CN103214557A - 一种Ezrin抗原决定簇多肽及其磷酸化Thr566抗体制备方法和采用该抗体制备的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种Ezrin抗原决定簇多肽及其磷酸化Thr566抗体制备方法和采用该抗体制备的试剂盒。包括以下氨基酸序列：CGRDKYKTLRQIRQ；CGRDKYKT-PLRQIRQ。本发明利用磷酸化修饰Ezrin的抗原决定簇多肽，得到的多克隆抗体可达到识别Ezrin第566位点苏氨酸磷酸化，使用酶联免疫法可以快速方便检测Ezrin蛋白磷酸化水平，相比常规方法更节约时间与样品，具有十分广阔的科研价值和经济前景。

Description

一种Ezrin抗原决定簇多肽及其磷酸化Thr566抗体制备方法和采用该抗体制备的试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种Ezrin抗原决定簇多肽及其磷酸化Thr566抗体制备方法和采用该抗体制备的试剂盒。

背景技术

Ezrin自1983年被Bretsher首先在鸡的小肠上皮细胞刷状缘中分离纯化出来。早期Ezfin的发现并未受到重视，但随着研究的深入。发现其在稳定细胞形态、辅助细胞运动、黏附、细胞信号传导和细胞凋亡等多项活动中发挥着重要的作用。目前许多研究均表明Ezfin与多种肿瘤的发生、发展，尤其与侵袭、转移及预后相关。Ezrin表达具有相对的组织和细胞特异性.在成人组织中分布于脑、肾、肠、肺、周围神经和施万细胞等，亚细胞定位于胞质膜、顶端的微绒毛、肌动蛋白包含的表面物质、细胞间的黏结点161。生理水平下，Ezrin在细胞中存在静止状态和激活状态两种，细胞内Ezrin多以静止的单体形式存在，分子内N端与C端直接进行自身分子内交联，形成头尾连接的折叠状态.产生一个闭合静止的构象，相互作用的N端与C端区域称为自身结合结构域，从而使Ezrin成为静止状态。目前认为主要是通过磷酸化与去磷酸化实现Ezrin的活化与静止的调节。活化的途径有两种：C端的苏氨酸磷酸化和N端与磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)的结合。细胞内蛋白激酶(PTK和PSTK)和小G蛋白Rho等能使c端的苏氨酸566(Thr566)磷酸化，减弱C-N作用，打开Ezrin的空间构象，暴露出C端的肌动蛋白一细胞骨架结合位点，通过此结合位点的桥接作用.Ezrin将肌动蛋白丝与细胞膜相连。而N端则直接与PIP2连接而活化Ezrin，活化后的Ezrin可促进FERM区与黏附分子的连接，进而发挥功能。Fievet等研究发现Ezrin的N端与PIP2的连接可诱导Ezrin构象的改变，并将Ezrin锚定于细胞膜上，促使nlr567发生磷酸化。而去磷酸化则被认为可能是Ezrin失活的机制。

Ezrin是连接细胞膜和细胞骨架的桥接蛋白，主要出现在细胞的表面结构。通过不同的膜表面分子信号传导及跨膜信号传导途径，发挥不同的功能，参与细胞的生存、黏附、增殖、迁移等的过程。1.Ezrin与细胞形态的调节活化后的Ezrin优先分布于细胞的表面突出，如微绒毛、丝状伪足、微小突起、局部的黏附物和膜皱褶，以维持正常的细胞形态以及细胞的极性。2.Ezrin与细胞间、细胞一基质间的黏着和细胞的运动Ezrin可与CD44、E-cadhefin、ICAM-1、ICAM-2等多种黏附分子共表达，通过调节肌动蛋白的组装和收缩，调节细胞与细胞之间、细胞与基质之间的黏附和运动。3.Ezrin与细胞信号传导、细胞周期的调控磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)/蛋白质丝、苏氨酸激酶(Akt)通路的信号传导能诱导细胞凋亡，而激活此通道的前提是Ezrin353位的酪氨酸磷酸化被苯丙氨酸代替。Ezrin的活化能稳定活化的AKT在细胞膜上的位置，增强其活性，活化的AKT能保护细胞减少坏死。Fas死亡受体途径是主要的细胞凋亡信号传导途径，Fas介导的凋亡并不总是依赖Fas在细胞表面的表达，而是通过Fas与Ezfin直接相连，连接细胞膜与细胞骨架，作为一个整体介导细胞的凋亡。另外.Ezrin在细胞因子作用下参与调控细胞的增殖，Kishore等研究发现TNF可诱导Rho激酶介导的Ezrin磷酸化。Ezrin在细胞中发挥着多种生物学功能，而其表达与恶性肿瘤的关系也密切，但目前的研究仍在某些方面存在争议.有必要改进实验手段及检测方法，并明确统一的定量标准.以便更好地分析Ezfin的表达与恶性肿瘤的关系。Ezfin如何在恶性肿瘤中发挥作用的机制仍未明确。随着研究的深入，Ezrin有望能成为治疗癌症的又一靶点。Ezrin蛋白在肿瘤细胞转移过程中发挥重要作用，Ezrin蛋白高表达与肿瘤恶性程度、转移能力密切相关。

发明内容

本发明提供一种Ezrin抗原决定簇多肽及其磷酸化Thr566抗体制备方法和采用该抗体制备的试剂盒。

10    20    30    40    50    60

MPKPINVRVT TMDAELEFAI QPNTTGKQLF DQVVKTIGLR

EVWYFGLHYV DNKGFPTWLK

70    80    90    100    110    120

LDKKVSAQEV RKENPLQFKF RAKFYPEDVA EELIQDITQK

LFFLQVKEGI LSDEIYCPPE

130    140    150    160    170    180

TAVLLGSYAV QAKFGDYNKE VHKSGYLS SE RLIPQRVMDQ

HKLTRDQWED RIQVWHAEHR

190    200    210    220    230    240

GMLKDNAMLE YLKIAQDLEM YGINYFEIKN KKGTDLWLGV

DALGLNIYEK DDKLTPKIGF

250    260    270    280    290    300

PWSEIRNISF NDKKFVIKPI DKKAPDFVFY APRLRINKRI

LQLCMGNHEL YMRRRKPDTI

310    320    330    340    350    360

EVQQMKAQAR EEKHQKQLER QQLETEKKRR ETVEREKEQM

MREKEELMLR LQDYEEKTKK

370    380    390    400    410    420

AERELSEQIQ RALQLEEERK RAQEEAERLE ADRMAALRAK

EELERQAVDQ IKSQEQLAAE

430    440    450    460    470    480

LAEYTAKIAL LEEARRRKED EVEEWQHRAK EAQDDLVKTK

EELHLVMTAP PPPPPPVYEP

490    500    510    520    530    540

VSYHVQESLQ DEGAEPTGYS AELSSEGIRD DRNEEKRITE

AEKNERVQRQ LLTLSSELSQ

550    560    570    580

ARDENKRTHN DIIHNENMRQ GRDKYKTLRQ IRQGNTKQRI

DEFEAL

本发明还提供了一种Ezrin磷酸化Thr566的抗体制备方法，包括以下步骤：

步骤一、制备抗原，选择Ezrin的抗原决定簇多肽，在所述多肽的N端添加半胱氨酸，苏氨酸添加磷酸化基团并纯化，将纯化后的多肽与血蓝蛋白通过Sulfo-SMCC偶联形成全抗原；

步骤二、将所述全抗原按常规制备多克隆抗体的方法制备抗血清；

步骤三、将所述抗血清分离纯化，即得。

所述步骤一中，按重量比计算，多肽∶血蓝蛋白∶Sulfo-SMCC为4∶4∶1，血蓝蛋白的浓度为8mg/ml。

所述步骤三中，采用多肽偶联Sulfolink Gel层析柱亲和层析法进行双次层析柱分离纯化，首次使用磷酸化多肽制备的亲和层析住分离出磷酸化抗体与非磷酸化抗体的混合液，第二次使用非磷酸化多肽制备的层析柱分离出磷酸化抗体与非磷酸化抗体，其中多肽与偶联树脂的重量比为1∶1，偶联成功的胶与封闭液的体积比为1∶1，所述封闭液为50mM半胱氨酸。

另外，本发明还提供一种Ezrin磷酸化Thr566基于细胞的快速试剂盒，各组分配方、用量、反应时间：

清洗液：PBS200ul/孔，配方：NaCl8g，KCL0.2g，KH₂PO₄0.2g，NA₂PO₄·12H₂O2.85g，ddH₂O1L，pH＝7.4，反应时间：室温5分钟，3次；

淬火液：H₂O₂100ul/孔，配方：1mL30％H₂O₂加入29mL PBS，反应时间：室温20-25分钟；

偶联液：多聚L-赖氨酸100ul/孔，配方：10ug/mL PBS，反应时间：室温1-2小时；

固定液：多聚甲醛100ul/孔，配方：质量分数为4％甲醛PBS重量体积比，适用贴壁细胞；质量分数为8％甲醛重PBS量体积比，适用悬浮细胞，反应时间：室温10-30分钟；

封闭液：质量分数为2％BSA，0.1％叠氮纳100ul/孔，配方：2％BSAPBS重量体积比，0.1％叠氮纳PBS重量体积比，反应时间：室温1-2小时；

抗体稀释液：1％BSA，0.5％Triton X-100，0.05％叠氮纳溶于PBS重量体积比中；

清洗液：154mM氯化钠，5.5mM磷酸氢二钠，1.2mM磷酸二氢钾，0.5％Tween20；

磷酸盐缓冲液：11.9mM磷酸二氢钠，137mM氯化钠，and2.7mM氯化钾溶于双蒸水。

本发明的有益效果为：快速方便检测Ezrin蛋白磷酸化水平，相比常规方法更节约时间与样品，具有十分广阔的科研价值和经济前景。

附图说明

图1是磷酸化抗体可以特异性识别细胞中的磷酸化蛋白

图2是本发明试剂盒可快速检测到细胞内Ezrin Ser566位点磷酸化水平有显著增高

具体实施方式

实施例1

经过Colostate大学和Expasy提供的在线工具做同源性分析，选择亲水性和抗原性数值良好(亲水性数值高于或接近1，抗原性数值低于或接近-1)的序列作为抗原决定簇。通过选择得到EzrinThr566位点附近的抗原决定簇：GRDKYKTLRQIRQ。根据实验过程的需要，在苏氨酸上添加一个磷酸化基团得到磷酸化多肽，与不添加磷酸化基团的多肽组成一对生产抗体所用抗原多肽，每种多肽的N端添加一个半胱氨酸。

将上述人工合成的磷酸化多肽的N端与血蓝蛋白(KLH)偶联，使用分批多次加强免疫动物方法，采集血清后使用多肽特异性亲和层析，得到多克隆抗体，具体操作步骤如下：

步骤一，通过化学合成的多肽与KLH(血蓝蛋白)偶联形成全抗原。

1.1按照8mg/mL的浓度把KLH溶解，KLH∶Sulfo-SMCC重量比4∶1加入Sulfo-SMCC在25°缓慢搅拌60分钟；

1.2KLH-Sulfo-SMCC溶液用脱盐柱去除游离的Sulfo-SMCC。脱盐柱用3个柱体积的交联缓冲液平衡，然后上样，若体积较大，可分几次上样。待KLH-SMCC溶液进入胶床后，用交联缓冲液洗脱。通过测定280nm的光吸收值收集KLH-SMCC所在的蛋白峰液并收集此峰液。

1.3将抗原∶KLH-SMCC＝1∶1(重量比)反应两小时后封闭，透析。以1mg每兔的比例加入弗氏佐剂乳化。

步骤二，将所述全抗原按常规制备多克隆抗体的方法制备抗血清：

2.1取兔进行免疫，基础免疫皮下注射8-10个部位，每个部位0.1-0.2ml抗原。并按计划安排进行加强免疫。

本实施例采用多次加强免疫，提高免疫效果，加强免疫时间为基础免疫后第21天加强第一次，第一次加强免疫应在兔子背部右侧剪毛进行，加强免疫除背部皮下免疫5个点外，增加注射两个肌肉位点，每个部位注射0.2-0.3ml抗原。再间隔21天加强第二次，再间隔21天加强第三次，再间隔21天加强第四次，再间隔35天静脉加强第五次。

2.2血清采集

(1)阳性血清的采集一般进行九次，

阳性血清编号  采集时间

C 第三次加强免疫后7天左右

DI 第四次加强免疫后7天左右

DII DI血采后14天

EI 第五次加强免疫后7天左右

EII EI血采后14天

FI 第六次加强免疫后7天左右

FII FI血采后14天

GI 第六次加强免疫后7天左右，若为静脉免疫，则为免疫后第四天

GII GI血采后14天

2.3收集的血液做好批号标记，室温放置一小时，3000rpm离心15min。转移上层血清于另一只干净的离心管中，再3000rpm离心15min，转移上层血清于另一只干净的离心管中，贴好标签。待纯化血清加2％叠氮钠至终浓度0.02％，4℃冰箱保存。

步骤三，分离纯化抗血清

3.1取出待处理的各批次血清，混合。控制每次反应体积为40ml左右，按血清量，加入1/10体积的1mol/L Tris·HCl PH7.5缓冲液调pH值，1/100体积0.2M正钒酸钠、0.1mol/L氟化钠溶液，在室温下混匀静置20分钟。将调过pH值血清样品用除菌0.45um膜过滤。

3.2取出2mL Sulfolink Gel悬浮液放入层析空柱中，用20mL交联缓冲液冲洗，加入2mg磷酸化多肽后置于4℃冰箱中混合过夜。第二天取出后加入2mL50mM半胱氨酸溶液封闭，分别用20mL PBS，20mL1M N_aCl，20mL PBS，20mL100mM Gly-HCl，20Ml PBS溶液清洗。

3.3从柱中取出磷酸化多肽偶联的Sulfolink Gel2ml，与处理后的血清样品混合，将混合样品在静音旋转仪上旋转混匀，在4℃条件下混匀反应过夜或在室温下混匀反应2小时。

3.4空层析柱直立放置于层析架上，加入10mlPBS用洗耳球吸吹以除去层析柱底片及底片下面的空气。将血清-Sulfolink Gel混合溶液分步装入层析柱，Sulfolink Gel沉积形成胶床(防止胶床流干)，用PBS5-7ml清洗层析柱(洗出胶内含血清)。收集流出液于一个干净瓶子中。

3.5用20ml10mM PBS pH7.4清洗层析柱，在液面距离胶面还有1-2cm时塞上层析柱的底盖，把胶上面disc胶片装上，再用10ml PBSpH7.4清洗层析柱，最后用10mM PBS pH7.4含0.05％Tween20溶液20ml清洗层析柱。

3.6每个样品准备2个含100ul1M Tris·HCl PH7.5的1.5ml收集管及一个30m的瓶子，做好标记。先用100mM甘氨酸(glycine)缓冲液PH3.01ml洗层析柱，不收集洗脱液，再用100mM甘氨酸(glycine)缓冲液PH3.01ml洗层析柱两次，每次流出液收集于1个1.5ml离心管中，混匀使其PH恢复中性。最后收集至无蛋白(OD₂₈₀＜0.1)为止。此步骤得到Ezrin的磷酸化与非磷酸化抗体混合液。

3.7层析过的血清流出液，可按3.3-3.6步骤重复吸收，直到抗体吸收完全为止。

3.8取出2mL Sulfolink Gel悬浮液放入层析空柱中，用20mL交联缓冲液冲洗，加入2mg非磷酸化多肽后置于4℃冰箱中混合过夜。第二天取出后加入2mL50mM半胱氨酸溶液封闭，分别用20mL PBS，20mL1M N_aCl，20mL PBS，20mL100mM Gly-HCl，20Ml PBS溶液清洗。

3.9从柱中取出非磷酸化多肽偶联的Sulfolink Gel2ml，与Ezrin的磷酸化与非磷酸化抗体混合液混合，将混合样品在静音旋转仪上旋转混匀，在4℃条件下混匀反应过夜或在室温下混匀反应2小时。

3.10空层析柱直立放置于层析架上，加入10mlPBS用洗耳球吸吹以除去层析柱底片及底片下面的空气。将Ezrin抗体混合液-SulfolinkGel混合溶液分步装入层析柱，Sulfolink Gel沉积形成胶床，收集流出液为磷酸化抗体。

3.11用10mM PBS pH7.4清洗层析柱。先加入2ml，收集入抗磷酸化位点抗体中，再用1ml10mM PBS pH7.4清洗层析柱，流出液接入比色杯，在280nm下测光吸收，大于0.1的并入抗磷酸化位点抗体中，重复清洗，收集流出液至无蛋白为止。

3.12用20ml10mM PBS pH7.4清洗层析柱，在液面距离胶面还有1-2cm时塞上层析柱的底盖，把胶上面disc胶片装上，再用10ml PBSpH7.4清洗层析柱。

3.13准备2个含100ul1M Tris·HCl PH7.5的1.5ml收集管，用100mM甘氨酸(glycine)缓冲液PH3.01ml洗层析柱，不收集洗脱液，再用100mM甘氨酸(glycine)缓冲液PH3.01ml洗层析柱两次，每次流出液收集于1个收集管中，混匀使其PH恢复中性，最后收集至无蛋白(OD₂₈₀＜0.1)为止。此为收集的非磷酸化Ezrin抗体。

3.14层析过的样品，可按步骤3.10-3.13重复收集。

3.15使用多肽包被的酶联免疫法检测Ezrin Thr566磷酸化抗体与非磷酸化抗体ELISA效价，多肽吸收法法进行免疫印迹，检测EzrinThr566磷酸化抗体与非磷酸化抗体(见图1)。

步骤四，实验确定试剂盒中各组分的用量，稀释比，pH值，反应时间温度等。

各组分配方、用量、反应时间：

清洗液：PBS200ul/孔，配方：NaCl8g，KCL0.2g，KH₂PO₄0.2g，NA₂PO₄·12H₂O2.85g，ddH₂O1L，pH＝7.4，反应时间：室温5分钟，3次；

淬火液：H₂O₂100ul/孔，配方：1mL30％H₂O₂加入29mL PBS，反应时间：室温20-25分钟；

偶联液：多聚L-赖氨酸100ul/孔，配方：10ug/mL PBS，反应时间：室温1-2小时；

固定液：多聚甲醛100ul/孔，配方：质量分数为4％甲醛PBS重量体积比，适用贴壁细胞；质量分数为8％甲醛重PBS量体积比，适用悬浮细胞，反应时间：室温10-30分钟；

封闭液：质量分数为2％BSA，0.1％叠氮纳100ul/孔，配方：2％BSAPBS重量体积比，0.1％叠氮纳PBS重量体积比，反应时间：室温1-2小时；

抗体稀释液：1％BSA，0.5％Triton X-100，0.05％叠氮纳溶于PBS重量体积比中；

清洗液：154mM氯化钠，5.5mM磷酸氢二钠，1.2mM磷酸二氢钾，0.5％Tween20；

磷酸盐缓冲液：11.9mM磷酸二氢钠，137mM氯化钠，and2.7mM氯化钾溶于双蒸水。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式之一，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种Ezrin抗原决定簇多肽，其特征在于包括以下的氨基酸序列：

CGRDKYKTLRQIRQ；

CGRDKYKT-^PLRQIRQ；

所述-P为氨基酸T添加磷酸化基团。

2.根据权利要求1所述的Ezrin抗原决定簇多肽，其特征在于所述抗原决定簇内不含有半胱氨酸的多肽的N端均添加半胱氨酸。

3.根据权利要求1所述的Ezrin抗原决定簇多肽，其特征在于所述抗原决定簇内苏氨酸添加磷酸化基团修饰。

4.一种Ezrin磷酸化Thr566的抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、制备抗原，选择Ezrin的抗原决定簇多肽，在所述多肽的N端添加半胱氨酸，苏氨酸添加磷酸化基团并纯化，将纯化后的多肽与血蓝蛋白通过Sulfo-SMCC偶联形成全抗原；

步骤二、将所述全抗原按常规制备多克隆抗体的方法制备抗血清；

步骤三、将所述抗血清分离纯化，即得。

5.根据权利要求4所述Ezrin磷酸化Thr566抗体制备方法，其特征是：所述步骤一中，按重量比计算，多肽∶血蓝蛋白∶Sulfo-SMCC为4∶4∶1，血蓝蛋白的浓度为8mg/ml。

6.根据权利要求4和权利要求5所述Ezrin磷酸化Thr566抗体制备方法，其特征是：所述步骤三中，采用多肽偶联Sulfolink Gel层析柱亲和层析法进行双次层析柱分离纯化，首次使用磷酸化多肽制备的亲和层析住分离出磷酸化抗体与非磷酸化抗体的混合液，第二次使用非磷酸化多肽制备的层析柱分离出磷酸化抗体与非磷酸化抗体，其中多肽与偶联树脂的重量比为1∶1，偶联成功的胶与封闭液的体积比为1∶1，所述封闭液为50mM半胱氨酸。

7.一种Ezrin磷酸化Thr566基于细胞的快速试剂盒，其特征是：各组分配方、用量、反应时间：

清洗液：PBS200ul/孔，配方：NaCl8g，KCL0.2g，KH₂PO₄O.2g，NA₂PO₄·12H₂O2.85g，ddH₂O1L，pH＝7.4，反应时间：室温5分钟，3次；

淬火液：H₂O₂100ul/孔，配方：1mL30％H₂O₂加入29mL PBS，反应时间：室温20-25分钟；

固定液：多聚L-赖氨酸100ul/孔，配方：10ug/mL PBS，反应时间：室温1-2小时；

穿膜液：多聚甲醛100ul/孔，配方：质量分数为4％甲醛PBS重量体积比，适用贴壁细胞；质量分数为8％甲醛重PBS量体积比，适用悬浮细胞，反应时间：室温10-30分钟；

封闭液：质量分数为2％BSA，0.1％叠氮纳100ul/孔，配方：2％BSAPBS重量体积比，0.1％叠氮纳PBS重量体积比，反应时间：室温1-2小时；

抗体稀释液：1％BSA，0.5％Triton X-100，0.05％叠氮纳溶于PBS重量体积比中；

清洗液：154mM氯化钠，5.5mM磷酸氢二钠，1.2mM磷酸二氢钾，0.5％Tween20；

磷酸盐缓冲液：11.9mM磷酸二氢钠，137mM氯化钠，and2.7mM氯化钾溶于双蒸水。

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