定同转移相关的磷酸化残基，将上述转移灶样本中的酸性点从胶上切下，利用胶内酶切技术取得肽段，以原位样本相应区域为对照，利用MALDI-TOF质谱鉴定技术鉴定磷酸化肽段。这些点所表示的蛋白均为Ezrin，而具有不同的修饰。鉴定出在肿瘤转移中可能包含的最典型的磷酸化修饰发生在567位的苏氨酸。
随后利用特异识别磷酸化的氨基酸残基(丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸等)的抗体，通过免疫印迹法对转移的癌细胞中Ezrin的磷酸化水平做了进一步的鉴定。如图1C、D所示，利用特异性识别Ezrin567位苏氨酸磷酸化的抗体(购自Cell Signaling公司，货号3141)检测，发现转移癌栓中有大量的ezrin发生了Thr567的磷酸化，原位癌中仅有少量ezrin发生了567位苏氨酸的磷酸化，而正常组织中则没有检测到发生567位苏氨酸磷酸化的ezrin。
二、肝癌组织中EzrinT567磷酸化水平的免疫染色分析
1、肝癌组织的免疫组化分析
收集正常肝组织和原位肝癌以及转移灶组织样品(自第四军医大学附属西京医院获得)进行免疫组化分析。首先进行冰冻切片4～8mm，25℃放置30分钟后，加入4℃丙酮固定10分钟，PBS(pH7.4，8g/LNaCl、0.2g/LKCl、1.44g/LNa2PO4、0.24g/LKH2PO4)洗3遍后用3％(体积百分含量)过氧化氢孵育5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。然后使用5％正常山羊血清(购自Abcam公司，产品号ab7481)(PBS稀释)封闭，25℃孵育20分钟。倾去血清，滴加稀释后的一抗工作液(含有适当稀释浓度的Ezrin 567位苏氨酸磷酸化特异性抗体(购自Cell Signaling公司，货号3141)的PBS缓冲液)，37℃孵育2小时或4℃过夜，PBS冲洗3遍后，依次滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(购自Jackson ImmunoResearchLaboratories Inc.，编号705-065-003)(1％BSA-PBS稀释)和辣根酶标记链霉卵白素(购自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.，编号200-032-211)(PBS稀释)，均在37℃下孵育30分钟后PBS冲洗3次。最后使用显色剂显色，再进行复染，封片，并使用电镜进行观察。
结果如图2A所示，为癌旁正常组织样本(a)，原位肝癌组织样本(b)以及转移性癌栓组织样本(c)经免疫组化分析，用ezrin Thr567磷酸化特异性抗体检测。从图中看出，免疫组化中黄色或棕色表征的是样本的阳性程度，颜色越深表明阳性程度越高，在正常肝组织中(a)，基本没有磷酸化抗体着色；原位灶可见少量磷酸化抗体染色(b)；转移灶中大多数细胞呈现磷酸化抗体强阳性染色(c)，图距＝30μm.
在正常肝上皮组织中，几乎没有Ezrin的567位磷酸化信号；原位癌组织中则有较弱的磷酸化信号；而如预期的一样，转移灶癌组织中检测到很强的567位磷酸化的信号。这也与免疫印迹的结果相一致。特别的是，这些567位磷酸化的信号主要定位在肝癌细胞或者血管内皮细胞的质膜上。由于Ezrin的蛋白表达水平在原位癌和转移灶细胞中基本一致(图1C)，因此可以得出，Ezrin的567位的磷酸化同肝癌细胞的转移相关。
2、利用免疫荧光检测肝癌组织中Ezrin567位苏氨酸磷酸化情况
收集正常肝组织和原位肝癌以及转移灶组织样品(自第四军医大学附属西京医院获得，患者知情)，分别铺入24孔板的孔内(含有载玻片)，附着后用预冷的PBS缓冲液洗一遍。弃去溶液，迅速用新鲜配制的2％的甲醛(溶解于PBS中)固定细胞5分钟，固定后用PBS缓冲液洗三遍，每次5分钟。对其中一个盖玻片用含有0.1％(体积百分含量)Triton X-100的PBS缓冲液处理2分钟使细胞膜穿孔以利于抗体进入细胞内，另一个则不处理。接下来，用1％(质量体积比)BSA(溶解于TBST缓冲液)在25℃下封闭30分钟。用适当稀释的一抗Ezrin 567位苏氨酸磷酸化特异性抗体在25℃孵育细胞/盖玻片60分钟。加100μl 1％BSA(溶解于TBST缓冲液)至盖玻片上以洗去非特异性结合的抗体，洗三次，每次5分钟。然后将带有FITC偶联的二抗(购自Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.产品号711-095-152兔)加在盖玻片上，室温孵育30分钟。重复上述步骤，而将一抗改为全Ezrin抗体(购自美国Santa Cruz公司，编号sc-32758)，二抗改为Rhodamine偶联的抗鼠的二抗(购自Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.产品号715-025-150)。用100μl PBS洗涤三次，每次5分钟。最后，在载玻片上加适量(5μl)的荧光抗淬灭封片剂，轻轻地将盖玻片盖下(生长细胞的一面朝下)，用指甲油封片。使用Zeiss公司的激光共聚焦显微镜LSM510观察染好的片子，并用photoshop处理。
结果如图2B和2C所示，图2B为不同来源的组织样本分别经ezrin单抗及ezrin Thr567磷酸化特异性抗体孵育并用不同颜色荧光二抗染色，在激光共聚焦显微镜下观察。图2C为以转移的肝癌组织样本中细胞的ezrin磷酸化信号与ezrin信号之比设定为100％，对其他组织样本的磷酸化荧光强度进行标准化，得到各组织发生磷酸化的百分比率。图中数据分别为5个不同样本中至少250个不同细胞计所得到的平均值±S.E.(p＜0.001)。从图中看出，相对于正常肝组织和原位癌组织，转移灶肝癌组织中，Ezrin第567位的磷酸化明显提高。对结果进行光密度分析后可见，如图2C，以磷酸化的Ezrin信号与全Ezrin信号的比率作比较，也证实上述结论。
实施例2、Ezrin磷酸化物质对肝癌细胞转移能力的影响
一、侵染实验评估磷酸化对肝癌细胞转移能力的影响
1、ezrin及突变体病毒的获得
CFP(购自美国Clontech公司的pECFP载体，编号6900-1)载体通过SalI+NotI酶切下得到3971bp的片段(包含可表达CFP的基因片段)，将该片段与同样酶切得到的pShuttleCMV载体(购自美国Stratagene公司，编号240007)大片段连接，连接产物转化大肠杆菌，得到转化子，挑取抗kana的转化子提取质粒，利用kana抗性进行筛选获得正确的穿梭质粒克隆，将该质粒命名为pShuttleCMV-CFP。
CFP-Ezrin载体(Zhou，R.，Cao，X.，Watson，C.，Miao，Y.，Guo，Z.，Forte，J.G.，and Yao，X.(2003)J.Biol.Chem.278，35651-35659，公众可从中国科技大学获得。)，通过SalI+NotI酶切得到5738bp的片段(包含可表达CFP-Ezrin的基因片段)，将该片段与同样酶切得到的pShuttleCMV载体大片的连接，连接产物转化大肠杆菌，得到转化子，挑取抗kana的转化子提取质粒，利用kana抗性进行筛选获得正确的穿梭质粒克隆，将该质粒命名为pShuttleCMV-CFP-Ezrin。
模拟567位不可磷酸化的突变体CFP-Ezrin567A(含有将Ezrin的第567位苏氨酸突变为丙氨酸的突变蛋白的编码基因，该突变蛋白的氨基酸序列为序列表的序列2，核苷酸序列为序列表中的序列3)，具体如下：以序列6和序列7所示的DNA作为引物，以上述CFP-Ezrin质粒为模板，进行PCR，产物经末端平端化和加磷处理后，进行自连接，产物经测序得到正确突变的产物，再通过SalI+NotI酶切下5738bp片段(包含可表达CFP-Ezrin567A的基因片段)，将该片段与同样酶切得到的pShuttleCMV载体大片段连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子，挑取抗kana的转化子提取质粒，送去测序，结果为该质粒为将包含可表达CFP-Ezrin567A的基因片段(含有序列表序列3)插入pShuttleCMV载体的SalI和NotI位点间得到的载体，将该质粒命名为pShuttleCMV-CFP-Ezrin567A。
模拟567位磷酸化的突变体CFP-Ezrin567D(含有将Ezrin的第567位苏氨酸突变为天冬氨酸的突变蛋白的编码基因，该突变蛋白的氨基酸序列为序列表的序列5，核苷酸序列为序列4)，具体如下：以序列6和序列8所示的DNA作为引物，以上述CFP-Ezrin质粒为模板，进行PCR，产物经末端平端化和加磷处理后，进行自连接，产物经测序得到正确突变的产物，再通过SalI+NotI酶切下5738bp片段(包含可表达CFP-Ezrin567D的基因片段)，将该片段与同样酶切得到的pShuttleCMV载体大片段连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子，挑取抗kana的转化子提取质粒，送去测序，结果为该质粒为将包含可表达CFP-Ezrin567D的基因片段(含有序列表序列4)插入pShuttleCMV载体的SalI和NotI位点间得到的载体，将该质粒命名为pShuttleCMV-CFP-Ezrin567D。
用限制性内切酶PmeI将上述pShuttleCMV-CFP-Ezrin567A、pShuttleCMV-CFP-Ezrin567D、pShuttleCMV-CFP、pShuttleCMV-CFP-Ezrin线性化，并用胶回收的方法回收上述4种线性化穿梭质粒。
制备BJ5183(购自美国Stratagene公司，编号200154)电转化感受态，用电转化仪将线性化的穿梭质粒pShuttleCMV-CFP-Ezrin567A和pAdeasy-1载体(购自美国Stratagene公司，编号240009)共转化到BJ5183电转化感受态中，得到转化子，提取抗Amp的转化子的质粒，进行PCR(引物为5’-atgccgaaaccaatcaat-3’和5’-cagggcctcgaactc-3’)，得到1758bp的片段为正确质粒1。
将正确质粒1转入DH5α感受态，得到转化子。提取转化子的质粒进行PCR鉴定，引物为5’-atgccgaaaccaatcaat-3’和5’-cagggcctcgaactc-3’，得到1758bp的片段为正确质粒2。将PCR鉴定正确的质粒2用PacI酶切进行鉴定，得到1758bp的片段为正确质粒3，将其送去测序，结果该质粒为将包含可表达CFP-Ezrin567A的基因片段(含有序列表序列3)与pAdeasy-1同源重组得到的载体，将该质粒命名为pAdeasy-CFP-Ezrin567A。
通过乙醇沉淀法回收PacI线性化的质粒pAdeasy-CFP-Ezrin567A，通过脂质体转染方法将线性化质粒转入培养好的HEK293细胞(购自美国ATCC，编号CRL-1573)，培养于含有10％胎牛血清(购自美国Gibco公司，编号10091-148)的DMEM(购自美国Gibco公司，编号12100046)培养基中，于5％CO2，37℃环境中培养，10天后，至细胞大部分都漂浮起来时，收集细胞，并用反复冻融的方法，破碎细胞使病毒释放到溶液中，收集上清液，得到重组病毒，命名为Ad-CFP-Ezrin567A。
设定一定梯度检测病毒滴度，具体如下：在96孔板中以1*104/孔的细胞量铺三个孔的HEK293细胞，分别加入10μl、1μl、0.1μl的病毒悬液，用荧光检测感染的细胞数，计量病毒的滴度，结果为Ad-CFP-Ezrin567A滴度为3.6*106/ml。
以上述同样的方法再次利用HEK293细胞对病毒进行扩增，提高其滴度(与上述同样的检测方法)，使Ad-CFP-Ezrin567A滴度达到5.2*108/ml，分装并保存于-80℃备用。
采用上述的方法，将pShuttleCMV-CFP-Ezrin567D、pShuttleCMV-CFP、pShuttleCMV-CFP-Ezrin分别与pAdeasy-1载体同源重组，分别得到pAdeasy-CFP-Ezrin567D、pAdeasy-CFP、pAdeasy-CFP-Ezrin；再分别导入HEK293细胞中，组装得到重组病毒Ad-CFP-Ezrin567D、Ad-CFP、Ad-CFP-Ezrin。采用同样的方法检测，Ad-CFP-Ezrin567D、Ad-CFP、Ad-CFP-Ezrin的滴度分别为6.5*108/ml、6.4*108/ml、4.8*108/ml。
利用免疫印迹法检测Ad-CFP-Ezrin567A、Ad-CFP-Ezrin567D和Ad-CFP-Ezrin中ezrin的表达(ezrin抗体购自美国Santa Cruz公司，编号sc-32758)，结果如图3A所示，3A为HepG2细胞中分别转染pAdeasy-CFP-Ezrin(CFP-Ezrin)、pAdeasy-CFP-Ezrin567A(CFP-Ezrin567A)和pAdeasy-CFP-Ezrin567A(CFP-Ezrin567A)的裂解液，转染30-36小时后，收集细胞并裂解蛋白经SDS-PAGE分离后蛋白印迹法检测外源转染的ezrin及突变体的表达水平，结果显示ezrin及其突变体的外源表达水平基本相似。
2、ezrin及突变体病毒侵染实验检测癌细胞转移活性
将HepG2细胞(购自美国ATCC，编号HB-8065)铺在8μm小孔的BioCoat Matrigelinvasion chambers(购自美国BD Biosciences公司，编号354480)中，于37℃的DMEM中培养60分钟，按照说明书的指导进行实验。HepG2分别被Ad-CFP-Ezrin567A、Ad-CFP-Ezrin567D、Ad-CFP和Ad-CFP-Ezrin感染后(质粒上均连有CFP，以便在显微镜下能很容易的观察到感染的细胞穿过人工基底膜)，得到HepG2/Ad-CFP-Ezrin567A、HepG2/Ad-CFP-Ezrin567D、HepG2/Ad-CFP和HepG2/Ad-CFP-Ezrin。
分别在共聚焦显微镜下对穿过人工基底膜的细胞数进行计数并比较。
结果如图3B所示，3B中，a为HepG2/Ad-CFP-Ezrin(野生型CFP-Ezrin)、b为HepG2/Ad-CFP-Ezrin567D(模拟磷酸化状态的突变体CFP-Ezrin567D)、c为HepG2/Ad-CFP-Ezrin567A(模拟非磷酸化状态的突变体CFP-Ezrin567A)、d为HepG2/Ad-CFP(CFP)。观察通过人工基底膜的细胞并记数比较ezrin及其突变体对HepG2细胞运动侵袭能力的影响。标尺代表20μm。图像代表了至少4个独立的实验组。随着ezrin的磷酸化，HepG2的迁移能力极大提高(HepG2/Ad-CFP-Ezrin567A)。Ezrin及其突变体在HepG2细胞中的定位基本类似，但感染了在HepG2/Ad-CFP-Ezrin567D细胞表现为穿过人工基底膜的细胞数显著增多(图3B，b，箭头)。相反，在HepG2/Ad-CFP-Ezrin567A细胞仅有很少几个穿过人工基底膜(图3B，c，箭头)。
定量分析感染了CFP-ezrinT567D的HepG2细胞运动侵袭能力的变化，在上述侵染实验中分别选取大小相同的4-5个区域，对通过人工基底膜的细胞进行计数，并取平均值后，计算与野生型ezrin处理组的结果的比例，进行柱状图比较，设定HepG2/Ad-Ezrin的迁移能力为100％(以细胞侵染效率可以表征细胞迁移能力的高低)，其他各组分别与该组做比较，结果如图3C所示，图C设定感染ezrin野生型的HepG2细胞的迁移能力为100％，其他各实验组细胞的迁移能力分别与该组做比较，平均值和标准差的计算来自至少四组相对独立实验的统计(**P＜0.01，*P＞0.01)。
Ezrin(HepG2/Ad-CFP-Ezrin)的迁移能力为100(以野生型处理组为100)；
T567A(HepG2/Ad-CFP-Ezrin567A)的迁移能力为16.5±2.5；
T567D(HepG2/Ad-CFP-Ezrin567D)的迁移能力为201.6±9.8；
CFP tag(HepG2/Ad-CFP)的迁移能力为17.3±3.3；
ROCK siRNA处理组(在HepG2细胞中预先转染过ROCK SiRNA)的迁移能力为15.2±5.5；
ROCK siR+Ezrin处理(在HepG细胞中预先转染过ROCK SiRNA，ROCK SiRNA的一条RNA的序列为序列表中的序列1，然后再用Ad-CFP-Ezrin病毒感染)组的迁移能力为17.1±2.3；
ROCK siR+T567D(在HepG细胞中预先转染过ROCK的SiRNA，然后再用Ad-CFP-Ezrin567D病毒感染)的迁移能力为197.6±5.7；
Parental处理组(未进行任何处理)的迁移能力为10.8±1.6；
通过统计学分析，发现相对于HepG2/Ad-CFP-Ezrin(ezrin野生型)，HepG2/Ad-CFP-Ezrin567D(ezrin Thr567非磷酸化)迁移能力提高了2倍(P＜0.01，n＝10)。相反，HepG2/Ad-CFP基本不能穿过人工基底膜(图3B，d)。因此，认为ezrin Thr567磷酸化促进了HepG2细胞的迁移。
图3D补充验证了Rho激酶对ezrin Thr567的磷酸化作用。用western-blot检测各对照组及实验组ezrin磷酸化的水平，设定感染表达CFP-ezrin的实验组的磷酸化水平为100％，其他各组包括转染ROCK SiRNA的母细胞(ROCK Si)实验组、感染表达CFP-ezrin并转染ROCK SiRNA实验组(ezrin+ROCK Si)和感染表达CFP-ezrin T567A实验组。相对于对照组，其ezrin Thr567磷酸化水平均降低到极低的水平{依次为只有(1±0.5)％、(5±2)％和(0.8±0.6)％}。
二、检测Rho激酶的抑制对肝癌细胞HepG2转移的影响
一些研究显示Rho激酶信号通路在肿瘤中发生异常的上调，并且对癌症细胞的侵染和转移具有重要作用。而Ezrin的567位苏氨酸也是Rho激酶的底物之一，尝试了利用Rho激酶的抑制剂Y27632(购自美国Milipore公司，编号SCM075)检测Rho激酶对HepG2细胞侵染性的作用。采用与图3C同样的方法检测，以溶剂DMSO处理组为对照组设为100，结果如图4A所示，分别用不同浓度的Y27632处理HepG2/Ad-CFP-Ezrin(ezrin野生型)，侵染效率以占仅用溶剂处理组(DMSO)的侵染能力的百分比来计。实验数据来自三组独立的数据的统计结果。
1u M Y27632组(用终浓度1uM的Y27632加入细胞培养基中后再进行侵染实验)侵染效率为96.2±4.2；
5u M Y27632组(用终浓度5uM的Y27632加入细胞培养基中后再进行侵染实验)侵染效率为66.4±2.8；
10uM Y27632组(用终浓度10uM的Y27632加入细胞培养基中后再进行侵染实验)侵染效率为12.9±3.9；
ROCK siR组(在HepG2细胞中预先转染过ROCK的SiRNA)侵染效率为11.1±9.9；
Ctri siR组(在HepG2细胞中预先转染过对照SiRNA)侵染效率为94.2±5.7；
结果显示HepG2细胞运动力下降，其下降程度表现为对Y27632的剂量依赖(黑色)。蓝色显示的是HepG2细胞经ROCK激酶特异性SiRNA处理后，其迁移能力与对照组相比显著下降。(P＜0.01)
用Y27632抑制了Rho激酶活性后，产生一种剂量依赖的对HepG2细胞侵染性的抑制作用。这与早先的动物实验中发现的，在SCID小鼠中引入Y27632可以阻止人源的肝细胞肿瘤在鼠肝脏内的转移作用结果一致。通过侵染实验的测定，对HepG2的侵染能力的最大抑制作用来源于浓度为10uM的Y27632。
如果Ezrin的567位苏氨酸是Rho激酶的一个底物，那么利用Y27632对HepG2细胞的处理应当可以抑制567位的磷酸化。
等量的HepG2细胞分别在1uM、5uM、10uM Y27632孵育处理后(分别加入各种终浓度的Y27632后，于37℃、5％的CO2浓度的培养箱中继续培养若干小时)，细胞裂解液经SDS-PAGE分离通过蛋白印迹技术转到硝酸纤维膜上，用特异性ezrinThr567磷酸化抗体(购自Cell Signaling公司，货号3141)检测，结果如图4B所示，HepG2细胞用不同浓度的Y27632处理后，经SDS-PAGE分离后用免疫印迹对其Ezrin蛋白水平以及Thr567的磷酸化的水平进行检测。ezrin的磷酸化水平随着加入的Y27632的剂量增加而逐渐降低，细胞表现出一种剂量依赖的对Ezrin的磷酸化作用的抑制现象。
利用特异性Rho激酶SiRNA通过下调Rho激酶的胞内水平进一步评估ezrin Thr567磷酸化与HepG2细胞的迁移能力的相关性(分别在两份等量的HepG2细胞中转染ROCK的SiRNA和对照SiRNA，37℃培养两天，收取细胞裂解液进行免疫印迹，检测ROCK、总ezrin和567位苏氨酸磷酸化的ezrin的信号，ROCK SiRNA的一条RNA的序列为序列表中的序列1)，结果如图4C，HepG2细胞转入ROCK激酶特异的siRNA(25nM)或者对照SiRNA(SiRNA的一条RNA的编码序列：5′GCTAGACTCATTACAACTA 3′)，样品经SDS-PAGE分离后做免疫印迹分析，分别检测ROCK激酶水平，Ezrin水平以及ezrin Thr567的磷酸化水平。Rho表达水平在转入SiRNA以后明显下调，并且Rho表达水平的下调并没有影响ezrin在细胞内表达，却减少了ezrin的Thr567磷酸化水平。
更重要的是，发现Rho激酶SiRNA处理的HepG2细胞原本减弱的迁移能力可以通过转染CFP-ezrinT567D而得到逆转(如图3C黑色柱状图部分，)。因此，Rho激酶通过磷酸化ezrinThr567从而促进了肝癌细胞的运动侵染能力。
为了进一步解析ezrinThr567磷酸化促进肝癌细胞迁移所涉及的分子机制，对细胞骨架组分actin进行了免疫荧光分析。HepG2/Ad-CFP-Ezrin567A、HepG2/Ad-CFP-Ezrin567D、HepG2/Ad-CFP和HepG2/Ad-CFP-Ezrin，经固定后，用Alexa 488偶联的鬼笔环肽标记actin骨架(购自美国invitrogen公司，编号A12379)，观察其在ezrin不同磷酸化状态下的变化。结果如图4D所示，HepG2/Ad-CFP(a)、HepG2/Ad-CFP-Ezrin(b)、HepG2/Ad-CFP-Ezrin567A(c)、HepG2/Ad-CFP-Ezrin567D(d)，用FITC偶联的鬼笔环肽标记actin微丝骨架。可注意到ezrinT567D能刺激细胞膜产生皱褶(d，箭头所示)。选图来自4个独立的实验结果。表达模拟磷酸化突变体的HepG2细胞(HepG2/Ad-CFP-Ezrin567D)有大量增多的褶皱产生，而表达模拟不可磷酸化状态的突变体(HepG2/Ad-CFP-Ezrin567A)及CFP载体(HepG2/Ad-CFP)均没有这样的现象。研究表明ezrinThr567的磷酸化能引起细胞骨架重排，而膜皱褶正是细胞迁移相关的膜可塑性变化的表现。因此推断Rho激酶对ezrinThr567的磷酸化促进了actin骨架动态性变化，并为细胞运动迁移提供膜骨架物质基础。
三、动物实验检测Ezrin磷酸化对肝癌转移的影响
将肝癌细胞MHCC97-H(购自上海复蒙基因生物科技有限公司)细胞以每1ml体积培养液5X107的浓度，分别用Ad-CFP-Ezrin567A、Ad-CFP-Ezrin567D、Ad-CFP、Ad-CFP-Ezrin腺病毒感染细胞，得到MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin567A、MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin567D、MHCC97-H/Ad-CFP、MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin。
随后将感染上病毒的上述细胞MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin567A、MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin567D、MHCC97-H/Ad-CFP、MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin分别植入6周大小雌性NOD/SCID小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)的肝区(每组取10只小鼠)。观察移植瘤的生长情况，每隔2天测量肿瘤大小，按照公式：V＝πa2b/6计算肿瘤生长体积。10周后处死裸鼠，取出肿瘤，并切取肝组织，用10％甲醛溶液固定，石蜡包埋，切成4-5um的切片。组织切片均行经苏木精-伊红(HE)染色。
结果如图5A所示，皮下注射不同实验组包括CFP对照组(MHCC97-H/Ad-CFP，C)、ezrin野生型(MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin，WT)、ezrinT567A(MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin567A，TA)及ezrinT567D(MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin567D，TD)等的小鼠肝组织照片。
TD(MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin567D)的移植瘤导致了大量的小鼠肝内组织转移。
苏木精-伊红染色结果如图5B所示(图5B为肿瘤边缘切片组化分析(左栏，放大100倍)，相对与表达ezrinT567A及野生型，表达EzrinT567D的移植瘤导致小鼠肝内大量的转移(右栏放大400倍))，可以看出，相对于野生型(WT)和CFP-EzrinT567A(TA)，CFP-EzrinT567D(TD)的表达促进了肝癌细胞在裸鼠肝脏内的转移。
对小鼠中肝转移节点的计数，对比每组一个低倍镜视野下可见的结节数总和，结果如图5C，Vector(MHCC97-H/Ad-CFP)的肝转移节点数位27，WT(MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin)的肝转移节点数位61，T567A(MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin567A)的肝转移节点数位38，T567D(MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin567D)的肝转移节点数位210，也证明CFP-EzrinT567D的表达引起了更多的癌细胞转移的发生。
同时，由于肝癌细胞在裸鼠肝脏内的转移及癌症发展最终导致小鼠体重的减轻，产生移植瘤9周以后各实验组小鼠体重比较结果如图5D所示，Vec(MHCC97-H/Ad-CFP)的体重为21.6±2.2g，WT(MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin)的体重为19.4±3.1g，T567A(MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin567A)的体重为20.4±2.8g，T567D(MHCC97-H/Ad-CFP-Ezrin567D)的体重为15.9±3.7g；说明了CFP-EzrinT567D对肝肿瘤转移与疾病的发展起了促进作用。鉴于T567的磷酸化在临床肝癌组织中的过表达及抑制567位苏氨酸磷酸化对细胞浸润能力及在动物体内转移能力的抑制作用，认为Ezrin 567位苏氨酸磷酸化可作为肝癌转移的预警指标，同时干扰567位苏氨酸磷酸化或干扰567位苏氨酸活化的ezrinT567A腺病毒可作为肝癌转移的基因治疗方案。
Claims (10)
1.抑制Ezrin第567位苏氨酸磷酸化的物质在制备具有抑制肿瘤功能的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述抑制Ezrin第567位苏氨酸磷酸化的物质为如下1)或2)中任意一种：
1)如下权利要求8所述蛋白或权利要求9所述编码基因或权利要求10所述重组载体或重组腺病毒载体或转基因细胞系或重组腺病毒；
2)抑制介导Ezrin第567位苏氨酸磷酸化的信号通路的物质。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述抑制介导Ezrin第567位苏氨酸磷酸化的信号通路的物质为抑制Rho激酶表达/或活性的物质。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：
所述抑制Rho激酶表达和/或活性的物质为如下A)或B)：
A)Rho激酶抑制剂Y27632；
B)Rho激酶siRNA，所述siRNA的一条链的核苷酸序列为序列表中的序列1；
所述抑制肿瘤为抑制肿瘤细胞的迁移和/或扩散；
所述肿瘤为肝癌。
5.一种具有抑制肿瘤功能的产品，其活性成分为抑制Ezrin第567位苏氨酸磷酸化的物质。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：
所述抑制Ezrin第567位苏氨酸磷酸化的物质为如下1)或2)中任意一种：
1)如下权利要求13或14所述编码基因或权利要求15或16所述的重组载体或重组腺病毒；
2)抑制介导Ezrin第567位苏氨酸磷酸化的信号通路的物质。
7.根据权利要求5或6所述的产品，其特征在于：
所述抑制Rho激酶表达/或活性的物质为如下A)或B)：
A)Rho激酶抑制剂Y27632；
B)Rho激酶siRNA，所述siRNA的一条链的核苷酸序列为序列表中的序列1；
所述抑制肿瘤为抑制肿瘤细胞的迁移和/或扩散；
所述肿瘤为肝癌；
所述产品为药物。
8.一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：
1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将序列表中序列2氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。
9.权利要求8所述蛋白的编码基因；所述编码基因为1)、2)或3)：
1)序列表中的序列3所示的DNA分子；
2)与1)限定的DNA序列至少具有80％同源性且具有相同功能蛋白的DNA分子；
3)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且具有相同功能蛋白的DNA分子。
10.含有权利要求9所述编码基因的重组载体或重组腺病毒载体或转基因细胞系或重组腺病毒；
所述重组载体具体为1)或2)：
1)所示的重组载体为将权利要求9所述编码基因插入pShuttleCMV载体的多克隆位点得到的载体；
2)所示的重组载体为将含有权利要求9所述编码基因的片段插入pShuttleCMV载体的多克隆位点得到的载体；
所述重组腺病毒载体具体为将所述重组载体与pAdeasy-1载体同源重组得到的载体；
所述重组腺病毒具体为重组腺病毒载体与HEK293细胞共培养，装配得到的腺病毒。
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