JP3741647B2

JP3741647B2 - 抗フコイダン抗体

Info

Publication number: JP3741647B2
Application number: JP2001503905A
Authority: JP
Inventors: 一夫中川; 文嗣日野; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1999-06-11
Filing date: 2000-06-07
Publication date: 2006-02-01
Anticipated expiration: 2020-06-07
Also published as: AU5106100A; US6686453B1; KR20020007418A; WO2000077049A1; ATE402959T1; EP1186616B1; CN1354757A; KR100641977B1; CN1191275C; EP1186616A1; DE60039695D1; EP1186616A4

Description

【０００１】
技術分野
本発明は、生理活性多糖であるフコイダンの機能研究や、構造解析に有用なフコイダンの構造を認識する抗体に関する。
【０００２】
背景技術
フコイダンとは、分子中にフコース硫酸を含有する多糖であり、フコイダンには、ウロン酸を実質的に含まず構成糖の主成分がフコースのものと、ウロン酸を含み構成糖にフコースやマンノースを含むものがある。
【０００３】
本発明者らは、ガゴメ昆布より、ウロン酸を実質的に含まず構成糖の主成分がフコースであるフコイダン、すなわちフコース硫酸含有多糖−Ｆ（以下、Ｆ−フコイダンと称す）、及びウロン酸を含むフコイダン、すなわちフコース硫酸含有多糖−Ｕ（以下、Ｕ−フコイダンと称す）をそれぞれ調製している（国際公開ＷＯ９７／２６８９６号公報参照）。
【０００４】
フコイダンの生理作用としては、アポトーシス誘発活性、がん増殖抑制活性、がん転移抑制活性、抗凝血活性、抗ウイルス活性等が知られており、医薬品としての用途開発が期待されている。またフコインダンは、化粧品素材としても優れた機能を有している。
【０００５】
そのため、フコイダンの構造や生理機能をさらに解析することが求められている。
【０００６】
発明の目的
本発明の目的は、フコイダンの構造を特異的に認識し、フコイダンの構造解析や、構造と生理機能の関係の究明に有用な抗体を提供することにある。
【０００７】
発明の概要
本発明者らはガゴメ昆布由来フコイダンを抗原とし、宿主を免疫することにより、フコイダンの構造を認識する抗体を産生する細胞を創成することに成功し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物を認識する抗フコイダン抗体を提供する。
【０００９】
【化３】

【００１０】
【化４】

【００１１】
さらに、本発明は上記抗フコイダン抗体を固定化した担体を提供する。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明の抗体を調製するための抗原となるガゴメ昆布由来フコイダンは、国際公開ＷＯ９７／２６８９６号公報記載の方法により調製することができる。具体的には、参考例１−（１）に記載の方法で調製することができる。またＵ−フコイダン及びＦ−フコイダンも当該公報記載の方法により調製することができる。具体的には、参考例１−（２）に記載の方法で調製することができる。
【００１３】
また式（Ｉ）で表される化合物は、国際公開ＷＯ９９／４１２８８号公報記載の方法により調製することができる。具体的には、参考例２に記載の方法で調製することができる。
【００１４】
更に式（ＩＩ）で表される化合物は、国際公開ＷＯ９６／３４００４号公報記載の方法により調製することができる。具体的には、参考例３に記載の方法で調製することができる。
【００１５】
なお、式（Ｉ）で表される化合物は、アルテロモナス（Alteromonas）ｓｐ．ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭＢＰ−５７４７）の産生するＦ−フコイダン分解酵素による、Ｆ−フコイダンの低分子化物であり、Ｆ−フコイダンは式（Ｉ）で表される化合物を構成単位とした繰り返し構造を有している。
【００１６】
また、式（ＩＩ）で表される化合物は、フラボバクテリウム（Flavobacterium）ｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＲＥＲＭＢＰ−５４０２）の産生するフコイダン分解酵素による、フコイダンの低分子化物である。
【００１７】
本発明の抗フコイダン抗体は、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表される化合物を認識するのであればポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体として調製することもできる。当該モノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合法によって製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞の間に、融合ハイブリドーマを形成させ、該ハイブリドーマをクローン化し、上記の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表される化合物に対して特異性を示す抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
【００１８】
抗体産生細胞は、例えばガゴメ昆布由来フコイダンによりそれぞれ免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞Ｂリンパ球が使用できる。免疫させる動物としては、マウス、ラット、馬、ヤギ、ウサギ等が例示される。
【００１９】
抗原としてはガゴメ昆布由来フコイダン、Ｕ−フコイダン、又はＦ−フコイダン等が利用可能であり、これらの抗原をフロイントのアジュバントと混合し、動物の免疫用として使用する。
【００２０】
免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に１回に２０〜２００μｇ、２〜３週に１回、３〜７週間、抗原を投与することによって行われる。最終免疫より約３〜５日後、免疫動物から抗体産生細胞を分取する。
【００２１】
骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用される。細胞融合は、例えばネイチャー（Nature）、第２５６巻、第４９５頁（１９７５）に記載の方法又はこれに準ずる方法によって行われる。この際、３０〜５０％ポリエチレングリコール（分子量１０００〜４０００）を用い、３０〜４０℃の温度下、約１〜３分間程度反応させることによって行われる。
【００２２】
細胞融合によって得られたハイブリドーマはスクリーニングに付される。スクリーニングは、酵素抗体法等によって行われる。得られた抗体産生ハイブリドーマはクローニングに付される。すなわち、当該ハイブリドーマを例えば限界希釈法によってクローニングを行ってクローンを得る。得られたクローンは、次いで目的とするモノクローナル抗体を産生するクローンのスクリーニングに付され、例えば酵素抗体法等によって、スクリーニングが行われる。選択されたクローンは、例えばあらかじめプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取する。この腹水からのモノクローナル抗体の回収は、抗体の精製法として公知の硫安分画法、ポリエチレングリコール分画法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲルクロマトグラフ法等を応用することによって容易に達成される。
【００２３】
本発明の抗体としては、上記方法により調製することができるもので有れば良く、特に限定はないが、その例としてはハイブリドーマＧＦＤＧ−２８（ＦＥＲＭＢＰ−７１７３）が産生し、式（Ｉ）で表される化合物を認識し、式（ＩＩ）で表される化合物を認識しない抗フコイダン抗体（以下、当該抗体をＧＦＤＧ−２８と称す）、及び、ハイブリドーマＧＦＤ２−９Ｃ（ＦＥＲＭＢＰ−７１７４）が産生し、式（Ｉ）で表される化合物を認識せず、式（ＩＩ）で表される化合物を認識する抗フコイダン抗体（以下、当該抗体をＧＦＤ２−９Ｃと称す）が例示される。
【００２４】
また、本発明の抗体を担体に固定し、これを吸着担体として使用することにより、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表される化合物や、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）を含有する多糖や、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）を構成単位とする多糖の分別が可能となる。本発明の抗体の担体への固定化のためには公知の方法を用いることができ、使用する固定化用担体の材料としては、例えば、アガロース、セルロース、デキストラン等の多糖類、ポリアクリルアミド、アクリル酸ポリマー、スチレンジビニルベンゼンポリマー、ポリメタクリレート等の合成高分子、シリカゲル、ガラス等の無機高分子等から使用の目的、方法に応じて、適宜選択することができる。
【００２５】
なお、ＧＦＤＧ−２８はＦ−フコイダンを認識するので、これを用いてＦ−フコイダンを測定することができる。また、式（Ｉ）で表される化合物をサンドウィッチ法で測定することもできる。その認識部位はフコース−２−硫酸部位であると考えられる。
【００２６】
これらの抗体はフコイダンの分別測定に有用であり、例えばガゴメ昆布由来フコイダンの測定にも使用することができる。
【００２７】
かくして得られた抗体はフコイダンの構造と生理活性の相関関係を究明するために極めて有用である。またフコイダン由来物質の生体内濃度、例えば血清、血漿又は尿中濃度を特異的に精度良く測定するためにも極めて有用である。
【００２８】
これらの目的で使用するためには、モノクローナル抗体そのもの又はそれからの対応する免疫学的特性を有するフラグメント、例えばＦａｂフラグメントを使用することができる。また遺伝子工学的に製造した抗体又はそのフラグメントも本発明の抗体に包含される。
【００２９】
実施例
以下に、実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３０】
参考例１
（１）ガゴメ昆布を充分乾燥後、乾燥物２０ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕した。
【００３１】
水道水９００リットルに塩化カルシウム二水和物（日本曹達社製）７．３ｋｇを溶解し、次にガゴメ昆布粉砕物２０ｋｇを混合した。液温を１２℃から９０℃になるまで水蒸気吹込みにより４０分間昇温させ、次いで撹拌下９０〜９５℃に１時間保温し、次いで冷却し、冷却物１１００リットルを得た。
【００３２】
次いで固液分離装置（ＣＮＡ型：ウエストファリアセパレーター社製）を用い、冷却物の固液分離を行い、約９００リットルの固液分離上清液を調製した。
【００３３】
固液分離上清液３６０リットルをダイセル社製ＦＥ１０−ＦＣ−ＦＵＳ０３８２（分画分子量３万）を用い、２０リットルまで濃縮した。次いで水道水を２０リットル加え、再度ＦＥ１０−ＦＣ−ＦＵＳ０３８２を用いて２０リットルまで濃縮するという操作を５回行うことによって脱塩処理を行い、ガゴメ昆布由来の抽出液２５リットルを調製した。
【００３４】
該溶液１リットルを凍結乾燥し、ガゴメ昆布由来フコイダン乾燥物１３ｇを得た。
【００３５】
（２）参考例１−（１）記載のフコイダン乾燥物７ｇを、５０ｍＭの塩化ナトリウムと１０％のエタノールを含む２０ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ８．０）７００ｍｌに溶解し、遠心分離により不溶物を除去した。ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム（φ１１．４ｃｍ×４８ｃｍ）（生化学工業社製）を同緩衝液にて平衡化し、遠心分離上清をアプライ後、同緩衝液で洗い、塩化ナトリウムの５０ｍＭから１．９５Ｍの濃度勾配により溶出させた（１フラクション：２５０ｍｌ）。フェノール硫酸法及びカルバゾール硫酸法にて、総糖量及びウロン酸含量を求め、溶出順にフラクション４３〜５５、フラクション５６〜６７の画分を得た。次に、これらの画分を電気透析により脱塩後凍結乾燥し、フラクション４３〜５５よりＵ−フコイダン画分（１．２１ｇ）、フラクション５６〜６７よりＦ−フコイダン画分（２．６４ｇ）をそれぞれ調製した。
【００３６】
図１にガゴメ昆布由来フコイダンのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム溶出パターンを示す。図１において縦軸はカルバゾール硫酸法での５３０ｎｍの吸光度（図中黒丸）、フェノール硫酸法での４８０ｎｍの吸光度（図中白丸）、及び電導度（ｍＳ／ｃｍ：図中白四角）、横軸はフラクション番号を示す。
【００３７】
参考例２
（１）アルテロモナスｓｐ．ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭＢＰ−５７４７）を、グルコース０．２５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．２からなる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分間）２リットルの三角フラスコに接種し、２５℃で２６時間培養して種培養液とした。ペプトン１．０％、酵母エキス０．０２％、下記参考例２−（２）に記載のフコイダン０．２％、及び消泡剤（信越化学工業社製ＫＭ７０）０．０１％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．０からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファメンターに入れて１２０℃、２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２４時間、毎分１０リットルの通気量と毎分２５０回転の撹拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して培養上清を得た。得られた培養上清を、排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により濃縮後８５％飽和硫安塩析し、生じた沈殿を遠心分離により集め、１０分の１濃度の人工海水を含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に対して充分透析し、６００ｍｌのフコイダンに選択的に作用するＦ−フコイダン分解酵素液を調製した。
【００３８】
（２）乾燥したガゴメ昆布２Ｋｇを直径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミル（増幸産業社製）により粉砕し、得られた昆布のチップを２０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、２５℃で３時間撹拌し、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、９５℃に加温した４０リットルの５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５に懸濁し、時々撹拌しながら９５℃で２時間処理し、フコイダンを抽出した。
【００３９】
抽出液中の懸濁物を、ろ過し、ろ液を調製した後、ろ過残渣を３．５リットルの１００ｍＭ塩化ナトリウムにより洗浄し、更にろ液を得た。
【００４０】
両ろ液を合わせた後、３０℃まで温度を下げ、３０００Ｕのアルギン酸リアーゼ（ナガセ生化学工業社製）を添加後、エタノールを４リットル加え２５℃で２４時間撹拌した。次に遠心分離を行い、得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバーを備えた限外ろ過器により４リットルに濃縮し、更に、１０％のエタノールを含む１００ｍＭの塩化ナトリウムにより、着色性物質がろ過されなくなるまで限外ろ過を続けた。
【００４１】
非ろ過液中に生じた沈殿は遠心分離により除去し、この上清を５℃まで温度を下げ、０．５Ｎ塩酸によりｐＨを２．０とした後、生じたタンパク質等の沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を速やかに１Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを８．０とした。
【００４２】
次に、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過器により限外ろ過を行い、２０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ８．０により完全に溶媒置換後、再度ｐＨを８．０として遠心分離後、凍結乾燥を行い、約９５ｇのフコイダンを調製した。
【００４３】
（３）乾燥したガゴメ昆布２Ｋｇを直径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミルにより粉砕し、得られた昆布のチップを２０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、２５℃で３時間撹拌し、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、３０ｍｌの上記参考例２−（１）で調製したＦ−フコイダン分解酵素液、１０％のエタノール、１００ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭの塩化カルシウム、及び５０ｍＭのイミダゾールを含む２０リットルの緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁し、２５℃で４８時間撹拌した。この懸濁液を網目の直径３２μｍのステンレス金網でろ過し、残渣を５０ｍＭの塩化カルシウムを含む１０％のエタノールで洗浄した。更にその残渣を１０リットルの５０ｍＭ塩化カルシウムを含む１０％のエタノール中に懸濁し、３時間撹拌後、ステンレス金網でろ過、洗浄した。更にその残渣を同条件で懸濁後、１６時間撹拌し、直径３２μｍのステンレス金網でろ過、洗浄した。
【００４４】
こうして得られたろ液及び洗浄液を集め、排除分子量３０００のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により限外ろ過し、ろ過液と非ろ過液に分離した。
【００４５】
このろ過液をロータリーエバポレーターで約３リットルに濃縮後、遠心分離して上清を得た。得られた上清を排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、この溶液に０．１Ｍとなるように酢酸カルシウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清をあらかじめ５０ｍＭの酢酸カルシウムにより平衡化させたＤＥＡＥ−セルロファイン（樹脂量４リットル）にかけ、５０ｍＭの酢酸カルシウム及び５０ｍＭの塩化ナトリウムで充分洗浄後、５０ｍＭ〜８００ｍＭの塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。この時の分取量は１本当り５００ｍｌで行った。分取した画分をセルロースアセテート膜電気泳動法［アナリティカルバイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、第３７巻、第１９７〜２０２頁（１９７０）］により分析したところ塩化ナトリウム濃度が約０．４Ｍで溶出されるフコイダン（フラクションナンバー６３付近）が均一であった。
【００４６】
そこで、まずフラクションナンバー６３の液を１５０ｍｌに濃縮後、濃度が４Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、あらかじめ４Ｍの塩化ナトリウムにより平衡化したフェニル（Phenyl）−セルロファイン（樹脂量２００ｍｌ）にかけ、４Ｍの塩化ナトリウムにより充分洗浄した。非吸着性のフコイダン分解物画分を集め、排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、脱塩液５０５ｍｌを得た。
【００４７】
得られた脱塩液のうち４０ｍｌを１０％のエタノールを含む０．２Ｍの塩化ナトリウムによって平衡化させたセルロファインＧＣＬ−９０のカラム（４．１ｃｍ×８７ｃｍ）（生化学工業社製）にかけて、ゲルろ過を行った。分取は１フラクション当り９．２ｍｌで行った。
【００４８】
全フラクションに対して総糖量の分析をフェノール硫酸法〔アナリティカルケミストリー（Analytical Chemistry）、第２８巻、第３５０頁（１９５６）〕により行った。
【００４９】
この結果、フコイダン分解物は１つのピークを形成したので、そのピークの中央部分、フラクションナンバー６３〜７０を集め、排除分子量３００の膜を装着させた電気透析器により脱塩後、凍結乾燥し、１１２ｍｇの式（Ｉ）で表される化合物（以下、単に７−１２ｓと称す）の乾燥品を得た。
【００５０】
参考例３
（１）フラボバクテリウムｓｐ．ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭＢＰ−５４０２）を、グルコース０．１％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ７．５からなる培地６００ｍｌを分注して、殺菌した（１２０℃、２０分）２リットルの三角フラスコに接種し、２４℃で２０時間培養して種培養液とした。参考例２−（２）記載のガゴメ昆布由来フコイダン０．３％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．０１％、及び消泡剤（信越化学工業社製ＫＭ７０）０．０１％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ７．５からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃で２０分殺菌した。冷却後、上記種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２０時間、毎分１０リットルの通気量と毎分１２５回転の撹拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して培養上清を得た。得られた培養上清を、排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により４００ｍｌに濃縮し、フコイダン分解酵素液を調製した。
【００５１】
（２）５％のガゴメ昆布由来フコイダン溶液６００ｍｌと、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）７５０ｍｌと４Ｍの塩化ナトリウム１５０ｍｌと参考例３−（１）で調製したフコイダン分解酵素液１２０ｍｌを混合し、２５℃で１４４時間反応させた。
【００５２】
反応液をポアサイズ３５００の透析膜を用いて透析し、分子量３５００以下の画分を集めた。この画分をマイクロアナライザーＧ３（旭化成社製）により脱塩し、脱塩液５００ｍｌを得た。次に該脱塩液を、１０ｍＭ酢酸アンモニウムで平衡化させたＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラム（５ｃｍ×２６ｃｍ）（ファルマシア社製）にかけ、１０ｍＭ酢酸アンモニウム１リットル、１０ｍＭ〜１Ｍ酢酸アンモニウムのグラジュエント液１リットル、１Ｍ酢酸アンモニウム１リットル、１Ｍ〜５Ｍ酢酸アンモニウム１リットルの順で溶出した。この時の分取量は１本当たり５０ｍｌで行った。このうち、フラクションナンバー６４〜７８を集め、該画分を２００ｍｌに濃縮、脱塩後、５００ｍＭ酢酸アンモニウムで平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラム（２．４ｃｍ×２２ｃｍ）にかけ、次いで、５００ｍＭ酢酸アンモニウム１００ｍｌ、５００ｍＭ〜２Ｍ酢酸アンモニウムのグラジュエント液９００ｍｌの順で溶出した。この時の分取量は１本当たり９．７ｍｌで行った。このうち、フラクションナンバー９２〜９６を集め、該画分を濃縮、脱塩し、式（ＩＩ）で表される化合物（以下、単に６−５ｓと称す）を得た。
【００５３】
実施例１
抗フコイダンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞の作製及びそのクローン化
（１）６週齢Ｂａｌｂ／ｃマウス雌（日本クレア社製）４匹に、それぞれ抗原として、参考例１−（１）に記載の方法で調製したガゴメ昆布由来フコイダンをマウス１匹当たり１００μｇ／１００μｌとなるように完全フロイントアジュバントと混ぜ乳化させマウス腹腔に投与した。
【００５４】
初回免疫より２１日目に初回免疫と同じフコイダンをマウス１匹当たり１００μｇ/１００μｌとなるように不完全フロイントアジュバントと混ぜ乳化させマウス腹腔に投与し追加免疫をした。
【００５５】
更に、１４日後に初回免疫と同じフコイダンをマウス１匹当たり１００μｇ／１００μｌとなるように補助免疫としてマウス腹腔に投与した。
【００５６】
補助免疫より３日後にマウスの脾臓を取り出し、ステンレスメッシュを使って１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０（バイオウィッタカー社製）培地中に徐々に均一化させ、１５００ｒ．ｐ．ｍで３回遠心分離、洗浄を繰り返し脾臓細胞を分離した。
【００５７】
得られた脾臓細胞を遠心分離し、洗浄したマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１（Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ.１）と合わせた後、ＰＥＧ１５００溶液［ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を５０％（Ｖ／Ｖ）含むＲＰＭＩ１６４０培地］１ｍｌを１分間かけて滴下しながら、更に１分間混ぜた後、ＲＰＭＩ１６４０培地で徐々に希釈してＰＥＧ濃度を５％（Ｖ／Ｖ）にした。
【００５８】
そして、遠心分離機で細胞を分離し、その細胞を徐々に増殖培地（１０％牛胎児血清ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）を加えて分散させ、９６穴培養プレート（ファルコン社製）の穴に１穴当たり１０^６個／０．１ｍｌの細胞を播き、３７℃の５％二酸化炭素インキュベーター内で一晩培養した。
【００５９】
翌日から、上記増殖培地にヒポキサンチン０．１ｍＭ、アミノプテリン０．４μＭ、チミジン１６μＭを加えた選択培地（以下、ＨＡＴ培地と略記する）を、各穴に１００μｌ添加して培養し、その後１〜２日ごとに１００μｌずつＨＡＴ培地に置換しながら培養し、非融合細胞を死滅させ、融合細胞のみ生存可能な状態で選択培養を行った。
【００６０】
さらに、生存融合細胞の中より抗体を産生する陽性株を選択するために、コロニーが大きくなった時点でその培養上清中に含まれる抗フコイダンモノクローナル抗体の検出を酵素免疫測定法で行った。
【００６１】
免疫感作に使用した抗原フコイダンを生理リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１０μｇ／ｍｌに調整して９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）に１穴当たり５０μｌずつ加え４℃で一晩静置して固相化した。
【００６２】
固相化した後、液を捨て市販のブロッキング剤（ブロックエース：大日本製薬社製）を１穴当たり２００μｌずつ加えて３７℃、２時間インキュベートしてブロッキングを施し、固相抗原プレートを作製した。
【００６３】
この固相抗原プレートにそれぞれの融合細胞の培養上清を５０μｌずつ加えて、３７℃、１時間インキュベートし、抗体抗原反応をさせた。
【００６４】
このプレートをＰＢＳで洗浄した後、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ザイムド社製）をブロッキング剤で１０００倍希釈し、各穴に５０μｌずつ加えて３７℃、１時間インキュベートした。
【００６５】
さらに、このプレートをＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ／０．０２％過酸化水素水溶液〔０．５５ｍｇ／ｍｌＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム：ナカライテスク社製）を含む０．１Ｍクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）、０．０２％過酸化水素水〕を５０μｌずつ加え、室温で１５分間発色反応をさせた。
【００６６】
緑色に発色した穴を陽性とし、検出した陽性株をＨＴ培地（アミノプテリンを含まないＨＡＴ培地）でコロニーを９６穴から２４穴、更に６穴プレートへ拡大培養した後、９６穴培養プレートの１穴当たり細胞１個になるように市販のクローニング培地（エスクローン：三光純薬社製）にて希釈し、９６穴プレートに播き込み培養する限界希釈法にてクローニングした。
【００６７】
育ったシングルコロニーの培養上清をフコイダン固相抗原プレート用いた酵素免疫抗体法にて陽性株を検出した。
【００６８】
その結果、ＧＦＤ２−９Ｃ、ＧＦＤＧ−２８の２クローンのモノクローナル抗体産生細胞を得た。当該細胞は日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＧＦＤ２−９ＣはＦＥＲＭＢＰ−７１７４として、ＧＦＤＧ−２８はＦＥＲＭＢＰ−７１７３として平成８年１０月２９日（原寄託日）に寄託されている。
【００６９】
（２）クローン化したモノクローナル抗体産生細胞を増殖培地（１０％牛胎児血清ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）で増殖させた後、予め３週間前に０.５ｍｌの免疫抑制剤プリステン（２，６，１０，１４，−テトラメチルペンタデカン：和光純薬社製）を投与したＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔に、１匹当たり１０^６〜１０^７個で移植した。約２週間後に溜まった腹水を回収し、これよりモノクローナル抗体を精製した。
【００７０】
（３）マウス腹腔より回収した腹水を３０００ｒ．ｐ．ｍ、１０分間遠心分離して沈殿物を除き、遠心上清をＰＢＳで２倍希釈し綿濾過した後、５０％硫安塩析して抗体を沈殿させ遠心分離した。
【００７１】
得られた沈殿をＰＢＳに溶解後、さらにＰＢＳに透析して硫安を除いた後、プロテインＡカラム（ファルマシア社製）により常法に従ってアフィニティー処理をした。
【００７２】
まず、カラムをプロテインＡ吸着バッファー（３ＭＮａＣｌ、１．５ＭグリシンｐＨ８．９）で平衡化した後、透析後の抗体を含む沈殿溶解液をプロテインＡカラムで処理し、吸着画分をさらにプロテインＡ吸着バッファーで洗浄後、０.１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ４．０）で溶出した。
【００７３】
得られた溶出画分をＰＢＳに透析し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略記する）でシングルバンドであることを確認後、精製抗体とした。
【００７４】
ハイブリドーマＧＦＤ２−９Ｃが産生する抗フコイダン抗体をＧＦＤ２−９Ｃ、ハイブリドーマＧＦＤＧ−２８が産生する抗フコイダン抗体をＧＦＤＧ−２８と命名した。
【００７５】
（４）抗フコイダン抗体のサブクラスは市販の抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ各ウサギポリクローナル抗体（ザイムド社製）を用いた酵素免疫抗体法にて決定した。
【００７６】
免疫感作に抗原として使用した精製フコイダンをＰＢＳにて１０μｇ／ｍｌに調整、９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）に５０μｌずつ分注し、４℃で一晩静置して吸着させた。
【００７７】
プレートの液を捨てＰＢＳで洗浄後、各穴を２００μｌの市販のブロッキング剤（ブロックエース：大日本製薬社製）にてブロッキングを施し、抗原プレートを作製した。
【００７８】
精製した各抗フコイダン抗体のＧＦＤ２−９Ｃ、ＧＦＤＧ−２８をそれぞれ市販のブロッキング液（ブロックエース：大日本製薬社製）にて１０μｇ／ｍｌに調整、抗原プレートに５０μｌずつ分注し、３７℃で１時間反応させた。
【００７９】
プレートをＰＢＳで洗浄後、市販の抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ各ウサギポリクローナル抗体（ザイムド社製）を市販のブロッキング剤（ブロックエース：大日本製薬社製）にて１０００倍希釈して各穴５０μｌずつ分注し、３７℃で1時間反応させた。
【００８０】
さらに、プレートをＰＢＳで洗浄後、市販の抗ウサギＨＲＰ標識２次抗体（ザイムド社製）を市販のブロッキング剤（ブロックエース：大日本製薬社製）にて５００倍希釈して各穴５０μｌずつ分注し、３７℃で１時間反応させた。
【００８１】
プレートをＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ／０．０２％過酸化水素水溶液を各穴に５０μｌずつ分注し、室温で１５分間発色反応させた。
【００８２】
その結果、どちらの抗体もＩｇＧ１であった。
【００８３】
（５）フコイダン由来化合物である７−１２ｓ、及び６−５ｓを用いてガゴメ昆布由来フコイダンとの競合試験を実施した。
【００８４】
予め、精製したガゴメ昆布由来フコイダンをＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに濃度を調整して、９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）に５０μｌ／穴で播き込み、４℃で一晩静置して固相化し、市販のブロッキング剤（ブロックエース：大日本製薬社製）２００μｌにてブロッキングを施し、抗原プレートを作製した。
【００８５】
各酵素消化断片糖を蒸留水で１ｍｇ/ｍｌに濃度調整したものを市販のブロッキング剤（ブロックエース：大日本製薬社製）でさらに、３倍ずつ、３段階に希釈（３倍希釈、９倍希釈、２７倍希釈）して濃度を振り、最後に７−１２ｓ、６−５ｓを含まないブロッキング剤だけを含む４種類の競合溶液を調整し、それぞれ１．５ｍｌエッペンドルフチューブ（エッペンドルフ社製）に分注した。
【００８６】
次に、抗フコイダン抗体であるＧＦＤ２−９Ｃ、ＧＦＤＧ−２８を市販のブロッキング剤（ブロックエース：大日本製薬社製）にて１０μｇ／ｍｌに濃度調整し、抗体溶液とした。
【００８７】
競合溶液（濃度調整した７−１２ｓ、又は６−５ｓ、ブロッキング剤のみを含む）５０μｌに、１０μｇ／ｍｌに濃度調整したＧＦＤ２−９Ｃ、ＧＦＤＧ−２８抗体溶液５０μｌを加え、３７℃で３０分間インキュベートさせ１次反応液とした。
【００８８】
この１次反応においてＧＦＤ２−９Ｃ及びＧＦＤＧ−２８の抗体の結合部位が競合溶液中の７−１２ｓ、又は６−５ｓとの結合反応により奪われた場合（抗体結合部位が７−１２ｓ、又は６−５ｓに存在した場合のみ）、７−１２ｓ、又は６−５ｓの濃度に比例して２次反応における固相抗原プレートへの結合能力が失われる。
【００８９】
２次反応としてガゴメ昆布由来フコイダン固相抗原プレートに各１次反応液５０μｌをそれぞれ加え、３７℃で１時間インキュベートした。
【００９０】
ＰＢＳで３回プレートを洗浄後、抗マウスＨＲＰ標識２次抗体を市販のブロッキング剤（ブロックエース：大日本製薬社製）で５００倍希釈して１穴当たり５０μｌずつ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
【００９１】
ＰＢＳで４回プレートを洗浄後、ＡＢＴＳ／０.０２％過酸化水素水溶液を５０μｌ加え、１５分間発色反応をした。
【００９２】
プレートの各穴に１５０ｍＭシュウ酸５０μｌずつ加え反応停止後、プレートリーダーにて吸光度４０５ｎｍを測定した。
【００９３】
すなわち、競合溶液中の７−１２ｓ、又は６−５ｓの濃度に比例して発色が弱ければ７−１２ｓ、又は６−５ｓ中に抗体の結合部位が存在する事となる。
【００９４】
その結果、下記表１に示す様に、抗フコイダン抗体であるＧＦＤ２−９Ｃは６−５ｓに結合し、７−１２ｓには結合せず、ＧＦＤＧ−２８は７−１２ｓに結合し、６−５ｓには結合しないことが明らかとなった。
【００９５】
【表１】

【００９６】
（６）ＨＲＰ標識抗体の作製は、「イムノアッセイスインザクリニカルラボラトリー」、第８１頁（アランアールリスインコーポレーテッド、１９７９年発行、Ｐ．Ｋ．ナカネ著）に記載の方法に準じて行った。
【００９７】
ＨＲＰ（ベーリンガーマンハイム社製）１０ｍｇを１ｍｌの蒸留水に溶かし、０．１Ｍ過ヨウ素酸ソーダ０.２ｍｌを加えて室温で２０分間反応させた後、１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に対して一晩透析した。
【００９８】
得られた溶液に、２Ｍ炭酸ソーダ緩衝液（ｐＨ９．５）０．０２ｍｌを加えてｐＨ９〜９．５にすると同時に、予め、０．０１Ｍ炭酸ソーダ緩衝液（ｐＨ９．５）に対して透析を行ったモノクローナル抗体ＧＦＤ２−９ＣとＧＦＤＧ−２８を、それぞれ１０ｍｇ／ｍｌずつ、上記透析で得られた溶液に加えた。その後、室温で２時間反応させた後、水素化ホウ素ナトリウム（４ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌ加えて、４℃で２時間反応させた。
【００９９】
これをＰＢＳに対して４℃で一晩透析し、ＨＲＰ標識ＧＦＤ２−９Ｃ、ＨＲＰ標識ＧＦＤＧ−２８を取得した。
【０１００】
９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各穴に、ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌの濃度になるように調整したＧＦＤ２−９Ｃ及びＧＦＤＧ−２８抗体溶液をそれぞれ５０μｌずつ分注し、４℃で一晩静置して、抗体を固相化した。
【０１０１】
次に、プレートの各穴中の液を捨て、市販のブロッキング剤（ブロックエース：大日本製薬社製）２００μｌ加え、３７℃で１時間ブロッキングを施し、固相プレートを作製した。
【０１０２】
この固相プレートに、スタンダード（以下、ＳＴＤと略記）として、ＧＦＤ２−９Ｃ測定系では、６−５ｓをトップ（最高）濃度４０μｇ／ｍｌより５倍希釈したもの、ＧＦＤＧ−２８測定系では、７−１２ｓをトップ濃度１１１μｇ／ｍｌより３倍希釈したものをそれぞれ５０μｌ加え、３７℃１時間インキュベートして反応させた。
【０１０３】
反応終了後、プレートをＰＢＳで３回洗浄した後、市販のブロッキング剤で５００倍に希釈した上記のＨＲＰ標識ＧＦＤ２−９Ｃ、ＨＲＰ標識ＧＦＤＧ−２８を５０μｌずつ各穴に添加し、３７℃１時間インキュベートして反応させた。
【０１０４】
反応終了後、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、ＡＢＴＳ／０．０２％過酸化水素水溶液を各穴に５０μｌずつ分注して、室温で１５分間発色反応をさせた。
【０１０５】
プレートリーダーにより、各穴の吸光度４０５ｎｍを測定した。その結果を表２に示す。
【０１０６】
尚、検量線は、ＧＦＤ２−９Ｃ用には６−５ｓ、ＧＦＤＧ−２８用には７−１２ｓをＳＴＤとして用いて測定した吸光度から作製した。
【０１０７】
その結果、下記表２に示すように、６−５ｓ、又は７−１２ｓ濃度に比例して吸光度の測定値が上昇した。この事より、サンドイッチ法ＥＩＡ測定系が上手く機能している事が明らかとなった。
【０１０８】
【表２】

【０１０９】
また、ガゴメ昆布由来フコイダンについては、ＧＦＤ２−９ＣとＨＲＰ標識ＧＦＤＧ−２８の組み合わせでもサンドイッチ法ＥＩＡ測定系で測定可能であった。その結果を表３に示す。更に、ＧＦＤ２−９ＣとＨＲＰ標識ＧＦＤ２−９Ｃ、ＧＦＤＧ−２８とＨＲＰ標識ＧＦＤＧ−２８、ＧＦＤＧ−２８とＨＲＰ標識ＧＦＤ２−９Ｃの各々の組合せで行った結果、ガゴメ昆布由来フコイダンを用いたサンドイッチ法ＥＩＡ測定系での測定が可能であることが明らかとなり、ＧＦＤＧ−２８とＨＲＰ標識ＧＦＤＧ−２８の組合せでＦ−フコイダンのサンドイッチ法ＥＩＡ測定系での測定が可能であることが明らかとなった。
【０１１０】
【表３】

【０１１１】
実施例２
抗フコイダン抗体カラムの作製
ＨｉＴｒａｐＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄカラム（ファルマシア社製）を１ｍＭ塩酸６ｍｌで洗浄後、実施例１−（３）で精製したＧＦＤＧ−２８溶液０．９ｍｌをアプライした。室温で１時間放置後、３ｍｌのカップリングバッファー（０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ８．３）で洗浄した。続いてカラムを６ｍｌのブロッキングバッファー（０．５Ｍトリス−塩酸ｐＨ８．３、０．５Ｍ塩化ナトリウム）、６ｍｌのバッファーＢ（０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．０、０．５Ｍ塩化ナトリウム）、６ｍｌのブロッキングバッファーで順次洗浄し、室温で３０分間放置した。さらに、６ｍｌのバッファーＢ、６ｍｌのブロッキングバッファー、６ｍｌのバッファーＢでカラムを洗浄した後、ＰＢＳでカラムを平衡化して抗フコイダン抗体カラムを作製した。
【０１１２】
精製したガゴメ昆布由来フコイダンをＰＢＳに予め溶解し、得られた溶液を、上記抗フコイダン抗体カラムにアプライした。その後、得られた溶出液を、参考例１−（２）記載の方法に準じて、ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムクロマトグラフィーに供したところ、塩化ナトリウム濃度勾配によるＦ−フコイダンの溶出塩濃度に相当する画分にピークが見られなかった。すなわち、ＧＦＤＧ−２８を固定化したカラムを用いることにより、ガゴメ昆布由来フコイダンからＦ−フコイダンを除くことが可能であることが分かった。また、ＧＦＤ２−９Ｃを固定化したカラムを用いて得られた溶出液を、参考例３−（２）記載の方法に準じて処理した。その結果、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラムクロマトグラフィー後に６−５ｓを得ることが出来ず、６−５ｓ及び６−５ｓを含有する多糖を除くことが可能であることが分かった。
【０１１３】
以上、本発明の抗体を使用することにより、ＧＦＤ２−９Ｃ、ＧＦＤＧ−２８抗体に結合する化合物を構造に持った色々な化合物の検出と定量が可能になった。
【０１１４】
産業上の利用の可能性
本発明により、フコイダンの構造解析や、その定量に有用な、フコイダン構造に特異的に結合する抗フコイダン抗体が提供される。
当該抗体を使用することにより、フコイダンの構造と生理機能の関係が明らかになり、当該抗体は生化学的分野において極めて有用である。また種々のオリジンのフコイダンから、生理機能構造を有するフコイダンを選別することが可能となる。さらに当該抗体は目的のフコイダンの精製にも使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ガゴメ昆布由来フコイダンのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム溶出パターンを示す図である。

Claims

ＧＦＤＧ−２８（ＦＥＲＭＢＰ−７１７３）が産生する抗フコイダン抗体。
ＧＦＤ２−９Ｃ（ＦＥＲＭＢＰ−７１７４）が産生する抗フコイダン抗体。
請求項１または２記載の抗フコイダン抗体を固定した担体。