CN103468644A - 产生抗人d-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗人D-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法和应用。本发明用纯化的D-二聚体作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术经多次细胞融合,利用ELISA法克隆化筛选出能稳定分泌抗D-二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。小鼠腹水法生产单克隆抗体。并利用已制备的抗D-二聚体单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体,以D-二聚体作为检测抗原,进行抗体配对试验,获得能检测天然D-二聚体的抗体配对并以此建立了检测D-二聚体的双抗体夹心ELISA方法。杂交瘤细胞株分泌相应的单克隆抗体,能进行配对和检测天然血清,初步建立了检测D-二聚体的双抗体夹心ELISA方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域,尤其涉及杂交瘤细胞株及由其产生的抗人D-二聚体的单克隆抗体。
背景技术
D-二聚体(D-dimer)是纤维蛋白单体经活化因子XIII交联后,再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物。具体而言,血浆中纤维蛋白原在凝血酶(thrombin)、Factor XIIIa(转谷酰胺酶)和钙离子的作用下,去掉血纤肽A、B,暴露出新的结合位点,自发聚集形成非共价结合的纤维蛋白束;纤维蛋白束再在Factor XIIIa的作用下,形成γ-γ的异肽键,将聚合形式以共价键的方式稳定下来,称为交联纤维蛋白,即血栓的基本骨架;交联纤维蛋白在纤溶酶的作用下,降解为不同大小的交联纤维蛋白降解产物,其最小结构(DD/E,也有文献认为是DD)因为含有两个由异肽键共价交联的D片段而称为D-二聚体。
近年来,D-二聚体作为体内交联纤维蛋白水解的标志性产物,其临床诊断价值已得到普遍认同。它以其高度的敏感性和阴性预示能力,在深静脉血栓(DVT)和肺栓塞(PE)的排除、弥散性血管内凝血(DIC)的诊断及溶栓治疗效果监测等方面具有很好的临床应用价值。
目前实验室中检测D-二聚体都是基于免疫学的方法,包括免疫层析(胶体金)方法、双向测流免疫测定法、化学发光酶联免疫法和免疫比浊测定法(包括免疫散射比浊法和免疫投射比浊法,每一种又有乳胶凝集增强和普通的两种类型)。所有这些方法都需要高质量的D-二聚体特异性抗体,上述部分方法只用一种抗体即可工作,部分方法需要两种抗体进行配对后才能实现测定。目前D-二聚体检测所用抗体全部来自于国外,国内尚未见到相关抗体报道和销售,客观上影响了国内公司在D-二聚体检测试剂上的研发,在一定程度上导致了目前国内D-二聚体检测试剂市场基本上被欧美公司全部占据的局面。
发明内容
本发明根据临床病人在凝血-纤维蛋白溶解过程中血液成分的相关变化,以纯化的天然D-二聚体为免疫原,通过改良的杂交瘤技术,获得杂交瘤细胞株,分泌D-二聚体特异性单克隆抗体。这两株单克隆抗体能够配对用于D-二聚体的免疫检测。该抗体对将有助于D-二聚体免疫检测试剂的研发。
本发明提供的两株产生抗人D-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,本发明将其命名分别为1C6(细胞保藏号CCTCC NO:C2013138),培养物名称:杂交瘤细胞株1-C6(IgG1)和1D10(细胞保藏号CCTCC NO:C2013139),培养物名称:杂交瘤细胞株1-D10(IgG2b)。保藏单位为中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection,简称CCTCC),地址:中国武汉武汉大学,保藏日为2013年9月5日。
杂交瘤细胞株1C6和1D10均由纯化的D-二聚体免疫Balb/c小鼠后小鼠脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后培养产生。
本发明还提供一种由杂交瘤细胞株1C6所产生的单克隆抗体。
本发明还提供一种由杂交瘤细胞株1D10所产生的单克隆抗体。
本发明还提供一种用于检测D-二聚体的试剂盒,其包含杂交瘤细胞株1C6和/或1D10所产生的单克隆抗体。
本发明还提供上述的杂交瘤细胞株的制备方法,其主要包含步骤:
1)用纯化的D-二聚体作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠;
2)通过杂交瘤技术将小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞经多次细胞融合,利用间接ELISA法进行正向和负向筛选,克隆化筛选出能稳定分泌抗D-二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
具体地,步骤1)包含:将纯化的D-二聚体与等量的弗氏完全佐剂乳化,乳化完成后,对8周龄的Balb/c小鼠进行基础免疫。2周后,追加免疫一次。
具体地,步骤2)包含:将脾细胞与骨髓瘤细胞混合,以聚乙二醇为融合剂,形成融合细胞,将融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液中,并置CO2中在37℃培养;用间接ELISA法进行筛选,筛选时,先用纤维蛋白原及其降解产物包被,进行负向筛选,去掉能够与纤维蛋白原及其降解产物结合的杂交瘤细胞;然后用D-二聚体包被筛选剩下的杂交瘤细胞进行正向筛选,对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化,并置于CO2中于37℃培养,直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止。
上述的单克隆抗体可用于制备检测人D-二聚体的制剂。
本发明利用已制备的抗D-二聚体单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体,以D-二聚体作为检测抗原,进行抗体配对试验,经过优化ELISA反应条件,获得能检测天然D-二聚体的抗体配对并以此成功建立了检测D-二聚体的双抗体夹心ELISA方法。
本发明通过杂交瘤技术,制备了抗D-二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C6和1D10,分泌相应的单克隆抗体,能进行配对和检测天然血清,初步建立了检测D-二聚体的双抗体夹心ELISA方法。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂,下文特举较佳实施例,并配合附图,作详细说明如下。
附图说明
图1表示单克隆抗体1C6的ELISA鉴定,其中上行为包被D-二聚体抗原,中行为包被D-单体,下行为包被纤维蛋白原及其降解产物;每一行中左边第1孔为阴性对照,第2到12孔为抗体倍比稀释,从1:1000、1:2000、…….到1:106。
图2 表示单克隆抗体1D10的ELISA鉴定,其中上行为包被D-二聚体抗原,中行为包被D-单体,下行为包被纤维蛋白原及其降解产物;每一行中左边第1孔为阴性对照,第2到12孔为抗体倍比稀释,从1:1000、1:2000、…….到1:106。
图3 表示单克隆抗体1C6的免疫印迹鉴定,其中左侧为非变性电泳后的免疫印迹,右侧为变性电泳后的免疫印迹;每图中,DD-A的抗原为购自Abcam公司的D-二聚体抗原,DD-C为国内公司的D-二聚体抗原,第三和第四条分别为D片段(D fragment)和E片段(E fragment)。
图4 表示单克隆抗体1D10的免疫印迹鉴定,其中左侧为非变性电泳后的免疫印迹,右侧为变性电泳后的免疫印迹;每图中,DD-A的抗原为购自Abcam公司的D-二聚体抗原,DD-C为国内公司的D-二聚体抗原,第三和第四条分别为D片段(D fragment)和E片段(E fragment)。
图5 表示HRP标记抗体的效价检测结果。其中上行为单克隆抗体1C6,下行为单克隆抗体1D10;包被抗原为D-二聚体,孔1、2和3是阴性对照,孔4为标记抗体1:1000稀释,孔5为1:2000,孔6为1:4000,……,孔12为1:256000。
图6 表示D-二聚体ELISA检测体系的分析特异性鉴定,分别测定D-二聚体和各种相关抗原,横坐标为抗原浓度,单位为单位为μg/ml;纵坐标为450nm处吸光度。
图7 表示D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体的标准曲线,横坐标为D-二聚体的浓度,单位为μg/ml;纵坐标为450nm处吸光度。
图8表示 D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体与Siemens公司的D-dimer Plus试剂测定结果比较,横坐标为本发明中涉及方法的检测结果,纵坐标为Siemens公司的D-dimer Plus试剂测定结果,单位均为ng/mL。
具体实施方式
本发明以纯化的D-二聚体作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术经多次细胞融合,利用间接ELISA法和克隆化筛选出能稳定分泌抗D-二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株,腹水经HiTrap IgG Purification HP亲和层析柱纯化,所得的单克隆抗体进行效价测定,亲和力测定。经筛选得到2株稳定分泌D-二聚体特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C6和1D10,ELISA和免疫印迹鉴定结果表明2株单克隆抗体均具有较高的特异性。
本发明建立了D-二聚体的ELISA检测体系:应用抗D-二聚体抗体1C6为捕获抗体,抗D-二聚体抗体1D10为检测抗体,建立标准的双抗体夹心ELISA检测方法,能够准确检测血清中的天然D-二聚体,并以此成功建立了检测D-二聚体的双抗体夹心ELISA方法。
材料和来源
实验动物:Balb/C小鼠购自第三军医大学实验动物中心(中国重庆)。
细胞培养基和胎牛血清购自Gibco公司。
D-二聚体等抗原购自Abcam公司,HRP-山羊抗小鼠IgG购自中山公司。
纯化柱和填料购自美国GE公司。
其余试剂均为国产分析纯试剂。
实施例1 抗D-二聚体单克隆抗体的制备
1. D-二聚体单克隆抗体的制备
将纯化的D-二聚体与等量的弗氏完全佐剂乳化,抗原乳化采用双注射器互推法。乳化完成后,以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对5只8周龄左右的Balb/c小鼠进行基础免疫(100 μg/ml)。2周后,将D-二聚体与等量的弗氏不完全佐剂乳化,以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对小鼠进行追加免疫(100 μg/ml);2周后,再采用同样方式追加免疫一次,7天后处死小鼠取出小鼠脾脏,将脾细胞进行细胞融合。
融合过程为将脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)以8:1混合,以聚乙二醇为融合剂。融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液中,并置于6% CO2中在37℃培养。用间接ELISA法进行筛选。筛选时,先用纤维蛋白原及其降解产物包被,进行负向筛选,去掉能够与纤维蛋白原及其降解产物结合的杂交瘤细胞;然后用D-二聚体包被筛选剩下的杂交瘤细胞进行正向筛选,对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化,并置于6% CO2中于37℃培养,直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止,即可进行单克隆抗体的扩大培养。
采用小鼠腹腔内诱生单克隆抗体的方法进行抗体生产。取已成年的Balb/c小鼠,于腹腔内注入液态石蜡0.5 mL,1周后再于腹腔内注入杂交瘤细胞。用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮混匀,并将细胞数调至4×105 个/mL,每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5 mL杂交瘤细胞。10-14天后收集腹水。
2. D-二聚体单克隆抗体的纯化
收集腹水后对其进行纯化,具体方案为:配置抗体纯化所需buffer:Binding Buffer (A液)20 mmol/L磷酸钠,0.8 mol/L (NH4)2SO4,pH 7.5;Elution Buffer (B液):20 mmol/L 磷酸钠,pH 7.5;Regeneration Buffer(C液):20 mmol/L磷酸钠,pH 7.5,并按体积比30 %加入异丙醇;在单抗腹水中加入硫酸铵,使其终溶度与A液中硫酸铵的溶度一致,0.45 μm滤膜过滤等待上样;选用HiTrap IgG Purification HP柱接入AKTA prime蛋白纯化仪,A、B液和C液对柱子进行充分洗涤;用A液进行充分平衡后,将准备的样品从A管上样,上样后用A液平衡柱子,去除杂蛋白,再用B液洗脱纯化柱,收集洗脱峰;调节洗脱蛋白的pH至7.0-8.0,将抗体分装冷冻于-20℃保存;用Regeneration Buffer使填料进行再生,然后用Binding Buffer进行平衡即可。
3. ELISA鉴定抗D-二聚体单克隆抗体
将纯化的D-二聚体抗原和相关对照抗原用包被稀释液稀释至5μg/ml,ELISA条板每孔加入100μl,4℃包被过夜。次日取出板子弃抗原,洗板。将待鉴定单克隆抗体作1:1000,1:2000,1:4000,1:8000,1:16000......,按100μl/孔加入对应条孔中,另作空白及阴阳对照孔。37℃孵育1h,洗板,加入二抗,1:3000 HRP标记山羊抗小鼠IgG,按100μl/孔加入对应条孔中,37℃孵育40min。弃液,洗板,拍干,加入底物液100μl/孔,避光显色10min,加入终止液50μl/孔。在450nm 处测定吸光度值。结果如图 1和图2所示,单克隆抗体1C6对D-二聚体效价达到1:50万,对D-单体的效价为1:8000,对纤维蛋白原及其降解产物的效价为0;单克隆抗体1D10对D-二聚体效价为1:100万,对D-单体效价为0,对纤维蛋白原及其降解产物的效价为0。
4. 抗D-二聚体单克隆抗体的免疫印迹鉴定
1)将Marker 3 μl、D-二聚体抗原20 μl、相关对照抗原20 μl行SDS-PAGE。
2)电泳结束后,取下凝胶,置于转印缓冲液中平衡10 min。
3)将0.22 μm PVDF膜先用无水甲醇处理20 s,再用ddH2O洗涤5 min。然后再浸入Transfer Buffer超过5 min。同时将滤纸浸入Transfer Buffer中。
4)转膜:从下至上依次排列:滤纸—PVDF膜—胶—滤纸,排出气泡,放入转膜仪,18 V恒压电转移1.5 h。
5)转膜完成后,在膜上可见清晰蛋白marker,ddH2O清洗两遍,TBST洗5 min。将转移膜置于封闭液中,室温封闭2 h。
6)弃去封闭液,用1×TBST漂洗膜3次,每次15 min。
7)加入以1:1000稀释的纯化抗体,4℃孵育过夜。1×TBST漂洗膜3次,每次15 min。
8)加入已稀释到1:10000的HRP-羊抗小鼠IgG抗体,37℃孵育3 h。
9)1×TBST洗涤3次,每次15 min。
10)用化学发光显色,显影定影后,观察分析结果并摄像。在D-二聚体对应分子量处处均可见抗D-二聚体单克隆抗体结合清晰条带。结果如图3和图4所示。在7%非变性条件下,单克隆抗体1C6和1D10均能识别并结合两种不同来源的D-二聚体,不识别D-片段和E-片段,在7%变性条件下,两种单克隆抗体均不识别和结合这四种形式的抗原。。
实施例2 双抗体夹心ELISA法检测D-二聚体
1. HRP标记抗体
本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再与抗体蛋白的氨基相结合,所获酶标记抗体的产率高,具体步骤如下:
1)HRP酶的准备:称取10 mg HRP酶,加2 mL纯水配置为5 mg/ml的HRP液体,按照每mg HRP酶加入34 μL计算,加340 μL NaIO4,4℃避光放置,1 h后,按照每mg HRP酶加入250 μL的量加入乙二醇250 μL,避光放置4℃,30 min后转入透析袋中,用1 mM醋酸缓冲液(pH 4.0~4.4)透析过夜,期间至少换液2次,均要求避光。
2)抗体的准备:0.01 M的PBS缓冲液进行4℃透析过夜,并测定蛋白浓度。
3)标记:抗体与HRP酶按1:1(质量比)混合,加入1 mol/L Na2CO3缓冲液(1:80),调解反应的pH为9.5,25℃反应2~3 h。
4)终止:新鲜配制0.1 mol/L NaH4B(4 mg/mL),按照每mg HRP酶加入47 μL。4℃放置2 h后,转入透析袋。用0.01 mol/L PBS缓冲液(pH7.0~7.2)透析过夜,期间至少换液两次,避光。
5)HRP标记抗体的效价检测:将纯化的D-二聚体抗原用包被稀释液稀释至5μg/ml,ELISA条板每孔加入100μl,4℃包被过夜。次日取出酶标板弃抗原,洗板,加入350μl/孔的1%BSA进行封闭,37℃,2h。洗板后将HRP标记好的待鉴定单克隆抗体作1:1000,1:2000,1:4000,1:8000,1:16000......,按100μl/孔加入对应条孔中,另作空白及阴性对照孔。37℃孵育40min,弃液,洗板,拍干,加入底物液100μl/孔,避光显色10min,加入终止液50μl/孔。在450nm 处测定吸光度值。结果如图5所示,结果显示,1-C6和1-D10酶标抗体的效价均>1:256000,满足应用要求。
6)分装保存:标记好的抗体用棕色EP管分装,并测定抗体效价。-20℃避光保存。
2. 抗体配对及临床样本的检测
1)标本收集:
从第三军医大学第一附属医院收集临床血浆标本,取回过程中用冰袋储存,以保持标本新鲜,离心取上清加防腐剂后做好标记分装于1.5 ml Ep管中,-80℃保存,并将病人基本信息录入电脑,做好编号。
2)标本检测:
选取单克隆抗体1C6作为捕获抗体,酶标单克隆抗体1D10作为检测抗体,D-二聚体校准品为测定对象,检测方法如下:a. 包被酶标板:用包被液将抗体稀释为5 μg/ml,每孔加100 μl, 4℃包被过夜。b. 将包被过夜的酶标板洗3遍,甩干。c. 封闭:每孔加封闭液350 μl,37℃孵育1 h,洗涤3遍,甩干。d. 用抗体稀释液将D-二聚体校准品从50 μg /ml开始倍比稀释,每孔加100 μl,第一孔为空白对照,做标准曲线。检测临床标本时,每孔加标本100 μl,37℃孵育1 h。e. 洗板3遍,甩干。f. 将相对应的酶标二抗以1:5000稀释,每孔加入100 μl,37℃孵育30 min。g. 洗板5遍,甩干。h. 每孔加入100 μl底物显色液,室温避光显色5 min。i. 每孔加入50 μl终止液,450nm处读取吸光度值,同时制作标准曲线,根据标准曲线确定临床样本中D-二聚体的含量。
具体请参照图6、图7和图8。图6显示基于单克隆抗体1C6和1D10建立的ELISA体系结果表明,新建的ELISA仅对D-二聚体反应,而对纤维蛋白原、FgDP-X和FgDP-Y没有反应,提示该检测体系具有良好的特异性。图7 表示D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体的标准曲线,横坐标为D-二聚体的浓度,单位为μg/ml;纵坐标为450nm处吸光度。提示该检测体系在0-2μg/ml范围内线性良好。图8表示 D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体与Siemens公司的D-dimer Plus试剂测定结果比较,横坐标为本发明中涉及方法的检测结果,纵坐标为Siemens公司的D-dimer Plus试剂测定结果,单位均为ng/mL。提示该检测体系与公认方法检测结果相关良好,具有很好的检测准确度。
同时请参照表1,其中对D-二聚体ELISA检测体系测定D-二聚体与Simens公司的D-dimer Plus试剂测定结果进行了比较,结果表明,对于阴性标本,二者之间的符合率为97%,对于阳性标本,二者之间的符合率为84%,总体符合率为91%。
表1 新建ELISA 体系与公认试剂检测结果比较
阴性结果 | 阳性结果 | 合计 | |
Siemens D-Dimer PLUS | 140 | 112 | 252 |
1C6/1D10 | 136 | 94 | 230 |
符合率(%) | 97 | 84 | 91 |
虽然本发明已以较佳实施例披露如上,然其并非用以限定本发明,任何所属技术领域的技术人员,在不脱离本发明的精神和范围内,当可作些许的更动与改进,因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。
Claims (10)
1.一种产生抗人D-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其保藏号为CCTCC NO:C2013138。
2.一种产生抗人D-二聚体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其保藏号为CCTCC NO:C2013139。
3.一种权利要求1所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体。
4.一种权利要求2所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体。
5.一种用于检测人D-二聚体的试剂盒,其包含权利要求3和/或权利要求4所述的单克隆抗体。
6.一种权利要求1或2所述的杂交瘤细胞株的制备方法,其特征在于,包含步骤:
1)用纯化的D-二聚体作为免疫原免疫动物Balb/c小鼠;
2)通过杂交瘤技术将小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞经多次细胞融合,利用间接ELISA法进行正向和负向筛选,克隆化筛选出能稳定分泌抗D-二聚体单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤1)包含:将纯化的D-二聚体与等量的弗氏完全佐剂乳化,乳化完成后,对8周龄的Balb/c小鼠进行基础免疫。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,2周后,追加免疫一次。
9.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤2)包含:将脾细胞与骨髓瘤细胞混合,以聚乙二醇为融合剂,形成融合细胞,将融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液中,并置CO2中在37℃培养;用间接ELISA法进行筛选,筛选时,先用纤维蛋白原及其降解产物包被,进行负向筛选,去掉能够与纤维蛋白原及其降解产物结合的杂交瘤细胞;然后用D-二聚体包被筛选剩下的杂交瘤细胞进行正向筛选,对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化,并置于CO2中于37℃培养,直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止。
10.权利要求3和/或权利要求4所述的单克隆抗体在制备检测人D-二聚体的制剂中的应用。
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