CN103966173B - 一种杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体和应用 - Google Patents
一种杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体和应用。本发明所述单克隆抗体杂交瘤细胞保藏编号为CGMCC NO.9153。本发明以经过优化的PDI家族成员蛋白为抗原蛋白，制备了单克隆抗体杂交瘤细胞及其分泌产生的单克隆抗体，该杂交瘤细胞能够稳定产生抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体具有双向抑制性功能，其既可抑制血栓形成，也可抑制凝血反应，可应用于治疗血栓性疾病和凝血性疾病的药物制备中。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体和应用。
背景技术
血栓是指血液成分在血液流动过程中，在血管或心脏内膜表面形成的一种半凝块状物质。血栓由不溶性纤维蛋白、沉积的血小板、积聚的白细胞和陷入的红细胞组成。血栓形成是一种涉及许多彼此相互作用的遗传和环境因素的多因素变化的过程。在临床上常见到血栓性疾病，如冠脉综合征、深静脉血栓等。血栓性疾病属于心脑血管疾病，全球每年因心脑血管疾病死亡人数达1200万，相当于世界总死亡人数的1/4，已成为人类生命的头号杀手。
弥散性血管内凝血(DIC)又称消耗性凝血病、去纤维蛋白综合征。DIC是一种影响中枢神经系统最为常见和严重的凝血疾病。常见病因有严重感染、创伤、产科和血管病急症、癌症、非细菌性血栓性心脑膜炎、蛛网膜下腔出血、脑肿瘤、脑血管畸形，心、肝、肾功能衰竭和免疫性疾病等。在各种致病因素的作用下，血循环内出现局限的或弥漫性的凝血促动，凝血瀑布被激活，产生过量的凝血酶。凝血系统进一步被激活，使血液凝固性增高，破坏了体内凝血和抗凝过程的平衡，易引起脑组织缺血、缺氧和缺血性梗死。
针对血栓和DIC两种疾病，国内外已经研究和开发了很多药物。主要包括两大类药物，如抗凝血药物肝素、华法林、Fondaparinux、水蛭素等，以及抗血小板药物磷酸二酯酶抑制剂、阿西匹林、ADP受体抑制剂、GPIIb/IIIa受体抑制剂等。以上药物的缺陷在于它们的作用只限于单一靶点。而蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)家族成员可以调控不同底物蛋白的二硫键状态，能作用于多个靶点。但是，目前鲜有针对蛋白质二硫键异构酶(PDI)家族成员用于预防和治疗血栓性疾病和弥散性血管内凝血的研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供抗一种杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体，使所产生的单克隆抗体具有防治血栓形成和抑制凝血酶的作用，可以应用于治疗血栓性疾病和如弥散性血管内凝血这种凝血性疾病的药物制备中。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC NO.9153。
本发明所述单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备获得：
SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白免疫BALB/C小鼠，3天后取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞按照5∶1～10∶1的比例混合，利用PEG进行细胞融合，融合后进行HAT培养，然后吸取杂交瘤细胞培养上清液进行ELISA检测，筛选出阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆至能稳定分泌抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白单克隆抗体，获得所述单克隆抗体杂交瘤细胞。
其中，所述SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白免疫BALB/C小鼠具体为：
取SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白100μg加等质量福氏完全佐剂对BALB/C小鼠进行第一次皮下注射，21天后取SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白300μg加等质量福氏不完全佐剂对BALB/C小鼠进行第二次皮下注射，10天后尾部采血并用ELISA间接法测定抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白的鼠血清效价，选择效价高的BALB/C小鼠用SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白100μg进行免疫。
本发明所用抗原蛋白选自蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)家族，通过优化编码基因表达所述抗原蛋白，以其实现所述杂交瘤细胞产生的单克隆抗体具有双向抑制性功能，其既可抑制血栓形成，也可抑制凝血反应。所述抗原蛋白可由试剂公司进行全合成，或参照SEQ ID NO:2所示核苷酸序列进行常规表达获得。
经过上述方法制备后，最终筛选出能够稳定分泌抗SEQ ID NO:1 所示氨基酸序列蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为DuIn，并于2014年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.9153。
此外，本发明还提供一种抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白单克隆抗体(以下简称DuIn抗体)，由保藏编号为CGMCC NO.9153的杂交瘤细胞分泌产生。
制备DuIn抗体可采用本技术领域常规方法，如用杂交瘤细胞株诱导小鼠腹水，本发明优选为：
步骤1、用不完全佐剂免疫BALB/C小鼠1～2周后，分别往小鼠腹腔注射1×106个保藏编号为CGMCC NO.9153的杂交瘤细胞，接种所述杂交瘤细胞7～10天后产生腹水；
步骤2、从所述BALB/C小鼠腹腔抽取腹水，置于15ml离心管中，2000rpm离心10min，以沉淀血细胞及其它杂质，将上清转移入新的离心管中，放入-80℃冰箱保存，纯化前，使用0.1M的PBS溶液按1:3的比例稀释腹水；
取0.5ml Protein G装入吸附柱中，加入20倍柱体积的0.1M的PBS缓冲液平衡柱子，以备上样；
取稀释的腹水，加入纯化柱中，每次2-3ml，腹水循环过柱3遍；
步骤3、待腹水循环过柱3遍后，加上30倍柱体积的0.1M的PBS缓冲液充分洗涤柱子，洗掉杂蛋白；
洗涤完毕后，加0.1M、pH值为2.8的Gly洗脱液洗脱结合的抗体，预先在收集管中加入25ul1M、pH值8.9的Tris-Hcl，每管收集500ul的洗脱液，连续收集10管；
使用显色液测定每管收集液是否含有蛋白质，取蛋白含量最多的收集液进行透析，透析后获得DuIn抗体。
本发明制备的DuIn抗体具有双向抑制性功能，其既可抑制血栓形成，也可抑制凝血反应。如抑制血小板聚集、抑制血小板表面整合素αIIbβ3的活化、抑制血小板表面p-selectin的表达、明显抑制血栓形成、 明显抑制体内血小板积聚和纤维蛋白形成、体外明显抑制凝血酶生成。
基于此，本发明提供所述单克隆抗体在制备治疗血栓性疾病或凝血性疾病药物中的应用。
其中作为优选，所述血栓性疾病为冠脉综合征或深静脉血栓；所述凝血性疾病为弥散性血管内凝血病。
由以上技术方案可知，本发明以经过优化的PDI家族成员蛋白为抗原蛋白，制备了单克隆抗体杂交瘤细胞及其分泌产生的单克隆抗体，该杂交瘤细胞能够稳定产生DuIn抗体，该单克隆抗体具有双向抑制性功能，其既可抑制血栓形成，也可抑制凝血反应，可应用于治疗血栓性疾病和凝血性疾病的药物制备中。
生物保藏信息说明
抗ERp57单克隆抗体杂交瘤细胞于2014年4月29日保藏在保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.9153。
附图说明
图1所示为DuIn抗体特异性检测的聚集曲线图，其中，曲线1为ERp57fl/fl小鼠血小板经DuIn抗体60μg/mL孵育后的聚集曲线，曲线2为ERp57fl/fl小鼠血小板经DuIn抗体30μg/mL孵育后的聚集曲线，曲线3为ERp57fl/fl小鼠血小板经DuIn抗体15μg/mL孵育后的聚集曲线，曲线4为ERp57fl/fl小鼠血小板经IgG2a60μg/mL孵育后的聚集曲线；横坐标为时间min，对应时间为1min、2min、3min、4min，纵坐标为透光度％；
图2所示为DuIn抗体特异性检测的聚集曲线图，其中，曲线1为PF4-Cre/ERp57fl/fl小鼠血小板经DuIn抗体60μg/mL孵育后的聚集曲线，曲线2为PF4-Cre/ERp57fl/fl小鼠血小板经DuIn抗体30μg/mL孵育后的聚集曲线，曲线3为PF4-Cre/ERp57fl/fl小鼠血小板经DuIn抗体15μg/mL孵育后的聚集曲线，曲线4为PF4-Cre/ERp57fl/fl小鼠血小 板经IgG2a60μg/mL孵育后的聚集曲线；横坐标为时间min，对应时间为1min、2min、3min、4min，纵坐标为透光度％；
图3所示为DuIn抗体抑制血小板聚集试验的聚集曲线图，其中，曲线1为人来源血小板经DuIn抗体60μg/mL孵育后的聚集曲线，曲线2为人来源血小板经DuIn抗体30μg/mL孵育后的聚集曲线，曲线3为人来源血小板经DuIn抗体15μg/mL孵育后的聚集曲线，曲线4为人来源血小板经IgG2a 60μg/mL孵育后的聚集曲线；横坐标为时间min，对应时间为1min、2min、3min、4min，纵坐标为透光度％；
图4所示为DuIn抗体抑制血小板表面整合素αIIbβ3的活化的柱形图，其中，柱形1为对照抗体鼠IgG2a组柱形，柱形2为DuIn抗体组柱形，纵坐标为荧光强度％；
图5所示为DuIn抗体抑制血小板表面p-selectin的表达的柱形图，其中，柱形1为对照抗体鼠IgG2a组柱形，柱形2为DuIn抗体组柱形，纵坐标为荧光强度％；
图6所示DuIn抗体抑制小鼠体内血栓形成的柱形图，其中，柱形1为对照抗体鼠IgG2a组柱形，柱形2为DuIn抗体组柱形，纵坐标为血管阻塞时间min；
图7所示DuIn抗体体内抑制血小板积聚的曲线图，其中，曲线1为对照抗体鼠IgG组曲线，曲线2为DuIn抗体组曲线，纵坐标为血小板的荧光强度，横坐标为时间s；
图8所示DuIn抗体体内抑制纤维蛋白形成的曲线图，其中，曲线1为对照抗体鼠IgG组曲线，曲线2为DuIn抗体组曲线，纵坐标为纤维蛋白荧光强度，横坐标为时间s；
图9所示为DuIn抗体抑制凝血酶形成的曲线图，其中，曲线1为对照抗体鼠IgG组曲线，曲线2为DuIn抗体组曲线，纵坐标为凝血酶生成量，横坐标为时间min。
具体实施方式：
本发明公开了一种杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体和应用，本 领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面就本发明提供的一种杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体和应用做进一步说明。
实施例1：单克隆抗体杂交瘤细胞的制备
1、材料
抗原：SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白，试剂公司全合成；
试验动物：8-10周龄、17g左右BALB/C小鼠；
试剂：福氏完全佐剂和不完全佐剂(购自Promega公司)；
骨髓瘤细胞：SP2/0细胞(由中国典型培养物保藏中心提供)；
培养基：HAT选择性培养基(购自Sigma公司)；
2、方法
取SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白100μg加等质量福氏完全佐剂对BALB/C小鼠进行第一次皮下注射，21天后取SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白300μg加等质量福氏不完全佐剂对BALB/C小鼠进行第二次皮下注射，10天后尾部采血并用ELISA间接法测定抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白的鼠血清效价，选择效价高的BALB/C小鼠用SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白100μg进行免疫，腹腔注射后3天准备进行细胞融合。
腹腔注射3天后，取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞按照5∶1～10∶1的比例混合，利用PEG进行细胞融合，融合后进行HAT培养，然后吸取杂交瘤细胞培养上清液进行ELISA检测，筛选出阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆至能稳定分泌抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白单克隆抗体，获得所述单克隆抗体杂交瘤细胞。
实施例2：分泌产生DuIn抗体
用不完全佐剂免疫BALB/C小鼠1～2周后，分别往小鼠腹腔注射1×106个保藏编号为CGMCC NO.9153的杂交瘤细胞，接种所述杂交瘤细胞7～10天后产生腹水；
从所述BALB/C小鼠腹腔抽取腹水，置于15ml离心管中，2000rpm离心10min，以沉淀血细胞及其它杂质，将上清转移入新的离心管中，放入-80℃冰箱保存，纯化前，使用0.1M的PBS溶液按1:3的比例稀释腹水；
取0.5ml Protein G装入吸附柱中，加入20倍柱体积的0.1M的PBS缓冲液平衡柱子，以备上样；
取稀释的腹水，加入纯化柱中，每次2-3ml，腹水循环过柱3遍；
待腹水循环过柱3遍后，加上30倍柱体积的0.1M的PBS缓冲液充分洗涤柱子，洗掉杂蛋白；
洗涤完毕后，加0.1M、pH值为2.8的Gly洗脱液洗脱结合的抗体，预先在收集管中加入25ul1M、pH值8.9的Tris-Hcl，每管收集500ul的洗脱液，连续收集10管；
使用显色液测定每管收集液是否含有蛋白质，取蛋白含量最多的收集液进行透析，透析后获得DuIn抗体。
实施例3：DuIn抗体特异性检测
分别取ERp57fl/fl(对照小鼠，未敲除SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白的编码基因)以及PF4-Cre/ERp57fl/fl(血小板特异性敲除SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白的编码基因的小鼠)血小板裂解液200μg和ERp57重组蛋白50ng进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将蛋白转印到PVDF膜上，使用5％的脱脂牛奶溶液室温封闭1小时。使用TBS/T溶液将抗DuIn抗体稀释到1μg/ml，将封闭过的PVDF膜放入抗体稀释液中，室温孵育2小时。孵育结束后，使用TBS/T溶液洗涤3次，每次10分钟，然后再加膜放入荧光标记的二抗稀释液中，室温孵 育1小时。1小时之后，用TBS/T溶液洗涤膜3次，使用Odyssey红外成像仪观察，结果见图1和图2。
由图1和图2可以看出，DuIn抗体可抑制ERp57fl/fl小鼠血小板聚集，而不抑制PF4-Cre/ERp57fl/fl小鼠的血小板聚集(刺激剂Thrombin0.015U)，以上结果表明DuIn抗体特异性识别SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白。
实施例4：DuIn抗体抑制血小板聚集试验
人来源全血使用柠檬酸钠作为抗凝剂。人来源全血加入Tyrode’sbuffer(1:3)稀释，然后800rpm，室温离心10min，取上层富含血小板血浆至新的离心管。富血小板血浆再经1300rpm，室温离心15min，弃去上清，获得血小板沉淀。血小板沉淀加入适当体积的Tyrode’s buffer，缓慢吹打制成洗涤血小板悬液，计数，调整血小板浓度为2×108/ml。使用双通道血小板聚集仪(美国Chrono-Log公司产品)，通过透光度的变化测试血小板的聚集。血小板聚集仪的温度设置为37℃，搅拌转速设置为1200rpm。取300μl洗涤血小板血液加入聚集管中，分别加入不同浓度的DuIn抗体和对照抗体IgG2a，37℃孵育5分钟。然后加入3μl100mMCaCl2溶液，使终浓度为1mM。将聚集管放入聚集仪中，加入刺激剂Thrombin0.025U，记录聚集曲线，结果见图3。
由图3的结果可以看出，不同浓度的DuIn抗体的透光度明显低于对照IgG的透光度，表明DuIn抗体可有效抑制血小板聚集。
实施例5：DuIn抗体抑制血小板表面整合素αIIbβ3的活化
取小鼠富含血小板血浆10μl，分别加入DuIn抗体(30μg/ml)或者对照抗体鼠IgG2a，室温孵育10分钟。10分钟后，加入适当浓度的刺激剂convulxin，室温孵育5分钟，然后加入FITC标记的PAC-1抗体(BD公司，可结合血小板表面整合素αIIbβ3)1μl，避光孵育15分钟。孵育完毕后，加入290μl PBS溶液稀释样品，再加入终浓度为1％的多聚甲醛固定样品。制备好的样品使用流式细胞仪进行分析并记录 柱形图，结果见图4。
由图4的结果可以明显看出，DuIn抗体可明显抑制血小板表面整合素αIIbβ3的活化，从而在试验结果上表现出较低的荧光强度。
实施例6：DuIn抗体抑制血小板表面p-selectin的表达
取小鼠富含血小板血浆10μl，分别加入DuIn抗体(30μg/ml)或者对照抗体鼠IgG2a，室温孵育10分钟。10分钟后，加入适当浓度的刺激剂convulxin，室温孵育5分钟，然后加入PE标记的抗p-selectin的抗体(eBioscience公司)0.1μl，避光孵育15分钟。孵育完毕后，加入290μl PBS溶液稀释样品，再加入终浓度为1％的多聚甲醛固定样品。制备好的样品使用流式细胞仪进行分析并记录柱形图，结果见图5。
由图5的结果可以明显看出，DuIn抗体可明显抑制血小板表面p-selectin的表达，从而在试验结果上表现出较低的荧光强度。
实施例7：DuIn抗体抑制小鼠体内血栓形成
取体重20～25克的C57BL/6雄性小鼠，腹膜内注射戊巴比妥钠(120mg/kg)麻醉小鼠。麻醉后的小鼠取仰卧位固定在解剖台上，解剖台温度设定为37℃。在小鼠颈部中间线处做一纵向切口，用显微镊分离皮下组织，暴露出颈总动脉，用显微镊分离处左侧颈动脉。实验前5分钟，分别经髂静脉注射450μg的DuIn抗体和对照抗体IgG2a。5分钟后，用滤纸(1mmx2mm)浸润5％的FeCl3溶液，将滤纸片放置到暴露的小鼠颈动脉上2分钟。两分钟后除去滤纸，滴加PBS清洗小鼠颈动脉5次，然后在小鼠的颈部伤口处加上用于多普勒检测的成像超声导电膏。利用VisualSonics Vevo model2100小动物超声成像仪和小动物血液流量传感器(MS400,18-38MHz,VisualSonics)，在频谱多普勒模式下观察小鼠颈动脉血流状态。血管阻塞所需时间从最初的动脉损伤开始计算，直到血流最终消失。当血流完全停止至少5分钟时，说明血管达到完全阻塞，记录此时间为血管阻塞时间，结果见图6。
由图6可知，由于DuIn抗体能够抑制血栓的形成，从而导致其血 管阻塞时间变长，而对照抗体组的时间较短。
实施例8：DuIn抗体抑制血小板积聚和纤维蛋白形成
激光诱导提睾肌动脉血栓形成(活体荧光摄像显微镜法)：
荧光标记抗体探针的制备：抗小鼠CD41(整合素αIIb)单克隆抗体(cloneMWReg30)和抗fibrin单克隆抗体(clone NYBT2G1)分别购自BD Bioscience和AccurateChemical公司,二者在体内可分别识别血小板血栓和生成的纤维蛋白。使用ImmunoPureFab试剂盒(Peirce公司)制备Fab片段，分别用Alexa Fluor488或Alexa Fluor647(Invitrogen)进行荧光标记。
血栓形成模型的观测方法：应用腹腔内注射戊巴比妥钠(90mg/kg),将小鼠麻醉，置于保温毯，温度保持在37℃。在颈静脉留置插管，用于戊巴比妥维持麻醉和注射荧光标记抗体CD41(0.1μg/g)anti-Fibrin(0.2μg/g)。在活体显微镜下，切开阴囊，游离出提睾肌，固定于圆形托孔。在配有60倍水浸物镜的显微镜下，对提睾肌动脉血管壁定位，用AblateTM(3I)微点激光器(Photonics Instruments)产生的激光诱导血管壁损伤，自血流流向的下游至上游诱导多处损伤。用荧光显微镜(ZEISS，Examiner D1)在每一损伤部位，用高灵敏度CCD数字录像机Photometrics(Cool SNAP HQ2)获取标记积聚的血小板和纤维蛋白的荧光信号，记录5分钟(50frames/秒)，应用Slide Book5.5软件(Intelligent ImagingInnovations)对荧光图像进行分析，通过计算损伤的血栓的荧光值中位数作为反映血栓形成的动态曲线。应用上述方法，对分别注射Mouse IgG(对照小鼠抗体)和DuIn抗体(450μg/mice)两组小鼠提睾肌动脉血栓形成进行比较，每组小鼠4只，每只激光诱导损伤30-40处，结果见图7和图8。
与注射Mouse IgG小鼠相比，注射DuIn抗体的小鼠损伤部位的血小板积聚和纤维蛋白形成均明显受到抑制。
实施例9：DuIn抗体抑制凝血酶形成
将人新鲜外周血与PBS1:1稀释后用CEDARLANE公司 -H(CL5020)分离液密度梯度离心，室温800g20分钟，吸取中间层细胞转移至新的离心管，加入PBS稀释后800g离心10分钟，去上清，沉淀加PBS重悬再400g离心10分钟，用含5％FBS的1640培养基重悬，计数备用。取1×105PBMC分别加入100μg/mlControl mouse IgG和DuIn抗体，混匀，加入100ng/ml LPS,置于含5％CO2的37℃培养箱中4小时。使用Technoclone公司Ceveron AlphaTGA分析仪分别加入40μl新鲜血浆(含4μM CTI)，40μl荧光底物(能被凝血酶切割而产生荧光)和35μl25mM Ca2+，检测荧光的增加量，Ceveron软件自动将荧光的增加值转换成凝血酶的生成量，结果见图9。
由图9的曲线图可以看出，注射DuIn抗体组的凝血酶生成量明显低于注射对照小鼠抗体(Control mouse IgG)组，表明DuIn抗体可显著抑制凝血酶的生成，具有抗凝血作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种杂交瘤细胞，其特征在于，保藏编号为CGMCC NO.9153。
2.保藏编号为CGMCC NO.9153的杂交瘤细胞在制备抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白单克隆抗体中的应用。
3.一种抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CGMCC NO.9153的杂交瘤细胞分泌产生。
4.权利要求3所述单克隆抗体在制备治疗血栓性疾病或凝血性疾病药物中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述血栓性疾病为冠脉综合征或深静脉血栓。
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述凝血性疾病为弥散性血管内凝血病。
7.权利要求3所述单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、用不完全佐剂免疫BALB/C小鼠1～2周后，分别往小鼠腹腔注射1×106个保藏编号为CGMCC NO.9153的杂交瘤细胞，接种所述杂交瘤细胞7～10天后产生腹水；
步骤2、从所述BALB/C小鼠腹腔抽取腹水，置于15ml离心管中，2000rpm离心10min，以沉淀血细胞及其它杂质，将上清转移入新的离心管中，放入-80℃冰箱保存，纯化前，使用0.1M的PBS溶液按1:3的比例稀释腹水；
取0.5ml Protein G装入吸附柱中，加入20倍柱体积的0.1M的PBS缓冲液平衡柱子，以备上样；
取稀释的腹水，加入纯化柱中，每次2-3ml，腹水循环过柱3遍；
步骤3、待腹水循环过柱3遍后，加上30倍柱体积的0.1M的PBS缓冲液充分洗涤柱子，洗掉杂蛋白；
洗涤完毕后，加0.1M、pH值为2.8的Gly洗脱液洗脱结合的抗体，预先在收集管中加入25μl 1M、pH值8.9的Tris-HCl，每管收集500μl的洗脱液，连续收集10管；
使用显色液测定每管收集液是否含有蛋白质，取蛋白含量最多的 收集液进行透析，透析后获得抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白单克隆抗体。
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