CN101343319A - 抗登革病毒e蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNo.2407的小鼠杂交瘤细胞2B10分泌产生；本发明的单克隆抗体综合效能高，能特异性的结合登革病毒，可以应用于制备新型有效的预防和治疗登革病毒感染的药物，并且还可以做成试剂盒，用于检测登革病毒。

Description

抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用。

背景技术

登革热和登革出血热/休克综合症是由登革病毒(Dengue virus)引起经蚊传播的急性传染病，以发热、皮疹、出血、休克等为主要特征，病死率高，近年来，登革热和登革出血热/休克综合症的发病呈上升趋势，世界卫生组织已将登革出血热/休克综合症和肝炎、疟疾、结核列为全球最严重的传染病。登革病毒为B组虫媒病毒，归类于披膜病毒科、黄病毒属，病毒由RNA基因组和衣壳蛋白组成，呈哑铃形、杆状或球形，直径为30-40nm，可在乳鼠脑内和组织细胞中培养繁殖，以白纹伊蚊细胞株(C6/36)最为敏感。登革病毒有I、II、III、IV四个血清型，II型登革病毒毒力强，易引起登革出血热。

对登革病毒引起的疾病目前还没有具体有效的的预防和治疗方法，多是在发病后的对症治疗，因此，采用特异性中和抗体进行被动免疫，或者说是治疗性抗体策略倍受关注。许多研究者认为，具有高度特异性、制备简易性、安全性、发挥作用的快速性等优点的特异性抗体具备成为治疗性免疫药物的潜质。大量的体外和体内实验已经发现，抗体尤其是中和抗体能有效阻止病毒感染宿主细胞。有报道发现针对登革病毒PrM、E、NS1等蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体在小鼠感染模型中具有保护作用；与登革病毒同属的西尼罗河病毒的小鼠模型也证明了中和抗体能起到预防和治疗作用；有报道用西尼罗河病毒的NS1蛋白为抗原免疫小鼠，获得了4株中和抗体，用致死剂量的病毒感染小鼠，在注射其中任意1株抗体后，存活率高于对照组75-95％，而常规输液治疗仅存活17％，并且，在感染病毒后(最长4天)再注射中和抗体，这些抗体仍具有明显的治疗效果。

单克隆抗体(Monoclonal antibody，简称mAb)针对一个抗原决定簇，它来源于一个抗体形成细胞经过增殖后产生的细胞系，其特点是特异性强，可以无限制的大量生产。目前全世界1000余种抗体正在进行临床试验，约占整个生物药品数量的一半。治疗性单克隆抗体的优势是：(1)特异性强，能直接针对病原体，减少交叉反应或副作用；(2)通用性广，运用灵活；(3)易于修饰改造；(4)周期较长，一般体内存在21天左右。

同时，中和抗体亦是进行病毒感染机制研究的重要工具。抗体中和黄病毒属病毒的具体机制不明，目前主要有两种观点：(1)中和作用：通过阻断病毒与细胞受体的接合而达到完全或部分阻断病毒的吸附，从而抵御病毒对宿主细胞的感染；(2)在中和抗体存在的条件下，病毒与细胞膜融合的机理不同，即病毒-抗体复合物在小泡包绕下进入细胞内，病毒核酸不能进入细胞质中，因而出现顿挫感染。

综上所述，中和抗体不仅在研究登革病毒的病理机制、登革病毒感染的早期诊断中具有重要作用，而且在通过被动免疫进行预防和治疗等方面具有很大的潜力。目前还有大量使用登革病毒各重组蛋白(如NS1、E蛋白)制备单克隆抗体的报道，但由于重组蛋白缺乏天然结构和自然折叠，可能丢失重要的抗原决定簇。因此，本领域迫切需要开发特异性强，综合效能高的抗登革病毒的单克隆抗体来用于检测、预防和治疗登革病毒引起的疾病。

发明内容

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题是提供一种抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.2407的小鼠杂交瘤细胞2B10分泌产生；

小鼠杂交瘤细胞2B10，是按照国际惯例，以筛选的阳性细胞所在的96孔板的位置进行命名，于2008年3月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.2407。

进一步，所述单克隆抗体可以特异性的结合II型登革病毒E蛋白。

本发明的另一个目的在于，抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体用于制备预防和治疗登革病毒感染药物的应用；

进一步，所述的抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体用于制备预防和治疗II型登革病毒感染药物的应用。

本发明的再一目的在于，抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体用于检测登革病毒的应用；

进一步，所述单克隆抗体用于检测II型登革病毒的应用；

进一步，所述单克隆抗体用于检测登革病毒的应用是用抗登革病毒的多克隆抗体为包被抗体，用所述抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体为酶标抗体，制成检测登革病毒的试剂盒。

本发明的又一目的在于，提供所述的抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)病毒纯化

(A)病毒增殖：取白纹伊蚊C6/36细胞，用RPMI 1640培养液，内含质量百分浓度为10％的胎牛血清、摩尔浓度为2mmol/L的谷氨酰胺、摩尔浓度为10mmol/L的HEPES缓冲液，培养至单层后，按感染复数＝1进行II型登革病毒Tr1751株的感染，待出现明显细胞病变后，收取含有病毒的培养液上清，离心去除细胞碎片，采用VERO细胞单层培养噬斑法进行病毒滴度测定，调整病毒滴度为5.0×10⁶PFU/ml，置-80℃保存备用；

(B)病毒浓缩：在含病毒的上清液中，加入聚乙二醇8000即PEG 8000和氯化钠至最终质量百分浓度分别为7％和1.4％，于温度为4℃振摇过夜后，17,000g离心30分钟，弃上清，按体积比1∶100加入TNE buffer(pH值为7.4，由摩尔浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、摩尔浓度为100mmol/L的氯化钠、摩尔浓度为1mmol/L的乙二胺四乙酸组成的溶液)，重悬沉淀，即制得浓缩病毒；

(C)病毒纯化：在水平离心管中，以10％的质量百分浓度递减，由底层依次加入质量百分浓度为60％-30％的蔗糖溶液，体积分别为4ml、3ml、3ml、3ml，再加入浓缩病毒1ml，110,000g离心6小时，小心收取60％层面上的蛋白颗粒，即制得纯化病毒，测定其滴度，置-80℃保存备用；

(2)动物免疫

(A)免疫抗原：将纯化病毒分别与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂等体积混合，充分乳化，制得免疫抗原；

(B)免疫动物：SPF级6-8周龄雌性BALB/c小鼠，体重20-25g；

(C)免疫步骤：基础免疫第1针，用弗氏完全佐剂抗原皮下、肌肉、腹腔多点注射，每只200μg；3周后第2针，用弗氏不完全佐剂抗原皮下、肌肉、腹腔多点注射，每只200μg；再3周后，于细胞融合前3天，加强免疫，对经间接免疫荧光法确定特异性高、间接ELISA法测定抗体效价达到1∶12800以上的小鼠，用不加佐剂的纯化病毒腹腔注射，每只200μg；

(3)细胞融合

(A)骨髓瘤细胞的准备：取Sp2/0细胞，用含有质量浓度为20μg/ml的8-氮杂鸟嘌呤的培养液进行筛选培养；

(B)脾细胞的准备：无菌条件下取免疫小鼠脾脏，铜网碾磨，得到脾细胞悬液；

(C)聚乙二醇即PEG融合：台盼蓝染色计数活细胞百分比，分别吸取1×10⁸个脾细胞与3×10⁷个Sp2/0细胞，混匀，加入质量百分比浓度为50％的聚乙二醇4000即PEG4000溶液1ml，进行细胞融合；融合细胞经洗涤后，用10ml含HAT的1640培养液，内含摩尔浓度为1×10^-4mol/L的次黄嘌呤、摩尔浓度为4×10^-7mol/L的氨基嘌呤、摩尔浓度为1.6×10^-5mol/L的胸腺嘧啶，进行重悬，再加至用小鼠腹水稀释液包被的含饲养细胞的96孔培养板中进行培养，每孔100μl，每日观察；

(4)杂交瘤筛选

通过细胞计数稀释法将融合细胞单克隆化，再通过间接ELISA法检测阳性株。步骤如下：以纯化病毒为抗原铺板，融合细胞培养上清为第一抗体，辣根过氧化物酶即HRP标记的羊抗小鼠IgG为第二抗体；设不加第一抗体为空白对照，正常小鼠血清、培养液为阴性对照，小鼠抗II型登革病毒血清为阳性对照；第一抗体于温度为4℃吸附过夜，洗涤后加入第二抗体，于温度为37℃孵育1小时，洗涤后以邻苯二胺即OPD显色，测定OD₄₉₀nm值，高于阴性对照2.1倍者判为阳性；阳性细胞进一步单克隆化筛选，再经间接ELISA法检测，反复进行，直到获得稳定分泌单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞，按照国际惯例，将此细胞株命名为2B10；

(5)单克隆抗体的制备

(A)腹水单克隆抗体的制备：取经过腹腔注射降植烷预处理的BALB/c小鼠，腹腔接种小鼠杂交瘤细胞2B10，诱生腹水，约8-10天后收取腹水，离心，收集上清，过滤除去杂质，制得腹水单克隆抗体；

(B)单克隆抗体的制备：利用G蛋白亲和层析柱对腹水单克隆抗体进行纯化，制得单克隆抗体，透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。

本发明的有益效果在于：本发明以纯化的II型登革病毒为抗原免疫BLAB/c小鼠，以标准方法制备单克隆抗体，通过大量筛选，获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞1株，命名为2B10，由此得到高亲和力的中和特性的单克隆抗体，并提供了制备此单克隆抗体的方法，该单克隆抗体能特异性的结合登革病毒，减少交叉反应或副作用，不仅在研究登革病毒的病理机制、登革病毒感染的早期诊断中具有重要作用，而且在通过被动免疫进行预防和治疗等方面具有很大的潜力，可以发展成为新型有效的治疗登革病毒感染疾病的药物，还可以做成试剂盒检测登革病毒。

本发明的其他优点、目标，和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书，权利要求书，以及附图中所特别指出的方法来实现和获得。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为感染登革病毒的BALB/c小鼠的脑切片间接免疫荧光染色图；

图2为纯化病毒的SDS-PAGE图；

图3为阳性对照的Western Blot图；

图4为抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体的Western Blot图；

图5为抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体对高病毒滴度感染小鼠的保护活性图；

图6为抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体对低病毒滴度感染小鼠的保护活性图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

一、抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体的制备

(1)病毒纯化

(A)病毒增殖：取白纹伊蚊C6/36细胞，用RPMI 1640培养液，内含质量百分浓度为10％的胎牛血清、摩尔浓度为2mmol/L的谷氨酰胺、摩尔浓度为10mmol/L的HEPES缓冲液，培养至单层后，按感染复数(MOI)＝1进行II型登革病毒(DENV2)Tr1751株的感染，待出现明显细胞病变后，收取含有病毒的培养液上清，离心去除细胞碎片，采用VERO细胞(非洲绿猴肾细胞)单层培养噬斑法(Plaque assay)进行病毒滴度测定，调整病毒滴度为5.0×10⁶PFU/ml，置-80℃保存备用；

(B)病毒浓缩：在含病毒的上清液中，加入PEG8000和NaCl至最终质量百分浓度分别为7％和1.4％，于温度为4℃振摇过夜后，17,000g离心30分钟，弃上清，按体积比1∶100加入TNE buffer(pH值为7.4，由摩尔浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、摩尔浓度为100mmol/L的氯化钠、摩尔浓度为1mmol/L的乙二胺四乙酸组成的溶液)，重悬沉淀，即制得浓缩病毒；

(C)病毒纯化：在水平离心管中，以10％的质量百分浓度递减，由底层依次加入质量百分浓度为60％-30％的蔗糖溶液，体积分别为4ml、3ml、3ml、3ml，再加入浓缩病毒1ml，110,000g离心6小时，小心收取60％层面上的蛋白颗粒，即制得纯化病毒，测定其滴度，置-80℃保存备用；

(2)动物免疫

(A)免疫抗原：将纯化病毒分别与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂等体积混合，充分乳化，制得免疫抗原；

(B)免疫动物：SPF级6-8周龄雌性BALB/c小鼠，体重20-25g；

(C)免疫步骤：基础免疫第1针，用弗氏完全佐剂抗原皮下、肌肉、腹腔多点注射，每只200μg；3周后第2针，用弗氏不完全佐剂抗原皮下、肌肉、腹腔多点注射，每只200μg；再3周后，于细胞融合前3天，加强免疫，对经间接免疫荧光法确定特异性高、间接ELISA法测定抗体效价达到1∶12800以上的小鼠，用不加佐剂的纯化病毒腹腔注射，每只200μg；

(3)细胞融合

(A)骨髓瘤细胞的准备：取Sp2/0细胞，用含质量浓度为20μg/ml的8-氮杂鸟嘌呤的培养液进行筛选培养；

(B)脾细胞的准备：无菌条件下取免疫小鼠脾脏，铜网碾磨，得到脾细胞悬液；

(C)PEG融合：台盼蓝染色计数活细胞百分比，分别吸取1×10⁸个脾细胞与3×10⁷个Sp2/0细胞，混匀，加入质量百分比浓度为50％的PEG4000溶液1ml，进行细胞融合；融合细胞经洗涤后，用10ml含HAT的1640培养液，内含摩尔浓度为1×10^-4mol/L的次黄嘌呤、摩尔浓度为4×10^-7mol/L的氨基嘌呤、摩尔浓度为1.6×10^-5mol/L的胸腺嘧啶，进行重悬，再加至用小鼠腹水稀释液包被的含饲养细胞的96孔培养板中进行培养，每孔100μl，每日观察；

(4)杂交瘤筛选

通过细胞计数稀释法将融合细胞单克隆化，再通过间接ELISA法检测阳性株。步骤如下：以纯化病毒为抗原铺板，融合细胞培养上清为第一抗体，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG为第二抗体；设不加第一抗体为空白对照，正常小鼠血清、培养液为阴性对照，小鼠抗II型登革病毒血清为阳性对照；第一抗体于温度为4℃吸附过夜，洗涤后加入第二抗体，于温度为37℃孵育1小时，洗涤后以邻苯二胺(OPD)显色，测定OD₄₉₀nm值，高于阴性对照2.1倍者判为阳性；阳性细胞进一步单克隆化筛选，再经间接ELISA法检测，反复进行，直到获得稳定分泌单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞，按照国际惯例，将此细胞株命名为2B10；

(5)单克隆抗体的制备

(A)腹水单克隆抗体的制备：取经过腹腔注射降植烷预处理的BALB/c小鼠，腹腔接种小鼠杂交瘤细胞2B10，诱生腹水，约8-10天后收取腹水，离心，收集上清，过滤除去杂质，制得腹水单克隆抗体；

(B)单克隆抗体的制备：利用G蛋白亲和层析柱(Bio-rad公司)对腹水单克隆抗体进行纯化，制得单克隆抗体，透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。

二、抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体的性质鉴定

(1)Ig亚型鉴定

方法：采用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(Mouse mAb Isotyping Kit，Sigma公司)进行鉴定。

结果：本发明所述单克隆抗体为IgG2a亚型。

(2)特异性鉴定

(A)间接免疫荧光染色法

方法：将感染登革病毒的BALB/c小鼠和正常小鼠的脑切片分别作为感染组和对照组，以腹水单克隆抗体为第一抗体，荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的羊抗小鼠IgG为第二抗体，进行间接免疫荧光染色，同时设抗登革病毒的多克隆抗体为阳性对照，正常小鼠血清为阴性对照。

结果：见图1；1A、1B为阳性对照染色结果，分别为100×、400×照片，可见登革病毒特异性强染，特别是海马区；1C、1D为腹水单克隆抗体染色结果，分别为100×、400×照片，与阳性对照染色结果相似，强度略低，特异性好；1E为阴性对照染色结果，为100×照片，无强染出现。

结论：本发明所述单克隆抗体具有高度特异性和亲和性。

(B)蛋白质免疫印迹法(Western Blot)

方法：以纯化病毒、感染登革病毒的VERO细胞裂解物为检测组，设正常VERO细胞裂解物为阴性对照，小鼠抗登革病毒血清为阳性对照，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，凝胶经15V半干转印1小时，以腹水单克隆抗体为第一抗体，浸泡条带并于温度为4℃吸附过夜，以HRP标记的羊抗小鼠IgG为第二抗体，于37℃孵育1小时，3，3-二氨基联苯胺(DAB)显色观察。

结果：见图2-4；图2中1泳道为纯化病毒，2泳道为蛋白分子量标准，比较可知纯化病毒包括约62Kd的E蛋白、70Kd的NS3蛋白、100Kd的NS5蛋白和46Kd的NS1蛋白，而含量相对较少、分子质量较小的蛋白不显著；图3中1泳道为阳性对照，2泳道为蛋白分子量标准，比较可知小鼠抗登革病毒的多克隆抗体包括约62Kd的E蛋白、70Kd的NS3蛋白和100Kd的NS5蛋白；图4中1泳道为纯化病毒，2泳道为正常VERO细胞裂解物，3泳道为感染登革病毒的VERO细胞裂解物，4泳道为蛋白分子量标准，比较可知1、3泳道均于E蛋白分子质量处出现阳性反应，而2泳道无反应。

结论：本发明所述单克隆抗体能够特异性地识别登革病毒E蛋白。

(3)中和特性鉴定

方法：通过蚀斑减少中和试验(PRNT)进行鉴定，将VERO细胞接种于24孔板，生长至单层；以无血清的MEM溶液为稀释液，将已测定滴度的II型登革病毒稀释成每0.1ml约100PFU；按1∶10、1∶40、1∶100、1∶160、1∶640的比例，以相同稀释液分别稀释腹水单克隆抗体、正常小鼠腹水及血清；取稀释的病毒液0.1ml和各稀释度的腹水单克隆抗体、正常小鼠腹水及血清0.1ml，混匀，分别作为检测组和对照组，同时设II型登革病毒稀释液0.1ml加MEM培养液0.1ml为阳性对照，MEM培养液0.2ml为阴性对照；于温度为37℃孵育1小时，将上述各稀释度的混合液分别感染培养于24孔板的VERO细胞，于温度为37℃孵育1小时，弃去液体充分洗涤后，再加入含质量浓度为10g/L的甲基纤维素的MEM培养液进行培养，约7天后结晶紫染色计数病毒蚀斑，计算50％噬斑阻断浓度。

结果：50％噬斑阻断浓度为1∶60，即30μg抗体中和约50PFU的登革病毒。

结论：本发明所述单克隆抗体具有较高的中和能力。

(4)阻断病毒机制的鉴定

方法：通过前吸附和后吸附实验进行鉴定。前吸附实验为先将II型登革病毒和单克隆抗体于温度为4℃孵育1小时，再加入到VERO细胞上进行吸附(4℃孵育1小时)；后吸附实验为先将II型登革病毒加入到VERO细胞上进行吸附(4℃孵育1小时)，洗涤后，再加入单克隆抗体于温度为4℃孵育1小时；最后按测定病毒滴度的方法进行。

结果：单克隆抗体在前吸附实验中显示出中和特性，而后吸附实验基本没有中和作用。

结论：本发明所述单克隆抗体阻断病毒机制在于阻断病毒对细胞的吸附。

三、单克隆抗体在制备预防和治疗登革病毒感染药物中的应用

方法：取BALB/c新生小鼠69只，分成2个大组，高病毒滴度(1×10⁴PFU)组和低病毒滴度(500PFU)组，每个大组再分成2个小组，抗体组(加入单克隆抗体)和对照组(加入正常小鼠血清，蛋白总量和抗体组相同)。具体步骤如下：将单克隆抗体125μg、正常小鼠血清125μg分别与登革病毒混合，置温度为37℃水浴1小时，取混合液20μl，用乳鼠脑内注射专用针头(27-gauge one-stopneedle，Top Injection Needle，Japan)于小鼠生后2天内注入乳鼠脑内；同一大组小鼠一起饲养，以排除不同母鼠和不同饲养条件的影响，观察、记录乳鼠发病(出现爬行不稳、下肢痉挛、角弓反张或一侧瘫痪等症状)和死亡情况。

结果：见图5-6；如图5所示，高病毒滴度时，对照组感染后第5天开始死亡，第8天全部死亡，而抗体组第5天开始死亡，第9天全部死亡；如图6所示，低病毒滴度时，对照组与高病毒滴度时情况相似，而抗体组第6天开始死亡，第11天全部死亡；抗体组小鼠无论是发病时间，还是死亡时间都明显晚于对照组，并且在低病毒滴度时更显著。

结论：本发明所述单克隆抗体对感染登革病毒的小鼠具有保护作用，可以用于登革病毒感染疾病的治疗。

四、单克隆抗体在检测登革病毒中的应用

E蛋白在登革病毒中含量高，且为病毒外膜的主要成分，能稳定存在，以抗登革病毒的多克隆抗体和单克隆抗体为基础，建立双抗夹心ELISA法，可以对登革病毒进行检测。

方法：以抗登革病毒的多克隆抗体包被96孔板，每孔4μg，于温度为4℃孵育过夜，用T-PBS溶液(即浓度为0.01mol/L、pH值为7.4、含有质量百分浓度为0.5％的吐温-20的磷酸盐缓冲溶液)洗涤3次；以II型登革病毒、I型登革病毒、日本脑炎病毒为待测样本，同时设1640培养液为阴性对照，以浓度为0.01mol/L、pH值为7.4、含有质量百分浓度为0.1％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液为稀释液，按1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000稀释度分别对待测样本(病毒滴度均为1×10⁵PFU/ml)进行稀释；将稀释的各待测样本加入96孔板，每孔100μl，每个待测样本设复孔，于室温下孵育1小时，用T-PBS洗涤3次，再加入用相同溶液稀释的腹水单克隆抗体，每孔4μg，于室温下孵育1小时，用T-PBS洗涤3次，加入用相同溶液按1∶2000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，每孔100μl，于室温孵育30分钟，OPD显色，酶标仪测定OD_490nm值，取复孔的平均值进行结果比较，以强于阴性对照2.1倍为阳性。

结果：见表1。

表1.各稀释度待测样本的检测结果

结论：使用本发明所述单克隆抗体能特异性地检测微量的II型登革病毒(稀释度1∶10000)，也能检测I型登革病毒(稀释度为1∶100)，而与日本脑炎病毒的交叉反应性低，可用于制备登革病毒检测试剂，包括登革病毒感染疾病的诊断试剂盒等。

尽管通过参照本发明的某些优选实施例，已经对本发明进行了图示和描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (9)

1、抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.2407的小鼠杂交瘤细胞2B10分泌产生。

2、根据权利要求1所述的抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体可以特异性的结合II型登革病毒E蛋白。

3、权利要求1或2所述的抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体用于制备预防和治疗登革病毒感染药物的应用。

4、根据权利要求3所述的抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体用于制备预防和治疗登革病毒感染药物的应用，其特征在于：所述单克隆抗体用于制备预防和治疗II型登革病毒感染药物的应用。

5、权利要求1或2所述的抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体用于检测登革病毒的应用。

6、根据权利要求5所述的抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体用于检测登革病毒的应用，其特征在于：所述单克隆抗体用于检测II型登革病毒的应用。

7、根据权利要求5所述的抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体用于检测登革病毒的应用，其特征在于：用抗登革病毒的多克隆抗体为包被抗体，用所述抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体为酶标抗体，制成检测登革病毒的试剂盒。

8、根据权利要求6所述的抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体用于检测登革病毒的应用，其特征在于：用抗登革病毒的多克隆抗体为包被抗体，用所述抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体为酶标抗体，制成检测登革病毒的试剂盒。

9、权利要求1所述的抗登革病毒E蛋白的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)病毒纯化

(A)病毒增殖：取白纹伊蚊C6/36细胞，用RPMI 1640培养液，内含质量百分浓度为10％的胎牛血清、摩尔浓度为2mmol/L的谷氨酰胺、摩尔浓度为10mmol/L的HEPES缓冲液，培养至单层后，按感染复数＝1进行II型登革病毒Tr1751株的感染，待出现明显细胞病变后，收取含有病毒的培养液上清，离心去除细胞碎片，采用VERO细胞单层培养噬斑法进行病毒滴度测定，调整病毒滴度为5.0×10⁶PFU/ml，置-80℃保存备用；

(B)病毒浓缩：在含病毒的上清液中，加入聚乙二醇8000和氯化钠至最终质量百分浓度分别为7％和1.4％，于温度为4℃振摇过夜后，17,000g离心30分钟，弃上清，按体积比1∶100加入TNE buffer，即pH值为7.4、由摩尔浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、摩尔浓度为100mmol/L的氯化钠、摩尔浓度为1mmol/L的乙二胺四乙酸组成的溶液，重悬沉淀，即制得浓缩病毒；

(C)病毒纯化：在水平离心管中，以10％的质量百分浓度递减，由底层依次加入质量百分浓度为60％-30％的蔗糖溶液，体积分别为4ml、3ml、3ml、3ml，再加入浓缩病毒1ml，110,000g离心6小时，小心收取60％层面上的蛋白颗粒，即制得纯化病毒，测定其滴度，置-80℃保存备用；

(2)动物免疫

(A)免疫抗原：将纯化病毒分别与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂等体积混合，充分乳化，制得免疫抗原；

(B)免疫动物：SPF级6-8周龄雌性BALB/c小鼠，体重20-25g；

(C)免疫步骤：基础免疫第1针，用弗氏完全佐剂抗原皮下、肌肉、腹腔多点注射，每只200μg；3周后第2针，用弗氏不完全佐剂抗原皮下、肌肉、腹腔多点注射，每只200μg；再3周后，于细胞融合前3天，加强免疫，对经间接免疫荧光法确定特异性高、间接ELISA法测定抗体效价达到1∶12800以上的小鼠，用不加佐剂的纯化病毒腹腔注射，每只200μg；

(3)细胞融合

(A)骨髓瘤细胞的准备：取Sp2/0细胞，用含有质量浓度为20μg/ml的8-氮杂鸟嘌呤的培养液进行筛选培养；

(B)脾细胞的准备：无菌条件下取免疫小鼠脾脏，铜网碾磨，得到脾细胞悬液；

(C)聚乙二醇即PEG融合：台盼蓝染色计数活细胞百分比，分别吸取1×10⁸个脾细胞与3×10⁷个Sp2/0细胞，混匀，加入质量百分比浓度为50％的聚乙二醇4000溶液1ml，进行细胞融合；融合细胞经洗涤后，用10ml含HAT的1640培养液，内含摩尔浓度为1×10^-4mol/L的次黄嘌呤、摩尔浓度为4×10^-7mol/L的氨基嘌呤、摩尔浓度为1.6×10^-5mol/L的胸腺嘧啶，进行重悬，再加至用小鼠腹水稀释液包被的含饲养细胞的96孔培养板中进行培养，每孔100μl，每日观察；

(4)杂交瘤筛选

通过细胞计数稀释法将融合细胞单克隆化，再通过间接ELISA法检测阳性株。步骤如下：以纯化病毒为抗原铺板，融合细胞培养上清为第一抗体，辣根过氧化物酶即HRP标记的羊抗小鼠IgG为第二抗体；设不加第一抗体为空白对照，正常小鼠血清、培养液为阴性对照，小鼠抗II型登革病毒血清为阳性对照；第一抗体于温度为4℃吸附过夜，洗涤后加入第二抗体，于温度为37℃孵育1小时，洗涤后以邻苯二胺即OPD显色，测定OD_490nm值，高于阴性对照2.1倍者判为阳性；阳性细胞进一步单克隆化筛选，再经间接ELISA法检测，反复进行，直到获得稳定分泌单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞，按照国际惯例，将此细胞株命名为2B10；

(5)单克隆抗体的制备

(A)腹水单克隆抗体的制备：取经过腹腔注射降植烷预处理的BALB/c小鼠，腹腔接种小鼠杂交瘤细胞2B10，诱生腹水，约8-10天后收取腹水，离心，收集上清，过滤除去杂质，制得腹水单克隆抗体；

(B)单克隆抗体的制备：利用G蛋白亲和层析柱对腹水单克隆抗体进行纯化，制得单克隆抗体，透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。

Images