CN114042072A - Stm2457的新用途 - Google Patents

Stm2457的新用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114042072A
CN114042072A CN202111543015.9A CN202111543015A CN114042072A CN 114042072 A CN114042072 A CN 114042072A CN 202111543015 A CN202111543015 A CN 202111543015A CN 114042072 A CN114042072 A CN 114042072A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stm2457
nsclc
mettl3
cyp19a1
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111543015.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114042072B (zh
Inventor
肖晗
廖永德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology
Original Assignee
Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology filed Critical Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology
Priority to CN202111543015.9A priority Critical patent/CN114042072B/zh
Publication of CN114042072A publication Critical patent/CN114042072A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114042072B publication Critical patent/CN114042072B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于STM2457研究技术领域，尤其涉及STM2457的新用途。STM2457在制备防治肿瘤疾病药物中的应用。在一些方式中，所述肺癌为非小细胞肺癌；所述STM2457的作用浓度为5μM。STM2457在制备NSCLC细胞阻滞增殖制剂、NSCLC细胞转移抑制剂、NSCLC细胞促进凋亡制剂至少之一中的应用。STM2457在制备CYP19A1表达抑制剂中的应用；所述CYP19A1表达为CYP19A1蛋白；所述STM2457的作用浓度为5μM。STM2457在制备雌激素信号通路抑制剂中的应用；所述雌激素信号通路为NSCLC关联雌激素信号通路。STM2457在制备METTL3活性抑制剂中的应用。本发明针对NSCLC开发了新的治疗药物，提供了新的治疗方案，有望在克服肿瘤异质性的基础上抑制NSCLC进展；针对METTL3提供了有效的活性抑制剂，并明确了分子靶点的变化规律和肿瘤抑制的潜在机制。同时针对STM2457研究一些新用途。

Description

STM2457的新用途
技术领域
本发明属于STM2457研究技术领域，尤其涉及STM2457的新用途。
背景技术
在中国乃至全世界范围内，肺癌尤其是非小细胞肺癌(Non-small cell lungcancer,NSCLC)的死亡率在所有肿瘤中居于首位，肿瘤转移显著降低了NSCLC患者的生存率。我国NSCLC的高负担和晚期NSCLC转移的高比例，亟待挖掘抑制NSCLC转移的新靶点进而开发晚期NSCLC治疗的新策略。
近几十年来，NSCLC被进一步定义为一类具有基因和细胞异质性的独特疾病，表现为瘤灶中包含有多种多样的细胞集合，这些细胞具有不同的遗传和分子特征，对临床治疗具有不同的敏感性，为药物耐受提供了沃土，严重影响了晚期NSCLC临床疗效。
无论NSCLC在基因和细胞水平上的异质性程度如何，蛋白质始终是病理生理过程中必不可少的效应分子。翻译作为蛋白表达的终末阶段，在致癌基因蛋白表达中发挥着广泛而至关重要的作用，已有研究表明，翻译失调是肿瘤细胞的普遍特征。鉴于翻译调控整合了肿瘤内几乎所有的致癌信号通路的表达和激活，靶向翻译调控能够有效地避免肿瘤内异质性对临床疗效的不良影响。然而，翻译调控的分子复杂多样，翻译调控的过程精密脆弱，一直困囿着翻译机制的研究，随着相关组学技术的发展，翻译调控的全局研究直到近些年才取得突破性进展，形成了“翻译组学”这一新兴研究领域。随着翻译调控的临床价值凸显，加之翻译组学的科研技术革新，靶向特异性翻译调控因子有望在克服异质性的基础上，有效地抑制NSCLC转移，为晚期NSCLC治疗带来新的曙光。
m6A(N6-mehtyladenosine，6-甲基腺嘌呤)甲基化作为最常见、最丰富且最保守的mRNA内源性表观修饰，能够调控mRNA的转录、加工、剪接和翻译等诸多过程，越来越多的研究发现m6A甲基化与肿瘤转移密切相关。METTL3(Methyltransferase-like 3，甲基转移酶样3)作为m6A甲基化表观修饰中唯一的催化酶，在各种恶性肿瘤侵袭转移中发挥着复杂多样且至关重要的作用。而目前的研究表明，METTL3作为致癌基因在NSCLC中显著高表达，促进NSCLC的侵袭转移。
STM2457在NSCLC中的应用尚未见报道，其能否作为一种新的NSCLC治疗策略亟待进一步研究。
发明内容
针对上述问题，本发明提供STM2457的新用途，主要解决了STM2457一些应用领域研究问题的缺失，主要是在肿瘤治疗中应用的缺失。
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
STM2457在制备防治肿瘤疾病药物中的应用。
在一些方式中，所述肿瘤疾病为肺癌。
在一些方式中，所述肺癌为非小细胞肺癌；所述STM2457的作用浓度为5μM。
STM2457在制备NSCLC细胞阻滞增殖制剂、NSCLC抑制转移制剂、NSCLC细胞促进凋亡制剂至少之一中的应用。
STM2457在制备CYP19A1表达抑制剂中的应用。
在一些方式中，所述CYP19A1表达为CYP19A1蛋白。
在一些方式中，所述STM2457的作用浓度为5μM。
STM2457在制备雌激素信号通路抑制剂中的应用。
在一些方式中，所述雌激素信号通路为NSCLC关联雌激素信号通路。
STM2457在制备METTL3活性抑制剂、METTL3表达促进剂中的应用。
其中，STM2457为化合物，其分子结构如图1中A所示。
STM2457在制备m6A甲基化表观修饰催化抑制剂中的应用。
本发明的有益效果是：
针对NSCLC开发了新的治疗药物，提供了新的治疗方案，有望在克服肿瘤异质性的基础上抑制NSCLC进展；针对METTL3提供了有效的活性抑制剂，并明确了分子靶点的变化规律和肿瘤抑制的潜在机制。同时针对STM2457研究一些新用途。
附图说明
图1-4中展示STM2457在NSCLC细胞中的基本性质，其中：
A为STM2457的分子结构式(CAS#2499663-01-1)；
B-C为H1975/A549干预1,3和6天对STM2457的量效反应曲线(平均值±标准差，n＝3)；
D为NSCLC和正常肺上皮细胞系对STM2457的量效反应曲线(平均值±标准差，n＝3)，括号内为每个细胞株的半数最大抑制浓度(IC50)；
E为安慰剂处理6天或5μM STM2457处理梯度时间(0-6天)，A549/H1975中METTL3蛋白表达变化；
F为安慰剂或梯度浓度STM2457(0，0.01,0.05,0.1,0.5,1,5,10,50μM)处理3天或6天，A549/H1975中METTL3蛋白表达变化；
G为5μM STM2457处理梯度时间(0-6天)，检测A549/H1975中m6A表达水平变化；
H为梯度浓度STM2457(0,0.01,0.05,0.1,0.5,1,5,10,50μM)处理6天，检测A549/H1975中m6A表达水平变化；
I为STM2457诱导的METTL3表达上调及其活性抑制效应模型图。
图5-6中展示METTL3能够促进NSCLC转移和进展，其中：
A为NSCLC患者(8例)配对的癌灶和癌旁组织中METTL3蛋白表达水平；
B-C为NSCLC患者(93例)配对的癌旁、癌灶和转移淋巴结中METTL3蛋白表达水平；
D为瞬时过表达或敲降METTL3前后，扫描电子显微镜观察A549细胞形态变化；
E为瞬时敲降METTL3或CRISPR Cas9稳定敲除METTL3前后，荧光基质降解实验评估A549细胞基质降解能力和侵袭性伪足形成；
F为瞬时敲降或稳定敲除METTL3前后，划痕实验评估A549细胞迁移能力的变化；
G为瞬时敲降或稳定敲除METTL3前后，Tranwell侵袭实验评估A549细胞侵袭能力的变化。
图7中展示STM2457能够在NSCLC中阻滞增殖、抑制转移和促进耐药，其中：
A为安慰剂或STM2457(0μM，1μM和5μM)处理10天，克隆形成检测A549/H1975的增殖能力变化；
B-C为安慰剂处理6天或STM2457(5μM)处理1天、3天和6天，划痕实验检测A549/H1975的迁移能力变化；
D为安慰剂处理6天或STM2457(5μM)处理1天、3天和6天，Tranwell侵袭实验检测A549/H1975的侵袭能力变化；
E为安慰剂或STM2457(1μM或5μM)处理3天，western-blot检测A549中凋亡相关蛋白(PARP，caspase-3，Bcl2和Bax)的表达变化；
F为安慰剂或STM2457(5μM)处理3天或6天，western-blot检测H1975中凋亡相关蛋白(PARP，caspase-3，Bcl2和Bax)的表达变化。
图8中展示STM2457可能通过阻断CYP19A1的翻译抑制NSCLC进展，其中：
A为瞬时敲降METTL3前后，western-blot检测A549细胞中CYP19A1蛋白水平的表达变化；
B为瞬时敲降METTL3前后，RT-PCR检测A549细胞中CYP19A1 mRNA水平的表达变化；
C为稳定敲除METTL3，Western-blot检测A549细胞中CYP19A1蛋白水平的表达变化；
D为稳定敲除METTL3，RT-PCR检测A549细胞中CYP19A1 mRNA水平的表达变化；
E为瞬时敲降METTL3前后，ELISA检测A549细胞内外雌激素合成和分泌水平；
F为稳定敲除METTL3前后，ELISA检测A549细胞内外雌激素合成和分泌水平；
G为安慰剂或STM2457(5μM)处理3天后，Western-blot检测A549细胞中CYP19A1蛋白水平的表达变化；
H为安慰剂或STM2457(5μM)处理3天后，RT-PCR检测A549细胞中CYP19A1 mRNA水平的表达变化；
I为安慰剂或STM2457(5μM)处理3天后，ELISA检测A549细胞内雌激素的合成水平。
具体实施方式
下面对本发明作进一步介绍：
本部分第一方面介绍STM2457在一些疾病治疗中的用途：
STM2457在制备防治肿瘤疾病药物中的应用。
在一些方式中，所述肿瘤疾病为肺癌。
在一些方式中，所述肺癌为非小细胞肺癌；所述STM2457的作用浓度为5μM。
STM2457能够克服肿瘤异质性，同时有效抑制肿瘤细胞的转移。进而为相关肿瘤的治疗提供新的治疗思路和产品。
本部分第二方面介绍STM2457在一些机理调节中的用途：
STM2457在制备NSCLC细胞阻滞增殖制剂、NSCLC细胞抑制转移制剂、NSCLC细胞促进凋亡制剂至少之一中的应用。“至少之一”表示其中任一或多个。
STM2457在制备CYP19A1表达抑制剂中的应用。
在一些方式中，所述CYP19A1表达为CYP19A1蛋白表达。
在一些方式中，所述STM2457的作用浓度为5μM。
STM2457在制备雌激素信号通路抑制剂中的应用。
在一些方式中，所述雌激素信号通路为NSCLC关联雌激素信号通路。
其应用方式之一为制备相应的治疗药物，至少包括：a.防治肿瘤疾病药物，有效成分包括化合物STM2457；b.抑制CYP19A1表达的药物，包含有效成分化合物STM2457，所述药物为抑制NSCLC细胞阻滞增殖制剂、抑制NSCLC细胞转移制剂和促进NSCLC细胞凋亡制剂；
其应用方式之二为在相关商业研究实验中作为调节试剂(第一、三方面部分在商业中应用说明同本部分)，至少包括：
A.在一些肿瘤疾病研究中，为了控制肿瘤细胞迁移等，通过化合物STM2457实现控制；
B.在研究肿瘤细胞影响因素实验中，通过STM2457实现对肿瘤细胞迁移、增殖速度等的调节，包括有利和不利因素控制；
C.在肿瘤细胞其他研究项目中，需要控制转移等，通过STM2457实现控制；
D.在研究与CYP19A1蛋白表达相关项目中，通过STM2457实现控制表达水平。
本部分第三方面介绍STM2457在影响因子调节中的用途：
STM2457在制备METTL3活性抑制剂、METTL3表达促进剂中的应用。STM2457通过靶向翻译调控因子METTL3。通过靶向翻译调控因子METTL3，实现对一些与METTL3相关的调节。
其中，‘METTL3活性’表现为‘METTL3酶活性’，‘METTL3表达’表现为‘METTL3的蛋白表达’。
STM2457在制备m6A甲基化表观修饰催化抑制剂中的应用。其中一种表现方式为，在m6A甲基化表观修饰进行催化过程中，反应速度过快，可通过加入STM2457进行降速，或者在m6A甲基化表观修饰过程中通过STM2457与METTL3配合实现反应速率调整。
STM2457的衍生物等，当其性质与STM2457基本相同，且用途与本发明基本相同时，均应当等同在本发明的范围内。比如，部分位置的H-被取代后，只要不影响性质突变，均应当在本发明范围内。
前述三个方面中，前述仅是列举了部分使用场景，其他采用与本发明机理一致目的相近的均应在本发明范围内。
其中抑制表现为降低、水平保持不增长，不限定其必须在使用后使得该信号通路或蛋白表达或活性降低。促进表现为提高或使其保持不降低。
本部分第四方面结合一些具体的实验项目进行说明：
实验一：如图1-4中，STM2457在NSCLC细胞中的基本性质
本发明确定STM2457对NSCLC细胞系最佳处理条件，即浓度为5μM处理时间6天；明确相比于正常肺上皮细胞系，NSCLC细胞系对STM2457更敏感；发现METTL3作为直接靶点在STM2457处理下酶活性受到抑制的同时表达出现上调。具体步骤如下：
(1)随机选取A549和H1975作为NSCLC细胞系的典型代表，两株细胞以适宜的细胞密度接种到96孔板中，在0～500μM的浓度范围内初步设置了11个药物处理的浓度梯度，即0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100和500μM，将上述浓度梯度的药物预混至200ul的完全培养基中加入96孔板中，每个浓度梯度设置3个复孔。分别培养1天、3天和6天后，吸出培养基，按照1:9的比例将CCK-8试剂与完全培养基预混至100ul分别加入上述96孔板中，37℃孵育1小时，酶标仪测定450nm处各样品孔的吸光光度值，并绘制两株细胞系对STM2457的量效反应曲线，初步确定5μM为STM2457在NSCLC细胞系实验中的最适处理浓度，6天为STM2457在NSCLC细胞系实验中的最佳处理时间。
(2)围绕STM2457在NSCLC细胞系实验中的最佳处理条件(5μM和6天)，我们纳入了更多的NSCLC细胞系(PC-9、H1793和HCC827)和正常的人肺上皮细胞系(BEAS-2B和HBE)，将上述细胞系以适宜的细胞密度分别接种于96孔板中，在0～100μM范围内设置了10个浓度梯度即0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50和100μM，将上述浓度梯度的药物预混至200ul的完全培养基中加入96孔板，每个浓度梯度设置3个复孔，培养6天后，同(1)绘制上述细胞系对STM2457的量效反应曲线，并确定各个细胞系在STM2457处理下的半数最大抑制浓度(IC50)。经对比IC50值，我们发现相比于正常肺上皮细胞系(HBE：20.21μM和BEAS-2B:22.187)，NSCLC细胞系(A549:4.101μM，H1975:8.343μM,PC-9:3.758μM,H1793:11.66μM和HCC827:14.59μM)对STM2457的反应更为敏感。
(3)对A549和H1975两株NSCLC细胞系开展后续的STM2457处理相关实验。将两株细胞系接种至6孔板中，每株细胞分别给予5μM STM2457处理0、1、2、3、4、5、6天，作为对照等量的DMSO处理6天。药物处理结束后，收取A549和H1975两株细胞中的总蛋白，并测定浓度，western-blot检测STM2457靶点METTL3的蛋白表达水平，同时测定内参蛋白GAPDH以作标准化分析。相比于对照组，NSCLC细胞在STM2457处理下METTL3的表达显著上升，并且随着处理时间的逐渐延长，其蛋白表达的水平也逐渐提高。
(4)将A549和H1975两株NSCLC细胞系接种到6孔板中，每株细胞分别给予梯度浓度(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10和50μM)STM2457处理3天或6天，作为对照与50μM组等量的DMSO同样处理3天或6天。药物处理结束后，收取A549和H1975两株细胞中的总蛋白，并测定浓度，western-blot检测METTL3的蛋白表达水平，并测定内参蛋白GAPDH以作标准化分析。我们进一步发现，无论是处理3天还是处理6天，相比于对照组，随着STM2457处理浓度的逐渐上升，NSCLC细胞中METTL3的蛋白表达水平同样逐渐提高。
(5)将A549/H1975两株细胞系接种至6孔板中，每株细胞分别给予5μMSTM2457处理0、1、2、3、4、5、6天。药物处理结束后，使用DNA/RNAExtraction Kit(Vazyme,RM201-01)提纯各组细胞样品的RNA，并按照m6A RNA Methylation Quantification Kit(Colorimetric)(EpiQuik,P-9005)指南测定各组RNA的m6ARNA甲基化水平，用以反映METTL3的酶活性和分子功能。结果表明5μM STM2457处理3天时A549/H1975中m6A甲基化表达水平最低，提示METTL3的酶活性受到了最显著的抑制；第3天之前随着处理时间的延长，A549/H1975中METTL3酶活性抑制逐渐增强；而第3天之后随着处理时间的延长，A549/H1975中METTL3酶活性抑制则逐渐减弱。
(6)将A549和H1975两株NSCLC细胞系接种到6孔板中，每株细胞分别给予梯度浓度(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10和50μM)STM2457处理6天。药物处理结束后，方法同(5)测定各组m6ARNA甲基化水平以反映METTL3的酶活性和分子功能。结果进一步表明，同样在处理6天的情况下，5μM STM2457处理的A549/H1975中m6A甲基化表达水平最低，METTL3酶活性受到最显著的抑制；低于5μM时，随着处理浓度的提高，A549/H1975中METTL3酶活性抑制逐渐增强；高于5μM时，随着处理浓度的提高，A549/H1975中METTL3酶活性抑制逐渐减弱。
实验二：如图5-6中，METTL3能够促进NSCLC进展
本发明发现相比于正常癌旁组织，METTL3在NSCLC癌灶中显著高表达；随后扩大样本量发现，相比于正常癌旁组织，METTL3在癌灶和转移淋巴结中显著高表达，提示METTL3可能与NSCLC转移和进展相关；在NSCLC细胞系中，我们进一步明确了METTL3能够促进细胞侵袭性伪足的形成、降解细胞外基质，并显著提高细胞的迁移和侵袭潜能。具体步骤如下：
(1)在武汉协和医院胸外科系统性收集NSCLC患者术中组织标本，筛选标准如下：①在我科接受手术治疗经病理证实为原发性NSCLC患者，准确p-TNM分期(2017UICC第八版)且按高、中、低分化程度分级；②NSCLC所有淋巴结转移灶均经过病理确诊，由两名以上高年资病理医生做出诊断证明；③无内分泌疾病，肝肾功能正常。④项目已获伦理批准(伦理委员会批准号：TJ-IRB-20180403)，入组患者均知情同意。将纳入的8例NSCLC患者的癌旁正常肺组织和原发灶标本进行组织研磨后提取蛋白，western-blot检测发现，相比于正常肺组织，NSCLC组织中METTL3的蛋白表达水平显著增高，提示METTL3与NSCLC进展相关。
(2)遵循上述筛选标准，在武汉协和医院胸外科肺癌标本库中筛选NSCLC患者手术标本，将纳入的93例NSCLC患者的癌旁正常肺组织、原发灶和配对的转移淋巴结制成组织芯片，免疫组化检测METTL3的蛋白表达水平，结合预后随访信息，绘制生存曲线评估METTL3的预后价值。结果表明METTL3在癌灶和配对转移淋巴结中METTL3蛋白表达水平均显著高于癌旁，提示METTL3与NSCLC转移相关。
(3)在A549细胞系中使用Lipofectamine 3000(ThermoFisher,L3000001)转染体系，瞬时转染过表达METTL3质粒以上调METTL3，或瞬时转染敲低METTL3的siRNA以下调METTL3，固定细胞后，扫描电子显微镜观察瞬时高表达或敲降METTL3前后细胞的形态变化，发现高表达METTL3后NSCLC细胞形态不规则、突起增多、异型性显著，敲降METTL3则反之。
(4)在A549细胞系中使用lipo3000转染体系，瞬时转染siRNA-NC和siRNA-METTL3，48小时后进行后续检测，或使用CRISPR Cas9稳定敲除METTL3进行后续检测。首先，配制1×L-赖氨酸溶液，在共聚焦玻璃皿上每孔加入200μL 1×L-赖氨酸，室温孵育20min；其次，移除L-赖氨酸后，每孔加入2mL不含Ca和Mg的DPBS溶液洗涤3次。然后，配制1×戊二醛溶液，在共聚焦玻璃皿上每孔加入200μL 1×戊二醛溶液，室温孵育15min；移除戊二醛，每孔加入DPBS溶液2mL洗涤3次。接着配制1:4混合绿色荧光明胶基质：分别将4×荧光明胶与4×无荧光标记明胶分别用DPBS溶液1:4稀释至1×溶液；将稀释后的两种明胶1:4(荧光明胶：无荧光明胶)混合，水浴60℃加热5min，冷却至室温。接下来，在共聚焦玻璃皿上每孔加入200μL混合荧光明胶基质，避光室温孵育10min，用DPBS每孔2mL洗涤3次。每孔加入2mL培养基灭活自由醛基，避光室温孵育30min。将上述分组的细胞稀释至10000个/200μL，每孔加入200μL细胞悬液至玻璃皿中心凹槽。孵育6h细胞贴壁后再加入2mL培养基培养48小时。标本染色固定后使用双光子共聚焦显微镜观察并采集图像。荧光基质降解实验结果表明，敲降或敲除METTL3后NSCLC细胞系侵袭性伪足形成受到显著抑制，提示METTL3能够促进NSCLC侵袭性伪足相关的细胞外基质降解。
(5)在A549细胞系中使用lipo3000转染体系，瞬时转染siRNA-NC和siRNA-METTL3，48小时后进行后续检测，或使用CRISPR Cas9稳定敲除METTL3进行后续检测。细胞计数取5×104个细胞接种于6孔板划痕小室中(Culture-Insert 2Well inμ-Dish 35mm，ibidi)，含＜2％FBS的低血清培养基培养过夜，提取小室后继续观察24小时划痕变化，评估细胞的迁移能力；细胞计数取8×104个细胞接种在预先铺有BD Matrigel基质胶的Transwell小室(3422，Corning)中，上室维持无血清培养基，下室选用含20％FBS的高血清培养基，48小时观察侵袭跨膜的细胞量，评估细胞的侵袭能力。对比阴性对照组和METTL3敲降组，我们发现A549瞬时敲降或稳定敲除METTL3后，细胞迁移能力和侵袭能力显著下降。
实验三：如图7中，STM2457能够抑制NSCLC进展
本发明率先明确了STM2457在NSCLC中能够发挥显著地阻滞增殖、抑制迁移、减弱侵袭以及促进凋亡的效应，并且在最适处理浓度(5μM)和最佳处理时间(6天)能够达到更突出的抑制NSCLC进展的效果。具体步骤如下：
(1)A549/H1975以1000个/孔的密度接种到6孔板中，每株细胞分别给予不同浓度(0、1和5μM)STM2457处理，或给予5μM组等量的DMSO作为对照，动态观察至第10天，4％多聚甲醛固定15min后，结晶紫染色15min，光学显微镜下观察克隆形成情况并拍照记录。结果表明，相比于对照组，STM2457处理能够抑制NSCLC细胞的克隆形成，并且随着浓度的提高，NSCLC细胞的增殖能力受到更为显著的抑制。
(2)A549/H1975预先给予5μM STM2457处理1天、3天或6天，或使用等量的DMSO预处理6天后，划痕实验(方法同实施例2：(5))评估各组细胞的迁移能力，transwell侵袭实验(方法同实施例2：(5))评估各组细胞的侵袭能力。对比DMSO组和药物处理组，我们明确了STM2457能够有效地抑制NSCLC细胞的迁移和侵袭，并且随着预处理时间的延长STM2457抑制NSCLC转移的效应会更加显著。
(3)选取A549细胞系，分别给予1μM和5μM STM2457或等量的DMSO处理3天；或选取H1975细胞系，给予5μM STM2457或等量的DMSO分别处理3天或6天。将上述处理的细胞裂解，提取总蛋白并测定浓度后，western-blot检测凋亡相关蛋白如PARP、Caspase-3、Bcl2和Bax。我们进一步证实，STM2457能够有效地促进NSCLC细胞系凋亡的发生，这种促进凋亡的效应与其作用浓度和时间成正相关关系。
实验四：如图8中，STM2457能够抑制NSCLC进展的潜在机制
本发明率先发现METTL3能够在不影响CYP19A1 mRNA表达的基础上有效地抑制其蛋白表达，推测能够调控CYP19A1的翻译，进而激活雌激素信号通路促进NSCLC进展；作为METTL3新型小分子抑制剂的STM2457则能够通过阻断CYP19A1的翻译，进而抑制雌激素信号通路激活抑制NSCLC进展。具体步骤如下：
(1)选取A549细胞系，分别予以瞬时转染敲降METTL3的siRNA以下调METTL3或使用CRISRP Cas9稳定敲除METTL3，并设置相应的阴性对照组。Westernblot检测CYP19A1的蛋白表达水平，RT-PCR检测CYP19A1的蛋白表达水平。我们发现敲降或敲除METTL3能够显著的下调CYP19A1的蛋白表达，而不影响其mRNA的表达，甚至在某种程度上会代偿性的上调其mRNA的表达。下调METTL3引起的CYP19A1这种蛋白和mRNA表达变化的不一致，提示METTL3可能在翻译调控过程中影响了CYP19A1的表达，从而能够在CYP19A1低mRNA表达的基础上显著上调其蛋白表达。
(2)选用A549细胞系，予以瞬时转染敲降METTL3的siRNA以下调METTL3或使用CRISRP Cas9稳定敲除METTL3，并设置相应的阴性对照组。细胞计数取5×105个细胞置于新的完全培养基中超声裂解，使用人雌激素酶联免疫试剂盒(CSB-E07286h，CUBABIO)测定5×105个细胞内雌激素合成水平；同法检测上清培养基中雌激素含量，并根据细胞总数，标准化至5×105个细胞的雌激素分泌水平。对比阴性对照组和METTL3敲降组，我们发现A549瞬时敲降或稳定敲除METTL3后，细胞胞内合成和胞外分泌的雌激素水平均显著下降，提示METTL3可能通过调控CYP19A1的翻译参与NSCLC细胞的雌激素合成与分泌。
(3)选用A549细胞系，予以5μM STM2457或等量的DMSO处理3天后，对上述处理的NSCLC细胞，使用western-blot检测CYP19A1的蛋白表达水平，结合RT-PCR结合CYP19A1的mRNA表达水平，最后使用ELISA(方法同实施例4：(2))评估NSCLC细胞中雌激素合成水平。结果表明，STM2457能够有效地抑制CYP19A1的蛋白水平表达，而代偿性上调CYP19A1的mRNA水平表达，提示在CYP19A1的翻译过程中可能发挥着重要的阻断作用，进而最终有效地抑制了NSCLC细胞系的雌激素合成。
本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。

Claims (10)

1.STM2457或其衍生物在制备防治肿瘤疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤疾病为肺癌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞肺癌；所述STM2457的作用浓度为5μM。
4.STM2457或其衍生物在制备NSCLC细胞阻滞增殖制剂、NSCLC细胞抑制转移制剂、NSCLC细胞促进凋亡制剂至少之一中的应用。
5.STM2457或其衍生物在制备CYP19A1表达抑制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述CYP19A1表达为CYP19A1蛋白表达；所述STM2457的作用浓度为5μM。
7.STM2457或其衍生物在制备雌激素信号通路抑制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述雌激素信号通路为NSCLC关联雌激素信号通路。
9.STM2457或其衍生物在制备METTL3活性抑制剂或METTL3表达促进剂中的应用。
10.STM2457或其衍生物在制备m6A甲基化表观修饰催化抑制剂中的应用。
CN202111543015.9A 2021-12-16 2021-12-16 Stm2457的新用途 Active CN114042072B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111543015.9A CN114042072B (zh) 2021-12-16 2021-12-16 Stm2457的新用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111543015.9A CN114042072B (zh) 2021-12-16 2021-12-16 Stm2457的新用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114042072A true CN114042072A (zh) 2022-02-15
CN114042072B CN114042072B (zh) 2023-03-31

Family

ID=80212917

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111543015.9A Active CN114042072B (zh) 2021-12-16 2021-12-16 Stm2457的新用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114042072B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114712510A (zh) * 2022-04-08 2022-07-08 中国人民解放军空军军医大学 小分子抑制剂在制备通过mettl3治疗干预相关疾病药物中的应用
CN114869891A (zh) * 2022-04-28 2022-08-09 复旦大学附属中山医院 Mettl3抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用
CN116251105A (zh) * 2023-02-14 2023-06-13 华中科技大学同济医学院附属同济医院 Stm2457在制备治疗变应性鼻炎的药品中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELIZA YANKOVA等: "Small molecule inhibition of METTL3 as a strategy against myeloid leukaemia", 《NATURE》 *
HANNAH M. BURGESS等: "Targeting the m6A RNA modification pathway blocks SARS-CoV-2 and HCoV-OC43 replication", 《GENES & DEVELOPMENT》 *
JIAZHI LI等: "Mining for METTL3 inhibitors to suppress cancer", 《NAT STRUCT MOL BIOL》 *
WEI HUANG等: "N6‑methyladenosine methyltransferases:functions, regulation, and clinical potential", 《JOURNAL OF HEMATOLOGY & ONCOLOGY》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114712510A (zh) * 2022-04-08 2022-07-08 中国人民解放军空军军医大学 小分子抑制剂在制备通过mettl3治疗干预相关疾病药物中的应用
CN114869891A (zh) * 2022-04-28 2022-08-09 复旦大学附属中山医院 Mettl3抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用
CN116251105A (zh) * 2023-02-14 2023-06-13 华中科技大学同济医学院附属同济医院 Stm2457在制备治疗变应性鼻炎的药品中的应用
CN116251105B (zh) * 2023-02-14 2024-02-06 华中科技大学同济医学院附属同济医院 Stm2457在制备治疗变应性鼻炎的药品中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114042072B (zh) 2023-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114042072B (zh) Stm2457的新用途
Mu et al. MiR-130b/TNF-α/NF-κB/VEGFA loop inhibits prostate cancer angiogenesis
Gan et al. KIF2C exerts an oncogenic role in nonsmall cell lung cancer and is negatively regulated by miR‐325‐3p
Tanno et al. Serine/threonine kinase AKT is frequently activated in human bile duct cancer and is associated with increased radioresistance
Li et al. miR-153 inhibits epithelial–mesenchymal transition by targeting metadherin in human breast cancer
Chen et al. FLJ10540-elicited cell transformation is through the activation of PI3-kinase/AKT pathway
He et al. Circular RNA circHERC4 as a novel oncogenic driver to promote tumor metastasis via the miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin axis in colorectal cancer
Meng et al. Annexin A3 gene silencing promotes myocardial cell repair through activation of the PI3K/Akt signaling pathway in rats with acute myocardial infarction
Hui et al. Radiosensitization by inhibiting STAT1 in renal cell carcinoma
Sun et al. Periostin: a promising target of therapeutical intervention for prostate cancer
Zhai et al. Analysis of clinical factors and PDGFR-β in predicting prognosis of patients with clival chordoma
Chang et al. DPP9 stabilizes NRF2 to suppress ferroptosis and induce sorafenib resistance in clear cell renal cell carcinoma
Liang et al. Development of a new analog of SGK1 inhibitor and its evaluation as a therapeutic molecule of colorectal cancer
Wang et al. Downregulation of a mitochondria associated protein SLP-2 inhibits tumor cell motility, proliferation and enhances cell sensitivity to chemotherapeutic reagents
Wu et al. Silencing of RAD51AP1 suppresses epithelial–mesenchymal transition and metastasis in non‐small cell lung cancer
Li et al. Upregulated LINC01088 facilitates malignant phenotypes and immune escape of colorectal cancer by regulating microRNAs/G3BP1/PD-L1 axis
Gui et al. Long non-coding RNA CDKN2B-AS1 promotes osteosarcoma by increasing the expression of MAP3K3 via sponging miR-4458
Ju et al. CircRNA ANXA2 promotes lung cancer proliferation and metastasis by upregulating PDPK1 expression
Wang et al. Regulation of PTEN and ovarian cancer progression by an E3 ubiquitin ligase RBCK1
Dai et al. Upregulation of p-Smad2 contributes to FAT10-induced oncogenic activities in glioma
Xu et al. BRCA1 mutation leads to deregulated Ubc9 levels which triggers proliferation and migration of patient-derived high grade serous ovarian cancer and triple negative breast cancer cells
Li et al. MicroRNA-145 suppresses gastric cancer progression by targeting Hu-antigen R
CN110496221A (zh) 抑制dppa3表达的物质在制备预防和治疗癌症的产品中的应用
Liu et al. MDC1 promotes ovarian cancer metastasis by inducing epithelial-mesenchymal transition
Shi et al. Overexpression of PIP5KL1 suppresses cell proliferation and migration in human gastric cancer cells

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant