WO2000077049A1

WO2000077049A1 - Anticorps antifucoidan

Info

Publication number: WO2000077049A1
Application number: PCT/JP2000/003679
Authority: WO
Inventors: Kazuo Nakagawa; Fumitsugu Hino; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date: 1999-06-11
Filing date: 2000-06-07
Publication date: 2000-12-21
Also published as: AU5106100A; US6686453B1; KR20020007418A; ATE402959T1; EP1186616B1; CN1354757A; KR100641977B1; JP3741647B2; CN1191275C; EP1186616A1; DE60039695D1; EP1186616A4

Description

明細書抗フコィダン抗体

技術分野

本発明は、生理活性多糖であるフコィダンの機能研究や、構造解析に有用なフコィダンの構造を認識する抗体に関する。背景技術

フコィダンとは、分子中にフコース硫酸を含有する多糖であり、フコィダンには、ゥロン酸を実質的に含まず構成糖の主成分がフコースのものと、ゥロン酸を含み構成糖にフコースゃマンノースを含むものがある。

本発明者らは、ガゴメ昆布より、ゥロン酸を実質的に含まず構成糖の主成分がフコースであるフコィダン、すなわちフコース硫酸含有多糖一 F (以下、 F—フコィダンと称す）、及ぴゥロン酸を含むフコィダン、すなわちフコース硫酸含有多糖一 U (以下、 U—フコィダンと称す）をそれぞれ調製している（国際公開 W O 9 1 / 2 6 8 9 6号公報参照）。

フコィダンの生理作用としては、アポトーシス誘発活性、がん増殖抑制活性、がん転移抑制活性、抗凝血活性、抗ウィルス活性等が知られており、医薬品としての用途開発が期待されている。またフコインダンは、化粧品素材としても優れた機能を有している。

そのため、フコィダンの構造や生理機能をさらに解析することが求められている。発明の目的

本発明の目的は、フコィダンの構造を特異的に認識し、フコィダンの構造解析や、構造と生理機能の関係の究明に有用な抗体を提供することにある。発明の概要本発明者らはガゴメ昆布由来フコィダンを抗原とし、宿主を免疫することにより、フコィダンの構造を認識する抗体を産生する細胞を創成することに成功し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は下記式（I) 又は（I I) で表される化合物を認識する抗フコィダン抗体を提供する。

(I)

(I I) さらに、本発明は上記抗フコィダン抗体を固定化した担体を提供する c 図面の簡単な説明

図 1 ：ガゴメ昆布由来フコィダンの DEAE—セル口ファイン A— 800カラム溶出パターンを示す図である。発明の詳細な説明

本発明の抗体を調製するための抗原となるガゴメ昆布由来フコィダンは、国際公開 W097/26896号公報記載の方法により調製することができる。具体的には、参考例 1一（1) に記載の方法で調製することができる。また U—フコィダン及び F—フコィダンも当該公報記載の方法により調製することができる。具体的には、参考例 1— (2) に記載の方法で調製することができる。

また式（ I ) で表される化合物は、国際公開 WOO 0Z41288号公報記載の方法により調製することができる。具体的には、参考例 2に記載の方法で調製することができる。

更に式（I I) で表される化合物は、国際公開 WO 96/34004号公報記載の方法により調製することができる。具体的には、参考例 3に記載の方法で調製することができる。

なお、式（I) で表される化合物は、アルテロモナス（Alteromonas) s p. SN- 1009 (FERM BP— 5747) の産生する F—フコィダン分解酵素による、 F—フコィダンの低分子化物であり、 F—フコィダンは式 (I) で表される化合物を構成単位とした繰り返し構造を有している。

また、式（I I) で表される化合物は、フラボパクテリゥム（Flavobacteriu m) s p. S A— 0082 (FRERM BP— 5402) の産生するフコイダン分解酵素による、フコィダンの低分子化物である。

本発明の抗フコィダン抗体は、式（I) 又は式（I I) で表される化合物を認識するのであればポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体として調製することもできる。当該モノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合法によって製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞の間に、融合ハイプリドーマを形成させ、該ハイプリドーマをクローン化し、上記の式（I) 又は式

(I I) で表される化合物に対して特異性を示す抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。

抗体産生細胞は、例えばガゴメ昆布由来フコィダンによりそれぞれ免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞 Bリンパ球が使用できる。免疫させる動物としては、マウス、ラット、馬、ャギ、ゥサギ等が例示される。

抗原としてはガゴメ昆布由来フコィダン、 U—フコィダン、又は F—フコイダン等が利用可能であり、これらの抗原をフロイントのアジュバントと混合し、動物の免疫用として使用する。

免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に 1回に 20〜200 μ g、 2〜3 週に 1回、 3〜7週間、抗原を投与することによって行われる。最終免疫より約 3〜5日後、免疫動物から抗体産生細胞を分取する。

骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用される。細胞融合は、例えばネイチヤー（Nature) 、第 256卷、第 495頁（1975) に記载の方法又はこれに準ずる方法によって行われる。この際、 30〜50%ポリエチレングリコール（分子量 1000〜4000) を用い、 30〜40°Cの温度下、約 1〜3分間程度反応させることによって行われる。

細胞融合によって得られたハイプリドーマはスクリーニングに付される。スクリーニングは、酵素抗体法等によって行われる。得られた抗体産生ハイプリドーマはクローニングに付される。すなわち、当該ハイブリドーマを例えば限界希釈法によってクローユングを行ってクローンを得る。得られたクローンは、次いで目的とするモノクローナル抗体を産生するクローンのスクリーニングに付され、例えば酵素抗体法等によって、スクリーニングが行われる。選択されたクローンは、例えばあらかじめプリスタン（2, 6, 10, 14—テトラメチルペンタデカン）を投与した B A LBZcマウスの腹腔内へ移植し、 10〜14日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取する。この腹水からのモノクローナル抗体の回収は、抗体の精製法として公知の硫安分画法、ポリエチレングリコール分画法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲルクロマトグラフ法等を応用することによって容易に達成される。

本発明の抗体としては、上記方法により調製することができるもので有れば良く、特に限定はないが、その例としてはハイブリドーマ GFD G— 28 (FE RM BP-7173) が産生し、式（I) で表される化合物を認識し、式（I I) で表される化合物を認識しない抗フコィダン抗体（以下、当該抗体を GFD G— 28と称す）、及び、ハイプリドーマ GFD 2-9C (FERM BP— 7 1 74) が産生し、式（I) で表される化合物を認識せず、式（I I) で表される化合物を認識する抗フコィダン抗体（以下、当該抗体を GFD2— 9Cと称す）が例示される。

また、本発明の抗体を担体に固定し、これを吸着担体として使用することにより、式（I) 又は式（I I) で表される化合物や、式（I) 又は式（I I) を含有する多糖や、式（I) 又は式（I I) を構成単位とする多糖の分別が可能となる。本発明の抗体の担体への固定化のためには公知の方法を用いることができ、使用する固定ィヒ用担体の材料としては、例えば、ァガロース、セルロース、デキストラン等の多糖類、ポリアクリルアミド、アクリル酸ポリマー、スチレンジビニルベンゼンポリマー、ポリメタクリレート等の合成高分子、シリカゲル、ガラス等の無機高分子等から使用の目的、方法に応じて、適宜選択することができる。

なお、 GFDG— 28は F—フコィダンを認識するので、これを用いて F—フコィダンを測定することができる。また、式（I) で表される化合物をサンドウイツチ法で測定することもできる。その認識部位はフコース一 2—硫酸部位であると考えられる。

これらの抗体はフコィダンの分別測定に有用であり、例えばガゴメ昆布由来フコィダンの測定にも使用することができる。

力べして得られた抗体はフコィダンの構造と生理活性の相関関係を究明するために極めて有用である。またフコィダン由来物質の生体内濃度、例えば血清、血漿又は尿中濃度を特異的に精度良く測定するためにも極めて有用である。

これらの目的で使用するためには、モノクローナル抗体そのもの又はそれからの対応する免疫学的特性を有するフラグメント、例えば F a bフラグメントを使用することができる。また遺伝子工学的に製造した抗体又はそのフラグメントも本発明の抗体に包含される。実施例

以下に、実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。参考例 1

( 1 ) ガゴメ昆布を充分乾燥後、乾燥物 20 k gを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉碎した。

水道水 900リツトルに塩化カルシウム二水和物（日本曹達社製） 7. 3 k g を溶解し、次にガゴメ昆布粉碎物 20 k gを混合した。液温を 12 °Cから 90 °C になるまで水蒸気吹込みにより 40分間昇温させ、次いで撹拌下 90〜95でに 1B寺間保温し、次いで冷却し、冷却物 1 100リツトルを得た。

次いで固液分離装置（CNA型：ウェストファリアセパレーター社製）を用レ、、冷却物の固液分離を行い、約 900リツトルの固液分離上清液を調製した。固液分離上清液 360リツトルをダイセル社製 FE 10-FC-FUS 038

2 (分画分子量 3万）を用い、 20リットルまで濃縮した。次いで水道水を 20 リットル加え、再度 FE 10-FC-FUS 0382を用いて 20リツトルまで濃縮するという操作を 5回行うことによって脱塩処理を行い、ガゴメ昆布由来の抽出液 25リツトルを調製した。

該溶液 1リットルを凍結乾燥し、ガゴメ昆布由来フコィダン乾燥物 13 gを得た。

( 2 ) 参考例 1— ( 1 ) 記載のフコィダン乾燥物 7 gを、 50 mMの塩化ナトリウムと 10 %のェタノールを含む 20 mMのィミダゾール緩衝液（ p H 8. 0) 700mlに溶解し、遠心分離により不溶物を除去した。 DEAE—セル口ファイン A— 800カラム（φ 1 1. 4 cmX48 cm) (生ィ匕学工業ネ環）を同緩衝液にて平衡ィ匕し、遠心分離上清をアプライ後、同緩衝液で洗い、塩ィ匕ナトリウムの 5 OmMから 1. 95 Mの濃度勾配により溶出させた（1フラクション： 250ml) 。フエノール硫酸法及び力ルバゾール硫酸法にて、総糖量及びゥロン酸含量を求め、溶出順にフラクション 43〜55、フラクション 56〜6 7の画分を得た。次に、これらの画分を電気透析により脱塩後凍結乾燥し、フラクシヨン 43〜 55より U—フコィダン画分（1. 21 g) 、フラクション 56 〜67より F—フコィダン画分（2. 64 g) をそれぞれ調製した。

図 1にガゴメ昆布由来フコィダンの DEAE—セル口ファイン A— 800カラム溶出パターンを示す。図 1において縦軸は力ルバゾール硫酸法での 530 nm の吸光度（図中黒丸）、フエノール硫酸法での 480 nmの吸光度（図中白丸）、及び電導度（mS/cm：図中白四角）、横軸はフラクション番号を示す。参考例 2

(1) アルテロモナス s p. SN- 1009 (FERM BP— 5747) を、グルコース 0. 25%、ペプトン 1. 0%、酵母エキス 0. 05%を含む人ェ海水（ジャマリンラボラトリー ¾ ) pH8. 2からなる培地 60 Om 1を分注して殺菌した（120°C、 20分間） 2リットルの三角フラスコに接種し、 2 5。Cで 26時間培養して種培養液とした。ペプトン 1. 0 %、酵母エキス 0. 0

2%、下記参考例 2— (2) に記載のフコィダン 0. 2%、及び消泡剤（信越化学工業ネ; fc KM70) 0. 01 %を含む人工海水（ジャマリンラボラトリ一社製） pH8. 0からなる培地 20リットルを 30リットル容のジャーファメンターに入れて 120°C、 20分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液 60 Oml を接種し、 24°Cで 24時間、毎分 10リツトルの通気量と毎分 250回転の撹拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して培養上清を得た。得られた培養上清を、排除分子量 1万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により濃縮後 85%飽和硫安塩析し、生じた沈殿を遠心分離により集め、 10分の 1濃度の人工海水を含む 2 OmMのトリス一塩酸緩衝液（pH8. 2) に対して充分透析し、 60 Om 1のフコィダンに選択的に作用する F—フコィダン分解酵素液を調製した。

(2) 乾燥したガゴメ昆布 2 Kgを直径 lmmのスクリーンを装着させたカツタ一ミル（增幸産業ネ: t ) により粉砕し、得られた昆布のチップを 20リットルの 80%エタノール中に懸濁し、 25°Cで 3時間撹拌し、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、 95 °Cに加温した 40リットルの 5 OmMの塩化ナトリウムを含む 2 OmMリン酸ナトリウム緩衝液 pH6. 5に懸濁し、時々撹拌しながら 95°Cで 2時間処理し、フコィダンを抽出した。

抽出液中の懸濁物を、ろ過し、ろ液を調製した後、ろ過残渣を 3. 5リット/レの 10 OmM塩ィ匕ナトリゥムにより洗浄し、更にろ液を得た。両ろ液を合わせた後、 30°Cまで温度を下げ、 3000Uのアルギン酸リア一ゼ（ナガセ生化学工業社製）を添加後、エタノールを 4リットル加え 25 °Cで 2 4時間撹拌した。次に遠心分離を行い、得られた上清を排除分子量 10万のホロファイバーを備えた限外ろ過器により 4リツトルに濃縮し、更に、 10%のエタノールを含む 10 OmMの塩ィヒナトリウムにより、着色性物質がろ過されなくなるまで限外ろ過を続けた。

非ろ過液中に生じた沈殿は遠心分離により除去し、この上清を 5°Cまで温度を下げ、 0. 5N塩酸により pHを 2. ◦とした後、生じたタンパク質等の沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を速やかに 1 N水酸化ナトリウムにより p Hを 8. 0とした。

次に、排除分子量 10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過器により限外ろ過を行い、 20mM塩ィヒナトリウム pH8. 0により完全に溶媒置換後、再度 p Hを 8 · 0として遠心分離後、凍結乾燥を行い、約 95 gのフコィダンを調製した。

(3) 乾燥したガゴメ昆布 2 Kgを直径 lmmのスクリーンを装着させたカツタ一ミルにより粉碎し、得られた昆布のチップを 20リツトルの 80%エタノール中に懸濁し、 25°Cで 3時間撹拌し、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、 30mlの上記参考例 2— ( 1 ) で調製した F—フコィダン分解酵素液、 10%のエタノール、 10 OmMの塩化ナトリゥム、 5 OmMの塩化力ルシゥム、及び 50 mMのィミダゾールを含む 20リットルの緩衝液（ p H 8.

2 ) に懸濁し、 25でで 48時間撹拌した。この懸濁液を網目の直径 32 μ mのステンレス金網でろ過し、残渣を 5 OmMの塩ィ匕カルシウムを含む 10%のエタノールで洗浄した。更にその残渣を 10リツトルの 5 OmM塩化カルシウムを含む 10%のエタノール中に懸濁し、 3時間撹拌後、ステンレス金網でろ過、洗浄した。更にその残渣を同条件で懸濁後、 16時間撹拌し、直径 32 mのステンレス金網でろ過、洗浄した。

こうして得られたろ液及び洗浄液を集め、排除分子量 3000のホロフアイバーを装着させた限外ろ過機により限外ろ過し、ろ過液と非ろ過液に分離した。このろ過液をロータリーエバポレーターで約 3リットルに濃縮後、遠心分離して上清を得た。得られた上清を排除分子量 300の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、この溶液に 0. 1Mとなるように酢酸カルシウムを添カ卩し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清をあらかじめ 5 OmMの酢酸カルシゥムにより平衡ィ匕させた DEAE—セル口ファイン（樹脂量 4リットル）にかけ、 5 OmMの酢酸カルシウム及び 50 mMの塩化ナトリゥムで充分洗浄後、 50m

M〜80 OmMの塩化ナトリゥムのグラジェントにより溶出させた。この時の分取量は 1本当り 50 Om 1で行った。分取した画分をセルロースァセテ一ト膜電気泳動法 [アナリティカルバイオケミストリー（Analytical Biochemistr y) 、第 37卷、第 197〜 202頁（1970) ] により分析したところ塩ィ匕ナトリウム濃度が約 0. 4Mで溶出されるフコィダン（フラクションナンバー 6 3付近）が均一であった。

そこで、まずフラクションナンバー 63の液を 15 Omlに濃縮後、濃度が 4 Mとなるように塩化ナトリゥムを添力 Pし、あらかじめ 4 Mの塩ィ匕ナトリゥムにより平衡ィ匕したフエニル（Phenyl) —セル口ファイン（樹脂量 200 ml) にかけ、 4 Mの塩化ナトリウムにより充分洗浄した。非吸着性のフコィダン分解物画分を集め、排除分子量 300の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、脱塩液 505mlを得た。

得られた脱塩液のうち 4 Om 1を 10%のエタノールを含む 0. 2 Mの塩化ナトリウムによって平衡化させたセル口ファイン GCL— 90のカラム（4. 1 c mX 87 cm) (生化学工業社製）にかけて、ゲルろ過を行った。分取は 1フラクシヨン当り 9. 2mlで行った。

全フラクションに対して総糖量の分析をフエノール硫酸法〔アナリティカルケミストリー（Analytical Chemistry) 、第 28卷、第 350頁（1956) 〕により行った。

この結果、フコィダン分角早物は 1つのピークを形成したので、そのピークの中央部分、フラクションナンバー 63〜 70を集め、排除分子量 300の膜を装着させた電気透析器により脱塩後、凍結乾燥し、 112mgの式（I) で表される化合物（以下、単に 7—12 sと称す）の乾燥品を得た。参考例 3

(1) フラポバクテリゥム s p. S A-0082 (FERM BP— 540 2) を、グルコース 0. 1%、ペプトン 1. 0%、酵母エキス 0. 05%を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー ¾ ) pH7. 5からなる培地 600m 1を分注して、殺菌した（120°C、 20分） 2リットルの三角フラスコに接種し、 24 °Cで 20時間培養して種培養液とした。参考例 2— (2) 記載のガゴメ昆布由来フコィダン 0. 3%、ペプトン 0. 5%、酵母エキス 0. 01%、及び消泡剤（信越化学工業社製 KM 70) 0. 01%を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー ¾M) pH7. 5からなる培地 20リットルを 30リットノレ容のジャーフアーメンターに入れ、 120°Cで 20分殺菌した。冷却後、上記種培養液 60 Omlを接種し、 24°Cで 20時間、毎分 10リットルの通気量と毎分 125回転の撹拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して培養上清を得た。得られた培養上清を、排除分子量 1万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により 40 Om 1に濃縮し、フコィダン分解酵素液を調製した。

(2) 5%のガゴメ昆布由来フコィダン溶液 60 Om 1と、 100 mMのリン酸緩衝液（ρΗ8· 0) 75 Om 1と 4Μの塩ィ匕ナトリウム 15 Om 1と参考例 3- (1) で調製したフコィダン分解酵素液 120mlを混合し、 25°Cで 14 4時間反応させた。

反応液をポアサイズ 3500の透析膜を用いて透析し、分子量 3500以下の画分を集めた。この画分をマイクロアナライザー G3 (旭化成社製）により脱塩し、脱塩液 50 Omlを得た。次に該脱塩液を、 1 OmM酢酸アンモニゥムで平衡ィ匕させた DEAE—セファロース F Fカラム（5 cmX26 cm) (ファノレマシア社製）にかけ、 1 OmM酢酸アンモニゥム 1リットル、 10mM〜lM酢酸アンモニゥムのグラジュェント液 1リットル、 1M酢酸アンモニゥム 1リットノレ、 1M〜 5 M酢酸アンモニゥム 1リットルの順で溶出した。この時の分取量は

1本当たり 5 Om 1で行った。このうち、フラクションナンバー 64〜 78を集め、該画分を 20 Om 1に濃縮、脱塩後、 50 OmM酢酸アンモニゥムで平衡化した DEAE— ファロース FFカラム（2. 4 cmX22 cm) にかけ、次いで、 50 OmM酢酸アンモニゥム 10 Om 1、 500 mM〜 2 M酢酸アンモニゥムのグラジュェント液 900mlの順で溶出した。この時の分取量は 1本当たり 9. 7mlで行った。このうち、フラクションナンバー 92〜 96を集め、該画分を濃縮、脱塩し、式（I I) で表される化合物（以下、単に 6— 5 sと称す）を得た。実施例 1

抗フコィダンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞の作製及びそのクローンィ匕

(1) 6週齢 Ba l b/cマウス雌（日本クレア社製） 4匹に、それぞれ抗原として、参考例 1— (1) に記載の方法で調製したガゴメ昆布由来フコィダンをマウス 1匹当たり 100)u gノ 100/x 1となるように完全フロイントアジュバントと混ぜ乳化させマウス腹腔に投与した。

初回免疫より 21日目に初回免疫と同じフコィダンをマウス 1匹当たり 100 μ g/100 μ 1となるように不完全フロイントアジュバントと混ぜ乳ィ匕させマウス腹腔に投与し追加免疫をした。

更に、 14日後に初回免疫と同じフコィダンをマウス 1匹当たり 100 μ gZ 100 μ 1となるように補助免疫としてマウス腹腔に投与した。

補助免疫より 3日後にマウスの脾臓を取り出し、ステンレスメッシュを使って 10m 1の RPMI 1640 (バイオゥイツタカ一社製）培地中に徐々に均一化させ、 1500 r. p. mで 3回遠心分離、洗浄を繰り返し脾臓細胞を分離した。

得られた脾臓細胞を遠心分離し、洗浄したマウスミエローマ細胞 P 3U1 (P 3X63AgU.1) と合わせた後、 PEG 1500溶液 [ポリエチレングリコール（PEG) を 50% (V/V) 含む RPM I 1640培地] 1mlを 1分間かけて滴下しながら、更に 1分間混ぜた後、 R PM I 1640培地で徐々に希釈して PEG濃度を 5% (VZV) にした。

そして、遠心分離機で細胞を分離し、その細胞を徐々に増殖培地（10%牛胎児血清 FCSを含む RPMI 1640培地）を加えて分散させ、 96穴培養プレート（ファルコン社製）の穴に 1穴当たり 10⁶個/ 0. 1mlの細胞を播き、 3 7°Cの 5%二酸化炭素インキュベーター内で一晚培養した。

翌日から、上記増殖培地にヒポキサンチン 0. I mM、アミノプテリン 0. 4 μΜ、チミジン 1 6 を加えた選択培地（以下、 HAT培地と略記する）を、各穴に 1 00 μ 1添加して培養し、その後 1〜2日ごとに 1 00 μ 1ずつ HAT 培地に置換しながら培養し、非融合細胞を死滅させ、融合細胞のみ生存可能な状態で選択培養を行った。

さらに、生存融合細胞の中より抗体を産生する陽性株を選択するために、コロニーが大きくなった時点でその培養上清中に含まれる抗フコィダンモノクローナル抗体の検出を酵素免疫測定法で行った。

免疫感作に使用した抗原フコィダンを生理リン酸緩律 ί液 (PB S) で 1 0 g

Zmlに調整して 9 6穴マイクロタイタープレート（ヌンクネ; t ) に 1穴当たり 5 0 μ 1ずつ加え 4 °Cでー晚静置して固相化した。

固相化した後、液を捨て市販のブロッキング剤（ブロックエース：大日本製薬社製）を 1穴当たり 2 00 μ 1ずつ加えて 3 7°C、 2時間ィンキュベートしてブロッキングを施し、固相抗原プレートを作製した。

この固相抗原プレートにそれぞれの融合細胞の培養上清を 5 0 μ 1ずつ加えて、 3 7°C、 1時間インキュベートし、抗体抗原反応をさせた。

このプレートを PB Sで洗浄した後、西洋ヮサビ由来ぺ^"ォキシダーゼ（HR P) 標識抗マウス I g G抗体（ザィムド社製）をブロッキング剤で 1 000倍希釈し、各穴に 50 μ 1ずつ加えて 3 7°C、 1時間インキュベートした。

さらに、このプレートを PB Sで洗浄後、 ABTSZ0. 0 2%過酸化水素水溶液〔0. 5 5mgZm l ABT S (2, 2，一アジノビス（3—ェチルベンゾチアゾリンー 6—スルホン酸）二アンモニゥム：ナカライテスク社製）を含む 0. 1Mクェン酸一水酸ィ匕ナトリウム緩衝液（pH4. 0) 、 0. 0 2%過酸化水素水〕を 50 μ 1ずつ加え、室温で 1 5分間発色反応をさせた。

緑色に発色した穴を陽性とし、検出した陽性株を ΗΤ培地（アミノプテリンを含まない HAT培地）でコロニーを 9 6穴から 24穴、更に 6穴プレートへ拡大培養した後、 9 6穴培養プレートの 1穴当たり細胞 1個になるように市販のクローニング培地（エスクローン：三光純薬社製）にて希釈し、 9 6穴プレートに播き込み培養する限界希釈法にてクローユングした。

育ったシングルコロニーの培養上清をフコィダン固相抗原プレート用いた酵素免疫抗体法にて陽性株を検出した。

その結果、 GFD 2— 9C、 GFD G— 28の 2クローンのモノクローナル抗体産生細胞を得た。当該細胞は日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に GFD 2— 9Cは FERM B P— 71 74として、 GFD G— 28は FERM BP— 71 73として平成 8年 10月 29日（原寄託日）に寄託されている。

(2) クローン化したモノクローナル抗体産生細胞を増殖培地（10%牛胎児血清 FCSを含む RPMI 1640培地）で増殖させた後、予め 3週間前に 0.

5m 1の免疫抑制剤プリステン（2， 6, 10, 14，ーテトラメチルペンタデカン：和光純薬社製）を投与した B a 1 bZcマウスの腹腔に、 1匹当たり 10 6〜10⁷個で移植した。約 2週間後に溜まった腹水を回収し、これよりモノクローナル抗体を精製した。

(3) マウス腹腔より回収した腹水を 3000 r. p. m、 10分間遠心分離して沈殿物を除き、遠心上清を P B Sで 2倍希釈し綿濾過した後、 50 %硫安塩祈して抗体を沈殿させ遠心分離した。

得られた沈殿を PB Sに溶解後、さらに PBSに透析して硫安を除いた後、プ口ティン Aカラム（フアルマシア社製）により常法に従ってァフィ二ティー処理をした。

まず、カラムをプロテイン A吸着バッファー（3M N a C 1、 1. 5M グリシン pH8. 9) で平衡ィ匕した後、透析後の抗体を含む沈殿溶解液をプロティン A力ラムで処理し、吸着画分をさらにプロティン A吸着バッファ一で洗浄後、 0. 1Mクェン酸バッファー（pH4. 0) で溶出した。

得られた溶出画分を PBSに透析し、ドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、 SDS— PAGEと略記する). でシングルパンドであることを確認後、精製抗体とした。

ハイブリドーマ GFD 2— 9 Cが産生する抗フコィダン抗体を GFD 2— 9 C、ハイブリドーマ GFD G— 28が産生する抗フコィダン抗体を GFDG— 2 8と命名した。

(4) 抗フコィダン抗体のサブクラスは市販の抗マウス I g G l、 I g G 2 a、 I g G 2 b、 I g G 3、 I gM各ゥサギポリクローナル抗体（ザィムド社製）を用いた酵素免疫抗体法にて決定した。

免疫感作に抗原として使用した精製フコィダンを PB Sにて 1 Ο μ gZm lに調整、 9 6穴マイクロタイタープレート（ヌンクネ: t ) 〖こ 5 0 μ ΐずつ分注し、

4 °Cで一晚静置して吸着させた。

プレートの液を捨て P B Sで洗浄後、各穴を 200 μ \の市販のブロッキング剤（ブロックエース：大日本製薬社製）にてブロッキングを施し、抗原プレートを作製した。

精製した各抗フコィダン抗体の GFD 2— 9 C、 GFDG- 2 8をそれぞれ巿販のブ口ッキング液（ブロックエース：大日本製薬社製）にて 1 0 μ g/m 1に調整、抗原プレートに 5 Ο μ 1ずつ分注し、 3 7 °Cで 1時間反応させた。

プレートを PB Sで洗浄後、市販の抗マウス I g G 1、 I g G 2 a、 I g G 2 b、 I g G 3、 I g M各ゥサギポリクローナル抗体（ザィムドネ土製）を市販のブ口ッキング剤（プロックエース：大日本製薬ネ±^) にて 1 0 00倍希釈して各穴

5 0 μ 1ずつ分注し、 3 7 °Cで 1時間反応させた。

さらに、プレートを PB Sで洗浄後、市販の抗ゥサギ HRP標識 2次抗体（ザィムドネ ± ) を市販のブロッキング剤（ブロックエース：大日本製薬ネ環）にて 5 00倍希釈して各穴 5 0 /i 1ずつ分注し、 3 7でで 1時間反応させた。

プレートを PB Sで洗浄後、 ABT S/0. 0 2%過酸化水素水溶液を各穴に 5 0 μ Iずつ分注し、室温で 1 5分間発色反応させた。

その結果、どちらの抗体も I g G 1であった。

(5) フコィダン由来化合物である 7— 1 2 s、及び 6— 5 sを用いてガゴメ昆布由来フコィダンとの競合試験を実施した。

予め、精製したガゴメ昆布由来フコィダンを PB Sで 1 0 μ g/m 1に濃度を調整して、 9 6穴マイクロタイタープレート（ヌンタネ： t^) に 50 /i l Z穴で播き込み、 4 °Cで一晚静置して固相化し、市販のブロッキング剤（ブロックエース：大日本製薬） 200 /z 1にてブロッキングを施し、抗原プレートを作製した。

各酵素消化断片糖を蒸留水で 1 m g /m 1に濃度調整したものを市販のプロッキング剤（ブロックエース：大日本製薬ネ ± ) でさらに、 3倍ずつ、 3段階に希釈（3倍希釈、 9倍希釈、 27倍希釈）して濃度を振り、最後に 7— 12 s、 6 -5 sを含まないプロッキング剤だけを含む 4種類の競合溶液を調整し、それぞれ 1. 5mlエツペンドルフチューブ（エツペンドノレフネ： h^) に分注した。

次に、抗フコィダン抗体である GFD 2— 9 C、 GFDG—28を巿販のブ口ッキング剤（プロックエース：大日本製薬社製）にて 10 μ g/m 1に濃度調整し、抗体溶液とした。

競合溶液（濃度調整した 7— 12 s、又は 6— 5 s、プロッキング剤のみを含む） 50 μ 1に、 10 t gZm 1に濃度調整した GFD 2— 9 C、 GFDG— 2 8抗体溶液 50 μ 1を加え、 37°Cで 30分間インキュベートさせ 1次反応液とした。

この 1次反応において GFD 2— 9 C及び GFDG— 28の抗体の結合部位が競合溶液中の 7—12 s、又は 6— 5 sとの結合反応により奪われた場合（抗体結合部位が 7— 12 s、又は 6— 5 sに存在した場合のみ）、 7— 12 s、又は 6-5 sの濃度に比例して 2次反応における固相抗原プレートへの結合能力が失われる。

2次反応としてガゴメ昆布由来フコィダン固相抗原プレートに各 1次反応液 5 0 μ 1をそれぞれ加え、 37でで 1時間ィンキュベートした。

PBSで 3回プレートを洗浄後、抗マウス H R Ρ標識 2次抗体を市販のブ口ッキング剤（ブロックエース：大日本製薬社製）で 500倍希釈して 1穴当たり 5 0 μ 1ずつ添加し、 37でで 1時間ィンキュベ一トした。

P B Sで 4回プレートを洗浄後、 ABTSZ0.02 %過酸化水素水溶液を 5 0 i l加え、 15分間発色反応をした。

プレートの各穴に 15 OmMシユウ酸 50 μ 1ずつ加え反応停止後、プレートリーダ一にて吸光度 405 nmを測定した。

すなわち、競合溶液中の 7— 12 s、又は 6— 5 sの濃度に比例して発色が弱ければ 7— 12 s、又は 6— 5 s中に抗体の結合部位が存在する事となる。その結果、下記表 1に示す様に、抗フコィダン抗体である GFD 2— 9 Cは 6 - 5 sに結合し、 7— 12 sには結合せず、 GFDG— 28は 7— 12 sに結合し、 6— 5 sには結合しないことが明らかとなった。

競合化合物濃度（μ gノ ml)

抗体クロ' —ン名化合物名 333 111 36.7 0

測定吸光度 (405 n m)

GFD 2 - 9 C 6 -5 s (0.160) (0.235) (0.277) (0.293)

7-12 s (0.294) (0.281) (0.318) (0: 305)

GFDG -28 6 - 5 s (0.364) (0.385) (0.405) (0.400)

7- 12 s (0.194) (0.345) (0.373) (0.418)

(6) HRP標識抗体の作製は、「ィムノアッセイスインザクリニカルラボラトリー」、第 81頁（ァランアールリスインコ一ポレーテッド、 197 9年発行、 P. K. ナカネ著）に記載の方法に準じて行った。

HRP (ベーリンガーマンハイム社製） 1 Omgを 1 m 1の蒸留水に溶かし、

0. 1M過ヨウ素酸ソーダ 0.2m 1を加えて室温で 20分間反応させた後、 1 mM酢酸ナトリウム緩衝液 (_PH4. 0) に対して一晚透析した。

得られた溶液に、 2 M炭酸ソーダ緩衝液（pH 9. 5) 0. 02mlを加えて pH9〜9. 5にすると同時に、予め、 0. 01M炭酸ソーダ緩衝液（ρΗ9· 5) に対して透析を行ったモノクローナル抗体 GFD2— 9Cと GFDG— 28 を、それぞれ 10 m g Ζπι 1ずつ、上記透析で得られた溶液に加えた。その後、室温で 2時間反応させた後、水素化ホウ素ナトリウム（4mg/ml) 0. lm 1加えて、 4でで 2時間反応させた。

これを PB Sに対して 4°Cで一晚透析し、 HRP標識 GFD 2— 9 C、 HRP 標識 GFDG— 28を取得した。

96穴マイクロタイタープレート（ヌンタネ： t^) の各穴に、 PBSで 10/z g Zmlの濃度になるように調整した GFD 2— 9 C及び GFDG— 28抗体溶液をそれぞれ 50 1ずつ分注し、 4でで一晚静置して、抗体を周相化した。次に、プレートの各穴中の液を捨て、市販のブロッキング剤（ブロックエース：大日本製薬社製） 200 μ 1加え、 37でで 1時間ブロッキングを施し、固相プレートを作製した。

この固相プレートに、スタンダード（以下、 STDと略記）として、 GFD2 一 9 C測定系では、 6— 5 sをトップ（最高）濃度 40 μ g Zm 1より 5倍希釈したもの、 GFDG— 28測定系では、 7— 12 sをトップ濃度 1 1 1 /X gZm 1より 3倍希釈したものをそれぞれ 50 μ 1加え、 37 °C1時間インキュベートして反応させた。

反応終了後、プレートを PBSで 3回洗浄した後、市販のブロッキング剤で 5 00倍に希釈した上記の HRP標識 GFD2— 9 C、 HRP標識 GFDG— 28 を 50 μ 1ずつ各穴に添加し、 37 °C1時間インキュベートして反応させた。反応終了後、プレートを PB Sで 4回洗浄し、 ABTS 0. 02%過酸化水素水溶液を各穴に 50 X 1ずつ分注して、室温で 15分間発色反応をさせた。プレートリーダーにより、各穴の吸光度 405 nmを測定した。その結果を表 2に示す。

尚、検量線は、 GFD2— 9C用には 6— 5 s、 G F D G— 28用には 7— 1 2 sを STDとして用いて測定した吸光度から作製した。

その結果、下記表 2に示すように、 6— 5 s、又は 7— 12 s濃度に比例して吸光度の測定値が上昇した。この事より、サンドィツチ法 E I A測定系が上手く機能している事が明らかとなった。表 2

固相抗体 HRP標識抗体 STD

GFD2-9C GFD2-9C 6— 5 s

測定吸光度値（405 nm)

(トップ濃度 40 μ g Zm 1より各 5倍希釈）

トップ

(1.687) (0.870) (0.264) (0.111) (0.062) (0.073) (0.058) 固相抗体 HRP標識抗体 STD

GFDG- -28 GFDG— 28 7- 12 s

測定吸光度値（405 nm)

(トップ濃度 1 1 1 μ g/mlより各 3倍希釈）

トップ

(1.589) (0.780) (0.316) (0.150) (0.087) (0.066) (0.042) また、ガゴメ昆布由来フコィダンについては、 GFD 2— 9 CとHRP標識G FDG-28の組み合わせでもサンドィツチ法 E I A測定系で測定可能であつた。その結果を表 3に示す。更に、 GFD 2— 9 Cと HRP標識 GFD 2— 9 C、 GFDG— 28と HRP標識 GFDG— 28、 G F D G— 28と HR P標識 GFD 2-9 Cの各々の組合せで行った結果、ガゴメ昆布由来フコィダンを用いたサンドィツチ法 E I A測定系での測定が可能であることが明らかとなり、 G F DG- 28と HRP標識 GFDG— 28の組合せで F—フコィダンのサンドィッチ法 E I A測定系での測定が可能であることが明らかとなった。

表 3

固相抗体 HRP標識抗体 STD

GFD 2-9 C GFDG— 28 ガゴメ昆布由来フコィダン測定吸光度値（405 nm)

(トップ濃度 40 μ g/m 1より 5倍希釈）

トップ

(0.449) (0.220) (0.139) (0.089) (0.086) (0.073) (0.072) 実施例 2

抗フコィダン抗体力ラムの作製

H i T r a p NHS— a c t i v a t e dカラム（フアルマシアネ： t ) を 1 mM塩酸 6m 1で洗浄後、実施例 1— (3) で精製した GFDG— 28溶液 0. 9m lをアプライした。室温で 1時間放置後、 3m lのカップリングバッファー (0. 5M塩化ナトリウム、 0. 2M重炭酸ナトリウム、 pH8. 3) で洗浄した。続いてカラムを 6m 1のブロッキングバッファー（0. 5M トリス一塩酸 pH8. 3、 0. 5M塩ィ匕ナトリウム）、 6m lのバッファー B (0. 1 M酢酸ナトリウム pH4. 0、 0. 5M塩化ナトリウム）、 6m lのブロッキングバッファ一で順次洗浄し、室温で 30分間放置した。さらに、 6m lのバッファー B、 6m 1のブロッキングバッファー、 6m 1のバッファ— Bでカラムを洗浄した後、 P B Sでカラムを平衡化して抗フコィダン抗体力ラムを作製した。精製したガゴメ昆布由来フコィダンを P B Sに予め溶解し、得られた溶液を、上記抗フコィダン抗体カラムにアプライした。その後、得られた溶出液を、参考例 1一（2) 記載の方法に準じて、 DEAE—セル口ファイン A— 800カラムクロマトグラフィーに供したところ、塩化ナトリゥム濃度勾配による F—フコィダンの溶出塩濃度に相当する画分にピークが見られなかった。すなわち、 GFD G— 28を固定ィ匕したカラムを用いることにより、ガゴメ昆布由来フコィダンから F—フコィダンを除くことが可能であることが分かった。また、 GFD2— 9

Cを固定化したカラムを用いて得られた溶出液を、参考例 3— (2) 記載の方法に準じて処理した。その結果、 DEAE—セファロース F Fカラムクロマトグラフィー後に 6— 5 sを得ることが出来ず、 6— 5 s及び 6— 5 sを含有する多糖を除くことが可能であることが分かった。

以上、本発明の抗体を使用することにより、 GFD2— 9C、 GFDG- 28 抗体に結合する化合物を構造に持った色々な化合物の検出と定量が可能になつた。産業上の利用の可能性

本発明により、フコィダンの構造解析や、その定量に有用な、フコィダン構造に特異的に結合する抗フコィダン抗体が提供される。

当該抗体を使用することにより、フコィダンの構造と生理機能の関係が明らかになり、当該抗体は生化学的分野において極めて有用である。また種々のオリジンのフコィダンから、生理機能構造を有するフコィダンを選別することが可能となる。さらに当該抗体は目的のフコィダンの精製にも使用することができる。

Claims

請求の範囲下記式（I) 又（I I) で表される化合物を認識する抗フコイダン抗体。

(I)

(I I)

2. 請求項 1記載の式（I) で表される化合物を認識し、請求項 1記載の式 (I I) で表される化合物を認識しない請求項 1記載の抗フコィダン抗体。

3. GFD G-28 (FERM BP— 7173) が産生する請求項 2記載の抗フコィダン抗体。

4. 請求項 1記載の式（I) で表される化合物を認識せず、請求項 1記載の式

(I I) で表される化合物を認識する請求項 1記載の抗フコィダン抗体。

5. GFD 2-9 C (FERM BP— 7174) が産生する請求項 4記載の抗フコィダン抗体。

6. 請求項 1記載の抗フコィダン抗体を固定した担体。