CN102559724A - 一种新的hiv重组多表位融合抗原及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新的HIV重组多表位融合抗原，并以该抗原制备的检测试剂盒。该发明将HIV-1 gp41、″M″组和″O″组的主要表位基因、HIV-1 gp120主要表位基因和HIV-2 gp36主要表位基因加以柔性结构基因，全部基因DNA联一起的一条人造基因序列。将此序列克隆到表达载体再异位表达，建立免疫活性高表达细胞株。最后发酵培养、诱导高效表达，层析分离纯化艾滋病病毒多抗原表位融合抗原。将该抗原应用与免疫检测试剂，因融合抗原减少了不必要的基因序列能使非特异性反应减少50％以上，而同一个抗原上多个抗原表位的协同作用能使检出的灵敏度增加2-3倍。

Description

一种新的HIV重组多表位融合抗原及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学及免疫学领域，涉及一种重组融合蛋白，包含编码该蛋白的DNA序列的载体构建和工程菌构建以及该重组融合蛋白的免疫学应用。 

背景技术

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的一种疾病。1981年，人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒(Lentivirus)，属反转录病毒的一种。至今无有效疗法的致命性传染病。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统的失去抵抗力，而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病(获得性免疫缺陷综合征)。 

当前全球208个国家和地区已受到艾滋病严重威胁，3320万人受到HIV的感染，700多万人患了AIDS，200多万已经死亡。150万儿童成为受害者，60万儿童已病死。目前每天正以6000个新感染HIV者速度向前发展。 

中国自1985年首次报告艾滋病病例以来，艾滋病的流行呈快速上升趋势。近年来，中国艾滋病的感染与发病人数也增长较快。据联合国驻华机构公布的数据，目前中国艾滋病病毒感染者约84万人，加上已经染病死亡的24万人，总数应该在100万人左右。根据世界卫生组织统计，目前中国艾滋病病毒感染者占总人口的比例虽然很低，但感染人数在亚洲位居第2位，在全球居第14位。 

长期以来，中国政府高度重视艾滋病防控工作。2010年11月29日召开的国务院常务会议更是明确指出，预防和控制艾滋病，关系到人民群众身体健康和经济社会发展，关系到民族兴衰和国家存亡。 

目前艾滋病的防治主要为疫苗、诊断和治疗这三个方面，HIV疫苗的研制至今仍未获得成功，而HIV的治疗不仅价格昂贵，而且效果极其有限，这使得HIV的诊断成为艾滋病防治的最基础最有效的手段。 

自1985年第一代ELISA试剂问世以来，随着医学技术的飞速发展，包被抗原已从第一 代的全病毒裂解物发展为目前以基因重组与多肽抗原包被和标记的有着良好敏感性和特异性的第三代双抗原夹心试剂，检测亚型包括HIV-1、HIV-2和HIV-1型的O亚型，窗口期由10周缩短至3～4周。为避免窗口期传染，荷兰、法国等国已研制出可同时检测抗原抗体的第四代ELISA筛查试剂，但其临床价值有待评估。 

决定检测试剂的质量最重要因素就是检测抗原的质量，本发明一种新的HIV重组多表位融合抗原融合抗原在免疫试剂上的应用减少了不必要的基因序列能使临床检测的非特异性反应减少50％以上，而同一个抗原上多个抗原表位的协同作用能使检出的灵敏度增加2-3倍。 

发明内容

艾滋病在世界许多地区传播迅猛，常由最初的几例经十多年的传染就可达上百万至数百万例的感染。有效的诊断极其重要，一例的漏检、误诊就可能造成十年后的大面积传播。高效的诊断依赖于高质量的抗原。本发明是将艾滋病毒各型主要表位融合的重组抗原可以高效地检测出病人抗HIV病毒的抗体。本发明的HIV重组多表位融合抗原减少了很多不必要的蛋白序列，从而大大减少了非特异性吸附，不易漏检，多个主要抗原表位的融合大大提高了与抗HIV抗体反应的灵敏性，融合抗原与抗体可变区的嵌合较分别检测提高了效率，更重要的是增强了试剂稳定性，减少了批间、不同操作条件下的误差，从而建立了艾滋病高效诊断的基础。 

本发明根据蛋白质的结构特性和抗原的免疫学知识，采用计算机辅助设计，将第三代艾滋病重组抗原HIV-1 gp41、″M″组和″O″组的主要表位基因、HIV-1 gp120主要表位基因和HIV-2 gp36主要表位基因加以柔性结构基因，全部基因DNA联一起的一条人造基因序列。将此序列克隆到表达载体再异位表达，建立免疫活性高表达细胞株。最后发酵培养、诱导高效表达，层析分离纯化艾滋病病毒多抗原表位融合抗原，因融合抗原减少了不必要的基因序列能使非特异性反应减少50％以上，而同一个抗原上多个抗原表位的协同作用能使检出的灵敏度增加2-3倍。应用本发明抗原的HIV的检测试剂将具有更高的检出灵敏度和更好特异性。 

具体实施方式：

1、HIV多表位融合抗原基因的克隆和表达质粒的构建 

(1)设计引物 

P1：5’-aattccatg ggagtagcacccaccaaggcaagg-3’(SEQ ID NO.11) 

P2：5’-ttaggaggccacctccgagttcattcttttcttg-3’(SEQ ID NO.12) 

P3：5’-ggaggtggcctcctaaacctatggggatgtaaag-3’(SEQ ID NO.13) 

P4：5’-atatctcgccacctccataccacaaccatttag-3’(SEQ ID NO.14) 

P5：5’-ggaggtggcgagatataagacaagcacattgtaac-3’(SEQ ID NO.15) 

P6：5’-gcctggagccacctcctactattcctattattat-3’(SEQ ID NO.16) 

P7：5’-ggaggtggcctccaggcaagagtcactgctatcg-3’(SEQ ID NO.17) 

p8：5’-ttaactcgagaatattcctattattatataaactcc-3’(SEQ ID NO.18) 

(2)P1和P2引物扩PCR增出HIV-1GP41(SEQ ID NO.2)，P3和P4引物扩PCR增出HIV-1亚型″O″(SEQ ID NO.4)，P5和P6引物PCR扩增出HIV-1GP120(SEQ ID NO.6)，P7和P8引物PCR扩增出HIV-2GP36(SEQ ID NO.8)，PCR扩增条件为变性95℃5分钟，25个循环，94℃30秒，52℃30秒，72℃60秒。经25个循环后72℃10分钟。 

(3)借助P2和P3之间16个碱基的重叠，用P1和P4引物PCR扩增出HIV-1GP41(SEQ ID NO.2)+HIV-1亚型″O″(SEQ ID NO.4)，共811个碱基的片段。PCR扩增条件为变性95℃5分钟，25个循环，94℃30秒，52℃30秒，72℃90秒。经25个循环后72℃10分钟。 

(4)借助P6和P7之间16个碱基的重叠，用P5和P8引物PCR扩增出HIV-1GP120(SEQ ID NO.6)+HIV-2GP36(SEQ ID NO.8)，共673个碱基的片段。PCR扩增条件为变性95℃5分钟，25个循环，94℃30秒，52℃30秒，72℃90秒。经25个循环后72℃10分钟。 

(5)借助P4和P5之间16个碱基的重叠，用P1和P8引物PCR扩增出HIV-1GP41(SEQ ID NO.2)+HIV-1亚型″O″(SEQ ID NO.4)+HIV-1GP120(SEQ ID NO.6)+HIV-2GP36(SEQ ID NO.8)，共1484个碱基的片段。命名为HIVM(SEQ ID NO.19)。PCR扩增条件为变性95℃5分钟，25个循环，94℃30秒，52℃30秒，72℃150秒。经25个循环后72℃10分钟。 

(6)利用P1引物上的Nco I及P8引物上的Xho I酶切位点，将长片段HIVM进行双酶切，片段回收后连到进行了同样双酶切的pTXB1表达载体上(New England Biolabs)，构建出表达质粒pTXB1HIVM。

附图说明″图1是重组表达质粒PTXB1HIVM构建示意图″。 

2、重组融合蛋白的表达和纯化 

(1)将表达质粒pTXB1HIVM转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布于含有50ug/ml的氨苄青霉素的LB平板上。37℃培养过夜，挑取单克隆。 

(2)接种于含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基10ml中，培养至OD600值0.8左右，8000G离心10分钟，收集细菌沉淀，SDS-PAGE鉴定目的蛋白。 

(3)接种步骤(1)中工程菌于含50ug/ml氨苄青霉素的培养皿上分区划碟，挑取阳性克隆再次进行如步骤(2)中的小量表达。 

(4)将步骤(3)中挑取的阳性克隆提取质粒，进行酶切鉴定，鉴定阳性的样品送测序公司进行测序，以证实表达质粒构建的正确性；加20％甘油低温保存工程菌。 

(5)低温保存的工程菌涂于细菌培养皿，单个细菌菌落摇起活化之后，接种至大量含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养至OD600在0.8左右；再加入1mM IPTG 37℃诱导5小时。 

(6)8 000g离心10分钟，收集细菌沉淀； 

(7)用裂解液(0.1％NP40、10mM Tris·HCl，pH8.0)裂解细菌，超声波破碎，12000g离心10分钟，弃上清。 

(8)沉淀用1M NaCL溶液洗涤3次，均12000g离心取沉淀。 

(9)用基液(8M尿素、10mM Tris·HCl，pH8.0、1％2-ME)溶解沉淀过夜； 

(10)18000g离心10分钟，取上清。 

(11)上清过阴离子层析介质DEAE进行纯化，用不同浓度0-0.5NaCl溶液进行洗脱； 

紫外分光光度计检测流出峰，自动收集器收集。 

(12)SDS-PAGE鉴定收集峰，合并。 

(13)用几丁质磁珠亲和层析介质进行纯化(12)步骤合并收集峰，DTT溶液进行洗脱，得到纯的重组HIVM融合蛋白，其最终氨基酸序列为HIV-1GP41(SEQ ID NO.1)+HIV-1亚型″O″(SEQ ID NO.3)+HIV-1GP120(SEQ ID NO.5)+HIV-2GP36(SEQ ID NO.7)；(SEQ ID NO.20) 

实施例一 

重组融合蛋白在HIV ELISA检测中的应用 

1.重组抗原包被的酶联板制备：将pTXB1HIVM重组抗原用0.05M，PH9.6碳酸缓冲液稀 释，优选浓度为2ug/ml，按100ul/孔加至酶联板，4℃24小时。弃去液体，按200ul/孔加入封闭液，4℃24小时。弃去液体，置室温小于30％湿度下干燥24小时，真空保存备用。封闭液为0.02M磷酸缓冲液，含0.5％Casein、10％小牛血清、2％蔗糖和0.1％proclin-300。 

2.酶结合物制备：用pTXB1HIVM标记HRP，用常规方阵滴定法选择最佳酶结合物浓度，优选后确定为0.02ug/ml，用酶稀释液配置后分装置4℃备用。 

3.质控血清制备：收集HIV阳性血清，将5份以上混合，测定其OD值，最终稀释到OD为1.0，按1ml/支分装，-20℃保存备用。 

4.检测原理和方法：本试剂盒采用双抗原夹心法原理检测HIV抗体，包被板中包被本发明的pTXB1HIVM重组抗原，若样本中含有HIV抗体，则被包被板结合，再加入pTXB1HIVM-HRP复合物，形成夹心复合物，最后利用底物显色，酶标仪读数，从而判定结果。检测步骤为首先在酶联板孔内加入50ul样品稀释液和50ul样本，37℃孵育60分钟；洗板后加入100ul酶结合物37℃孵育60分钟加入显色液孵育30分钟后用酶标仪OD450读数，判定结果。 

5.性能分析：将此试剂测试临床确定样本，计算其灵敏度及特异性。 

5.1临床血清：湖南医科大学附属湘雅医院收集，共576份。其中艾滋病病人血清276份，正常健康人血样300份。 

5.2结果：以上述发明试剂检测临床样本，结果表明，具有非常高的灵敏度和特异性。结果见下表。 

计算公式 

灵敏度＝真阳性/(真阳性+假阴性)×100％ 

特异性＝真阴性/(真阴性+假阳性)×100％ 

利用本发明试剂检测灵敏度100％，特异性100％。 

结果表明，本发明试剂具有非常高的灵敏度和特异性。 

实施例二 

重组融合蛋白在HIV金标试纸条检测中的应用 

1包被膜的制备：优选0.02M pH 7.2磷酸盐缓冲液为包被溶液，0.22um膜过滤后，置4℃备用，有效期一周。调试喷膜机(Bio-Dot)，优选喷膜液量为20ul/30cm，用包被缓冲液稀释重组pTXB1HIVM抗原，浓度为0.5mg/ml，用包被膜缓冲液稀释制备的″羊抗-pTXB1HIVM多抗″至浓度为0.5mg/ml，机器划线，两线间隔5mm，应细致均匀，室温凉干20分钟。后置37℃烘干处理2小时，封袋备试纸板贴板用。 

2复合物垫的制备：去离于水1200ml置于洁净的玻璃器皿中(有条件可硅化)，选用适合大小的搅拌子，中速搅拌。依顺序加入1％氯金酸24ml，柠檬酸三钠0.42克。煮沸10分钟。然后进行光谱扫描，以500-600nm间出现最大吸收峰为宜。胶体金颗粒为30-50nm为宜。用去离子水调整胶体金OD值为1.5，用0.1M碳酸钾调pH为7.2。在100ml胶体金溶液中加入0.5mgpTXB1HIVM，混匀，标记30分钟。加入10％的BSA至终浓度为1％，混匀，放置30分钟。12000r/min离心50分钟，弃上清，沉淀用三分之一初始胶体金的重悬液溶解。将标记好的胶体金均匀地铺在无纺布上，按500ul/条涂覆在0.5×30cm的玻璃纤维膜上，再置干燥间，温度20--25℃，湿度小于20％，干燥2--4小时，备用。重悬液配方为：2％牛血清白蛋白BsA，2％蔗糖，0.15％tweeen-20，0.01M pH7.0PBS溶液，0.22p膜过滤，置4℃备用，有效期两周。 

3样品垫的制备以3×30cm规格在配制好的样品垫处理溶液中浸泡15分钟，置于干燥间，温度50℃，湿度小于20％，干燥18小时以上，备用。样品垫处理液的配方为：2％BSA的0.01MTris溶液，PH为8.0，并含0.2％PEG、1％水解络蛋白和0.02％TWEEN-20表面活性剂。 

4试纸卡的制备：在干燥室内，温度20--25℃，湿度小于20％，取PVC底板，将已包被的NC膜粘贴在中部，在NC膜检测区一侧搭接胶体金垫，在胶体金垫再搭接样品垫，在NC膜控制区一侧搭接吸水垫，最上面贴一标志膜，最后用切割机将贴好的板切成3mm或4mm的试纸条，切好的条可以装入塑料卡内，形成试剂卡。 

将试纸条固定在试剂盒的底板上，合上上盖板，使上盖的加样窗对应试纸条的样品垫，结果显示窗对应检测区和控制区。 

5.检测原理和方法 

其检测原理为在检测试纸硝酸纤维素膜的检测区包被了本发明pTXB1HIVM重组抗原， 在对照区包被了″羊抗-pTXB1HIVM多抗”。检测时，用加样器加入50ul样至本试纸的加样区，接着加入50ul样本稀释液。试纸上的微红色pTXB1HIVM-胶体金标记物被溶解，样本中的HIV抗体同pTXB1HIVM-胶体金粒子结合在一起，形成″pTXB1HIVM-金″复合物，并沿着试纸向上方移动，首先到达包被了pTXB1HIVM重组抗原的检测区。如果样本中含有HIV的抗体，″pTXB1HIVM-金″复合物将同HIV抗体结合，形成″pTXB1HIVM-金-HIV抗体-pTXB1HIVM″复合物，并在检测线上滞留下来，形成一条微红色的线，这代表阳性结果。线条颜色的深浅同样本中的抗体数量没有比例关系。检测区里如果没有带颜色的线条表示样本中不含抗HIV抗体。游离的″pTXB1HIVM-金″复合物继续向试纸上方移动，到达试纸的对照区。对照区包被了羊抗-pTXB1HIVM多抗，固定在试纸的对照线上。″pTXB1HIVM-金″复合物将同″羊抗-pTXB1HIVM多抗”结合在一起而富集在对照线上，形成一条微红色的线。对照线的出现证明试纸条检测功能正常。无论样本中是否含有HIV抗体，在有效试验中，试纸的对照区都应当出现微红-紫色对照线。样本继续移动，越过对照区最终进入吸收区。吸收区的作用是吸附剩余的复合物，使其在试纸内移动，并消除背景色。 

6.性能分析：将此试剂测试临床确定样本，计算其灵敏度及特异性。 

6.1临床血清：湖南医科大学附属湘雅肿瘤医院收集，共576份。其中鼻咽癌病人血清276份，健康人血样300份。 

6.2结果：以上述发明试剂盒检测临床样本，结果表明，本发明试剂非常高的灵敏度和特异性。结果见下表。 

计算公式 

灵敏度＝真阳性/(真阳性+假阴性)×100％ 

特异性＝真阴性/(真阴性+假阳性)×100％ 

利用本发明试剂检测灵敏度100％，特异性100％。 

结果表明，本发明试剂具非常高的灵敏度和特异性。 

Claims (9)

1.一种HIV多表位融合重组抗原基因的DNA编码序列，起特征在于该DNA序列包括HIV-1GP41(SEQ ID NO.1)氨基酸片段的DNA编码序列(SEQ ID NO.2)，HIV-1亚型″O″(SEQ ID NO.3)氨基酸片段的DNA编码序列(SEQ ID NO.4)，HIV-1GP120(SEQ ID NO.5)位氨基酸片段的DNA编码序列(SEQ ID NO.6)，HIV-2GP36(SEQ ID NO.7)位氨基酸片段的DNA编码序列(SEQ ID NO.8)。

2.一种HIV多表位融合重组抗原，HIV-1GP41(SEQ ID NO.1)，HIV-1亚型″O″(SEQID NO.3)，HIV-1GP120(SEQ ID NO.5)，HIV-2GP36(SEQ ID NO.7)之间的柔性连接子，其氨基酸序列″GGG″(SEQ ID NO.9)，对于的DNA编码序列是″ggaggtggc″(SEQ ID NO.10)。

3.一种重组表达载体，其特征在于该表达载体是质粒上插入如权利要求1所述的多表位抗原基因DNA编码序列。

4.一种重组表达载体，其特征在于该表达载体上插入的重组抗原之间用如权利2所述的连接子连接。

5.一种工程菌株，其特征为其插入质粒是如权利要求3所述的表达载体。

6.一种重组蛋白质，其特征为该重组蛋白质含有如权利要求1所述的DNA序列所编码的氨基酸序列。

7.一种重组蛋白质，其特征为如权利要求2所述的连接子连接。

8.一种生产方法，其特征为将权利要求5所述的工程菌在适合的条件下表达出具有权利要求6、7的蛋白质，并分离纯化该蛋白质。

9.应用权利要求6、7重组蛋白质的HIV免疫学检测试剂，包括但不限于此重组蛋白质在HIV ELISA试剂盒，HIV血液检测胶体金试纸条，HIV唾液检测胶体金试纸条，HIV尿液检测胶体金试纸条，HIV胶体硒检测试纸条的应用。

Images