CN110917352A - Rock抑制剂在肿瘤免疫治疗中的新用法 - Google Patents

Rock抑制剂在肿瘤免疫治疗中的新用法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及ROCK抑制剂在肿瘤免疫治疗中的新用法，具体提出了ROCK激酶抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫。发明人发现，用ROCK激酶抑制剂如Y‑27632来抑制MSN磷酸化，可以导致PD‑L1的表达水平下降，从而触发T细胞的活化。因此，ROCK激酶抑制剂如Y‑27632制备的药物可以有效用于肿瘤(如乳腺癌)的免疫治疗。

Description

ROCK抑制剂在肿瘤免疫治疗中的新用法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及ROCK抑制剂在肿瘤免疫治疗中的新用法，更具体地，本发明涉及ROCK激酶抑制剂在制备药物中的用途，ROCK激酶抑制剂在制备试剂盒中的用途，药物组合物，试剂盒，试剂在制备药物中的用途，试剂在制备试剂盒中的用途，以及筛选药物的方法。
背景技术
免疫检查点抑制剂如抗PD(L)1抗体已经被批准用于治疗几种具有优异的临床结果的肿瘤类型。实验结果显示，抗PD-L1疗法可有效治疗三阴性乳腺癌。应用抗PD(L)-1疗法治疗癌症的主要问题是低反应率和免疫抗性。PD-L1和抗癌药物的联合治疗为提高抗PD(L)-1的治疗效率提供了新的思路。因此，深入了解PD-L1表达的调节机制将为乳腺癌的联合治疗提供新的靶点。
PD-L1与T细胞中的PD-1配体结合，从而导致T细胞失活和凋亡，而免疫疗法的效率与肿瘤内CD8+T细胞的数量和活性密切相关。PD-L1由几种细胞因子诱导，例如I型和II型干扰素，肿瘤坏死因子α(TNF-α)和VEGF。PD-L1 mRNA水平可以被3'-UTR下调，然而在多种癌症中，通常3'-UTR已被破坏。作为跨膜蛋白，PD-L1的表达可以通过翻译后修饰广泛调节，例如磷酸化，糖基化，乙酰化，棕榈酰化和泛素化。
Moesin(MSN)属于ERM家族，其包括埃兹蛋白，radixin和moesin。ERM蛋白在调节细胞表面结构如微绒毛和膜褶皱以及特殊的膜结构域如肠道中的纤维、光感受器稳定性和有丝分裂皮质硬化中发挥关键作用。关于生物化学特征，MSN蛋白质由氨基末端的FERM结构域和C末端ERM结合结构域(C-ERMAD)组成，其中C-ERMAD能够结合FERM结构域或F-肌动蛋白。在无活性构象中，N末端FERM结构域与C末端区域结合，而在磷酸化介导的活性构象中，释放的FERM结构域与膜蛋白如CD44、CD43相互作用，并且C末端结构域与肌动蛋白细胞骨架结合。MSN的激活受几种激酶的调节，包括rho相关蛋白激酶(ROCK)，其在MSN苏氨酸558处磷酸化以抑制分子间头尾关联。
近年来，国内外应用PD-L1抗体治疗肿瘤取得了重大进展，免疫治疗被认为是继手术、化疗与放疗之后肿瘤治疗的又一重要手段。因此，研究PD-L1水平的调控对对提高抗PD-L1免疫治疗水平以及其他抗癌药物联合治疗效果至关重要。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
鉴于目前对乳腺癌中PD-L1调节机制的理解有限，发明人采用质谱来筛选PDL-1相互作用蛋白。通过分析乳腺癌TCGA数据库中丰度较高的蛋白，发明人发现MSN与PD-L1表达呈正相关。此外，发明人发现，ROCK介导的MSN Thr558磷酸化是PD-L1稳定化所必需的，且MSN磷酸化水平与PD-L1表达呈正相关。进一步地，发明人发现，抑制乳腺癌中MSN的表达或用ROCK激酶抑制剂如Y-27632来抑制MSN磷酸化，可以导致PD-L1的表达水平下降，从而触发T细胞的活化。且体内研究证明，ROCK激酶抑制剂通过激活T细胞和NK细胞的活性(免疫反应)来实现与anit-PD1抗体相似的抗肿瘤活性。由此，ROCK激酶抑制剂可以有效用于抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了ROCK激酶抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫。发明人发现，用ROCK激酶抑制剂如Y-27632可以抑制MSN磷酸化，从而导致PD-L1的表达水平下降，进而触发T细胞的活化，从而实现免疫治疗肿瘤如乳腺癌的目的。因此，ROCK激酶抑制剂制备的药物，能够用于抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫。
根据本发明的实施例，上述用途还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述ROCK激酶抑制剂为Y-27632或其药学上可接受的盐。发明人惊喜地发现，Y-27632可以应用于肿瘤如乳腺癌的免疫治疗，且疗效显著。由此，Y-27632或其药学上可接受的盐(如Y-27632二盐酸盐，CAS登录号：146986-50-7)制备的药物可以有效用于抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫。
需要说明的是，本发明所使用的“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的有机盐和无机盐。药学上可接受的盐在所属领域是为我们所熟知的，如文献：S.M.Berge etal.,describe pharmaceutically acceptable salts in detail in J.PharmaceuticalSciences,1977,66:1-19.所记载的。药学上可接受的无毒的酸形成的盐包括，但并不限于，与氨基基团反应形成的无机酸盐有盐酸盐，氢溴酸盐，磷酸盐，硫酸盐，高氯酸盐，和有机酸盐如乙酸盐，草酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐，丙二酸盐，或通过书籍文献上所记载的其他方法如离子交换法来得到这些盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐，藻酸盐，抗坏血酸盐，天冬氨酸盐，苯磺酸盐，苯甲酸盐，重硫酸盐，硼酸盐，丁酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，环戊基丙酸盐，二葡萄糖酸盐，十二烷基硫酸盐，乙磺酸盐，甲酸盐，反丁烯二酸盐，葡庚糖酸盐，甘油磷酸盐，葡萄糖酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，氢碘酸盐，2-羟基-乙磺酸盐，乳糖醛酸盐，乳酸盐，月桂酸盐，月桂基硫酸盐，苹果酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，硝酸盐，油酸盐，棕榈酸盐，扑酸盐，果胶酸盐，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，苦味酸盐，特戊酸盐，丙酸盐，硬脂酸盐，硫氰酸盐，对甲苯磺酸盐，十一酸盐，戊酸盐，等等。通过适当的碱得到的盐包括碱金属，碱土金属，铵和N+(C1-4烷基)4的盐。本发明也拟构思了任何所包含N的基团的化合物所形成的季铵盐。水溶性或油溶性或分散产物可以通过季铵化作用得到。碱金属或碱土金属盐包括钠，锂，钾，钙，镁，等等。药学上可接受的盐进一步包括适当的、无毒的铵，季铵盐和抗平衡离子形成的胺阳离子，如卤化物，氢氧化物，羧化物，硫酸化物，磷酸化物，硝酸化物，C1-8磺酸化物和芳香磺酸化物。
根据本发明的实施例，所述抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫是通过降低MSN蛋白磷酸化水平实现的。发明人发现，ROCK介导的MSN Thr558磷酸化是PD-L1稳定化所必需的，且MSN磷酸化水平与PD-L1表达呈正相关。用ROCK激酶抑制剂如Y-27632抑制MSN第558位苏氨酸的磷酸化，可以导致PD-L1的表达水平下降，进而触发T细胞的活化，从而实现肿瘤如乳腺癌的免疫治疗。因此，ROCK激酶抑制剂制备的药物可以通过降低MSN蛋白磷酸化水平来抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫。
根据本发明的实施例，所述肿瘤为乳腺癌。
在本发明的第二方面，本发明提出了ROCK激酶抑制剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于增强T细胞的活性或降低PD-L1蛋白的表达水平。发明人发现，用ROCK激酶抑制剂如Y-27632可以抑制MSN磷酸化，从而导致PD-L1的表达水平下降，进而触发T细胞的活化。因此，ROCK激酶抑制剂制备的试剂盒，能够有效用于增强T细胞的活性或抑制PD-L1蛋白的表达水平，以便用于科学研究，如用于肿瘤免疫治疗的机理研究中。
根据本发明的实施例，上述用途还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述增强T细胞的活性或降低PD-L1蛋白的表达水平是通过降低MSN蛋白磷酸化水平实现的。发明人发现，ROCK介导的MSN Thr558磷酸化是PD-L1稳定化所必需的，且MSN磷酸化水平与PD-L1表达呈正相关。用ROCK激酶抑制剂如Y-27632抑制MSN第558位苏氨酸的磷酸化，可以导致PD-L1的表达水平下降，进而触发T细胞的活化。因此，ROCK激酶抑制剂制备的试剂盒，能够通过降低MSN蛋白磷酸化水平来增强T细胞的活性或抑制PD-L1蛋白的表达水平，以便用于科学研究，如用于肿瘤免疫治疗的机理研究中。
根据本发明的实施例，所述ROCK激酶抑制剂为Y-27632或其药学上可接受的盐。发明人发现，Y-27632可以有效抑制MSN磷酸化，从而导致PD-L1的表达水平下降，进而触发T细胞的活化。因此，作为ROCK激酶抑制剂的Y-27632或其药学上可接受的盐(如Y-27632二盐酸盐，CAS登录号：146986-50-7)制备的试剂盒，能够有效用于增强T细胞的活性或抑制PD-L1蛋白的表达水平，以便用于科学研究，如用于肿瘤免疫治疗的机理研究中。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：降低MSN蛋白表达水平和/或降低MSN蛋白磷酸化水平的试剂，所述药物组合物用于抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫。发明人发现，抑制乳腺癌中MSN的表达或用ROCK激酶抑制剂如Y-27632可以抑制MSN磷酸化，从而导致PD-L1的表达水平下降，进而触发T细胞的活化，从而实现肿瘤如乳腺癌的免疫治疗。因此，包括降低MSN蛋白表达水平和/或降低MSN蛋白磷酸化水平的试剂的根据本发明实施例的药物组合物，能够用于抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫。
根据本发明的实施例，上述药物组合物还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫是通过增强T细胞的活性实现的。根据本发明的实施例，所述增强T细胞的活性是通过降低PD-L1蛋白的表达水平实现的。如前所述，发明人发现，抑制乳腺癌中MSN的表达或用ROCK激酶抑制剂如Y-27632可以抑制MSN磷酸化，从而导致PD-L1的表达水平下降，进而触发T细胞的活化，从而实现肿瘤如乳腺癌的免疫治疗。因此，包括降低MSN蛋白表达水平和/或降低MSN蛋白磷酸化水平的试剂的根据本发明实施例的药物组合物，能够通过降低PD-L1蛋白的表达水平，触发T细胞的活化，来抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫。
根据本发明的实施例，所述降低MSN蛋白表达水平的试剂为siRNA，所述siRNA具有SEQ ID NO：1～2所示的核苷酸序列。
si-1：GCUAAAUUGAAACCUGGAAUU(SEQ ID NO：1)；
si-2：GGAGGAUGCUGUCCUGGAAUA(SEQ ID NO：2)。
根据本发明的实施例，所述降低MSN蛋白磷酸化水平的试剂为ROCK功能抑制剂。需要说明的是，“ROCK功能抑制剂”指的是能够特异性敲低ROCK蛋白的试剂、ROCK蛋白的竞争性抑制剂或ROCK蛋白的抗体等能够抑制ROCK蛋白功能发挥的试剂。
根据本发明的实施例，所述ROCK功能抑制剂为ROCK激酶抑制剂或siRNA，所述siRNA具有SEQ ID NO：3～4所示的核苷酸序列。
hROCK si-1：GCACCAGUUGUACCCGAUUUA(SEQ ID NO：3)；
hROCK si-2：CGAUCGUCUCUAGGAUGAUAU(SEQ ID NO：4)。
根据本发明的实施例，所述ROCK激酶抑制剂为Y-27632或其药学上可接受的盐。如前所述，发明人惊喜地发现，Y-27632可以抑制MSN磷酸化，有效应用于肿瘤如乳腺癌的免疫治疗，且疗效显著。由此，包括Y-27632或其药学上可接受的盐(如Y-27632二盐酸盐，CAS登录号：146986-50-7)的药物组合物可以有效用于抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫。
根据本发明的实施例，所述肿瘤为乳腺癌。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括试剂，所述试剂用于调节MSN蛋白表达水平和/或调节MSN蛋白磷酸化水平，所述试剂盒用于调节PD-L1蛋白的表达水平和/或调节T细胞的活性。如前所述，发明人发现MSN与PD-L1表达呈正相关。此外，发明人发现，ROCK介导的MSN Thr558磷酸化是PD-L1稳定化所必需的，且MSN磷酸化水平与PD-L1表达呈正相关。抑制乳腺癌中MSN的表达或用ROCK激酶抑制剂如Y-27632来抑制MSN第558位苏氨酸的磷酸化，可以导致PD-L1的表达水平下降，从而触发T细胞的活化。因此，包含用于调节MSN蛋白表达水平和/或调节MSN蛋白磷酸化水平的试剂的试剂盒，可以用于调节PD-L1蛋白的表达水平和/或调节T细胞的活性，以便用于科学研究，如用于肿瘤免疫机理的研究。
根据本发明的实施例，所述试剂用于升高MSN蛋白表达水平和/或升高MSN蛋白磷酸化水平，所述试剂盒用于升高PD-L1蛋白的表达水平和/或抑制T细胞的活性。
根据本发明的实施例，所述试剂用于降低MSN蛋白表达水平和/或降低MSN蛋白磷酸化水平，所述试剂盒用于降低PD-L1蛋白的表达水平和/或增强T细胞的活性。
根据本发明的实施例，所述降低MSN蛋白表达水平的试剂为siRNA，所述siRNA具有SEQ ID NO：1～2所示的核苷酸序列。
si-1：GCUAAAUUGAAACCUGGAAUU(SEQ ID NO：1)；
si-2：GGAGGAUGCUGUCCUGGAAUA(SEQ ID NO：2)。
根据本发明的实施例，所述降低MSN蛋白磷酸化水平的试剂为ROCK功能抑制剂。如前所述，“ROCK功能抑制剂”指的是能够特异性敲低ROCK蛋白的试剂、ROCK蛋白的竞争性抑制剂或ROCK蛋白的抗体等能够抑制ROCK蛋白功能发挥的试剂。
根据本发明的实施例，所述ROCK功能抑制剂为ROCK激酶抑制剂或siRNA，所述siRNA具有SEQ ID NO：3～4所示的核苷酸序列。
hROCK si-1：GCACCAGUUGUACCCGAUUUA(SEQ ID NO：3)；
hROCK si-2：CGAUCGUCUCUAGGAUGAUAU(SEQ ID NO：4)。
根据本发明的实施例，所述ROCK激酶抑制剂为Y-27632或其药学上可接受的盐。发明人发现，Y-27632或其药学上可接受的盐(如Y-27632二盐酸盐，CAS登录号：146986-50-7)可以抑制MSN第558位苏氨酸的磷酸化，导致PD-L1的表达水平下降，从而触发T细胞的活化。因此，所述ROCK激酶抑制剂为Y-27632或其药学上可接受的盐时，所述试剂盒可以有效用于降低PD-L1蛋白的表达水平和/或增强T细胞的活性。
在本发明的第五方面，本发明提出了试剂在制备药物中的用途，所述试剂用于降低MSN蛋白表达水平和/或降低MSN蛋白磷酸化水平，所述药物用于抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫。如前所述，发明人发现，抑制乳腺癌中MSN的表达或用ROCK激酶抑制剂如Y-27632可以抑制MSN磷酸化，从而导致PD-L1的表达水平下降，进而触发T细胞的活化，从而实现肿瘤如乳腺癌的免疫治疗。因此，用于降低MSN蛋白表达水平和/或降低MSN蛋白磷酸化水平的试剂制备的药物，能够有效用于抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫。
根据本发明的实施例，上述用途还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫是通过增强T细胞的活性实现的。根据本发明的实施例，所述增强T细胞的活性是通过降低PD-L1蛋白的表达水平实现的。如前所述，发明人发现，抑制乳腺癌中MSN的表达或用ROCK激酶抑制剂如Y-27632可以抑制MSN磷酸化，从而导致PD-L1的表达水平下降，进而触发T细胞的活化，从而实现肿瘤如乳腺癌的免疫治疗。因此，用于降低MSN蛋白表达水平和/或降低MSN蛋白磷酸化水平的试剂制备的药物，能够通过降低PD-L1蛋白的表达水平，触发T细胞的活化，来抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫。
根据本发明的实施例，所述降低MSN蛋白表达水平的试剂为siRNA，所述siRNA具有SEQ ID NO：1～2所示的核苷酸序列。
si-1：GCUAAAUUGAAACCUGGAAUU(SEQ ID NO：1)；
si-2：GGAGGAUGCUGUCCUGGAAUA(SEQ ID NO：2)。
根据本发明的实施例，所述降低MSN蛋白磷酸化水平的试剂为ROCK功能抑制剂。如前所述，“ROCK功能抑制剂”指的是能够特异性敲低ROCK蛋白的试剂、ROCK蛋白的竞争性抑制剂或ROCK蛋白的抗体等能够抑制ROCK蛋白功能发挥的试剂。
根据本发明的实施例，所述ROCK功能抑制剂为ROCK激酶抑制剂或siRNA，所述siRNA具有SEQ ID NO：3～4所示的核苷酸序列。
hROCK si-1：GCACCAGUUGUACCCGAUUUA(SEQ ID NO：3)；
hROCK si-2：CGAUCGUCUCUAGGAUGAUAU(SEQ ID NO：4)。
根据本发明的实施例，所述ROCK激酶抑制剂为Y-27632或其药学上可接受的盐。如前所述，发明人惊喜地发现，Y-27632可以抑制MSN磷酸化，有效应用于肿瘤如乳腺癌的免疫治疗，且疗效显著。由此，Y-27632或其药学上可接受的盐(如Y-27632二盐酸盐，CAS登录号：146986-50-7)制备的药物可以有效用于抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫。
根据本发明的实施例，所述肿瘤为乳腺癌。
在本发明的第六方面，本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂用于调节MSN蛋白表达水平和/或调节MSN蛋白磷酸化水平，所述试剂盒用于调节PD-L1蛋白的表达水平和/或调节T细胞的活性。如前所述，发明人发现MSN与PD-L1表达呈正相关。此外，发明人发现，ROCK介导的MSN Thr558磷酸化是PD-L1稳定化所必需的，且MSN磷酸化水平与PD-L1表达呈正相关。抑制乳腺癌中MSN的表达或用ROCK激酶抑制剂如Y-27632来抑制MSN第558位苏氨酸的磷酸化，可以导致PD-L1的表达水平下降，从而触发T细胞的活化。因此，用于调节MSN蛋白表达水平和/或调节MSN蛋白磷酸化水平的试剂制备的试剂盒，可以用于调节PD-L1蛋白的表达水平和/或调节T细胞的活性，以便用于科学研究，如用于肿瘤免疫机理的研究。
根据本发明的实施例，上述用途还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述试剂用于升高MSN蛋白表达水平和/或升高MSN蛋白磷酸化水平，所述试剂盒用于升高PD-L1蛋白的表达水平和/或抑制T细胞的活性。
根据本发明的实施例，所述试剂用于降低MSN蛋白表达水平和/或降低MSN蛋白磷酸化水平，所述试剂盒用于降低PD-L1蛋白的表达水平和/或增强T细胞的活性。
根据本发明的实施例，所述降低MSN蛋白表达水平的试剂为siRNA，所述siRNA具有SEQ ID NO：1～2所示的核苷酸序列。
si-1：GCUAAAUUGAAACCUGGAAUU(SEQ ID NO：1)；
si-2：GGAGGAUGCUGUCCUGGAAUA(SEQ ID NO：2)。
根据本发明的实施例，所述降低MSN蛋白磷酸化水平的试剂为ROCK功能抑制剂。如前所述，“ROCK功能抑制剂”指的是能够特异性敲低ROCK蛋白的试剂、ROCK蛋白的竞争性抑制剂或ROCK蛋白的抗体等能够抑制ROCK蛋白功能发挥的试剂。
根据本发明的实施例，所述ROCK功能抑制剂为ROCK激酶抑制剂或siRNA，所述siRNA具有SEQ ID NO：3～4所示的核苷酸序列。
hROCK si-1：GCACCAGUUGUACCCGAUUUA(SEQ ID NO：3)；
hROCK si-2：CGAUCGUCUCUAGGAUGAUAU(SEQ ID NO：4)。
根据本发明的实施例，所述ROCK激酶抑制剂为Y-27632或其药学上可接受的盐。发明人发现，Y-27632或其药学上可接受的盐(如Y-27632二盐酸盐，CAS登录号：146986-50-7)可以抑制MSN第558位苏氨酸的磷酸化，导致PD-L1的表达水平下降，从而触发T细胞的活化。因此，所述ROCK激酶抑制剂为Y-27632或其药学上可接受的盐时，所述试剂盒可以有效用于降低PD-L1蛋白的表达水平和/或增强T细胞的活性。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗或预防乳腺癌。根据本发明的实施例，所述方法包括：
给予乳腺癌动物模型候选药物；
比较给药前后，所述乳腺癌动物模型的乳腺癌细胞中MSN蛋白的表达水平和/或MSN蛋白的磷酸化水平，以及乳腺癌细胞中PD-L1蛋白的表达水平或T细胞的活性，判断所述候选药物是否为目标药物。
如前所述，发明人发现，抑制乳腺癌中MSN的表达或用ROCK激酶抑制剂如Y-27632可以抑制MSN磷酸化，从而导致PD-L1的表达水平下降，进而触发T细胞的活化，从而实现肿瘤如乳腺癌的免疫治疗。因此，利用根据本发明实施例的方法可以有效筛选获得治疗或预防乳腺癌的药物。
根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，给药后相比于给药前，所述乳腺癌动物模型的乳腺癌细胞中所述MSN蛋白的表达水平和/或所述MSN蛋白的磷酸化水平降低，且乳腺癌细胞中PD-L1蛋白的表达水平降低或T细胞活性增强，是所述候选药物为目标药物的指示。
附图说明
图1表示根据本发明实施例的MSN对乳腺癌细胞PD-L1的调节作用，其中：
A表示Flag-PD-L1免疫沉淀物的质谱分析，其中丰度较高的与PD-L1相互作用的蛋白质已经列出，并利用Ualcan在线工具分析了TCGA数据库中与PD-L1相互作用的蛋白质的Pearson相关系数；B表示TCGA数据库中MSN与PD-L1的相关性分析，其中皮尔森相关系数为0.47；C表示TCGA数据库中的MSN的转录水平，P＝8.3E-14；D表示TCGA数据库中的PD-L1的转录水平，P＝0.049；E表示Flag-PD-L1免疫沉淀的免疫印迹；F表示用APC耦合的抗体通过FACS分析MSN沉默细胞的细胞表面PD-L1水平；G表示在MDA-MB-231或BT-549细胞中用siRNA沉默MSN后，PD-L1水平降低；
图2表示根据本发明实施例的MDA-MB-231细胞的WCL免疫印迹分析和PD-L1mRNA水平，其中：
A表示用PD-L1 siRNA转染的MDA-MB-231细胞的WCL免疫印迹分析；B表示用Flag-MSN转染的MDA-MB-231细胞的WCL免疫印迹分析；C表示用MSN siRNA转染的MDA-MB-231细胞的PD-L1 mRNA水平的qPCR分析，其中，mRNA relevent level表示mRNA相对水平；
图3表示根据本发明实施例的MSN调节PD-L1的泛素化，其中：
A表示用MSN siRNA转染细胞，并在指定的时间点用放线菌酮(Chx，50μg/mL)处理，其中PD-L1水平通过蛋白质印迹来显示，并通过Image J软件进行半定量，其中，Relativeprotein level表示相对蛋白水平，Time表示时间，Control表示对照；B表示用MSN siRNA转染并用MG132(10μM)处理6小时的细胞的免疫印迹；C表示用MSN siRNA、V5-PD-L1和Flag-SPOP转染细胞，其中通过抗V5抗体进行PD-L1的免疫沉淀，并用Flag抗体进行印迹；
图4表示根据本发明实施例的MSN对PD-L1表达的调节依赖于磷酸化，其中：
A表示在重新引入MSN-T558D(TD)和WT-MSN而不是MSN-T558A(TA)后，在MSN沉默的细胞中完全恢复了蛋白质印迹中显示的PD-L1水平；B表示MDA-MB-231细胞中Flag-PD-L1和p-MSN的免疫荧光，比例尺：10μm；C表示人乳腺癌组织(n＝140)和正常组织中p-MSN和PD-L1的IHC染色的代表性图像，比例尺：1000μm(左)，50μm(右)，其中，Tumor表示肿瘤，Normal表示正常；D表示使用Pearsonχ2检验进行p-MSN和PD-L1之间的相关性分析(P<0.0001)；
图5表示根据本发明实施例的ROCK抑制导致T细胞活化，其中：
A表示用ROCK siRNA转染的MDA-MB-231细胞的WCL免疫印迹分析；B表示用MSNsiRNA转染并用Y-27632(20μM)处理24小时的MDA-MB-231细胞的WCL免疫印迹分析；C表示用Flag-MSN转染并用Y-27632(20μM)处理24小时的MDA-MB-231细胞的WCL免疫印迹分析；D表示通过ELISA测试检测Jurkat T细胞和转染的MDA-MB-231细胞的3天共培养物的上清液中的IL-2水平，*P<0.05，非配对双尾t检验；E表示通过ELISA测试检测用Y-27632(20μM)处理的Jurkat T细胞和MDA-MB-231细胞的3天共培养物的上清液中IL-2的水平，*P＝0.0012<0.01，非配对双尾t检验；F表示Jurkat T细胞共培养3天后MDA-MB-231细胞的存活细胞数，*P<0.05，非配对双尾t检验；
图6表示根据本发明实施例的细胞增殖和细胞凋亡实验，其中：
A表示Y-27632处理后的细胞增殖，其中，Cell number表示细胞数量，Time表示时间；B表示用膜联蛋白V-FITC/PI双染色，通过FACS检测Y-27632处理3天后的细胞凋亡；
图7表示根据本发明实施例的ROCK抑制剂抑制乳腺癌的发展，其中：
A表示Y-27632(8mg/kg)和/或抗PD-1抗体(75μg)处理对EMT6同系小鼠模型(n＝8)中肿瘤生长的影响，其中，Tumor injection表示肿瘤注射；B表示在EMT6同系小鼠模型中的指定时间点用Y-27632和/或抗PD-1抗体处理后获得的肿瘤，其中，saline表示盐水；C表示Y-27632和/或抗PD-1抗体处理后获得的肿瘤的CD4的IHC染色，比例尺：100μm，**P<0.01，其中，cell表示细胞，field表示区域；D表示Y-27632和/或抗PD-1抗体处理后获得的肿瘤的CD8的IHC染色，比例尺：100μm，**P<0.01；E表示Y-27632和/或抗PD-1抗体处理后，对肿瘤的CD4和CD8的qPCR分析，*P<0.05，*P<0.01，不成对的双尾t检验，其中，Relative mRNAexpression表示相对mRNA表达量；
图8表示根据本发明实施例的Y-27632处理后，小鼠肿瘤的PD-L1的IHC染色，比例尺：100μm；
图9表示根据本发明实施例的ROCK抑制剂的应用引发免疫应答，其中：
收获Y-27632和/或抗PD-1抗体处理后的小鼠肿瘤用于转录组学分析，A表示用维恩图显示Y-27632和/或抗PD-1抗体处理的肿瘤的差异基因；B表示用GO途径分析Y-27632处理的肿瘤和对照；C表示用热图显示Y-27632处理的肿瘤和对照的表达值(基于cufflink计数的z分数)；D表示TCGA数据库中MSN与GZMB的相关性分析。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
发明人用质谱法筛选到乳腺癌细胞中PD-L1相互作用蛋白，并证实细胞骨架结构调节蛋白moesin(MSN)对PD-L1水平的调节中起着关键作用。发明人的研究结果表明，由ROCK激酶介导的MSN磷酸化通过阻断PD-L1和SPOP(E3连接酶接头)的相互作用来稳定PD-L1蛋白水平。抑制乳腺癌中MSN的表达或用ROCK抑制剂Y-27632可抑制MSN磷酸化，进而导致PD-L1的表达水平下降，触发T细胞的活化，但并不影响T细胞的增殖和凋亡。在免疫正常的BALB/C乳腺癌模型小鼠中加入Y-27632可抑制肿瘤进展，增强CD4+和CD8+T细胞浸润。RNA序列分析表明应用Y-27632治疗上调免疫应答相关通路与基因。然而，由于Y-27632治疗导致PD-L1水平降低，因而联合应用PD-L1抗体和Y-27632治疗并不会表现协同作用。发明人的研究揭示了ROCK-MSN途径调控PD-L1表达的新途径。其中ROCK抑制剂Y-27632可应用于肿瘤的免疫治疗。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。
实施例
一、实验方法和实验材料
1.抗体和化学品
以下抗体用于免疫印迹分析、免疫荧光、体内给药和免疫沉淀：PD-L1和MSN(cst)、phospho-MSN(abcam)、flag(sigma)和v5(invitrogen)。用于体内实验的PD-L1购自BioXcell。Y-27632、放线菌酮、PMA和PHA购自Medchem Express。乳腺癌组织芯片是从iwill生物技术公司订购的。
2、T细胞杀伤试验
用MSN siRNA转染或用y-27632(20μm)处理MDA-MB-231细胞。使用25ng ml-1pma和1μg ml-1pha激活Jurkat T细胞24小时，然后以5:1Jurkat:MDA-MB-231的比例混合培养。在显微镜下采集存活细胞图像并计算。
3、免疫荧光染色
用PBS洗涤MDA-MB-231细胞，用4％甲醛固定20分钟，然后用Trion x100渗透5分钟，在室温下用5％BSA封闭20分钟，用一抗(p-MSN，1％BSA稀释1:200；flag，1％BSA稀释1:500)在4℃孵育过夜。用PBS洗涤3次后，用二抗(驴抗兔IgG-Alexa Fluor 594和驴抗鼠IgG-Fitc，1％BSA稀释1:500)在室温下孵育1h。以DAPI(Invitrogen)共染色，并于荧光显微镜下观察。
4、免疫沉淀
使用
Figure BDA0002243125350000111
3000(Invitrogen，USA)并按照制造商的说明将质粒转染MDA-MB-231或BT-549细胞。转染48h后，细胞在缓冲液中裂解(50mM Tris-HCl，pH7.4，200mMNaCl，0.2％NP40，10％甘油，1mM NaF和完整的蛋白酶抑制剂混合物，罗氏)。将细胞提取物与抗体于4℃孵育过夜。然后在4℃下加入蛋白A/G磁珠孵育2h。用裂解缓冲液洗涤3次后，用2×laemmli缓冲液煮沸免疫沉淀物，以蛋白印迹法分析。
5、乳腺肿瘤小鼠模型
动物研究开展经过天津医科大学肿瘤医院动物护理和使用委员会(批准号：LLSP2019004)批准进行的。乳腺肿瘤小鼠模型和治疗方案参照之前文献报道，并进行了一些修改。简言之，将EMT6(1x105)细胞与matrigel混匀，并注射到BALB/C小鼠(6-8周大的雌性)乳头下。小鼠每天腹腔注射8mg/kg Y-27632或生理盐水，同时每隔4天注射75mg抗鼠PD-L1抗体(10F.9G2，Bio X细胞)或对照大鼠抗体IgG2b。每3天用游标卡尺测量一次肿瘤体积，计算公式为：1/2x长度x宽度2。
6、IL-2分泌量分析
用MSN siRNA转染或用Y-27632(20μm)处理MDA-MB-231细胞。使用25ng/ml PMA和1μg/ml PHA处理Jurkat T细胞24小时，然后以4:1Jurkat:MDA-MB-231细胞的比例混合培养。共培养72小时后收获细胞培养液。参照试剂盒说明，用IL-2酶联免疫吸附测定试剂盒测定培养液中的IL-2水平。
7、统计分析
采用t检验或单因素方差分析比较实验数据。利用GRAPHPAD软件进行统计分析和绘图。采用Image pro plus软件对IHC数据进行半定量分析，采用Pearsonχ2检验进行统计学分析。P值<0.05被认为具有统计学意义。
二、实验结果和实验结论
1、乳腺癌组织中PD-L1表达受MSN调控。
为了鉴定PD-L1的调节因子，发明人在MDA-MB-231乳腺癌细胞中Flag标签标记PD-L1并进行免疫沉淀，通过质谱法筛选相互作用蛋白(图1A)。在肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库中，通过在线工具ualcan，选择高富集蛋白与PD-L1进行相关性分析。发明人发现MSN是富集程度最高的蛋白质之一，并与数据库中的PD-L1有很强的相关性(图1B)。进一步的生物信息学分析表明，在乳腺原发肿瘤中，MSN和PD-L1表达明显下调(图1C和图1D)。需要说明的是，图1C与1D是TCGA中的转录水平比较。为了验证这种相互作用，发明人对flag-PD-L1进行了免疫沉淀，结果表明MSN与PD-L1具有相互作用(图1E)。为了研究MSN和PD-L1的分子联系，发明人在两个乳腺癌细胞系(MDA-MB-231和bt-549)中敲除了MSN，发现当MSN表达降低时，PD-L1水平随之降低(图1F)，而沉默PD-L1后，MSN水平没有变化(图2A)。此外，在细胞中过度表达MSN后，PD-L1水平增加(图2B)。值得注意的是，沉默MSN后PD-L1的mRNA水平没有变化(图2C)。使用流式细胞技术，发明人还证明了沉默MSN后细胞膜PD-L1水平下降(图1G)。综上所述，发明人的数据表明，MSN调节乳腺癌中PD-L1水平。
2、MSN与SPOP竞争性结合PD-L1，减少PD-L1降解。
下一步，发明人试图阐述沉默MSN后PD-L1表达下降的分子机制。使用放线菌酮释放实验分析，发明人发现沉默MSN可提高细胞中PD-L1的降解速率(图3A)。此外，在没有MSN的情况下，PD-L1的泛素化水平增加，这表明MSN降低PD-L1泛素化水平(图3B)。SPOP是介导PD-L1降解的主要E3连接酶转接器，发明人发现在MSN缺失后PD-L1与SPOP的相互作用增强(图3C)，表明MSN与SPOP竞争结合PD-L1。综上所述，发明人的数据表明，MSN通过阻断PD-L1与SPOP的相互作用，有助于PD-L1的稳定性。
3、MSN第558位苏氨酸磷酸化对pdl-1表达是必要的
MSN功能活性受磷酸化调节，ROCK激酶磷酸化MSN第558位苏氨酸。发明人探究是否需要磷酸化MSN来调节PD-L1的表达。为了实现这一目标，发明人在MSN敲低的细胞中回补表达MSN野生型(wt-MSN)、非磷酸化(t558a-MSN)或磷酸化型(t558d-MSN)。发明人发现，虽然wt-MSN和t558d-MSN都能完全回补PD-L1水平，但t558a-MSN的表达只能部分恢复(图4A)。同时，发明人发现用免疫荧光染色法发现磷酸化的MSN和PD-L1在细胞膜上共定位(图4B)。为了探讨p-MSN和PD-L1的临床相关性，发明人通过免疫组织化学检查了乳腺癌组织芯片中p-MSN和PD-L1的表达(图4C)。140例标本中69例(50.2％)检测到高水平的p-MSN，其中97例(70.0％)显示高水平的PD-L1表达(图4D)。卡方检验进一步表明，乳腺癌患者标本中p-MSN水平与PD-L1表达存在正相关。这些结果支持MSN高磷酸化水平增强PD-L1水平。
4.抑制ROCK激酶导致PDL-1依赖性T细胞活化。
ROCK是MSN第558位苏氨酸在细胞运动过程中磷酸化的关键激酶。如图5A所示，sirna沉默或存在激酶抑制剂y-27632(图5B)时磷酸化MSN水平降低，而总MSN水平没有改变。如预期的，在ROCK沉默后或在存在ROCK激酶抑制剂Y-27632的情况下，PD-L1水平降低(图5A和图5B)。为了检验是否由ROCK通过MSN调控PD-L1，发明人在y-27632存在的情况下敲除了细胞中的MSN，发现y-27632下调PD-L1的作用减弱。此外，当在Y-27632处理的细胞中过度表达MSN时，PD-L1水平被恢复(图5C)。这些结果表明，由ROCK调控的PD-L1表达依赖于MSN。
为了研究ROCK-MSN通路在T细胞激活中的作用，发明人将jurkat T和MDA-MB-231细胞共培养，发现使用y-27632抑制ROCK激酶或者沉默MSN时，T细胞介导的肿瘤细胞死亡显著增多(图5D)。此外，应用y-27632抑制ROCK激酶或者沉默MSN使得Jurkat细胞IL-2分泌增多(图5E和图5F)。值得注意的是，Y-27632对T细胞的增殖和凋亡作用有限(图6A和图6B)。综上所述，这些数据表明，抑制ROCK-MSN通路可通过下调PD-L1来改善T细胞的活化。
5.抑制ROCK-MSN通路通过下调PD-L1抑制肿瘤进展。
为了评估抑制ROCK-MSN通路在免疫应答中的作用，发明人利用小鼠乳腺癌细胞系EMT6建立了免疫功能小鼠乳腺癌肿瘤模型。将ROCK抑制剂Y-27632和PD1抗体分别或组合注射到肿瘤小鼠体内(图7A)。注射Y-27632和/或抗PD-1抗体可显著抑制肿瘤生长。然而，与单独治疗相比，Y-27632和抗-PD-1抗体的组合没有明显的协同效应(图7A和图7B)，这表明Y-27632和抗-PD-1治疗可能具有类似的机制。与体外数据一致，IHC分析显示，注射Y-27632可降低PD-L1蛋白水平(图8)。通过IHC染色分析肿瘤浸润淋巴细胞，发现Y-27632或抗PD-1抗体或联合治疗的肿瘤有明显的CD4+和CD8+T细胞浸润(图7C和图7D)。发明人还发现，Y-27632和/或抗PD-1抗体治疗后，CD4和CD8的mRNA水平显著增加。此外，Y-27632治疗与抗PD-1抗体治疗无显著性差异(图7E)，这些数据表明抑制ROCK-MSN通路通过增强肿瘤浸润淋巴细胞抑制肿瘤进展。
6、ROCK抑制剂Y-27632激活免疫应答基因。
为了进一步探讨ROCK抑制肿瘤的机制，发明人对每个治疗肿瘤进行转录组分析，并分析了转录调控网络。文氏图显示了Y-27632和/或抗-PD-1抗体治疗肿瘤的差异表达基因(图9A)。通过对Y-27632经Go分析后的差异基因进行分析，发明人发现Y-27632能显著诱导免疫应答和正向调节T细胞途径(图9B)。聚类分析显示，经过Y-27632治疗的肿瘤高度表达免疫应答基因(图9C)。其中代表性基因为正向调节T细胞增殖的基因。为了进一步研究MSN与免疫应答的关系，发明人分析了肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库(17)中MSN和GZMB的表达。GZMB是T细胞和NK细胞毒性活性的重要生物标志物。基因相关分析显示MSN和GZMB与皮尔逊相关系数呈正相关(图9D)。综上所述，本文的研究结果表明，ROCK抑制剂Y-27632通过增强T细胞活性，显著抑制了乳腺肿瘤的生长，然而，两种疗法的结合没有额外的益处。
三、思考与讨论
PD-L1的表达与肿瘤免疫微环境密切相关，特别是CD8+T细胞的浸润。尽管基于pd(l-1)的免疫治疗取得了很好的效果，但仍有大量患者对该治疗没有反应。因此，了解PDL-1的调节对于免疫治疗和化疗的联合治疗至关重要。利用蛋白质组学方法，发明人鉴定出MSN是乳腺癌中PD-L1最丰富的相互作用蛋白之一。此外，发明人还提供了证据表明PD-L1表达受ROCK-MSN通路调节。通过下调PD-L1，给予ROCK激酶抑制剂抑制肿瘤进展，并在肿瘤微环境中引发免疫反应。这些结果突出了使用ROCK抑制剂治疗乳腺癌的潜力。
之前研究报道膜相关蛋白cmtm6和cmtm4通过阻止PD-L1溶酶体介导的降解来稳定细胞膜PD-L1水平。全基因组筛选发现PD-L1基因的3′区常被结构变异(SVS)破坏，导致肿瘤生长和免疫逃避。肿瘤细胞中低PD-L1表达和肿瘤内高CD8+T细胞含量与患者生存时间呈正相关。更重要的是，PD-L1/PD1通路阻断抑制肿瘤进展和转移。发明人的研究发现，MSN与SPOP竞争以避免E3泛素介导的PD-L1降解。这种机制如何与CMTM-4和-6相互作用还不得而知。CMTM-4和-6以及MSN可能共享类似的分子机制来调节PD-L1的表达。然而，由MSN介导的PD-L1水平的调节需要磷酸化修饰，使得磷酸化MSN比CMTM-4和-6更适合作为治疗靶点。
抗PD1或基于PD-L1的免疫疗法疗效的临床数据提示癌症和T细胞浸润的重要性。T细胞分泌IFNγ，刺激邻近癌细胞PD-L1的表达，另一方面抑制T细胞上的PD1配体，导致T细胞无反应和凋亡。通过CMTM-4和-6下调PD-L1表达降低PD-L1/PD1信号传导，导致T细胞活化，具有分泌IL-2增多、杀伤活性高的特点。发明人的数据显示，通过y-27632沉默MSN或抑制MSN磷酸化增强了与MDA-MB-231细胞共培养的Jurkat T细胞的IL-2分泌，表明通过PD-L1-PD1信号途径通过沉默MSN调节T细胞活性。发明人还观察到在乳腺癌小鼠中给予Y-27632可增加肿瘤中CD4+CD8+T细胞的浸润，这表明T细胞浸润有助于抑制肿瘤生长。
作为细胞骨架相关蛋白，MSN与其他erm蛋白成员ezrin和radixin一起调节细胞皮质、膜泡和受体复合物。此外，发明人的数据表明，磷酸化MSN是稳定PD-L1所必需的。发明人报道用ROCK抑制剂y-27632治疗可显著抑制PD-L1的表达，对EMT6移植小鼠乳腺癌生长抑制情况，与抗PD1抗体治疗相当。在发明人的研究中，仅使用Y-27632对rock-MSN通路的抑制作用与抗pd1治疗相比表现出相似的活性，导致T细胞活化和肿瘤生长衰退。然而，由于Y-27632与抗-PD1抗体的作用机制相似，联合治疗因而并没有显示出更多的疗效。Y-27632必须激活免疫应答以达到抗肿瘤的效果。发明人的研究结果表明Y-27632可用于免疫治疗的进一步临床研究。此外，在免疫治疗中使用药物Y-27632似乎比抗PD1抗体更经济。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津医科大学肿瘤医院
<120> ROCK抑制剂在肿瘤免疫治疗中的新用法
<130> PIDC3191618
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> si-1
<400> 1
gcuaaauuga aaccuggaau u 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> si-2
<400> 2
ggaggaugcu guccuggaau a 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> hROCK si-1
<400> 3
gcaccaguug uacccgauuu a 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> hROCK si-2
<400> 4
cgaucgucuc uaggaugaua u 21

Claims (9)

1.ROCK激酶抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述ROCK激酶抑制剂为Y-27632或其药学上可接受的盐；
任选地，所述抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫是通过降低MSN蛋白磷酸化水平实现的；
任选地，所述肿瘤为乳腺癌。
3.ROCK激酶抑制剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于增强T细胞的活性或降低PD-L1蛋白的表达水平；
任选地，所述增强T细胞的活性或降低PD-L1蛋白的表达水平是通过降低MSN蛋白磷酸化水平实现的；
任选地，所述ROCK激酶抑制剂为Y-27632或其药学上可接受的盐。
4.一种药物组合物，其特征在于，包括：降低MSN蛋白表达水平和/或降低MSN蛋白磷酸化水平的试剂，所述药物组合物用于抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫；
任选地，所述抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫是通过增强T细胞的活性实现的；
任选地，所述增强T细胞的活性是通过降低PD-L1蛋白的表达水平实现的；
任选地，所述降低MSN蛋白表达水平的试剂为siRNA，所述siRNA具有SEQ ID NO：1～2所示的核苷酸序列；
任选地，所述降低MSN蛋白磷酸化水平的试剂为ROCK功能抑制剂；
任选地，所述ROCK功能抑制剂为ROCK激酶抑制剂或siRNA，所述siRNA具有SEQ ID NO：3～4所示的核苷酸序列；
任选地，所述ROCK激酶抑制剂为Y-27632或其药学上可接受的盐；
任选地，所述肿瘤为乳腺癌。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括试剂，所述试剂用于调节MSN蛋白表达水平和/或调节MSN蛋白磷酸化水平，所述试剂盒用于调节PD-L1蛋白的表达水平和/或调节T细胞的活性；
任选地，所述试剂用于升高MSN蛋白表达水平和/或升高MSN蛋白磷酸化水平，所述试剂盒用于升高PD-L1蛋白的表达水平和/或抑制T细胞的活性；
任选地，所述试剂用于降低MSN蛋白表达水平和/或降低MSN蛋白磷酸化水平，所述试剂盒用于降低PD-L1蛋白的表达水平和/或增强T细胞的活性；
任选地，所述降低MSN蛋白表达水平的试剂为siRNA，所述siRNA具有SEQ ID NO：1～2所示的核苷酸序列；
任选地，所述降低MSN蛋白磷酸化水平的试剂为ROCK功能抑制剂；
任选地，所述ROCK功能抑制剂为ROCK激酶抑制剂或siRNA，所述siRNA具有SEQ ID NO：3～4所示的核苷酸序列；
任选地，所述ROCK激酶抑制剂为Y-27632或其药学上可接受的盐。
6.试剂在制备药物中的用途，所述试剂用于降低MSN蛋白表达水平和/或降低MSN蛋白磷酸化水平，所述药物用于抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫；
任选地，所述抑制肿瘤免疫逃逸或增强肿瘤免疫是通过增强T细胞的活性实现的；
任选地，所述增强T细胞的活性是通过降低PD-L1蛋白的表达水平实现的；
任选地，所述降低MSN蛋白表达水平的试剂为siRNA，所述siRNA具有SEQ ID NO：1～2所示的核苷酸序列；
任选地，所述降低MSN蛋白磷酸化水平的试剂为ROCK功能抑制剂；
任选地，所述ROCK功能抑制剂为ROCK激酶抑制剂或siRNA，所述siRNA具有SEQ ID NO：3～4所示的核苷酸序列；
任选地，所述ROCK激酶抑制剂为Y-27632或其药学上可接受的盐；
任选地，所述肿瘤为乳腺癌。
7.试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂用于调节MSN蛋白表达水平和/或调节MSN蛋白磷酸化水平，所述试剂盒用于调节PD-L1蛋白的表达水平和/或调节T细胞的活性；
任选地，所述试剂用于升高MSN蛋白表达水平和/或升高MSN蛋白磷酸化水平，所述试剂盒用于升高PD-L1蛋白的表达水平和/或抑制T细胞的活性；
任选地，所述试剂用于降低MSN蛋白表达水平和/或降低MSN蛋白磷酸化水平，所述试剂盒用于降低PD-L1蛋白的表达水平和/或增强T细胞的活性；
任选地，所述降低MSN蛋白表达水平的试剂为siRNA，所述siRNA具有SEQ ID NO：1～2所示的核苷酸序列；
任选地，所述降低MSN蛋白磷酸化水平的试剂为ROCK功能抑制剂；
任选地，所述ROCK功能抑制剂为ROCK激酶抑制剂或siRNA，所述siRNA具有SEQ ID NO：3～4所示的核苷酸序列；
任选地，所述ROCK激酶抑制剂为Y-27632或其药学上可接受的盐。
8.一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗或预防乳腺癌，其特征在于，包括：
给予乳腺癌动物模型候选药物；
比较给药前后，所述乳腺癌动物模型的乳腺癌细胞中MSN蛋白的表达水平和/或MSN蛋白的磷酸化水平，以及乳腺癌细胞中PD-L1蛋白的表达水平或T细胞的活性，判断所述候选药物是否为目标药物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，给药后相比于给药前，所述乳腺癌动物模型的乳腺癌细胞中所述MSN蛋白的表达水平和/或所述MSN蛋白的磷酸化水平降低，且乳腺癌细胞中PD-L1蛋白的表达水平降低或T细胞活性增强，是所述候选药物为目标药物的指示。
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