TW201350502A - 發炎疾病治療劑 - Google Patents

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Yayoi Shimada
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Takahiro Hiratsuka
Takayuki Noguchi
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Abstract

本發明係關於一種有關組蛋白之發炎治療劑，其係包含單株抗體或其抗原結合片段所成，該單株抗體或其抗原結合片段係與：由SSVLYGGPPSAA(序列號碼1)所示胺基酸序列所構成之胜肽、或該胜肽與藥學上可容許的載體之結合體相結合。

Description

發炎疾病治療劑 [相關申請]
本專利申請案，係伴隨基於先前已於日本申請之專利申請案特願2012-35965號(申請日：2012年2月22日)之優先權之主張者。引用該先前之專利申請案中全部內容成為本說明書之一部分。
本發明係關於以單株抗體或其抗原結合片段作為有效成分之新穎發炎疾病治療劑。
近年，核內的構成成分之組蛋白被報告為損害相關分子模式分子群(DAMPs：Damage-associated molecular pattern molecules)。此般損害相關分子模式分子群因係臟器傷害等發炎疾病之原因，故受到注目。
另一方面，敗血症係起因於感染症、肝硬化、腎衰竭、糖尿病、難產等疾病或留置導管、輸液器具、透析、氣管切開等針對受傷或疾病的治療，其係細菌 從細菌傳染灶連續地或間斷地侵入血液所成之嚴重的全身性感染症。又，敗血症並非限定於由微生物侵襲宿主者，其以滿足下述感染症的臨床症狀之中2項目以上之病理狀態來定義，即(1)體溫>38℃或<36℃；(2)心跳數>90下/分；(3)呼吸率>20呼吸/分或PaCO2<32mmHg；(4)白血球數>12000/μl、<4000/μl或桿狀核嗜中性球>10%。最近，顯示此種症狀的病理狀態稱為全身性發炎反應症候群(Systemic inflammatory response syndrome；SIRS)(非專利文獻1：Crit.Care Med.,20：864-874,1992)。再者，敗血症更包含了合併器官功能障礙、血液灌流不足或低血壓之嚴重敗血症，合併乳酸酸血症、乏尿、意識障礙之敗血症休克(非專利文獻2：Chest,101：1644-1655,1992)。再來病理狀態會從嚴重敗血症、敗血症休克，招致彌散性血管內凝血症候群(DIC)、成人呼吸窘迫症候群(ARDS)、多重器官功能障礙(MODS)。
此般敗血症的原因菌主要認為係葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、克留氏菌、腸桿菌。感染此等細菌顯示出高燒、惡寒、心搏過速、強烈全身症狀，往往變得可以從動/靜脈血、脊髓液、骨髓中確認出感染菌。
近年來，因各種強力抗生素之開發而使得以此等菌為原因之敗血症變少，但以MRSA(抗甲氧苯青黴素金黃色葡萄球菌)為代表之獲得抗性基因之新病原菌所 引起之敗血症卻增加。又，反映使用留置導管或輸液器具之處置，或是人工透析、氣管切開等之侵入性處置．手術的泛用，敗血症的發生於愈大之醫院愈有增加傾向。進一步地，對於對感染抵抗力低的新生兒、高齡者、造血器官腫瘤患者、及投予腎上腺皮質激素或抗癌劑之免疫力降低之患者，敗血症的發病頻率增加。因此等原因，使得敗血症隨著醫療的進步反而持續增加。
作為此般敗血症之預防/治療方法，現在已知，於檢驗出原因菌並測定其對抗生素的敏感性後，針對起因菌投予最適當之抗生素，同時施行補液、電解質修正、改善低蛋白血症、補給營養，投予γ-球蛋白等有助宿主防禦力的方法等。又，不幸陷入休克之情形，可作出之處置有藉由外科手術將病灶去除、循環障礙之改善、調理素活化物質之投予、腎上腺皮質激素之投予、合成蛋白酶抑制劑之投予。然而，因為基礎疾病之症狀與敗血症之症狀互相重疊，所以常看到難以明確的診斷，而使敗血症的預防/治療產生困難之情形。若進而陷入敗血症休克等情形，其預防/治療困難，敗血症至今依然是導致高死亡率之疾病。
敗血症的死亡率從10%~20%程度至50%，依報告而有所不同。亦有敗血症休克合併於敗血症病例之40%、而休克病例之預後不佳有77~90%之死亡率的報告。因此，敗血症性休克之預防為治療的第一目標，特別是若能把握住休克初期階段中發生之變化而早期診斷，能 早期治療則可期待預後之改善。但至此為止，已檢討了許多被認為有效之抗休克藥或治療法的臨床效果，其中幾乎沒有被判定為有效者。
敗血症被認為因感染刺激(菌本身、內毒素或肽聚糖/磷壁酸複合體之細胞壁成分及外毒素等)而從單核球、巨噬細胞、血管內皮細胞等過量產生之腫瘤壞死因子(TNF)、介白素-1(IL-1)、介白素-6(IL-6)及介白素-8(IL-8)等發炎性細胞介素為原因而發病。藉由過量產生之發炎性細胞介素，類花生酸或血小板活化因子之脂質媒介亦被放出，而藉由該等之相互作用使細胞介質網絡被活化而發炎反應增幅。此過程中，補體系統、凝血系統、激肽系統、促腎上腺皮質激素系統/腦啡系統亦被活化，引起以血管內皮損傷作為基礎病理狀態之全身性發炎反應。特別是顯示出循環障礙或組織障礙之表現與粒細胞由來之彈性蛋白酶或活性氧有關。
因此，以抑制發炎性細胞介質般之物質等之投予等作為代表之發炎性細胞介質抑制療法的臨床試驗被多數進行，然而該等全數以失敗告終(非專利文獻3：Lancet,351：929-933,1998、JAMA,271：1836-1843,1994)。
儘管如此之種種治療方法被檢討，敗血症的死亡率依然高居不下，幾乎沒有有效果的治療藥。其理由為敗血症之病理狀態尚未完全被理解(非專利文獻4：Nath.J.Med.,55：132-141,1999)。
又，缺血再灌流傷害被報告為損害相關分子模式分子群相關的其他發炎疾病。又，常有腎缺血再灌流傷害為起因而導致急性腎衰竭之事被報告。然而，對於此等病理狀態幾乎沒有有效果的治療法。
因此，製出對於損害相關分子模式分子群相關的發炎疾病之優異治療劑依然被尋求著。
[先前技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1]Crit. Care Med., 20: 864-874, 1992
[非專利文獻2]Chest, 101: 1644-1655, 1992
[非專利文獻3]Lancet, 351: 929-933, 1998、JAMA, 271: 1836-1843, 1994
[非專利文獻4]Nath. J. Med., 55: 132-141, 1999
最近，本發明者們發現可辨識由SSVLYGGPPSAA(序列號碼1)所示胺基酸序列所構成之胜肽的單株抗體或抗原結合片段，對於組蛋白相關發炎疾病達到優異之治療效果。本發明為基於此見識者。
因此，本發明係以提供針對發炎疾病之新穎治療劑為目的。
接著，依據本發明，提供一種發炎疾病治療 劑，其係包含單株抗體或抗原結合片段所成，該單株抗體或抗原結合片段係與：由SSVLYGGPPSAA(序列號碼1)所示胺基酸序列所構成之胜肽、或該胜肽與藥學上可容許的載體之結合體相結合。
依據本發明之單株抗體或抗原結合片段，可有效地治療發炎疾病。
[圖1]表示本發明之單株抗體(以下亦稱作「SSVmAb」)之同型(isotype)鑑定試驗的結果。
[圖2]表示本發明之單株抗體(SSVmAb)對組蛋白H1、組蛋白H2A、H2B、H3或H4結合親合性之比較試驗的結果。
[圖3]參考例；表示以寄存編號FERM BP-10413寄存之融合瘤16G9所產生之單株抗體(以下，亦稱作「16G9mAb」)，對組蛋白H1、組蛋白H2A、H2B、H3或H4結合親合性之比較試驗的的結果。
[圖4]表示使用本發明之單株抗體(SSVmAb)及16G9mAb之混合淋巴細胞反應(MLR)試驗的結果。
[圖5]表示以流式細胞儀比較本發明之單株抗體(SSVmAb)及16G9mAb對T細胞反應性的結果。
[圖6]A表示使用未經siRNA減弱(knockdown)ATP合成酵素之脾臟細胞下，本發明之單株抗體(SSVmAb)及對照組試藥(Isotype IgG1)之MLR試驗的結果。B表 示使用經siRNA減弱(knockdown)ATP合成酵素之脾臟細胞下，本發明之單株抗體(SSVmAb)及對照組試藥(Isotype IgG1)之MLR試驗的結果。
[圖7]表示試驗例7中，本發明之單株抗體(SSVmAb)提高敗血症模式動物之生存率的圖。
[圖8]表示試驗例8中，本發明之單株抗體(SSVmAb)提高敗血症模式動物之生存率的圖。
[圖9]表示試驗例8之對照組及SSVmAb投予組中，血液樣本(血清)中及肺中組蛋白H1濃度的測定結果。圖9A為血液樣本中之組蛋白H1濃度的圖表。圖9B為肺中之組蛋白H1濃度的圖表。
[圖10]表示試驗例8之對照組及SSVmAb投予組中，血液樣本中及肺中組蛋白H3濃度的測定結果。圖10A為血液樣本中之組蛋白H3濃度的圖表。圖10B為肺中之組蛋白H3濃度的圖表。
[圖11]表示試驗例8之對照組及SSVmAb投予組中，血液樣本中及肺中組蛋白H4濃度的測定結果。圖11A為血液樣本中之組蛋白H4濃度的圖表。圖11B為肺中之組蛋白H4濃度的圖表。
[圖12]試驗例8之試驗結束後，由健康大鼠及SSVmAb投予組及對照組之大鼠取得並染色之肺組織切片的顯微鏡照片。圖12A為健康大鼠的照片。圖12B為SSVmAb投予組的照片。圖12C為對照組的照片。
[圖13]表示試驗例8之試驗結束後，對於SSVmAb投 予組及對照組之關於大鼠之鬱血、浮腫、發炎及出血之評估結果的圖表。
[圖14]表示試驗例8之對照組及SSVmAb投予組中，血液樣本中之發炎性細胞介素(TNF-α、IL-1β、IL-6)與抑制性細胞介素(IL-10)濃度的測定結果。圖14A表示血液樣本中TNF-α之濃度。圖14B表示血液樣本中IL-1β之濃度。圖14C表示血液樣本中IL-6之濃度。圖14D表示血液樣本中IL-10之濃度。
[發明之具體說明] 單株抗體及融合瘤
本發明之單株抗體或其抗原結合片段之特徵之一為，與由SSVLYGGPPSAA(序列號碼1)所示胺基酸序列所構成之胜肽、或該胜肽與藥學上可容許的載體之結合體相結合。該單株抗體或其抗原結合片段對於發炎疾病產生優異治療效果為意外之事實。
本發明之發炎疾病，宜為組蛋白相關之發炎疾病，較宜為急性發炎疾病，較宜為敗血症、腎缺血再灌流傷害或腎衰竭，更宜為敗血症、腎缺血再灌流傷害或急性腎衰竭，再更宜為敗血症。
依據本發明之較佳態樣為，上述抗體或其抗原結合片段係針對由SSVLYGGPPSAA(序列號碼1)所 示胺基酸序列所構成之胜肽或該胜肽與藥學上可容許的載體者。
又，依據本發明之一態樣，上述抗體或其抗原結合片段係特異性結合於組蛋白H1、組蛋白H3及組蛋白H4者。具有該結合能之抗體或其抗原結合片段係如後述實施例中8-2所示，對於發炎疾病之治療可特別有利地利用。
又，依據本發明之一態樣，上述抗體或其抗原結合片段係，比起對於連接組蛋白(組蛋白H1)之結合親合性，對於核心組蛋白之結合親合性較高。
又，依據本發明之較佳態樣，核心組蛋白為組蛋白H2A、H2B、H3或H4，更佳為組蛋白H2A、H3或H4。
又，本發明之抗體或其抗原結合片段可含有重鏈及/或輕鏈。各輕鏈及重鏈於其N-端可具有變異區，各變異區可交互含有4個架構區(framework region)(FR)與3個互補決定區(CDR)。變異區中之殘基依據Kabat等所想之系編上慣用的號碼。此系為Kabat等於1987,Sequence of Proteins of Immunological Interest,US Department of Health and Human Services,NIH,USA中所述。本說明書若無特表示的話則使用此編號體系。基於如此Kabat等的方法編號，可簡易地利用網頁http：//www.bioinf.org.uk/abysis/tools/analyze.cgi進行。
Kabat殘基命名法並非總是與胺基酸殘基的直 線編號直接一致。實際的直線胺基酸序列係，無論基本變異區構造的構造要素、架構區或CDR何者，對應其縮短或插入，嚴格的Kabat編號中有具有較少或追加胺基酸的情形。對於給定的抗體，以「標準的」Kabat編號之序列與抗體序列中之相同性殘基對齊來決定殘基之正確的Kabat編號。
依據一種態樣，本發明之抗體或其抗原結合片段的輕鏈變異區係包含：RASSSVSYMH(序列號碼2)所示胺基酸序列所構成之CDR1、ATSNLAS(序列號碼3)所示胺基酸序列所構成之CDR2、以及QQWSSNPWT(序列號碼4)所示胺基酸序列所構成之CDR3所成。依據更佳態樣，上述輕鏈變異區係包含序列號碼6之第23~128號所示胺基酸序列所成。
又，依據別的態樣，本發明之抗體或其抗原結合片段的重鏈變異區係包含：GYNMN(序列號碼7)所示胺基酸序列所構成之CDR1、NINPYYGSTSYNQKFKG(序列號碼8)所示胺基酸序列所構成之CDR2、以及SPYYSNYWRYFDY(序列號碼9)所示胺基酸序列所構成之CDR3所成。依據更佳態樣，上述重鏈變異區係包含序列號碼11之第20~141號所示胺基酸序列所成。
又，依據本發明之再更佳態樣，本發明之抗體或其抗原結合片段係包含：由包含RASSSVSYMH(序列號碼2)所示胺基酸序列所構成之CDR1、ATSNLAS(序列號碼3)所示胺基酸序列所構成之CDR2、以及 QQWSSNPWT(序列號碼4)所示胺基酸序列所構成之CDR3所成之輕鏈變異區，與由包含GYNMN(序列號碼7)所示胺基酸序列所構成之CDR1、NINPYYGSTSYNQKFKG(序列號碼8)所示胺基酸序列所構成之CDR2、以及SPYYSNYWRYFDY(序列號碼9)所示胺基酸序列所構成之CDR3所成之重鏈變異區。
又，依據本發明之再更佳態樣，本發明之抗體或其抗原結合片段係包含：包含序列號碼6之第23~128號所示胺基酸序列所成之輕鏈變異區，與包含序列號碼11之第20~141號所示胺基酸序列所成之重鏈變異區。
又，依據本發明之較佳態樣，上述單株抗體或其抗原結合片段可調降(down-regulation)ATP合成酵素活性。又，依據本發明之更佳態樣，上述ATP合成酵素為粒線體之ATP合成酵素。
本發明之單株抗體或其抗原結合片段之上述結合親和性及調降ATP合成酵素之活性，係藉由例如本案說明書之試驗例2及4所載之手法來確認。
又，本發明之單株抗體較佳為嵌合體、人源化抗體或完全人類抗體。基於例如Morrison,S.L.,Oi,V.T.,“immunoglobulin genes”Academic Press(London),260-274(1989)、Roguska,M.L.et.Al.,Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,969-973 (1994)、Tomizuka,K.et.al.Functional expression and germline transmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice,Nature Genet.,16,133-143(1997)、Winter,G.et.al.,Making antibodies by phage display technology,Ann.Rev.Immunol.,12,433-455(1994)、Griffiths,A.D.et.al.,Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires,EMBO.J.,13,3245-3260(1994)等中記載之該技術領域之公知技術，發明所屬領域中具有通常知識者能夠製造此等之抗體。
又，依據本發明之較佳態樣，上述抗原結合片段較佳為Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv或scFv。
又，依據本發明之其他較佳態樣，上述單株抗體或其抗原結合片段係融合瘤Mouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3所產生者。
本發明之單株抗體或其抗原結合片段、及融合瘤，例如，能以下述方法製造，亦即藉由：首先，使用SSVLYGGPPSAA(序列號碼1)所示胺基酸序列所構成之胜肽或該胜肽與藥學上可容許的載體之結合體作為感作抗原，使經此感作抗原免疫之動物漿細胞(免疫細胞)與哺乳動物之骨髓瘤細胞融合，選殖得到之融合瘤，藉由從該融合瘤中篩選可得到本發明之融合瘤。接著，藉由培養本發明之融合瘤並回收此等所產生之抗體，可得到本發明之單株抗體。
免疫哺乳動物的方法，可使用該技術領域中一般的投予法，具體可舉例為腹腔內注射、脾臟內注射、肌肉內注射、皮下注射、皮內注射、經口投予、經黏膜投予、經皮投予等，較佳為腹腔內注射、脾臟內注射。感作抗原之投予間隔為可對應感作抗原之投予量及哺乳動物的種類等來適宜地決定，例如可每1個月間數次。
被免疫的哺乳動物並無特別限定，但考慮與細胞融合時使用之骨髓瘤細胞的適合性來選擇較佳，例如，可舉例小鼠、大鼠、倉鼠等，較佳為小鼠。
又，免疫細胞較佳為使用脾細胞。
本發明所使用之骨髓瘤細胞，可舉例例如P3(P3X63Ag8.653)(J.Immunol.,123,1548,1978)、p3-U1(Current Topics in Micro-biology and Immunology,81,1-7,1978)、NS-1(Eur.J.Immunol.,6,511-519,1976)、MPC-11(Cell,8,405-415,1976)、Sp2/0-Ag14(Nature,276,269-270,1978)、FO(J.Immunol.Meth.,35,1-21,1980)、S194(J.Exp.Med.,148,313-323,1978)、及R210(Nature,277,131-133,1979)等，較佳為P3或p3-U1，更佳為P3。
免疫細胞與骨髓瘤細胞之細胞融合，例如，可以密爾斯坦等(Milstein et.Al.)之方法(Methods Enzymol.,73,3-46,1981)等為準來進行。具體而言，細胞融合可例如藉由在融合促進劑的存在下將培養液中的免疫細胞與骨髓瘤細胞混合來實施。之後，細胞融合中，可 添加適宜的培養液重複離心分離之操作而生成融合瘤。
細胞融合所使用的培養液，可舉例例如RPMI-1640培養液、MEM培養液等細胞融合中常用的培養液。又，可適宜地併用胎牛血清(FBS)等之血清補液。
又，細胞融合溫度較佳為25~37℃，更佳為30~37℃。
又，骨髓瘤細胞與免疫細胞之混合比率，較佳為1：1~1：10之程度。
融合促進劑，可舉例例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，較佳為PEG。可適宜地選擇PEG之分子量，例如，平均分子量可為1,000~6,000程度。又，培養液中之PEG濃度較佳為約30~60%(W/V)。
又，視需要可適宜地添加二甲基亞碸等的輔助劑於培養液中。
本發明之融合瘤的選擇可藉由以下方法實施：將藉由細胞融合所得之融合瘤以例如HAT培養液等常用之選擇培養液培養，使用常用之限數稀釋法，以例如針對SSVLYGGPPSAA(序列號碼1)所示胺基酸序列所構成之胜肽或該胜肽與藥學上可容許的載體之結合體的抗體價等作為指標來篩選。以HAT培養液培養之期間，係能使目的融合瘤以外之細胞(未融合細胞)完全死亡的時間，通常可為數日~數週。如此方法得到的本發明之融合瘤，能以通常的培養液繼代培養，亦能於液態氮中長期保 存。
又，回收本發明之單株抗體或其抗體結合片段之方法，可舉例例如依照常用方法培養融合瘤後，從培養上清液中得到單株抗體的方法，或是將融合瘤投予至有適合性的哺乳動物中使其增殖，再從其腹水中得到單株抗體的方法。此處，前述之方法對於得到高純度的抗體較佳，後述之方法對於大量生產抗體較佳。
進一步，本發明之單株抗體或其抗體結合片段可藉由鹽析法、凝膠過濾法、親和層析等方法，純化至高純度。
本發明之單株抗體或其抗原結合片段，如上述，對於組蛋白相關發炎疾病有優異之治療效果。因此，依據本發明之其他態樣，提供於發炎疾病治療劑之製造中使用本發明之單株抗體之用途。又，上述方法中，發炎疾病宜為組蛋白相關之發炎疾病，較宜為急性發炎疾病，較宜為敗血症、腎缺血再灌流傷害或腎衰竭，更宜為敗血症、腎缺血再灌流傷害或急性腎衰竭，再更宜為敗血症。又，本發明之單株抗體或其抗原結合片段，可直接使用，亦可與藥學上容許之添加劑一起用作為醫藥組成物。因此，依據本發明之一態樣，提供含有本發明之單株抗體或其抗原結合片段所成之發炎疾病治療用的醫藥製劑。
本發明之敗血症治療劑，例如可將本發明之單株抗體溶解於注射用生理食鹽水、注射用蒸餾水、注射用緩衝溶液等來調製。進一步，本發明之免疫抑制用組成 物中可含有適當的溶劑、溶解輔助劑、保存劑、安定劑、乳化劑、懸濁劑、舒緩劑、等張化劑、緩衝劑、賦形劑、增黏劑、著色劑、周知的載體(各種微脂體、聚胺基酸載體、合成高分子、天然高分子等)等。
又，依據本發明之其他態樣，提供一種包含將有效量的本發明之單株抗體或其抗原結合片段投予至受驗者所成之發炎疾病的治療方法。此處，所謂「治療」，意指改善已確認之病理狀態。又，依據本發明之其他態樣，提供一種減輕受驗者之發炎疾病的發生風險的方法，其係包含將有效量的本發明之單株抗體或其抗原結合片段投予至受驗者所成之方法。又，上述方法中，發炎疾病宜為組蛋白相關之發炎疾病，較宜為急性發炎疾病，較宜為敗血症、腎缺血再灌流傷害或腎衰竭，更宜為敗血症、腎缺血再灌流傷害或急性腎衰竭，再更宜為敗血症。
又，本發明之單株抗體或其抗原結合片段可發揮顯著的免疫抑制作用。可使用於治療發炎疾病之上述單株抗體或其抗原結合片段，亦產生免疫抑制作用為意外之事實。因此，依據一態樣，本發明之單株抗體或其抗原結合片段可使用作為免疫抑制劑。
又，依據本發明之一態樣，上述受檢體較佳為哺乳動物，更佳為人類。
又，本發明之單株抗體或其抗原結合片段可與其他用於發炎疾病之藥劑組合，同時或逐次投予至哺乳動物。
又，本發明之單株抗體或其抗原結合片段可投予至全身或局部。具體之投予方法，可舉例點滴、靜脈內注射、肌肉內注射、皮下注射、皮內注射、經口投予、經黏膜投予、經皮投予等。
又，本發明之單株抗體或其抗原結合片段之有效量並無特別限定，該領域具有通常知識者可對應受檢體的種類、性質、性別、年齡、症狀等適宜地決定。例如，作為該有效量，可舉例0.05~40mg/體重kg/日，較佳為一次或數次之2~10mg/體重kg/日。
[實施例]
以下，舉例實施例以具體說明本發明，但本發明並非為限定於此等實施例者。
實施例1：單株抗體(SSVmAb)之製造 抗原物質之製造
抗原物質使用序列號碼1所示胺基酸序列所構成之胜肽及KLH之結合體。
抗原物質的調製中，首先，序列號碼1所示胺基酸序列所構成之胜肽藉由Fmoc胜肽固相合成法(製造裝置；ABI430型Applied Biosystems公司製)合成。進而，上述胜肽及KLH(SIGMA公司製)之結合體，係將5mg上述胜肽、約20mg KLH及30μg戊二醛(片山化學工業股份有限公司)於磷酸緩衝液(pH 8.0)中，室 溫下攪拌約6小時而合成。
融合瘤之製造 免疫
0.8mL之溶解於PBS之抗原物質溶液(抗原物質濃度：0.5mg/mL)與0.8mL弗氏完全佐劑(和光純藥股份有限公司製)混合，得到懸濁液(抗原濃度：0.25mg/mL)。接著，將0.2mL此懸濁液腹腔內投予至BALB/c小鼠中。進而，每2週投予同量之此懸濁液至小鼠中。再來，投予開始16週後，將0.2mL溶解於PBS之抗原溶液(抗原濃度：600~1000mg/mL)最終投予至小鼠腹腔內。而，投予時，進行眼底靜脈採血並藉由ELISA測定抗體價。最終投予4日後，進行全採血，將得到之血液進行離心分離(2000rpm，20分)，得到抗血清用於作為以下實驗之對照組抗血清。又，全採血後，從鼠中摘出脾臟，得到之脾細胞用於以下之細胞融合。
細胞融合
上述脾細胞及骨髓瘤細胞(P3X63-Ag.8.653)，以脾細胞：骨髓瘤細胞=10：1~10混合後進行離心分離(1500rpm，5分)。離心分離後，用抽氣器去除上清液，得到之細胞團塊中以1分鐘添加1mL 37℃之聚乙二醇4000(50% PBS溶液)成為混合液，此混合液於37℃靜置1分鐘後，以每30秒1mL加入37℃之IMDM培養液(計9 mL)後，離心分離(1500rpm，5分)。離心分離後，吸引去除上清液，適量添加37℃之含有15% FCS(JRH BIOSCIENCES製)之IMDM(GIBCO製)培養液。得到之懸濁液以每100mL進行分注至96孔培養盤，於37℃/5% CO2之培養箱中培養1日。接著添加100mL HAT培養液(將HAT粉末(HAT MEDIA SUPPLEMENT(x50)，SIGMA製)溶於10mL無血清IMDM培養液中，以含有10% FCS之IMDM培養液稀釋50倍者)，於37℃/5% CO2之培養箱中培養。每2~3日進行HAT培養液更換，10日後替換成HT培養液(將HT粉末(HT MEDIA SUPPLEMENT，SIGMA製)溶於10mL無血清IMDM培養液中，以含有10% FCS之IMDM培養液稀釋50倍者)，於37℃/5% CO2之培養箱中培養3日。之後，每2~3日進行培養液(HT培養液)更換。藉由顯微鏡確認細胞增殖後，回收培養上清液(約100mL)。使用此培養上清液，藉由抗體價測定來進行融合瘤之篩選。
融合瘤細胞之篩選 抗體價測定
將含有上述抗原物質(5mg)之緩衝液(Baicarbonate buffer：100mM NaHCO3-NaOH，pH 9.2~9.5，胜肽濃度：1μg/mL)以每1孔50μL添加至平底96孔盤中，於室溫靜置2小時進行塗覆。將盤以洗淨緩衝液(PBST)洗淨3次，以200~250μL/孔加入阻斷液(3%脫脂奶1% BSA、PBS)，4℃反應一晝夜後，洗淨3次。接著，每孔加入融合瘤的培養上清液100μL，37℃反應4小時或4℃反應一晝夜。將盤洗淨3次後，以50μL/孔加入以稀釋緩衝液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.9%(W/V)NaCl、0.05%(W/V)Tween 20)稀釋10000倍之生物素標記之抗小鼠IgG(Biotion-labeled anti-mouse IgG，SIGMA)，室溫反應2小時。其後洗淨6次後，以50μL/孔加入以稀釋緩衝液稀釋1000倍之鹼性磷酸酶標記之鏈黴抗生物素蛋白(streptaridin)，室溫反應1~2小時。其後進行洗淨6次，以50μL/孔加入螢光基質緩衝液(Attophos substrate buffer，Roche-diagnostics公司製)後將盤避光使其發色。螢光強度以CytoFluor II(Perceptive公司製)測定。
融合瘤之篩選
於上述抗體價測定中顯示陽性結果的孔(1×105細胞/mL)中加入含有15% FCS 10% HCF(Hybridoma cloning factor，Origin公司製)之IMDM培養液，以成為約200細胞/孔之方式分注至96孔培養盤中，37℃ 5% CO2之培養箱中進行培養。接著，進行與上述相同之抗體價測定，選擇抗體生產量多之融合瘤。
進一步進行限數稀釋法，將選擇的融合瘤以含有15% FCS 10% HCF之IMDM培養液稀釋成為0.5~1細胞/孔，37℃/5% CO2之培養箱中培養3~4日後，進行與 上述相同之抗體價測定，選擇抗體生產量多之融合瘤。進而重覆限數稀釋法，得到產生針對上述抗原物質之單株抗體的融合瘤。在此之中，選擇抗體價最高之融合瘤命名為Mouse-Mouse Hybridoma SSV-C93-3。
單株抗體之取得
使用含有15% FCS之RPMI培養液培養融合瘤Mouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3(1×106細胞/mL)。接著，回收融合瘤之培養液，以過濾器過濾以去除死細胞碎片。接著，於培養上清液中以終濃度成為40%加入硫酸銨，40℃下攪拌1小時。接著，進行離心分離(3000g，30分，4℃)，捨棄上清液回收沉澱物，以上述培養上清液1/10量之PBS溶解此沉澱物，以PBS為外液透析一晚。
接著，以20mM之磷酸鈉緩衝液(pH 7.0)將上述沉澱物稀釋2倍，與1M Tris-HCl緩衝液同時，添加至HiTrapNHS活性化管柱中，進一步，以0.1M甘胺酸-HCl溶液(pH 2.7)將抗體溶出，以分液管(fraction tube)回收。
試驗1：SSVmAb之同型的鑑定
為了鑑定實施例1之單株抗體(SSVmAb)之同型，使用Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents(SIGMA)進行同型鑑定試驗。
結果如圖1所示，IgG1顯示最高值。
又，將小鼠IgG1(eBioscience公司)及實施例1之單株抗體(SSVmAb)以2-巰基乙醇還原，以SDS-PAGE處理時，任一者皆在同樣的位置(50 KD、25 KD)確認到相當於重鏈及輕鏈的條帶。另一方面，使用小鼠IgM(eBioscience公司)代替小鼠IgG1進行同樣的實驗時，並沒有確認出相同的條帶。
從圖1及SDS-PAGE之結果，確認了實施例1之單株抗體(SSVmAb)的同型為IgG1。
試驗2：確認SSVmAb之對於核心組蛋白的親和性
WO2006/025580號公報中報告有融合瘤16G9(寄存號碼FERM BP-10413)所產生的單株抗體(16G9mAb)，其可用於免疫抑制，作為與序列號碼1所示胺基酸序列所構成之胜肽相結合之抗H1單株抗體。
以WO2006/025580號公報中記載之抗體(16G9mAb)作為參考例1，與實施例1之單株抗體(SSVmAb)進行對於抗原親和性之比較。
作為抗原，選擇了參考例1(16G9mAb)之抗原組蛋白H1、及類似組蛋白H1抗原之核心組蛋白H2A、H2B、H3及H4。
組蛋白H1或核心組蛋白與SSVmAb之親和性以ELISA來決定。
將組蛋白H1、H2A、H2B、H3或H4塗覆於96孔微 盤，各組蛋白分別使用溶解100mM碳酸鈉緩衝液(pH 9.3)者。該盤以PBS-tween 20(0.05%)洗淨，3%脫脂奶與1% BSA阻斷1小時。將SSVmAb以5μg/mL添加於各孔中，放置1小時。以過氧化酶(HRP)conjugated anti mouse IgG1 Ab(SIGMA)檢測經結合之SSVmAb，放置1小時。使用ABTS〔2,2’-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-磺酸)〕基質溶液檢測經結合之SSVmAb，使用Multiskan Ascent(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA)測定405nm之吸光度。
結果，如圖2及圖3所示。
如圖2所示，實施例1(SSVmAb)中，比起對於組蛋白H1之親和性，對於組蛋白H2A、H2B、H3或H4之親和性較高。
另一方面，如圖3所示，參考例1(16G9)中，比起對於組蛋白H2A、H2B、H3或H4之親和性，對於組蛋白H1之親和性較高。
試驗例3：MLR試驗
使用來自無處理之DA大鼠的脾臟淋巴球(應答細胞)以及進行絲裂黴素C(協和發酵工業股份有線公司製)處理過之來自LEW大鼠的脾臟淋巴球(刺激細胞)。於10% FCS-RPMI培養液中將應答細胞調整成5×105細胞/mL，於10% FCS-RPMI培養液中將刺激細胞調整成8×106細胞/mL。將此應答細胞懸濁液及刺激細胞 懸濁液分別播種100μL至96孔圓底盤(Nunc Brand Products公司製)後，混合培養開始時添加參考例1之單株抗體16G9mAb(0.1、2、4或6μg/mL/孔)或實施例1之單株抗體SSVmAb(4μg/mL/孔)，37℃、5% CO2/95%空氣之條件下培養3.5日以上。又，添加免疫抑制劑他克莫司(tacrolimus)(FK506：藤澤藥品公司製，1nM/孔)作為陽性對照。進而，培養結束15小時前添加10μL之溴化去氧尿嘧啶(BrdU)，接著，使用BrdU標示及測試套組III(Roche Diagnostics公司製)，以細胞內DNA攝入之BrdU量作為指標，測定以免疫抑制物質處理過細胞之增殖能，作為免疫抑制程度的指標。
結果，如圖4所示。
實施例1(SSVmAb)中，比起表示參考例1(16G9mAb)及他克莫司(FK506)，BrdU量攝入之吸光度較低。特別是，實施例1(SSVmAb)之吸光度0.552±0.114(平均±S.E.)與相同添加量(4μg/mL/孔)之參考例1(16G9mAb)之吸光度1.351±0.389(平均±S.E.)相比，實施例1之平均值為參考例1的約41%之程度。
試驗例4：單株抗體(SSVmAb)對於T細胞之反應性的確認
藉由以下之手法，從C57BL/6小鼠(5週齡，雌，日本Charles River公司製)摘出脾臟，調製全脾臟細胞。
首先，於加入5mL RPMI 1640培養液(Sigma-Aldrich公司製之R-8758)之5mL培養皿(BD Bioscience公司製FALCON 351007)中，以解剖用剪刀及鑷子將脾臟好好分解後使脾臟細胞懸濁後，移至15mL離心管(BD Bioscience公司製FALCON 352096)中。接著於5mL培養皿上以磷酸緩衝鹽液(PBS，Invitrogen公司製20012-027)洗淨數次，將此等加至先前之細胞懸濁液靜置後，將上清液回收至別的15mL離心管中。進一步再添加5mL RPMI 1640培養液至不溶性脾臟組織殘渣中，靜置後僅回收上清液，將此與上述細胞懸濁液一起以1,500rpm、5分鐘進行離心分離。回收之細胞中加入2mL lysis buffer(150mM NH4Cl/15mM NaHCO3/0.1mM EDTA-Na2,pH 7.3)藉由輕敲溶血後，加入10mL PBS以1,500rpm、5分鐘離心洗淨3次後之細胞作為全脾臟細胞。
接著，以下列的方法為準，使用Pan T Cell Isolation Kit,mouse(Miltenyi Biotec公司製130-090-861)，藉由磁力分選(MACS)從脾臟細胞純化全T細胞。
首先，以MACS buffer(0.5% bovine serum albumin(BSA,Nacalai tesque公司製08777-36)/PBS)將脾臟細胞以5×107細胞/200μL之比例懸濁，添加50μL Biotin-antibody cocktail/5×107細胞，於4℃放置10分鐘。將此以150μL MACS buffer/5×107細胞懸濁後，添加100μL anti-biotin micro beads/5×107細胞，於4℃放置15分鐘。於此添加MACS buffer(10ml)後，以1500rpm、5分鐘離心洗淨後，以500μL MACS buffer將回收細胞懸濁。將MACS管柱(MS管柱，Miltenyi Biotec公司製130-042-201)設置於磁鐵(MiniMACS separation Unit，Miltenyi Biotec公司製130-090-312)上，以500μL MACS buffer將管柱平衡化後，供入上述之細胞懸濁液。回收500μL流過液(flow-through)部分及之後的以MACS buffer之管柱洗淨部分(1.5mL)作為純化未刺激T細胞(純度約97%)。
藉由流式細胞儀(FACS)解析上述之未刺激與16G9 mAb或SSV mAb的反應性。
首先，將各T細胞樣本(1×106細胞)以89μL之FACS buffer(0.5% FBS/PBS/0.02% NaN3)懸濁後，加入1μg之anti-mouse CD16/32-blocks Fc binding(eBioscience公司製14-0161-85)，於4℃放置20分鐘。於此加入10μL 16G9 mAb或SSV mAb(100μg/mL)作為一次抗體，於4℃放置60分鐘。以FACS buffer將細胞離心洗淨2次後，加入100μL2次抗體(Biotin-conjugated rat anti-mouse IgM mAb(eBioscience公司製13-5780-85)或Biotin-conjugated rat anti-mouse IgG1 mAb(BD Biosciences公司製553441)，各1μg/mL)，於4℃放置30分鐘。再次以FACS buffer將細胞離心洗淨2次後，加入100μL Streptavidin-PE-Cy7(BD Biosciences公司製556463，1μg/mL)，以終濃度成為1 μg/mL於此添加FITC-conjugated rat anti-mouse CD3 mAb(BD Biosciences公司製553062)，於4℃放置30分鐘。以FACS buffer將細胞離心洗淨2次以及以40μm細胞篩(cell strainer)(BD Bioscience公司製FALCON 352340)濾過處理後，將各樣本供至FACSCalibur流式細胞儀及CellQuest軟體(BD Biosciences公司製)解析16G9 mAb或SSV mAb陽性/CD3陽性T細胞數。
結果，如圖5所示。
參考例1(16G9 mAb)及實施例1(SSV mAb)相比較，對於CD3陽性T細胞之反應性沒有顯著差異，此等抗體顯示同等之反應性(studentt-test，p<0.05)。
試驗例5：因SSV mAb而調降之目標之特定
藉由蛋白質體分析(Proteomic analysis)鑑定出7種因實施例1(SSV mAb)而調降之候補蛋白質。
接著，於7種候補蛋白質中，藉由以下手法確認了ATP合成酵素為實施例1(SSV mAb)之目標抗原。
首先，使用ThermoFisher公司之Accell siRNA套組，取得粒腺體ATP合成酵素被減弱(knockdown)之來自Balb/c小鼠之T細胞。
接下來，以試驗例2之手法為準，使用得到之T細胞，以實施例1(SSV mAb)作為試驗物質進行MLR試驗。
此處，使用同型IgG1(eBioscience公司製)作為對 照試藥。又，作為對照組，使用粒腺體ATP合成酵素未被減弱之來自小鼠之T細胞進行同樣的試驗。
結果，如圖6A及B所示。
如圖6A所記載，ATP合成酵素未被減弱時，與同型IgG1相比，實施例1(SSV mAb)顯著地阻礙細胞增殖。
另一方面，如圖6B所記載，當ATP合成酵素被減弱時，關於細胞增殖之阻礙，實施例1(SSV mAb)與同型IgG1之間並未有顯著差異。
圖6A及B中，教示藉由ATP合成酵素之減弱SSV mAb之免疫抑制活性降低，而SSV mAb於免疫抑制之際，ATP合成酵素活性被調降。
試驗例6：SSV mAb之輕鏈及重鏈之變異區序列之鑑定融合瘤cDNA之合成
使用FastPure RNA kit(TaKaRa公司製)，從試驗例1所取得之1.6×107融合瘤(Mouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3)細胞調製全RNA。使用Poly(A)+ Isolation Kit from Total RNA(NIPPON GENE公司製)，從240μg全RNA調製mRNA。使用Etachinmate(NIPPON GENE公司製)進行乙醇沉澱，使mRNA沉澱。以75%乙醇洗淨後，乾燥mRNA。於此加入10μL之無RNase水溶解mRNA。得到的mRNA溶液保存在-80℃。使用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司製)，由1μg之SSV融合瘤mRNA合成5’-RACE用的cDNA。得到 的cDNA溶液保存在-20℃。
SSV mAb之輕鏈及重鏈之互補決定區(CDR)之鑑定
基於小鼠IgG1重鏈恆定區的鹼基序列，製作引子5’-CAC CAT GGA GTT AGT TTG GGC AGC AG-3’(序列號碼12)。基於小鼠輕鏈κ恆定區的鹼基序列，製作引子5’-CAC GAC TGA GGC ACC TCC AGA TG-3’(序列號碼13)。使用各自的引子與Universal Primer A Mix(SMARTer RACE cDNA Amplification Kit附屬引子)，以cDNA作為模板進行5’-RACE。RACE反應使用Advantage2 PCR Kit(Clontech公司製)。將反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit(OMEGA bio-tek公司製)從凝膠純化約600bp之重鏈5’-RACE產物及約550bp之輕鏈5’-RACE產物。將此與pGEM-T Easy Vector(Promega公司製)相連結，並將Competent high E.coli DH5α(TOYOBO公司製)轉形。使用E.Z.N.A Plasmid Miniprep Kit I(OMEGA bio-tek公司製)，從得到之轉形體調製質體。調製後的質體作為模板，使用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems公司製)進行循環反應。
其次，使用DNA序列測定儀(Applied Biosystems製造)，解析輕鏈以及重鏈變異區的鹼基序列。
其結果為，輕鏈變異區之鹼基序列為序列號碼5之第 67號~第384號所表示者。
又，重鏈變異區之鹼基序列為序列號碼10之第58號~第423號所表示者。
基於轉譯開始密碼子以及藉由Kabat等人的方法決定之FR(恆定區)1的位置，推定序列號碼5之第1號~第66號為輕鏈訊息胜肽的鹼基序列，以及序列號碼10之第1號~第57號為重鏈訊息胜肽的鹼基序列。
其次，從得到之鹼基序列推定輕鏈和重鏈變異區的胺基酸序列，依照Kabat等人之方法鑑定其CDR區域。
其結果，輕鏈變異區之胺基酸序列為序列號碼6之第23號~第128號所表示者。於此，序列號碼6之第1號~第22號為輕鏈訊息胜肽的胺基酸序列。
又，輕鏈變異區之胺基酸序列中，確認CDR1為以RASSSVSYMH(序列號碼2)所表示，CDR2為以ATSNLAS(序列號碼3)所表示，CDR3為以QQWSSNPWT(序列號碼4)所表示。
又，重鏈變異區之胺基酸序列為序列號碼11之第20號~第141號所表示者。於此，序列號碼11之第1號~第19號為重鏈訊息胜肽的胺基酸序列。
又，重鏈變異區之胺基酸序列中，確認CDR1為以GYNMN(序列號碼7)所表示，CDR2為以NINPYYGSTSYNQKFKG(序列號碼8)所表示，CDR3為以SPYYSNYWRYFDY(序列號碼9)所表示。
試驗例7：敗血症治療作用之評估
BALB/c小鼠(實驗開始時體重20g-30g，n=6)在SPF、恆溫恆濕(22±1度，55±5%)下，於塑膠製籠內在12小時明暗循環的條件下飼養。飼料和水為自由攝取。以一般使用之脂多醣(LPS)誘發致死敗血症作為實驗敗血症模式，其藉由腹腔內投予40mg/kg LPS誘發。於腹腔內LPS投予30分鐘前、LPS投予6小時後、12小時後計3次，以100μg/次之SSV mAb量投予溶解於生理食鹽水中之SSV mAb至腹腔內。其後調查動物個體之生存情形。對照組是以同樣之方式投予代替SSV mAb之溶解於生理食鹽水之IgG(SIGMA公司製)。
其結果表示在圖7。LPS投予(誘導敗血症)之後70個小時之生存率，相對於對照組(IgG)之20%(累積生存比例0.2)，SSV mAb投予組為70%(累積生存比例0.7)。LPS投予(誘導敗血症)之後70個小時之生存率，SSV mAb投予組(SSV)為對照組(IgG)之約3.5倍，SSV mAb投予組為顯著地較高(p<0.05)。
試驗例8：發炎疾病治療作用之評估 8-1
BALB/c小鼠(實驗開始時體重20g-30g，n=10)在SPF、恆溫恆濕(22±1度，55±5%)下，於塑膠製籠內在12小時明暗循環的條件下飼養。飼料和水為自由攝取。 接著，藉由進行腹腔內投予40mg/kg LPS至小鼠，誘發與試驗例7同樣的脂多醣(LPS)誘發致死敗血症作為發炎疾病。於腹腔內LPS投予30分鐘前，LPS投予6小時後、12小時後計3次，以100μg/次之SSV mAb量投予溶解於生理食鹽水中之SSV mAb至腹腔內。其後調查動物個體之生存情形。對照組是以同樣之方式投予代替SSV mAb之溶解於生理食鹽水之IgG(SIGMA公司製)。
其結果表示在圖8。LPS投予(誘導敗血症)之後24個小時之生存率，相對於對照組(IgG)之20%，SSV mAb投予組為70%。LPS投予(誘導發炎)之後70個小時之生存率，SSV mAb投予組(SSV)為對照組(IgG)之約3.5倍，SSV mAb投予組為顯著地較高(p<0.05)。
8-2：血清及發炎組織中之組蛋白濃度測定
在試驗例8中，對照組及SSV mAb投予組中，以長谷川等(Surg Res.2012 May 1；174(1)：136-41)進行之方法為準，在全身麻醉下取得從心臟中來的血液或肺組織。得到之樣本使用ELISA法以市面販售之測定套組來測定組蛋白H1、組蛋白H3及H4的濃度。
組蛋白H1濃度測定之結果，如圖9A(來自血液之血清)及圖9B(肺組織)所示。
SSV mAb投予組之血液樣本中之組蛋白H1濃度，於試驗中無增加幾乎維持一定。另一方面，對照組之血液樣 本中之組蛋白H1濃度，於試驗期間確認有增減。
又，確認了發炎組織(肺)之組蛋白H1濃度，在SSV mAb投予組，較對照組有顯著地降低。
組蛋白H3濃度測定之結果，如圖10A(來自血液之血清)及圖10B(肺組織)所示。
確認了血液樣本及發炎組織(肺)之組蛋白H3濃度，在SSV mAb投予組，較對照組有降低之傾向。
組蛋白H4濃度測定之結果，如圖11A(來自血液之血清)及圖11B(肺組織)所示。
確認了血液樣本及發炎組織(肺)之組蛋白H3濃度，在SSV mAb投予組，較對照組有降低之傾向。
試驗結束後，藉由與試驗例2同樣之手法，以ELISA，進行SSV mAb與組蛋白H1、組蛋白H3及組蛋白H4之結合試驗(binding assay)。
其結果，確認了SSV mAb在體外(in vitro)與組蛋白H1、組蛋白H3及組蛋白H4有結合能。
8-3：肺組織之染色試驗
試驗例8結束後，分別從對照組及SSV mAb投予組之大鼠取得肺組織切片，以長谷川等(Surg Res.2012 May 1；174(1)：136-41.)進行之方法為準，使用蘇木精．伊紅染色液(和光純藥製)染色。接著，將得到之樣本拍攝顯微鏡照片。
健康大鼠以同樣的方式，拍攝肺組織切片之照片以作 為參考。
其結果，如圖12A~C所示。
圖12A(健康大鼠)及圖12B(SSVmAb投予組)，未觀察到肺中的發炎。另一方面，圖12C(對照組)，確認了肺有發炎。
8-4：鬱血、浮腫、發炎及出血之評估
試驗例8結束後，以Murakami等之手法為準(Shock,18(2002),p.236)，評估鬱血、浮腫、發炎及出血分數。具體而言，以顯微鏡24視野之擴大像作為觀測對象。之後，將SSV mAb投予組及對照組之鬱血、浮腫及發炎之惡化度，以分數0~4分5等級(4為惡化度最高)來評估。
其結果，如圖13所示(分數之平均值±標準差)。
不論是鬱血、浮腫、發炎及出血，在SSV mAb投予組皆顯示較對照組顯著低之值。
8-5：發炎相關細胞介素之測定
試驗例8中，對照組及SSV mAb投予組中，每3小時從靜脈取得血清。接著，得到之樣本使用ELISA法以市面販售之測定套組來測定發炎性細胞介素(TNF-α、IL-1β、IL-6)、及抑制性細胞介素(IL-10)的濃度。
其結果，如圖14A~D所示。
如圖14A~C所示，關於發炎性細胞介素TNF-α、IL-1β及IL-6，SSV mAb投予組之值與對照組比較，有顯著地低下。
另一方面，如圖14D所示，關於抑制性細胞介素IL-10，SSV mAb投予組之值與對照組比較，有顯著地上升。
由上述結果亦確認了，SSV mAb投予組比對照組能抑制發炎。
試驗例9：確認對於腎缺血再灌流傷害所致之急性腎衰竭的治療效果之試驗1
對於Wistar雄性大鼠(n=4)，全身麻醉下摘出右腎後，左腎以血管夾作成缺血再灌流模式。接著，於SSV mAb投予組，在作成模式30分鐘前及再灌流後立刻投予10mg/kg SSV mAb。又，對照組是以同樣之方式投予代替SSV mAb之IgG(SIGMA公司製)。其後，於作成模式24小時後測定血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Cr)來評估腎障礙的等級。又，試驗結束後進行大鼠之解剖檢驗，進行組織學的評估。
結果，如表1所示。
比起對照組，於SSV mAb投予組中之BUN及Cr的值顯著地較低。又，進行腎臟的組織學評估，SSV mAb投予組比起對照組狀態較良好。
試驗例10：確認對於腎缺血再灌流傷害所致之急性腎衰竭的治療效果之試驗2
使用Wistar系雄性大鼠(n=4~6)，除於SSV mAb投予組中，在作成模式30分鐘前及再灌流6小時後投予10mg/kg SSV mAb以外，與試驗例10同樣進行試驗。
又，對照是以同樣之方式投予代替SSV mAb之IgG(SIGMA公司製)。其後，於作成模式24小時後測定血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Cr)濃度來評估腎障礙的等級。又，試驗結束後進行大鼠之解剖檢驗，進行組織學的評估。
結果，如表2所示。
比起對照組，於SSV mAb投予組中之BUN及Cr的值顯著地較低。又，進行腎臟的組織學評估，SSV mAb投予組比起對照組狀態較良好。
[生物材料寄存]
本發明之融合瘤Mouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3，原寄存日為2010年8月17日，寄存於獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物寄存中心(地址：日本國千葉縣木更津市Kazusa鐮足2-5-8生物技術本部)，寄存編號為NITE BP-972。又，本發明之融合瘤已於民國100年11月7日寄存於國內之食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 960431。
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Claims (18)

  1. 一種發炎疾病治療劑，其係包含單株抗體或其抗原結合片段所成，該單株抗體或其抗原結合片段係與：由SSVLYGGPPSAA(序列號碼1)所示胺基酸序列所構成之胜肽、或該胜肽與藥學上可容許的載體之結合體相結合。
  2. 如申請專利範圍第1項之治療劑，其中前述發炎疾病係組蛋白之相關者。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之治療劑，其中前述發炎疾病係急性發炎疾病。
  4. 如申請專利範圍第1~3項中任一項之治療劑，其中前述發炎疾病係自敗血症、腎缺血再灌流傷害及腎衰竭所選者。
  5. 如申請專利範圍第1~4項中任一項之治療劑，其中前述發炎疾病係敗血症。
  6. 如申請專利範圍第1~5項中任一項之治療劑，其係與組蛋白H1、組蛋白H3及組蛋白H4相結合。
  7. 如申請專利範圍第1~6項中任一項之敗血症治療劑，其係包含輕鏈變異區所成，該輕鏈變異區包含RASSSVSYMH(序列號碼2)所示胺基酸序列所構成之CDR1、ATSNLAS(序列號碼3)所示胺基酸序列所構成之CDR2、以及QQWSSNPWT(序列號碼4)所示胺基酸序列所構成之CDR3所成。
  8. 如申請專利範圍第1~7項中任一項之治療劑，其中前述單株抗體或其抗原結合片段之輕鏈變異區係包含序列 號碼6之第23~128號所示胺基酸序列所成。
  9. 如申請專利範圍第1~8項中任一項之治療劑，其係包含重鏈變異區所成，該重鏈變異區包含GYNMN(序列號碼7)所示胺基酸序列所構成之CDR1、NINPYYGSTSYNQKFKG(序列號碼8)所示胺基酸序列所構成之CDR2、以及SPYYSNYWRYFDY(序列號碼9)所示胺基酸序列所構成之CDR3所成。
  10. 如申請專利範圍第1~9項中任一項之治療劑，其中前述單株抗體或其抗原結合片段之重鏈變異區係包含序列號碼11之第20~141號所示胺基酸序列所成。
  11. 如申請專利範圍第1~10項中任一項之治療劑，其中前述單株抗體或其抗原結合片段係針對前述胜肽或胜肽與藥學上可容許的載體者。
  12. 如申請專利範圍第1~11項中任一項之治療劑，其中前述藥學上可容許的載體係鑰孔蟲戚血藍蛋白(Keyhole limpet hemocyanin)、卵白蛋白或牛血清白蛋白。
  13. 如申請專利範圍第1~12項中任一項之治療劑，其中前述單株抗體或其抗原結合片段係可調降ATP合成酶活性。
  14. 如申請專利範圍第1~13項中任一項之治療劑，其中前述單株抗體係嵌合體、人源化或人類抗體。
  15. 如申請專利範圍第1~14項中任一項之治療劑，其中前述單株抗體係融合瘤Mouse-Mouse hybridoma SSV- C93-3所產生。
  16. 如申請專利範圍第1~15項中任一項之治療劑，其中前述抗原結合片段係Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv或scFv。
  17. 一種發炎疾病之治療方法，其係包含投予如申請專利範圍第1~16項中任一項之單株抗體或其抗原結合片段之有效量至受驗者所成。
  18. 一種如申請專利範圍第1~16項中任一項之單株抗體或其抗原結合片段之用途，其係使用於發炎疾病治療劑之製造。
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