KR100641977B1

KR100641977B1 - 항푸코이단 항체

Info

Publication number: KR100641977B1
Application number: KR1020017014938A
Authority: KR
Inventors: 나카가와카즈오; 히노후미츠구; 카토이쿠노신
Original assignee: 다카라 바이오 가부시키가이샤
Priority date: 1999-06-11
Filing date: 2000-06-07
Publication date: 2006-11-02
Also published as: AU5106100A; US6686453B1; KR20020007418A; WO2000077049A1; ATE402959T1; EP1186616B1; CN1354757A; JP3741647B2; CN1191275C; EP1186616A1; DE60039695D1; EP1186616A4

Abstract

일반식(I) 또는 (II)에 의해 나타낸 화합물을 인식하는 항푸코이단 항체.

항푸코이단 항체

Description

항푸코이단 항체{ANTIFUCOIDAN ANTIBODY}

본발명은 생리학적으로 활성인 다당류, 푸코이단의 구조를 인식하고, 푸코이단의 기능 연구 및 구조 분석에 유용한 항체에 관한 것이다.

푸코이단은 분자 내에 황산염화된 푸코스(fucose)를 함유한 다당류이다. 실질적으로 우론산을 함유하지 않고 구성하는 당류의 주요 성분으로서 푸코스를 함유한 푸코이단, 및 우론산을 함유하고 구성하는 당류로서 푸코스 및 만노스를 함유하는 푸코이단이 공지되어 있다.

본 발명자는 실질적으로 우론산을 함유하지 않고 구성하는 당류의 주요 성분으로서 푸코스를 함유한 푸코이단, 즉 황산염화된-푸코스-함유 다당류-F(이후부터 F-푸코이단이라 칭함) 및 우론산을 함유한 푸코이단, 즉, 황산염화된-푸코스-함유 다당류-U(이후부터 U-푸코이단으로 칭함)를 개다시마속 크라시폴리아(Kjellmani

ella crassifolia)로부터 제조하였다(WO 97/26896 참조).

푸코이단의 공지된 생리학적 활성은 세포자살-유도 활성, 암 증식 억제 활성, 암전이 저해 활성, 항혈액응고 활성 및 항바이러스 활성을 포함한다. 그러므로, 푸코이단은 의약적 용도로서 개발될 것으로 기대된다. 더우기, 푸코이단은 화장품 재료로서 우수한 기능을 가진다.

그러므로, 푸코이단의 구조 및 생리학적 기능을 더욱 분석하는 것이 바람직하다.

발명의 목적

본발명의 주요 목적은 푸코이단의 구조를 특이적으로 인식하는 항체를 제공하는 것으로서, 이 항체는 푸코이단의 구조적 분석 및 구조와 생리학적 기능 간의 관계를 연구하는데 유용하다.

발명의 요약

본 발명자는 숙주를 개다시마속 크라시폴리아로부터 유래한 푸코이단인 항원으로 면역화시킴으로써 푸코이단의 구조를 인식하는 항체를 생성하는 세포를 성공적으로 만들어냈다. 그러므로, 본발명은 완성되었다.

따라서, 본발명은 일반식(I) 또는 (II)의 화합물을 인식하는 항-푸코이단 항체를 제공한다:

더 나아가, 본발명은 상기 항-푸코이단 항체가 고정되는 담체를 제공한다.

도 1: 개다시마속 크라시폴리아로부터 유래한 푸코이단의 DEAE-Cellulofine A-800 칼럼의 용리 패턴을 설명한다.

개다시마속 크라시폴리아로부터 유래한 푸코이단은 본발명의 항체의 제조에 대한 항원으로서 사용되고, WO 97/26896에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 특히, 참조 실시예 1-(1)에 기술된 바와 같이 제조될 수있다. 또한, U-푸코이단 및 F-푸코이단은 이 문헌에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 특히, 이들은 참조 실시예 1-(2)에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.

일반식(I)의 화합물은 WO 99/41288에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 특히, 참조 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.

일반식(II)의 화합물은 재 96/34004에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 특히, 참조 실시예3에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.

일반식(I)의 화합물은 알테로모나스 (Alteromonas) 종 SN-1009(FERM BP-5747)에 의해 생산된 F-푸코이단-분해 효소의 작용에 의해 F-푸코이단으로부터 생성된 더 작은 분자이다. F-푸코이단은 구성 단위로서 일반식(I)의 화합물이 반복되는 구조를 갖는다.

일반식(II)의 화합물은 플라보박테리움(Flavobacterium) 종 SA-0082(FERM BP-5402)에 의해 생산된 푸코이단-분해 효소의 작용에 의해 푸코이단으로부터 생성된 더 작은 분자이다.

본발명의 항-푸코이단 항체는 일반식(I) 또는 (II)의 화합물을 인식하는 한 폴리클론 항체일 수 있거나 또는 단일클론 항체로서 제조될 수 있다. 그러한 단일클론 항체는 소위 세포 융합 방법에 의해 제조된다. 특히, 단일클론 항체는 다음과 같이 제조된다. 하이브리도마는 항체-생성 세포를 골수종 세포와 함께 융합시켜 형성된다. 하이브리도마는 클로닝된다. 일반식(I) 또는 (II)의 화합물에 특이적인 항체를 생성하는 클론이 이후 선택된다.

예를 들면, 개다시마속 크라시폴리아로부터 유래한 푸코이단으로 면역화된 동물로부터의 비장 세포 또는 림프절 세포 내의 B 림프구가 항체-생성 세포로서 사용될 수 있다. 면역화될 동물은 마우스, 래트, 말, 염소 및 토끼에 의해 예시된다.

개다시마속 크라시폴리아로부터 유래한 푸코이단, U-푸코이단, F-푸코이단 등은 항원으로서 사용될 수 있다. 그러한 항원은 프로이드 보조제(Freund's adjuvant)와 함께 혼합시키고 동물을 면역화하는데 사용된다.

면역화는 경피적으로, 근육적으로 또는 복강 내에 20 - 200㎍/투여용량의 항원을 동물에게 2 내지 3 주에 한번씩 3 내지 7주 동안 투여함으로써 수행된다. 항체-생성 세포는 최종 면역화의 약 3 내지 5일 후에 면역화된 동물로부터 수집된다.

골수종 세포로서, 마우스, 래트, 사람 등으로부터 유래된 것이 사용된다. 세포 융합은 예를 들면 Nature, 256:495(1975)에 기술된 방법 또는 그 변형법에 따라서 수행된다. 이 방법에서, 세포 융합은 30 내지 40℃의 온도에서 약 1 내지 3분 동안 1000 내지 4000 분자량을 갖는 30 내지 50% 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 반응시켜 수행된다.

세포 융합에 의해 얻어진 하이브리도마는 효소 면역분석 등을 사용하여 선별된다. 그리하여 얻어진 항체-생성 하이브리도마는 클로닝된다. 특히, 클론은 예를 들면 희석을 제한시킴으로써 하이브리도마를 클로닝시켜 얻어진다. 클론은 이후 효소 면역분석 등을 이용하여 대상 단일클론 항체를 생성하는 클론에 대해 선별된다. 예를 들면, 선택된 클론은 프리스탄(2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸)을 투여한 BALB/c 마우스에 복강 내 이식된다. 고농도로 단일클론 항체를 함유한 복수(ascite)가 이식 10 - 14일 후 수집된다. 단일클론 항체는 암모늄 설페이트 분별법, 폴리에틸렌 글리콜 분별법, 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 크로마토그래피와 같은 항체를 정제하는 공지된 방법에 의해 복수로부터 용이하게 채취된다.

본발명의 항체는 상기에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있는 한 특이적인 것에 제한되지 않는다. 항체는 일반식(I)의 화합물을 인식하고 일반식(II)의 화합물을 인식하지 않는, 하이브리도마 GFD G-28(FERM BP-7173)에 의해 제조된 항-푸코이단 항체(이 항체는 이후 GFDG-28로 언급됨), 또는 일반식(I)의 화합물을 인식하지 않고 일반식(II)의 화합물을 인식하는, 하이브리도마 GFD 2-9C(FERM BP-7174)에 의해 제조된 항-푸코이단 항체(이 항체는 이후 GFD2-9C로 언급됨)에 의해 예시된다.

더 나아가, 본발명의 항체를 담체에 고정시키고 이를 흡수용 담체로 사용함으로써, 다음이 식별될 수 있다: 일반식(I) 또는 (II)의 화합물, 일반식(I) 또는 (II)의 화합물을 함유하는 다당류, 또는 구성 단위로서 일반식(I) 또는 (II)의 화합물을 갖는 다당류. 공지된 방법은 본발명의 항체를 담체에 고정시키는데 사용될 수 있다. 고정에 사용되는 담체의 재료는 목적 또는 방법에 따라 적절히 선택되는데, 아가로스, 셀룰로스 및 덱스트란 같은 다당류, 폴리아크릴아미드, 아크릴산 중합체, 스티렌 디비닐벤젠 중합체 및 폴리메타크릴레이트와 같은 합성 중합체, 및 실리카겔 및 유리와 같은 무기 중합체로부터 선택된다.

GFDG-28은 F-푸코이단을 인식한다. 그러므로, 이는 F-푸코이단을 측정하는데 사용될 수 있다. 더 나아가, 이것은 샌드위치 방법에서 일반식(I)의 화합물을 측정하는데 사용될 수 있다. 인식 부위는 푸코스-2-설페이트 부위로서 고려된다.

그러한 항체는 그 형태를 식별하면서 푸코이단을 측정하는데 유용하다. 예를 들면, 이 항체는 개다시마속 크라시폴리아으로부터 유래한 푸코이단을 측정하는 데 사용될 수 있다.

상기에서 기술된 바와 같이 얻어진 항체는 푸코이단의 구조 및 생리학적 활성 사이의 관계를 연구하는데 매우 유용하다. 더 나아가, 항체는 생체, 예를 들면 혈청, 혈장 또는 소변 내의 푸코이단-유래 물질의 농도를 특이적이고 정확하게 측정하는데 매우 유용하다.

이러한 목적으로, 단일클론 항체 자체 또는 Fab 단편과 같은 상응하는 면역학적 특성을 갖는 그 단편이 사용될 수 있다. 본발명의 항체는 유전공학적으로 생성된 항체 또는 그 단편을 포함한다.

다음의 실시예는 본발명을 보다 상세히 예시하는데, 본발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.

참조 실시예 1

(1) 개다시마속 크라시폴리아를 대량 건조시켰다. 20kg의 건조 생성물을 분말제조기 Jiyu Mill(Nra Machinery)를 사용하여 분쇄시켰다.

7.3kg의 칼슘 클로라이드 디하이드레이트(Nippon Soda)를 900 l의 수돗물 내에 용해시켰다. 20kg의 상기 분쇄된 개다시마속 크라시폴리아를 이 용액과 혼합시켰다. 혼합물의 온도는 12℃에서 90℃로 40분 동안 혼합물 내에 증기를 불어넣어 상승시켰다. 혼합물을 1시간 동안 교반시키면서 90 내지 95℃에서 배양시키고 이후 냉각시켜 1100 l의 냉각된 생성물을 얻었다.

냉각된 생성물을 고체-액체 분리기(CNA형, Westfalier Separator)를 사용하 여 고체-액체 분리시켜 약 900 l의 상청액을 제조하였다.

360 l의 상청액을 FE10-FC-FUS0382(30,000 Daicel의 분별 분자량)을 사용하여 20 l의 부피로 농축시켰다. 20 l의 수돗물을 이후 이 농축액에 부가시켰다. 결과의 혼합물을 다시 FE10-FC-FUS0382을 사용하여 20 l의 부피로 농축시켰다. 이 절차를 5번 반복하여 혼합물을 탈염시켰다. 그리하여, 25 l의 추출물이 개다시마속 크라시폴리아로부터 제조되었다.

1 l의 추출물을 동결건조시켜 개다시마속 크라시폴리아로부터 유래한 13g의 건조된 푸코이단을 얻었다.

(2) 참조 실시예 1-(1)에 기술된 바와 같이 건조된 푸코이단 7g을 500mM 염화나트륨 및 10% 에탄올을 함유한 700ml의 20mM 이미다졸 버퍼(pH 8.0) 내에 용해시켰다. 불용성 물질을 원심분리에 의해 제거시켰다. DEAE-Cellulofine A-800 칼럼(φ11.4 cm x 48 cm)(Seikagaku Corparation)이 동일한 버퍼로 평형이 되었다. 원심분리에 의해 얻어진 상청액을 칼럼에 적용시켰다. 칼럼을 동일한 버퍼로 세척시켰다. 50 mM로부터 1.95M까지의 염화나트륨 농도 구배를 사용하여 용리를 수행하였다. 용리물을 분획당 250ml의 속도에서 수집하였다. 총 수크로스 및 우론산 함량을 페놀-황산법 및 카바졸-황산법에 의해 측정하였다. 분획 번호 43-55 및 분획번호 56-67을 수집하였다. 이들 분획은 전기투석에 의해 탈염되고 이후 동결건조시켰다. 이후, 1.21g의 U-푸코이단을 함유한 분획 및 2.64g의 F-푸코이단을 함유한 분획을 분획 번호 43 내지 55 및 분획번호 56 내지 67로부터 각각 제조하였다.

도 1은 개다시마속 크라시폴리아로부터 유래한 푸코이단의 DEAE-Cellulofine A-800 칼럼으로부터의 용리 패턴을 예시한다. 도 1에서, 수직축(폐쇄 원)은 카바졸-황산법에 따라 측정된 530nm에서의 흡수도, 페놀-황산법에 따라 측정된 480nm에서의 흡수도(열린 원) 및 전도율(mS/cm, 열린 사각)를 나타낸다. 수평축은 분획 번호를 나타낸다.

참조 실시예 2

(1) 알테로모나스 종 SN-1009(FERM BP-5747)을 0.25% 글루코스, 1.0% 펩톤 및 0.05% 이스트 추출물(pH 8.2)을 함유하고, 120℃에서 20분 동안 2 l의 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask) 내에서 살균된 인조 해수(Jamarin Laboratory)로 구성된 배지 600 ml 내에 접종시키고 25℃에서 26 시간 동안 배양하여 해초 배양물을 제조하였다. 1.0% 펩톤, 0.02% 이스트 추출물, 아래 참조 실시예 2-(2)에서 기술된 바와 같이 제조된 0.2% 푸코이단 및 0.01% 소포제(KM70, Shin-Etsu Chemical)(pH 8.0)를 함유하는 인공 해수(Jamarin Laboratory)로 구성된 배지 20 l를 30 l 용기 발효기 내에 두고 120℃에서 20 분 동안 살균시켰다. 냉각 후, 600 ml의 해초 배양물을 상기 배지에 접종시키고 24℃에서 24 시간동안 10 l/분에서 폭기시키고 또한 250rpm에서 교반시키면서 배양시켰다. 배양 후, 배양물을 원심분리시켜 배양물 상청액을 얻었다. 배양물 상청액은 10,000의 분리 분자량을 갖는 빈 섬유를 구비한 한외여과 장치를 사용하여 농축시키고, 85%-포화 암모늄 설페이트를 사용하여 염석(salting out)시켰다. 결과의 침전물을 원심분리에 의해 수집하고 인공 해수를 1/10 농도에서 함유한 20 mM Tris-염산 버퍼(pH 8.2)에 대해 광범위하게 투석시켜 푸코이단에 선택적으로 작용하는 F-푸코이단-분해 효소의 용액 600ml를 제조하였다.

(2) 2kg의 건조 개다시마속 크라시폴리아를 1 mm 직경 크기의 체를 갖는 스크린을 구비한 절단 밀(Masuko Sangyo)을 사용하여 분쇄시켰다. 결과적인 개다시마속 크라시폴리아 조각을 20 l의 80% 에탄올 내에 현탁시켰다. 현탁액을 25℃에서 3 시간 동안 교반시키고, 필터 종이를 통해 여과시켰다. 결과의 잔류물을 광범위하게 세척하고 50 mM 염화나트륨을 함유하고 95℃에서 가열시킨 40 l의 20 mM 인산 나트륨 버퍼(pH 6.5) 내에 현탁시켰다. 현탁액을 95℃에서 2 시간동안 처리시키면서 일정 간격으로 교반시켜 푸코이단을 추출시켰다.

추출물 내에 현탁된 물질은 여과되어 여액을 제조하였다. 잔류물을 3.5 l의 100 mM 염화나트륨으로 세척하여 추가의 여액을 얻었다.

여액을 함께 조합하고 30℃로 냉각시켰다. 3000 U의 알기네이트 리아제(Nagase Biochemicals)를 거기에 부가시켰다. 4 l의 에탄올을 추가로 부가시켰다. 혼합물을 25℃에서 24 시간 동안 교반시켰다. 이 혼합물을 원심분리시켜 얻어진 상청액을 100,000의 분리 분자량을 갖는 빈 섬유를 구비한 한외여과 장치를 사용하여 4 l의 부피로 농축시켰다. 한외여과는 10% 에탄올을 함유한 100 mM 염화나트륨을 사용하여 계속되어 착색 물질이 여액 내에서 검출되지 않게 되었다.

잔류물 내에 생성된 침전물을 원심분리에 의해 제거시켰다. 상청액을 5℃로 냉각시켰다. pH를 0.5 N 염산을 사용하여 2.0으로 조절시켰다. 단백질 등으로 구성된 결과의 침전물을 원심분리에 의해 제거시켰다. 그리하여-얻어진 상청액의 pH는 1N 수산화나트륨을 사용하여 8.0으로 즉시 조절되었다.

용매는 100,000의 분리 분자량을 갖는 빈 섬유를 구비한 한외여과 장치를 사용하여 한외여과에 의해 20 mM 염화나트륨(pH 8.0)으로 완전히 대체되었다. pH를 다시 8.0으로 조절하였다. 원심분리 후, 동결건조를 수행하여 약 95g의 푸코이단을 제조하였다.

(3) 2kg의 건조 개다시마속 크라시폴리아를 1 mm의 직경 크기의 체를 갖는 스크린을 구비한 절단 밀을 사용하여 분쇄시켰다. 결과적인 개다시마속 크라시폴리아 조각을 20 l의 80% 에탄올 내에 현탁시켰다. 현탁액을 25℃에서 3 시간 동안 교반시키고, 필터 종이를 통해 여과시켰다. 결과의 잔류물을 광범위하게 세척하고, 참조 실시예 2-(1)에서 제조된 30ml의 F-푸코이단 분해 효소 용액, 10% 에탄올, 100 mM 염화나트륨, 50 mM 염화 칼슘 및 50 mM 이미다졸을 함유한 20 l의 버퍼(pH 8.2) 내에 현탁시켰다. 현탁액을 25℃에서 48 시간동안 교반시켰다. 현탁액을 32㎛ 스테인레스 스틸 체를 통해 여과시켰다. 잔류물을 50 mM 염화칼슘을 함유한 10% 에탄올로 세척시켰다. 잔류물을 50 mM 염화칼슘을 함유한 10 l의 10% 에탄올 내에 현탁시켰다. 현탁액을 3 시간동안 교반시키고, 스테인레스 스틸 체를 통해 여과시키고 세척시켰다. 잔류물을 동일한 방법으로 현탁시켰다. 현탁액을 16시간 동안 교반시키고, 32㎛ 스테인레스 스틸 체를 통해 여과시키고 세척시켰다.

여액 및 상기에서 기술된 세척 용액을 조합시키고, 3000의 분리 분자량을 갖는 빈 섬유를 구비한 한외여과 장치를 사용하여 한외여과시켜 잔류물로부터 여액을 분리시켰다.

여액을 회전 증발기를 사용하여 약 3 l의 부피로 농축시켰다. 농축물을 이후 원심분리시켜 상청액을 얻었다. 상청액을 300의 분리 분자량을 갖는 막을 구비한 전기투석 장비를 사용하여 탈염시켰다. 칼슘 아세테이트를 0.1 M의 최종 농도로 용액에 부가시켰다. 결과의 침전물을 원심분리에 의해 제거시켰다. 그리하여-얻어진 상청액을 50 mM 칼슘 아세테이트로 평형화된 DEAE-Cellulofine 칼럼(수지 부피: 4 l)에 적용시켰다. 50 mM 칼슘 아세테이트 및 50 mM 염화나트륨으로 광범위하게 세척시킨 후, 50 mM로부터 800 mM까지의 염화나트륨 농도 구배를 사용하여 용리를 수행시켰다. 용리물을 분획 당 500 ml의 속도에서 수집하였다. 수집된 분획물을 셀룰로스 아세테이트 막 전기영동(Analytical Biochemistry, 37:197-202(1970))을 사용하여 분석시켰을 때, 약 0.4 M의 염화나트륨 농도(분획 번호 63 근처)를 사용하여 용리된 푸코이단이 균질한 것으로 나타났다.

이후, 분획 번호 63 내에 함유된 용액을 150 ml의 부피로 농축시켰다. 염화나트륨을 4 M의 최종 농도에서 거기에 부가시켰다. 이 혼합물을 4 M 염화나트륨으로 평형화된 Phenyl-Cellulofine 칼럼(수지 부피: 200 ml)에 적용시켰다. 이 칼럼을 4 M 염화나트륨으로 광범위하게 세척시켰다. 푸코이단으로부터의 비-흡착 분해 생성물을 함유한 분획을 수집하고 300의 분리 분자량을 갖는 막을 구비한 전기투석 장비를 사용하여 탈염시켜 505 ml의 탈염된 용액을 얻었다.

40 ml의 탈염된 용액을 겔 여과를 위해 10% 에탄올을 함유한 0.2 M 염화나트륨으로 평형화된 Cellulofine GCL-90 칼럼(4.1 x 87 cm)(Seikagaku Corporation)에 적용시켰다. 용리물을 분획당 9.2 ml의 속도에서 수집하였다.

총 당의 양의 분석은 페놀-황산법(Analytical Chemistry, 28: 350 (1956))에 따라 모든 분획에 대해 수행되었다.

결과로서, 푸코이단으로부터의 분해 생성물이 단일 피크를 형성하였다. 피크에 집중된 분획 번호 63 내지 70이 수집되었고, 300의 분리 분자량을 갖는 막을 구비한 전기투석 장비를 사용하여 탈염시키고, 동결건조시켜 112 mg의 일반식(I)의 화합물의 건조 생성물(이후 7-12s로 간단히 언급됨)을 얻었다.

참조 실시예 3

(1) 플라보박테리움(flavobacterium) 종 SA-0082(FERM BP-5402)을 0.1% 글루코스, 1.0% 펩톤 및 0.05% 이스트 추출물(pH 7.5)을 함유하고, 120℃에서 20분 동안 2 l의 삼각 플라스크 내에서 살균된 인조 해수(Jamarin laboratory)로 구성된 배지 600 ml 내에 접종시키고 24℃에서 20 시간 동안 배양하여 해초 배양물을 제조하였다. 참조 실시예 2-(2)에서 기술된 바와 같이 제조된 0.3% 푸코이단, 0.5% 펩톤, 0.01% 이스트 추출물, 및 0.01% 소포제(KM70, Shin-Etsu Chemical)(pH 7.5)를 함유하는 인공 해수(Jamarin Laboratory)로 구성된 배지 20 l를 30 l 용기 발효기 내에 두고 120℃에서 20 분 동안 살균시켰다. 냉각 후, 600 ml의 해초 배양물을 상기 배지에 접종시키고 24℃에서 20 시간동안 10 l/분에서 폭기시키고 또한 125rpm에서 교반시키면서 배양시켰다. 배양 후, 배양물을 원심분리시켜 배양물 상청액을 얻었다. 배양물 상청액은 10,000의 분리 분자량을 갖는 중공섬유를 구비한 한외여과 장치를 사용하여 400ml의 부피로 농축시켜 푸코이단-분해 효소의 용액을 얻었다.

(2) 개다시마속 크라시폴리아에서 유래된 푸코이단을 5%의 농도에서 함유하는 용액 600 ml, 750 ml의 100 mM 포스페이트 버퍼(pH 8.0), 150 ml의 4 M 염화나트륨 및 참조 실시예 3-(1)에서 제조된 푸코이단-분해 효소 용액 120 ml를 함께 혼합시키고, 25℃에서 144 시간 동안 반응시켰다.

반응 혼합물을 3500의 공극 크기를 갖는 투석 막을 사용하여 투석시켜 3500 또는 그 미만의 분자량을 각각 갖는 물질을 함유한 분획을 수집하였다. 분획은 Microanalyzer G3(Asahi Kasei)를 사용하여 탈염시켰고, 500 ml의 탈염된 용액이 얻어졌다. 탈염된 용액을 10 mM 암모늄 아세테이트로 평형화된 DEAE-Sepharose FF 칼럼(5 cm x 26 cm)(Pharmacia)에 적용시켰다. 용리를 1 l의 10 mM 암모늄 아세테이트, 1 l의 10 mM로부터 1 M까지의 암모늄 아세테이트 농도 구배, 및 1 l의 1 M로부터 5 M까지의 암모늄 아세테이트 농도 구배를 순서대로 사용하여 수행하였다. 분획 번호 64 내지 78을 수집하였고, 200 ml의 부피로 농축시켰고, 탈염시키고 500 mM 암모늄 아세테이트로 평형화된 DEAE-Sepharose FF 칼럼(2.4 cm x 22 cm)에 적용시켰다. 용리는 100 ml의 500 mM 암모늄 아세테이트 및 900 ml의 500 mM로부터 2 M 까지의 암모늄 아세테이트 농도 구배를 순서대로 사용하여 수행하였다. 용리물을 분획 당 9.7 ml의 속도에서 수집하였다. 분획 번호 92 내지 96을 수집하였고, 농축시키고, 탈염시켜 일반식(II)의 화합물(이후 6-5s로 간단히 언급됨)을 얻었다.

실시예 1

항-푸코이단 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포의 제조 및 클로닝

(1) 항원으로서 참조 실시예 1-(1)에서 기술된 바와 같이 제조된 개다시마속 크라시폴리아로부터 유래한 푸코이단 100㎍을 100 ㎕ 부피의 프로이드 완전 보조제(Freud's complete adjuvant)와 혼합시키고 유화시켰고, 이후 6주된 암컷 Balb/c 마우스(Clea Japan) 각각의 복강 내에 투여하였다.

프라이밍 21일 후, 100㎍의 프라이밍에 사용된 것과 동일한 푸코이단 을 100 ㎕ 부피의 프로이드 완전 보조제(Freud's complete adjuvant)와 혼합시키고 유화시켰고, 이후 부스팅을 위해 상기 마우스 각각에 복강내 투여하였다.

부스팅 14일 후, 프라이밍에 사용된 것과 동일한 푸코이단 100 ㎍을 예비 면역화를 위해 100㎕의 부피에서 상기 마우스 각각에 복강내 투여하였다.

예비 면역화 3일 후, 비장을 각 마우스로부터 제거시키고 10 ml의 RPMI 1640 배지(Bio Whittaker) 내에서 스테인레스 스틸 체를 사용하여 균질하게 천천히 분산시켰다. 비장 세포는 1500 rpm에서 원심분리를 반복하고 세번 세척시킴으로써 분리시켰다.

그리하여-얻어진 비장 세포는 원심분리시켰고 세척된 마우스 골수암 P3U1(P3X63AgU.1)과 함께 조합시켰다. 1ml의 PEG 1500 용액(폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 50%(v/v)의 농도로 함유한 RPMI 1640 배지)을 이 혼합물에 1분에 걸쳐 적가했다. 1분 동안 추가로 혼합시킨 후, 혼합물을 RPI 1640 배지로 천천히 희석시켜 PEG 농도를 5%(v/v)로 만들었다.

원심분리에 의해 세포를 분리하고 거기에 증식 배지(10% 태아 송아지 혈청(FCS)를 함유한 RPMI 1640 배지)를 천천히 부가시킴으로써 분산시켰다. 0.1 ml의 부피 내에 10⁶ 개의 세포가 96-웰 배양 평판(Falcon) 각 웰 내로 접종되었다. 이 평판은 5% CO₂ 배양기 내에서 37℃에서 밤새 배양되었다.

다음 날, 0.1 mM 하이포잔틴, 0.4 μM 아미노프테린 및 16μM 티미딘을 부가시켜 제조된 상기 증식 배지에 대해 선택적인 배지(이후 HAT 배지로서 언급됨) 100㎖를 각 웰에 부가시켰다. 배지를 100㎖의 신선한 HAT 배지로 1 또는 2일 간격으로 대체시키면서, 즉, 비-융합된 세포가 죽고 융합된 세포만이 생존하는 선택적 조건하에서 배양을 계속하였다.

더 나아가, 배양 상청액 내에 함유된 항-푸코이단 단일클론 항체는 생존한 융합 세포 중 항체 생성에 대해 양성인 라인을 선택하기 위해 콜로니가 커졌을 때 효소 면역분석으로 검출되었다.

면역화를 위해 항원으로서 사용된 푸코이단의 농도를 포스페이트 버퍼된 식염수(PBS)로 10㎍/ml로 조절되었다. 50㎕의 희석액을 96-웰 마이크로역가 평판(Nunc)의 각 웰 내에 부가시켰다. 이 평판을 고정을 위해 4℃에서 밤새 방치시켰다.

고정 후, 액체를 버리고 200㎕의 시판되는 블로킹 시약(Block Ace, Dainippon Pharmaceutical)을 각 웰에 부가시켰다. 이 평판을 37℃에서 2 시간 동안 블로킹을 위해 배양시켜 고정된 항원을 갖는 평판을 제조하였다.

각각의 융합된 세포로부터의 배양 상청액 각 50㎕를 상기 평판에 부가시켰다. 이 평판을 37℃에서 1 시간 동안 배양시켜 항원-항체 반응을 실행시켰다.

평판을 PBS로 세척시켰다. 50㎕의 생강무 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)-표지된 항-마우스 IgG 항체(Zymed)의 1000배 희석액을 상기 블로 킹제와 함께 각 웰에 부가시켰다. 상기 평판을 37℃에서 1 시간 동안 배양시켰다.

평편을 PBS로 세척시켰다. 50㎕의 ABTS/0.02% 과산화 수소 용액(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산) 디암모늄 염(ABTS, Nacalai Tesque)을 0.55 mg/ml의 농도로 함유하고 0.02% 과산화 수소를 함유하는 0.1 M 시트레이트-수산화 나트륨 버퍼(pH 4.0))을 각 웰에 부가시켰다. 평판을 실온에서 15분간 색 전개를 위해 배양시켰다.

녹색으로 전개된 웰을 양성으로 판정하였다. 양성 라인은 96-웰 평판으로부터 24-웰 평판으로 콜로니를 옮기고, 이후 HT 배지(아미노프테린이 없는 HAT 배지) 내의 6-웰 평판으로 옮김으로써 확대시켰다. 다음과 같은 제한적 희석에 의해 클로닝을 수행하였다. 확대된 세포는 시판되는 클로닝 배지(S-Colne, Sanko Junyaku)로 96-웰 배양 평판의 각 웰이 하나의 세포를 갖도록 희석되었다. 희석액을 이후 96-웰 평판에 뿌리고 이 세포를 배양시켰다.

재배한 단일 콜로니로부터의 배지 상청액을 양성 라인을 검출하기 위해 고정된 항원으로서 푸코이단을 갖는 평판을 사용하여 효소 면역 분석 시켰다.

결과로서, 두 개의 단일클론 항체-생성 세포 클론, GFD 2-9C 및 GFD G-28이 얻어졌다. 이들 세포는 1996년 10월 29일(최초 기탁일)에 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소, 일본 아바카키-켄, 츠쿠바-시, 히가시 1-초메, 1-3에 수탁 번호 FERM BP-7174(GFD 2-9C) 및 FERM BP-7173(GFD G-28) 기탁되었다.

(2) 클로닝된 단일클론 항체-생성 세포 각각은 증식 배지(10% 태아 송아지 혈청(FCS)를 함유한 RPMI 1640 배지) 내에서 재배되었고, 이후 10⁶ 내지 10⁷ 개의 세포를 0.5 ml의 먼역억제제, 프리스탄(2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸, Wako Pure Chemical Industries)를 3주전에 투여한 Balb/c 마우스의 복강 내에 이식시켰다. 단일클론 항체를 2주 후에 수집된 축적된 복수로부터 정제시켰다.

(3) 각 마우스의 복강으로부터 수집된 복수는 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리시켜 침전물을 제거시켰다. 상청액을 PBS로 두번 희석시키고 면(cotton)을 통해 여과시켰다. 그리하여-얻어진 여액을 50% 암모늄 설페이트로 염석시켜 항체를 침전시키고, 이후 원심분리시켰다.

결과의 침전물을 PBS 내에 용해시켰다. 용액을 PBS에 대해 투석하여 암모늄 설페이트를 제거시키고, 이후 종래의 방법에 따라 Protein A 칼럼(Pharmacia)을 사용하여 친화 처리시켰다.

이 칼럼을 Protein A 흡착 버퍼(3M NaCl, 1.5 M 글리신, pH 8.9)로 평형화시켰다. 항체를 함유한 투석된 용액은, 침전물을 용해시킴으로써 제조되었고, Protein A 칼럼으로 처리되었다. 흡착된 분획을 Protein A 흡착 버퍼로 세척시키고, 이후 0.1 M 시트레이트 버퍼(pH 4.0)으로 용리시켰다.

용리된 분획을 PBS에 대해 투석시켰다. 그리하여-얻어진 투석물을 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(이후 SDS-PAGE로 언급됨)시켰을 때, 단일 밴드가 생기는 것이 확인되었다. 그러므로, 정제된 항체가 얻어졌다.

하이브리도마 GFD 2-9C 및 GFD G-28에 의해 제조된 항-푸코이단 항체는 GFD2-9C 및 GFDG-28로 각각 명명되었다.

(4) 항-푸코이단 항체의 하위분류는 시판되는 토끼 항-마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgM 폴리클론 항체(Zymed)를 사용하여 효소 면역분석에 의해 결정되었다.

면역화를 위한 항원으로서 사용된 정제된 푸코이단의 농도는 PBS로 10㎍/ml로 조절되었다. 50㎕의 희석액을 96-웰 마이크로역가 평판(Nunc)의 각 웰에 부가시켰다. 이 평판을 흡착을 위해 4℃에서 밤새 방치시켰다.

평판 내의 액체는 버리고, 평판을 PBS로 세척시키고, 200㎕의 시판 블로킹제(Block Ace, Dainippon Pharmaceutical)를 각 웰에 부가시켜 각 웰을 블록시켜 항원 평판을 제조하였다.

정제된 항-푸코이단 항체 GFD2-9C 및 GFDG-28 각각의 농도는 시판 블로킹제(Block Ace, Dainippon Pharmaceutical)로써 10㎍/ml로 조절되었다. 50㎕의 각 희석액을 평판에 부가시켰다. 평판을 37℃에서 1시간동안 반응을 위해 배양시켰다.

평판을 PBS로 세척시켰다. 시판 토끼 항-마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgM 폴리클론 항체(Zymed)의 각각의 1000배 희석액 50㎕ 를 시판 블로킹제(Block Ace, Dainippon Pharmaceutical)와 함께 각 웰에 부가시켰다. 이 평판을 반응을 위해 37℃에서 1시간동안 배양시켰다.

평판을 PBS로 세척시켰다. 시판되는 HRP-표지된 항-토끼 2차 항체(Zymed)의 500배 희석액 50㎕를 시판 블로킹제(Block Ace, Dainippon Pharmaceutical)와 함께 각 웰에 부가시켰다. 평판을 반응을 위해 1시간 동안 37℃에서 배양시켰다.

평판을 PBS로 세척시켰다. ABTS/0.02% 과산화수소 용액 50㎕를 각 웰에 부 가시켰다. 이 평판을 실온에서 15분간 색 전개를 위해 배양시켰다.

결과로서, 두 항체 모두 IgG1 하위분류인 것으로 증명되었다.

(5) 푸코이단-유래 화합물, 7-12s 및 6-5s는 개다시마속 크라시폴리아로부터 유래한 푸코이단과 함께 경쟁 테스트를 수행하는데 사용되었다.

개다시마속 크라시폴리아로부터 유래된 정제된 푸코이단의 농도는 PBS로써 10㎍/ml로서 조절되었다. 50㎕의 용액을 96-웰 마이크로역가 평판(Nunc)의 각 웰에 부가되었다. 이 평판은 고정을 위해 4℃에서 밤새 방치시켰다. 시판되는 블로킹제(Block Ace, Dainippon Pharmaceutical) 200㎕를 사용하여 블로킹을 수행하여 항원 평판을 제조하였다.

효소적으로 분해된 당류 단편 용액의 농도는 증류수로써 1 mg/ml로 조절되었다. 3개의 3배 일련적 희석액(3-, 9- 및 27-배)이 시판 블로킹제(Block Ace, Dainippon Pharmaceutical)를 사용하여 상기 각 용액에 대해 제조되었다. 이들 희석액 뿐만 아니라 블로킹제만을 함유하고 7-12s 및 6-5s를 함유하지 않는 용액을 포함하는 경쟁 용액을 1.5-ml Eppendorf 튜브(Eppendorf)에서 분산시켰다.

항체 용액은 항-푸코이단 항체 GFD2-9C 및 GFDG-28의 농도를 10㎍/ml으로 시판 블로킹제(Block Ace, Dainippon Pharmaceutical)를 사용하여 조절시켜 제조하였다.

10㎍/ml의 농도에서 항체 GFD2-9C 또는 GFDG-28 함유하는 용액 50㎕를 경쟁 용액(7-12s 또는 6-5s를 규정된 농도에서 함유하거나, 블로킹제만을 함유하는 용액)에 부가시켰다. 이 혼합물을 37℃에서 30분간 배양시켜 1차 반응 혼합물을 제 조하였다.

1차 반응에서, 항체 GFD2-9C 또는 GFDG-28 내의 결합 부위가 경쟁 용액 내의 7-12s 또는 6-5s와의 결합 반응에 의해 점유되면(즉, 항체에 대한 결합 부위가 7-12s 또는 6-5s 내에 존재한다면), 2차 반응에서, 평판 상에 고정된 항원에 대한 항체의 결합 능력은 7-12s 또는 6-5s의 농도에 비례하여 상실된다.

2차 반응을 위해, 각 1차 반응 혼합물을 각각 50㎕씩 개다시마속 크라시폴리아로부터 유래한 푸코이단을 고정된 항원으로서 갖는 평판에 부가시켰다. 이 평판을 37℃에서 1시간동안 배양시켰다.

이 평판을 PBS로 세번 세척시킨 후, HRP-표지된 항-마우스 2차 항체의 500배 희석액 50㎕ 를 시판되는 블로킹제(Block Ace, Dainippon Pharmaceutical)와 함께 각 웰에 부가시켰다. 이 평판을 37℃에서 1시간동안 배양시켰다.

이 평판을 PBS로 네번 세척시킨 후, 50㎕의 ABTS/0.02% 과산화수소 용액을 각 웰에 부가시켰다. 이 평판을 15분동안 색 전개를 위해 배양시켰다.

50㎕의 150 mM 옥살산을 각 웰에 부가시켜 반응을 정지시키고, 평판 판독기를 사용하여 405 nm에서 흡수도를 측정하였다.

다시 말하면, 색 전개가 경쟁 용액 내의 7-12s 또는 6-5s의 농도에 비례하여 감소하면 항체에 대한 결합 부위가 7-12s 또는 6-5s 내에 존재하는 것으로 생각된다.

결과적으로, 항 푸코이단 항체 GFD2-9C는 6-5s에 결합하고 7-12s에는 결합하지 않으며, GFDG-28은 7-12s에는 결합하고 6-5s에는 결합하지 않는 것으로 아래 표 1에서 나타내어진 바와 같이 입증되었다.

표 1

항체 클론	화합물	경쟁 화합물 농도 (㎍/ml)
		333	111	36.7	0
		405nm에서 측정된 흡수도
GFD2-9C	6-5s	0.160	0.235	0.277	0.293
GFD2-9C	7-12s	0.294	0.281	0.318	0.305
GFDG-28	6-5s	0.364	0.385	0.405	0.400
GFDG-28	7-12s	0.194	0.345	0.373	0.418

(6) HRP-표지된 항체는 P. K. Nakane, "Immunoassays in the Clinical Laoratory", pp. 81, Alan R. Liss Inc. (1979)에서 기술된 방법에 의해 제조되었다.

10mg의 HRP(Boehringer-Mannheim)가 1ml의 증류수 내에 용해되었다. 0.2 ml의 0.1 M 소듐 퍼아이오데이트를 거기에 부가시켰다. 혼합물을 실온에서 20분간 반응시키고, 이후 1 mM 소듐 아세테이트 버퍼(pH 4.0)에 대해 밤새 투석시켰다.

결과의 용액의 pH는 0.02 ml의 2M 소듐 카보네이트 버퍼(pH 9.5)fm 부가시켜 9 내지 9.5로 조절되었다. 0.01 M 소듐 카보네이트 버퍼(pH 9.5)에 대해 투석된 단일클론 항체 GFD2-9C 및 GFDG-28 중의 하나를 최종 농도 10 mg/ml에서 상기 투석된 용액에 부가시켰다. 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 0.1 ml의 소듐 보론 하이드라이드(4 mg/ml)를 이후 각 혼합물에 부가시키고, 결과의 혼합물을 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다.

반응 혼합물을 4℃에서 밤새 PBS에 대해 투석시켰다. 그리하여, HRP-표지된 GFD2-9C 및 HRP-표지된 GFDG-28을 얻었다.

항체 GFD2-9C 또는 GFDG-28의 농도는 PBS로써 10 ㎍/ml로 조절되었다. 50 ㎕의 두 용액 중 하나를 96-웰 마이크로역가 평판(Nunc)의 각 웰에 부가시켰다. 평판을 4℃에서 밤새 방치시켜 항체를 고정시켰다.

평판의 각 웰 내의 액체를 버리고, 200㎕의 시판 블로킹제(Block Ace, Dainippon Pharmaceutical)를 각 웰에 부가시켰다. 이 평판을 37℃에서 1 시간동안 블로킹을 위해 배양시켜 고정된 평판을 제조하였다.

GFD2-9C를 사용한 측정 시스템을 위해 6-5s를 40㎍/ml(최고 농도)의 농도에서 함유한 5배의 일련적 희석액, 또는 GFDG-28를 사용한 측정 시스템을 위해 7-12s를 111㎍/ml(최고 농도)의 농도에서 함유한 3배의 일련적 희석액 각 50 ㎕를 평판에 대한 기준물질(이후 STD로서 언급됨)로서 부가시켰다. 평판을 반응을 위해 37℃에서 1시간 동안 배양시켰다.

반응 후, 평판을 PBS로 세번 세척시켰다. HRP-표지된 GFD2-9C 또는 PRP-표지된 GFDG-28의 500배 희석액 50㎕를 시판 블로킹제와 함께 각 웰에 부가시켰다. 이 평판을 반응을 위해 37℃에서 1 시간 동안 배양시켰다.

반응 후, 평판을 PBS로 네번 세척시켰다. ABTS/0.02% 과산화수소 용액 50㎕를 각 웰에 부가시켰다. 평판을 실온에서 15분간 색 전개를 위해 배양시켰다.

405 nm에서의 흡수도를 평판 판독기를 사용하여 각 웰에 대해 측정되었다. 결과를 표 2에 나타내었다.

STD로서의 6-5s(GFD2-9C에 대해) 또는 7-12s(GFDG-28에 대해)와 함께 측정된 흡수도에 기초하여 보정 곡선을 제조하였다.

결과로서, 측정된 흡수도 값은 6-5s 또는 7-12s의 농도에 비례하여 아래 표 2에 나타낸 바와 같이 증가하였다. 이들 결과는 샌드위치 효소 면역분석(샌드위치 EIA)측정 시스템이 잘 동작함을 보여준다.

표 2

고정된 항체 GFD2-9C			HRP-표지된 항체 GFD2-9C			STD 6-5s
405 nm에서 측정된 흡수도 최고 농도(40㎍/ml)로부터 시작하여 5-배 일련적 희석액
최고 1.687	0.870	0.264	0.111	0.062	0.073	0.058
고정된 항체 GFDG-28			HRP-표지된 항체 GFDG-28			STD 7-12s
405 nm에서 측정된 흡수도 최고 농도(111㎍/ml)로부터 시작하여 3-배 일련적 희석액
최고 1.589	0.780	0.316	0.150	0.087	0.066	0.042

개다시마속 크라시폴리아로부터 유래한 푸코이단은 GFD2-9C 및 HRP-표지된 GFDG-28의 조합을 사용하여 샌드위치 EIA 측정 시스템에서 측정될 수 있다. 그 결과를 아래 표 3에 나타내었다. 추가로, GFD2-9C 및 HRP-표지된 GFD2-9C의 조합, GFDG-28 및 HRP-표지된 GFDG-28의 조합 및 GFDG-28 및 HRP-표지된 GFD2-9C의 조합은 각각 측정되었다. 결과로서, 개다시마속 크라시폴리아로부터 유래된 푸코이단이 이들 조합을 사용하여 샌드위치 EIA 측정 시스템 내에서 측정될 수 있는 것을 알아냈다. 더우기, F-푸코이단은 GFDG-28 및 HRP-표지된 GFDG-28의 조합을 사용하여 샌드위치 EIA 측정 시스테에서 측정될 수 있음을 알아냈다.

표 3

고정된 항체 GFD2-9C			HRP-표지된 항체 GFDG-28			STD 개다시마속 크라시폴리아로부터의 푸코이단
405 nm에서 측정된 흡수도 최고 농도(40㎍/ml)로부터 시작하여 5-배 일련적 희석액
최고 0.449	0.220	0.139	0.089	0.086	0.073	0.072

실시예2

항-푸코이단 항체 칼럼의 제조

HiTrap NHS-활성화된 칼럼(Pharmacia)을 6ml의 1 mM 염산을 사용하여세척시켰다. 실시예1-(3)에서 정제된 GFDG-28 용액 0.9 ml를 칼럼에 적용시켰다. 실온에서 1 시간동안 방치시킨 후, 칼럼을 커플링 버퍼(0.5 M 염화 나트륨, 0.2 M 중탄산 나트륨, pH 8.3) 3ml로 세척시켰다. 다음, 칼럼을 6 ml의 블로킹 버퍼(0.5 M Tris-염산(pH 8.3), 0.5 M 염화나트륨), 6ml의 버퍼 B(0.1 M 소듐 아세테이트(pH 4.0), 0.5 M 염화 나트륨) 및 6 ml의 블로킹 버퍼로써 순서대로 세척시키고, 이후 칼럼을 30분간 실온에서 방치시켰다. 칼럼을 6 ml의 버퍼 B, 6ml의 블로킹 버피및 6 ml의 버퍼 B로 추가로 세척시키고, 이후 칼럼을 PBS로 평형화시켜 항-푸코이단 항체 칼럼을 제조하였다.

개다시마속 크라시폴리아로부터 유래한 정제된 푸코이단을 PBS 내에 용해시켜 얻어진 용액을 항-푸코이단 항체 칼럼에 적용시켰다. 용리물을 참조 실시예1-(2)에서 기술된 바와 같이 DEAE-Cellulofine A-800 칼럼 크로마토그래피시켰을 때, F-푸코이단이 염화나트륨 구배를 사용하여 용리되는 염 농도에 상응하는 분획에 대해 어떠한 피크도 관찰되지 않았다. 그러므로, GFDG-28이 고정된 칼럼을 사용하여 개다시마속 크라시폴리아로부터 유래된 푸코이단으로부터 F-푸코이단이 제거될 수 있음을 발견하였다. 더우기, 고정된 GFD2-9C 칼럼으로 얻어진 용리물을 참조 실시예 3-(2)에 기술된 바와 같이 처리되었을 때, 6-5s는 DEAE-Sepharose FF 칼럼 크로마토그래피 후에 얻어질 수 없었다. 그러므로, 6-5s 및 6-5s를 함유한 다당류가 제거될 수 있음을 발견하였다.

상기에서 기술된 바와 같이, 본발명의 항체를 사용함으로써, 항체 GFD2-9C 또는 GFDG-28에 결합하는 화합물을 그 구조 내에 갖는 다양한 물질이 검출되고 정량될 수 있다.

본발명은 푸코이단의 구조에 특이적으로 결합하고, 푸코이단의 구조 분석 및 정량에 유용한 항-푸코이단 항체를 제공한다. 푸코이단의 구조 및 생리학적 기능 간의 관계는 항체를 사용하여 밝혀진다. 그러므로, 그러한 항체는 생화학 분야에서 매우 유용하다. 더 나아가, 생리학적으로 기능적인 구조를 갖는 푸코이단은 다양한 기원의 것들로부터 선택될 수 있다. 더우기, 항체는 대상 푸코이단을 정제하는데 사용될 수 있다.

Claims

하이브리도마 GFD G-28(FERM BP-7173)에 의해 생성되는 항-푸코이단 항체.
하이브리도마 GFD 2-9C(FERM BP-7174)에 의해 생성되는 항-푸코이단 항체.
제 1항 또는 제 2항에 의해 정의된 항-푸코이단 항체가 고정된 담체.
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