KR102159412B1

KR102159412B1 - 염증 질환 치료제

Info

Publication number: KR102159412B1
Application number: KR1020147024978A
Authority: KR
Inventors: 수지 사토; 타케시 고토; 나오야 오모리; 쿠에첸 시앙; 야요이 시마다; 마사푸미 이노마타; 토루 쿠사노; 타카히로 히라츠카; 타카유키 노구치; 사토시 하기와라
Original assignee: 조사이 유니버시티 코포레이션
Priority date: 2012-02-22
Filing date: 2013-02-22
Publication date: 2020-09-23
Also published as: JP2015117181A; EP2815763B1; IN2014DN07875A; CN104379165A; TWI605059B; KR20140138699A; CN104379165B; WO2013125687A1; TW201350502A; US20150079090A1; US20170096478A1; EP2815763A4; EP2815763A1

Abstract

본 발명은 SSVLTGGPPSAA(서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 또는 상기 펩티드와 약학상 허용 가능한 담체의 결합체와 결합하는 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함해서 이루어지는 히스톤이 관여하는 염증 치료제에 관한 것이다.

Description

염증 질환 치료제{THERAPEUTIC AGENT FOR INFLAMMATORY DISEASE}

본 특허출원은 앞서 출원된 일본에서의 특허출원인 특원 2012-35965호(출원일: 2012년 2월 22일)에 기초해서 우선권 주장을 따르고 있다. 이러한 앞선 특허출원에 있어서의 전체 개시 내용은 인용됨으로써 본 명세서의 일부가 된다.

본 발명은 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편을 유효 성분으로 하는 신규한 염증 질환 치료제에 관한 것이다.

최근, 손상 관련 분자 패턴 분자군(DAMPs: Damage-associated molecular pattern molecules)으로서 핵 내의 구성 성분인 히스톤이 보고되고 있다. 이러한 손상 관련 분자 패턴 분자군은 장기 상해 등의 염증 질환의 원인으로서 주목을 모으고 있다.

한편, 패혈증은 감염증, 간경변, 신부전, 당뇨병, 이상 분만과 같은 질병이나, 유치카테터, 수액 기구, 투석, 기관 절개와 같은 상처나 병에 대한 치료가 원인이 되어서 세균 감염점으로부터 끊어지거나 단속적으로 세균이 혈액에 침입해 오는 중증 전신성 감염증이다. 또한, 패혈증은 많은 미생물에 의한 숙주의 침습에 한정되지 않고, 감염증의 임상적 증상, 즉 (1) 체온>38℃ 또는 <36℃; (2) 심박수>90박/분; (3) 호흡수>20호흡/분 또는 ㎩CO₂<32 ㎜Hg; (4) 백혈구수>12000/㎕, <4000/㎕, 내지 간상핵호중구>10% 중 2항목 이상을 만족하는 병태를 정의하고 있다. 최근에서는 이러한 증상을 나타내는 병태는 전신성 염증 반응 증후군(Systemic inflammatory response symdrome: SIRS)이라 불리어진다(비특허문헌 1: Crit. Care Med., 20:864-874, 1992). 또한, 패혈증은 장기 기능 장해, 저관류 또는 저혈압을 합병해서 중증 패혈증, 젖산성 아시도시스, 핍뇨, 의식 장해를 합병하는 패혈증성 쇼크 등도 포함한다(비특허문헌 2: Chest, 101:1644-1655, 1992). 그리고, 병태는 중증 패혈증, 패혈증 쇼크로부터 종양성 혈관내 응고 증후군(DIC), 성인 호흡 궁박 증후군(ARDS), 다장기 기능 장해(MODS)를 초래한다.

이러한 패혈증의 원인균으로서는 포도상 구균, 연쇄상 구균, 대장균, 녹농균, 클렙시엘라, 엔테로박터 등이 주로 확인되고 있다. 이들 세균 감염에 따라 고열, 오한, 빈맥, 강한 전신 증상을 나타내고, 종종 동·정맥혈, 척수액, 골수액에 감염균이 확인된다.

최근에는, 각종 강력한 항생 물질의 개발에 의해 이들 균을 원인으로 한 패혈증은 적어지고 있지만, MRSA를 대표로 하는 내성 유전자를 획득한 새로운 병원균에 의한 패혈증이 증가하고 있다. 또한, 유치카테터나 수액 기구를 사용한 처치, 또는 인공 투석, 기관 절개 등의 침습적 처치·수술의 범용을 반영하여 패혈증의 발생은 큰 병원일수록 증가 경향이 있다. 또한, 감염에 대해서 저항력이 낮은 신생아, 고령자, 조혈기 종양 환자에서의 발증 빈도, 및 부신 피질 호르몬이나 항암제를 투여하여 면역력이 저하한 환자에서의 패혈증의 발증 빈도가 증가하고 있다. 이러한 점에서 패혈증은 의료의 진보와는 반대로 계속 증가하고 있다.

이러한 패혈증의 예방·치료방법으로서 현재는 원인균을 속출하여 그 항생 물질 감수성을 측정하고, 기인균에 대해서 최적인 항생 물질을 투여함과 동시에 보액, 전해질 보정, 저단백혈증의 개선, 영양의 보급, γ-글로불린의 투여와 같이 숙주의 방위력에 노력하는 방법 등이 알려져 있다. 또한, 불행하게 쇼크에 빠진 경우는 외과 수술에 의한 병의 제거, 순환 장해의 개선, 옵소닌 활성화 물질의 투여, 부신 피질 호르몬의 투여, 합성 프로테아제 저해제의 투여와 같은 처치가 이루어지고 있다. 그러나, 기초 질환의 증상과 패혈증의 증상이 오버랩되기 때문에, 명확한 진단이 어려워 패혈증의 예방·치료에 곤란을 초래하는 경우도 자주 보인다. 또한, 패혈증성 쇼크 등에 빠진 경우는 그 예방·치료는 곤란하고, 패혈증은 현재에 있어서도 높은 사망률을 초래하는 질환이다.

패혈증의 사망률은 10%~20%대로부터 50%까지 보고에 따라 다르다. 패혈증 쇼크는 패혈증 예의 40%로 합병되고, 쇼크예의 예후는 좋지 않아 77%~90%의 사망률의 보고도 있다. 그래서, 패혈증성 쇼크의 예방이 치료의 제1목표가 되고, 특히 쇼크의 초기 단계에 일어나는 변화를 파악하여 조기 진단이 가능하면 조기 치료가 가능해져 예후의 개선이 기대될 수 있다. 그러나 지금까지, 흔히 유효하다고 생각되는 항쇼크약이나 치료법의 임상 효과가 검토되었지만, 거기에서 유효하다고 판정되는 것은 거의 없었다.

패혈증은 감염 자극(균 자체, 엔도톡신이나 펩티도글리칸/테이코산 복합체의 세포벽 성분 및 외독소 등)에 의해 단구, 대식 세포, 혈관 내피 세포 등으로부터 과잉으로 생산되는 종양 괴사 인자(TNF), 인터류킨 1(IL-1), 인터류킨 6(IL-6) 및 인터류킨 8(IL-8) 등의 염증성 사이토카인이 원인으로 발증한다고 생각될 수 있었다. 과잉으로 생산된 염증성 사이토카인에 의해 아이코사노이드나 혈소판 활성화 인자의 지질 매개체도 방출되고, 그들의 상호 작용에 의해 사이토카인 네트워크가 활성화되어서 염증 반응이 증폭된다. 이 과정 중에서 보체계, 응고계, 키닌계, 부신 피질 자극 호르몬/엔도르핀계도 활성화되어 혈관 내피 장해를 기초 병태로 하는 전신성의 염증 반응이 야기된다. 특히 순환 장해나 조직 장해의 발현에는 과립구 유래의 엘라스타아제나 활성 산소의 관여를 나타내고 있다.

그 때문에 염증성 사이토카인을 저해하는 물질의 투여 등으로 대표되는 염증성 사이토카인 억제 요법의 임상 치험이 다양하게 행해질 수 있다. 그러나 그것들은 전부 실패로 끝나고 있다(비특허문헌 3: Lancet, 351:929-933, 1998, JAMA, 271:1836-1843, 1994).

이러한 다양한 치료방법이 검토되고 있음에도 불구하고 패혈증의 사망률은 여전히 높은 상태이고, 효과적인 치료약도 거의 없다. 그 이유는 패혈증의 병태가 아직 완전하게는 이해되지 않는데 있다(비특허문헌 4: Nath. J. Med., 55:132-141, 1999).

또한, 부상 관련 분자 패턴 분자군이 관여하는 다른 염증 질환으로서 허혈 재관류 상해가 보고되고 있다. 또한, 신허혈 재관류 상해에 기인해서 자주 급성 신부전이 발생하는 것이 보고되고 있다. 그러나, 이러한 병태에 대한 효과적인 치료방법은 거의 없다.

따라서, 손상 관련 분자 패턴 분자군이 관여하는 염증 질환에 대한 뛰어난 치료제를 창출하는 것이 여전히 요구되고 있다.

Crit. CareMed., 20:864-874, 1992 Chest, 101:1644-1655, 1992 Lancet, 351:929-933, 1998, JAMA, 271:1836-1843, 1994 Nath. J. Med., 55:132-141, 1999

본 발명자들은 이번 SSVLYGGPPSAA(서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 특이적으로 인식하는 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편이 히스톤이 관여하는 염증 질환에 대해서 뛰어난 치료 효과를 주는 것을 발견했다. 본 발명은 이러한 지견에 기초한 것이다.

따라서, 본 발명은 염증 질환에 대한 신규한 치료제의 제공을 목적으로 한다.

그리고, 본 발명에 의하면 SSVLYGGPPSAA(서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 또는 상기 펩티드와 약학상 허용 가능한 담체의 결합체와 결합하는 모노클로널 항체 또는 항원 결합 단편을 포함해서 이루어지는 염증 질환 치료제가 제공된다.

본 발명의 모노클로널 항체 또는 항원 결합 단편에 의하면 염증 질환을 효과적으로 치료할 수 있다.

도 1은 본 발명의 모노클로널 항체(이하, "SSVmAb"라 칭함)의 이소타입의 확인 시험의 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 모노클로널 항체(SSVmAb)에 관해서 히스톤 H1, 히스톤 H2A, H2B, H3 또는 H4에의 결합 친화성을 비교한 시험의 결과를 나타낸다.
도 3은 참고예; 수탁번호 FERM BP-10413 하에 기탁된 하이브리도마 16G9의 생산되는 모노클로널 항체(이하, "16G9mAb"라 칭함)에 관해서 히스톤 H1, 히스톤 H2A, H2B, H3 또는 H4에의 결합 친화성을 비교한 시험의 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 모노클로널 항체(SSVmAb) 및 16G9mAb를 사용한 혼합 림프구 반응(MLR) 시험의 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 모노클로널 항체(SSVmAb) 및 16G9mAb의 T세포에 대한 반응성을 유동세포계수법에 의해 비교한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 모노클로널 항체(SSVmAb) 및 대조 시약(이소타입 IgG1)에 관한 ATP 합성 효소를 siRNA에 의해 녹다운하지 않은 비장 세포를 사용한 MLR 시험의 결과(A), 및 본 발명의 모노클로널 항체(SSVmAb) 및 대조 시약(이소타입 IgG1)에 관한 ATP 합성 효소를 siRNA에 의해 녹다운한 비장 세포를 사용한 MLR 시험의 결과(B)를 나타낸다.
도 7은 시험예 7에 있어서, 본 발명의 모노클로널 항체(SSVmAb) 및 패혈증 모델에 있어서의 동물의 생존율을 높인 것을 나타낸 도면이다.
도 8은 시험예 8에 있어서, 본 발명의 모노클로널 항체(SSVmAb)가 패혈증 모델에 있어서의 동물의 생존율을 높인 것을 나타낸 도면이다.
도 9는 시험예 8의 대조군 및 SSV mAb 투여군에 있어서 혈액 샘플(혈청) 중 그리고 폐 중의 히스톤 H1 농도를 측정한 결과를 나타낸다. 도 9의 A는 혈액 샘플 중의 히스톤 H1 농도의 그래프이다. 도 9의 B는 폐 중의 히스톤 H1 농도의 그래프이다.
도 10은 시험예 8의 대조군 및 SSV mAb 투여군에 있어서 혈액 샘플 중 그리고 폐 중의 히스톤 H3 농도를 측정한 결과를 나타낸다. 도 10의 A는 혈액 샘플 중의 히스톤 H3 농도의 그래프이다. 도 10의 B는 폐 중의 히스톤 H3 농도의 그래프이다.
도 11은 시험예 8의 대조군 및 SSV mAb 투여군에 있어서 혈액 샘플 중 그리고 폐 중의 히스톤 H4 농도를 측정한 결과를 나타낸다. 도 11의 A는 혈액 샘플 중의 히스톤 H4 농도의 그래프이다. 도 11의 B는 폐 중의 히스톤 H4 농도의 그래프이다.
도 12는 시험예 8의 시험 종료 후, 건강한 래트, 및 SSV mAb 투여군 및 대조군의 래트로부터 취득하여 염색한 폐 조직 절편의 현미경 사진이다. 도 12의 A는 건강한 래트의 사진이다. 도 12의 B는 SSV mAb 투여군의 사진이다. 도 12의 C는 대조군의 사진이다.
도 13은 시험예 8의 시험 종류 후, SSV mAb 투여군 및 대조군의 래트에 대해서 울혈, 부종, 염증 및 출혈에 관해서 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 시험예 8의 대조군 및 SSV mAb 투여군에 있어서 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6)과 억제성 사이토카인(IL-10)의 혈액 샘플 중 농도를 측정한 결과를 나타낸다. 도 14의 A는 혈액 샘플 중의 TNF-α 농도를 나타낸다. 도 14의 B는 혈액 샘플 중의 IL-1β 농도를 나타낸다. 도 14의 C는 혈액 샘플 중의 IL-6 농도를 나타낸다. 도 14의 D는 혈액 샘플 중의 IL-10 농도를 나타낸다.

기탁

본 발명의 하이브리도마 Mouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3은 원기탁일을 2010년 8월 17일로 하여, 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허 미생물기탁센터(주소: 일본 치바켄 키사라즈시 가마타리 2-5-8 바이오 테크놀로지 본부)에 있어서 수탁번호 NITE BP-972 하에 기탁되고 있다.

모노클로널 항체 및 하이브리도마

본 발명의 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편은 SSVLYGGPPSAA(서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 또는 상기 펩티드와 약학상 허용 가능한 담체의 결합체와 결합하는 것을 하나의 특징으로 하고 있다. 이러한 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편이 염증 질환에 대해서 뛰어난 치료 효과를 주는 것은 의외의 사실이다.

본 발명의 염증 질환은 바람직하게는 히스톤이 관여하는 염증 질환이고, 보다 바람직하게는 급성 염증 질환이며, 보다 바람직하게는 패혈증, 신허혈 재관류 상해 또는 신부전이고, 더욱 바람직하게는 패혈증, 신허혈 재관류 상해 또는 급성 신부전이며, 더욱 한층 바람직하게는 패혈증이다.

본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 상기 항체 또는 그 항원 결합 단편은 SSVLYGGPPSAA(서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 또는 상기 펩티드와 약학상 허용 가능한 담체에 대한 것이다.

또한, 본 발명의 하나의 태양에 의하면, 상기 항체 또는 그 항원 결합 단편은 히스톤 H1, 히스톤 H3 및 히스톤 H4에 특이적으로 결합하는 것이다. 이러한 결합능을 갖는 항체 또는 그 항원 결합 단편은 후술하는 실시예 중의 8-2에 나타내어지고, 염증 질환의 치료에 있어서 특히 유리하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 하나의 태양에 의하면, 상기 항체 또는 그 항원 결합 단편은 링커 히스톤(히스톤 H1)에 대한 결합 친화성보다 코어 히스톤에 대한 결합 친화성이 높다.

또한, 본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 코어 히스톤은 히스톤 H2A, H2B, H3 또는 H4이고, 보다 바람직하게는 H2A, H3 또는 H4이다.

또한, 본 발명의 항체 또는 그 항체 결합 단편은 중쇄 및/또는 경쇄를 포함할 수 있다. 각 경쇄 및 중쇄는 그 N-말단에 가변 영역을 가질 수 있고, 각 가변 영역에서는 4개의 프레임워크 영역(framework region)(FR)과 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 번갈아 포함해도 좋다. 가변 영역 중의 잔기는 Kabat 등에 의해서 생각된 계에 따라서 범용적으로 번호가 붙어있다.

이 계는 Kabat 등, 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Departement of Health and Human Services, NIH, USA에 기술되어 있다. 특별히 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 이 번호 붙임 체계가 사용된다. 이러한 Kabat 등의 방법에 기초한 번호 붙임은, 예를 들면 Web 사이트 http://www.bioinf.org.uk/abysis/tools/analyze.cgi를 사용해서 간이하게 행할 수 있다.

Kabat 잔기 명명법은 아미노산 잔기의 직선적 번호 붙임으로 반드시 직접 일치하지 않는다. 실제 직선적 아미노산 예는 기본 가변 영역 구조의 구조적 요소, 프레임워크 또는 CDR 중 어느 쪽이든 그 단축 또는 삽입에 대응해서 엄격한 Kabat 번호 붙임에 있어서 보다 적은 또는 추가 아미노산을 갖는 것이 있다. 잔기의 정확한 Kabat의 번호 붙임은 주어진 항체에 대해서 "표준적" Kabat 번호 붙여진 서열과 항체의 서열 중의 상동성 잔기를 정렬시킴으로써 결정될 것이다.

하나의 태양에 의하면, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 단편의 경쇄 가변 영역은 RASSSVSYMH(서열번호 2)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, ATSNLAS(서열번호 3)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 QQWSSNPWT(서열번호 4)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3를 포함해서 이루어진다. 더욱 바람직한 태양에 의하면, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 6의 제23번~제128번으로 표시되는 아미노산 서열을 포함해서 이루어진다.

또한, 다른 태양에 의하면, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역은 GYNMN(서열번호 7)으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, NINPYYGSTSYNQKFKG(서열번호 8)로 표시되는 아미노산 서열 예로 이루어지는 CDR2, 및 SPYYSNYWRYFDY(서열번호 9)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함해서 이루어진다. 더욱 바람직한 태양에 의하면, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 11의 제20번~제141번으로 표시되는 아미노산 서열을 포함해서 이루어진다.

또한, 본 발명에 의해 한층 바람직한 태양에 의하면, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 단편은 RASSSVSYMH(서열번호 2)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, ATSNLAS(서열번호 3)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 QQWSSNPWT(서열번호 4)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함해서 이루어지는 경쇄 가변 영역과 GYNMN(서열번호 7)으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, NINPYYGSTSYNQKFKG(서열번호 8)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 SPYYSNYWRYFDY(서열번호 9)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함해서 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함해서 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함해서 이루어진다.

또한, 본 발명의 보다 한층 바람직한 태양에 의하면, 본 발명의 항체 또는 그 항원 결합 단편은 서열번호 6의 제23번~제128번으로 표시되는 아미노산 서열을 포함해서 이루어지는 경쇄 가변 영역과 서열번호 11의 제20번~제141번으로 표시되는 아미노산 서열을 포함해서 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함해서 이루어진다.

또한, 본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 상기 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편은 ATP 합성 효소 활성을 하향 조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 보다 바람직한 태양에 의하면, 상기 ATP 합성 효소는 미토콘드리아의 ATP 합성 효소이다.

본 발명의 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편의 상기 결합 친화성 및 ATP 합성 효소 활성의 하향 조절 활성은, 예를 들면 본원 명세서의 시험예 2 및 4에 기재된 방법에 의해 확인된다.

또한, 본 발명의 모노클로널 항체는, 바람직하게는 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 완전 인간형 항체이다. 이들 항체는, 예를 들면 Morrison, S.L., Oi, V.T., "immunoglobulin genes" Academic Press(London), 260-274(1989), Roguska, M.L. 등, Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 969-973(1994), Tomizuka, K. 등, Functional expression and germline transmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice, Nature Genet., 16, 133-143(1997), Winter, G. 등, Making antibodies by phage display technology, Ann. Rev. Immunol., 12, 433-455(1994), Griffiths, A.D. 등, Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires, EMBO. J., 13, 3245-3260(1994) 등에 기재된 당해 기술 분야의 공지 기술에 기초해서 당업자가 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 상기 항원 결합 단편은 바람직하게는 Fab, Fab', (Fab')₂, Fv 또는 scFv이다.

또한, 본 발명의 다른 바람직한 태양에 의하면, 상기 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편은 하이브리도마는 Mouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3에 의해 생산되는 것이다.

본 발명의 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편, 및 하이브리도마는, 예를 들면 다음과 같이 해서 제조할 수 있다. 즉, 우선 본 발명의 하이브리도마는 SSVLYGGPPSAA(서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 또는 상기 펩티드와 약학상 허용 가능한 담체의 결합체를 민감 항원으로서 사용하고, 이 민감 항원에 의해 면역된 포유 동물의 형질 세포(면역 세포)를 포유 동물의 미엘로마 세포와 융합시켜 얻어진 하이브리도마를 클로닝하여 그 하이브리도마 중에서 선별함으로써 얻어질 수 있다. 그리고, 본 발명의 모노클로널 항체는 본 발명의 하이브리도마를 배양하고, 이것이 생산하는 항체를 회수함으로써 얻어질 수 있다.

포유 동물을 면역하는 방법으로서는 당해 기술 분야에 있어서의 일반적인 투여법을 사용할 수 있고, 구체적으로는 복강내 주사, 비장내 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 경구 투여, 경점막 투여, 경피 투여 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 복강내 주사, 비장내 주사이다. 민감 항원의 투여 간격은 민감 항원의 투여량 및 포유 동물의 종류 등에 따라서 적당하게 결정되지만, 예를 들면 1개월간으로 수회마다 할 수 있다.

면역되는 포유 동물은 특별히 한정되지 않지만, 세포 융합에 사용되는 미엘로마 세포와의 적합성 등을 고려해서 선택하는 것이 바람직하고, 예를 들면 마우스, 래트, 햄스터 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 마우스이다.

또한, 면역 세포로서는 바람직하게는 비장 세포를 사용한다.

본 발명에 사용되는 미엘로마 세포로서는, 예를 들면 P3(P3×63Ag.8. 653)(J.Immunol., 123, 1548, 1978), p3-U1(Current Top ics in Micro-biology and Immunology, 81, 1-7, 1978), NS-1(Eur. J. Immunol., 6, 511-519, 1976), MPC-11(Cell, 8, 405-415, 1976), Sp2/O-Ag14(Nature, 276, 269-270, 1978), FO(J. Immunol. Meth., 35, 1-21, 1980), S194(J. Exp. Med., 148, 313-323, 1978), 및 R210(Nature, 277, 131-133, 1979) 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 P3 또는 p3-U1이고, 보다 바람직하게는 P3이다.

면역 세포와 미엘로마 세포의 세포 융합은, 예를 들면 밀스테인 등(Milstein 등)의 방법(Methods Enzymol., 73, 3-46, 1981) 등에 준해서 행할 수 있다. 구체적으로는 세포 융합은, 예를 들면 융합 촉진제의 존재 하 배지 중에서 면역 세포와 미엘로마 세포를 혼합함으로써 실시될 수 있다. 그리고, 세포 융합에 있어서 적절한 배지를 첨가해서 원심 분리하는 조작을 반복해서 하이브리도마를 생성할 수 있다.

세포 융합에 사용되는 배지로서는, 예를 들면 RPMI-1640배지, MEM 배지 등의 세포 융합에 있어서 통상 사용되는 배지를 들 수 있다. 또한, 우태아 혈청(FBS) 등의 혈청 보액을 적절하게 병용할 수 있다.

또한, 세포 융합 온도는 바람직하게는 25~37℃이고, 보다 바람직하게는 30~37℃이다.

또한, 미엘로마 세포와 면역 세포의 혼합 비율은 바람직하게는 1:1~1:10 정도이다.

융합 촉진제로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 혈액 응집 바이러스(HVJ) 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 PEG이다. PEG의 분자량은 적절하게 선택할 수 있고, 예를 들면 평균 분자량 1,000~6,000 정도로 할 수 있다. 또한, 배지 중의 PEG의 농도는 바람직하게는 약 30~60%(W/V)이다.

또한, 소망에 의해 디메틸술폭시드 등의 보조제를 배지에 적절하게 첨가할 수 있다.

본 발명의 하이브리도마의 선택은 세포 융합에 의해 얻어지는 하이브리도마를, 예를 들면 HAT 배지 등의 통상의 선택 배지에서 배양하고, 통상의 한계 희석법을 사용하며, 예를 들면 SSVLYGGPPSAA(서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 또는 상기 펩티드와 약학상 허용 가능한 담체의 결합체에 대한 항체값 등을 지표로 해서 스크리닝함으로써 실시될 수 있다. HAT 배지에 의한 배양 기한은 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(미융합 세포)가 사멸하기에 충분한 시간이고, 통상 수일~수 주간으로 할 수 있다. 이렇게 해서 얻어지는 본 발명의 하이브리도마는 통상의 배지에서 계대 배양하는 것이 가능하고, 또한 액체 질소 중에서 장기 보존될 수 있다.

또한, 본 발명의 모노클로널 항체 또는 그 항체 결합 단편을 회수하는 방법으로서는, 예를 들면 하이브리도마를 통상적으로 사용되는 방법에 따라서 배양해서 그 배양 상청으로부터 모노클로널 항체 등을 얻는 방법, 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유 동물에 투여해서 증식시켜 그 복수로부터 모노클로널 항체 등을 얻는 방법 등을 들 수 있다. 여기에서, 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻기에 바람직하고, 한편 후자의 방법은 항체를 대량으로 생산하기에 바람직하다.

또한, 본 발명의 모노클로널 항체 또는 그 항체 결합 단편은 염석법, 겔여과법, 친화성 크로마토그래피 등의 방법에 의해 고순도로 정제될 수 있다.

본 발명의 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편은 상술한 바와 같이, 히스톤이 관여하는 염증 질환에 대한 뛰어난 치료 효과를 갖고 있다. 따라서, 본 발명의 다른 태양에 의하면, 염증 질환 치료제의 제조에 있어서의 본 발명의 모노클로널 항체의 사용이 제공된다. 또한, 상기 방법에서 염증 질환은 바람직하게는 히스톤이 관여하는 염증 질환이고, 보다 바람직하게는 급성 염증 질환이며, 보다 바람직하게는 패혈증, 신허혈 재관류 상해 또는 신부전이고, 더욱 바람직하게는 패혈증, 신허혈 재관류 상해 또는 급성 신부전이며, 더욱 한층 바람직하게는 패혈증이다. 또한, 본 발명의 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편은 그대로 사용해도 좋다. 따라서, 본 발명의 하나의 태양에 의하면, 본 발명의 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함해서 이루어지는 염증 질환 치료용의 의약 제제가 제공된다.

본 발명의 패혈증 치료제는, 예를 들면 본 발명의 모노클로널 항체를 주사용 생리 식염수, 주사용 증류수, 주사용 완충 용액 등에 용해해서 조제할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역 제어용 조성물에는 적당한 용제, 용해 보조제, 보존제, 안정제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 등장화제, 완충제, 부형제, 증점제, 착색제, 공지의 캐리어(각종 리포솜, 폴리아미노산 캐리어, 합성 고분자, 천연 고분자 등) 등을 함유시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 의하면, 유효량의 본 발명의 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편을 피험체에 투여하는 것을 포함해서 이루어지는 염증 질환의 치료방법이 제공된다. 여기에서, "치료"란 확립된 병태를 개선하는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 다른 태양에 의하면, 피험체의 염증 질환의 발생 리스크를 경감하는 방법으로서 유효량의 본 발명의 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편을 피험체에 투여하는 것을 포함해서 이루어지는 방법이 제공된다. 또한, 상기 방법에서 염증 질환은 바람직하게는 히스톤이 관여하는 염증 질환이고, 보다 바람직하게는 급성 염증 질환이며, 보다 바람직하게는 패혈증, 신허혈 재관류 상해 또는 신부전이고, 더욱 바람직하게는 패혈증, 신허혈 재관류 상해 또는 급성 신부전이며, 더욱 한층 바람직하게는 패혈증이다.

또한, 본 발명의 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합단은 현저한 면역 제어 작용을 줄 수 있다. 염증 질환 치료에 사용되는 상기 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합단이 면역 제어 작용도 생기게 하는 것은 의외의 사실이다. 따라서, 하나의 태양에 의하면, 본 발명의 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합단은 면역 제어제로서 사용된다.

또한, 하나의 태양에 의하면, 상기 피험체로서는 바람직하게는 포유 동물이고, 보다 바람직하게는 인간이다.

또한, 본 발명의 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편은 염증 질환에 사용되는 다른 약제와 조합해서 동시 또는 순차적으로 포유 동물에 투여해도 좋다.

또한, 본 발명의 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편은 전신적 또는 국소적으로 투여될 수 있고, 구체적인 투여방법으로서는 점적, 정맥내 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 경구 투여, 경점막 투여, 경피 투여 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 모노클로널 항체 또는 항원 결합 단편의 유효량은 특히 한정되지 않아 피험체의 종류, 성질, 성별, 연령, 증상 등에 따라서 당업자에 의해 적절하게 결정된다. 예를 들면, 이러한 유효량으로서는 0.05~40 ㎎/체중 ㎏/일, 바람직하게는 2~10 ㎎/체중 ㎏/일을 1회 또는 수회 등을 들 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 들어서 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 모노클로널 항체( SSVmAb )의 제조

항원 물질의 제조

항원 물질로서는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 및 KLH의 결합체를 사용했다.

항원 물질의 제조에 있어서는, 우선 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드는 Fmoc 펩티드 고상 합성법(제조 장치; ABI430형 어플라이 바이오시스템즈사 제품)에 의해 합성했다. 또한, 상기 펩티드 및 KLH(SIGMA사 제품)의 결합체는 상기 펩티드 5 ㎎, KLH 약 20 ㎎ 및 글루타르알데히드 30 ㎍(KATAYAMA CHEMICAL, LTD.)을 인산 완충액(pH 8.0) 중, 실온에서 약 6시간 교반해서 합성했다.

하이브리도마의 제조

면역

PBS 중에 항원 물질을 용해시킨 용액 0.8 ㎖(항원 물질 농도: 0.5 ㎎/㎖)와 프로인트 컴플리트 아쥬반트(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.8 ㎖를 혼합하여 현탁액(항원 농도: 0.25 ㎎/㎖)을 얻었다. 이어서, 이 현탁액 0.2 ㎖를 BALB/c 마우스에 복강내 투여했다. 또한, 이 현탁액을 2주간마다 같은 양으로 마우스에 투여했다. 그리고, 투여 개시로부터 16주간 후, PBS 중 항원을 용해시킨 용액 0.2 ㎖(항원 농도: 600~1000 ㎎/㎖)를 마우스 복강내에 최종 투여했다. 또한, 투여할 때에는 안저정맥으로부터 채혈을 행해서 ELISA에 의해 항체값을 측정했다. 최종 투여 4일 후, 전채혈을 행하고, 얻어진 혈액을 원심 분리(2000 rpm, 20분)하여 항혈청을 얻어서 이하의 실험의 컨트롤 항혈청으로서 사용했다. 또한, 전채혈 후, 래트로부터 비장을 적출하고, 얻어진 비장 세포를 이하의 세포 융합에 사용했다.

세포 융합

상기 비장 세포 및 미엘로마 세포(P3×63-Ag.8.653)를 비장 세포:미엘로마 세포=10:1~10에서 혼합해서 원심 분리(1500 rpm, 5분)했다. 원심 분리한 후, 흡이기를 사용해서 상청을 제거하고, 얻어진 세포 펠릿에 37℃의 폴리에틸렌글리콜 4000(50% PBS 용액) 1 ㎖를 1분간 걸쳐서 첨가해서 혼합액으로 했다. 이 혼합액을 37℃에서 1분간 정치한 후, 37℃의 IMDM 배지(총 9 ㎖)를 30초마다 1 ㎖씩 가한 후, 원심 분리(1500 rpm, 5분)했다. 원심 분리 후, 상청을 흡인 제거하고, 37℃의 15% FCS(JIRH BIOSCIENCES 제품) 함유 IMDM(GIBCO제) 배지를 적량 첨가했다. 얻어진 현탁액을 96웰 배양 플레이트에 100 ㎖씩 분주를 행하고, 37℃/5% CO₂ 인큐베이터에서 1일 배양했다. 또한, HAT 배지(HAT 분말(HAT MEDIA SUPPLEMENT(×50), SIGMA 제품)을 무혈청 IMDM 배지 10 ㎖에 용해하고, 10% FCS 함유 IMDM 배지에서 50배 희석한 것이다.)를 100 ㎖ 첨가하여 37℃/5% CO₂ 인큐베이터에서 배양했다. HAT 배지의 교환은 2~3일마다 행하고, 10일 후에는 HT 배지(HT 분말(HT MEDIA SUPPLEMENT, SIGMA 제품)를 무혈청 IMDM 배지 10 ㎖에 용해하고, 10% FCS 함유 IMDM 배지에서 50배 희석한 것이다.)로 전환하고, 3일간, 37℃/5% CO₂ 인큐베이터에서 배양을 행했다. 이후 2~3일마다 배지(HT 배지)의 교환을 행했다. 세포 증식을 현미경에 의해 확인한 후, 배양 상청(약 100 ㎖)을 회수했다. 이 배양 상청을 사용해서 항체값 측정에 의한 하이브리도마의 스크리닝을 행했다.

하이브리도마 세포의 스크리닝

항체값 측정

상기 항원 물질(5 ㎎)을 포함한 완충액(Baicarbonate 버퍼:100 mH NaHCO₃-NaOH, pH9.2~9.5, 펩티드 농도: 1 ㎍/㎖)을 1웰당 50 ㎕씩 96웰 평저 플레이트에 첨가하고, 실온에서 2시간 정치해서 코팅했다. 플레이트를 세정 버퍼(PBST)에서 3회 세정하고, 블로킹 버퍼(3% 스킴 밀크 1% BSA, PBS)를 200~250 ㎕/웰에서 첨가하고, 4℃에서 만 하루 반응시킨 후, 3회 세정했다. 그리고, 하이브리도마의 배양 상청을 100 ㎕/웰에서 첨가하고, 37℃에서 4시간 또는 4℃에서 만 하루 반응시켰다. 플레이트를 3회 세정한 후, 희석 버퍼(10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.9%(W/V) NaCl, 0.05%(W/V) Tween20)에서 10000배 희석한 비오틴 표식 항마우스 IgG(Biotion-labeled anti-mouse IgG, SIGMA)를 50 ㎕/웰에서 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. 그 후 6회 세정한 후, 희석 버퍼에서 1000배 희석한 알칼리포스파타아제 표식 스트렙타리딘(Streptaridin)을 50 ㎕/웰에서 첨가하고, 실온에서 1~2시간 반응시켰다. 그 후 6회 세정을 행하고, 형광 기질 버퍼(Attophos substrate 버퍼, Roche Diagnostics K.K. 제품)를 50 ㎕/웰 가해서 플레이트를 차광하여 발색시켰다. 형광 강도는 CytoFluorⅡ(Asramuse Company, Ltd. 제품)에서 측정했다.

하이브리도마의 선별

상기 항체값 측정에서 양성의 결과를 나타낸 웰(1×10⁵세포/㎖)에 15% FCS 10% HCF(Hybridoma cloning factor, Origin Co., Ltd. 제품) 함유 IMDM 배지를 가해서 약 200세포/웰이 되도록 96웰 배양 플레이트에 분주하여 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양을 행했다. 그리고, 상기와 마찬가지로 항체값 측정을 행하고, 항체 생성량이 많은 하이브리도마를 선택했다.

또한, 한계 희석을 행하고, 선택한 하이브리도마가 0.5~1세포/웰로 이루어지도록 15% FCS 10% HCF 함유 IMDM 배지에서 희석하여 37℃/5% CO₂ 인큐베이터에서 약 3~4시간 배양한 후, 상기와 마찬가지로 항체값 측정을 행하고, 항체 생성량이 많은 하이브리도마를 선택했다. 또한, 한계 희석을 반복하여 상기 항원 물질에 대한 모노클로널 항체를 생성하는 하이브리도마를 얻었다. 이 중, 항체값이 가장 높은 하이브리도마를 선택해서 Mouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3으로 명명했다.

모노클로널 항체의 취득

하이브리도마 Mouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3DMS 15% FCS 함유 RPMI 배지를 사용해서 배양했다(1×10⁶세포/㎖). 이어서, 하이브리도마 배양액을 회수하여 죽은 세포편을 제거하기 위해 필터에서 여과했다. 이어서, 최종 농도 40%가 되도록 배양 상청에 황산 암모늄을 가해 40℃에서 1시간 교반했다. 이어서, 원심 분리(3000 g, 30분, 4℃)를 행하고, 상청을 버려 침전을 회수했다. 이 침전을 상기 배양 상청의 1/10량의 PBS에 용해하여 PBS를 외액으로서 밤새 투석했다.

이어서, 상기 침전을 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.0)에서 2배 희석하고, 1M 트리스-HCl 완충액과 함께 HiTrapNHS 활성화 칼럼에 첨가했다. 또한, 0.1M 글리신-HCl 용액(pH 2.7)에서 항체를 용출하여 프랙션 튜브로 회수했다.

시험예 1: SSVmAb 의 이소타입 의 확인

실시예 1의 모노클로널 항체(SSVmAb)의 이소타입를 확인하기 위해서 Mouos Monoclonal Antibody Isotyping Reagents(시그마)를 사용한 이소타입 확인 시험을 행했다.

결과는 도 1에 나타낸 바와 같이, IgG1이 가장 높은 값을 나타냈다.

또한, 마우스 IgG1(eBioscience사) 및 실시예 1의 모노클로널 항체(SSVmAb)를 2-메르캅토에탄올에서 환원하고, SDS-PAGE에서 처리한 결과, 모두 같은 위치(50KD, 25KD)에 중쇄 및 경쇄에 상당하는 밴드가 확인되었다. 한편, 마우스 IgG1 대신 마우스 IgM(eBioscience사)을 사용해서 같은 실험을 행한 결과 같은 밴드가 확인되지 않았다.

도 1 및 SDS-PAGE의 결과로부터, 실시예 1의 모노클로널 항체(SSVmAb)의 이소타입는 IgG1인 것이 확인되었다.

시험예 2: SSVmAb 의 코어 히스톤에 대한 친화성의 확인

WO2006/025580호 공보에는 면역 제어에 사용될 수 있고, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드와 결합하는 항H1 모노클로널 항체로서 하이브리도마 16G9(수탁번호 FERM BP-10413)가 생성하는 모노클로널 항체(16G9mAb)가 보고되어 있다.

거기에서, WO2006/025580호 공보에 기재된 항체(16G9mAb)를 참고예 1로 하고, 실시예 1의 모노클로널 항체(SSVmAb)의 항원에 대한 친화성의 비교를 행했다.

항원으로서는 참고예 1(16G9mAb)의 항원인 히스톤 H1, 및 히스톤 H1 유사 항원인 코어 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4를 선택했다.

히스톤 H1 또는 코어 히스톤과 SSVmAb의 친화성을 ELISA로 결정했다. 96웰 마이크로플레이트를 히스톤 H1, H2A, H2B, H3 또는 H4에서 코트했다. 각각의 히스톤은 100 mM 탄산 나트륨 완충액(pH 9.3)에 용해시킨 것을 사용했다. 그 플레이트를 PBS-tween20(0.05%)에서 세정하고, 3% 스킴 밀크와 1% BSA에서 1시간 블로킹했다. SSVmAb 5 ㎍/㎖를 각 웰에 첨가하고, 1시간 인큐베이터했다. 혼합한 SSVmAb를 과산화 효소(HRP) 컨쥬게이트 anti mouse IgG1 Ab(시그마)를 사용해서 검출하고, 1시간 인큐베이터했다. 결합한 SSVmAb를 ABTS[2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-술폰산)] 기질 용액을 사용해서 검출하고, Multiskan Ascent(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)를 사용해서 405 ㎚의 흡광도를 측정했다.

결과는 도 2 및 3에 나타낸 바와 같다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1(SSVmAb)에서는 히스톤 H1에 대한 친화성보다 히스톤 H2A, H2B, H3 또는 H4에 대한 친화성이 높았다.

한편, 도 3에 나타낸 바와 같이, 참고예 1(16G9)에서는 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4에 대한 친화성보다 히스톤 H1에 대한 친화성의 것이 높았다.

시험예 3: MLR 시험

무처리의 DA 래트 유래의 비장 림프구(응답 세포) 및 마이토마이신 C(교와 발효 공업 주식회사 제품) 처리를 행한 LEW 래트 유래의 비장 림프구(자극 세포)를 사용했다. 응답 세포는 10% FCS-RPMI 배지에서 5×10⁵세포/㎖로 조정하고, 자극 세포는 10% FCS-RPMI 배지에서 8×10⁶세포/㎖로 조정했다. 이 응답 세포 현탁액 및 자극 세포 현탁액을 각각 100 ㎕를 96웰 둥근 바닥 플레이트(Nunc Brand Products사 제품)에 파종한 후, 혼합 배양 개시시에 참고예 1의 모노클로널 항체 16G9mAb(0.1, 2, 4 또는 6 ㎍/㎖/웰) 또는 실시예 1의 모노클로널 항체 SSVmAb(4 ㎍/㎖/웰)를 첨가하여 37℃, 5% CO₂/95% air의 조건 하에서 3.5일 이상 배양했다. 또한, 양성 대조로서 면역 억제제 타크로리무스(FK506: Fujisawa Pharmaceutical Co.,Ltd 제품, 1 nM/웰)를 첨가했다. 또한, 배양 종료 15시간 전에 브로모데옥시우리딘(BrdU) 10 ㎕를 첨가했다. 그리고, BrdU 라벨링 & 디텍션 키트 Ⅲ(Roche Diagnostics K.K. 제품)을 사용해서 세포내 DNA에 삽입된 BrdU 양을 지표로 해서 면역 억제 물질에 의해 처리된 세포의 증식능을 측정하여 면역 억제 레벨의 지표로 했다.

결과는 도 4에 나타낸 대로였다.

실시예 1(SSVmAb)에서는 BrdU 양 삽입을 나타낸 흡광도는 참고예 1(16G9mAb) 및 타크로리무스(FK506)의 그것보다 낮았다. 특히, 실시예 1(SSVmAb)의 흡광도 0.552±0.114(평균±S.E.)와 같은 첨가량(4 ㎍/㎖/웰)의 참고예 1(16G9mAb)의 흡광도 1.351±0.389(평균±S.E.)를 비교한 결과 실시예 1의 평균값은 참고예 1의 그것의 약 41% 정도였다.

시험예 4: 모노클로널 항체( SSVmAb ) T세포에 대한 반응성의 확인

이하의 방법에 의해, C57BL/6마우스(5주령, 암컷, Charles River Laboratories International, Inc. 제품)로부터 비장을 적출하여 전체 비장 세포를 조제했다.

우선, 5 ㎖의 RPMI1640 배지(Sigma-Aldrich사 제품 R-8758)를 넣은 5 ㎖ 배양 디쉬(BD Bioscience사 제품 FALCON 351007) 중에서 비장을 해부용 가위와 핀셋으로 잘 풀어서 비장 세포를 현탁 후, 15 ㎖ 원심 튜브(BD Bioscience사 제품 FALCON 352096)로 옮겼다. 이어서 5 ㎖ 디쉬 상을 인산 완충 식염수(PBS, Invitrogen사 제품 20012-027)에서 수회 세정하고, 이들도 상기 세포 현탁액에 가해서 정치 후, 상청을 별도로 15 ㎖ 원심 튜브에 회수했다. 또한, 나머지의 불용성 비장 조직에도 다시 RPMI1640 배지 5 ㎖를 가해서 정치 후 상청만을 회수하고, 이것과 상기 세포 현탁액을 합해서 1,500 rpm, 5분의 원심 분리를 행했다. 회수된 세포에 용균 버퍼(150 mM NH₄Cl/15 mM NaHCO₃/0.1 mM EDTA-Na₂, pH 7.3) 2 ㎖를 가해서 태핑에 의해 용혈 후, PBS 10 ㎖를 가해서 1,500 rpm, 5분에서 3회 원심 세정한 세포를 전체 비장 세포로 했다.

이어서, 이하에 기재된 방법에 준해서 본 비장 세포로부터 전체 T세포를 Pan T Cell Isolation Kit, mouse(Miltenyi Biotec사 제품 130-090-861)를 사용하여, 자기 소팅(MACS)에 의해 정제했다.

우선, 비장 세포를 MACS 버퍼(0.5% 소혈청 알부민(BSA, NACALAI TESQUE, INC. 제품 08777-36)/PBS)에서 5×10⁷세포/200 ㎕의 비율로 현탁하고, 50 ㎕ 비오틴 항체 칵테일/5×10⁷세포를 첨가해서 4℃, 10분 인큐베이터했다. 이것을 150 ㎕ MACS 버퍼/5×10⁷세포에 현탁 후, 100 ㎕ 항비오틴 마이크로 비즈/5×10⁷세포를 첨가해서 4℃, 15분 인큐베이터했다. 이것에 MACS 버퍼(10 ㎖)를 첨가해서 1500 rpm, 5분 원심 세정 후, 회수 세포를 MACS 버퍼 500 ㎕에 현탁했다. MACS 칼럼(MS 칼럼, Miltenyi Biotec사 제품 130-042-201)을 자석(MiniMACS 분리 장치, Miltenyi Biotec사 제품 130-090-312)으로 세트해서 500 ㎕ MACS 버퍼에서 칼럼을 평형화 후, 상술한 세포 현탁액을 제공했다. 그냥 흘러나온 분획 500 ㎕ 및 그 후의 MACS 버퍼에 의한 칼럼 세정 분획(1.5 ㎖)을 회수해서 정제 미자극 T세포로 했다(순도 약 97%).

상기 미자극과 16G9 mAb 또는 SSV mAb의 반응성을 플로우 사이토메트리(FACS)에 의해 분석했다.

우선, 각 T세포 샘플(1×10⁶세포)을 89 ㎕의 FACS 버퍼(0.5% FBS/PBS/0.02% NaN₃)에 현탁 후, 1 ㎍의 항마우스 CD16/32-blocks Fc binding(eBioscience사 제품 14-0161-85)를 첨가해서 4℃, 20분 인큐베이터했다. 이것에 1차 항체로서 16G9 mAb 또는 SSV mAb(100 ㎍/㎖) 10 ㎕를 첨가해서 4℃, 60분 인큐베이터했다. FACS 버퍼에서 세포를 2회 원심 세정 후, 2차 항체(Biotin-conjugated rat anti-mouse IgM mAb(eBioscience사 제품 13-5780-85) 또는 Biotin-conjugated rat anti-mouse IgG1 mAb(BD Biosciences사 제품 553441), 각 1 ㎍/㎖)을 100 ㎕ 첨가해서 4℃, 30분 인큐베이터했다. 다시 FACS 버퍼에서 세포를 2회 원심 세정 후, Streptavidin-PE-Cy7(BD Biosciences사 제품 556463, 1 ㎍/㎖)을 100 ㎕ 첨가하고, 이것에 FITC-conjugated rat anti-mouse CD3 mAb(BD Biosciences사 제품 553062)을 최종 농도 1 ㎍/㎖가 되도록 첨가해서 4℃, 30분 인큐베이터했다. FACS 버퍼에서 2회 원심 세정 및 40 ㎛ 셀 스트레이너(BD Bioscience사 제품 FALCON 352340)에서 여과 처리 후, 각 샘플을 FACSCalibur 플로우 사이토미터 및 CellQuest 소프트웨어(BD Bioscience사 제품)에 제공해서 16G9 mAb 또는 SSV mAb 양성/CD3 양성 T세포수를 분석했다.

결과는 도 5에 나타낸 대로였다.

참고예 1(16G9 mAb) 및 실시예 1(SSV mAb)을 비교한 결과, CD3 양성 T세포에 대한 반응성에 유의차는 확인되지 않고, 이들 항체는 동등한 반응성을 나타냈다(student t-test, ｐ<0.05).

시험예 5: SSV mAb 에 의한 하향 조절 타겟의 특정

실시예 1(SSV mAb)에 의해 하향 조절되는 후보 단백질을 프로테옴 분석에서 7종 확인했다.

그리고, 7종의 후보 단백질 중 ATP 합성 효소가 실시예 1(SSV mAb)의 타겟 항원인 것을 이하의 방법에 의해 확인했다.

우선, Thermo Fisher Scientific K.K.의 Accell siRNA 키트를 사용해서 미토콘드리아 ATP 합성 요소의 녹다운된 Balb/c 마우스 유래의 T세포를 취득했다.

이어서, 시험예 2의 방법에 준해서 얻어진 T세포를 사용해서 실시예 1(SSV mAb)을 시험 물질로서 MLR 시험을 행했다.

여기에서, 대조 시약으로서는 이소타입 IgG1(eBioscience사)을 사용했다. 또한, 컨트롤 시험으로서 ATP 합성 효소를 녹다운하지 않은 마우스 유래의 T세포를 사용한 동등한 시험을 행했다.

결과는 도 6의 (A) 및 (B)에 나타낸 대로였다.

도 6의 (A)에 기재된 바와 같이, ATP 합성 효소를 녹다운하지 않을 경우에는 실시예 1(SSV mAb)은 이소타입 IgG1과 비교해서 유의하게 세포 증식을 저해하고 있었다.

한편, 도 6의 (B)에 기재된 바와 같이, ATP 합성 효소를 녹다운한 경우에는 세포 증식의 저해에 관하여 실시예 1(SSV mAb)과 이소타입 IgG1의 사이에는 유의차가 확인되지 않았다.

도 6의 (A) 및 (B)에서는 ATP 합성 효소의 녹다운에 의해 SSV mAb의 면역 억제 활성이 저하되고 있고, SSV mAb가 면역 억제될 때에 ATP 합성 효소 활성을 하향 조절하고 있는 것이 시사된다.

시험예 6: SSV mAb 의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 서열의 확인

하이브리도마 cDNA 의 합성

FastPure RNA Kit(TaKaRa사 제품)를 사용해서 시험예 1에서 취득한 하이브리도마(Mouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3) 1.6×10⁷세포로부터 총 RNA를 조제했다. Poly(A)⁺ Isolation Kit from Total RNA(NIPPON GENE 제품)를 사용해서 240 ㎍의 총 RNA로부터 mRNA를 조제했다. Etachinmate(NIPPON GENE사 제품)를 사용해서 에탄올 침전을 행해 mRNA를 침전했다. 75% 에탄올에서 세정한 후, mRNA를 건조했다. 이것에 RNase free water를 10 ㎕ 첨가해서 mRNA를 용해했다. 얻어진 mRNA 용액은 -80℃에서 보존했다. SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech사 제품)를 사용해서 1 ㎍의 SSV 하이브리도마 mRNA로부터 5'-RACE용의 cDNA를 합성했다. 얻어진 cDNA 용액은 -20℃에서 보존했다.

SSV mAb 경쇄 및 중쇄에 있어서의 상보성 결정 영역( CDR )의 확인

마우스 IgG1 중쇄 정상 영역의 염기 서열을 바탕으로 프라이머 5'-CAC CAT GGA GTT AGT TTG GGC AGC AG-3'(서열번호 12)을 제조했다. 마우스 경쇄 κ정상 영역의 염기 서열을 바탕으로 프라이머 5'-CAC GAC TGA GGC ACC TCC AGA TG-3'(서열번호 13)을 제조했다. 각각의 프라이머와 Universal Primaer A Mix(SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 부속 프라이머)를 사용해서 cDNA를 템플릿으로 한 5'-RACE를 행했다. RACE 반응은 Advantage2 PCR Kit(Clontech사 제품)를 사용했다. 반응액을 아가로오스 전기 영동하고, 약 600 bp의 중쇄 5'-RACE 산물 및 약 500 bp의 경쇄 5'-RACE 산물을 E.Z.N.A. Gel Extraction Kit(OMEGA bio-tek사 제품)를 사용해서 겔로부터 정제했다. 이것을 pGEM-T Easy Vector(Promega사 제품)에 연결하고, Competent high E.coli DH 5α(TOYOBO사 제품)를 형질 전환했다. 얻어진 형질 전환체로부터 E.Z.N.A. Plasmid Miniprep KitⅠ(OMEGA bio-tek사 제품)을 사용해서 플라스미드를 제조했다. 제조한 플라스미드를 템플레이트로서 BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems사 제품)를 사용해서 사이클 반응을 행했다.

이어서, DNA 시퀀스(Applied Biosystems 제품)를 사용해서 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 염기 서열을 분석했다.

그 결과, 경쇄 가변 영역의 염기 서열은 서열번호 5의 제67번~제384번으로 표시되는 것이었다.

또한, 중쇄 가변 영역의 염기 서열은 서열번호 10의 제58번~제423번으로 표시되는 것이었다.

또한, 번역 개시 코돈과 Kabat 등의 방법에 의해 결정된 FR(정상 영역) 1의 위치에 기초해서 서열번호 5의 제1번~제66번은 경쇄 시그널 펩티드의 염기 서열이며, 그리고 서열번호 10의 제1번~제57번은 중쇄 시그널 펩티드의 염기 서열인 것으로 추정했다.

이어서, 얻어진 염기 서열로부터 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 추정하여 Kabat 등의 방법에 따라서 CDR 영역을 확인했다.

그 결과, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 6의 제23번~제128번으로 표시되는 것이었다. 여기에서, 서열번호 6의 제1번~제22번은 경쇄 시그널 펩티드의 아미노산 서열이다.

또한, 경쇄 가변 영역 가변 영역의 아미노산 서열 중, CDR1은 RASSSVSYMH(서열번호 2)로 표시되고, CDR2는 ATSNLAS(서열번호 3)로 표시되며, CDR3은 QQWSSNPWT(서열번호 4)로 표시되는 것을 확인했다.

또한, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 11의 제20번~제41번으로 표시되는 것이었다. 여기에서, 서열번호 11의 제1번~제19번은 중쇄 시그널 펩티드의 아미노산 서열이다.

또한, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 중, CDR1은 GYNMN(서열번호 7)으로 표시되고, CDR2는 NINPYYGSTSYNQKFKG(서열번호 8)으로 표시되며, CDR3은 SPYYSNYWRYFDY(서열번호 9)으로 표시되는 것을 확인했다.

시험예 7: 패혈증 치료 작용의 평가

BALB/c 마우스(실험 개시시 체중 20g-30g, n=6)를 SPF, 항온 항습(22±1도, 55±5%)에서 플라스틱제 케이지 내에서 12시간 명암 사이클의 조건 하에서 사육했다. 먹이 및 물은 자유롭게 섭취했다. 실험적 패혈증 모델로서 일반적으로 사용되는 리포폴리사카라이드(LPS) 유발 치사적 패혈증을 LPS 40 ㎎/㎏의 복강내 투여에 의해 유발했다. 생리식염수에 용해된 SSV mAb를 복강내에 LPS 투여 30분전, LPS 투여 6시간 후, 12시간 후의 3회, SSV mAb 양으로서 100 ㎍/회로 복강내에 투여했다. 그 후의 동물 개체의 생존을 조사했다. 또한, 대조는 SSV mAb 대신에 생리식염수에 용해한 IgG(SIGMA사 제품)를 동등하게 투여했다.

그 결과를 도 7에 나타냈다. LPS 투여(패혈증 유도) 후 70시간의 생존율은 대조군(IgG)이 20%(누적 생존 비율 0.2)였던 반면 SSV mAb 투여군에서는 70%(누적 생존 비율 0.7)였다. LPS 투여(염증 유도) 후 70시간의 생존율은 SSV mAb 투여군(SSV)이 대조군(IgG)의 약 3.5배이고, SSV mAb 투여군의 것이 유의하게 높았다(p<0.05).

시험예 8: 염증 질환 치료 작용의 평가

8-1

BALB/c 마우스(실험 개시시 체중 20 g-30 g, n=10)를 SPF, 항온 항습(22±1도, 55±5%)에서 플라스틱제 케이지 내에서 12시간 명암 사이클의 조건 하에서 사육했다. 먹이 및 물은 자유롭게 섭취했다. 이어서, 마우스에 LPS 40 ㎎/㎏의 복강내 투여를 행하고, 염증 질환으로서 시험예 7과 동등하게 리포폴리사카라이드(LPS) 유발 치사적 패혈증을 유발했다. 생리식염수에 용해한 SSV mAb량으로서 100 ㎍/회로 복강내에 투여했다. 그 후의 동물 개체의 생존을 조사했다. 또한, 대조는 SSV mAb 대신에 생리식염수에 용해한 IgG(SIGMA사 제품)를 동등하게 투여했다.

그 결과를 도 8에 나타냈다. LPS 투여(패혈증 유도) 후 24시간의 생존율은 대조군(IgG)이 20%였던 반면 SSV mAb 투여군에서는 70%였다. LPS 투여(염증 유도) 후 70시간의 생존율은 SSV mAb 투여군(SSV)이 대조군(IgG)의 약 3.5배이고, SSV mAb 투여군의 것이 유의하게 높았다(p<0.05).

8-2: 혈청 및 염증 조직 중의 히스톤 농도 측정

시험예 8에서는 대조군 및 SSV mAb 투여군에 있어서, 하세가와 등(Surg Res. 2012 May 1; 174(1): 136-41.)이 행한 방법에 준해 전신 마취 하에서 심장 유래의 혈액 또는 폐 조직을 취득했다. 얻어진 샘플에 대해서 ELISA법을 사용한 시판의 측정 키트에 의해서 히스톤 H1, 히스톤 H3 및 H4의 농도를 측정했다.

히스톤 H1 농도 측정의 결과는 도 9A(혈액 유래 혈청) 및 도 9B(폐 조직)에 나타낸 대로였다.

SSV mAb 투여군의 혈액 샘플 중의 히스톤 H1 농도는 시험 중 증가하지 않고 거의 일정하게 유지되고 있었다. 한편, 대조군의 혈액 샘플 중의 히스톤 H1 농도는 시험 기간 중 증감이 확인되었다.

또한, 염증 조직(폐)의 히스톤 H1 농도는 SSV mAb 투여군의 것이 대조군보다 유의하게 저하하고 있는 것이 확인되었다.

히스톤 H3 농도 측정의 결과는 도 10A(혈액 유래 혈청) 및 도 10B(폐 조직)에 나타낸 대로였다.

혈액 샘플 및 염증 조직(폐)의 히스톤 H3 농도는 SSV mAb 투여군의 것이 대조군보다 낮은 경향이 확인되었다.

히스톤 H4 농도 측정의 결과는 도 11A(혈액 유래 혈청) 및 도 11B(폐 조직)에 나타낸 대로였다.

또한, 시험 종료 후, 시험예 2와 동등한 방법에 의해 ELISA에서 SSV mAb와 히스톤 H1, 히스톤 H3 및 히스톤 H4의 바인딩 시금을 행했다.

그 결과, SSV mAb는 인 비트로에 있어서 히스톤 H1, 히스톤 H3 및 히스톤 H4와 결합능을 갖는 것을 확인했다.

8-3: 폐 조직의 염색 시험

시험예 8의 시험 종료 후, 대조군 및 SSV mAb 투여군의 래트로부터 각각 폐 조직 절편을 취득하고, 하세가와 등(Surg Res. 2012 May 1;174(1):136-41.)이 행한 방법에 준해서 헤마톡실린·에오신 염색액(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제품)을 사용해서 염색했다. 이어서, 얻어진 샘플의 현미경 사진을 촬영했다. 참고로서 건강한 래트에 대해서도 마찬가지로 폐 조직 단편의 사진을 촬영했다.

그 결과, 도 12A~C에 나타낸 대로였다.

도 12A(건강한 래트)와 도 12B(SSV mAb 투여군)는 폐 중의 염증은 관찰되지 않았다. 한편, 도 12C(대조군)에서는 폐에 염증이 확인되었다.

8-4: 울혈, 부종, 염증 및 출혈의 평가

시험예 8의 시험 종료 후, Murakami 등의 방법(Shock, 18 (2002), p.236)에 준해서 울혈, 부종, 염증 및 출혈 스코어를 평가했다. 구체적으로는 현미경에 의한 24시야의 확대상을 관측 대상했다. 그리고, SSV mAb 투여군 및 대조군에 있어서의 울혈, 부종 및 염증의 악화 정도를 스코어 0-4의 5단계(4가 가장 악화도가 높음)로 평가했다.

그 결과, 도 13에 나타낸 대로였다(스코어의 평균값±표준 편차).

울혈, 부종, 염증 및 출혈 중 어느 하나에 있어서도 대조군보다 SSV mAb 투여군의 것이 유의하게 낮은 값을 나타냈다.

8-5: 염증 관련 사이토카인의 측정

시험예 8에서는 대조군 및 SSV mAb 투여군에 있어서 3시간마다 정맥혈로부터 혈청을 취득했다. 그리고, 얻어진 샘플에 대해서 ELISA법을 사용한 시판의 측정 키트에 의해서 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6)과 억제성 사이토카인(IL-10)의 농도를 측정했다.

그 결과, 도 14A~D에 나타낸 대로였다.

도 14A~C에 나타낸 바와 같이, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6에 관해서는 SSV mAb 투여군의 값이 대조군과 비교해서 유의하게 저하했다.

한편, 도 14D에 나타낸 바와 같이, 억제성 사이토카인 IL-10에 관해서는 SSV mAb 투여군의 값이 대조군과 비교해서 유의하게 상승했다.

상기 결과로부터, SSV mAb 투여군에서는 대조군과 비교해서 염증이 억제되고 있는 것이 확인되었다.

시험예 9: 신허혈 재관류 상해에 의한 급성 신부전에 대한 치료 효과의 확인 시험 1

Wistar계 수컷 래트(n = 4)에 대해서 전신 마취 하에 우신장 적출 후, 좌신장을 혈관 클립에서 허혈 재관류시켜 모델을 작성했다. 이어서, SSV mAb 투여군에서는 모델 작성 30분전 및 재관류 직후에 SSV mAb를 10 ㎎/㎏ 투여했다. 또한, 대조군에서는 SSV mAb 대신 IgG(SIGMA사 제품)를 동등하게 투여했다. 그리고, 모델 작성 24시간 후의 혈청 중의 요소 질소(BUN) 및 크레아티닌(Cr)을 측정하고, 신장 손상의 레벨을 평가했다. 또한, 시험 종료 후에 래트의 부검을 행하고, 조직학적 평가를 행했다.

결과는 표 1에 나타낸 대로였다.

SSV mAb 투여군에서는 대조군보다 BUN 및 Cr의 값이 유의하게 낮았다. 또한, 신장의 조직학적 평가를 행한 결과, SSV mAb 투여군의 것이 대조군보다 형태가 양호했다.

시험예 10: 신허혈 재관류 상해에 의한 급성 신부전에 대한 치료 효과의 확인 시험 2

Wistar계 수컷 래트(n=4~6)를 사용하고, SSV mAb 투여군에 있어서 모델 작성 30분전 및 재관류로부터 6시간 후에 SSV mAb를 10 ㎎/㎏ 투여하는 것 이외에 시험예 10과 마찬가지로 시험을 행했다.

또한, 대조는 SSV mAb 대신 IgG(SIGMA사 제품)를 동등하게 투여했다. 그리고, 모델 작성 24시간 후의 혈청 중의 요소 질소(BUN) 및 크레아티닌(Cr)을 측정하고, 신장 장해의 레벨을 평가했다. 또한, 시험 종료 후에 래트의 부검을 행하고, 조직학적 평가를 행했다.

결과는 표 2에 나타낸 대로였다.

SSV mAb 투여군에서는 대조군보다 BUN 및 Cr의 값이 유의하게 낮았다. 또한, 신장의 조직학적 평가를 행한 결과, SSV mAb 투여군의 것이 대조군보다 상태가 양호했다.

SEQUENCE LISTING <110> Josai university corporation <120> Therapeutic agent for inflammatory disease <130> 198711PX <150> JP 2012-035965 <151> 2012-02-22 <160> 13 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SSV PEPTIDE <400> 1 Ser Ser Val Leu Tyr Gly Gly Pro Pro Ser Ala Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- LIGHT CHAIN VARIABLE REGION CDR1 <400> 2 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- LIGHT CHAIN VARIABLE REGION CDR2 <400> 3 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- LIGHT CHAIN VARIABLE REGION CDR3 <400> 4 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr 1 5 <210> 5 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- LIGHT CHAIN VARIABLE REGION DNA <400> 5 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcc 60 agaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt ctgcatctcc aggggagaag 120 gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag 180 ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat gccacatcca acctggcttc tggagtccct 240 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagagtggag 300 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gtaacccgtg gacgttcggt 360 ggaggcacca agctggaaat caaacgg 387 <210> 6 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- LIGHT CHAIN VARIABLE REGION PRT <400> 6 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60 Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110 Ser Ser Asn Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- HEAVY CHAIN VARIABLE REGION CDR1 <400> 7 Gly Tyr Asn Met Asn 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- HEAVY CHAIN VARIABLE REGION CDR2 <400> 8 Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- HEAVY CHAIN VARIABLE REGION CDR3 <400> 9 Ser Pro Tyr Tyr Ser Asn Tyr Trp Arg Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 423 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- HEAVY CHAIN VARIABLE REGION DNA <400> 10 atgggatgga gctggatctt tctcttcctt ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactctgag 60 atccagctgc agcagtctgg agctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120 tgcaaggctt ctggttactc attcactggc tacaacatga actgggtgaa gcagagccat 180 ggaaagagcc ttgagtggat tggaaatatt aatccttact atggtagtac tagctacaat 240 cagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaaat cttccagcac agcctacatg 300 cagctcaaca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag aagtccctac 360 tatagtaact actggaggta ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 420 tca 423 <210> 11 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> SSV Mab- HEAVY CHAIN VARIABLE REGION PRT <400> 11 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Tyr Tyr Ser Asn Tyr Trp Arg Tyr Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 12 caccatggag ttagtttggg cagcag 26 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PRIMER <400> 13 cacgactgag gcacctccag atg 23

Claims

SSVLYGGPPSAA(서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 또는 상기 펩티드와 약학상 허용 가능한 담체의 결합체와 결합하는 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함해서 이루어지는 염증 질환 치료제로서,
상기 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편이 RASSSVSYMH(서열번호 2)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, ATSNLAS(서열번호 3)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 QQWSSNPWT(서열번호 4)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함해서 이루어지는 경쇄 가변 영역, 및
GYNMN(서열번호 7)으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, NINPYYGSTSYNQKFKG(서열번호 8)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2, 및 SPYYSNYWRYFDY(서열번호 9)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3를 포함해서 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함해서 이루어지는 염증 질환 치료제.
제1항에 있어서, 상기 염증 질환은 히스톤이 관여하는 것인 치료제.
제1항에 있어서, 상기 염증 질환은 급성 염증 질환인 치료제.
제1항에 있어서, 상기 염증 질환은 패혈증, 심허혈 재관류 상해 및 신부전으로부터 선택되는 것인 치료제.
제1항에 있어서, 상기 염증 질환은 패혈증인 치료제.
제1항에 있어서, 히스톤 H1, 히스톤 H3 및 히스톤 H4와 결합하는 치료제.
삭제
제1항에 있어서, 상기 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편의 경쇄 가변 영역은 서열번호 6의 제23번~제128번으로 표시되는 아미노산 서열을 포함해서 이루어지는 치료제.
삭제
제1항에 있어서, 상기 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역은 서열번호 11의 제20번~제141번으로 표시되는 아미노산 서열을 포함해서 이루어지는 치료제.
제1항에 있어서, 상기 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편은 상기 펩티드 또는 펩티드와 약학상 허용 가능한 담체에 대한 것인 치료제.
제1항에 있어서, 상기 약학상 허용 가능한 담체는 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌, 오보 알부민 또는 소 혈청 알부민인 치료제.
제1항에 있어서, 상기 모노클로널 항체 또는 그 항원 결합 단편은 ATP 합성 효소 활성을 하향 조절할 수 있는 치료제.
제1항에 있어서, 상기 모노클로널 항체는 키메라, 인간화, 또는 인간 항체인 치료제.
제1항에 있어서, 상기 모노클로널 항체는 하이브리도마 Mouse-Mouse hybridoma SSV-C93-3에 의해 생성되는 치료제.
제1항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab, Fab', (Fab')₂, Fv 또는 scFv인 치료제.
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