JPS5896028A

JPS5896028A - ヒトＩｇＥの製造法

Info

Publication number: JPS5896028A
Application number: JP56193324A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Sugino; 杉野　弘; Shuichi Ikeyama; 池山　崇一; Koichi Igarashi; 貢一五十嵐
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1981-11-30
Filing date: 1981-11-30
Publication date: 1983-06-07
Also published as: JPH0339680B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はヒ）ＩｙＥ（ヒト免疫グロブリンＥ）の製造法
に関する。

ヒト免疫グロブリンはＩｙＡ　、　Ｉ、Ｄ　、　ＩｙＥ
　、　ＩｙＧおよびＩｙＭの５種類に分類される。これ
らのうちＩｙＧ　、　Ｉ、ＡおよびＩｙＭの正常人血清
中での濃度はＩｙＥ、ＩｙＤにくらべて比較的高い。し
かし、Ｉ、Ｅの正常人血清中での濃度は０．０１−０．
０７　＃／〆ｌとされ、ｒｙＧ（１，０００−１，４ｏ
ｏＩｌｖ／ｄＪ）などに比較して極めて低く、正常人血
清よ！０　Ｉ、Ｅを精製することは極めて困難であった
。ＩｙＥ　Ｆｉ通常肥満細胞および好塩基球に固着して
おシ、抗原と反応することにより、それらの細胞からヒ
スタミンなどの生物活性を有する物質を放出させ■型ア
レルギーなどを引き起こす。このようにして惹起される
アレルギーの予防や治療の研究あるいは診断用試薬の調
製などには高純度のヒ）　ＩｙＥが必要とされている。

しかしながら、ヒ）　ＩｙＥはＩｙＥが高濃度に含有さ
れている骨髄腫患者血清から硫安塩析。

イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などを組
み合わせる方法により精製されており、現状では、随時
、同一種の標品を任意の量取得することは不可能である
。

本発明者らは、株化ヒト骨髄腫細胞の培養により大量の
ヒ）　Ｉ、Ｅを生成させ、これを採取することに成功し
、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、ヒトＩｙＥ産生能を有する細胞を
培養し、培養液中にヒトＩ、Ｅを生成蓄積せしめ、これ
を採取することを特徴とするヒ）　ＩｙＥの製造法であ
る。

本発明に用いるヒトＩ、Ｅ産生能を有する細胞は株化ヒ
ト骨髄腫細胞が好ましく、該株化ヒト骨髄腫細胞は例え
ば、ヒトＩｙＥが検出される骨髄腫患者のヒト血液を材
料に自体公知の方法〔例えば、クリニカルアンドエクス
ベリメンタル・イムノロジー、第７巻、４７７頁（１９
７０年）参照〕によシ作製することができる。すなわち
、例えばヘパリンを添加した上記ヒト血液を試験管内に
入れ、垂直に約１．５時間保ち、赤血球を沈澱させた後
、白血球を含む血漿部分を吸引採取し、約１０００回転
で約１０分間遠心して細胞を集める。この細胞を培地、
例えば１０％子ウシつ児血清、ペニシリン１００　Ｉ　
Ｅ　／　ｍｌ　、ストレプトマイシン５０μｙ／Ｗ／お
よびアンフォテリシンＢ１．２５μｊ；’　／ｖｔｌ　
を含む栄養培地Ｆ−１０に浮遊させ、グリッド上に作製
したスポンジ状のゼラチンの上に播種した。増殖した細
胞を５０〜１００ｇ／容のエーレンマイヤーフラスコ内
の上記培地に移し、ＲＩＳＴ法［Ｒａｄｉ。

ｉｍｍｕｎｏ　５ｏｒｂｅｎｔ　ｔｅｓｔ　（イムノロ
ジー、第１４巻。

２６５頁（１９６８年）〕〕によりＩｙＥの産生を観察
しつつ、グリッド培養開始から３〜４力月培養して株化
ヒト骨髄腫細胞を作製する。

本発明のヒ）　ＩｙＥの製造にはこのようにして作製し
た株化ヒト骨髄腫細胞を用いることができるが、とりわ
け株化ヒト骨髄腫細胞Ｕ−２６６を用いることが好まし
い。なお、Ｕ−２６６は文献記載の株化細胞である（イ
ムノロジー、第３８巻、６３頁（１９７９年））。

ヒ）　ＩｙＥ産生能を有する細胞の培養に際して用いら
れる培地は該細胞が生育増殖してヒトＩ、Ｅを蓄積し得
るものであればどのようなものでもよい。

望ましくは培地中に抗生物質および緩衝液を添加する。

培地成分としては、例えば種々の動物血清を用いること
ができるが、ウシ胎児血清が好ましく通常５〜２０％と
なるように培地に添加する。抗生物質としては、例えば
カナマイシン、ペニシリン。

ストレプトマイシンが挙げられ、これらを通常０６０５
〜１ダ／譚ｌの濃度となるように加える。緩衝液として
、例えばＮ−２−とドロキシエチルピ　５− ペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホンｅｋ５〜１００ｍ
Ｍとなるように加えることもできる。

培養ハ、ローラーボトルやスピンナー７ラスフを用いて
行なうが、ローラーボトルで培養した後スピンナーフラ
スコで培養してこの培養物をヒトＩｙＥの分離、採取に
供するのが好ましい。この方法によれば、細胞の増殖能
およびヒト■ｙＥ産生能を低下させることなく有利に継
代培養することができる。

すなわち、例えば、１ず該細胞を０５×１０５〜１０　
Ｘ　１０　／　簿／の細胞濃度でローラーボトル内の培
地に接種し、ボトルを０．５〜５回転／分で回転させ、
２〜１０日間培養した後、培養物を同培地により１〜５
倍に希釈し、この一部をスピンナーフラスコに移し、ボ
トル内の回転子を３０〜１５０回転／分で回転させて３
〜１２日間培養する。培養温度はいずれの場合も１５〜
４０℃が好ましい。

ヒ）　Ｉ、Ｅ産生能を有する細胞を培養して得られる培
養物中にはヒ）　ＩｙＥが生成蓄積される。ヒトＩ　ｙ
　Ｅは主として培養液中に分泌されるので、培養　６− 液を一旦遠心分離して細胞を除去したあとの上清液から
ヒ）ＩｙＥを分離、採取する。遠心上清液からのヒト■
ｙＥの分離、採取は、ヒ）　ＩｙＥの物理化学的特性に
もとづいて種々の方法を組み合わせることにより行ない
得る。すなわち、例えば硫安塩析。

アミノ酸結合水不溶性担体を用いるアフィニティクロマ
トグラフィー、イオン交換力うムクロマトダラフィー、
ゲルｐ過および抗ウシ血清抗体結合水不溶性担体を用い
るアフィニティークロマトグラフィーなどの分離、精製
手段から適宜選択し、組み合わせて使用することができ
るが、とりわけ上記記載のこれらの手段をこの順番に用
いるのがよい。

硫安塩析は通常行なわれている手段を適応すればよく、
例えば硫安４０〜５５％飽和で沈澱する両分を遠心分離
により採取し、リン酸緩衝液−食塩水に溶解した後、同
緩衝液に対して２０〜４０時間透析する。緩衝液は途中
で交換することが好ましい。これらの操作は通常低温（
０〜１０℃）で行なわれる。

アミノ酸結合水不溶性担体を用いるアフィニティークロ
マトグラフィーにおいてはリジン、グリシンなど各種ア
ミノ酸類を用いることができるが、リジンを用い、例え
ばカトレカサスの方法〔プロシーディングスオブザナシ
コナルアカデミーオブサイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｊ
？、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、　Ａ、　）　、第６１
巻、６３６頁（１９６８年）〕によりリジン結合水不溶
性担体が調製される。クロマトグラフィーは公知の手段
によって行なわれるが、用いる緩衝液に１０〜４０チの
糖類、例えばデキストロース、マルトースなどを含有さ
せてもよい。得られたと）　Ｉ、Ｅを含む画分け、通常
の手段、例えば限外濾過膜を用いる方法、あるいは凍結
乾燥により濃縮すれば容易に後処理、例えばトリス−リ
ン酸緩衝液に対する透析、に付すことができる。

イオン交換カラムクロマトグラフィーにおいて１ＤＥＡ
Ｅ−セルロースなど市販のクロマトグラフィー担体を用
いることができる。緩衝液としてはトリス−リン酸緩衝
液などを用い、得られたヒト■ｙＥを含む両分の濃縮に
は限外濾過膜などを用いることができる。

ゲル済過は、例えばセファクリルカラムを用いて公知の
手段を適用して実施される。ヒト■ｙＥを含む両分を、
例えば限外濾過膜を用いる方法により濃縮後さらに濃縮
液を、例えばセファクリルカラムにかけ、リサイクリン
グクロマトグラフィーを実施することが好ましい。しか
し、上記のゲル濾過において長いカラム（３〜４ｍ）を
用いることによりこのリサイクリングクロマトグラフィ
ーを省略することもできる。

抗ウシ血清抗体結合水不溶性担体を用いるアフィニティ
ークロマトグラフィーにおいては、例えばカトレカサス
の方法（前記した同著者の文献参照）により調製した抗
つシ血清つサギＩｙＧ結合セファロースカラムなどを用
いることができる。溶出に用いる緩衝液、とじてはリン
酸緩衝液−食塩水などが挙げられるが、同緩衝液に糖類
、例えばマルトース、デキストロースなどを１０〜４０
９！＋となるように添加して用いることが好ましい。得
られたヒ）　ＩｙＥを含む画分は限外ν過膜などにより
　９− 濃縮する。必要に応じてこのクロマトグラフィーを２〜
５回繰り返す。なお、用いたカラムは公知の手段により
再生することができる。

本発明により得られるヒト■ｙＥを含む画分を凍結乾燥
することにより、ヒトＩｙＥを長期間安定に保存するこ
とができる。本操作を実施するに際し、ヒ）　Ｉ、Ｅを
含む両分に糖類、例えばマルトース。

デキストロースなどを添加することが好ましい。

以上、ヒトＩ、Ｅ産生能を有する細胞を大量に培養し、
得られた培養液からヒ）　ＩｙＥを分離、採取するヒト
ＩｙＥの製造法について詳述した。

本発明によって得られる高純度のヒ）　Ｉ、Ｅは公知の
方法によりヒト血清から得られるヒトＩ　ｙ　Ｅと同様
に血中１ｙＥ濃度を測定するだめのキットの標準品とし
て使用でき、また、アレルギーの予防や治療に関する研
究にも広く応用できる。さらに、本発明によって得られ
るヒ）　Ｉ、Ｅを免疫原として抗と）ＩＥ抗血清あるい
は抗ヒトＩｙＥモノクローナル抗体を作製することもで
きる。

すなわち、該ヒ）　Ｉ、Ｅを公知の方法〔例えば、−１
〇− イムノロジー、第１３巻、３８１頁（１９６７年）参照
〕に上り哺乳動物に接種、免疫することにより抗ヒ）　
ＩｙＥ抗血清を製造することができる。

とりわけ、本発明によシ得られるヒ）　ＩｙＥでヤギを
免疫することにより高力価の抗ヒ）　Ｉ、Ｅ抗血清を得
ることができる。

また、抗ヒトＩｙＥモノクローナル抗体は次のようにし
て作製できる。

すなわち、例えば該ヒトＩｙＥを必要によりアジュバン
ト、例えばフロイント　コンプリートアジュバントと共
に、マウスに２〜６週間にわたって、３〜４回皮下に接
種する。但し、最終免疫はヒトＩ、Ｈの・みを静脈内に
接種することが望ましい。免疫されたマウスの牌細胞を
とり出しこの細胞と８−アサ゛グアニン抵抗性マウスミ
エローマ細胞株、例えばＰ　３−Ｘ６３・Ａｙ８−Ｕｌ
などとをポリエチレングリコール、例、ｔはボりエチレ
ンクリコール６０００などを用いて融合させる。常法に
従い、得られた細胞懸濁液の一定量をＨＡＴ（ヒボキサ
ンチン、アミノプテリンおよびチミジン）含有培地を含
むマルチディッシーの各ウェルに播種して、融合細胞の
みを選択的に増殖させる。増殖のみられたウェルの培養
上清の抗ヒトＩｙＥ抗体産生量をラジオラムノアッセイ
法等により測定して、高い抗体価を示したウェル中のハ
イブリドーマ細胞を限界希釈法によりクローニングする
。単一細胞由来の細胞群として増殖させた後、再び抗体
価の測定を行い、抗体価の高いクローンを選ぶことがで
きる。得られた・・イブリドーマ細胞を同系マウス腹腔
内に接種し、細胞を腹水中で増殖！させることにより、
腹水中に抗ヒ）　ＩｙＥ抗体を　生成蓄積させる。採取
した腹水から硫安塩析、ＤＥＡＥ−セルロースカラムク
ロマトグラフィーなどにより抗ヒトＩ、Ｅモノクローナ
ル抗体を容易に取得できる。

以上のようにして得られる抗ヒトＩｙＥ抗血清および抗
と）　ＩｙＥモノクローナル抗体はアレルギー診断用試
薬の材料として使うこともできるが、さらに以下に述べ
るように、これらを水不溶性担体に化学的に結合させる
ことによりヒトＩｙＥの精製にも利用できる。

すなワチ、抗ヒト■ｙＥモノクローナル抗体を、例えば
水不溶性担体に結合させ、抗ヒトＩｙＥモノクローナル
抗体結合水不溶性担体カラムを調製して、通常のアフィ
ニティークロマトグラフィーによりヒ）　ＩｙＥ含有物
、例えばヒ）　ＩｙＥ産生能を有する細胞株の培養物か
らのヒ）　Ｉ、Ｅの分離、精製に供することができる。

クロマトグラフィーの溶出溶媒としては酢酸−食塩水、
プロピオン酸−食塩水、グリシン−塩酸−食塩水などが
通常用いられるが、該溶媒は必要により糖類、例えばマ
ルトース、デキストロースなどを含んでいてもよい。

抗ヒ）　ＩｙＥモノクローナル抗体結合水不溶性担体カ
ラムによるアフィニティークロマトグラフィーによれば
、手軽に高純度のヒトＩｙＥが得られ、抗ヒ）ＩＥモノ
クローナル抗体はヒトＩｙＥの分離。

精製に極めて有効に利用できる。

以下に本発明を実施例および参考例により具体的に説明
する。

実施例（１）株化ヒト骨髄腫細胞Ｕ−２６６を４０本の１３− ローラーボトルＲＣ−９４（長さ５０α、直径１１礪、
　Ｎ、　Ｂ、　Ｓ、社〔米国〕製）内のＮ−２−ヒドロ
キシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸２
５ｍＭ、カナマイシン（明治製菓製）１００μｙ／ｍｌ
およびウシ胎児血清（ミクロバイオロジ力ルアソシェー
ト社〔米国〕製）１０％を含むＲＰＭＩ−１６４０培地
〔ジャーナルオブアメリカンメデカルアソシエーション
、第１９９巻、　５１９頁（１９６７年）　）　５００
　ｍｌに２．ＯＸ　１０〜２．５Ｘ１０５／ｍｌの細胞
濃度となるように接種して３７℃で１分間当り１回転ボ
トルを回転させながら４〜５日間培養した。細胞濃度が
４×１０〜５×１０５／　ｗ、ｌに達した時上記の培地
で約２倍に希釈して、細胞数を２．０Ｘ１０〜２．５　
Ｘ　１０　／ｄとした。得られた細胞懸濁希釈液のうち
、２０７は細胞の継代に使用するために再びローラーボ
トルを用い同一条件で培養した。残りの２０／は培養容
量８１および１５／のスピシナーフラスコ（ペルコグラ
ス社〔米国〕製）に移し、ボトル内の回転子を７５回転
／分で回転させて５〜６日間３７℃で培養し１４− た。培養物をトミ一連続遠心機を用いて連続遠心（３，
０００回転／分；流量１２０ｍ／／亦）してヒトＩｙＥ
を含む培養上清を得た。

（２）前記２回の培養で得られた培養上清４０Ｉ！の硫
安塩析（硫安４０〜５５％飽和）は５℃で行ない、生じ
た沈澱をベックマン遠心機Ｊ−６Ｂを用いて遠心分離（
Ｊ、Ｓ−４，２ローター：　４，０００回転／分：６０
分）することにより採取した。沈澱物をリン酸緩衝液−
食塩水ＣＰＢＳ　；　８．１　ｍＭＮａＨ２ｐｏ４．　
ｉ、　５　ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，２゜７　ｍＭ　ＭＣＩ
　、　１３７ｍＭＮａＣ／、　ｐＨ７，２）　１．００
０ｗ／　　に溶解したのち、溶解液の硫安を除くために
同緩衝液１０Ｉ！に対して５℃で４０時間透析した。な
お、途中で１回緩衝液を交換した。

（３）　　カトレカサスらの方法（前記した同著者の文
献参照）によ！ｌｌ調製したりジン−セファロース４Ｂ
カラム（３，６Ｘ　２５．５ｃｍ　）を０．１　％　Ｔ
ｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳにより平衡化して、（２）
で得られた透析内液の１／６量（２００ｄ）を同カラム
にかけたのち、同緩衝液４００ｙ／および２０チデキス
トロースを含む同緩衝液２．ＯＯＯ鰐／　を用いてカラ
ムからヒトＩｙＥを溶出した。ついで、ヒトＩｙＥを含
む両分を限外ｒ過膜（ダイアフロー膜ＰＭ−１０，アミ
コンーファ〜・イースト社〔米国〕製）により濃縮した
。

この操作を６回繰り返して得られた全濃縮液３４０ｍ１
を４．０００ｇ／の６０ｍＭ）リス−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）に対して５°Ｃで４０時間透析した。なお、
途中で１回緩衝液を交換した。

（４）　　（３）で得られた透析内液３４０＊／を蒸留
水で６倍に希釈し、希釈液の半量１０２０＋１７をあら
かじめ１０ｍＭ）リス−リン酸緩衝液（ｐＨ８，０）で
平衡化したＤＥＡＥ−セファセルカラム（４，８Ｘ　２
８ｃｍ）にかけた。カラムを１．６００ｇ／　の同緩衝
液で洗浄（ＰＨ３，Ｏル両液２，４００ヨｌ　を入扛て作製した直線濃度勾配に
よりヒトＩｙＥを溶出した。ヒ）　ＩｙＥを含む両分２
．０００ｇ＋／をすみヤカに集め、１０倍ｍ　Ｋ　（／
、）　Ｐ　Ｂ　８１００ｇ／を加え限外濾過膜（ダイア
フロー膜ＰＭ−１０）を用いて３０＊／に濃縮した。残
りの希釈液を同様に処理して合計６０ｍ１の濃縮液を得
た。

（５）　　あらかじめＰＢＳで平衡化したセファクリル
Ｓ−３００カラム（５Ｘ９５ｃｍ）に（４）で得られた
濃縮液６０ｇ／をかけ、同緩衝液を用いてヒ）　ＩｙＥ
を溶出した。ヒ）　ＩｙＥを含む溶出画分を限外濾過膜
（ダイアフロー膜ＰＭ−１０）を用いて４０ｍ１Ｋ濃縮
した。

（６）　　（５）で得られた濃縮液４０　ｖｔｌを再度
（５）で用いたセファクリルＳ−３００カラムにかけた
。カラムからの溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を紫
外線検出器（ユビコードＳ紫外線吸収計、　ＬＫＢ社〔
ス工−デン〕製）を用いてモニターしながら、溶出液を
カラムに２回循環させたのち、ヒトＩｙＥを含む両分を
フラクションコレクターにより集めた（リサイクリング
クロマトグラフィー）。ヒトＩｙＥを含む画分は限外濾
過膜（ダイアフロー膜ＰＭ−１０）により２６　ｖｔｌ
に濃縮した。

（７）　　カトレカサスらの方法（前記した同著者の文
献参照）により調製した抗つシ血清つサギＩ、Ｇ結合セ
ファロース４Ｂカラム（１，８Ｘ３０ｃｍ）を１７− ＰＢＳで平衡化して（６）で得られた濃縮液２６　ａｒ
ｔをカラムにかけた。カラムを素通りする画分を集め、
さらに２０％マルトースを含む同緩衝液３００ｇ＋／で
カラムを洗浄した。ヒ）　ＩｙＥを含む両分を集めて、
限外濾過膜（ダイアフロー膜ＰＭ−１０）により１５ｍ
１に濃縮した。この吸収操作を３回繰り返した。

本カラムは５　Ｍ　Ｎａ５ＣＮ　１５０　ｍｌ　、つい
でＰＢＳ　２００　ｍで洗浄することにより再生した。

（８）精製したヒ）　ＩｙＥを長期間安定に保存するた
め（７）で得られた濃縮液を２胃ｌ容のバイアルピンに
１露ｊづつそのまま分注して凍結乾燥を行なった。

溶媒としで用いた緩衝液にマルトース２０％を含ませた
。

（９）　　（８）で得られたヒｌ−１，Ｈの純度をドデ
シル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル電気
泳動〔ラエムリの方法〔ネーチャー、第２２７巻。

６８０頁（１９７０年）〕〕により調べた結果、９９％
以上であった。本標品中に含まれるウシＩ、Ｇ　、ウシ
Ｉ、Ａなどの培地由来の夾雑蛋白質はオフタロニー法〔
グログレスインアレルギー、第５１８− 巻、１１頁（１９５８年）〕および−元平板拡散法〔イ
ムノケミストリー、第２巻、２３５頁（１９６５年）〕
などの免疫化学的方法で検出限度以下（０，２チ以下）
であった。なお、培養上溝液からのヒトＩ、Ｅの収率は
２９　％　（ＲＩＳＴ法）であった。得られたヒ）　Ｉ
ｙＥ最終標品の物理化学的性質は下記のとおりであった
。

■）分子量：２２０．０００±３０．０００分子量は前述のラエムリのポリアクリルアミドゲル電気
泳動法により測定した。なお、分子量測定用標準蛋白質
としてパイオーラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社（米国）製
の５ＤＳ−ＰＡＧＥスタンダード、ハイモレキヱラーウ
ェイトを使用した。ヒトＩｙＥは標準蛋白質ミオシン（
分子量２００．０００　）よりも相対易動度の小さい位
置に単一バンドあるいは泳動条件によっては２本のバン
ドとして検出された。

旧　紫外部吸収スペクトル：吸収極大は２８０ｎｍに、また吸収極小は２５１　ｎｍ
に存在した。

■）等電点ニア、４付近等電点はタロマドフォーカシング法により測定した。

■）アミノ酸組成（表１）：ヒ）　Ｉ、Ｅに定沸点塩酸を加え、１１０℃で２４時間
加水分解したのち、日立製８３５型高速アミノ酸自動分
析装置によりアミノ酸分析した。シスチンおよびシステ
ィンの定量はハースの方法〔メンドインエンサ゛イモロ
ジー、第１１巻、１９７頁（１９６７年）〕により、ヒ
トＩｙＥを過ギ酸酸化しシスティン酸として定量した。

表　　１ ■）糖組成（表２〕：フェノール硫酸法〔アナリティカルケミストリー、第２
８巻、３５０頁（１９５６年）〕により一２１＝測定したヒ）　ＩｙＥの中性糖含有量は、ガラク）　−
スに換算して４．８±０．６％であった。中性糖およと
＞π びアミノ糖の個別定量ビ箱守　の方法〔ジャーナルオプ
バイオロジカルヶミストリー、第２４６巻。

１１９２頁（１９７１年）〕　により日立製に一５３型
ガスクロマトグラフを用いて分析した。シアル酸は過ヨ
ウ素酸レゾルシノール法〔ジャーナルオブバイオロジカ
ルケミストリー、第２４６巻、４３゜頁（１９７１年）
〕により測定した。

表　　２参考例１（１）抗ヒ）　ＩｙＥモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマの作製２２− 実施例で得られたヒトＩｙＥ　５０μｙを７０インドコ
ンプリートアジユバントと混合し、６〜７週令の雌性Ｂ
ＡＬＢ／Ｃマウスの皮下に接種した。２週後、ヒトＩｙ
Ｅ　５０μｙをフロイントインコンプリートアジュバン
トと混合して再度皮下に接種した。

さらに２週間後、ヒ）Ｉ、Ｅ３５μｙを生理食塩水に溶
解し、静脈内に接種して、３日後常法に従って肺細胞を
採取した。得られた肺細胞１×ｌＯ個およびＢＡＬＢ／
Ｃマウス由来の８−アザグアニン抵抗性ミｘ　ａ　−−
ｑ細胞株Ｐ３−Ｉ６３　ｈｙ８ｙｕ１１ｘ１０７個を４
５チポリエチレングリコール６０００（ＰＥＧ６０００
）を含むＭＥＭ培地（日永製薬製）　０．３　ｍｌ中、
３７℃で７分間静置して反応させた。ＰＥＧ６０００を
希釈するため細胞懸濁液にＭＥＭ培地をできるだけゆっ
くりと滴下して加え、最終的に１’）、ｗｌとした。遠
心分離によシ細胞を集め、細胞を３７℃であらかじめ保
温した１０チウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地
５０譚１に懸濁した。得られた細胞懸濁液を１１１１づ
つマルチディッシ８−（リンプロ社〔米国〕製）の４８
ウエルに播種した。２４時間後に上清を半分すて、３７
℃に保温しておいたＨＡＴ培地を加え、以後同様の操作
を２〜３日ごとにくり返した。マルチディツシュに細胞
を播種し１４日後、各ウェルの上清の抗ヒ）　ＩｙＥ抗
体活性を測定した。抗ヒトＩｙＥ抗体陽性を示したウェ
ルの細胞を限界希釈法によりウェル当９０．２個の割合
でマルチディツシュに播種（、非糞肴辻堆クローニング
して、抗ヒｌ−ＩｙＥ抗体産生・・イブリドーマ細胞３
１株を得た。

（２）抗ヒトＩｙＥモノクローナル抗体の精製上記のよ
うにして得られた抗ヒ）　ＩｙＥ産生ノ・イブリドーマ
（Ｅ２３５　　Ｉ６３株）ＩＸＩＯ個を６週令の雌性Ｂ
ＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に接種して、１４日後に腹水
を採取した。５匹のマウスより得られた腹水１８　Ｗ／
に硫安を４７チ飽和となるように添加して、遠心分離に
より沈澱物を集めた。得られた沈澱物を２０ｍＭ）リス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，９）　−０，０５Ｍ食塩６　ｗ
ｌに溶解し、溶解液を同緩衝液２１に対して５℃で１６
時間透析した。透析内液１５　ｗｅを、あらかじめ同緩
衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム（１，６
ｘ１２ｃＭ）にかけ、同緩衝液により溶出して、抗ヒト
■ｙＥモノクローナル抗体６５ダを得た。

参考例２抗ヒトＩｙＥ抗体結合水不溶性担体を用いるアフィニテ
ィークロマトグラフィーによるヒトＩｙＥの精製参考例１（２）で得られた抗ヒトエｙＥモノクローナル
抗体１５ｑを水不溶性担体アフィ・ゲル１０（バイオ−
ラッド社（米国）製）１ｍ？に結合させ抗ヒトＩｙＥモ
ノクローナル抗体−アフィ・ゲル１０を調製した。結合
方法は、公知のアフィ・ゲル１０に蛋白質を結合させる
際に用いられている方法に従った。あらかじめＰＢＳで
平衡化した抗ヒ）　Ｉ、Ｅモノクローナル抗体−アフィ
・ゲル１０カラム１ｍｌに実施例（２）で得られた透析
内液１０ｗ１をかけた。

２０チテキストロースを含むＰＢ５６０ｇ＋／を用いて
カラムを洗浄し、ついで０．２　Ｍ酢酸−０，１５ＭＮ
ａｃｌ！１０ゴを用いてヒ）　Ｉ、Ｅをカラムから溶出
し、溶出液をただちに中和したのちＰＢＳＩ／に対して
５２５− ℃で４０時間透析した。但し、途中で１回緩衝液を交換
した。得られた透析内液をドデシル硫酸ナトリウムを含
むポリアクリルアミドゲル電気泳動法によシ分析したと
ころ、本標品の純度は９０％以上であり、実施例で得た
ヒ）　Ｉ、Ｅと同一の易動度を示した。アフィニティー
カラムクロマトグラフィーでのヒ）　ＩｙＥの回収率は
７０チであった（ＲＩＳＴ法）。

２６一

Claims

【特許請求の範囲】

（１）　　ヒ）　ＩＰＥ産生能を有する細胞を培養し、
培養液中にヒ）　ＩｙＥを生成蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とするヒトＩ、Ｅの製造法。
（２）　　ヒ）　Ｉ、Ｅ産生能を有する細胞が株化ヒト
骨髄腫細胞である特許請求の範囲第１項記載の製造法。
（３）　　ローラーボトル培養装置およびスピンナ＝７
うλコ培養装置を用いて培養することを特徴とする特許
請求の範囲第１項記載の製造法。
（４）　　ウシ胎児血清含有培地で培養することを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載の製造法。
（５）　　ヒ）　Ｉ、Ｅを分離、採取するに際し、アミ
ノ酸結合水不溶性担体を用いるアフィニティークロマト
グラフィーを行なうことを特徴とする特許請求の範囲第
１項記載の製造法。
（６）　　ヒ）　Ｉ、Ｅを分離、採取するに際し、硫安
塩析、アミノ酸結合水不溶性担体を用いるアフィニティ
ークロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラ
フィー、ゲル濾過ついで抗ウシ血清抗体結合水不溶性担
体を用いるアフィニティークロマトグラフィーを行なう
ことを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の製造法。
（７）　　と）ＩｙＥを分離、採取するに際して実施す
るアフィニティークロマトグラフィーにおいて、糖類添
加緩衝液を用いることを特徴とする特許請求の範囲第６
項記載の製造法。